CN117580951A - 用于沉默myoc表达的组合物和方法 - Google Patents

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CN117580951A CN202280045287.2A CN202280045287A CN117580951A CN 117580951 A CN117580951 A CN 117580951A CN 202280045287 A CN202280045287 A CN 202280045287A CN 117580951 A CN117580951 A CN 117580951A
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A·卡斯托雷诺
B·A·潘迪亚
E·卡斯特拉诺斯-里扎尔多斯
M·K·施莱格尔
V·R·贾达夫
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Alnylam Pharmaceuticals Inc
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Abstract

本公开涉及靶向MYOC的双链核糖核酸(dsRNA)组合物，以及使用此类dsRNA组合物来改变(例如，抑制)MYOC的表达的方法。

Description

用于沉默MYOC表达的组合物和方法
相关申请交叉引用
本申请要求于2021年6月28日提交的美国临时申请第63/215,804号的优先权的权益，要求于2021年12月8日提交的美国临时申请第63/287,404号的优先权的权益，并且要求于2022年6月10日提交的美国临时申请第63/351,033号的优先权的权益。前述申请的全部内容特此通过引用并入本文。
序列表
本申请含有已经以ASCII格式电子提交的序列表，并且特此以全文引用的方式并入。创建于2022年6月22日的所述ASCII副本命名为A108868_1490WO_SL.txt并且大小为596,467字节。
技术领域
本公开涉及MYOC的表达的特异性抑制。
背景技术
青光眼(例如，原发性开角型青光眼(POAG))是当今老龄化群体中不可逆视力丧失的主要原因。MYOC蛋白错误折叠阻断了其从小梁网细胞的分泌，导致升高的眼压，进而压迫和损伤视神经，降低其向脑传递视觉信息的能力，从而导致视力丧失。青光眼需要新的治疗方法。
发明内容
本公开描述了用于调节MYOC的表达的方法和iRNA组合物。在某些实施例中，使用MYOC特异性iRNA来减少或抑制MYOC的表达。此类抑制可以用于治疗与MYOC表达相关的病症，如眼部病症(例如，青光眼，例如原发性开角型青光眼(POAG))。
因此，本文描述了在细胞中或在受试者体内(例如，在哺乳动物体内，如人类受试者)影响RNA诱导的沉默复合物(RISC)介导的MYOC的RNA转录物的切割的组合物和方法。还描述了用于治疗与MYOC的表达相关的病症，如青光眼(例如，原发性开角型青光眼(POAG))的组合物和方法。
本文所提出的组合物中包含的iRNA(例如，dsRNA)包含RNA链(反义链)，其具有与MYOC(例如，人MYOC)的mRNA转录物(本文也称为“MYOC特异性iRNA”)的至少一部分基本互补的区，例如，30个核苷酸或更少的区，通常长度为19个至24个核苷酸。在一些实施例中，所述MYOC mRNA转录物是人MYOC mRNA的转录物，例如，本文中的SEQ ID NO:1。
在一些实施例中，本文所描述的iRNA(例如，dsRNA)包括具有与人MYOC mRNA的区基本上互补的区的反义链。在一些实施例中，人MYOC mRNA具有序列NM_000261.2(SEQ IDNO:1)。NM_000261.2的序列也通过引用以其整体并入本文。SEQ ID NO:1的反向互补在本文中作为SEQ ID NO:2提供。
在一些方面，本公开提供了一种用于抑制肌纤蛋白(MYOC)的表达的双链核糖核酸(dsRNA)药剂，其中所述dsRNA药剂包括形成双链区的有义链和反义链，其中所述有义链包括核苷酸序列，所述核苷酸序列包括具有人MYOC的编码链的部分的0个、1个、2个或3个错配的至少15个连续核苷酸，并且所述反义链包括核苷酸序列，所述核苷酸序列包括具有人MYOC的非编码链的对应部分的0个、1个、2个或3个错配至少15个连续核苷酸，使得所述有义链与所述反义链中的至少15个连续核苷酸互补。
在一些方面，本公开提供了一种用于抑制MYOC的表达的双链核糖核酸(dsRNA)药剂，其中所述dsRNA药剂包括形成双链区的有义链和反义链，其中所述反义链包括核苷酸序列，所述核苷酸序列包括具有SEQ ID NO:2的核苷酸序列的部分的0个、1个、2个或3个错配的至少15个连续核苷酸，使得所述有义链与所述反义链中的至少15个连续核苷酸互补。
在一些方面，本公开提供了一种用于抑制MYOC的表达的双链核糖核酸(dsRNA)药剂，其中所述dsRNA药剂包括形成双链区的有义链和反义链，其中所述反义链包括核苷酸序列，所述核苷酸序列包括与双链体AD-1565804的反义链核苷酸序列具有0个、1个、2个或3个错配的至少15个连续核苷酸，并且所述有义链包括核苷酸序列，所述核苷酸序列包括与双链体AD-1565804的有义链核苷酸序列具有0个、1个、2个或3个错配的至少15个连续核苷酸。
在一些方面，本公开提供了一种用于抑制MYOC的表达的双链核糖核酸(dsRNA)药剂，其中所述dsRNA药剂包括形成双链区的有义链和反义链，其中所述反义链包括核苷酸序列，所述核苷酸序列包括与双链体AD-1565837的反义链核苷酸序列具有0个、1个、2个或3个错配的至少15个连续核苷酸，并且所述有义链包括核苷酸序列，所述核苷酸序列包括与双链体AD-1565837的有义链核苷酸序列具有0个、1个、2个或3个错配的至少15个连续核苷酸。
在一些方面，本公开提供了一种人细胞或组织，与其它类似的未经处理的细胞或组织相比，所述人细胞或组织包括降低水平的MYOC mRNA或一定水平的MYOC蛋白，其中任选地所述细胞或组织不是基因工程化的(例如，其中所述细胞和组织包括一个或多个天然产生的突变，例如，MYOC突变)，其中任选地，所述水平降低至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。在一些实施例中，所述人细胞或组织是小梁网组织、睫状体、视网膜色素上皮(RPE)、视网膜组织、星形胶质细胞、周细胞、缪氏细胞(Müller cell)、神经节细胞、内皮细胞、光感受器细胞、视网膜血管(例如，包含内皮细胞和血管平滑肌细胞)或脉络膜组织，例如，脉络膜血管。
在一些方面，本公开还提供了含有本文所描述的dsRNA药剂的细胞。
另一方面，本文提供了人眼细胞，例如(小梁网的细胞、睫状体的细胞、RPE细胞、视网膜细胞、星形胶质细胞、周细胞、缪氏细胞、神经节细胞、内皮细胞或光感受器细胞)，与其它类似的未经处理的细胞相比，所述人眼细胞包括降低水平的MYOC mRNA或一定水平的MYOC蛋白。在一些实施例中，所述水平降低至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。
在一些方面，本公开还提供了一种用于抑制编码MYOC的基因的表达的药物组合物，所述药物组合物包括本文所描述的dsRNA药剂。
在一些方面，本公开还提供了一种抑制细胞中的MYOC的表达的方法，所述方法包括：
(a)使所述细胞与本文所描述的dsRNA药剂或本文所描述的药物组合物接触；以及
(b)将在步骤(a)中产生的细胞维持足以使MYOC的所述mRNA转录物降解的时间，由此抑制所述细胞中的所述MYOC的表达。
在一些方面，本公开还提供了一种抑制细胞中的MYOC的表达的方法，所述方法包括：
(a)使所述细胞与本文所描述的dsRNA药剂或本文所描述的药物组合物接触；以及
(b)将在步骤(a)中产生的细胞维持足以降低MYOC mRNA、MYOC蛋白或MYOC mRNA和蛋白两者的水平的时间，由此抑制所述MYOC在所述细胞中的表达。
在一些方面，本公开还提供了一种抑制眼细胞或组织中的MYOC的表达的方法，所述方法包括：
(a)使所述细胞或组织和与MYOC结合的dsRNA药剂接触；以及
(b)将在步骤(a)中产生的细胞或组织维持足以降低MYOC mRNA、MYOC蛋白或MYOCmRNA和蛋白两者的水平的时间，由此抑制MYOC在所述细胞或组织中的表达。
在一些方面，本公开还提供了一种治疗被诊断患有MYOC相关病症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本文所描述的dsRNA药剂或本文所描述的药物组合物，由此治疗所述病症。
在本文的任何方面，例如，上述组合物和方法中，本文的实施例中的任一个(例如，以下)都可以应用。
在一些实施例中，人MYOC的编码链具有SEQ ID NO:1的序列。在一些实施例中，人MYOC的非编码链具有SEQ ID NO:2的序列。
在一些实施例中，所述有义链包括核苷酸序列，所述核苷酸序列包括具有SEQ IDNO:1的核苷酸序列的对应部分的0个或1个、2个或3个错配的至少15个连续核苷酸。
在一些实施例中，所述dsRNA药剂包括有义链和反义链，其中所述反义链包括核苷酸序列，所述核苷酸序列包括具有SEQ ID NO:2的核苷酸序列的部分的0个、1个、2个或3个错配的至少17个连续核苷酸，使得所述有义链与所述反义链中的至少17个连续核苷酸互补。在一些实施例中，所述有义链包括核苷酸序列，所述核苷酸序列包括具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列的对应部分的0个或1个、2个或3个错配的至少17个连续核苷酸。
在一些实施例中，所述dsRNA药剂包括有义链和反义链，其中所述反义链包括核苷酸序列，所述核苷酸序列包括具有SEQ ID NO:2的核苷酸序列的部分的0个、1个、2个或3个错配的至少19个连续核苷酸，使得所述有义链与所述反义链中的至少19个连续核苷酸互补。在一些实施例中，所述有义链包括核苷酸序列，所述核苷酸序列包括具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列的对应部分的0个、1个、2个或3个错配的至少19个连续核苷酸。
在一些实施例中，所述dsRNA药剂包括有义链和反义链，其中所述反义链包括核苷酸序列，所述核苷酸序列包括具有SEQ ID NO:2的核苷酸序列的部分的0个、1个、2个或3个错配的至少21个连续核苷酸，使得所述有义链与所述反义链中的至少21个连续核苷酸互补。在一些实施例中，所述有义链包括核苷酸序列，所述核苷酸序列包括具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列的对应部分的0个或1个、2个或3个错配的至少21个连续核苷酸。
在一些实施例中，所述有义链的部分是表2A和2B中的任一个中的有义链内的部分。
在一些实施例中，所述反义链的部分是表2A和2B中的任一个中的反义链内的部分。
在一些实施例中，所述反义链包括核苷酸序列，所述核苷酸序列包括与表2A和2B中的任一个中所列出的反义序列中的一个反义序列具有0个、1个、2个或3个错配的至少15个连续核苷酸。在一些实施例中，所述有义链包括核苷酸序列，所述核苷酸序列包括与表2A和2B中的任一个中所列出的与所述反义序列对应的有义序列具有0个、1个、2个或3个错配的至少15个连续核苷酸。
在一些实施例中，所述反义链包括核苷酸序列，所述核苷酸序列包括与表2A和2B中的任一个中所列出的反义序列中的一个反义序列具有0个、1个、2个或3个错配的至少17个连续核苷酸。在一些实施例中，所述有义链包括核苷酸序列，所述核苷酸序列包括与表2A和2B中的任一个中所列出的与所述反义序列对应的有义序列具有0个、1个、2个或3个错配的至少17个连续核苷酸。
在一些实施例中，所述反义链包括核苷酸序列，所述核苷酸序列包括与表2A和2B中的任一个中所列出的反义序列中的一个反义序列具有0个、1个、2个或3个错配的至少19个连续核苷酸。在一些实施例中，所述有义链包括核苷酸序列，所述核苷酸序列包括与表2A和2B中的任一个中所列出的与所述反义序列对应的有义序列具有0个、1个、2个或3个错配的至少19个连续核苷酸。
在一些实施例中，所述反义链包括核苷酸序列，所述核苷酸序列包括与表2A和2B中的任一个中所列出的反义序列中的一个反义序列具有0个、1个、2个或3个错配的至少21个连续核苷酸。在一些实施例中，所述有义链包括核苷酸序列，所述核苷酸序列包括与表2A和2B中的任一个中所列出的与所述反义序列对应的有义序列具有0个、1个、2个或3个错配的至少21个连续核苷酸。
在一些实施例中，所述dsRNA药剂的所述有义链的长度为至少23个核苷酸，例如，长度为23个至30个核苷酸。
在一些实施例中，所述有义链和所述反义链中的至少一个与一个或多个亲脂性部分缀合。在一些实施例中，所述亲脂性部分与所述dsRNA药剂的所述双链区中的一个或多个位置缀合。在一些实施例中，所述亲脂性部分通过接头或载剂缀合。在一些实施例中，所述亲脂性部分的通过logKow测量的亲脂性超过0。
在一些实施例中，通过双链RNAi药剂的血浆蛋白结合测定中的未结合级分测量的所述双链RNAi药剂的疏水性独立地超过0.2。在一些实施例中，所述血浆蛋白结合测定是使用人血清白蛋白的电泳迁移率偏移测定。
在一些实施例中，所述dsRNA药剂包括至少一个经修饰的核苷酸。在一些实施例中，不超过五个有义链核苷酸和不超过五个所述反义链的核苷酸是未经修饰的核苷酸。在一些实施例中，所述有义链的所有核苷酸和所述反义链的所有核苷酸包括修饰。
在一些实施例中，经修饰的核苷酸中的至少一个经修饰的核苷酸选自由以下组成的组：脱氧核苷酸、3'末端脱氧胸腺嘧啶(dT)核苷酸、2'-O-甲基修饰的核苷酸、2'-氟修饰的核苷酸、2'-脱氧修饰的核苷酸、锁定核苷酸、解锁核苷酸、构象限制性核苷酸、约束乙基核苷酸、无碱基核苷酸、2'-氨基修饰的核苷酸、2'-O-烯丙基修饰的核苷酸、2'-C-烷基修饰的核苷酸、2'-甲氧基乙基修饰的核苷酸、2'-O-烷基修饰的核苷酸、吗啉代核苷酸、氨基磷酸酯、包括核苷酸的非天然碱基、四氢吡喃修饰的核苷酸、1,5-脱水己糖醇修饰的核苷酸、环己烯基修饰的核苷酸、包括硫代磷酸酯基的核苷酸、包括甲基膦酸酯基的核苷酸、包括5'-磷酸酯的核苷酸、包括5'-磷酸酯模拟物的核苷酸、乙二醇修饰的核苷酸和2'-O-(N-甲基乙酰胺)修饰的核苷酸；以及其组合。在一些实施例中，不超过五个所述有义链核苷酸和不超过五个所述反义链的核苷酸包含除2'-O-甲基修饰的核苷酸、2'-氟修饰的核苷酸、2'-脱氧修饰的核苷酸、解锁核酸(UNA)或甘油核酸(GNA)以外的修饰。
在一些实施例中，所述dsRNA包括位于所述有义链的两个连续核苷酸之间或所述反义链的两个连续核苷酸之间的非核苷酸间隔子(其中任选地，所述非核苷酸间隔子包括C3-C6烷基)。
在一些实施例中，每条链的长度不超过30个核苷酸。在一些实施例中，至少一条链包括至少1个核苷酸的3'突出端。在一些实施例中，至少一条链包括至少2个核苷酸的3'突出端。在一些实施例中，至少一条链包括2个核苷酸的3'突出端。
在一些实施例中，所述双链区的长度为15个至30个核苷酸对。在一些实施例中，所述双链区的长度为17个至23个核苷酸对。在一些实施例中，所述双链区的长度为17个至25个核苷酸对。在一些实施例中，所述双链区的长度为23个至27个核苷酸对。在一些实施例中，所述双链区的长度为19个至21个核苷酸对。在一些实施例中，所述双链区的长度为21个至23个核苷酸对。在一些实施例中，每条链具有19个至30个核苷酸。在一些实施例中，每条链具有19个至23个核苷酸。在一些实施例中，每条链具有21个至23个核苷酸。
在一些实施例中，所述药剂包括至少一个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键。在一些实施例中，所述硫代磷酸酯或甲基膦酸酯的核苷酸间键位于一条链的3'末端处。在一些实施例中，所述链是所述反义链。在一些实施例中，所述链是所述有义链。
在一些实施例中，所述硫代磷酸酯或甲基膦酸酯的核苷酸间键位于一条链的5'末端处。在一些实施例中，所述链是所述反义链。在一些实施例中，所述链是所述有义链。
在一些实施例中，一条链的5'和3'末端中的每一个都包括硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键。在一些实施例中，所述链是所述反义链。
在一些实施例中，在所述双链体的所述反义链的5'端的1位置处的碱基对是AU碱基对。
在一些实施例中，所述有义链具有总计21个核苷酸，并且所述反义链具有总计23个核苷酸。
在一些实施例中，一个或多个亲脂性部分与至少一条链上的一个或多个内部位置缀合。在一些实施例中，所述一个或多个亲脂性部分通过接头或载剂与至少一条链上的一个或多个内部位置缀合。
在一些实施例中，所述内部位置包含除了距离所述至少一条链的每一端的末端两个位置以外的所有位置。在一些实施例中，所述内部位置包含除了距离所述至少一条链的每一端的末端三个位置以外的所有位置。在一些实施例中，所述内部位置不包括所述有义链的切割位点区。在一些实施例中，所述内部位置包含从所述有义链的5'端开始计数的除位置9至12以外的所有位置。在一些实施例中，所述内部位置包含从所述有义链的3'端开始计数的除位置11至13以外的所有位置。在一些实施例中，所述内部位置不包括所述反义链的切割位点区。在一些实施例中，所述内部位置包含从所述反义链的5'端开始计数的除位置12至14以外的所有位置。在一些实施例中，所述内部位置包含从3'端开始计数的除所述有义链上的位置11至13以外和从5'端开始计数的除所述反义链上的位置12至14以外的所有位置。
在一些实施例中，所述一个或多个亲脂性部分与一个或多个所述内部位置缀合，所述一个或多个所述内部位置选自由以下组成的组：从每条链的5'端开始计数的所述有义链上的位置4至8和13至18，以及所述反义链上的位置6至10和15至18。在一些实施例中，所述一个或多个亲脂性部分与一个或多个所述内部位置缀合，所述一个或多个所述内部位置选自由以下组成的组：从每条链的5'端开始计数的所述有义链上的位置5、6、7、15和17，以及所述反义链上的位置15和17。
在一些实施例中，所述双链区中的所述位置不包括所述有义链的切割位点区。
在一些实施例中，所述有义链的长度为21个核苷酸，所述反义链的长度为23个核苷酸，并且所述亲脂性部分与所述有义链的位置21、位置20、位置15、位置1、位置7、位置6或位置2或所述反义链的位置16缀合。在一些实施例中，所述亲脂性部分与所述有义链的位置21、位置20、位置15、位置1或位置7缀合。在一些实施例中，所述亲脂性部分与所述有义链的位置21、位置20或位置15缀合。在一些实施例中，所述亲脂性部分与所述有义链的位置20或位置15缀合。在一些实施例中，所述亲脂性部分与所述反义链的位置16缀合。在一些实施例中，所述亲脂性部分与从所述有义链的5'端计数的位置6缀合。
在一些实施例中，所述亲脂性部分是脂肪族、脂环族或聚脂环族化合物。在一些实施例中，所述亲脂性部分选自由以下组成的组：脂质、胆固醇、视黄酸、胆酸、金刚烷乙酸、1-芘丁酸、二氢睾酮、1,3-双-O(十六烷基)甘油、香叶基氧基己醇、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基、棕榈酸、肉豆蔻酸、O3-(油酰基)石胆酸、O3-(油酰基)胆烯酸、二甲氧基三苯甲基或吩噁嗪。在一些实施例中，所述亲脂性部分含有饱和或不饱和C4-C30烃链，以及选自由以下组成的组的任选的官能团：羟基、胺、羧酸、磺酸酯、磷酸酯、硫醇、叠氮化物和炔烃。在一些实施例中，所述亲脂性部分含有饱和或不饱和C6-C18烃链。在一些实施例中，所述亲脂性部分含有饱和或不饱和C16烃链。
在一些实施例中，所述亲脂性部分通过置换所述内部位置或所述双链区中的一个或多个核苷酸的载剂缀合。在一些实施例中，所述载剂是选自由以下组成的组的环状基团：吡咯烷基、吡唑啉基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、哌啶基、哌嗪基、[1,3]二氧戊环基、噁唑烷基、异噁唑烷基、吗啉基、噻唑烷基、异噻唑烷基、喹喔啉基、哒嗪酮基、四氢呋喃基和十氢萘基；或是基于丝氨醇主链或二乙醇胺主链的无环部分。
在一些实施例中，所述亲脂性部分通过含有醚、硫醚、脲、碳酸盐、胺、酰胺、马来酰亚胺-硫醚、二硫化物、磷酸二酯、磺酰胺键、点击反应的产物或氨基甲酸酯的接头与双链iRNA药剂缀合。
在一些实施例中，所述亲脂性部分与核碱基、糖部分或核苷间键缀合。
在一些实施例中，所述亲脂性部分或靶向配体通过选自由以下组成的组的生物可切割接头缀合：DNA、RNA、二硫化物、酰胺、半乳糖胺的官能化单糖或寡糖、葡糖胺、葡萄糖、半乳糖、甘露糖以及其组合。
在一些实施例中，所述有义链的3'端通过端盖保护，所述端盖是具有胺的环状基团，所述环状基团选自由以下组成的组：吡咯烷基、吡唑啉基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、哌啶基、哌嗪基、[1,3]二氧戊环、噁唑烷基、异噁唑烷基、吗啉基、噻唑烷基、异噻唑烷基、喹喔啉基、哒嗪壬基、四氢呋喃基和十氢萘基。
在一些实施例中，所述dsRNA药剂进一步包括靶向配体，例如，靶向眼组织或肝组织的配体。在一些实施例中，所述眼组织是小梁网组织、睫状体、视网膜组织、视网膜色素上皮(RPE)或脉络膜组织，例如，脉络膜血管。
在一些实施例中，所述配体与所述有义链缀合。在一些实施例中，所述配体与所述有义链的3'端或5'端缀合。在一些实施例中，所述配体与所述有义链的3'端缀合。
在一些实施例中，所述配体包括N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)。在一些实施例中，所述靶向配体包括一种或多种GalNAc缀合物或一种或多种GalNAc衍生物。在一些实施例中，所述配体是通过单价接头或二价、三价或四价支链接头连接的一种或多种GalNAc缀合物或一种或多种GalNAc衍生物。在一些实施例中，所述配体是
在一些实施例中，所述dsRNA药剂与所述配体缀合，如以下示意图所示
其中X是O或S。在一些实施例中，所述X是O。
在一些实施例中，所述dsRNA药剂进一步包括发生在所述反义链的3'端处的第一核苷酸间键处，具有呈Sp构型的键磷原子的末端手性修饰；发生在所述反义链的5'端处的第一核苷酸间键处，具有呈Rp构型的键磷原子的末端手性修饰；以及发生在所述有义链的5'端处的第一核苷酸间键处，具有呈Rp构型或Sp构型的键磷原子的末端手性修饰。
在一些实施例中，所述dsRNA药剂进一步包括发生在所述反义链的3'端处的第一核苷酸间键和第二核苷酸间键处，具有呈Sp构型的键磷原子的末端手性修饰；发生在所述反义链的5'端处的第一核苷酸间键处，具有呈Rp构型的键磷原子的末端手性修饰；以及发生在所述有义链的5'端处的第一核苷酸间键处，具有呈Rp或Sp构型的键磷原子的末端手性修饰。
在一些实施例中，所述dsRNA药剂进一步包括发生在所述反义链的3'端处的第一核苷酸间键、第二核苷酸间键和第三核苷酸间键处，具有呈Sp构型的键磷原子的末端手性修饰；发生在所述反义链的5'端处的第一核苷酸间键处，具有呈Rp构型的键磷原子的末端手性修饰；以及发生在所述有义链的5'端处的第一核苷酸间键处，具有呈Rp或Sp构型的键磷原子的末端手性修饰。
在一些实施例中，所述dsRNA药剂进一步包括发生在所述反义链的3'端处的第一核苷酸间键和第二核苷酸间键处，具有呈Sp构型的键磷原子的末端手性修饰；发生在所述反义链的3'端处的第三核苷酸间键处，具有呈Rp构型的键磷原子的末端手性修饰；发生在所述反义链的5'端处的第一核苷酸间键处，具有呈Rp构型的键磷原子的末端手性修饰；以及发生在所述有义链的5'端处的第一核苷酸间键处，具有呈Rp或Sp构型的键磷原子的末端手性修饰。
在一些实施例中，所述dsRNA药剂进一步包括发生在所述反义链的3'端处的第一核苷酸间键和第二核苷酸间键处，具有呈Sp构型的键磷原子的末端手性修饰；发生在所述反义链的5'端处的第一核苷酸间键和第二核苷酸间键处，具有呈Rp构型的键磷原子的末端手性修饰；以及发生在所述有义链的5'端处的第一核苷酸间键处，具有呈Rp或Sp构型的键磷原子的末端手性修饰。
在一些实施例中，所述dsRNA药剂进一步包括在所述反义链的5'端处磷酸酯或磷酸酯模拟物。在一些实施例中，所述磷酸酯模拟物是5'-乙烯基膦酸酯(VP)。
在上述dsRNA药剂的各种实施例中，所述dsRNA药剂靶向编码MYOC的mRNA的热点区。
另一方面，本发明提供了靶向肌纤蛋白(MYOC)mRNA的热点区的dsRNA药剂。
在一些实施例中，本文所描述的细胞，例如人细胞，通过包括使人细胞与本文所描述的dsRNA药剂接触的过程产生。
在一些实施例中，本文所描述的药物组合物包括dsRNA药剂和脂质调配物。
在一些实施例中(例如，本文所描述的方法的实施例)，所述细胞在受试者体内。在一些实施例中，所述受试者是人。在一些实施例中，MYOC mRNA的水平被抑制至少50％。在一些实施例中，MYOC蛋白的水平被抑制至少50％。在一些实施例中，MYOC的表达被抑制至少50％。在一些实施例中，抑制MYOC的表达使来自所述受试者的生物样品(例如，水性眼液样品)中的MYOC蛋白水平降低至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。在一些实施例中，抑制MYOC基因的表达使来自所述受试者的生物样品(例如，水性眼液样品)中的MYOC mRNA水平降低至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。
在一些实施例中，所述受试者已被诊断患有MYOC相关病症。在一些实施例中，所述受试者满足MYOC相关病症的至少一个诊断标准。在一些实施例中，所述MYOC相关病症是青光眼。在一些实施例中，所述MYOC相关病症是原发性开角型青光眼(POAG)。
在一些实施例中，所述眼细胞或组织是小梁网组织、睫状体、RPE、视网膜细胞、星形胶质细胞、周细胞、缪氏细胞、神经节细胞、内皮细胞、光感受器细胞、视网膜血管(例如，包含内皮细胞和血管平滑肌细胞)或脉络膜组织，例如，脉络膜血管。
在一些实施例中，所述MYOC相关病症是青光眼。在一些实施例中，所述青光眼是由升高的眼压引起的或与升高的眼压相关。在一些实施例中，所述青光眼原发性开角型青光眼(POAG)。
在一些实施例中，治疗包括所述病症的至少一种体征或症状的改善。在一些实施例中，所述至少一种体征或症状包含对视神经损伤、视力丧失、管状视力、视力模糊、眼睛疼痛或MYOC(例如，MYOC基因、MYOC mRNA或MYOC蛋白)的存在、水平或活性中的一种或多种的测量。
在一些实施例中，高于参考水平的所述MYOC的水平指示所述受试者患有青光眼。在一些实施例中，治疗包括预防所述病症的进展。在一些实施例中，所述治疗包括以下中的一种或多种：(a)抑制或降低MYOC的表达或活性；(b)降低错误折叠的MYOC蛋白的水平；(c)减少小梁网细胞死亡；(d)降低眼压；或(e)增加视敏度。
在一些实施例中，所述治疗引起所述小梁网组织、睫状体、视网膜、RPE、视网膜血管(例如，包含内皮细胞和血管平滑肌细胞)或脉络膜组织(例如，脉络膜血管)中的MYOCmRNA从基线平均减少至少30％。在一些实施例中，所述治疗引起所述小梁网组织、睫状体、视网膜、RPE、视网膜血管(例如，包含内皮细胞和血管平滑肌细胞)或脉络膜组织(例如，脉络膜血管)中的MYOC mRNA从基线平均减少至少60％。在一些实施例中，所述治疗引起所述小梁网组织、睫状体、视网膜、RPE、视网膜血管(例如，包含内皮细胞和血管平滑肌细胞)或脉络膜组织(例如，脉络膜血管)中的MYOC mRNA从基线平均减少至少90％。
在一些实施例中，在治疗后，所述受试者在单剂量的dsRNA之后经历至少8周的敲低持续时间，如通过所述视网膜中的MYOC蛋白评估的。在一些实施例中，治疗引起在单剂量的dsRNA之后至少12周的敲低持续时间，如通过所述视网膜中的MYOC蛋白评估的。在一些实施例中，治疗引起在单剂量的dsRNA之后至少16周的敲低持续时间，如通过所述视网膜中的MYOC蛋白评估的。
在一些实施例中，所述受试者是人。
在一些实施例中，所述dsRNA药剂以约0.01mg/kg至约50mg/kg的剂量施用。
在一些实施例中，向所述受试者眼内施用所述dsRNA药剂。在一些实施例中，所述眼内施用包括玻璃体内施用，例如玻璃体内注射；经巩膜施用，例如经巩膜注射；结膜下施用，例如结膜下注射；眼球后施用，例如眼球后注射；前房内施用，例如前房内注射，或视网膜下施用，例如视网膜下注射。
在一些实施例中，向所述受试者静脉内施用所述dsRNA药剂。在一些实施例中，向所述受试者局部施用所述dsRNA药剂。
在一些实施例中，本文所描述的方法进一步包括测量所述受试者的MYOC(例如，MYOC基因、MYOC mRNA或MYOC蛋白)的水平。在一些实施例中，测量所述受试者的MYOC的水平包括测量来自所述受试者的生物样品(例如，水性眼液样品)中的MYOC蛋白的水平。在一些实施例中，本文所描述的方法进一步包括进行血液测试、成像测试或水性眼液活检(例如，房水龙头)。
在一些实施例中，本文所描述的进一步测量所述受试者的MYOC(例如，MYOC基因、MYOC mRNA或MYOC蛋白)的水平的方法在用所述dsRNA药剂或所述药物组合物治疗之前进行。在一些实施例中，在确定受试者的MYOC的水平高于参考水平后，向所述受试者施用所述dsRNA药剂或所述药物组合物。在一些实施例中，在用所述dsRNA药剂或所述药物组合物治疗后进行所述受试者的MYOC的水平的测量。
在一些实施例中，本文所描述的方法进一步包括用适合于治疗或预防MYOC相关病症的疗法治疗所述受试者，例如，其中所述疗法包括激光小梁成形术外科手术、小梁切除术外科手术、微创青光眼外科手术或在眼睛中放置引流管。在一些实施例中，本文所描述的方法进一步包括向所述受试者施用适于治疗或预防MYOC相关病症的另外的药剂。在一些实施例中，所述另外的药剂包括碳酸酐酶抑制剂、前列腺素、β阻断剂、α肾上腺素能激动剂、碳酸酐酶抑制剂、ρ激酶抑制剂或胆碱能剂或其任何组合。在一些实施例中，所述另外的药剂包括口服药物或滴眼液。
本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献通过引用整体并入。
附图说明
并入并构成本说明书的一部分的附图展示了本公开的若干特征。
专利或申请文件含有至少一张彩色附图。在请求并支付必要的费用后，官方将提供带有彩色附图的本专利或专利申请公开的副本。
图1A示出了在SAM小鼠中测试人MYOC siRNA AD-822899对眼压(IOP)的影响的实验设置，所述实验设置包括用AAV2.Y3F-SAM-g4处理的包括Y437H突变的人源化MYOC基因座(SAM-MYOC小鼠，每个等位基因纯合)。
图1B示出了包括人源化MYOC基因座的SAM小鼠的眼压(IOP)，所述基因座包括用AAV2.Y3F-SAM-g4处理或什么都不处理的(原初)Y437H突变(SAM-MYOC小鼠，每个等位基因纯合)，其中AAV2.Y3F-SAM-g4处理的小鼠随后用人MYOC siRNA或对照荧光素酶siRNA处理。
图2A示出了在SAM小鼠中测试人MYOC siRNA AD-822899、AD-1565804、AD-1565837、AD-1193175和AD-1565503对眼压(IOP)的影响的实验设置，所述实验设置包括用LV-SAM-g4处理的包括Y437H突变的人源化MYOC基因座(SAM-MYOC小鼠，每个等位基因纯合)。
图2B示出了包括人源化MYOC基因座的SAM小鼠的眼压(IOP)，所述基因座包括用LV-SAM-g4或PBS处理的Y437H突变(SAM-MYOC小鼠，每个等位基因纯合)，其中LV-SAM-g4处理的小鼠随后用人MYOC siRNAAD-822899、AD-1565804、AD-1565837、AD-1193175或AD-1565503处理。
图2C示出了qPCR结果，所述结果示出了在SAM小鼠中人MYOC mRNA表达相对于Gapdh的百分比，所述小鼠包括人源化MYOC基因座，所述基因座包括用LV-SAM-g4或PBS处理的Y437H突变(SAM-MYOC小鼠，每个等位基因纯合)，其中LV-SAM-g4处理的小鼠随后用人MYOC siRNA AD-822899、AD-1565804、AD-1565837、AD-1193175或AD-1565503处理。
图2D示出了对来自SAM小鼠的眼睛中的人MYOC mRNA表达的分析，所述小鼠包括人源化MYOC基因座，所述基因座包括用LV-SAM-g4或PBS处理的Y437H突变(SAM-MYOC小鼠，每个等位基因纯合)，其中LV-SAM-g4处理的小鼠随后用人MYOC siRNAAD-1565804或AD-1565837处理。
图3A示出了在SAM小鼠中测试人MYOC siRNA AD-1565804或AD-1565837对眼压(IOP)的影响的实验设置，所述实验设置包括用LV-SAM-g4处理的包括Y437H突变的人源化MYOC基因座(SAM-MYOC小鼠，每个等位基因纯合)。
图3B示出了包括人源化MYOC基因座的SAM小鼠的眼压(IOP)，所述基因座包括用LV-SAM-g4或PBS处理的Y437H突变(SAM-MYOC小鼠，每个等位基因纯合)，其中LV-SAM-g4处理的小鼠随后用人MYOC siRNAAD-1565804或AD-1565837处理。
图3C示出了qPCR结果，所述结果示出了在SAM小鼠中人MYOC mRNA表达相对于Gapdh的百分比，所述小鼠包括人源化MYOC基因座，所述基因座包括用LV-SAM-g4或PBS处理的Y437H突变(SAM-MYOC小鼠，每个等位基因纯合)，其中LV-SAM-g4处理的小鼠随后用人MYOC siRNA AD-1565804或AD-1565837处理。
图4示出了在非人灵长类动物(NHP)模型中，用AD-1565837双链体或AD-1565804双链体给药后第85天TM中相对于PBS剩余的MYOC蛋白百分比。结果显示了两种不同的MYOC抗体，R&D和Abnova。
图5描绘了在非人灵长类动物(NHP)模型中，用AD-1565837双链体或AD-1565804双链体给药后第-35天、第22天、第50天和第85天，相对于给药前房水中剩余的MYOC蛋白百分比。
图6A示出了在非人灵长类动物(NHP)模型中，用AD-1565837双链体或AD-1565804双链体给药后第85天玻璃体和睫状体中相对于PBS剩余的MYOC蛋白百分比。
图6B示出了在非人灵长类动物(NHP)模型中，用AD-1565837双链体或AD-1565804双链体给药后第85天虹膜和巩膜中相对于PBS剩余的MYOC蛋白百分比。
图7描绘了在非人灵长类动物(NHP)模型中，用AD-1565837双链体或AD-1565804双链体给药后第85天，相对于PBS房水中剩余的MYOC mRNA百分比。
在下文描述中阐述本公开的各种实施例的细节。从描述和图式以及从权利要求书中，本公开的其它特征、目的和优势将是显而易见的。
具体实施方式
iRNA通过一种称为RNA干扰(RNAi)的过程指导mRNA的序列特异性降解。本文描述了iRNA以及使用其用于调节(例如，抑制)MYOC的表达的方法。还提供了用于治疗与MYOC表达相关的病症(如青光眼(例如，原发性开角型青光眼(POAG)))的组合物和方法。
人MYOC是一种大约57kDa的分泌型糖蛋白，调控相邻细胞中的若干条信号传导通路的激活，以控制不同的过程，包含细胞粘附、细胞基质粘附、细胞骨架组织和细胞迁移。MYOC通常由各种组织表达和分泌，包含视网膜和参与房水调控的结构，如小梁网组织和睫状体。异常MYOC与青光眼向关，例如原发性开角型青光眼(POAG)。不希望受理论束缚，异常MYOC可能会加剧青光眼的发病机制，例如，通过阻碍房水的引流，从而导致增加的眼压。
以下描述公开了如何制备和使用含有iRNA的组合物来调节(例如，抑制)MYOC的表达，以及用于治疗与MYOC的表达相关的病症的组合物和方法。
在一些方面，本文提出了含有MYOC iRNA和药学上可接受的载剂的药物组合物、使用所述组合物抑制MYOC的表达的方法以及使用所述药物组合物治疗与MYOC的表达相关的病症(例如，青光眼，例如，原发性开角型青光眼(POAG))的方法。
I.定义
为了方便起见，以下提供了在本说明书、实例以及所附权利要求书中使用的某些术语与短语的意义。如果本说明书的其它部分中的术语使用与本部分中提供的其定义之间存在明显差异，则应以本部分中的定义为准。
当提及数字或数值范围时，术语“约”意指所提及的数字或数值范围是在实验可变性内(或在统计实验误差内)的近似值，并且因此数字或数值范围可以例如在所述数字或数值范围的1％与15％之间变化。
一个数或一系列数之前的术语“或更多”和“至少”应理解为包含与术语“至少”相邻的数，以及逻辑上可以包含的所有后续数或整数，如从上下文中可以清楚地看出的。例如，核酸分子中的核苷酸数量必须是整数。例如，“20个核苷酸的核酸分子中的至少17个核苷酸”意指17个、18个、19个或20个核苷酸具有所指示的特性。当“至少”出现在一系列数字或范围之前时，应当理解，“至少”可以修饰所述系列或范围中的数字中的每个数字。
如本文所使用的，“或更少”和“不超过”被理解为包含与短语相邻的值和逻辑较低的值或整数，从上下文来看是逻辑的到零。例如，具有与“不超过2个核苷酸”的靶位点的错配的双链体具有2个、1个或0个错配。当“不超过”出现在一系列数字或范围之前时，应当理解，“不超过”可以修饰所述系列或范围中的数字中的每个数字。
如本文所使用的，“少于”被理解不包含与短语相邻的值并且包含逻辑较低的值或整数，从上下文来看是逻辑的到零。例如，具有与“少于3个核苷酸”的靶位点的错配的双链体具有2个、1个或0个错配。当“少于”出现在一系列数字或范围之前时，应当理解，“少于”可以修饰所述系列或范围中的数字中的每个数字。
如本文所使用的，“多于”被理解为不包含与短语相邻的值并且包含逻辑较高的值或整数，从上下文来看是逻辑的到无穷大。例如，具有与“多于3个核苷酸”的靶位点的错配的双链体具有4个、5个、6个或更多个错配。当“多于”出现在一系列数字或范围之前时，应当理解，“多于”可以修饰所述系列或范围中的数字中的每个数字。
如本文所使用的，如“至多10”中的“至多”被理解为至多并包含10，即，0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
本文所提供的范围被理解为包含所有单个整数值和范围内的所有子范围。
术语“激活”、“增强”、“上调...的表达”、“增加...的表达”等，只要其指的是MYOC基因，本文中就是指MYOC基因表达的至少部分激活，表现为MYOC mRNA的量增加，所述MYOCmRNA可以从转录MYOC基因的第一细胞或细胞组中分离或检测到，并且已经或已被处理，使得与第二细胞或细胞组相比，MYOC基因的表达增加，所述第二细胞或细胞组与第一细胞或细胞组基本上相同但已经或未被如此处理(对照细胞)。
在一些实施例中，通过施用如本文所描述的iRNA，MYOC基因的表达被激活至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％。在一些实施例中，通过施用本公开中所提出的iRNA，MYOC基因被激活至少约60％、70％或80％。在一些实施例中，通过施用如本文所描述的iRNA，MYOC基因的表达被激活至少约85％、90％或95％或更多。在一些实施例中，与未经处理的细胞中的表达相比，用本文所描述的iRNA处理的细胞中的MYOC基因表达增加至少1倍、至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少50倍、至少100倍、至少500倍、至少1000倍或更多。小dsRNA对表达的激活在例如以下中进行了描述：Li等人,2006《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)》103:17337-42以及US2007/0111963和US2005/226848，所述文献中的每一个通过引用并入本文。
术语“沉默”、“抑制...的表达(inhibit expression of)”、“下调...的表达”、“抑制...的表达(suppress expression of)”等，就其所指的MYOC而言，本文是指对MYOC表达的至少部分抑制，如例如基于MYOC mRNA表达、MYOC蛋白表达或与MYOC表达功能相关的另一个参数所评估的。例如，与对照相比，MYOC表达的抑制可以通过MYOC mRNA的量的减少来表现，所述MYOC mRNA可以从转录MYOC的第一细胞或细胞组中分离或检测到，并且已经或已被处理使得MYOC的表达被抑制。对照可以是基本上与第一细胞或细胞组相同的第二细胞或细胞组，除了第二细胞或细胞组没有被如此处理(对照细胞)。抑制的程度通常表示为对照水平的百分比，例如，
可替代地，抑制的程度可以根据与MYOC表达功能相关的参数的减少来给出，例如，由MYOC基因编码的蛋白质的量。与MYOC表达功能相关的参数的减少可以类似地表示为对照水平的百分比。原则上，MYOC沉默可以在任何表达MYOC的细胞中确定，无论是组成型还是通过基因组工程化，以及通过任何适当的测定。
例如，在某些情况下，通过施用本文所公开的iRNA，MYOC的表达被抑制至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％。在一些实施例中，通过施用本文所公开的iRNA，MYOC被抑制至少约60％、65％、70％、75％或80％。在一些实施例中，通过施用本文所描述的iRNA，MYOC被抑制至少约85％、90％、95％、98％、99％或更多。
术语“反义链”或“引导链”是指iRNA的链，例如dsRNA，其包含与靶序列基本上互补的区。
如本文所使用的，术语“互补区”是指反义链上与如本文所定义的序列(例如，靶序列)基本上互补的区。在互补区与靶序列不完全互补的情况下，错配可以位于分子的内部或末端区中。在一些实施例中，互补区包括0个、1个或2个错配。
如本文所使用的，术语“有义链”或“随从链”是指包含与如本文所定义的术语的反义链的区基本上互补的区的iRNA链。
如本文所使用的，关于dsRNA的术语“平端”或“平末端”是指在dsRNA的给定末端处没有未配对的核苷酸或核苷酸类似物，即没有核苷酸突出端。dsRNA的一端或两端可以是平端的。当dsRNA的两端都是平端的时，所述dsRNA被称为“平末端”。为了清楚起见，“平末端”dsRNA是两端均为平端的dsRNA，即在分子的任一端处都没有核苷酸突出端。最常见的此类分子将在其整个长度上是双链的。
如本文所使用的，并且除非另外指明，否则术语“互补”当用于相对于第二核苷酸序列描述第一核苷酸序列时是指包括第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在某些条件下与包括第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸杂交并且形成双链体结构的能力，如技术人员将理解的。例如，此类条件可以是严格条件，其中严格条件可以包含：400mM NaCl，40mMPIPES，pH 6.4，1mM EDTA，50℃或70℃，持续12小时至16小时，然后洗涤。可以应用其它条件，如生物体内部可能遇到的生理学上相关的条件。技术人员将能够根据杂交核苷酸的最终应用确定最适合于两个序列的互补性测试的条件集。
iRNA内(例如，如本文所描述的dsRNA内)的互补序列包含包括第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸与包括第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在一个或两个核苷酸序列的全长上的碱基配对。此类序列在本文中可以被称为彼此“完全互补”。然而，当第一序列在本文中被称为相对于第二序列“基本互补”时，这两个序列可以是完全互补的，或其可以形成一个或多个，但通常不超过5个、4个、3个或2个杂交后错配的碱基对用于至多30个碱基对的双链体，同时保留在与其最终应用最相关的条件下杂交的能力，例如通过RISC通路抑制基因表达。然而，在两个寡核苷酸被设计以在杂交时形成一个或多个单链突出端的情况下，此类突出端不应视为相对于互补性的确定的错配。例如，包括一个长度为21个核苷酸的寡核苷酸和另一个长度为23个核苷酸的寡核苷酸的dsRNA，其中较长的寡核苷酸包括与较短的寡核苷酸完全互补的21个核苷酸的序列，仍可以被称为出于本文所描述的目的“完全互补”。
如本文所使用的，“互补”序列还可以包含非沃森-克里克碱基对(non-Watson-Crick base pair)和/或由非天然和经修饰的核苷酸形成的碱基对，或完全由其形成，只要满足关于其杂交能力的以上要求即可。此类非沃森-克里克碱基对包含但不限于G:U摆动碱基配对或胡斯坦碱基配对(Hoogstein base pairing)。
本文中的术语“互补”、“完全互补”和“基本互补”可以相对于dsRNA的有义链和反义链之间或iRNA药剂的反义链与靶序列之间的碱基匹配使用，如根据其使用的上下文所理解的。
如本文所使用的，与信使RNA(mRNA)的“至少部分基本上互补”的多核苷酸是指与所关注的mRNA(例如，编码MYOC蛋白的mRNA)的连续部分基本上互补的多核苷酸。例如，如果序列与编码MYOC的mRNA的不间断部分基本互补，则多核苷酸与MYOC mRNA的至少一部分互补。术语“互补”是指第一核酸与第二核酸的核碱基之间的配对能力。
如本文所使用的，术语“互补区”是指与另一序列基本上互补的一个核苷酸序列药剂的区，例如，dsRNA的有义序列和对应的反义序列的区，或iRNA的反义链和靶序列，例如，MYOC核苷酸序列，如本文所定义的。在互补区与靶序列不完全互补的情况下，错配可以位于iRNA的反义链的内部或末端区中。通常，最可容忍的错配在末端区中，例如，在iRNA药剂的5'或3'末端的5个、4个、3个或2个核苷酸内。
如本文所使用的，“接触”包含直接接触细胞以及间接接触细胞。例如，当向受试者施用(例如，眼内、局部或静脉内)包括iRNA的组合物时，可以接触受试者体内的细胞。
当提及iRNA时，“引入到细胞中”意指促进或影响摄入或吸收到细胞中。iRNA的吸收或摄取可以通过无辅助的扩散或活性细胞过程发生，或通过辅助剂或装置发生。此术语的含义不仅限于体外细胞；iRNA也可以“引入到细胞中”，其中细胞是活生物体的一部分。在这种情况下，引入到细胞中将包含递送到生物体。例如，对于体内递送，可以将iRNA注射到组织部位中或全身施用。体内递送也可以通过β-葡聚糖递送系统进行，如美国专利第5,032,401号和第5,607,677号以及美国公开第2005/0281781号中所描述的那些，所述文献特此通过全文引用的方式并入本文。体外引入细胞包含本领域已知的方法，如电穿孔和脂质转染。另外的方法在下文中描述或在本领域中是已知的。如本文所使用的，“与MYOC表达相关的病症”、“与MYOC表达相关的疾病”、“与MYOC表达相关的病理过程”、“MYOC相关的病症”、“MYOC相关疾病”等包含其中MYOC表达改变的任何病状、病症或疾病(例如，相对于参考水平，例如，非患病受试者的水平特征减少或增加)。在一些实施例中，MYOC表达减少。在一些实施例中，MYOC表达增加。在一些实施例中，MYOC表达的减少或增加在来自受试者的组织样品中(例如，在水性眼液样品中)是可检测的。可以相对于在病症发展之前在同一个体中观察到的水平或相对于未患有病症的其它个体来评估减少或增加。减少或增加可能仅限于身体的特定器官、组织或区(例如，眼睛)。MYOC相关病症包含但不限于青光眼(例如，原发性开角型青光眼(POAG))。
如本文所使用的，术语“青光眼”意指由视神经损伤引起或与之相关的任何眼部疾病。在一些实施例中，青光眼与升高的眼压相关。在一些实施例中，青光眼是无症状的。在其它实施例中，青光眼具有一种或多种症状，例如周边视力丧失、管状视力或盲点。可使用本文所提供的方法治疗的青光眼的非限制性实例是原发性开角型青光眼(POAG)。
如本文所使用的，术语“双链RNA”、“dsRNA”或“siRNA”是指包含具有杂交双链体区的RNA分子或分子复合物的iRNA，所述杂交双链体区包括两条反平行且基本上互补的核酸链，所述核酸链将被称为具有相对于靶RNA的“有义”和“反义”朝向。双链体区可以具有任何允许例如通过RISC通路特异性降解所需的靶RNA的长度，但通常长度范围将为9至36个碱基对，例如长度为15个至30个碱基对。考虑到介于9个与36个碱基对之间的双链体，所述双链体可以具有在此范围内的任何长度，例如9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个或36个以及其之间的任何子范围，包含但不限于15个至30个碱基对，15个至26个碱基对、15个至23个碱基对、15个至22个碱基对、15个至21个碱基对、15个至20个碱基对、15个至19个碱基对、15个至18个碱基对、15个至17个碱基对、18个至30个碱基对、18个至26个碱基对、18个至23个碱基对、18个至22个碱基对、18个至21个碱基对、18个至20个碱基对、19个至30个碱基对、19个至26个碱基对、19个至23个碱基对、19个至22个碱基对、19个至21个碱基对、19个至20个碱基对、20个至30个碱基对、20个至26个碱基对、20个至25个碱基对、20个至24个碱基对、20个至23个碱基对、20个至22个碱基对、20个至21个碱基对、21个至30个碱基对、21个至26个碱基对、21个至25个碱基对、21个至24个碱基对、21个至23个碱基对和21个至22个碱基对。通过用Dicer和类似酶处理在细胞中产生的dsRNA的长度通常在19个至22个碱基对的范围内。dsDNA的双链体区的一条链包括与靶RNA的区基本上互补的序列。形成双链体结构的两条链可以来自具有至少一个自身互补区的单一RNA分子，或可以由两个或更多个单独的RNA分子形成。当双链体区由单个分子的两条链形成时，所述分子可以具有由介于一条链的3'端与形成双链体结构的相应另一条链的5'端之间的单链核苷酸链(本文中被称为“发夹环”)分隔的双链体区。发夹环可以包括至少一个未配对核苷酸；在一些实施例中，发夹环可以包括至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少20个、至少23个或更多个未配对核苷酸。在dsRNA的两条基本上互补的链包括单独的RNA分子的情况下，那些分子不必但可以共价连接。在一些实施例中，当两条链通过除发夹环以外的方式共价连接时，并且连接结构是接头。
在一些实施例中，iRNA药剂可以是“单链siRNA”，其被引入细胞或生物体中以抑制靶mRNA。在一些实施例中，单链RNAi药剂可以与RISC核酸内切酶Argonaute 2结合，然后所述核酸内切酶切割靶mRNA。单链siRNA通常为15个至30个核苷酸，并且任选地经过化学修饰。单链siRNA的设计和测试在美国专利第8,101,348号和Lima等人,(2012)《细胞(Cell)》150:883-894中进行了描述，所述文献中每一个的全部内容特此通过引用并入本文。本文中所描述的反义核苷酸序列(例如，表2A或2B中所提供的序列)中的任一个可以用作本文所描述的单链siRNA，并且任选地用作化学修饰的，例如，如本文所描述的，例如，通过Lima等人,(2012)《细胞》150:883-894中所描述的方法。
在一些实施例中，RNA干扰剂包含单链RNA，所述单链RNA与靶RNA序列相互作用以引导靶RNA的切割。不希望受理论束缚，引入细胞中的长双链RNA被称为Dicer的III型核酸内切酶分解为siRNA(Sharp等人,《基因与发育(Genes Dev.)》2001,15:485)。Dicer，即核糖核酸酶-III样酶使用特性两个碱基3'突出端将dsRNA加工成19个至23个碱基对短干扰RNA(Bernstein等人,(2001)《自然(Nature)》409:363)。然后将siRNA掺入到RNA诱导的沉默复合物(RISC)中，其中一种或多种解旋酶解开siRNA双链体，从而使互补的反义链能够指导靶识别(Nykanen等人,(2001)《细胞》107:309)。在与适当的靶mRNA结合后，RISC内的一种或多种核酸内切酶切割靶以诱导沉默(Elbashir等人,(2001)《基因与发育》15:188)。因此，在一些实施例中，本公开涉及单链RNA，所述单链RNA促进RISC复合物的形成以影响靶基因的沉默。
“G”、“C”、“A”、“T”和“U”通常分别代表含有鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶作为碱基的核苷酸。然而，可以理解的是，术语“脱氧核糖核苷酸”、“核糖核苷酸”或“核苷酸”也可以指经修饰的核苷酸，如下文进一步详述的，或替代的替代部分。本领域技术人员清楚地知道，鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶可以被其它部分取代，而不会实质性改变包括含有此类替代部分的核苷酸的寡核苷酸的碱基配对特性。例如但不限于，包括肌苷作为其碱基的核苷酸可以与含有腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶的核苷酸碱基配对。因此，在本公开中所提出的dsRNA的核苷酸序列中，含有尿嘧啶、鸟嘌呤或腺嘌呤的核苷酸可以被含有例如肌苷的核苷酸取代。在另一个实例中，寡核苷酸中任何位置的腺嘌呤和胞嘧啶都可以分别被鸟嘌呤和尿嘧啶取代，以与靶mRNA形成G-U摆动碱基配对。含有此类取代部分的序列适用于公开内容中所提出的组合物和方法。
如本文所使用的，术语“iRNA”、“RNAi”、“iRNA药剂”或“RNAi药剂”或“RNAi分子”是指含有如本文所定义的术语的RNA并且例如通过RNA诱导的沉默复合物(RISC)通路介导RNA转录物的靶向切割的药剂。在一些实施例中，如本文所描述的iRNA影响抑制MYOC表达的抑制，例如，在细胞或哺乳动物中。可以基于MYOC mRNA的水平的降低或MYOC蛋白的水平的降低来评估MYOC表达的抑制。
术语“接头”或“连接基团”意指连接化合物两部分的有机部分，例如，共价连接化合物的两部分。
术语“亲脂性”或“亲脂性部分”广义上是指对脂质具有亲和力的任何化合物或化学部分。用于表征亲脂性部分的亲脂性的一种方法是通过辛醇-水分配系数logKow，其中Kow是处于平衡状态的两相系统的辛醇相中化学品的浓度与其水相中的浓度的比率。辛醇-水分配系数是实验室测量的物质特性。然而，其也可以通过使用归因于化学品的结构组分的系数来预测，所述系数是使用第一原则或经验方法计算的(参见例如，Tetko等人,《化学信息计算科学(J.Chem.Inf.Comput.Sci.)》41:1407-21(2001)，所述文献通过全文引用的方式并入本文)。其提供了物质倾向于非水或油性环境而不是水的热力学测量(即其亲水性/亲脂性平衡)。原则上，当化学物质的logKow超过0时，其为亲脂性的。通常，亲脂性部分具有超过1、超过1.5、超过2、超过3、超过4、超过5或超过10的logKow。例如，6-氨基己醇的logKow被预测为例如大约0.7。使用相同的方法，N-(己-6-醇)氨基甲酸胆固醇酯的logKow预测为10.7。
分子的亲脂性可以根据其携带的官能团而改变。例如，将羟基或胺基添加到亲脂性部分的末端可以增加或降低亲脂性部分的分配系数(例如，logKow)值。
可替代地，与一个或多个亲脂性部分缀合的双链RNAi药剂的疏水性可以通过其蛋白质结合特征来测量。例如，在某些实施例中，双链RNAi药剂的血浆蛋白结合测定中的未结合级分可以被确定为与双链RNAi药剂的相对疏水性正相关，其然后可以与双链RNAi药剂的沉默活性正相关。
在一些实施例中，所确定的血浆蛋白结合测定是使用人血清白蛋白蛋白的电泳迁移率偏移测定(EMSA)。此结合测定的示例性方案在例如PCT/US2019/031170中详细说明。通过结合测定中未结合的siRNA的级分测量的双链RNAi药剂的疏水性，对于siRNA的增强的体内递送而言超过0.15、超过0.2、超过0.25、超过0.3、超过0.35、超过0.4、超过0.45或超过0.5。
因此，将亲脂性部分与双链RNAi药剂的内部位置缀合为siRNA的增强的体内递送提供了最佳的疏水性。
术语“脂质纳米颗粒”或“LNP”是包括脂质层的囊泡，所述脂质层封装药物活性分子，如核酸分子，例如RNAi药剂或从其转录RNAi药剂的质粒。LNP在例如美国专利第6,858,225号、第6,815,432号、第8,158,601号和第8,058,069号中进行了描述，所述美国专利的全部内容特此通过引用并入本文。
如本文所使用的，术语“调节...的表达”是指与对照细胞中的对应基因的表达相比，用本文所描述的iRNA组合物处理的细胞中的基因(例如，MYOC基因)表达的至少部分“抑制”或部分“激活”。对照细胞包含未经处理的细胞或用非靶向对照iRNA处理的细胞。
技术人员将认识到，术语“RNA分子”或“核糖核酸分子”不仅涵盖在自然界中表达或发现的RNA分子，还涵盖包括如本文所述的或本领域已知的一种或多种核糖核苷酸/核糖核苷类似物或衍生物的RNA的类似物和衍生物。严格地说，“核糖核苷”包含核苷碱基和核糖，并且“核糖核苷酸”是具有一个、两个或三个磷酸盐部分或其类似物(例如，硫代磷酸酯)的核糖核苷。然而，术语“核糖核苷”和“核糖核苷酸”可以被认为与如本文所使用的等效。RNA可以在核碱基结构中，在核糖结构中或在核糖-磷酸主链结构中被修饰，例如，如本文下文更详细描述的。然而，包括核糖核苷类似物或衍生物的分子必须保留形成双链体的能力。作为非限制性实例，RNA分子还可以包含至少一种经修饰的核糖核苷，包含但不限于2'-O-甲基修饰的核苷、包括5'硫代磷酸酯基团的核苷、与胆甾醇基衍生物或正十二烷酸双癸酰胺基团连接的末端核苷、锁定核苷、无碱基核苷、无环核苷、乙二醇核苷酸、2'-脱氧-2'-氟代修饰的核苷、2'-氨基修饰的核苷、2'-烷基修饰的核苷、吗啉代核苷、氨基磷酸酯、或包括核苷的非天然碱基或其任何组合。可替代地或组合地，RNA分子可以包括至少两个经修饰的核糖核苷，至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少15个、至少20个或更多个，至多为dsRNA分子的整个长度。对于RNA分子中的此类多个经修饰的核糖核苷中的每一个，修饰不必相同。在一些实施例中，预期在本文所述的方法和组合物中使用的经修饰的RNA是肽核酸(PNA)，所述PNA具有形成所需双链体结构的能力并且允许或介导靶RNA例如通过RISC通路的特异性降解。为了清楚起见，应理解，术语“iRNA”不涵盖天然存在的双链DNA分子或100％含脱氧核苷的DNA分子。
在一些方面，经修饰的核糖核苷包含脱氧核糖核苷。在此类实例中，iRNA药剂可以包括一种或多种脱氧核苷，包含例如脱氧核苷突出端或dsRNA的双链部分内的一种或多种脱氧核苷。在某些实施例中，RNA分子包括至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％的脱氧核糖核苷的百分比或更高的(但不是100％)脱氧核糖核苷的百分比，例如，在一条或两条链中。
如本文所使用的，术语“核苷酸突出端”是指从iRNA(例如，dsRNA)的双链体结构突出的至少一个未配对的核苷酸。例如，当dsRNA的一条链的3'端延伸超过另一条链的5'端时，反之亦然，则存在核苷酸突出端。dsRNA可以包括至少一个核苷酸的突出端；可替代地，突出端可以包括至少两个核苷酸、至少三个核苷酸、至少四个核苷酸或至少五个核苷酸或更多。核苷酸突出端可以包括以下或由以下组成：核苷酸/核苷类似物，包含脱氧核苷酸/核苷。突出端可以在有义链、反义链或其任何组合上。此外，突出端的核苷酸可以存在于dsRNA的反义链或有义链的5'端、3'端或两端上。
在一些实施例中，dsRNA的反义链在3'端和/或5'端处具有1个至10个核苷酸突出端。在一些实施例中，dsRNA的有义链在3'端和/或5'端处具有1个至10个核苷酸突出端。在一些实施例中，突出端中的一个或多个核苷酸被核苷硫代磷酸酯替代。
如本文所使用的，“药物组合物”包括药理学上有效量的治疗剂(例如，iRNA)和药学上可接受的载剂。如本文所使用的，“药理学上有效量”、“治疗有效量”或简而言之的“有效量”是指有效产生预期的药理学、治疗或预防结果的药剂(例如，iRNA)的量。例如，在治疗与MYOC表达相关的病症(例如，青光眼，例如，原发性开角型青光眼(POAG))的方法中，有效量包含对减少与所述病症相关的一种或多种症状有效的量(例如，对以下有效的量：(a)抑制或减少MYOC的表达或活性；(b)降低错误折叠的MYOC蛋白的水平；(c)减少小梁网细胞死亡；(d)降低眼压；或(e)增加视敏度。例如，如果当与疾病或病症相关联的可测量的参数减少至少10％时，给定的临床治疗被认为是有效的，那么用于该疾病或病症的治疗的药物的治疗有效量是使得该参数至少减少10％所必需的量。例如，治疗有效量的靶向MYOC的iRNA可以将MYOC mRNA的水平或MYOC蛋白的水平降低任何可测量的量，例如，至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。
术语“药学上可接受的载剂”是指用于施用治疗剂的载剂。此类载剂包含但不限于盐水、缓冲盐水、右旋糖、水、甘油、乙醇以及其组合。所述术语特别排除细胞培养基。对于口服施用的药物，药学上可接受的载剂包含但不限于药学上可接受的赋形剂，如惰性稀释剂、崩解剂、结合剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂。合适的惰性稀释剂包含碳酸钠和碳酸钙、磷酸钠和磷酸钙以及乳糖，而玉米淀粉和海藻酸是合适的崩解剂。结合剂可以包含淀粉和明胶，而润滑剂(如果存在的话)通常是硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。如果期望，可以用如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯等材料涂覆片剂以延缓在胃肠道中的吸收。包含在药物调配物中的药剂在本文下文中进一步描述。
如本文所使用的，术语“SNALP”是指稳定的核酸-脂质颗粒。SNALP代表包被减少的水性内部的脂质囊泡，所述脂质囊泡包括核酸，如iRNA或转录iRNA的质粒。SNALP在例如美国专利申请公开第2006/0240093号、第2007/0135372号和国际申请第WO 2009/082817号中进行了描述。这些申请通过全文引用的方式并入本文。在一些实施例中，SNALP是SPLP。如本文所使用的，术语“SPLP”是指包括封装在脂质囊泡内的质粒DNA的核酸-脂质颗粒。
如本文所使用的，术语“包括序列的链”是指包括核苷酸链的寡核苷酸，所述核苷酸链通过使用标准核苷酸命名法指代的序列描述。
如本文所使用的，根据本文所描述的方法治疗的“受试者”包含人或非人动物，例如，哺乳动物。哺乳动物可以是例如，啮齿动物(例如，大鼠或小鼠)或灵长类动物(例如，猴子)。在一些实施例中，所述受试者是人。
“有需要的受试者”包含患有、疑似患有与MYOC表达(例如，过表达(例如，青光眼))相关的病症或具有发生所述病症的风险的受试者。在一些实施例中，受试者患有或疑似患有与MYOC表达或过表达相关的病症。在一些实施例中，受试者具有发生与MYOC表达或过表达相关的病症的风险。
如本文所使用的，“靶序列”是指在基因(例如，MYOC)的转录期间形成的mRNA分子的核苷酸序列的连续部分，包含作为初级转录产物的RNA加工产物的mRNA。序列的靶部分将至少足够长以充当在所述部分处或附近进行iRNA定向的切割的底物。例如，靶序列的长度通常将为9个至36个核苷酸，例如，长度为15个至30个核苷酸，包含其间的所有子范围。作为非限制性实例，靶序列可以为15个至30个核苷酸、15个至26个核苷酸、15个至23个核苷酸、15个至22个核苷酸、15个至21个核苷酸、15个至20个核苷酸、15个至19个核苷酸、15个至18个核苷酸、15个至17个核苷酸、18个至30个核苷酸、18个至26个核苷酸、18个至23个核苷酸、18个至22个核苷酸、18个至21个核苷酸、18个至20个核苷酸、19个至30个核苷酸、19个至26个核苷酸、19个至23个核苷酸、19个至22个核苷酸、19个至21个核苷酸、19个至20个核苷酸、20个至30个核苷酸、20个至26个核苷酸、20个至25个核苷酸、20个至24个核苷酸、20个至23个核苷酸、20个至22个核苷酸、20个至21个核苷酸、21个至30个核苷酸、21个至26个核苷酸、21个至25个核苷酸、21个至24个核苷酸、21个至23个核苷酸或21个至22个核苷酸。
如本文所使用的，短语“治疗有效量”和“预防有效量”等是指在治疗、预防或管理与MYOC表达相关的任何病症或病理过程(例如，青光眼，例如，原发性开角型青光眼(POAG))中提供治疗益处的量。治疗有效的具体量可以根据本领域已知的因素而变化，例如，病症或病理过程的类型、患者的病史和年龄、病症或病理过程的阶段以及其它疗法的施用。
在本公开的上下文中，术语“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”等意指预防、延迟、缓解或减轻与MYOC表达相关的病症相关的至少一种症状，或减缓或逆转此类病症的进展或预期的进展。例如，当用于治疗青光眼时，本文所提出的方法可以用于减少或预防青光眼的一种或多种症状，如本文所描述的，或降低相关病状的风险或严重程度。因此，除非上下文另有明确指示，否则术语“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”等旨在涵盖预防，例如，预防与MYOC表达相关的病症和/或病症症状。治疗也可以意指与没有治疗的预期存活期相比，延长存活期。
在疾病标志物或症状的上下文中，“较低”意指任何下降，例如，此类水平的统计上或临床上显著下降。减少可以是，例如，至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。减少可以是降低至无此类病症的个体的正常范围内所接受的水平。
如本文所使用的，“MYOC”是指“肌纤蛋白”、对应的mRNA(“MYOC mRNA”)或对应的蛋白质(“MYOC蛋白”)。人MYOC mRNA转录物的序列可以在SEQ ID NO:1中找到。
II.iRNA药剂
本文描述了调节(例如，抑制)MYOC的表达的iRNA药剂。
在一些实施例中，iRNA药剂激活细胞中或哺乳动物体内的MYOC的表达。
在一些实施例中，iRNA药剂包含用于抑制细胞中或受试者体内(例如，哺乳动物体内，例如，人体内)的MYOC的表达的双链核糖核酸(dsRNA)分子，其中dsRNA包含具有互补区的反义链，所述互补区与在MYOC的表达中形成的mRNA的至少一部分互补，并且其中所述互补区的长度为30个核苷酸或更少，通常长度为19个至24个核苷酸，并且其中dsRNA在与表达MYOC的细胞接触时抑制MYOC的表达，例如，抑制至少10％、20％、30％、40％或50％。
MYOC的表达的调节(例如，抑制)可以通过例如基于PCR或支链DNA(bDNA)的方法，或通过基于蛋白质的方法(如通过蛋白质印迹)来测定。MYOC在细胞培养物中的表达，如在COS细胞、ARPE-19细胞、hTERT RPE-1细胞、HeLa细胞、原代肝细胞、HepG2细胞、原代培养的细胞或来自受试者的生物样品中的表达可以通过测量MYOC mRNA水平，如通过bDNA或TaqMan测定，或通过测量蛋白质水平，如通过使用例如蛋白质印迹或流式细胞术技术进行的免疫荧光分析。
dsRNA通常包含两条充分互补并且在将使用dsRNA的条件下杂交以形成双链体结构的RNA链。dsRNA的一条链(反义链)通常包含与靶序列基本上互补且通常完全互补的互补区，所述靶序列源自MYOC的表达期间形成的mRNA的序列。另一条链(有义链)通常包含与反义链互补的区，使得两条链在适当条件下组合时杂交并形成双链体结构。通常，双链体结构的长度介于15与30个碱基对之间(包含端值)，更通常介于18与25个碱基对之间(包含端值)，还更通常介于19与24个碱基对之间(包含端值)，并且最通常介于19与21个碱基对之间(包含端值)。类似地，与靶序列互补的区的长度介于15与30个核苷酸之间(包含端值)，更通常介于18与25个核苷酸之间(包含端值)，还更通常介于19与24个核苷酸之间(包含端值)，并且最通常介于19与21个核苷酸之间(包含端值)。
在一些实施例中，dsRNA的长度介于15个与20个核苷酸之间(包含端值)，并且在其它实施例中，dsRNA的长度介于25个与30个核苷酸之间(包含端值)。如普通技术人员将认识到的，靶向切割的RNA的靶向区通常将是较大RNA分子的部分，通常是mRNA分子。在相关情况下，mRNA靶标的“部分”是mRNA靶标的连续序列，其长度足以成为RNAi定向切割(即通过RISC通路切割)的底物。在一些情况下，具有短至9个碱基对的双链体的dsRNA可以介导RNAi定向的RNA切割。在最通常情况下，靶标的长度为至少15个核苷酸，例如，长度为15个至30个核苷酸。
本领域技术人员还将认识到，双链体区是dsRNA的主要功能性部分，例如9个至36个，例如，15个至30个碱基对的双链体区。因此，在一些实施例中，在其被加工成靶向所需RNA进行切割的例如15个至30个碱基对的功能性双链体的程度上，具有大于30个碱基对的双链体区的RNA分子或RNA分子复合物是dsRNA。因此，普通技术人员然后将认识到，在一些实施例中，miRNA是dsRNA。在一些实施例中，dsRNA不是天然存在的miRNA。在一些实施例中，可用于靶向MYOC表达的iRNA药剂不是通过切割较大的dsRNA在靶细胞中产生的。
如本文所描述的dsRNA可以进一步包含一个或多个单链核苷酸突出端。dsRNA可以通过如下文进一步讨论的本领域已知的标准方法合成，例如，通过使用自动DNA合成仪，如可从例如应用生物系统公司的生物搜索(Biosearch,Applied Biosystems,Inc.)商购获得。
在一些实施例中，MYOC是人MYOC。
在具体实施例中，dsRNA包括有义链，所述有义链包括选自表2A或2B中所提供的有义序列的有义序列或由其组成，以及反义链，所述反义链包括选自表2A或2B中所提供的反义序列的反义序列或由其组成。
在一些方面，dsRNA将至少包含有义和反义核苷酸序列，由此有义链选自表2A或2B中所提供的序列，并且对应的反义链选自表2A或2B中所提供的序列。
在这些方面，两个序列中的一个序列与两个序列中的另一个序列互补，其中所述序列中的一个序列与通过MYOC的表达产生的mRNA序列基本上互补。如此，dsRNA将包含两个寡核苷酸，其中一个寡核苷酸被描述为有义链，并且第二寡核苷酸被描述为对应的反义链。如本文中其它地方所描述且如本领域已知的，dsRNA的互补序列相对于位于单独寡核苷酸上还可以作为单一核酸分子的自身互补区被包含在内。
本领域技术人员充分了解，具有20个至23个碱基对(但具体地，21个碱基对)的双链体结构的dsRNA已被誉为在诱导RNA干扰方面特别有效(Elbashir等人,《欧洲分子生物学组织杂志(EMBO)》2001,20:6877-6888)。然而，其它人发现更短或更长的RNA双链体结构也可能有效。
在上述实施例中，由于表2A和2B中所提供的寡核苷酸序列的性质，本文所描述的dsRNA可以包含至少一条长度为最少19个核苷酸的链。可以合理地预期，与上述dsRNA相比，具有表2A和2B中的序列中的一个，在一端或两端仅减去很少核苷酸的较短的双链体将类似地有效。
在一些实施例中，dsRNA具有来自表2A或2B的序列中的一个的至少15个、16个、17个、18个、19个、20个或更多个连续核苷酸的部分序列。
在一些实施例中，dsRNA具有反义序列和有义序列，所述反义序列包括表2A或2B中所提供的反义序列的至少15个、16个、17个、18个或19个连续核苷酸，所述有义序列包括表2A或2B中所提供的对应的有义序列的至少15个、16个、17个、18个、或19个连续核苷酸。
在一些实施例中，dsRNA包括反义序列和有义序列，所述反义序列包括表2A或2B中所提供的反义序列的至少15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个或23个连续核苷酸，所述有义序列包括表2A或2B中所提供的对应的有义序列的至少15个、16个、17个、18个、19个、20个或21个连续核苷酸。
在一些此类实施例中，尽管dsRNA仅包括表2A或2B中所提供的序列的一部分，但其在抑制MYOC表达的水平方面与包括表2A和2B中所提供的全长序列的dsRNA一样有效。在一些实施例中，与包括本文所公开的完整序列的dsRNA相比，dsRNA在其对MYOC的表达水平的抑制方面的差异不超过5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％的抑制。
在一些实施例中，本文所描述的iRNA包括反义链，所述反义链包括具有SEQ IDNO:2的核苷酸序列的一部分的0个、1个、2个或3个错配的至少15个连续核苷酸。在一些实施例中，本文所描述的iRNA包括有义链，所述有义链包括具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列的对应部分的0个、1个、2个或3个错配的至少15个连续核苷酸。
人MYOC mRNA可以具有本文所提供的SEQ ID NO:1的序列。
智人(Homo sapiens)肌纤蛋白(MYOC)，mRNA
SEQ ID NO:1的反向互补在本文中作为SEQ ID NO:2提供：
在一些实施例中，本文所描述的iRNA包含来自表2A和2B中所提供的序列中的一个的至少15个连续核苷酸，并且可以任选地与取自MYOC中与所选序列相邻的区的另外的核苷酸序列偶联。
虽然靶序列的长度通常为15-30个核苷酸，但此范围内特定序列对引导任何给定靶RNA切割的适用性存在很大差异。本文中所示的各种软件包和指南为任何给定基因靶标的最佳靶序列的鉴定提供了指导，但也可以采用经验方法，其中给定大小的“窗口”或“掩码”(作为非限制性实例，21个核苷酸)按字面意义或象征意义(包含例如，计算机模拟)放置在靶RNA序列上，以鉴定在可以用作靶序列的大小范围内的序列。通过将序列“窗口”逐步移动到位于初始靶序列位置的上游或下游的一个核苷酸，可以鉴定下一个潜在的靶序列，直到鉴定到针对所选的任何给定靶标大小的完整的可能序列集。与系统合成和所鉴定的序列的测试(使用本文所描述的或如本领域已知的测定)结合以鉴定那些表现最佳的序列的此过程可以鉴定那些在用iRNA药剂靶向时介导最佳靶基因表达抑制的RNA序列。因此，预期抑制效率的进一步优化可以通过逐步“走窗”位于给定序列上游或下游的一个核苷酸来实现，以鉴定具有相同或更好抑制特性的序列。
此外，设想对于所鉴定的任何序列，例如，表2A和2B中的，可以通过系统地添加或去除核苷酸以产生更长或更短的序列并测试这些序列和通过从所述点开始将靶RNA向上或向下走窗更长或更短大小产生的序列来实现进一步优化。同样，将这种产生新候选靶标的方法与如本领域已知或如本文所述的抑制测定中基于这些靶标序列测试iRNA的有效性相结合可以使抑制效率进一步提高。仍进一步地，可以通过例如引入如本文所述或本领域已知的修饰核苷酸、添加或改变突出端或本领域已知和/或本文讨论的其它修饰来调整此类优化的序列以进一步优化分子(例如，增加血清稳定性或循环半衰期、增加热稳定性、增强跨膜递送、靶向特定位置或细胞类型、增加与沉默途径酶的相互作用、增加从核内体的释放等)作为表达抑制剂。
在一些实施例中，本公开提供了未经修饰的或未缀合的表2B的iRNA。在一些实施例中，本公开的RNAi药剂具有如表2A中所提供的核苷酸序列，但缺乏表中所示的一个或多个配体或部分。配体或部分(例如，亲脂性配体或部分)可以包含在本申请中所提供的任何位置中。
如本文所描述的iRNA可以含有与靶序列的一个或多个错配。在一些实施例中，如本文所描述的iRNA含有不超过3个错配。在一些实施例中，当iRNA的反义链含有与靶序列的错配，则错配区域不位于互补区的中心。在一些实施例中，当iRNA的反义链含有与靶序列的错配，则错配被限制在距互补区的5'或3'端的最后5个核苷酸内。例如，对于与MYOC的区互补的23个核苷酸iRNA药剂RNA链，RNA链在中心13个核苷酸内通常不含有任何错配。本文所描述的方法或本领域已知的方法可以用于确定含有与靶序列的错配的iRNA是否有效抑制MYOC的表达。考虑具有错配的iRNA在抑制MYOC的表达方面的功效很重要，特别是如果已知MYOC基因中的特定互补区在群体内具有多态性序列变异。
在一些实施例中，dsRNA的至少一端具有1个至4个，通常为1或2个核苷酸的单链核苷酸突出端。在一些实施例中，具有至少一个核苷酸突出端的dsRNA相对于其平端对应物具有更好的抑制特性。在一些实施例中，iRNA的RNA，(例如，dsRNA)被化学修饰以增强稳定性或其它有益特性。本公开中所提出的核酸可以通过本领域公认的方法合成和/或修饰，例如“核酸化学中的当前实验方案(Current protocols in nucleic acid chemistry),”Beaucage,S.L等人,(编辑),美国纽约州纽约的约翰威利父子公司(John Wiley&Sons,Inc.,New York,NY,USA)中描述的那些方法，所述文献特此通过引用并入本文。修饰包含例如，(a)端修饰，例如，5'端修饰(磷酸化、缀合、反向连接等)、3'端修饰(缀合、DNA核苷酸反向连接等)、(b)碱基修饰，例如，用稳定碱基、不稳定的碱基或与扩增的配偶体库碱基配对的碱基替换，去除碱基(无碱基核苷酸)或缀合的碱基、(c)糖修饰(例如，在2'位置或4'位置处，或具有无环糖)或糖的替换，以及(d)主链修饰，包含磷酸二酯键的修饰或替换。可用于本公开的RNA化合物的具体实例包含但不限于含有经修饰的主链或不含天然核苷间键的RNA。除此之外，具有经修饰的主链的RNA包含在主链中不具有磷原子的那些。出于本说明书的目的，并且如本领域中有时提及的，在其核苷间主链中不具有磷原子的经修饰的RNA也可以被视为寡核苷。在具体实施例中，经修饰的RNA将在其核苷间主链中具有磷原子。
经修饰的RNA主链包含例如硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其它烷基膦酸酯(包含3'-亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯)、次膦酸酯、氨基磷酸酯(包含3'-氨基磷酰胺酯和氨基烷基磷酸胺酯)、硫代羰基磷酰胺酯、硫代羰基烷基膦酸酯、硫代羰基烷基磷酸三酯、以及具有正常3'-5'键的硼烷磷酸酯、这些酯的2'-5'连接类似物、以及具有反向极性的那些酯，其中相邻对的核苷单位以3'-5'至5'-3'或2'-5'至5'-2'连接。也包含了各种盐、混合盐和游离酸形式。
教导上述含磷键的制备的代表性美国专利包含但不限于美国专利第3,687,808号；第4,469,863号；第4,476,301号；第5,023,243号；第5,177,195号；第5,188,897号；第5,264,423号；第5,276,019号；第5,278,302号；第5,286,717号；第5,321,131号；第5,399,676号；第5,405,939号；第5,453,496号；第5,455,233号；第5,466,677号；第5,476,925号；第5,519,126号；第5,536,821号；第5,541,316号；第5,550,111号；第5,563,253号；第5,571,799号；第5,587,361号；第5,625,050号；第6,028,188号；第6,124,445号；第6,160,109号；第6,169,170号；第6,172,209号；第6,239,265号；第6,277,603号；第6,326,199号；第6,346,614号；第6,444,423号；第6,531,590号；第6,534,639号；第6,608,035号；第6,683,167号；第6,858,715号；第6,867,294号；第6,878,805号；第7,015,315号；第7,041,816号；第7,273,933号；第7,321,029号；以及美国专利RE39464，所述美国专利中的每一个都通过引用并入本文。
其中不包含磷原子的经修饰的RNA主链具有由以下形成的主链：短链烷基或环烷基核苷间键、混合杂原子和烷基或环烷基核苷间键或一个或多个短链杂原子或杂环核苷间键。这些包含具有吗啉代键的那些(部分地由核苷的糖部分形成)；硅氧烷主链；硫化物、亚砜和砜主链；甲酰乙酰基和硫代甲酰乙酰基主链；亚甲基甲酰乙酰基和硫代甲酰乙酰基主链；含烯烃的主链；氨基磺酸酯主链；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基主链；磺酸酯和磺酰胺主链；酰胺主链；和其它具有混合的N、O、S和CH2组分部分的主链。
教导上述寡核苷的制备的代表性美国专利包含但不限于美国专利第5,034,506号；第5,166,315号；第5,185,444号；第5,214,134号；第5,216,141号；第5,235,033号；第5,64,562号；第5,264,564号；第5,405,938号；第5,434,257号；第5,466,677号；第5,470,967号；第5,489,677号；第5,541,307号；第5,561,225号；第5,596,086号；第5,602,240号；第5,608,046号；第5,610,289号；第5,618,704号；第5,623,070号；第5,663,312号；第5,633,360号；第5,677,437号；以及第5,677,439号；所述美国专利中的每一个都通过引用并入本文。
在适合或设想用于iRNA的其它RNA模拟物中，核苷酸单元的糖和核苷间键，即主链被新基团替代。维持碱基单元以与适当的核酸靶化合物杂交。一种此类寡聚化合物(即已示出具有极佳杂交特性的RNA模拟物)被称作肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，RNA的糖主链被含酰胺的主链替代，尤其是氨基乙基甘氨酸主链。核碱基被保留并且直接或间接地与主链的酰胺部分的氮杂氮原子结合。教导PNA化合物的制备的代表性美国专利包含但不限于美国专利第5,539,082号；第5,714,331号；和第5,719,262号，所述美国专利中的每一个都通过引用并入本文。PNA化合物的另外的教导可以在例如Nielsen等人,《科学(Science)》,1991,254,1497-1500中找到。
本公开中所提出的一些实施例包含具有硫代磷酸酯主链的RNA和具有杂原子主链的寡核苷，特别是上文引用的美国专利第5,489,677号的--CH2--NH--CH2--,、--CH2--N(CH3)--O--CH2--[称为亚甲基(甲基亚氨基)或MMI主链]、--CH2--O--N(CH3)--CH2--、--CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH2--和--N(CH3)--CH2--CH2--[其中天然磷酸二酯主链表示为--O--P--O--CH2--]，以及上文引用的美国专利第5,602,240号的酰胺主链。在一些实施例中，本文提出的RNA具有上文引用的美国专利第5,034,506号的吗啉代主链结构。
经修饰的RNA还可以含有一个或多个经取代的糖部分。本文提出的iRNA，例如dsRNA可以在2'位置处包含以下之一：OH；F；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中烷基、烯基和炔基可以是经取代的或未经取代的C1至C10烷基或C2至C10烯基和炔基。示例性合适的修饰包含O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2).nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2和O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2，其中n和m为1至约10。在其它实施例中，dsRNA在2'位置处包含以下之一：C1至C10低级烷基、经取代的低级烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基、经取代的甲硅烷基、RNA切割基团、报告基团、嵌入子、用于改善iRNA的药代动力学特性的基团、或用于改善iRNA的药效动力学特性的基团以及具有类似特性的其它取代基。在一些实施例中，修饰包含2'-甲氧基乙氧基(2'-O--CH2CH2OCH3)，也称为2'-O-(2-甲氧基乙基)或2'-MOE(Martin等人,《瑞士化学学报(Helv.Chim.Acta)》,1995,78:486-504)，即烷氧基-烷氧基基团。另一个示例性修饰是2'-二甲氨基氧基乙氧基，即O(CH2)2ON(CH3)2基团，也称为2'-DMAOE，以及2'-二甲基氨基乙氧基乙氧基(在本领域中也称为2'-O-二甲基氨基乙氧基乙基或2'-DMAEOE)，即2'-O--CH2--O--CH2--N(CH2)2。
在其它实施例中，iRNA药剂包括一个或多个(例如，约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个)无环核苷酸(或核苷)。在某些实施例中，有义链或反义链，或有义链和反义链两者每条链包含少于五个无环核苷酸(例如，每条链四个、三个、两个或一个无环核苷酸)。所述一个或多个无环核苷酸可以在例如有义或反义链的双链区或两条链中找到；在iRNA药剂的有义或反义链的5'端、3'端、5'端和3'端两者或两条链处。在一些实施例中，一个或多个无环核苷酸存在于有义或反义链或这两者的位置1至8处。在一些实施例中，在反义链中从反义链的5'端起的位置4至10(例如，位置6至8)处发现了一个或多个无环核苷酸。在一些实施例中，在iRNA药剂的一个或两个3'末端突出端处发现了一个或多个无环核苷酸。
如本文所使用的，术语“无环核苷酸”或“无环核苷”是指具有无环糖(例如，无环核糖)的任何核苷酸或核苷。示例性无环核苷酸或核苷可以包含核碱基，例如天然存在的或经修饰的核碱基(例如，如本文所描述的核碱基)。在某些实施例中，任何核糖碳(C1、C2、C3、C4或C5)之间的键独立地或组合地不存在于核苷酸中。在一些实施例中，核糖环的C2-C3碳之间的键不存在，例如，无环2'-3'-断核苷酸单体。在其它实施例中，C1-C2、C3-C4或C4-C5之间的键不存在(例如，1'-2'、3'-4'或4'-5'-断核苷酸单体)。示例性无环核苷酸公开于US8,314,227中，所述文献通过全文引用的方式并入本文。例如，无环核苷酸可以包含US 8,314,227的图1至2中的任何单体D-J。在一些实施例中，无环核苷酸包含以下单体：
其中碱基是核碱基，例如天然存在的或经修饰的核碱基(例如，如本文所描述的核碱基)。
在某些实施例中，无环核苷酸可以被修饰或衍生化，例如通过将无环核苷酸与另一个部分偶联，例如配体(例如，GalNAc、胆固醇配体)、烷基、多胺、糖、多肽等。
在其它实施例中，iRNA药剂包含一个或多个无环核苷酸和一个或多个LNA(例如，如本文所描述的LNA)。例如，一个或多个无环核苷酸和/或一个或多个LNA可以存在于有义链、反义链或两者中。一条链中的无环核苷酸的数量可以与相对链中的LNA的数量相同或不同。在某些实施例中，有义链和/或反义链包括位于双链区或3'突出端中的少于五个LNA(例如，四个、三个、两个或一个LNA)。在其它实施例中，一个或两个LNA位于有义链的双链区或3'突出端。可替代地或组合地，有义链和/或反义链在双链区或3'突出端中包括少于五个无环核苷酸(例如，四个、三个、两个或一个无环核苷酸)。在一些实施例中，iRNA药剂的有义链包括在有义链的3'突出端中的一个或两个LNA，以及在iRNA药剂的反义链的双链区(例如，在反义链的5'端的位置4至10(例如，位置6至8)处)中的一或两个无环核苷酸。
在其它实施例中，在iRNA药剂中包含一个或多个无环核苷酸(单独或除了一个或更多个LNA之外)引起了以下的一种或多种(或全部)情况：(i)脱靶效应减少；(ii)参与RNAi的随从链减少；(iii)引导链对其靶mRNA的特异性增加；(iv)微小RNA脱靶效应减少；(v)稳定性增加；或(vi)iRNA分子的抗降解性增加。
其它修饰包含2'-甲氧基(2'-OCH3)、2'-5氨基丙氧基(2'-OCH2CH2CH2NH2)和2'-氟(2'-F)。类似修饰也可以在iRNA的RNA上的其它位置处进行，特别是糖在3'末端核苷酸上的3'位置或在2'-5'连接的dsRNA和5'末端核苷酸的5'位置上。iRNA也可以具有糖模拟物，如替代戊呋喃糖基糖的环丁基部分。教导此类经修饰的糖结构的制备的代表性美国专利包含但不限于美国专利第4,981,957号；第5,118,800号；第5,319,080号；第5,359,044号；第5,393,878号；第5,446,137号；第5,466,786号；第5,514,785号；第5,519,134号；第5,567,811号；第5,576,427号；第5,591,722号；第5,597,909号；第5,610,300号；第5,627,053号；第5,639,873号；第5,646,265号；第5,658,873号；第5,670,633号；以及第5,700,920号，其中某些与本申请共同拥有，并且所述美国专利中的每一个通过引用并入本文。
iRNA还可以包含核碱基(在本领域中通常被简称为“碱基”)修饰或取代。如本文所使用的，“未经修饰的”或“天然”核碱基包含嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。经修饰的核碱基包含其它合成和天然核碱基，如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-卤基、8-氨基、8-硫醇、8-硫烷基、8-羟基和其它8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤基，具体地5-溴、5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤以及3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。
另外的核碱基包含美国专利第3,687,808号中公开的那些，在《生物化学、生物技术和医学中经修饰的核苷(Modified Nucleosides in Biochemistry,Biotechnology andMedicine)》,Herdewijn,P.编辑Wiley-VCH出版社(Wiley-VCH),2008年中公开的那些；在《聚合物科学与工程化简明百科全书(The Concise Encyclopedia of Polymer Scienceand Engineering)》,第858-859页,Kroschwitz,J.L编辑约翰威利父子公司,1990中公开的那些，在Englisch等人,《应用化学(Angewandte Chemie)》,国际版本,1991,30 613中公开的那些，以及由Sanghvi,Y S.,第15章,《dsRNA研究与应用(dsRNA Research andApplications)》,第289-302页,Crooke,S.T.和Lebleu,B.编辑,CRC出版社(CRC Press)1993中公开的那些。这些核碱基中的某些核碱基对提高本公开中所提出的寡聚化合物的结合亲和力特别有用。这些包含5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶和N-2、N-6和0-6取代的嘌呤，包含2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。已经示出5-甲基胞嘧啶取代使核酸双链体稳定性提高0.6℃至1.2℃(Sanghvi,Y.S.,Crooke,S.T.和Lebleu,B.编辑,《dsRNA研究与应用》,CRC出版社,波卡拉顿(Boca Raton),1993，第276-278页)，并且是示例性碱基取代，甚至更具体地在与2'-O-甲氧基乙基糖修饰组合时。
教导上述某些经修饰的核碱基以及其它经修饰的核碱基的制备的代表性美国专利包含但不限于上述美国专利第3,687,808号；以及美国专利第4,845,205号；第5,130,30号；第5,134,066号；第5,175,273号；第5,367,066号；第5,432,272号；第5,457,187号；第5,459,255号；第5,484,908号；第5,502,177号；第5,525,711号；第5,552,540号；第5,587,469号；第5,594,121,5,596,091号；第5,614,617号；第5,681,941号；第6,015,886号；第6,147,200号；第6,166,197号；第6,222,025号；第6,235,887号；第6,380,368号；第6,528,640号；第6,639,062号；第6,617,438号；第7,045,610号；第7,427,672号；以及第7,495,088号；所述美国专利中的每一个通过引用并入本文；以及美国专利第5,750,692号，所述美国专利也通过引用并入本文。
iRNA的RNA也可以被修饰以包含一个或多个(例如，约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个)双环糖部分。“双环糖”是由两个原子桥接修饰的呋喃糖基环。“双环核苷”(“BNA”)是一种具有糖部分的核苷，所述糖部分包括连接糖环的两个碳原子的桥，由此形成双环系统。在某些实施例中，桥连接糖环的4'碳和2'碳。因此，在一些实施例中，本公开的药剂可以包含一种或多种锁定核酸(LNA)(本文也称为“锁定核苷酸”)。在一些实施例中，锁定核酸是具有经修饰的核糖部分的核苷酸，其中核糖部分包括连接例如2'和4'碳的额外桥。这种结构有效地将核糖“锁定”在3'-内结构构象中。向siRNA中添加锁定核酸已被证明可增加血清中的siRNA稳定性，增加热稳定性，并且减少脱靶效应(Elmen，J.等人,(2005)《核酸研究(Nucleic AcidsResearch)》33(1):439-447；Mook,OR.等人,(2007)《分子癌症治疗学(Mol Canc Ther)》6(3):833-843；Grunweller,A.等人,(2003)《核酸研究》31(12):3185-3193)。
用于本公开的多核苷酸的双环核苷的实例包含但不限于包括4'和2'核糖基环原子之间的桥的核苷。在某些实施例中，本公开的反义多核苷酸药剂包含一种或多种包括4'至2'桥的双环核苷。此类4'至2'桥接的双环核苷的实例包含但不限于4'-(CH2)—O-2'(LNA)；4'-(CH2)—S-2'；4'-(CH2)2—O-2'(ENA)；4’-CH(CH3)—O-2’(也称为“约束乙基”或“cEt”)和4'-CH(CH2OCH3)—O-2'(以及其类似物；参见例如，美国专利第7,399,845号)；4'-C(CH3)(CH3)—O-2'(以及其类似物；参见例如，美国专利第8,278,283号)；4'-CH2—N(OCH3)-2'(以及其类似物；参见例如，美国专利第8,278,425号)；4'-CH2—O—N(CH3)-2'(参见例如，美国专利公开第2004/0171570号)；4'-CH2—N(R)—O-2'，其中R是H、C1-C12烷基或保护基团(参见例如，美国专利第7,427,672号)；4'-CH2—C(H)(CH3)-2'(参见例如，Chattopadhyaya等人,《有机化学杂志(J.Org.Chem.)》,2009,74,118-134)；以及4'-CH2—C(═CH2)-2'(以及其类似物；参见例如，美国专利第8,278,426号)。前述每一项的内容通过引用并入本文，用于其中所提供的方法。教导锁定核酸的制备的代表性美国专利包含但不限于以下：美国专利第6,268,490号；第6,670,461号；第6,794,499号；第6,998,484号；第7,053,207号；第7,084,125号；第7,399,845号和第8,314,227号，所述美国专利中的每一个通过全文引用的方式并入。示例性LNA包含但不限于2',4'-C亚甲基双环核苷酸(参见例如Wengel等人,国际PCT 5公开第WO 00/66604号和第WO 99/14226号)。
可以制备具有一种或多种立体化学糖构型的任何前述双环核苷，包含例如α-L-呋喃核糖和β-D-呋喃核糖(参见WO 99/14226)。
本公开的RNAi药剂也可以被修饰以包含一个或多个约束乙基核苷酸。如本文所使用的，“约束乙基核苷酸”或“cEt”是包括包含4'-CH(CH3)-0-2'桥的双环糖部分的锁核酸。在一些实施例中，约束乙基核苷酸呈本文中称为“S-cEt”的S构象。
本公开的RNAi药剂还可以包含一个或多个“构象限制性核苷酸”(“CRN”)。CRN是具有连接核糖的C2'和C4'碳或核糖的C3和-C5'碳的接头的核苷酸类似物。CRN将核糖环锁定为稳定的构象，并且增加对mRNA的杂交亲和力。接头具有足够的长度以将氧放置在稳定性和亲和力的最佳位置，从而导致较少的核糖环褶皱。
教导上述某些CRN的制备的代表性出版物包含但不限于US 2013/0190383；以及WO2013/036868，所述文献中的每一个的内容特此通过引用并入本文，用于其中所提供的方法。
在一些实施例中，本公开的RNAi药剂包括一种或多种为UNA(解锁核酸)核苷酸的单体。UNA是未锁定的无环核酸，其中糖的任何键都已被去除，形成未锁定的“糖”残基。在一个实例中，UNA还涵盖C1'-C4'之间的键已被去除的单体(即C1'与C4'碳之间的共价碳-氧-碳键)。在另一个实例中，糖的C2'-C3'键(即C2'与C3'碳之间的共价碳-碳键)已被去除(参见《核酸研讨会丛刊(Nuc.Acids Symp.Series)》,52,133-134(2008)和Fluiter等人,《分子生物系统(Mol.Biosyst.)》,2009,10,1039)。
教导UNA的制备的代表性美国公开包含但不限于US8,314,227；以及美国专利公开第2013/0096289号；第2013/0011922号；和第2011/0313020号，所述文献中的每一个的内容特此通过引用并入本文，用于其中所提供的方法。
在其它实施例中，iRNA药剂包含一个或多个(例如，约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个)G-钳位核苷酸。G-钳位核苷酸是经修饰的胞嘧啶类似物，其中所述修饰赋予双链体内的互补鸟嘌呤的沃森-克里克(Watson-Crick)面和胡格斯丁(Hoogsteen)面两者发生氢键结合的能力，参见例如Lin和Matteucci 1998,《美国化学学会杂志(J.Am.Chem.Soc.)》,120,8531-8532。当与互补寡核苷酸杂交时，寡核苷酸内的单个G-钳位类似物取代可以引起显著增强的螺旋热稳定性和错配辨别。iRNA分子中包含此类核苷酸可以引起对核酸靶标、互补序列或模板链的亲和力和特异性增强。
对RNA分子末端的潜在稳定修饰可以包含N-(乙酰氨基己酰基)-4-羟脯氨醇(Hyp-C6-NHAc)、N-(己酰基-4-羟脯氨醇)(Hyp-C6)、N-(乙酰基-4-羟脯氨醇)(Hyp-NHAc)、胸苷-2'-O-脱氧胸苷(醚)、N-(氨基己酰基)-4-羟脯氨醇(Hyp-C6-氨基)、2-二十二烷酰基-尿苷-3"-磷酸酯、反向碱基dT(idT)等。此修饰的公开内容可以在PCT公开第WO 2011/005861号中找到。
本公开的RNAi药剂的其它修饰包含5'磷酸酯或5'磷酸酯模拟物，例如，RNAi药剂的反义链上的5'末端磷酸酯或磷酸酯模拟物。合适的磷酸酯模拟物公开于例如US2012/0157511中，所述文献的内容通过引用并入本文，用于其中所提供的方法。在一个实施例中，本发明的双链RNAi药剂在反义链的5'核苷酸处进一步包括5'-磷酸酯或5'-磷酸酯模拟物。在另一个实施例中，双链RNAi药剂在反义链的5'核苷酸处进一步包括5'-磷酸酯模拟物。在具体实施例中，5'-磷酸酯模拟物是5'-乙烯基膦酸酯(5'-VP)。在一个实施例中，磷酸酯模拟物是5'-环丙基膦酸酯(VP)。在一些实施例中，双链iRNA药剂的反义链的5'-端不含有5'-乙烯基膦酸酯(VP)。
在一个实施例中，经修饰的核苷酸中的至少一个经修饰的核苷酸选自由以下组成的组：脱氧核苷酸、2'-O-甲基修饰的核苷酸、2'-氟修饰的核苷酸、2'-脱氧修饰的核苷酸、乙二醇修饰的核苷酸(GNA)，例如Ggn、Cgn、Tgn或Agn、具有2'磷酸酯的核苷酸，例如G2p、C2p、A2p或U2p以及膦酸乙烯酯核苷酸；以及其组合。在其它实施例中，表5和6的双链体中的每一个可以被特别修饰以提供本公开的另一种双链iRNA药剂。在一个实例中，每个有义双链体的3'末端可以通过去除3'末端L96配体并用硫代磷酸酯核苷酸间键交换三个3'末端核苷酸之间的两个磷酸二酯核苷酸间键来修饰。也就是说，下式的有义序列的三个3'末端核苷酸(N)：
5'-N1-…-Nn-2Nn-1NnL96 3'
可以被替换为
5'-N1-…-Nn-2sNn-1sNn 3'。
RNA靶标可以具有靶RNA的核苷酸序列的区或跨度，所述区或跨度比RNA靶标的其它区相对更容易或更易于通过RNAi药剂与该区结合所诱导的RNA干扰介导RNA靶标的切割。在此类“热点区”(或简称为“热点”)内对RNA干扰的易感性增加意味着靶向所述区的iRNA药剂在诱导iRNA干扰方面可能比靶向靶RNA的其它区的iRNA药剂具有更高的功效。例如，在不受理论束缚的情况下，靶RNA的靶区的可及性可能影响靶向该区的iRNA药剂的功效，其中一些热点区具有增加的可及性。例如，在RNA靶标中形成的二级结构(例如，在热点区内或附近)可能影响iRNA药剂与靶区结合并诱导RNA干扰的能力。
根据本发明的某些方面，iRNA药剂可以被设计为靶向本文所描述的任何靶RNA的热点区，包含靶RNA的任何鉴定的部分(例如，特定外显子)。如本文所使用的，热点区可以指靶RNA序列的大约19个至200个、19个至150个、19个至100个、19个至75个、19个至50个、21个至200个、21个至150个、21个至100个、21个至75个、21个至50个、50个至200个、50个至150个、50个至100个、50个至75个、75个至200个、75个至150个、75个至100个、100个至200个或100个至150个核苷酸的区，相对于靶向相同靶RNA的其它区，使用RNAi药剂的靶向提供了显著更高的有效沉默概率。根据本发明的某些方面，热点区可以包括靶RNA的有限区，并且在一些情况下，包括靶标的基本上有限的区，包含例如小于靶RNA长度的一半，如靶RNA长度约5％、10％、15％、20％、25％或30％。相反，与热点进行比较的其它区可以累积地包括靶RNA长度的至少大部分。例如，其它区可以累积地包括靶RNA长度的至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％、或至少约95％。
可以使用从体外或体内筛选测定获得的功效数据对靶RNA的比较区进行经验评估以鉴定热点。例如，可以比较靶向跨越靶RNA的各个区的RNAi药剂与每个区结合的有效iRNA药剂的频率(例如，靶基因表达被抑制的量，如通过mRNA表达或蛋白质表达所测量的)。通常，可以通过观察与RNA靶标的有限区结合的多种有效RNAi药剂的聚类来识别热点。热点可以通过观察iRNA药剂的功效来充分表征，所述药剂累积跨越被鉴定为热点的靶区的至少约60％，如区长度的约70％、约80％、约90％或约95％或更多，包含所述区的两端(即，所述区内至少约60％、70％、80％、90％或95％或更多的核苷酸，包含所述区的每一端处的核苷酸被iRNA药剂靶向)。根据本发明的一些方面，对所述区表现出至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的抑制(例如，剩余的mRNA不超过约50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或5％)的iRNA药剂可以被鉴定为有效。
还可以使用在限定大小的不同区(例如，25、30、40、50、60、70、80、90或100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200nts)上的抑制测量的定量比较来评估对RNA区的靶向的顺从性。例如，可以为每个区确定抑制的平均水平，并且可以比较每个区的平均值。热点区内的抑制的平均水平可以显著高于所有评估的区的平均值的平均值。根据一些方面，热点区中的抑制的平均水平可以比平均值的平均值高至少约10％、20％、30％、40％或50％。根据一些方面，热点区中的抑制的平均水平可以比平均值的平均值高至少约1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2.0标准偏差。抑制的平均水平可以高出统计学显著(例如，p<0.05)量。根据一些方面，热点区内的每个抑制测量可以高于阈值量(例如，处于或低于剩余的mRNA的阈值量)。根据一些方面，区内的每个抑制测量值可以显著高于所有测量的区上的所有抑制测量值的平均值。例如，热点区中的每个抑制测量值可以比所有抑制测量值的平均值高至少约10％、20％、30％、40％或50％。根据一些方面，每个抑制测量值可以比所有抑制测量值的平均值高至少约1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2.0标准偏差。每个抑制测量值可以比所有抑制测量值的平均值高统计显著(例如，p<0.05)量。用于评估热点的标准可以包括在兼容的情况下的上述标准的各种组合(例如，至少约第一量的抑制的平均水平，并且在小于第一量的第二量的阈值水平以下没有抑制测量值)。
因此，明确设想了可以优选地选择靶向靶RNA的热点区的任何iRNA药剂，包含本文所描述的特定示例性iRNA药剂来诱导靶mRNA的RNA干扰，因为靶向此类热点区相对于靶向非热点区的区可能表现出稳健的抑制应答。靶向基本上重叠(例如，靶向靶序列长度的至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％)或优选地完全位于热点区内的靶序列的RNAi药剂可以被认为靶向热点区。本发明的RNA靶标的热点区可以包含本文所公开的数据证明有效RNAi药剂靶向的频率更高的任何区，包含本文其它地方描述的任何标准，无论是否明确规定了此类热点区的范围。
在各种实施例中，本发明的dsRNA药剂靶向编码MYOC的mRNA的热点区。
III.iRNA基序
在本公开的某些方面，本公开的双链RNAi药剂包含具有化学修饰的药剂，如在例如WO 2013/075035中公开的，所述文献中的内容通过引用并入本文，用于其中所提供的方法。如本文和WO 2013/075035所示，通过将在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的一个或多个基序引入RNAi药剂的有义链或反义链，特别是在切割位点处或附近，可以获得优异的结果。在一些实施例中，RNAi药剂的有义链和反义链可以以其它方式被完全修饰。这些基序的引入中断了有义或反义链的修饰模式(如果存在的话)。RNAi药剂可以任选地与亲脂性部分或配体缀合，例如C16部分或配体，例如在有义链上。RNAi药剂可以任选地用(S)-乙二醇核酸(GNA)修饰来修饰，例如在反义链的一个或多个残基上。产生的RNAi药剂呈现出优异的基因沉默活性。
在一些实施例中，有义链序列可以由式(I)表示：
5'np-Na-(X X X)i-Nb-Y Y Y-Nb-(Z Z Z)j-Na-nq 3'(I)
其中：
i和j各自独立地为0或1；
p和q各自独立地为0至6；
每个Na独立地表示包括0个至25个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列，每个序列包括至少两个不同修饰的核苷酸；
每个Nb独立地表示包括0个至10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列；
每个np和nq独立地表示突出端核苷酸；
其中Nb和Y不具有相同的修饰；并且
XXX、YYY和ZZZ各自独立地表示在三个连续核苷酸上的三个相同修饰的一个基序。在一些实施例中，YYY是所有2'-F修饰的核苷酸。
在一些实施例中，Na和/或Nb包括交替模式的修饰。
在一些实施例中，YYY基序出现在有义链的切割位点处或附近。例如，当RNAi药剂具有长度为17个至23个核苷酸的双链体区时，YYY基序可以出现在有义链的切割位点处或附近(例如，可以出现在位置6、7、8；7、8、9；8、9、10；9、10、11；10、11、12或11、12、13处)，计数从第1个核苷酸开始，从5'端开始；或任选地，计数从5'端开始，从双链体区内的第1配对核苷酸开始。
在一些实施例中，i是1并且j是0，或i是0并且j是1，或i和j两者都是1。因此，有义链可以由下式表示：
5'np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3'(Ib)；
5'np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq 3'(Ic)；或
5'np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3'(Id)。
当有义链由式(Ib)表示时，Nb表示包括0个至10个、0个至7个、0个至5个、0个至4个、0个至2个或0个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na可以独立地表示包括2个至20个、2个至15个或2个至10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
当有义链表示为式(Ic)时，Nb表示包括0个至10个、0个至7个、0个至5个、0个至4个、0个至2个或0个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na可以独立地表示包括2个至20个、2个至15个或2个至10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
当有义链表示为式(Id)时每个Nb独立地表示包括0个至10个、0个至7个、0个至5个、0个至4个、0个至2个或0个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。在一些实施例中，Nb为0、1、2、3、4、5或6。每个Na可以独立地表示包括2个至20个、2个至15个或2个至10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
X、Y和Z中的每一个可以彼此相同或不同。
在其它实施例中，i是0并且j是0，并且有义链可以由下式表示：
5'np-Na-YYY-Na-nq 3'(Ia)。
当有义链由式(Ia)表示时，每个Na可以独立地表示包括2个至20个、2个至15个或2个至10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
在一些实施例中，RNAi的反义链序列可以由式(Ie)表示：
5'nq'-Na'-(Z'Z'Z')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-(X'X'X')l-N'a-np'3'(Ie)
其中：
k和l各自独立地为0或1；
p'和q'各自独立地为0至6；
每个Na'独立地表示包括0个至25个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列，
每个序列包括至少两个不同修饰的核苷酸；
每个Nb'独立地表示包括0个至10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列；
每个np'和nq'独立地表示突出端核苷酸；
其中Nb'和Y'不具有相同的修饰；
并且
X'X'X'、Y'Y'Y'和Z'Z'Z'各自独立地表示在三个连续核苷酸上的三个相同修饰中的一个。
在一些实施例中，Na'和/或Nb'包括交替模式的修饰。
Y'Y'Y'基序出现在反义链的切割位点处或附近。例如，当RNAi药剂具有长度为17个至23个核苷酸的双链体区时，Y'Y'Y'基序可以出现在反义链的位置9、10、11；10、11、12；11、12、13；12、13、14；或13、14、15处，计数从第1个核苷酸开始，从5'端开始；或任选地，计数从5'端开始，从双链体区内的第1配对核苷酸开始。在一些实施例中，Y'Y'Y'基序出现在位置11、12、13处。
在一些实施例中，Y'Y'Y'基序全部是2'-Ome修饰的核苷酸。
在一个实施例中，k是1并且l是0，或k是0并且l是1，或5k和l两者都是1。
因此，反义链可以由下式表示：
5'nq'-Na'-Z'Z'Z'-Nb'-Y'Y'Y'-Na'np'3'(Ig)；
5'nq'-Na'-Y'Y'Y'-Nb'-X'X'X'-np'3'(Ih)；或
5'nq'-Na'-Z'Z'Z'-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-X'X'X'-Na'-np'3'(Ii)。
当反义链由式(Ig)表示时，Nb'表示包括0个至10个、0个至7个、0个至5个、0个至4个、0个至2个或0个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na'独立地表示包括2个至20个、2个至15个或2个至10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
当反义链表示为式(Ii)时，每个Nb'独立地表示包括0个至10个、0个至7个、0个至5个、0个至4个、0个至2个或0个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na'独立地表示包括2个至20个、2个至15个或2个至10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。在一些实施例中，Nb为0、1、2、3、4、5或6。
在其它实施例中，k是0并且l是0，并且反义链可以由下式表示：
5'np'-Na'-Y'Y'Y'-Na'-nq'3'(If)。
当反义链表示为式(If)时，每个Na'独立地
表示包括2个至20个、2个至15个或2个至10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
X'、Y'和Z'中的每一个可以彼此相同或不同。
有义链和反义链的每个核苷酸可以独立地用LNA、HNA、CeNA、GNA、2'-甲氧基乙基、2'-O-甲基、2'-O-烯丙基、2'-C-烯丙基、2'-羟基或2'-氟修饰。例如，有义链和反义链的每个核苷酸独立地用2'-O-甲基或2'-氟修饰。特别地，每个X、Y、Z、X'、Y'和Z'可以表示2'-O-甲基修饰或2'-氟修饰。
在一些实施例中，当双链体区为21nt时，RNAi药剂的有义链可以含有出现在链的9、10和11位置处的YYY基序，计数从5'端的第1个核苷酸开始，或任选地，计数从5'端的双链体区内的第1配对核苷酸开始；并且Y表示2'-F修饰。有义链可以另外含有XXX基序或ZZZ基序作为在双链体区的相对端处的翼修饰；并且XXX和ZZZ各自独立地表示2'-OMe修饰或2'-F修饰。
在一些实施例中，反义链可以含有出现在链的位置11、12、13处的Y'Y'Y'基序，计数从5'端的第1个核苷酸开始，或任选地，计数从5'端的双链体区内的第1配对核苷酸开始；并且Y'表示2'-O-甲基修饰。反义链可以另外含有X'X'X'基序或Z'Z'Z'基序作为在双链体区的相对端处的翼修饰；并且X'X'X'和Z'Z'Z'各自独立地表示2'-OMe修饰或2'-F修饰。
由上述式(Ia)、(Ib)、(Ic)和(Id)中的任一个表示的有义链与分别由式(If)、(Ig)、(Ih)和(Ii)中的任一个表示的反义链形成双链体。
因此，用于本公开的方法中的某些RNAi药剂可以包括有义链和反义链，每条链具有14个至30个核苷酸，RNAi双链体由式(Ij)表示：
有义：5'np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq 3'
反义：3'np'-Na'-(X'X'X')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-(Z'Z'Z')l-Na'-nq'5'
(Ij)
其中，
i、j、k和l各自独立地为0或1；
p、p'、q和q'各自独立地为0至6；
每个Na和Na'独立地表示包括0个至25个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列，每个序列包括至少两个不同修饰的核苷酸；
每个Nb和Nb'独立地表示包括0个至10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列；
其中
每个可能存在或不存在的np'、np、nq'和nq独立地表示突出端核苷酸；并且
XXX、YYY、ZZZ、X'X'X'、Y'Y'Y'和Z'Z'Z'各自独立地表示在三个连续核苷酸上的三个相同修饰中的一个基序。
在一些实施例中，i是0并且j是0；或i是1并且j是0；或i是0并且j是1；或i和j两者都是0；或i和j两者都是1。在一些实施例中，k是0并且l是0；或k是1并且l是0；k是0并且l是1；或k和l两者都是0；或k和l两者都是1。
形成RNAi双链体的有义链和反义链的示例性组合包含下式：
5'np-Na-Y Y Y-Na-nq 3'
3'np'-Na'-Y'Y'Y'-Na'nq'5'
(Ik)
5'np-Na-Y Y Y-Nb-Z Z Z-Na-nq 3'
3'np-Na'-Y'Y'Y'-Nb'-Z'Z'Z'-Na'-nq'5'
(Il)
5'np-Na-X X X-Nb-Y Y Y-Na-nq 3'
3'np-Na'-X'X'X'-Nb'-Y'Y'Y'-Na'-nq'5'(Im)
5'np-Na-X X X-Nb-Y Y Y-Nb-Z Z Z-Na-nq 3'
3'np-Na'-X'X'X'-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-Z'Z'Z'-Na’-nq'5'
(In)
当RNAi药剂由式(Ik)表示时，每个Na独立地表示包括2个至20个、2个至15个或2个至10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
当RNAi药剂由式(Il)表示时，每个Nb独立地表示包括1个至10个、1个至7个、1个至5个或1个至4个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na独立地表示包括2个至20个、2个至15个或2个至10个经饰修的核苷酸的寡核苷酸序列。
当RNAi药剂表示为式(Im)时，每个Nb、Nb'独立地表示包括0个至10个、0个至7个、0个至5个、0个至4个、0个至2个或0个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na独立地表示包括2个至20个、2个至15个或2个至10个经饰修的核苷酸的寡核苷酸序列。
当RNAi药剂表示为式(In)时，每个Nb、Nb'独立地表示包括0个至10个、0个至7个、0个至5个、0个至4个、0个至2个或0个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na、Na'独立地表示包括2个至20个、2个至15个或2个至10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。Na、Na'、Nb和Nb'中的每一个独立地包括交替模式的修饰。
式(Ij)、(Ik)、(Il)、(Im)和(In)中的X、Y和Z中的每一个可以彼此相同或不同。
当RNAi药剂由式(Ij)、(Ik)、(Il)、(Im)和(In)表示时，至少一个Y核苷酸可以与一个Y'核苷酸形成碱基对。可替代地，至少两个Y核苷酸与对应的Y'核苷酸形成碱基对；或所有三个Y核苷酸都与相应的Y'核苷酸形成碱基对。
当RNAi药剂由式(Il)或(In)表示时，至少一个Z核苷酸可以与一个Z'核苷酸形成碱基对。可替代地，至少两个Z核苷酸与对应的Z'核苷酸形成碱基对；或所有三个Z核苷酸都与相应的Z'核苷酸形成碱基对。
当RNAi药剂表示为式(Im)或(In)时，至少一个X核苷酸可以与一个X'核苷酸形成碱基对。可替代地，至少两个X核苷酸与对应的X'核苷酸形成碱基对；或所有三个X核苷酸都与相应的X'核苷酸形成碱基对。
在一些实施例中，Y核苷酸上的修饰不同于Y'核苷酸上的修饰，Z核苷酸上的修饰不同于Z'核苷酸上的修饰，和/或X核苷酸上的修饰不同于X'核苷酸上的修饰。
在一些实施例中，当RNAi药剂由式(IIId)表示时，Na修饰是2'-O-甲基或2'-氟修饰。在一些实施例中，当RNAi药剂由式(In)表示时，Na修饰是2'-O-甲基或2'-氟修饰，并且np'>0，并且至少一个np'通过硫代磷酸酯键与相邻核苷酸a连接。在一些实施例中，当RNAi药剂由式(In)表示时，Na修饰是2'-O-甲基或2'-氟修饰，np'>0，并且至少一个np'通过硫代磷酸酯键与相邻核苷酸连接，并且有义链与通过二价或三价支链接头连接的一个或多个部分或配体(例如，一个或多个亲脂性部分，任选地一个或多个C16部分或一个或多个GalNAc部分)缀合。在一些实施例中，当RNAi药剂由式(In)表示时，Na修饰是2'-O-甲基或2'-氟修饰，np'>0，并且至少一个np'通过硫代磷酸酯键与相邻核苷酸连接，有义链包括至少一个硫代磷酸酯键，并且有义链与通过二价或三价支链接头连接的一个或多个部分或配体(例如，一个或多个亲脂性部分，任选地一个或多个C16部分或一个或多个GalNAc部分)缀合。
在一些实施例中，当RNAi药剂由式(IIIa)表示时，Na修饰是2'-O-甲基或2'-氟修饰，np'>0，并且至少一个np'通过硫代磷酸酯键与相邻核苷酸连接，有义链包括至少一个硫代磷酸酯键，并且有义链与通过二价或三价支链接头连接的一个或多个部分或配体(例如，一个或多个亲脂性部分，任选地一个或多个C16部分或一个或多个GalNAc部分)缀合。
在一些实施例中，RNAi药剂是含有至少两个由式(Ij)、(Ik)、(Il)、(Im)和(In)表示的双链体的多聚体，其中所述双链体通过接头连接。接头可以是可切割的或不可切割的。任选地，多聚体进一步包括配体。每个双链体可以靶向相同的基因或两个不同的基因；或每个双链体可以靶向两个不同的靶位点处的相同的基因。
在一些实施例中，RNAi药剂是含有三个、四个、五个、六个或更多个由式(Ij)、(Ik)、(Il)、(Im)和(In)表示的双链体的多聚体，其中所述双链体通过接头连接。接头可以是可切割的或不可切割的。任选地，多聚体进一步包括配体。每个双链体可以靶向相同的基因或两个不同的基因；或每个双链体可以靶向两个不同的靶位点处的相同的基因。
在一些实施例中，由式(Ij)、(Ik)、(Il)、(Im)和(In)表示的两种RNAi药剂在5'端处以及一个或两个3'处彼此连接，并且任选地与配体缀合。每种药剂可以靶向相同的基因或两个不同的基因；或每种药剂可以靶向两个不同的靶位点处的相同的基因。
各种出版物描述了可以用于本公开的方法的多聚体RNAi药剂。此类出版物包含WO2007/091269、WO2010/141511、WO2007/117686、WO2009/014887和WO2011/031520；以及US7858769，所述文献中的每一个的内容特此通过引用并入本文，用于其中所提供的方法。在某些实施例中，本公开的RNAi药剂可以包含GalNAc配体。
如下文更详细描述的，含有一个或多个碳水化合物部分与RNAi药剂的缀合的RNAi药剂可以优化RNAi药剂的一个或多个特性。在许多情况下，碳水化合物部分将与RNAi药剂的经修饰的亚基连接。例如，dsRNA药剂的一个或多个核糖核苷酸亚基的核糖糖可以被另一个部分替代，例如，与碳水化合物配体连接的非碳水化合物(优选地，环状)载剂。其中亚基的核糖糖已经被如此替代的核糖核苷酸亚基在本文中被称为核糖替代修饰亚基(RRMS)。环状载剂可以是碳环系统，即所有环原子都是碳原子，或杂环系统，即一个或多个环原子可以是杂原子，例如氮、氧、硫。环状载剂可以是单环系统，或可以含有两个或多个环，例如稠环。环状载剂可以是完全饱和的环系统，或其可以含有一个或多个双键。
配体可以通过载剂与多核苷酸连接。载剂包含(i)至少一个“主链连接点”，优选地两个“主链连接点”以及(ii)至少一个“系链连接点”。如本文所使用的，“主链连接点”是指官能团，例如羟基，或通常是可用于并适合将载剂结合到主链中的键，例如核糖核酸的磷酸酯或经修饰的磷酸酯(例如，含硫)主链。在一些实施例中，“系链连接点”(TAP)是指连接所选部分的环状载剂的组成环原子，例如碳原子或杂原子(不同于提供主链连接点的原子)。所述部分可以是例如碳水化合物，例如单糖、二糖、三糖、四糖、寡糖和多糖。任选地，所选择的部分通过中间系链与环状载剂连接。因此，环状载剂将通常包含官能团，例如氨基，或通常提供适合于另一个化学实体(例如，组成环的配体)的结合或系留的键。
RNAi药剂可以通过载剂与配体缀合，其中所述载剂可以是环状基团或无环基团；优选地，所述环状基团选自吡咯烷基、吡唑啉基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、哌啶基、哌嗪基、[1,3]二氧戊环、噁唑烷基、异噁唑烷基、吗啉基、噻唑烷基、异噻唑烷基、喹喔啉基、哒嗪酮基、四氢呋喃基和十氢萘基；优选地，所述无环基团选自丝氨醇主链或二乙醇胺主链。
在某些特定实施例中，用于本公开的方法中的RNAi药剂是选自表2A和2B中的任一个所列出的药剂的组的药剂。这些药剂可以进一步包括配体。配体可以在3'端、5'端或两端处与有义链、反义链或两条链连接。例如，配体可以与有义链，特别是有义链的3'端缀合。
IV.iRNA缀合物
本文所公开的iRNA药剂可以呈缀合物的形式。缀合物可以在iRNA分子中的任何合适的位置处连接，例如，在有义或反义链的3'端或5'端处。缀合物任选地通过接头连接。
在一些实施例中，本文所描述的iRNA药剂与一个或多个配体、部分或缀合物化学连接，其可以赋予功能，例如，通过影响(例如，增强)iRNA的活性、细胞分布或细胞摄取。此类部分包含但不限于脂质部分，如胆固醇部分(Letsinger等人,《美国国家科学院院刊》,1989,86:6553-6556)，胆酸(Manoharan等人,《生物有机与药物化学快报(Biorg.Med.Chem.Let.)》,1994,4:1053-1060)，硫醚，例如，绿柱石-S-三苯基甲硫醇(Manoharan等人,《纽约科学院年鉴(Ann.N.Y.Acad.Sci.)》,1992,660:306-309；Manoharan等人,《生物有机与药物化学快报》,1993,3:2765-2770)，硫代胆固醇(Oberhauser等人,《核酸研究》,1992,20:533-538)，脂肪族链，例如十二烷二醇或十一烷基残基(Saison-Behmoaras等人,《欧洲分子生物学组织杂志》,1991,10:1111-1118；Kabanov等人,《FEBS快报(FEBS Lett.)》,1990,259:327-330；Svinarchuk等人,《生物化学(Biochimie)》,1993,75:49-54)，磷脂，例如二-十六烷基-rac-甘油或三乙基铵1,2-二-O-十六烷基-rac-甘油-3-膦酸酯(Manoharan等人,《四面体快报(Tetrahedron Lett.)》,1995,36:3651-3654；Shea等人,《核酸研究》,1990,18:3777-3783)，磷脂、多胺或聚乙二醇链(Manoharan等人,《核苷与核苷酸(Nucleosides&Nucleotides)》,1995,14:969-973)或金刚烷乙酸(Manoharan等人,《四面体快报》,1995,36:3651-3654)，棕榈基部分(Mishra等人,《生物化学与生物物理学报(Biochim.Biophys.Acta)》,1995,1264:229-237)，或十八胺或己基氨基-羰基氧基胆固醇部分(Crooke等人,《药理和实验治疗学杂志(J.Pharmacol.Exp.Ther.)》,1996,277:923-937)。
在一些实施例中，配体改变其掺入的iRNA药剂的分布、靶向或寿命。在一些实施例中，例如，与不存在此类配体的物种相比，配体为选定靶标(例如，分子、细胞或细胞类型)、区室(例如，细胞或器官区室、组织、器官或身体区)提供增强的亲和力。典型的配体将不参与双链体核酸中的双链体配对。
配体可以包含天然存在的物质，如蛋白质(例如，人血清白蛋白(HSA)、低密度脂蛋白(LDL)或球蛋白)；碳水化合物(例如，右旋糖酐、支链淀粉、几丁质、壳聚糖、菊粉、环糊精或透明质酸)；或脂质。配体也可以是重组分子或合成分子，如合成聚合物，例如合成聚氨基酸。聚氨基酸的实例包含聚氨基酸，即聚赖氨酸(PLL)、聚L-天冬氨酸、聚L-谷氨酸、苯乙烯-马来酸酐共聚物、聚(L-丙交酯-共-乙交酯)共聚物、二乙烯基醚-马来酸酐共聚物、N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺共聚物(HMPA)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚氨酯、聚(2-乙基丙烯酸)、N-异丙基丙烯酰胺聚合物或聚膦嗪。多胺的实例包含：聚乙烯亚胺、聚赖氨酸(PLL)、精胺、亚精胺、多胺、假肽-多胺、拟肽多胺、树枝状多胺、精氨酸、脒、鱼精蛋白、阳离子脂质、阳离子卟啉、多胺的季盐或α螺旋肽。
配体还可以包含靶向基团，例如细胞或组织靶向剂，例如凝集素、糖蛋白、脂质或蛋白质，例如与特定细胞类型(如肾细胞)结合的抗体。靶向基团可以是促甲状腺素、促黑素、凝集素、糖蛋白、表面活性剂蛋白A、粘蛋白碳水化合物、多价乳糖、多价半乳糖、N-乙酰基-半乳糖胺、N-乙酰基-葡糖胺多价甘露糖、多价岩藻糖、糖基化多氨基酸、多价半乳糖、转铁蛋白、双膦酸酯、聚谷氨酸酯、聚天冬氨酸酯、脂质、胆固醇、类固醇、胆汁酸、叶酸、维生素B12、生物素或RGD肽或RGD肽模拟物。
配体的其它实例包含染料、嵌入剂(例如，吖啶)、交联剂(例如，补骨脂烯、丝裂霉素C(mitomycin C))、卟啉(TPPC4、德克萨斯卟啉(texaphyrin)、扩环卟啉(Sapphyrin))、多环芳香族烃(例如，吩嗪、二氢吩嗪)、人工核酸内切酶(例如，EDTA)、亲脂性分子(例如，胆固醇、胆酸、金刚烷乙酸、1-芘丁酸、二氢睾酮、1,3-双-O(十六烷基)甘油、香叶基氧基己基、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基、棕榈酸、肉豆蔻酸、O3-(油酰基)石胆酸、O3-(油酰基)胆烯酸、二甲氧基三苯甲基或吩噁嗪)、肽缀合物(例如，触角足突变肽、Tat肽)、烷化剂、磷酸盐、氨基、巯基、PEG(例如，PEG-40K)、MPEG、[MPEG]2、聚氨基、烷基、经取代的烷基、放射性标记的标志物、酶、半抗原(例如，生物素)、转运/吸收促进剂(例如，阿司匹林(aspirin)、维生素E、叶酸)、合成核糖核酸酶(例如，咪唑、双咪唑、组胺、咪唑簇、吖啶-咪唑缀合物、四氮杂大环化合物的Eu3+络合物)、二硝基苯基、HRP或AP。
配体可以是蛋白质(例如，糖蛋白)或肽(例如，对共配体具有特异性亲和力的分子)或抗体(例如，与特定细胞类型，如眼细胞结合的抗体)。配体还可以包含激素和激素受体。配体还可以包含非肽物质，如脂质、凝集素、碳水化合物、维生素、辅因子、多价乳糖、多价半乳糖、N-乙酰基-半乳糖胺、N-乙酰基-葡糖胺多价甘露糖或多价岩藻糖。配体可以是例如脂多糖、p38MAP激酶的激活剂或NF-κB的激活剂。
配体可以是物质，例如药物，其可以例如通过破坏细胞的细胞骨架，例如通过破坏细胞的微管、微丝和/或中间丝来增加iRNA药剂摄取到细胞中。药物可以是例如分类单元(taxon)、长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、细胞松弛素(cytochalasin)、诺考达唑(nocodazole)、杰斯内酯(japlakinolide)、拉春库林A(latrunculin A)、毒伞素(phalloidin)、斯文赫利A(swinholide A)、印丹诺辛(indanocine)或麦司文(myoservin)。
在一些实施例中，与如本文所描述的iRNA连接的配体充当药代动力学调节剂(PK调节剂)。PK调节剂包含亲脂性物质、胆汁酸、类固醇、磷脂类似物、肽、蛋白质结合剂、PEG、维生素等。示例性PK调节剂包含但不限于胆固醇、脂肪酸、胆酸、石胆酸、二烷基甘油酯、二酰基甘油酯、磷脂、鞘脂、萘普生(naproxen)、布洛芬(ibuprofen)、维生素E、生物素。还已知包括许多硫代磷酸酯键的与血清蛋白结合的寡核苷酸，因此在主链中包括多个硫代磷酸酯键的短寡核苷酸(例如，具有约5个碱基、10个碱基、15个碱基或20个碱基的寡核苷酸)也适于本公开作为配体(例如，作为PK调节配体)。另外，与血清组分(例如，血清蛋白)结合的适体也适于用作本文所描述的实施例中的PK调节配体。
本公开的配体缀合的寡核苷酸可以通过使用具有侧反应功能的寡核苷酸来合成，如源自连接分子连接到寡核苷酸上的寡核苷酸(如下文所描述的)。这种反应性寡核苷酸可以直接与可商购获得的配体、合成的带有多种保护基团中的任一种的配体、或具有与其连接的连接部分的配体反应。
本公开的缀合物中使用的寡核苷酸可以通过众所周知的固相合成技术方便且常规地制备。用于此类合成的设备由若干个供应商销售，例如，包含加利福尼亚州福斯特市的应用生物系统公司(Applied Biosystems(Foster City,Calif.))。可以另外或可替代地采用本领域已知的用于此类合成的任何其它方式。使用类似技术来制备其它寡核苷酸(如硫代磷酸酯和烷基化的衍生物)也是已知的。
在本公开的配体缀合的寡核苷酸和带有序列特异性连接的核苷的配体分子中，寡核苷酸和寡核苷可以利用标准核苷酸或核苷前体或已经带有连接部分的核苷酸或核苷缀合物前体、已经带有配体分子的配体-核苷酸或核苷缀合物前体或带有构建块的非核苷配体组装在合适的DNA合成器上。
当使用已经带有连接部分的核苷酸缀合物前体时，通常完成序列特异性连接核苷的合成，并且然后配体分子与连接部分反应以形成配体缀合的寡核苷酸。在一些实施例中，本公开的寡核苷酸或连接的核苷通过自动合成器合成，使用源自配体-核苷缀合物的磷脒以及可商购获得的和常规用于寡核苷酸合成的标准磷脒和非标准磷酰胺。
A.亲脂性部分
在某些实施例中，亲脂性部分是脂肪族的、环状的(如脂环族的)或多环的(如聚脂环族化合物，如类固醇(例如，甾醇)或直链或支链脂肪族烃。亲脂性部分通常可以包括烃链，所述烃链可以是环状或非环状的。烃链可以包括各种取代基或一个或多个杂原子，如氧或氮原子。此类亲脂性脂肪族部分包含但不限于饱和或不饱和C4-C30烃(例如，C6-C18烃)、饱和或不饱和脂肪酸、蜡(例如，脂肪酸和脂肪二酰胺的一元醇酯)、萜烯(例如，C10萜烯、C15倍半萜烯、C20二萜、C30三萜和C40四萜)和其它聚脂环族烃。例如，亲脂性部分可以含有C4-C30烃链(例如，C4-C30烷基或烯基)。在一些实施例中，亲脂性部分含有饱和或不饱和C6-C18烃链(例如，直链C6-C18烷基或烯基)。在一些实施例中，亲脂性部分含有饱和或不饱和C16烃链(例如，直链C16烷基或烯基)。
亲脂性部分可以通过本领域已知的任何方法与RNAi药剂连接，包含通过已经存在于亲脂性部分中或引入RNAi药剂中的官能团，如羟基(例如，—CO—CH2—OH)。已经存在于亲脂性部分中或引入到RNAi药剂中的官能团包含但不限于羟基、胺、羧酸、磺酸酯、磷酸酯、硫醇、叠氮化物和炔烃。
RNAi药剂与亲脂性部分的缀合可以例如通过在羟基和烷基R—、烷酰基RCO—或经取代的氨基甲酰基RNHCO—之间形成醚或羧酸或氨基甲酰基酯键而发生。烷基R可以是环状的(例如，环己基)或是无环的(例如，直链或支链的；以及饱和或不饱和的)。烷基R可以是丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基或十八烷基等。
在一些实施例中，亲脂性部分通过接头与双链RNAi药剂缀合，所述接头是含有以下的接头：醚、硫醚、脲、碳酸酯、胺、酰胺、马来酰亚胺-硫醚、二硫化物、磷酸二酯、磺酰胺键、点击反应产物(例如，来自叠氮化物-炔烃环加成的三唑)或氨基甲酸酯。
在另一个实施例中，亲脂性部分是类固醇，如甾醇。类固醇是含有全氢--1,2-环戊并菲环系统的多环化合物。类固醇包含但不限于胆汁酸(例如，胆酸、脱氧胆酸和脱氢胆酸)、可的松、地高辛、睾酮、胆固醇和阳离子类固醇(如可的松)。“胆固醇衍生物”是指由胆固醇衍生的化合物，例如通过取代、添加或去除取代基。
在另一个实施例中，亲脂性部分是芳香族部分。在此上下文中，术语“芳香族”广泛地指单芳香族烃和多芳香族烃。芳香族基团包含但不限于包括一个至三个芳香族环的C6-C14芳基部分，其可以任选地被取代；包括与烷基共价连接的芳基的“芳烷基”或“芳基烷基”，其中任一个可以独立地是任选地经取代的或未经取代的；以及“杂芳基”基团。如本文所使用的，术语“杂芳基”是指具有5个至14个环原子，优选地5个、6个、9个或10个环原子的基团；具有在环状阵列中共享的6、10或14个π电子，并且除了碳原子之外，还具有选自由氮(N)、氧(O)和硫(S)组成的组的一个至约三个杂原子。
如本文所使用的，“经取代的”烷基、环烷基、芳基、杂芳基或杂环基是具有一个至约四个，优选地一个至约三个，更优选地一个或两个非氢取代基的基团。合适的取代基包含但不限于卤代、羟基、硝基、卤代烷基、烷基、烷芳基、芳基、芳烷基、烷氧基、芳氧基、氨基、酰氨基、烷基氨基甲酰基、芳基氨基甲酰基、氨基烷基、烷氧基羰基、羧基、羟烷基、烷烃磺酰基、芳烃磺酰基、烷烃磺酰氨基、芳烃磺酰氨基，芳烷基磺酰氨基、烷基羰基、酰氧基、氰基和脲基。
在一些实施例中，亲脂性部分是芳烷基，例如，2-芳基丙酰基部分。选择芳烷基的结构特征，使得亲脂性部分将在体内与至少一种蛋白质结合。在某些实施例中，选择芳烷基的结构特征，使得亲脂性部分与血清、血管或细胞蛋白结合。在某些实施例中，芳烷基的结构特征促进与白蛋白、免疫球蛋白、脂蛋白、α-2-巨球蛋白或α-1-糖蛋白的结合。
在某些实施例中，配体是萘普生或萘普生的结构衍生物。萘普生的合成程序可以在美国专利第3,904,682号和美国专利第4,009,197号中找到，所述美国专利特此通过全文引用的方式并入。萘普生的化学名称是(S)-6-甲氧基-α-甲基-2-萘乙酸，并且结构是
在某些实施例中，配体是布洛芬或布洛芬的结构衍生物。布洛芬的合成程序可以在US3,228,831中找到，所述文献通过引用并入本文，用于其中所提供的方法。布洛芬的结构是
在US 7,626,014中描述了另外的示例性芳烷基，所述文献通过引用并入本文，用于其中所提供的方法。
在另一个实施例中，合适的亲脂性部分包含脂质、胆固醇、视黄酸、胆酸、金刚烷乙酸、1-芘丁酸、二氢睾酮、1,3-双-O(十六烷基)甘油、香叶基氧基己醇、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基、棕榈酸、肉豆蔻酸、O3-(油酰基)石胆酸、O3-(油酰基)胆烯酸、布洛芬、萘普生、二甲氧基三苯甲基或吩噁嗪。
在某些实施例中，可以将多于一个亲脂性部分并入双链RNAi药剂中，特别是当亲脂性部分具有低亲脂性或疏水性时。在一些实施例中，将两个或更多个亲脂性部分并入双链RNAi药剂的同一条链中。在一些实施例中，双链RNAi药剂的每条链都具有并入的一个或多个亲脂性部分。在一些实施例中，两个或更多个亲脂性部分并入到双链RNAi药剂的相同位置(即，相同的核碱基、相同的糖部分或相同的核苷间键)。这可以通过例如，通过载剂将两个或更多个亲脂性部分缀合，或通过支链接头将两个或更多个亲脂性部分缀合，或通过一个或多个接头将两个或更多个亲脂性部分缀合来实现，其中一个或多个接头将亲脂性部分连续连接。
亲脂性部分可以通过与RNAi药剂的核糖的直接连接与RNAi药剂缀合。可替代地，亲脂性部分可以通过接头或载剂与双链RNAi药剂缀合。
在某些实施例中，亲脂性部分可以通过一个或多个接头(系链)与RNAi药剂缀合。
在一些实施例中，亲脂性部分通过含有以下的接头与双链RNAi药剂缀合：醚、硫醚、脲、碳酸酯、胺、酰胺、马来酰亚胺-硫醚、二硫化物、磷酸二酯、磺酰胺键、点击反应的产物(例如，来自叠氮化物-炔烃环加成的三唑)或氨基甲酸酯。
B.脂质缀合物
在一些实施例中，配体是脂质或基于脂质的分子。此类脂质或基于脂质的分子通常可以与血清蛋白，如人血清白蛋白(HSA)结合。HSA结合配体允许缀合物血管分布到靶组织。例如，靶组织可以是眼睛。可以与HSA结合的其它分子也可以用作配体。例如，可以使用萘普辛(neproxin)或阿司匹林。脂质或基于脂质的配体可以(a)增加对缀合物降解的抗性，(b)增加靶向或转运到靶细胞或细胞膜中，和/或(c)可以用于调节与血清蛋白，例如HSA的结合HSA。
基于脂质的配体可以用于调节，例如控制(例如，抑制)缀合物与靶组织的结合。例如，更强地与HSA结合的脂质或基于脂质的配体将较不可能被靶向到肾脏，并且因此较不可能从身体清除。较不强烈地与HSA结合的脂质或基于脂质的配体可以用于将缀合物靶向到肾脏。
在一些实施例中，基于脂质的配体与HSA结合。例如，配体可以以足够的亲和力与HSA结合，从而增强缀合物在非肾组织中的分布。然而，亲和力通常不会强到HSA配体结合不能被逆转。
在一些实施例中，基于脂质的配体与HSA微弱地结合或根本不结合，使得缀合物在肾脏中的分布增强。靶向到肾细胞的其它部分也可以代替基于脂质的配体或除其之外使用。
另一方面，配体是被靶细胞(例如，增殖细胞)摄取的部分，例如维生素。这些对于治疗以不期望的细胞增殖为特征的疾病特别有用，例如恶性或非恶性类型的疾病，例如癌细胞。示例性维生素包含维生素A、E和K。包含的其它示例性维生素是B族维生素，例如叶酸、B12、核黄素、生物素、吡哆醛或被癌细胞摄取的其它维生素或营养素。还包含HSA和低密度脂蛋白(LDL)。
C.细胞渗透剂
另一方面，配体是细胞渗透剂，如螺旋细胞渗透剂。在一些实施例中，药剂为两亲性的。示例性药剂为肽，如tat或触角足突变肽。如果药剂为肽，那么其可以被修饰，包含肽基模拟物、反演体、非肽或假肽键和使用D-氨基酸。螺旋剂通常是α-螺旋剂，并且可以具有亲脂性和疏脂性相。
配体可以是肽或肽模拟物。肽模拟物(在本文中也称为寡肽模拟物)是能够折叠成类似于天然肽的所定义三维结构的分子。肽和肽模拟物与iRNA药剂的连接可能影响iRNA的药代动力学分布，如通过增强细胞识别和吸收。肽或肽模拟物部分的长度可以为约5个至50个氨基酸，例如约5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个或50个氨基酸长。
肽或肽模拟物可以是例如细胞渗透肽、阳离子肽、两亲性肽或疏水肽(例如，主要由Tyr、Trp或Phe组成)。肽部分可以是树状体肽、约束肽或交联肽。在另一个替代方案中，肽部分可以包含疏水性膜易位序列(MTS)。示例性疏水性含MTS肽是具有氨基酸序列AAVALLPAVLLALLAP(SEQ ID NO:3)的RFGF。含疏水性MTS的RFGF类似物(例如，氨基酸序列AALLPVLLAAP(SEQ ID NO:4))也可以是靶向部分。肽部分可以是“递送”肽，所述肽可以携带包含肽、寡核苷酸和蛋白质在内的大极性分子穿过细胞膜。例如，来自HIV Tat蛋白(GRKKRRQRRRPPQ(SEQ ID NO:5))和果蝇触角足突变(Drosophila Antennapedia)蛋白(RQIKIWFQNRRMKWKK(SEQ ID NO:6))的序列已被发现能够起到递送肽的作用。肽或肽模拟物可以由DNA的随机序列编码，如从噬菌体展示文库或一珠一化合物(OBOC)组合文库中鉴定的肽(Lam等人,《自然》,354:82-84,1991)。通常，通过掺入的单体单元与dsRNA药剂连接的肽或肽模拟物的实例是细胞靶向肽，如精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)-肽或RGD模拟物。肽部分的长度可以在约5个氨基酸至约40个氨基酸的范围内。肽部分可以具有结构修饰，如增加稳定性或直接构象特性。可以使用下面描述的任何结构修饰。
用于本公开的组合物和方法的RGD肽可以是线性或环状的，并且可以被修饰，例如糖基化或甲基化，以促进靶向特定组织。含有RGD的肽和肽模拟物可以包含D-氨基酸以及合成的RGD模拟物。除了RGD，还可以使用靶向整合素配体的其它部分。在一些实施例中，此配体的缀合物靶向PECAM-1或VEGF。
RGD肽部分可以用于靶向特定细胞类型，例如肿瘤细胞，如内皮肿瘤细胞或乳腺癌肿瘤细胞(Zitzmann等人,《癌症研究(Cancer Res.)》,62:5139-43,2002)。RGD肽可以促进dsRNA药剂靶向多种其它组织的肿瘤，包含肺、肾、脾或肝的肿瘤(Aoki等人,《癌症基因疗法(Cancer Gene Therapy)》8:783-787,2001)。通常，RGD肽将促进iRNA药剂靶向肾。RGD肽可以是线性或环状的，并且可以被修饰，例如糖基化或甲基化，以促进靶向特定组织。例如，糖基化RGD肽可以将iRNA药剂递送到表达αVβ3的肿瘤细胞(Haubner等人,《核医学杂志(Jour.Nucl.Med.)》,42:326-336,2001)。
“细胞渗透肽”能够渗透细胞，例如微生物细胞(如细菌或真菌细胞)或哺乳动物细胞(如人细胞)。微生物细胞渗透肽可以是例如α-螺旋线性肽(例如，LL-37或Ceropin P1)、含二硫键的肽(例如，α-防御素、β-防御素或细菌素)或仅含有一个或两个主要氨基酸的肽(例如，PR-39或吲哚西丁(indolicidin))。细胞渗透肽还可以包含核定位信号(NLS)。例如，细胞渗透肽可以是二分两亲性肽，如MPG，其源自HIV-1gp41的融合肽结构域和SV40大T抗原的NLS(Simeoni等人,《核酸研究》31:2717-2724,2003)。
D.碳水化合物缀合物和配体
在本公开的组合物和方法的一些实施例中，iRNA寡核苷酸进一步包括碳水化合物。碳水化合物缀合的iRNA对于核酸的体内递送以及适于如本文所描述的体内治疗用途的组合物而言是有利的。如本文所使用的，“碳水化合物”是指化合物，所述化合物是碳水化合物，所述碳水化合物本身由一个或多个单糖单元构成，所述单糖单元具有至少6个碳原子(可以是直链、支链或环状)，其中氧、氮或硫原子与每个碳原子结合；或是具有碳水化合物部分作为其部分的化合物，所述碳水化合物部分由一个或多个单糖单元构成，每个单糖单元具有至少六个碳原子(可以是直链、支链或环状)，其中氧、氮或硫原子与每个碳原子结合。代表性碳水化合物包含糖(单糖、二糖、三糖和含有约4个、5个、6个、7个、8个或9个单糖单元的寡糖)和多糖如淀粉、糖原、纤维素和多糖胶。特定单糖包含C5及以上(例如，C5、C6、C7或C8)糖；二糖和三糖包含具有两个或三个单糖单元(例如，C5、C6、C7或C8)的糖。
在某些实施例中，本公开的组合物和方法包含C16配体。在示例性实施例中，本公开的C16配体具有以下结构(下文针对尿嘧啶碱基进行例示，然而对于呈现任何碱基(C、G、A等)或具有本文所呈现的任何其它修饰的核苷酸，C16配体的连接是可设想的，条件是保留2'核糖连接)，并且连接在如此修饰的残基内核糖的2'位置处：
如上所示，C16配体修饰的残基在如此修饰的示例性残基(此处为尿嘧啶)的2'-核糖位置处呈现直链烷基。
在一些实施例中，本公开的RNAi药剂的碳水化合物缀合物进一步包括一个或多个如上文所描述的另外的配体，如但不限于PK调节剂或细胞渗透肽。
适于本公开的另外的碳水化合物缀合物和接头包含WO 2014/179620和WO 2014/179627中所描述的那些，所述文献中的每一个的全部内容通过引用并入本文。
在某些实施例中，本公开的组合物和方法包含如本文所描述的RNAi药剂的乙烯基膦酸酯(VP)修饰。在示例性实施例中，本公开的乙烯基膦酸酯具有以下结构：
本公开的乙烯基膦酸酯可以与本公开的dsRNA的反义链或有义链连接。在某些优选实施例中，本公开的乙烯基膦酸酯与dsRNA的反义链连接，任选地在dsRNA反义链的5'端处。dsRNA药剂可以在有义链或反义链的5'端处包括含磷基团。5'端含磷基团可以是5'端磷酸酯(5'-P)、5'端硫代磷酸酯(5'-PS)、5-'端硫代磷酸二酯(5'-PS2)、5'端乙烯基膦酸酯(5'-VP)、5'端甲基膦酸酯(MePhos)或5'-脱氧-5'-C-丙二酰。当5'端含磷基团是5'端基乙烯基膦酸酯(5'-VP)时，5'-VP可以是5'-E-VP异构体(即反式乙烯基膦酸酯)、5'-Z-VP异构体(即顺式乙烯基磷酸酯/>)或其混合物。
乙烯基膦酸酯修饰也设想用于本公开的组合物和方法。示例性磷酸乙烯基膦酸酯结构是：
在一些实施例中，碳水化合物缀合物包括单糖。在一些实施例中，单糖是N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)。包括一种或多种N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)衍生物的GalNAc缀合物在例如美国专利第8,106,022号中进行了描述，所述美国专利的完整内容特此通过引用的方式并入本文。在一些实施例中，GalNAc缀合物用作将iRNA靶向特定细胞的配体。在一些实施例中，GalNAc缀合物将iRNA靶向肝细胞，例如，通过充当肝细胞(例如，肝细胞(hepatocyte))的去唾液酸糖蛋白受体的配体。
在一些实施例中，碳水化合物缀合物包括一种或多种GalNAc衍生物。GalNAc衍生物可以通过接头连接，例如，二价或三价支链接头。在一些实施例中，GalNAc缀合物与有义链的3'端缀合。在一些实施例中，GalNAc缀合物通过接头，例如本文所描述的接头与iRNA药剂缀合(例如，与有义链的3'端)。
在一些实施例中，GalNAc缀合物是
在一些实施例中，RNAi药剂通过接头与碳水化合物缀合物连接，如以下示意图所示，其中X是O或S：
/>
在一些实施例中，RNAi药剂与如表1中定义的L96缀合，并且如下所示：
在一些实施例中，用于本公开的组合物和方法的碳水化合物缀合物选自由以下组成的组：
/>
/>
/>
用于本文所描述的实施例中的另一代表性碳水化合物缀合物包含但不限于：
(式XXIII)，当X或Y中的一个是寡核苷酸时，另一个是氢。
在一些实施例中，碳水化合物缀合物进一步包括一个或多个如上文所描述的另外的配体，如但不限于PK调节剂和/或细胞渗透肽。
在一些实施例中，本公开的iRNA通过接头与碳水化合物缀合。iRNA碳水化合物缀合物与本公开的组合物和方法的接头的非限制性实例包含但不限于：
/>
以及
当X或Y中的一个是寡核苷酸时，另一个是氢。
E.热不稳定修饰
在某些实施例中，dsRNA分子可以通过在反义链的种子区(即反义链5'-端的位置2至9)掺入热不稳定修饰来优化RNA干扰，以减少或抑制脱靶基因沉默。已经发现，具有反义链的dsRNA具有降低脱靶基因沉默活性的作用，所述反义链包括前9个核苷酸位置内的双链体的至少一个热不稳定修饰，从所述反义链的5'端开始计数。因此，在一些实施例中，反义链在反义链的5'区的前9个核苷酸位置内包括至少一个(例如，一个、两个、三个、四个、五个或更多个)双链体的热不稳定修饰。在一些实施例中，双链体的一个或多个热不稳定修饰位于从反义链5'-端起的位置2至9处，或优选地位置4至8。在一些另外的实施例中，双链体的热不稳定修饰位于从反义链的5'端起的位置6、7或8处。在仍一些另外的实施例中，双链体的热不稳定修饰位于从反义链的5'端起的位置7处。术语“热不稳定修饰”包含将导致dsRNA的总熔融温度(Tm)低于(优选地，Tm低一度、两度、三度或四度)没有此类修饰的dsRNA的Tm的修饰。在一些实施例中，双链体的热不稳定修饰位于从反义链的5'端起的位置2、3、4、5或9处。
热不稳定修饰可以包含但不限于无碱基修饰；与相对链中的相对核苷酸的错配；以及糖修饰，如2'-脱氧修饰或无环核苷酸，例如解锁核酸(UNA)或乙二醇核酸(GNA)。
例示的无碱基修饰包含但不限于以下：
其中R＝H、Me、Et或OMe；R'＝H、Me、Et或OMe；R”＝H、Me、Et或OMe
其中B是经修饰的或未经修饰的核碱基。
例示的糖修饰包含但不限于以下：
其中B是经修饰的或未经修饰的核碱基。
在一些实施例中，双链体的热不稳定修饰选自由以下组成的组：
以及/>
其中B是经修饰的或未经修饰的核碱基，并且每个结构上的星号表示R、S或外消旋。
术语“无环核苷酸”是指具有无环核糖糖的任何核苷酸，例如其中核糖碳之间的任何键(例如，C1'-C2'、C2'-C3'、C3'-C4'、C4'-O4'或C1'-O4')不存在或核糖碳或氧中的至少一个(例如，C1'、C2'、C3'、C4'或O4')独立地或组合地不存在于核苷酸中。在一些实施例中，无环核苷酸是 其中B是经修饰的或未经修饰的核碱基，R1和R2独立地为H、卤素、OR3或烷基；并且R3是H、烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或糖。术语“UNA”是指解锁无环核酸，其中糖的任何键都已被去除，形成解锁“糖”残基。在一个实例中，UNA还涵盖C1'-C4'之间的键被去除的单体(即C1'与C4'碳之间的共价碳-氧-碳键)。在另一个实例中，糖的C2'-C3'键(即C2'与C3'碳之间的共价碳-碳键)被去除(参见Mikhailov等人,《四面体快报》,26(17):2059(1985)；以及Fluiter等人,《分子生物系统》,10:1039(2009)，所述文献特此通过全文引用的方式并入本文)。无环衍生物在不影响沃森-克里克配对的情况下提供了更大的主链灵活性。无环核苷酸可以通过2'-5'或3'-5'键连接。
术语‘GNA’是指乙二醇核酸，所述乙二醇核酸是一种类似于DNA或RNA的聚合物，但其“主链”的组成不同，因为其由磷酸二酯键连接的重复甘油单元组成：
双链体的热不稳定修饰可以是热不稳定核苷酸与dsRNA双链体内相对链中的相对核苷酸之间的错配(即非互补碱基对)。示例性错配碱基对包含G:G、G:A、G:U、G:T、A:A、A:C、C:C、C:U、C:T、U:U、T:T、U:T或其组合。本领域已知的其它错配碱基配对也适用于本发明。错配可以发生在核苷酸(天然存在的核苷酸或经修饰的核苷酸)之间，即，错配碱基配对可以发生在来自相应的核苷酸的核碱基之间，而与核苷酸的核糖糖上的修饰无关。在某些实施例中，dsRNA分子在错配配对中含有至少一个核碱基，所述核碱基为2'-脱氧核碱基；例如，2'-脱氧核碱基是在有义链中。
在一些实施例中，反义链的种子区中的双链体的热不稳定修饰包含与靶mRNA上的互补碱基具有受损W-C-H-键合的核苷酸，如：
/>
在WO 2011/133876中详细描述了无碱基核苷酸、无环核苷酸修饰(包含UNA和GNA)和错配修饰的更多实例，所述文献通过全文引用的方式并入本文。
热不稳定修饰还可以包含减少的或消除了与相对碱基形成氢键的能力的通用碱基和磷酸酯修饰。
在一些实施例中，双链体的热不稳定修饰包含具有非规范碱基的核苷酸，如但不限于具有受损的或完全消除了与相对链中的碱基形成氢键的能力的核碱基修饰。已经评估了这些核碱基修饰对dsRNA双链体的中心区域的不稳定，如WO 2010/0011895中所描述的，所述文献通过全文引用的方式并入本文。示例性核碱基修饰是：
在一些实施例中，反义链的种子区中的双链体的热不稳定修饰包含与靶mRNA上的碱基互补的一个或多个α-核苷酸，如：
其中R是H、OH、OCH3、F、NH2、NHMe、NMe2或O-烷基。
与天然磷酸二酯键相比，已知降低dsRNA双链体热稳定性的示例性磷酸酯修饰是：
R基团的烷基可以是C1-C6烷基。R基团的具体烷基包含但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、戊基和己基。
如本领域技术人员将认识到的，鉴于核碱基的功能作用是定义本公开的RNAi药剂的特异性，而核碱基修饰可以以如本文所描述的各种方式进行，例如将不稳定修饰引入本公开的RNAi药剂中，例如为了相对于脱靶效应增强在靶效应，对于非核碱基修饰，例如对多核糖核苷酸的糖基或磷酸酯主链的修饰，本公开的RNAi药剂上可用的和通常存在的修饰的范围往往要大得多。此类修饰在本公开的其它部分中进行了更详细的描述，并且明确考虑用于本公开的RNAi药剂，其具有如上所述或本文其它地方所述的天然核碱基或经修饰的核碱基。
除了包括热不稳定修饰的反义链外，dsRNA还可以包括一个或多个稳定修饰。例如，dsRNA可以包括至少两个(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个)稳定修饰。不受限制地，所有稳定修饰都可以存在于一条链中。在一些实施例中，有义链和反义链两者均包括至少两个稳定修饰。稳定修饰可以发生在有义链或反义链的任何核苷酸上。例如，稳定修饰可以发生在有义链或反义链上的每个核苷酸上；每个稳定修饰可以在有义链或反义链上以交替模式发生；或有义链或反义链两者包括交替模式的稳定修饰。有义链上的稳定修饰的交替模式可以与反义链相同或不同，并且有义链上稳定修饰的交替模式可以相对于反义链上稳定修饰的交替模式具有偏移。
在一些实施例中，反义链包括至少两个(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个)稳定修饰。不受限制地，反义链中的稳定修饰可以存在于任何位置处。
在一些实施例中，反义链包括从5'端起的位置2、6、8、9、14和16处的稳定修饰。在一些其它实施例中，反义链包括从5'端起的位置2、6、14和16处的稳定修饰。在仍一些其它实施例中，反义链包括从5'端起的位置2、14和16处的稳定修饰。
在一些实施例中，反义链包括与不稳定修饰相邻的至少一个稳定修饰。例如，稳定修饰可以是不稳定修饰的5'端或3'端处的核苷酸，即距离不稳定修饰的位置-1或+1的位置处。在一些实施例中，反义链包括不稳定修饰的5'端和3'端中的每一个处的稳定修饰，即从距离不稳定修饰的位置-1和+1的位置。
在一些实施例中，反义链包括不稳定修饰的3'端处的至少两个稳定修饰，即距离不稳定修饰的位置+1或+2的位置处。
在一些实施例中，有义链包括至少两个(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个)稳定修饰。不受限制地，有义链中的稳定修饰可以存在于任何位置处。在一些实施例中，有义链包括从5'端起的位置7、10和11处的稳定修饰。在一些其它实施例中，有义链包括从5'端起的位置7、9、10和11处的稳定修饰。在一些实施例中，有义链包括从反义链的5'端开始计数，与反义链的位置11、12和15相对或互补的位置处的稳定修饰。在一些其它实施例中，有义链包括从反义链的5'端开始计数，与反义链的位置11、12、13和15相对或互补的位置处的稳定修饰。在一些实施例中，有义链包括两个、三个或四个稳定修饰的嵌段。
在一些实施例中，有义链不包括与反义链中的双链体的热不稳定修饰相对或互补的位置中的稳定修饰。
示例性的热稳定修饰包含但不限于2'-氟修饰。其它热稳定修饰包含但不限于LNA。
在一些实施例中，本公开的dsRNA包括至少四个(例如，四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个)2'-氟核苷酸。不受限制地，所有2'-氟核苷酸都可以存在于一条链中。在一些实施例中，有义链和反义链两者均包括至少两个2'-氟核苷酸。2'-氟修饰可以发生在有义链或反义链的任何核苷酸上。例如，2'-氟修饰可以发生在有义链或反义链上的每个核苷酸上；每个2'-氟修饰可以在有义链或反义链上以交替模式发生；或有义链或反义链两者包括交替模式的2'-氟修饰。有义链上的2'-氟修饰的交替模式可以与反义链相同或不同，并且有义链上2'-氟修饰的交替模式可以相对于反义链上2'-氟修饰的交替模式具有偏移。
在一些实施例中，反义链包括至少两个(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个)2'-氟核苷酸。不受限制地，反义链中的2'-氟修饰可以存在于任何位置处。在一些实施例中，反义包括从5'端起的位置2、6、8、9、14和16处的2'-氟核苷酸。在一些其它实施例中，反义包括从5'端起的位置2、6、14和16处的2'-氟核苷酸。在仍一些其它实施例中，反义包括从5'端起的位置2、14和16处的2'-氟核苷酸。
在一些实施例中，反义链包括与不稳定修饰相邻的至少一个2'-氟核苷酸。例如，2'-氟核苷酸可以是不稳定修饰的5'端或3'端处的核苷酸，即距离不稳定修饰的位置-1或+1的位置处。在一些实施例中，反义链包括不稳定修饰的5'端和3'端中的每一个处的2'-氟核苷酸，即从距离不稳定修饰的位置-1和+1的位置。
在一些实施例中，反义链包括不稳定修饰的3'端处的至少两个2'-氟核苷酸，即距离不稳定修饰的位置+1或+2的位置处。
在一些实施例中，有义链包括至少两个(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个)2'-氟核苷酸。不受限制地，有义链中的2'-氟修饰可以存在于任何位置处。在一些实施例中，反义包括从5'端起的位置7、10和11处的2'-氟核苷酸。在一些其它实施例中，有义链包括从5'端起的位置7、9、10和11处的2'-氟核苷酸。在一些实施例中，有义链包括从反义链的5'端开始计数，与反义链的位置11、12和15相对或互补的位置处的2'-氟核苷酸。在一些其它实施例中，有义链包括从反义链的5'端开始计数，与反义链的位置11、12、13和15相对或互补的位置处的2'-氟核苷酸。在一些实施例中，有义链包括两个、三个或四个2'-氟核苷酸的嵌段。
在一些实施例中，有义链不包括与反义链中的双链体的热不稳定修饰相对或互补的位置中的2'-氟核苷酸。
在一些实施例中，本公开的dsRNA分子包括21个核苷酸(nt)的有义链和23个核苷酸(nt)的反义链，其中所述反义链包括至少一个热不稳定核苷酸，其中所述至少一个热不稳定核苷酸出现在反义链的种子区(即反义链的5'端的位置2至9处)，其中所述dsRNA的一端是平端，而另一端包括2nt突出端，并且其中所述dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个或全部七个)：(i)所述反义包括2个、3个、4个、5个或6个2'-氟修饰；(ii)所述反义包括1个、2个、3个、4个或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；(iii)所述有义链与配体缀合；(iv)所述有义链包括2个、3个、4个或5个2'-氟修饰；(v)所述有义链包括1个、2个、3个、4个或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；(vi)所述dsRNA包括至少四个2'-氟修饰；以及(vii)所述dsRNA包括所述反义链的5'端处的平端。优选地，2nt突出端位于反义的3'端处。
在一些实施例中，dsRNA分子的有义链和反义链中的每个核苷酸都可以是经修饰的。每个核苷酸可以用相同或不同的修饰进行修饰，所述修饰可以包含一个或两个非连接磷酸酯氧或一个或多个连接磷酸酯氧的一种或多种改变；核糖的成分的改变，例如，核糖上的2'羟基的改变；用“去磷酸”接头大规模取代磷酸酯部分；天然存在的碱基的修饰或替换；以及核糖-磷酸酯主链的替换或修饰。
由于核酸是亚基的聚合物，许多修饰发生在核酸内重复的位置，例如碱基或磷酸酯部分的修饰，或磷酸酯部分的非连接O。在一些情况下，修饰将发生在核酸中的所有主体位置，但在许多情况下不会。例如，修饰可以仅发生在3'或5'末端位置处，可以仅发生于末端区域中，例如，在末端核苷酸上的位置处或在链的最后2个、3个、4个、5个或10个核苷酸中。修饰可以发生在双链区、单链区或两者中。修饰可以只发生在RNA的双链区中，或可以只发生于RNA的单链区中。例如，非连接O位置处的硫代磷酸酯修饰可以仅发生在一个或两个末端处，可以仅发生于末端区中，例如，在末端核苷酸上的位置处或在链的最后2个、3个、4个、5个或10个核苷酸中，或可以发生在双链和单链区中，特别是在末端处。一个或多个5'端可以被磷酸化。
例如，为增强稳定性，可以在突出端中包含特定的碱基，或在单链突出端中，例如在5'或3'突出端中或在两者中包含经修饰的核苷酸或核苷酸替代物。例如，在突出端中包含嘌呤核苷酸可以是期望的。在一些实施例中，3'或5'突出端中的所有或一些碱基可以被修饰，例如，通过本文所描述的修饰。修饰可以包含，例如使用本领域已知的修饰在核糖糖的2'位置处的修饰，例如，用脱氧核糖核苷酸、2'-脱氧-2'-氟(2'-F)或2'-O-甲基修饰代替核碱基的核糖，以及磷酸酯基团的修饰，例如硫代磷酸酯修饰。突出端不需要与靶序列同源。
在一些实施例中，有义链和反义链的每个残基独立地用LNA、HNA、CeNA、2'-甲氧基乙基、2'-O-甲基、2'-O-烯丙基、2'-C-烯丙基、2'-脱氧或2'-氟修饰。链可以含有多于一种修饰。在一些实施例中，有义链和反义链的每个残基独立地用2'-O-甲基或2'-氟修饰。应理解，这些修饰是对反义链中存在的双链体的至少一个热不稳定修饰的补充。
在有义链和反义链上通常存在至少两种不同的修饰。这两种修饰可以是2'-脱氧、2'-O-甲基或2'-氟修饰、无环核苷酸或其它修饰。在一些实施例中，有义链和反义链各自包括选自2'-O-甲基或2'-脱氧的两种不同修饰的核苷酸。在一些实施例中，有义链和反义链的每个残基独立地用2'-O-甲基核苷酸、2'-O-脱氧核苷酸、2'-脱氧-2'-氟核苷酸、2'-O-N-甲基乙酰氨基(2'-O-NMA)核苷酸、2'-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2'-O-DMAEOE)核苷酸、2'-O-氨基丙基(2'-O-AP)核苷酸或2'-ara-F核苷酸修饰。同样，应理解，这些修饰是对反义链中存在的双链体的至少一个热不稳定修饰的补充。
在一些实施例中，本公开的dsRNA分子包括交替模式的修饰，特别是在B1、B2、B3、B1'、B2'、B3'、B4'区域中。如本文所使用的，术语“交替基序”或“交替模式”是指具有一个或多个修饰的基序，每个修饰发生在一条链的交替核苷酸上。交替核苷酸可以指每隔一个核苷酸一个或每三个核苷酸一个，或类似的模式。例如，如果A、B和C各自表示核苷酸的一种修饰类型，则交替基序可以是“ABABABABABAB…”、“AABBAABBAABB…”、“AABAABAABAAB…”、“AAABAAABAAAB…”、“AAABBBAAABBB…”或“ABCABCABCABC…”等。
包含在交替基序中的修饰的类型可以是相同的或不同的。例如，如果A、B、C、D各自表示核苷酸上的一种修饰类型，则交替模式，即每隔一个核苷酸上的修饰可以是相同的，但每个有义链或反义链可以选自交替基序内的若干种修饰可能性，如“ABABAB…”、“ACACAC…”、“BDBDBD…”或“CDCDCD…”等。
在一些实施例中，本公开的dsRNA分子包括相对于反义链上的交替基序的修饰模式，有义链上交替基序的修饰模式发生了偏移。所述偏移可以使得有义链的核苷酸的经修饰的基团对应于反义链的核苷酸的不同经修饰的基团，并且反之亦然。例如，当有义链与dsRNA双链体中的反义链配对时，有义链中的交替基序可以从链的5'到3'以“ABABAB”开始，并且反义链中的交替基序可以在双链体区内从链的3'到5'以“BABABA”开始。作为另一个实例，有义链中的交替基序可以从链的5'到3'以“AABBAABB”开始，并且反义链中的交替基序在双链体区内可以从链的3'到5'以“BBAABBAA”开始，因此在有义链与反义链之间存在修饰模式的完全或部分转移。
本公开的dsRNA分子可以进一步包括至少一个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键。硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键修饰可以发生在链的任何位置中的有义链或反义链或两条链的任何核苷酸上。例如，核苷酸间键修饰可以发生在有义链或反义链上的每个核苷酸上；每个核苷酸间键修饰可以在有义链或反义链上以交替模式发生；或有义链或反义链以交替模式包括两种核苷酸间键修饰。有义链上的核苷酸间键修饰的交替模式可以与反义链相同或不同，并且有义链上核苷酸间键修饰的交替模式可以相对于反义链上核苷酸间键修饰的交替模式具有偏移。
在一些实施例中，dsRNA分子包括突出端区中的硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键修饰。例如，突出端区包括两个核苷酸，所述两个核苷酸之间具有硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键。还可以进行核苷酸间键修饰，以将突出端核苷酸与双链体区内的末端配对核苷酸连接。例如，至少2个、3个、4个或所有突出端核苷酸可以通过硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键连接，并且任选地，可以存在另外的硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键，将突出端核苷酸与紧挨着突出端核苷酸的配对核苷酸连接。例如，在末端三个核苷酸之间可能存在至少两个硫代磷酸酯核苷酸间键，其中三个核苷酸中的两个是突出端核苷酸，并且第三个是与突出端核苷酸相邻的配对核苷酸。优选地，这些末端三个核苷酸可以位于反义链的3'端处。
在一些实施例中，dsRNA分子的有义链包括由1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个或16个磷酸酯核苷酸间键分离的两个至十个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键的1个至10个嵌段，其中所述硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键中的一个位于寡核苷酸序列中的任何位置处，并且所述有义链与包括硫代磷酸酯、甲基膦酸酯和磷酸酯核苷酸间键的任何组合的反义链或包括硫代磷酸酯或甲基膦酸酯或磷酸酯键的反义链配对。
在一些实施例中，dsRNA分子的反义链包括由1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个或18个磷酸酯核苷酸间键分离的两个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键的两个嵌段，其中所述硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键中的一个位于寡核苷酸序列中的任何位置处，并且所述反义链与包括硫代磷酸酯、甲基膦酸酯和磷酸酯核苷酸间键的任何组合的有义链或包括硫代磷酸酯或甲基膦酸酯或磷酸酯键的反义链配对。
在一些实施例中，dsRNA分子的反义链包括由1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个或16个磷酸酯核苷酸间键分离的三个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键的两个嵌段，其中所述硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键中的一个位于寡核苷酸序列中的任何位置处，并且所述反义链与包括硫代磷酸酯、甲基膦酸酯和磷酸酯核苷酸间键的任何组合的有义链或包括硫代磷酸酯或甲基膦酸酯或磷酸酯键的反义链配对。
在一些实施例中，dsRNA分子的反义链包括由1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个或14个磷酸酯核苷酸间键分离的四个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键的两个嵌段，其中所述硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键中的一个位于寡核苷酸序列中的任何位置处，并且所述反义链与包括硫代磷酸酯、甲基膦酸酯和磷酸酯核苷酸间键的任何组合的有义链或包括硫代磷酸酯或甲基膦酸酯或磷酸酯键的反义链配对。
在一些实施例中，dsRNA分子的反义链包括由1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个或12个磷酸酯核苷酸间键分离的五个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键的两个嵌段，其中所述硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键中的一个位于寡核苷酸序列中的任何位置处，并且所述反义链与包括硫代磷酸酯、甲基膦酸酯和磷酸酯核苷酸间键的任何组合的有义链或包括硫代磷酸酯或甲基膦酸酯或磷酸酯键的反义链配对。
在一些实施例中，dsRNA分子的反义链包括由1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个磷酸酯核苷酸间键分离的六个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键的两个嵌段，其中所述硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键中的一个位于寡核苷酸序列中的任何位置处，并且所述反义链与包括硫代磷酸酯、甲基膦酸酯和磷酸酯核苷酸间键的任何组合的有义链或包括硫代磷酸酯或甲基膦酸酯或磷酸酯键的反义链配对。
在一些实施例中，dsRNA分子的反义链包括由1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或8个磷酸酯核苷酸间键分离的七个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键的两个嵌段，其中所述硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键中的一个位于寡核苷酸序列中的任何位置处，并且所述反义链与包括硫代磷酸酯、甲基膦酸酯和磷酸酯核苷酸间键的任何组合的有义链或包括硫代磷酸酯或甲基膦酸酯或磷酸酯键的反义链配对。
在一些实施例中，dsRNA分子的反义链包括由1个、2个、3个、4个、5个或6个磷酸酯核苷酸间键分离的八个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键的两个嵌段，其中所述硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键中的一个位于寡核苷酸序列中的任何位置处，并且所述反义链与包括硫代磷酸酯、甲基膦酸酯和磷酸酯核苷酸间键的任何组合的有义链或包括硫代磷酸酯或甲基膦酸酯或磷酸酯键的反义链配对。
在一些实施例中，dsRNA分子的反义链包括由1个、2个、3个或4个磷酸酯核苷酸间键分离的九个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键的两个嵌段，其中所述硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键中的一个位于寡核苷酸序列中的任何位置处，并且所述反义链与包括硫代磷酸酯、甲基膦酸酯和磷酸酯核苷酸间键的任何组合的有义链或包括硫代磷酸酯或甲基膦酸酯或磷酸酯键的反义链配对。
在一些实施例中，本公开的dsRNA分子进一步包括有义或反义链的末端位置的位置1至10内的一个或多个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键修饰。例如，至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个核苷酸可以通过有义或反义链的一端或两端处的硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键连接。
在一些实施例中，本公开的dsRNA分子进一步包括每个有义或反义链的双链体的内部区的位置1至10内的一个或多个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键修饰。例如，至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个核苷酸可以通过从有义链的5'端开始计数的双链体区的位置8至16处的硫代磷酸酯甲基膦酸酯核苷酸间键连接；dsRNA分子可以任选地进一步包括末端位置的位置1至10内的一个或多个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键修饰。
在一些实施例中，本公开的dsRNA分子进一步包括有义链的位置1至5内的一个至五个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键修饰和位置18至23内的一个至五个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键修饰(从5'端开始计数)，以及反义链的位置1和2处的一个至五个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键修饰和位置18至23内的一个至五个(从5'端开始计数)。
在一些实施例中，本公开的dsRNA分子进一步包括有义链的位置1至5内的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置18至23内的一个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键修饰(从5'端开始计数)，以及反义链的位置1和2处的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置18至23内的两个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键修饰(从5'端开始计数)。
在一些实施例中，本公开的dsRNA分子进一步包括有义链的位置1至5内的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置18至23内的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5'端开始计数)，以及反义链的位置1和2处的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置18至23内的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5'端开始计数)。
在一些实施例中，本公开的dsRNA分子进一步包括有义链的位置1至5内的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置18至23内的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5'端开始计数)，以及反义链的位置1和2处的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置18至23内的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5'端开始计数)。
在一些实施例中，本公开的dsRNA分子进一步包括有义链的位置1至5内的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置18至23内的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5'端开始计数)，以及反义链的位置1和2处的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置18至23内的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5'端开始计数)。
在一些实施例中，本公开的dsRNA分子进一步包括有义链的位置1至5内的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置18至23内的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5'端开始计数)，以及反义链的位置1和2处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置18至23内的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5'端开始计数)。
在一些实施例中，本公开的dsRNA分子进一步包括有义链的位置1至5内的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置18至23内的一个(从5'端开始计数)，以及反义链的位置1和2处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置18至23内的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5'端开始计数)。
在一些实施例中，本公开的dsRNA分子进一步包括有义链的位置1至5(从5'端开始计数)内的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，以及反义链的位置1和2处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置18至23内的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5'端开始计数)。
在一些实施例中，本公开的dsRNA分子进一步包括有义链的位置1至5(从5'端开始计数)内的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，以及反义链的位置1和2处的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置18至23内的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5'端开始计数)。
在一些实施例中，本公开的dsRNA分子进一步包括有义链的位置1至5内的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置18至23内的一个(从5'端开始计数)，以及反义链的位置1和2处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置18至23内的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5'端开始计数)。
在一些实施例中，本公开的dsRNA分子进一步包括有义链的位置1至5内的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置18至23内的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5'端开始计数)，以及反义链的位置1和2处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置18至23内的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5'端开始计数)。
在一些实施例中，本公开的dsRNA分子进一步包括有义链的位置1至5内的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置18至23内的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5'端开始计数)，以及反义链的位置1和2处的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置18至23内的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5'端开始计数)。
在一些实施例中，本公开的dsRNA分子进一步包括有义链的位置1和2处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置20和21处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5'端开始计数)，以及反义链的位置1处的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置21处的一个(从5'端开始计数)。
在一些实施例中，本公开的dsRNA分子进一步包括有义链的位置1处的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置21处的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5'端开始计数)，以及反义链的位置1和2处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置20和21处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5'端开始计数)。
在一些实施例中，本公开的dsRNA分子进一步包括有义链的位置1和2处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置21和22处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5'端开始计数)，以及反义链的位置1处的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置21处的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5'端开始计数)。
在一些实施例中，本公开的dsRNA分子进一步包括有义链的位置1处的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置21处的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5'端开始计数)，以及反义链的位置1和2处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置21盒22处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5'端开始计数)。
在一些实施例中，本公开的dsRNA分子进一步包括有义链的位置1和2处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置22和23处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5'端开始计数)，以及反义链的位置1处的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置21处的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5'端开始计数)。
在一些实施例中，本公开的dsRNA分子进一步包括有义链的位置1处的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置21处的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5'端开始计数)，以及位置1和2处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置23和23处反义链的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5'端开始计数)。
在一些实施例中，本公开的化合物包括主链手性中心的模式。在一些实施例中，主链手性中心的常见模式包括呈Sp构型的至少5个核苷酸间键。在一些实施例中，主链手性中心的常见模式包括呈Sp构型的至少6个核苷酸间键。在一些实施例中，主链手性中心的常见模式包括呈Sp构型的至少7个核苷酸间键。在一些实施例中，主链手性中心的常见模式包括呈Sp构型的至少8个核苷酸间键。在一些实施例中，主链手性中心的常见模式包括呈Sp构型的至少9个核苷酸间键。在一些实施例中，主链手性中心的常见模式包括呈Sp构型的至少10个核苷酸间键。在一些实施例中，主链手性中心的常见模式包括呈Sp构型的至少11个核苷酸间键。在一些实施例中，主链手性中心的常见模式包括呈Sp构型的至少12个核苷酸间键。在一些实施例中，主链手性中心的常见模式包括呈Sp构型的至少13个核苷酸间键。在一些实施例中，主链手性中心的常见模式包括呈Sp构型的至少14个核苷酸间键。在一些实施例中，主链手性中心的常见模式包括呈Sp构型的至少15个核苷酸间键。在一些实施例中，主链手性中心的常见模式包括呈Sp构型的至少16个核苷酸间键。在一些实施例中，主链手性中心的常见模式包括呈Sp构型的至少17个核苷酸间键。在一些实施例中，主链手性中心的常见模式包括呈Sp构型的至少18个核苷酸间键。在一些实施例中，主链手性中心的常见模式包括呈Sp构型的至少19个核苷酸间键。在一些实施例中，主链手性中心的常见模式包括呈Rp构型的不超过8个核苷酸间键。在一些实施例中，主链手性中心的常见模式包括呈Rp构型的不超过7个核苷酸间键。在一些实施例中，主链手性中心的常见模式包括呈Rp构型的不超过6个核苷酸间键。在一些实施例中，主链手性中心的常见模式包括呈Rp构型的不超过5个核苷酸间键。在一些实施例中，主链手性中心的常见模式包括呈Rp构型的不超过4个核苷酸间键。在一些实施例中，主链手性中心的常见模式包括呈Rp构型的不超过3个核苷酸间键。在一些实施例中，主链手性中心的常见模式包括呈Rp构型的不超过2个核苷酸间键。在一些实施例中，主链手性中心的常见模式包括呈Rp构型的不超过1个核苷酸间键。在一些实施例中，主链手性中心的常见模式包括不超过8个非手性的核苷酸间键(作为非限制性实例，磷酸二酯)。在一些实施例中，主链手性中心的常见模式包括不超过7个非手性的核苷酸间键。在一些实施例中，主链手性中心的常见模式包括不超过6个非手性的核苷酸间键。在一些实施例中，主链手性中心的常见模式包括不超过5个非手性的核苷酸间键。在一些实施例中，主链手性中心的常见模式包括不超过4个非手性的核苷酸间键。在一些实施例中，主链手性中心的常见模式包括不超过3个非手性的核苷酸间键。在一些实施例中，主链手性中心的常见模式包括不超过2个非手性的核苷酸间键。在一些实施例中，主链手性中心的常见模式包括不超过1个非手性的核苷酸间键。在一些实施例中，主链手性中心的常见模式包括呈Sp构型的至少10个核苷酸间键和不超过8个非手性的核苷酸间键。在一些实施例中，主链手性中心的常见模式包括呈Sp构型的至少11个核苷酸间键和不超过7个非手性的核苷酸间键。在一些实施例中，主链手性中心的常见模式包括呈Sp构型的至少12个核苷酸间键和不超过6个非手性的核苷酸间键。在一些实施例中，主链手性中心的常见模式包括呈Sp构型的至少13个核苷酸间键和不超过6个非手性的核苷酸间键。在一些实施例中，主链手性中心的常见模式包括呈Sp构型的至少14个核苷酸间键和不超过5个非手性的核苷酸间键。在一些实施例中，主链手性中心的常见模式包括呈Sp构型的至少15个核苷酸间键和不超过4个非手性的核苷酸间键。在一些实施例中，呈Sp构型的核苷酸间键任选地是连续的或不连续的。在一些实施例中，呈Rp构型的核苷酸间键任选地是连续的或不连续的。在一些实施例中，非手性的核苷酸间键任选地是连续的或不连续的。
在一些实施例中，本公开的化合物包括为立体化学嵌段的嵌段。在一些实施例中，嵌段是Rp嵌段，因为所述嵌段的每个核苷酸间键是Rp。在一些实施例中，5'-嵌段是Rp嵌段。在一些实施例中，3'-嵌段是Rp嵌段。在一些实施例中，嵌段是Sp嵌段，因为所述嵌段的每个核苷酸间键是Sp。在一些实施例中，5'-嵌段是Sp嵌段。在一些实施例中，3'-嵌段是Sp嵌段。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸包括Rp和Sp嵌段两者。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸包括一个或多个Rp嵌段但不包括Sp嵌段。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸包括一个或多个Sp嵌段但不包括Rp嵌段。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸包括一个或多个PO嵌段，其中天然磷酸酯键中的每个核苷酸间键。
在一些实施例中，本公开的化合物包括为Sp嵌段的5'-嵌段，其中每个糖部分包括2'-F修饰。在一些实施例中，5'-嵌段是Sp嵌段，其中每个核苷酸间键是经修饰的核苷酸间键，并且每个糖部分包括2'-F修饰。在一些实施例中，5'-嵌段是Sp嵌段，其中每个核苷酸间键是硫代磷酸酯键，并且每个糖部分包括2'-F修饰。在一些实施例中，5'-嵌段包括4个或更多个核苷单元。在一些实施例中，5'-嵌段包括5个或更多个核苷单元。在一些实施例中，5'-嵌段包括6个或更多个核苷单元。在一些实施例中，5'-嵌段包括7个或更多个核苷单元。在一些实施例中，3'-嵌段是Sp嵌段，其中每个糖部分包括2'-F修饰。在一些实施例中，3'-嵌段是Sp嵌段，其中每个核苷酸间键是经修饰的核苷酸间键，并且每个糖部分包括2'-F修饰。在一些实施例中，3'-嵌段是Sp嵌段，其中每个核苷酸间键是硫代磷酸酯键，并且每个糖部分包括2'-F修饰。在一些实施例中，3'-嵌段包括4个或更多个核苷单元。在一些实施例中，3'-嵌段包括5个或更多个核苷单元。在一些实施例中，3'-嵌段包括6个或更多个核苷单元。在一些实施例中，3'-嵌段包括7个或更多个核苷单元。
在一些实施例中，本公开的化合物在一个区域中包括一种类型的核苷，或寡核苷酸之后是特定类型的核苷酸间键，例如天然磷酸酯键、经修饰的核苷酸间键、Rp手性核苷酸间键、Sp手性核苷酸间键等。在一些实施例中，A之后是Sp。在一些实施例中，A之后是Rp。在一些实施例中，A之后是天然磷酸酯键(PO)。在一些实施例中，U之后是Sp。在一些实施例中，U之后是Rp。在一些实施例中，U之后是天然磷酸酯键(PO)。在一些实施例中，C之后是Sp。在一些实施例中，C之后是Rp。在一些实施例中，C之后是天然磷酸酯键(PO)。在一些实施例中，G之后是Sp。在一些实施例中，G之后是Rp。在一些实施例中，G之后是天然磷酸酯键(PO)。在一些实施例中，C和U之后是Sp。在一些实施例中，C和U之后是Rp。在一些实施例中，C和U之后是天然磷酸酯键(PO)。在一些实施例中，A和G之后是Sp。在一些实施例中，A和G之后是Rp。
在一些实施例中，本公开的dsRNA分子包括与靶标、在双链体内或其组合的错配。所述错配可以发生在突出端区或双链体区中。碱基对可以基于其促进解离或熔化的倾向进行排序(例如，根据特定配对的缔合或离解的自由能，最简单的方法是在单个配对的基础上检查配对，尽管也可以使用下一个临近点或类似分析)。在促进解离方面：A:U优于G:C；G:U优于G:C；并且I:C优于G:C(I＝肌苷)。错配，例如非规范或规范外配对(如本文其它地方所述)优于规范(A:T、A:U、G:C)配对；并且包含通用碱基的配对优于规范配对。
在一些实施例中，本公开的dsRNA分子在从反义链的5'端开始的双链体区内包括前1个、2个、3个、4个或5个碱基对中的至少一个，所述双链体区可以独立地选自以下的组：A：U、G:U、I:C和错配对，例如非规范或规范外配对或包含通用碱基的配对，以促进双链体的5'端处反义链的解离。
在一些实施例中，反义链中从5'端开始的双链体区内1位置处的核苷酸选自由以下组成的组：A、dA、dU、U和dT。可替代地，从反义链的5'端开始的双链体区内的前1个、2个或3个碱基对中的至少一个是AU碱基对。例如，从反义链5'端起的双链体区内的第一个碱基对是AU碱基对。
发现了在单链或双链寡核苷酸的任何位置，将4'-修饰的或5'-修饰的核苷酸引入二核苷酸的磷酸二酯(PO)、硫代磷酸酯(PS)或二硫代磷酸酯(PS2)键的3'端可以对核苷酸间键施加空间效应，并且从而保护或稳定其免受核酸酶的作用。
在一些实施例中，在单链或双链siRNA的任何位置处的二核苷酸的3'端处引入5'-修饰的核苷。例如，可以在单链或双链siRNA的任何位置处的二核苷酸的3'端处引入5'-烷基化核苷。核糖糖的5'位置处的烷基可以是外消旋或手性纯R或S异构体。示例性5'-烷基化核苷是5'-甲基核苷。5'-甲基可以是外消旋或手性纯R或S异构体。
在一些实施例中，在单链或双链siRNA的任何位置处的二核苷酸的3'端处引入4'-修饰的核苷。例如，可以在单链或双链siRNA的任何位置处的二核苷酸的3'端处引入4'-烷基化核苷。核糖糖的4'位置处的烷基可以是外消旋或手性纯R或S异构体。示例性4'-烷基化核苷是4'-甲基核苷。4'-甲基可以是外消旋或手性纯R或S异构体。可替代地，可以在单链或双链siRNA的任何位置处的二核苷酸的3'端处引入4'-O-烷基化核苷。核糖糖的4'-O-烷基可以是外消旋或手性纯R或S异构体。示例性4'-O-烷基化核苷是4'-O-甲基核苷。4'-O-甲基可以是外消旋或手性纯R或S异构体。
在一些实施例中，在dsRNA的有义链或反义链上的任何位置处引入5'-烷基化核苷，并且此类修饰维持或提高dsRNA的效力。5'-烷基可以是外消旋或手性纯R或S异构体。示例性5'-烷基化核苷是5'-甲基核苷。5'-甲基可以是外消旋或手性纯R或S异构体。
在一些实施例中，在dsRNA的有义链或反义链上的任何位置处引入4'-烷基化核苷，并且此类修饰维持或提高dsRNA的效力。4'-烷基可以是外消旋或手性纯R或S异构体。示例性4'-烷基化核苷是4'-甲基核苷。4'-甲基可以是外消旋或手性纯R或S异构体。
在一些实施例中，在dsRNA的有义链或反义链上的任何位置处引入4'-O-烷基化核苷，并且此类修饰维持或提高dsRNA的效力。5'-烷基可以是外消旋或手性纯R或S异构体。示例性4'-O-烷基化核苷是4'-O-甲基核苷。4'-O-甲基可以是外消旋或手性纯R或S异构体。
在一些实施例中，本公开的dsRNA分子可以包括2'-5'键(具有2'-H、2'-OH和2'-OMe，并且具有P＝O或P＝S)。例如，2'-5'键修饰可以用于促进核酸酶抗性或抑制有义链与反义链的结合，或可以用于有义链的5'端以避免有义链被RISC激活。
在另一个实施例中，本公开的dsRNA分子可以包括L糖(例如，具有2'-H、2'-OH和2'-OMe的L核糖、L-阿拉伯糖)。例如，这些L糖修饰可以用于促进核酸酶抗性或抑制有义链与反义链的结合，或可以用于有义链的5'端以避免有义链被RISC激活。
各种出版物描述了多聚体siRNA，其都可以与本公开的dsRNA一起使用。此类出版物包含WO2007/091269、US 7858769、WO2010/141511、WO2007/117686、WO2009/014887和WO2011/031520，所述出版物特此通过全文引用的方式并入。
在一些实施例中，本公开的dsRNA分子是5'磷酸化的或在5'引物末端处包含磷酰基类似物。5'-磷酸酯修饰包含那些与RISC介导的基因沉默相容的修饰。合适的修饰包含：5'-单磷酸酯((HO)2(O)P-O-5')；5'-二磷酸酯((HO)2(O)P-O-P(HO)(O)-O-5')；5'-三磷酸酯((HO)2(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5')；5'-鸟苷帽(7-甲基化的或非甲基化的)(7m-G-O-5’-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5')；5'-腺苷帽(Appp)和任何经修饰的或未经修饰的核苷酸帽结构(N-O-5’-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5')；5'-单硫代磷酸酯(硫代磷酸酯；(HO)2(S)P-O-5')；5'-单二硫代磷酸酯(二硫代磷酸酯；(HO)(HS)(S)P-O-5')，5'-硫代磷酸酯((HO)2(O)P-S-5')；氧/硫置换的单磷酸酯、二磷酸酯和三磷酸酯的任何另外的组合(例如5'-α-硫代三磷酸酯、5'-γ-硫代三磷酸酯等)、5'-磷酰胺酯((HO)2(O)P-NH-5'、(HO)(NH2)(O)P-O-5')、5'-烷基膦酸酯(R＝烷基＝甲基、乙基、异丙基、丙基等，例如RP(OH)(O)-O-5'-、5'-烯基膦酸酯(即乙烯基、经取代的乙烯基)、(OH)2(O)P-5'-CH2-)、5'-烷基醚膦酸酯(R＝烷基醚＝甲氧基甲基(MeOCH2-)、乙氧基甲基等，例如RP(OH)(O)-O-5'-)。在一个实例中，修饰可以置于dsRNA分子的反义链中。
F.接头
在一些实施例中，本文所描述的缀合物或配体可以通过各种接头与iRNA寡核苷酸连接，所述接头可以是可切割的或不可切割的。
接头通常包括直接键或原子，如氧或硫；单元，如NR8、C(O)、C(O)NH、SO、SO2、SO2NH或原子链，如但不限于经取代的或未经取代的烷基、经取代的或未经取代的烯基、经取代的或未经取代的炔基、芳烷基、芳烯基、芳炔基、杂芳基烷基、杂芳基烯基、杂芳基炔基、杂环烷基、杂环烯基、杂环炔基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、环烯基、烷基芳烷基、烷基芳烯基、烷基芳炔基、烯基芳烷基、烯基芳烯基、烯基芳炔基、炔基芳烷基、炔基芳烯基、炔基芳炔基、烷基杂芳基烷基、烷基杂芳基烯基、烷基杂芳基炔基、烯基杂芳基烷基、烯基杂芳基烯基、烯基杂芳基炔基、炔基杂芳基烷基、炔基杂芳基烯基、炔基杂芳基炔基、烷基杂环烷基、烷基杂环烯基、烷基杂环炔基、烯基杂环烷基、烯基杂环烯基、烯基杂环炔基、炔基杂环烷基、炔基杂环烯基、炔基杂环炔基、烷基芳基、烯基芳基、炔基芳基、烷基杂芳基、烯基杂芳基、炔基杂芳基，所述一个或多个亚甲基可以被以下中断或封端：O、S、S(O)、SO2、N(R8)、C(O)、经取代的或未经取代的芳基、经取代的或未经取代的杂芳基、经取代的或未经取代的杂环基；其中R8是氢、酰基、脂肪族或经取代的脂肪族。在一些实施例中，接头介于约1个至24个原子、2个至24个、3个至24个、4个至24个、5个至24个、6个至24个、6个至18个、7个至18个、8个至18个原子、7个至17个、8个至17个、6个至16个、7个至16个或8个至16个原子之间。
在一些实施例中，本公开的dsRNA与二价或三价支链接头缀合，所述二价或三价支链接头选自由式(XXXI)至(XXXIV)中任一项所示的结构组成的组：
其中：
q2A、q2B、q3A、q3B、q4A、q4B、q5A、q5B和q5C在每次出现时独立地表示0-20，并且其中重复单元可以相同或不同；
P2A、P2B、P3A、P3B、P4A、P4B、P5A、P5B、P5C、T2A、T2B、T3A、T3B、T4A、T4B、T4A、T5B、T5C在每次出现时各自独立地为不存在、CO、NH、O、S、OC(O)、NHC(O)、CH2、CH2NH或CH2O；
Q2A、Q2B、Q3A、Q3B、Q4A、Q4B、Q5A、Q5B、Q5C在每次出现时独立地为不存在、亚烷基、经取代的亚烷基，其中一个或多个亚甲基可以被以下中的一个或多个中断或封端：O、S、S(O)、SO2、N(RN)、C(R')＝C(R”)、C≡C或C(O)；
R2A、R2B、R3A、R3B、R4A、R4B、R5A、R5B、R5C每次出现时各自独立地为不存在、NH、O、S、CH2、C(O)O、C(O)NH、NHCH(Ra)C(O)、-C(O)-CH(Ra)-NH-、CO、CH＝N-O、
或杂环基；
L2A、L2B、L3A、L3B、L4A、L4B、L5A、L5B和L5C表示配体；即每次出现时各自独立地为单糖(如GalNAc)、二糖、三糖、四糖、寡糖或多糖；并且Ra是H或氨基酸侧链。三价缀合的GalNAc衍生物特别适用于与RNAi药剂一起使用以抑制靶基因的表达，如式(XXXV)的表达：
式XXXV
其中L5A、L5B和L5C表示单糖，如GalNAc衍生物。
适合的缀合GalNAc衍生物的二价和三价支链接头基团的实例包含但不限于上文所提及的式II、式VII、式XI、式X和式XIII的结构。
可切割连接基团是在细胞外部充分稳定的连接基团，但其在进入靶细胞之后切割以释放接头保持在一起的两个部分。在一些实施例中，可切割连接基团在靶细胞中或在第一参考条件下(其可以例如被选择以模拟或代表细胞内条件)的切割是在受试者的血液中或在第二参考条件下(其可以例如被选择以模拟或代表在血液或血清中发现的条件)的切割速度的至少约10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或更多，或至少约100倍。
可切割连接基团易受切割剂(例如pH、氧化还原电位或降解分子的存在)影响。一般来说，切割剂在细胞内部比在血清或血液中更普遍，或以更高的水平或活性找到。此类降解剂的实例包含：针对特定底物选择的或不具有底物特异性的氧化还原剂，包含例如存在于细胞中的氧化或还原酶或还原剂，如硫醇，所述氧化或还原酶或还原剂可以通过还原降解氧化还原可切割连接基团；酯酶；可以产生酸性环境的核内体或药剂，例如，产生pH为五或更低的那些核内体或药剂；可以通过充当广义酸、肽酶(其可以是底物特异性的)和磷酸酶来水解或降解酸可切割连接基团的酶。
可切割键基团，如二硫键可能对pH敏感。人血清的pH为7.4，而细胞内pH的平均值略低，范围为约7.1-7.3。核内体具有更酸性的pH，范围为5.5-6.0，并且溶酶体具有甚至更酸性的pH，为约5.0。一些接头将具有可切割连接基团，所述连接基团在合适的pH下切割，由此从细胞内的配体释放阳离子脂质，或释放到细胞的期望的区室中。
接头可以包含可由特定酶切割的可切割连接基团。并入到接头中的可切割连接基团的类型可以取决于所靶向的细胞。
一般而言，可以通过测试降解剂(或条件)切割候选连接基团的能力来评价候选可切割连接基团的适合性。还将期望测试候选可切割连接基团抵抗在血液中或当与其它非靶组织接触时切割的能力。因此，可以确定第一条件与第二条件之间对切割的相对易感性，其中选择第一条件以指示靶细胞中的切割，并且选择第二条件以指示其它组织或生物流体，例如血液或血清中的切割。评价可以在无细胞系统、在细胞、在细胞培养物、在器官或组织培养物或在整只动物中进行。在无细胞或培养条件下进行初始评价并且通过在整只动物中进一步评价来确认可以是有用的。在一些实施例中，有用的候选化合物在细胞中(或在被选择以模拟细胞内条件的体外条件下)的切割是在血液或血清中(或在被选择以模拟细胞外条件的体外条件下)的切割速度的至少约2倍、4倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或约100倍。
i.氧化还原可切割连接基团
在一些实施例中，可切割连接基团是在还原或氧化时切割的氧化还原可切割连接基团。还原性可切割连接基团的实例是二硫化物连接基团(-S-S-)。为了确定候选可切割连接基团是否是合适的“还原性可切割连接基团”，或者例如是否适合与特定iRNA部分和特定靶向剂一起使用，可以参考本文所描述的方法。例如，可以通过使用本领域已知的试剂与二硫苏糖醇(DTT)或其它还原剂一起温育来评估候选物，这模拟将在细胞(例如，靶细胞)中观察到的切割速率。候选物还可以在被选择以模拟血液或血清条件的条件下评价。在一个中，候选化合物在血液中被切割至多约10％。在其它实施例中，有用的候选化合物在细胞中(或在被选择以模拟细胞内条件的体外条件下)的降解是在血液中(或在被选择以模拟细胞外条件的体外条件下)的切割速度的至少约2倍、4倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或约100倍。候选化合物的切割速率可以使用标准酶动力学测定在被选择以模拟细胞内介质的条件下确定并且与被选择以模拟细胞外介质的条件进行比较。
ii.基于磷酸酯的可切割连接基团
在一些实施例中，可切割接头包括基于磷酸酯的可切割连接基团。基于磷酸酯的可切割连接基团被降解或水解磷酸酯基团的药剂切割。细胞中使磷酸酯基团切割的药剂的实例为细胞中的酶，如磷酸酶。基于磷酸酯的连接基团的实例为-O-P(O)(ORk)-O-、-O-P(S)(ORk)-O-、-O-P(S)(SRk)-O-、-S-P(O)(ORk)-O-、-O-P(O)(ORk)-S-、-S-P(O)(ORk)-S-、-O-P(S)(ORk)-S-、-S-P(S)(ORk)-O-、-O-P(O)(Rk)-O-、-O-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-O-、-S-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-S-、-O-P(S)(Rk)-S-。在一些实施例中，基于磷酸酯的连接基团是-O-P(O)(OH)-O-、-O-P(S)(OH)-O-、-O-P(S)(SH)-O-、-S-P(O)(OH)-O-、-O-P(O)(OH)-S-、-S-P(O)(OH)-S-、-O-P(S)(OH)-S-、-S-P(S)(OH)-O-、-O-P(O)(H)-O-、-O-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-O、-S-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-S-、-O-P(S)(H)-S-。在一些实施例中，基于磷酸酯的连接基团为-O-P(O)(OH)-O-。可以使用与上文所描述的方法类似的方法来评价这些候选物。
iii.酸可切割连接基团
在一些实施例中，可切割接头包括酸可切割连接基团。酸可切割连接基团是在酸性条件下被切割的连接基团。在一些实施例中，酸可切割连接基团在pH为约6.5或更低(例如，约6.0、5.75、5.5、5.25、5.0或更低)的酸性环境中或通过可以充当广义酸的药剂(如酶)被切割。在细胞中，特定低pH细胞器，如核内体和溶酶体可以提供酸可切割连接基团的切割环境。酸可切割连接基团的实例包含但不限于腙、酯和氨基酸的酯。酸可切割基团可以具有通式-C＝NN-、C(O)O或-OC(O)。在一些实施例中，附接到酯的氧的碳(烷氧基)为芳基、经取代的烷基或叔烷基，如二甲基戊基或叔丁基。可以使用与上文所描述的方法类似的方法来评价这些候选物。
iv.基于酯的可切割连接基团
在一些实施例中，可切割接头包括基于酯的可切割连接基团。基于酯的可切割连接基团通过细胞中的酶，如酯酶和酰胺酶切割。基于酯的可切割连接基团的实例包含但不限于亚烷基、亚烯基和亚炔基的酯。酯可切割连接基团具有通式-C(O)O-或-OC(O)-。可以使用与上文所描述的方法类似的方法来评价这些候选物。
v.基于肽的可切割连接基团
在一些实施例中，可切割接头包括基于肽的可切割连接基团。基于肽的可切割连接基团通过细胞中的酶，如肽酶和蛋白酶切割。基于肽的可切割连接基团是在氨基酸之间形成以产生寡肽(例如，二肽、三肽等)和多肽的肽键。基于肽的可切割基团不包含酰胺基(-C(O)NH-)。酰胺基可以在任何亚烷基、亚烯基或亚炔基之间形成。肽键是在氨基酸之间形成以产生肽和蛋白质的特殊类型的酰胺键。基于肽的切割基团通常限于在产生肽和蛋白质的氨基酸之间形成的肽键(即酰胺键)并且不包含整个酰胺官能团。基于肽的可切割连接基团具有通式–NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)-，其中RA和RB为两个相邻氨基酸的R基团。可以使用与上文所描述的方法类似的方法来评价这些候选物。教导RNA缀合物的制备的代表性美国专利包含但不限于美国专利第4,828,979号；第4,948,882号；第5,218,105号；第5,525,465号；第5,541,313号；第5,545,730号；第5,552,538号；第5,578,717号、第5,580,731号；第5,591,584号；第5,109,124号；第5,118,802号；第5,138,045号；第5,414,077号；第5,486,603号；第5,512,439号；第5,578,718号；第5,608,046号；第4,587,044号；第4,605,735号；第4,667,025号；第4,762,779号；第4,789,737号；第4,824,941号；第4,835,263号；第4,876,335号；第4,904,582号；第4,958,013号；第5,082,830号；第5,112,963号；第5,214,136号；第5,082,830号；第5,112,963号；第5,214,136号；第5,245,022号；第5,254,469号；第5,258,506号；第5,262,536号；第5,272,250号；第5,292,873号；第5,317,098号；第5,371,241号、第5,391,723号；第5,416,203号、第5,451,463号；第5,510,475号；第5,512,667号；第5,514,785号；第5,565,552号；第5,567,810号；第5,574,142号；第5,585,481号；第5,587,371号；第5,595,726号；第5,597,696号；第5,599,923号；第5,599,928号和第5,688,941号；第6,294,664号；第6,320,017号；第6,576,752号；第6,783,931号；第6,900,297号；第7,037,646号；第8,106,022号；所述美国专利中的每一个的全部内容通过引用并入本文。
不需要均匀地修饰给定化合物中的所有位置，并且事实上，可以将上述修饰中的多于一个修饰并入单一化合物中或甚至iRNA内的单个核苷处。本公开还包含作为嵌合化合物的iRNA化合物。
在本公开的上下文中，“嵌合”iRNA化合物或“嵌合体”是iRNA化合物，例如dsRNA，其含有两个或更多个化学上不同的区，每个区由至少一个单体单元构成，即在dsRNA化合物的情况下的核苷酸。这些iRNA通常含有至少一个区，其中RNA被修饰以赋予iRNA增加的对核酸酶降解的抗性、增加的细胞摄取和/或增加的对靶核酸的结合亲和力。iRNA的另外的区可以作为能够切割RNA:DNA或RNA:RNA杂交体的酶的底物。举例来说，RNase H是细胞核酸内切酶，所述细胞核酸内切酶切割RNA:DNA双链体的RNA链。因此，RNase H的激活使RNA靶标切割，由此大大增强iRNA抑制基因表达的效率。因此，与杂交到同一靶标区的硫代磷酸酯脱氧dsRNA相比，当使用嵌合dsRNA时，使用更短的iRNA通常可以获得相当的结果。可以通过凝胶电泳和必要时本领域已知的相关核酸杂交技术常规检测RNA靶标的切割。
在某些情况下，iRNA的RNA可以被非配体基团修饰。许多非配体分子已与iRNA缀合以增强iRNA的活性、细胞分布或细胞摄取，并且进行此类缀合的程序可在科学文献中获得。此类非配体部分已经包含脂质部分，如胆固醇(Kubo，T.等人,《生物化学和生物物理研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Comm.)》,2007,365(1):54-61；Letsinger等人,《美国国家科学院院刊》,1989,86:6553)，胆酸(Manoharan等人,《生物有机与药物化学快报》,1994,4:1053)，硫醚，例如，己基-S-三苯基甲硫醇(Manoharan等人,《纽约科学院年鉴》,1992,660:306；Manoharan等人,《生物有机与药物化学快报》,1993,3:2765)，硫代胆固醇(Oberhauser等人,《核酸研究》,1992,20:533)，脂肪族链，例如十二烷二醇或十一烷基残基(Saison-Behmoaras等人,《欧洲分子生物学组织杂志》,1991,10:111；Kabanov等人,《FEBS快报》,1990,259:327；Svinarchuk等人,《生物化学》,1993,75:49)，磷脂，例如二-十六烷基-rac-甘油或三乙基铵1,2-二-O-十六烷基-rac-甘油-3-H-膦酸酯(Manoharan等人,《四面体快报》,1995,36:3651；Shea等人,《核酸研究》,1990,18:3777)，磷脂、多胺或聚乙二醇链(Manoharan等人,《核苷与核苷酸》,1995,14:969)或金刚烷乙酸(Manoharan等人,《四面体快报》,1995,36:3651)，棕榈基部分(Mishra等人,《生物化学与生物物理学报》,1995,1264:229)，或十八胺或己基氨基-羰基-羰基氧基胆固醇部分(Crooke等人,《药理和实验治疗学杂志》,1996,277:923)。上面列出了教导制备此类RNA缀合物的代表性美国专利。典型的缀合方案涉及合成在序列的一个或多个位置处具有氨基接头的RNA。随后使用适当偶联试剂或激活试剂使氨基与所缀合的分子反应。缀合反应可以在RNA仍与固相载体结合的情况下或在RNA切割之后在溶液相中进行。通过HPLC纯化RNA缀合物通常产生纯缀合物。
V.iRNA的递送
可以以多种不同方式实现iRNA向有需要的受试者的递送。可以通过向受试者施用包括iRNA的组合物(例如，dsRNA)直接进行体内递送。可替代地，递送可以通过施用一种或多种编码和引导iRNA的表达的载体间接进行。下文将进一步讨论这些替代方案。
A.直接递送
通常，任何递送核酸分子的方法都可以适于与iRNA一起使用(参见例如，AkhtarS.和Julian RL.(1992)《细胞生物学趋势(Trends Cell.Biol.)》2(5):139-144和WO94/02595，所述文献通过全文引用的方式并入本文)。然而，为了在体内成功递送iRNA分子，有三个重要因素需要考虑：(a)所递送分子的生物稳定性；(2)防止非特异性效应；以及(3)所递送的分子在靶组织中的累积。可以通过局部施用，例如通过直接注射或植入到组织(作为非限制性实例，眼睛)中或局部施用制剂来最小化iRNA的非特异性效应。对治疗位点的局部施用使药剂的局部浓度最大化，限制药剂暴露于全身组织，所述全身组织可能被药剂伤害或可能降解药剂，并允许施用较低的总剂量的iRNA分子。若干研究表明，当局部施用iRNA时，基因产物的成功敲低。例如，在食蟹猴中通过玻璃体内注射(Tolentino,MJ.等人,(2004)《视网膜(Retina)》24:132-138)和在小鼠中通过视网膜下注射(Reich,SJ.等人,(2003)《分子视觉(Mol.Vis.)》9:210-216)眼内递送VEGF dsRNA两者均表明在年龄相关性黄斑变性的实验模型中预防新生血管形成。另外，在小鼠中直接瘤内注射dsRNA减小了肿瘤体积(Pille,J.等人,(2005)《分子疗法(Mol.Ther.)》11:267-274)，并且可以延长荷瘤小鼠的存活期(Kim,WJ.等人,(2006)《分子疗法》14:343-350；Li,S.等人,(2007)《分子疗法》15:515-523)。RNA干扰也显示出通过直接注射局部递送到CNS的成功(Dorn,G.等人,(2004)《核酸(Nucleic Acids)》32:e49；Tan,PH.等人,(2005)《基因疗法(Gene Ther.)》12:59-66；Makimura,H.等人,(2002)《BMC神经科学(BMC Neurosci.)》3:18；Shishkina,GT.等人,(2004)《神经科学(Neuroscience)》129:521-528；Thakker,ER.等人,(2004)《美国国家科学院院刊》101:17270-17275；Akaneya,Y.等人,(2005)《神经生理学杂志(J.Neurophysiol.)》93:594-602)，并且通过鼻内施用到达肺部(Howard,KA.等人,(2006)《分子疗法》14:476-484；Zhang,X.等人,(2004)《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》279:10677-10684；Bitko,V.等人,(2005)《自然医学(Nat.Med.)》11:50-55)。为了全身地施用iRNA以治疗疾病，可以修饰RNA或可替代地使用药物递送系统递送；这两种方法都用于防止dsRNA在体内被内切和外切核酸酶快速降解。
RNA或药物载剂的修饰也可以允许iRNA组合物靶向靶组织，并且避免不期望的脱靶效应。iRNA分子可以通过与其它基团(例如，如本文所描述的脂质或碳水化合物基团)缀合进行修饰。此类缀合物可以用于将iRNA靶向特定细胞，例如肝脏细胞，例如肝细胞。例如，GalNAc缀合物或脂质(例如，LNP)调配物可以用于将iRNA靶向特定细胞，例如肝脏细胞，例如肝细胞。
iRNA分子也可以通过与亲脂性基团(如胆固醇)的化学缀合进行修饰，以增强细胞摄取并防止降解。例如，将针对与亲脂性胆固醇部分缀合的ApoB的iRNA全身注射到小鼠体内，并且引起肝脏和空肠两者中apoB mRNA的敲低(Soutschek,J.等人(2004)《自然》432:173-178)。在前列腺癌的小鼠模型中，iRNA与适体的缀合已被证明可以抑制肿瘤生长并介导肿瘤消退(McNamara,JO.等人,(2006)《自然生物技术(Nat.Biotechnol.)》24:1005-1015)。在替代性实施例中，可以使用药物递送系统(如纳米颗粒、树状物、聚合物、脂质体或阳离子递送系统)递送iRNA。带正电荷的阳离子递送系统促进(带负电荷的)iRNA分子的结合并且还在带负电荷的细胞膜增强相互作用以允许细胞高效地摄取iRNA。阳离子脂质、树状物或聚合物可以与iRNA结合或被诱导以形成包裹iRNA的囊泡或胶束(参见例如，Kim SH等人(2008)《控释杂志(Journal of Controlled Release)》129(2):107-116)。当全身施用时，囊泡或胶束的形成进一步防止iRNA的降解。用于制备和施用阳离子iRNA复合物的方法完全在本领域技术人员的能力范围内(参见例如，Sorensen,DR等人,(2003)《分子生物学杂志(J.Mol.Bio)》327:761-766；Verma,UN.等人,(2003)《临床癌症研究(Clin.CancerRes.)》9:1291-1300；Arnold,AS等人,(2007)《神经生理学杂志(J.Hypertens.)》25:197-205，所述文献通过全文引用的方式并入本文)。可用于iRNA的全身递送的药物递送系统的一些非限制性实例包含DOTAP(Sorensen,DR.等人,(2003),同上；Verma,UN.等人,(2003),同上)，Oligofectamine,“固体核酸脂质颗粒(solid nucleic acid lipid particles)”(Zimmermann,TS.等人,(2006)《自然》441:111-114)，心磷脂(Chien,PY.等人,(2005)《癌症基因疗法》12:321-328；Pal,A.等人,(2005)《国际肿瘤学杂志(Int J.Oncol.)》26:1087-1091)，聚乙烯亚胺(Bonnet ME.等人,(2008)《药学研究(Pharm.Res.)》8月16日电子版先于印刷版；Aigner,A.(2006)《生物医学与生物技术杂志(J.Biomed.Biotechnol.)》71659)，Arg-Gly-Asp(RGD)肽(Liu,S.(2006)《分子药物学(Mol.Pharm.)》3:472-487)以及聚酰胺型胺(Tomalia,DA.等人,(2007)《生化学会会刊(Biochem.Soc.Trans.)》35:61-67；Yoo,H.等人(1999)《药学研究》16:1799-1804)。在一些实施例中，iRNA与环糊精形成用于全身施用的复合物。施用方法以及iRNA和环糊精的药物组合物可以在美国专利第7,427,605号中找到，所述美国专利通过全文引用的方式并入本文。
B.载体编码的iRNA
另一方面，靶向MYOC的iRNA可以从插入DNA或RNA载体的转录单元表达(参见例如，Couture,A等人,《TIG.》(1996),12:5-10；Skillern,A.等人，国际PCT公开第WO 00/22113号，Conrad,国际PCT公开第WO 00/22114号，以及Conrad,美国专利第6,054,299号)。表达可以是瞬时的(数小时至数周的数量级)或持续的(数周至数月或更长)，这取决于所使用的特定构建体和靶组织或细胞类型。这些转基因可以作为线性构建体、环状质粒或病毒载体引入，其可以是整合或非整合载体。还可以构建转基因以允许其作为染色体外质粒遗传(Gassmann等人,《美国国家科学院院刊》(1995)92:1292)。
iRNA的一条或多条单独的链可以从表达载体上的启动子转录。在要表达两条单独的链以产生例如dsRNA的情况下，可以将两个单独的表达载体共同引入(例如，通过转染或感染)到靶细胞中。可替代地，dsRNA的每个单独的链都可以通过启动子转录，这两个启动子都位于同一表达质粒上。在一些实施例中，dsRNA被表达为通过接头多核苷酸序列连接的反向重复，使得dsRNA具有茎和环结构。
iRNA表达载体通常是DNA质粒或病毒载体。与真核细胞相容的表达载体，例如与脊椎动物细胞相容的表达载体可以用于产生用于表达如本文所描述的iRNA的重组构建体。真核细胞表达载体是本领域众所周知的并且可从许多商业来源获得。通常，此类载体含有用于插入期望的核酸区段的方便的限制性位点。iRNA表达载体的递送可以是全身的，如通过静脉内或肌内施用，通过施用从患者体内移植的靶细胞，然后重新引入患者体内，或通过允许引入期望的靶细胞的任何其它方式。
iRNA表达质粒可以作为与阳离子脂质载剂(例如，Oligofectamine)或非阳离子基于脂质的载剂(例如，Transit-TKOTM)的复合物转染到靶细胞中。本公开还设想在一周或更长时间内靶向靶RNA的不同区的用于iRNA介导的敲低的多脂质转染。可以使用各种已知的方法来监测载体成功引入宿主细胞。例如，瞬时转染可以用报告基因发出信号，如荧光标志物，如绿色荧光蛋白(GFP)。使用标志物可以确保细胞的稳定离体转染，所述标志物为转染的细胞提供对特定环境因素(例如，抗生素和药物)的抗性，如潮霉素B抗性。
可以与本文所描述的方法和组合物一起使用的病毒载体系统包含但不限于(a)腺病毒载体；(b)逆转录病毒载体，包含但不限于慢病毒载体、莫罗尼鼠白血病病毒(moloneymurine leukemia virus)等；(c)腺相关病毒载体；(d)单纯性疱疹病毒载体；(e)SV40载体；(f)多瘤病毒载体；(g)乳头瘤病毒载体；(h)小核糖核酸病毒载体；(i)痘病毒载体，如正痘(例如，牛痘病毒载体)或禽痘(例如，金丝雀痘或禽痘)；以及(j)辅助依赖性或无肠腺病毒。复制缺陷病毒也可能是有利的。不同的载体将或不会被并入到细胞的基因组中。如果期望，构建体可以包含用于转染的病毒序列。可替代地，构建体可以被并入能够附加型复制的载体中，例如EPV和EBV载体。用于重组表达iRNA的构建体将通常需要调节元件，例如启动子、增强子等，以确保iRNA在靶细胞中的表达。下文中进一步描述了对于载体和构建体要考虑的其它方面。
可用于递送iRNA的载体将包含足以在期望的靶细胞或组织中表达iRNA的调控元件(启动子、增强子等)。可以选择调控元件以提供组成型或调控的/诱导型表达。
iRNA的表达可以被精确调控，例如，通过使用对某些生理调节因子敏感的诱导型调控序列，例如，循环葡萄糖水平或激素(Docherty等人,1994,《美国实验生物学会联合会杂志(FASEB J.)》8:20-24)。此类适于控制细胞中或哺乳动物体内的dsRNA表达的诱导型表达系统包含例如，通过蜕皮激素，通过雌激素、黄体酮、四环素、二聚化的化学诱导剂和异丙基-β-D1-硫代半乳糖苷(IPTG)的调控。本领域技术人员将能够基于iRNA转基因的预期用途来选择合适的调控/启动子序列。
在具体实施例中，可以使用含有编码iRNA的核酸序列的病毒载体。例如，可以使用逆转录病毒载体(参见Miller等人,《酶学方法(Meth.Enzymol.)》217:581-599(1993))。这些逆转录病毒载体含有正确包装病毒基因组和整合到宿主细胞DNA中必需的组分。将编码iRNA的核酸序列克隆到一个或多个载体中，这有助于将核酸递送到患者体内。关于逆转录病毒载体的更多细节可以在例如Boesen等人,《生物疗法(Biotherapy)》6:291-302(1994)中找到，所述文献描述了使用逆转录病毒载体将mdr1基因递送到造血干细胞，以使干细胞对化疗更有抵抗力。说明逆转录病毒载体在基因疗法中的用途的其它参考文献有：Clowes等人,《临床研究杂志(J.Clin.Invest.)》93:644-651(1994)；Kiem等人,《血液(Blood)》83:1467-1473(1994)；Salmons和Gunzberg,《人类基因疗法(Human Gene Therapy)》4:129-141(1993)；以及Grossman和Wilson,《遗传与发育新见Curr.Opin.in Genetics and Devel.)》3:110-114(1993)。设想使用的慢病毒载体包含例如，美国专利第6,143,520号；第5,665,557号；以及第5,981,276号中描述的基于HIV的载体，所述美国专利其通过引用并入本文。
腺病毒也被设想用于iRNA的递送。腺病毒是特别有吸引力的媒剂，例如，用于将基因递送到呼吸道上皮细胞。腺病毒会自然感染呼吸道上皮细胞，其在其中引起轻度疾病。基于腺病毒的递送系统的其它靶标是肝脏、中枢神经系统、内皮细胞和肌肉。腺病毒具有能够感染非分裂细胞的优点。Kozarsky和Wilson,《遗传与发育新见(Current Opinion inGenetics and Development)》3:499-503(1993)对基于腺病毒的基因疗法进行了综述。Bout.等人,《人类基因疗法》5:3-10(1994)证明了使用腺病毒载体将基因转移到恒河猴的呼吸道上皮。在基因疗法中使用腺病毒的其它实例可以在以下中找到：Rosenfeld等人,《科学》252:431-434(1991)；Rosenfeld等人,《细胞》68:143-155(1992)；Mastrangeli等人,《临床研究杂志(J.Clin.Invest.)》91:225-234(1993)；PCT公开WO94/12649；以及Wang等人,《基因疗法》2:775-783(1995)。用于表达本公开提出的iRNA的合适的AV载体、构建重组AV载体的方法以及将载体递送到靶细胞中的方法在Xia H等人,(2002),《自然生物技术》20:1006-1010中进行了描述。
还设想了使用腺相关病毒(AAV)载体(Walsh等人,《实验生物学与医学学会论文集(Proc.Soc.Exp.Biol.Med.)》204:289-300(1993)；美国专利第5,436,146号)。在一些实施例中，iRNA可以表达为来自重组AAV载体的两个分离的互补单链RNA分子，所述载体具有例如U6或H1 RNA启动子或巨细胞病毒(CMV)启动子。用于表达本公开中所提出的dsRNA的合适的AAV载体、用于构建重组AV载体的方法以及将载体递送到靶细胞中的方法在以下中进行了描述：Samulski R等人,(1987),《病毒学杂志(J.Virol.)》61:3096-3101；Fisher K J等人,(1996),《病毒学杂志》,70:520-532；Samulski R等人,(1989),《病毒学杂志》63:3822-3826；美国专利第5,252,479号；美国专利第5,139,941号；国际专利申请第WO 94/13788号；以及国际专利申请第WO 93/24641号，所述文献的全部公开内容通过引用并入本文。
另一种典型的病毒载体是痘病毒，如痘苗病毒，例如减毒痘苗，如经修饰的病毒安卡拉(Modified Virus Ankara，MVA)或NYVAC，禽痘，如鸡痘或金丝雀痘。
病毒载体的嗜性可以通过用来自其它病毒的包膜蛋白或其它表面抗原对载体进行假型化，或者通过适当地取代不同的病毒衣壳蛋白来修饰。例如，慢病毒载体可以用来自水泡性口炎病毒(VSV)、狂犬病、埃博拉(Ebola)、莫科拉(Mokola)等的表面蛋白进行假型化。AAV载体可以通过工程化载体来表达不同的衣壳蛋白血清型，从而靶向不同的细胞；参见例如，Rabinowitz J E等人,(2002),《病毒学杂志》76:791-801，所述文献的全部公开内容通过引用并入本文。
载体的药物制剂可以包含在可接受的稀释剂中的载体，或者可以包含嵌入基因递送媒剂的缓释基质。可替代地，在完全的基因递送载体可以从例如逆转录病毒载体的重组细胞完整地产生的情况下，药物制品可以包含产生基因递送系统的一个或多个细胞。
VI.含有iRNA的药物组合物
在一些实施例中，本公开提供了药物组合物，所述药物组合物含有如本文所描述的iRNA以及药学上可接受的载剂。含有iRNA的药物组合物可用于治疗与MYOC的表达或活性相关的疾病或病症(例如，青光眼，例如，原发性开角型青光眼(POAG))。此类药物组合物基于递送模式调配。在一些实施例中，组合物可以被调配用于局部递送，例如，通过眼内递送(例如，玻璃体内施用，例如，玻璃体内注射；经巩膜施用，例如，经巩膜注射；结膜下施用，例如，结膜下注射；眼球后施用，例如，眼球后注射；前房内施用，例如，前房内注射；或视网膜下施用，例如，视网膜下注射)。在其它实施例中，组合物可以被调配用于局部递送。在另一个实例中，组合物可以通过肠胃外递送被调配用于全身施用，例如通过静脉内(IV)递送。在一些实施例中，本文所提供的组合物(例如，包括GalNAc缀合物或LNP调配物的组合物)被调配用于静脉内递送。
本文所提出的药物组合物以足以抑制MYOC的表达的剂量施用。通常，iRNA的合适剂量将在每天每千克受体体重0.01毫克至200.0毫克的范围内。药物组合物可以每天施用一次，或者iRNA可以全天以适当的间隔以两次、三次或更多次亚剂量施用，或者甚至使用连续输注或通过控制释放调配物递送。在所述情况下，每个亚剂量中含有的iRNA必须对应地更小，以达到每日总剂量。剂量单位也可以混合用于在若干天内递送，例如，使用常规的缓释调配物，所述调配物在若干天的时间段内提供iRNA的缓释。缓释调配物在本领域中是众所周知的，并且具体地可用于在特定位点处递送药剂，如可以与本公开的药剂一起使用。在此实施例中，剂量单位包括日剂量的对应倍数。
单个剂量对MYOC水平的影响可能是持久的，使得后续剂量的施用间隔不超过3天、4天或5天，或间隔不超过1周、2周、3周、4周、12周、24周或36周。
本领域技术人员将理解，某些因素可能影响有效治疗受试者所需的剂量和时间安排，这些因素包含但不限于疾病或病症的严重性、之前的治疗、所述受试者的总体健康和/或年龄以及存在的其它疾病。此外，用治疗有效量的组合物对受试者进行的治疗可以包含单次治疗或系列治疗。本公开所涵盖的单个iRNA的有效剂量和体内半衰期的估计可以使用常规方法或基于使用合适的动物模型的体内测试来进行。
合适的动物模型，例如小鼠或食蟹猴，例如含有表达人MYOC的转基因的动物可以用于确定MYOC siRNA的治疗有效剂量和/或有效剂量方案施用。
本公开还包含药物组合物和调配物，所述药物组合物和调配物包含本文所提出的iRNA化合物。取决于期望局部治疗还是全身治疗以及待治疗的区域，可以以许多方式施用本公开的药物组合物。施用可以是局部的(local)(例如，通过眼内注射)、局部的(topical)(例如，通过滴眼剂溶液)或肠胃外的。肠胃外施用包含静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌内注射或输注；皮下(例如，通过植入的装置)；或颅内(例如，通过实质内、鞘内或心室内施用)。
用于局部施用的药物组合物和调配物可以包含透皮贴剂、软膏、洗剂、乳膏、凝胶剂、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体以及粉末。常规的药物载剂、水性基质、粉末或油性基质、增稠剂等可以是必要的或期望的。带涂层的避孕套、手套等也可能是有用的。合适的局部调配物包含其中本公开所提出的iRNA与局部递送剂，如脂质、脂质体、脂肪酸、脂肪酸酯、类固醇、螯合剂和表面活性剂混合的那些调配物。合适的脂质和脂质体包含中性的(例如，二油酰磷脂酰DOPE乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱DMPC、二硬脂酰磷脂酰胆碱)、负性的(例如，二肉豆蔻酰磷脂酰甘油DMPG)和阳离子的(例如，二油酰四甲基氨基丙基DOTAP和二油酰磷脂酰乙醇胺DOTMA)。本公开所提出的iRNA可以被封装在脂质体中或可以与其形成复合物，具体地与阳离子脂质体。可替代地，iRNA可以与脂质复合，具体地与阳离子脂质复合。合适的脂肪酸和酯包含但不限于花生四烯酸、油酸、二十烷酸、月桂酸、辛酸、癸酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸、三癸酸、单油酸甘油酯、二月桂酸甘油酯、1-单癸酸甘油酯、1-十二烷基氮杂环庚烷-2-酮、酰基肉碱、酰基胆碱或C1-20烷基酯(例如，肉豆蔻酸异丙酯IPM)、甘油单酯、甘油二酯或其药学上可接受的盐。局部调配物详细描述于美国专利第6,747,014号中，所述美国专利通过引用并入本文。
A.脂质体调配物
除了微乳液外，还有许多有组织的表面活性剂结构已经被研究并用于药物的调配。这些包含单层、胶束、双层和囊泡。囊泡(如脂质体)由于其特异性和从药物递送的角度提供的作用持续时间，引起了极大的关注。如本公开中所使用的，术语“脂质体”是指由排列成一个或多个球形双层的两亲性脂质构成的囊泡。
脂质体为具有由亲脂性材料形成的膜和水性内部的单层或多层囊泡。水性部分含有要递送的组合物。阳离子脂质体具有能够与细胞壁融合的优势。非阳离子脂质体尽管不能够一样有效地与细胞壁融合，但是被体内巨噬细胞摄取。
为了穿过完整的哺乳动物皮肤，脂质囊泡必须在适当的透皮梯度的影响下穿过一系列直径小于50nm的细孔。因此，期望使用可高度变形并且能够穿过此类细孔的脂质体。
脂质体的另外的优点包含：从天然磷脂中获得的脂质体具有生物相容性且可生物降解；脂质体可以掺入多种水溶性和脂溶性药物；脂质体可以保护其内部区室中封装的药物免受代谢和降解(Rosoff,《药物剂型(Pharmaceutical Dosage Forms)》，Lieberman,Rieger和Banker(编辑),1988,纽约州纽约的马塞尔德克尔公司(Marcel Dekker,Inc.,NewYork,N.Y.),第1卷,第245页)。制备脂质体调配物的重要考虑因素是脂质表面电荷、囊泡大小和脂质体的水性体积。
脂质体可用于将活性成分转移和递送到作用位点。因为脂质体膜在结构上类似于生物膜，因此当脂质体被应用至组织时，脂质体开始与细胞膜合并，并且随着脂质体的合并和细胞进展，脂质体内容物被排空进入细胞，在所述细胞中活性剂可以起作用。
脂质体调配物作为许多药物的递送方式一直是广泛研究的焦点。越来越多的证据表明，对于局部施用，脂质体呈现出超过其它调配物的若干个优点。此类优点包含减少了与施用的药物的高全身吸收相关的副作用，增加了施用的药物在期望的靶标处的积聚，以及将多种药物(亲水性和疏水性)施用到皮肤中的能力。
若干报道详细介绍了脂质体将包含高分子量DNA的药剂递送到皮肤中的能力。包含镇痛剂、抗体、激素和高分子量DNA的化合物已被施用于皮肤。大多数应用都是靶向上表皮。
脂质体分为两个广泛的类别。阳离子脂质体是带正电荷的脂质体，其与带负电荷的DNA分子相互作用以形成稳定的复合物。带正电荷的DNA/脂质体复合物结合至带负电荷的细胞表面并且内化于内体中。由于核内体中的酸性pH，脂质体破裂，从而将其内容物释放到细胞质中(Wang等人,《生物化学和讯生物物理研究通讯》,1987,147,980-985)。
对pH敏感的或带负电荷的脂质体包埋DNA而不是与其复合。由于DNA和脂质均带有类似的电荷，所以会出现排斥而非复合物形成。然而，一些DNA包埋于这些脂质体的水性内部内。对pH敏感的脂质体已被用于将编码胸苷激酶基因的DNA递送到培养中的细胞单层。在靶细胞中检测到外源基因的表达(Zhou等人,《控释杂志》,1992,19,269-274)。
一种主要类型的脂质体组合物包含除天然来源的磷脂酰胆碱之外的磷脂。中性脂质体组合物例如可以由二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)或二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)形成。阴离子脂质体组合物通常由二肉豆蔻酰磷脂酰甘油形成，而阴离子融合脂质体主要由二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)形成。另一种类型的脂质体组合物由磷脂酰胆碱(PC)形成，例如大豆PC和鸡蛋PC。另一种类型由磷脂和/或磷脂酰胆碱和/或胆固醇的混合物形成。
若干项研究评估了脂质体药物调配物对皮肤的局部递送。将含有干扰素的脂质体应用于豚鼠皮肤引起皮肤疱疹溃疡的减少，而通过其它方式(例如，作为溶液或乳液)递送干扰素是无效的(Weiner等人,《药物靶向杂志(Journal of Drug Targeting)》,1992,2,405-410)。此外，另外的研究测试了作为脂质体调配物的一部分施用的干扰素对使用水性系统施用干扰素的功效，并且得出结论：脂质体调配物优于水性施用(du Plessis等人,《抗病毒研究(Antiviral Research)》,1992,18,259-265)。
还对非离子脂质体系统进行了检查，以确定其在向皮肤递送药物中的效用，特别是包括非离子表面活性剂和胆固醇的系统。使用包括NovasomeTM I(二月桂酸甘油酯/胆固醇/聚氧乙烯-10-硬脂基醚)和NovasomeTMII(二硬脂酸甘油酯/胆固醇/聚氧乙烯-10-硬脂基醚)的非离子脂质体调配物将环孢菌素A(cyclosporin-A)递送到小鼠皮肤的真皮中。结果表明，此类非离子脂质体系统在促进环孢菌素A沉积到皮肤的不同层中是有效的(Hu等人,《S.T.P.制药科学(S.T.P.Pharma.Sci.)》,1994,4,6,466)。
脂质体还包含“空间稳定的”脂质体，如本文所使用的，所述术语是指包括一种或多种特殊脂质的脂质体，当掺入脂质体中时，相对于缺乏此类特殊脂质的脂质体，所述脂质体导致提高的循环寿命。空间稳定的脂质体的实例是其中脂质体(A)的囊泡形成脂质部分的一部分包括一种或多种糖脂，如单唾液酸神经节苷脂GM1，或(B)用一种或多种亲水性聚合物衍生的脂质体，如聚乙二醇(PEG)部分。尽管不希望受到任何特定理论的束缚，但本领域认为，至少对于含有神经节苷脂、鞘磷脂或PEG衍生的脂质的空间稳定的脂质体，这些空间稳定的脂质体的增强的循环半衰期源自减少进入网状内皮系统(RES)的细胞的摄取(Allen等人,《FEBS快报(FEBS Letters)》,1987,223,42；Wu等人,《癌症研究》,1993,53,3765)。
包括一种或多种糖脂的各种脂质体是本领域已知的。Papahadjopoulos等人,(《纽约科学院年鉴》,1987,507,64)报道了单唾液酸神经节苷脂GM1、硫酸半乳糖脑苷酯和磷脂酰肌醇改善脂质体血液半衰期的能力。这些发现在以下中进行了阐述：Gabizon等人,(《美国国家科学院院刊》1988,85,6949)。美国专利第4,837,028号和第WO 88/04924号(两者均出自Allen等人)公开了脂质体，其包括(1)鞘磷脂和(2)神经节苷脂GM1或硫酸半乳糖脑苷酯。美国专利第5,543,152号(Webb等人)公开了包括鞘磷脂的脂质体。WO 97/13499(Lim等人)中公开了包括1,2-sn-二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱的脂质体。
包括用一种或多种亲水性聚合物衍生化的脂质的许多脂质体及其制备方法是本领域已知的。Sunamoto等人(《日本化学会通报(Bull.Chem.Soc.Jpn.)》,1980,53,2778)描述了包括非离子洗涤剂2C1215G(含有PEG部分)的脂质体。Illum等人(《FEBS快报》,1984,167,79)注意到了聚苯乙烯颗粒与聚合物二醇的亲水性涂层可以显著提高血液半衰期。通过连接聚亚烷基二醇(例如，PEG)的羧基修饰的合成磷脂由Sears(美国专利第4,426,330号和第4,534,899号)进行了描述。Klibanov等人(《FEBS快报》,1990,268,235)描述了实验，证明包括用PEG或PEG硬脂酸酯衍生的磷脂酰乙醇胺(PE)的脂质体在血液循环半衰期中显著增加。Blume等人(《生物化学与生物物理学学报(Biochimica et Biophysica Acta)》,1990,1029,91)将此类观察扩展到其它PEG衍生化的磷脂，例如由二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)和PEG的组合形成的DSPE-PEG。Fisher的欧洲专利第EP 0 445 131 B1号和第WO 90/04384号中描述了在其外表面上具有共价结合的PEG部分的脂质体。以下描述了含有1至20摩尔百分比的用PEG衍生化的PE的脂质体组合物以及其使用方法：Woodle等人(美国专利第5,013,556号和第5,356,633号)以及Martin等人(美国专利第5,213,804号和欧洲专利第EP 0 496813 B1号)。包括许多其它脂质聚合物缀合物的脂质体公开于WO 91/05545和美国专利第5,225,212号(两者均出自Martin等人)和WO 94/20073(Zalipsky等人)中。包括PEG修饰的神经酰胺脂质的脂质体在WO 96/10391(Choi等人)中进行了描述。美国专利第5,540,935号(Miyazaki等人)和美国专利第5,556,948号(Tagawa等人)描述了含有PEG的脂质体，其可以用其表面上的官能部分进一步衍生化。
本领域已知许多包括核酸的脂质体。WO 96/40062(出自Thierry等人)公开了将高分子量核酸封装在脂质体中的方法。美国专利第5,264,221号(出自Tagawa等人)公开了蛋白质结合的脂质体，并且断言此类脂质体的内容物可以包含dsRNA。美国专利第5,665,710号(出自Rahman等人)描述了将寡脱氧核苷酸封装在脂质体中的某些方法。WO 97/04787(出自Love等人)公开了包括靶向raf基因的dsRNA的脂质体。
传递体是又另一种类型的脂质体，并且是高度可变形的脂质聚集体，是药物递送媒剂的有吸引力的候选者。传递体可以被描述为脂滴，其可高度可变形，使得其很容易渗透穿过比液滴小的孔。传递体能够适应其使用的环境，例如其是自我优化的(适应皮肤中孔的形状)、自我修复的，经常在不碎裂的情况下达到其靶标，并且经常自我装载。为了制备传递体，可以向标准脂质体组合物添加表面边缘激活剂，通常是表面活性剂。传递体已被用于将血清白蛋白递送到皮肤。传递体介导的血清白蛋白的递送已被证明与皮下注射含有血清白蛋白的溶液一样有效。
表面活性剂广泛应用于调配物中，如乳液(包含微乳液)和脂质体。对许多不同类型的表面活性剂(天然和合成两者)的特性进行分类和排序的最常见方式是通过使用亲水/亲脂平衡(HLB)。亲水基团(也称为“头”)的性质为调配物中使用的不同表面活性剂的分类提供了最有用的方法(Rieger,《药物剂型》,纽约州纽约的马塞尔德克尔公司,1988,第285页)。
如果表面活性剂分子未离子化，则将其归类为非离子表面活性剂。非离子表面活性剂在药物和化妆品中有着广泛的应用，并且可用于多种pH值。通常，根据其结构，其HLB值的范围为2至约18。非离子表面活性剂包含非离子酯，如乙二醇酯、丙二醇酯、甘油酯、聚甘油酯、脱水山梨醇酯、蔗糖酯和乙氧基化酯。非离子烷醇酰胺和醚，如脂肪醇乙氧基化物、丙氧基化醇和乙氧基化/丙氧基化嵌段聚合物也包含在此类别中。聚氧乙烯表面活性剂是非离子表面活性剂类别中最受欢迎的成员。
如果表面活性剂分子在溶解或分散在水中时带有负电荷，则表面活性剂被分类为阴离子。阴离子表面活性剂包含羧酸酯，如皂类、酰基乳酸酯、氨基酸的酰基酰胺、硫酸酯，如烷基硫酸酯和乙氧基化烷基硫酸酯，磺酸酯，如烷基苯磺酸酯、酰基异硫辛酸酯、酰基牛磺酸酯和磺基琥珀酸酯，以及磷酸酯。阴离子表面活性剂类别中最重要的成员是烷基硫酸酯和皂类。
如果表面活性剂分子在溶解或分散在水中时带有正电荷，则表面活性剂被分类为阳离子。阳离子表面活性剂包含季铵盐和乙氧基化胺。季铵盐是此类别化合物中使用最多的成员。
如果表面活性剂分子具有携带正电荷或负电荷的能力，则表面活性剂被归类为两性。两性表面活性剂包含丙烯酸衍生物、经取代的烷基酰胺、N-烷基甜菜碱和磷脂。
对表面活性剂在药物产品、调配物和乳液中的应用进行了综述(Rieger,《药物剂型》,纽约州纽约的马塞尔德克尔公司,1988,第285页)。
B.核酸脂质颗粒
在一些实施例中，本公开中所提出的MYOC dsRNA完全封装在脂质调配物中，例如以形成SPLP、pSPLP、SNALP或其它核酸脂质颗粒。SNALP和SPLP通常含有阳离子脂质、非阳离子脂质和防止颗粒聚集的脂质(例如，PEG-脂质缀合物)。SNALP和SPLP对于全身应用非常有用，因为其在静脉内(i.v.)注射后表现出延长的循环寿命并在远隔位点(例如，与施用位点物理分离的位点)累积。SPLP包含“pSPLP”，其包含如PCT公开第WO 00/03683号中所示的封装的缩合剂-核酸复合物。本公开的颗粒的平均直径通常为约50nm至约150nm、更通常地为约60nm至约130nm、更通常地为约70nm至约110nm、最通常地为约70nm至约90nm，并且基本上无毒。另外，核酸当存在于本公开的核酸-脂质颗粒中时在水溶液中抵抗核酸酶的降解。核酸-脂质颗粒以及其制备方法公开于例如美国专利第5,976,567号；第5,981,501号；第6,534,484号；第6,586,410号；第6,815,432号；以及PCT公开第WO 96/40964号中。
在一些实施例中，脂质与药物的比率(质量/质量比)(例如，脂质与dsRNA的比率)将在约1:1至约50:1、约1:1至约25:1、约3:1至约15:1、约4:1至约10:1、约5:1至约9:1或约6:1至约9:1的范围内。
例如，所述阳离子脂质可以为N,N-二油基-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)、N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化铵(DDAB)、N-(1-(2,3-二油酰氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTAP)、N-(1-(2,3-二油基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、N,N-二甲基-2,3-二油基氧基)丙胺(DODMA)、1,2-二亚油酰氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)、1,2-二氢亚油酰氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLenDMA)、1,2-二烷基氨基甲酰氨基甲酰氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-C-DAP)、1,2-二烷基氨基甲酰氧基-3-(二甲基氨基)乙酰氧基丙烷(DLin-DAC)、1,2-二烷基氨基甲酰氧基-3-吗啉丙烷(DLin-MA)、1,2-二氢油酰基-3-二甲基氨基丙烷(DLinDAP)、1,2-二氢油酰基硫代-3-二甲基氨基丙烷(DLin-S-DMA)、1-亚油酰基-2-亚油酰基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-2-DMAP)、1,2-二氢油酰氧基-3-三甲氨基丙烷氯盐(DLin-TMA.Cl)、1,2-二氢油酰-3-三甲氨基丙烷氯盐(DLin-TAP.Cl)、1,2-二氢油酰氧基-3-(N-甲基哌嗪)丙烷(DLin-MPZ)或3-(N,N-二油基氨基)-1,2-丙二醇(DLinAP)、3-(N,N-二油基氨基)-1,2-丙二醇(DOAP)、1,2-二油基氧代-3-(2-N,N-二甲基氨基)乙氧基丙烷(DLin-EG-DMA)、1,2-二氢亚油酰氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)、2,2-二氢油酰基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧戊烷(DLin-K-DMA)或其类似物，(3aR,5s,6aS)-N,N-二甲基-2,2-二((9Z,12Z)-十八烷基-9,12-二烯基)四氢-3aH-环戊烯[d][1,3]二噁醇-5-胺(ALN100)、(6Z,9Z,28Z,31Z)-4-(二甲基氨基)丁酸三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-基酯(MC3)、1,1'-(2-(4-(2-((2-(双(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)哌嗪-1-基)乙基氮烷二基)二十二烷-2-醇(Tech G1)或其混合物。阳离子脂质可以占颗粒中存在的总脂质的约20mol％至约50mol％或约40mol％。
在一些实施例中，化合物2,2-二氢油酰基-4-二甲氨基乙基-[1,3]-二氧戊烷可以用于制备脂质siRNA纳米颗粒。2,2-二亚油酰基-4-二甲氨基乙基-[1,3]-二氧戊烷的合成在于2008年10月23日提交的美国临时专利申请第61/107,998号中进行了描述，所述美国临时专利申请通过引用并入本文。
在一些实施例中，脂质siRNA颗粒包含40％的2,2-二亚油酰基-4-二甲氨基乙基-[1,3]-二氧戊烷：10％ DSPC：40％胆固醇：10％的PEG-C-DOMG(摩尔百分比)，其中粒度为63.0±20nm，并且siRNA/脂质比率为0.027。
非阳离子脂质可以是包含阴离子脂质或中性脂质，包含但不限于二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰基-磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰油酰磷脂酰乙醇胺(POPE)、二油酰基-磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-羧酸盐(DOPE-mal)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰磷酸乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰-磷脂酰-乙醇胺(DSPE)、16-O-单甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反式PE、1-硬脂酰-2-油酰-磷脂酰乙醇胺(SOPE)、胆固醇或其混合物。非阳离子脂质可以占颗粒中存在的总脂质的约5mol％至约90mol％、约10mol％或约58mol％(如果包含胆固醇的话)。
抑制颗粒聚集的缀合的脂质可以是例如聚乙二醇(PEG)脂质，包含但不限于PEG-二酰基甘油(DAG)、PEG-二烷氧基丙基(DAA)、PEG-磷脂、PEG-神经酰胺(Cer)或其混合物。PEG-DAA缀合物可以是例如，PEG-二月桂氧基丙基(Ci2)、PEG-二肉豆蔻氧基丙基(Ci4)、PEG-二棕榈氧基丙基(Ci6)或PEG-二硬脂氧基丙基(C]8)。防止颗粒聚集的缀合的脂质可以是颗粒中存在的总脂质的0mol％至约20mol％或约2mol％。
在一些实施例中，核酸脂质颗粒进一步包含胆固醇，其为颗粒中存在的总脂质的例如约10mol％至约60mol％或约48mol％。
在一些实施例中，iRNA在脂质纳米颗粒(LNP)中调配。
LNP01
在一些实施例中，类脂质ND98·4HCl(MW 1487)(参见于2008年3月26日提交的美国专利申请第12/056,230号，所述美国专利申请通过引用并入本文)、胆固醇(西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))和PEG-神经酰胺C16(埃文蒂极性脂质公司(Avanti PolarLipids))可以用于制备脂质dsRNA纳米颗粒(例如，LNP01颗粒)。每种物质在乙醇中的储备溶液可按如下方式制备：ND98，133mg/ml；胆固醇，25mg/ml，PEG-神经酰胺C16，100mg/ml。然后可以将ND98、胆固醇和PEG-神经酰胺C16储备溶液以例如42:48:10的摩尔比合并。合并的脂质溶液可以与dsRNA水溶液(例如，在pH 5的乙酸钠中)混合，使得最终乙醇浓度为约35％至45％，并且最终乙酸钠浓度为约100mM至300mM。脂质dsRNA纳米颗粒通常在混合时自发形成。取决于期望的粒度分布，可以使用例如热桶挤出机，如Lipex挤出机(北方脂质公司(Northern Lipids,Inc))，经聚碳酸酯膜(例如，100nm截止值)挤出所得的纳米颗粒混合物。在一些情况下，可以省略挤出步骤。可以通过例如透析或切向流过滤实现乙醇去除和同时缓冲液交换。缓冲液可与例如约pH 7，例如约pH 6.9、约pH 7.0、约pH 7.1、约pH 7.2、约pH 7.3或约pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水(PBS)交换。
LNP01调配物在例如国际申请公开第WO 2008/042973号中进行了描述，所述国际申请公开特此通过引用并入。
下表中提供了另外的示例性脂质dsRNA调配物。
表4:示例性脂质调配物
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DSPC：二硬脂酰基磷脂酰胆碱
DPPC：二棕榈酰磷脂酰胆碱
PEG-DMG：PEG-二肉豆蔻酰基甘油(C14-PEG或PEG-C14)(平均摩尔重量为2000的PEG)
PEG-DSG：PEG-联苯乙烯基甘油(C18-PEG或PEG-C18)(平均摩尔重量为2000的PEG)
PEG-cDMA：PEG-氨基甲酰基-1,2-二肉豆蔻酰基氧基丙胺(平均摩尔重量为2000的PEG)
在于2009年4月15日提交的国际公开第WO2009/127060号中描述了包括SNALP(1,2-二氢亚油酰氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA))的调配物，所述国际公开特此通过引用并入。
包括XTC的调配物在例如以下中进行了描述：于2009年1月29日提交的美国临时序列号61/148,366；于2009年3月2日提交的美国临时序列号61/156,851；于2009年6月10日提交的美国临时序列号61/185,712；于2009年7月24日提交的美国临时序列号61/228,373；于2009年9月3日提交的美国临时序列号61/239,686和于2010年1月29日提交的国际申请第PCT/US2010/022614号，所述文献特此通过引用并入。
包括MC3的调配物在例如于2009年9月22日提交的美国临时序列号61/244,834、于2009年6月10日提交的美国临时序列号61/185,800和于2010年6月10日提交的国际申请第PCT/US10/28224号中进行了描述，所述文献特此通过引用并入。
描述了包括ALNY-100的调配物，例如于2009年11月10日提交的国际专利申请第PCT/US09/63933号，所述国际专利申请特此通过引用并入。
包括C12-200的调配物在于2009年5月5日提交的美国临时序列号61/175,770和于2010年5月5日提交的国际申请第PCT/US10/33777号中进行了描述，所述文献特此通过引用并入。
C.阳离子脂质的合成
用于本公开所提出的核酸脂质颗粒中的任何化合物，例如阳离子脂质等都可以通过已知的有机合成技术制备。除非另有说明，否则所有取代基的定义如下。
“烷基”意指含有1个至24个碳原子的直链或支链、非环状或环状饱和的脂肪族烃。代表性的饱和直链烷基包含甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基等，而饱和支链烷基包含异丙基、仲丁基、异丁基、叔丁基、异戊基等。代表性的饱和环状烷基包含环丙基、环丁基、环戊基、环己基等；而不饱和环状烷基包含环戊烯基和环己烯基等。
“烯基”意指如上文所定义的烷基，在相邻的碳原子之间含有至少一个双键。烯基包含顺式和反式异构体两者。代表性的直链和支链烯基包含乙烯基、丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、异丁烯基、1-戊烯基、2-戊烯基，3-甲基-1-丁烯基、2-甲基-2-丁烯基、2,3-二甲基-2-丁烯基等。
“炔基”意指如上文所定义的任何烷基或烯基，其在相邻碳之间另外含有至少一个三键。代表性的直链和支链炔基包含乙炔基、炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、1-戊炔基、2-戊炔基和3-甲基-1丁炔基等。
“酰基”意指任何烷基、烯基或炔基，其中连接点处的碳被氧代基取代，如下文所定义的。例如，-C(＝O)烷基、-C(＝O)烯基和-C(＝O)炔基是酰基。
“杂环”意指饱和、不饱和或芳香族的5元至7元单环或7元至10元双环、杂环，并且其含有1个或2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子，并且其中氮和硫杂原子可任选地氧化，并且氮杂原子可以任选地季铵化，包含双环，其中任何上述杂环与苯环稠合。杂环可以通过任何杂原子或碳原子连接。杂环包含如下文所定义的杂芳基。杂环包含吗啉基、吡咯烷酮基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪炔基(piperizynyl)、乙内酰脲基(hydantoinyl)、戊内酰胺基(valerolactamyl)、环氧乙烷基(oxiranyl)、氧杂环丁烷基(oxetanyl)、四氢呋喃基、四氢吡喃基、四氢吡啶基、四氢嘧啶基、四氢苯硫基、四氢硫代吡喃基、四氢嘧啶基、四氢苯硫基、四氢硫代吡喃基等。
术语“任选地经取代的烷基”、“任选地经取代的烯基”、“任选地经取代的炔基”、“任选地经取代的酰基”和“任选地经取代的杂环”意指当被取代时，至少一个氢原子被取代基置换。在氧代取代基(“＝O”)的情况下，两个氢原子被置换。在这方面，取代基包含氧代、卤素、杂环、-ORx、-NRxRy、-NRxC(＝O)Ry、-NRxSO2Ry、-C(＝O)Rx、-C(＝O)ORx、-C(＝O)NRxRy、–SOnRx和-SOnNRxRy，其中n是0、1或2，Rx和Ry相同或不同并且独立地为氢、烷基或杂环，并且所述烷基和杂环取代基中的每一个可以进一步被以下中的一个或多个取代：氧代、卤素、-OH、-CN、烷基、-ORx、杂环、-NRxRy、-NRxC(＝O)Ry、-NRxSO2Ry、-C(＝O)Rx、-C(＝O)ORx、-C(＝O)NRxRy、-SOnRx和-SOnNRxRy。
“卤素”意指氟、氯、溴或碘。
在一些实施例中，本公开中所提出的方法可能需要使用保护基团。保护基团方法是本领域技术人员熟知的(参见例如，《有机合成中的保护基团(PROTECTIVE GROUPS IN ORGANICSYNTHESIS)》,Green,T.W.等人,纽约市威利国际科学出版社(Wiley-Interscience,New YorkCity),1999)。简而言之，在本公开的上下文内，保护基团是减少或消除官能团的不期望的反应性的任何基团。保护基团可以添加到官能团中，以掩盖其在某些反应期间的反应性，并且然后去除以显示原始官能团。在一些实施例中，使用“醇保护基团”。“醇保护基团”是降低或消除醇官能团的不期望的反应性的任何基团。可以使用本领域众所周知的技术来添加和去除保护基团。
式A的合成
在一些实施例中，使用式A的阳离子脂质调配本公开中所提出的核酸脂质颗粒：
其中R1和R2独立地为烷基、烯基或炔基，各自可任选地被取代，并且R3和R4独立地为低级烷基，或者R3和R4可以在一起形成任选地经取代的杂环。在一些实施例中，阳离子脂质是XTC(2,2-二亚油酰基-4-二甲氨基乙基-[1,3]-二氧戊烷)。通常，上述式A的脂质可以通过以下反应方案1或2制备，其中除非另外指明，否则所有取代基均如上文所定义。
方案1
脂质A，其中R1和R2独立地为烷基、烯基或炔基，各自可以任选地被取代，并且R3和R4独立地为低级烷基，或者R3和R4可以一起形成任选地经取代的杂环，可以根据方案1制备。酮1和溴化物2可以根据本领域普通技术人员已知的方法购买或制备。1和2的反应产生缩酮3。用胺4处理缩酮3产生式A的脂质。式A的脂质可以用式5的有机盐转化为对应的铵盐，其中X是选自卤素、氢氧化物、磷酸酯、硫酸酯等的阴离子反离子。
方案2
可替代地，酮1起始材料可以根据方案2制备。格氏试剂(Grignard reagent)6和氰化物7可以根据本领域普通技术人员已知的方法购买或制备。6和7的反应产生酮1。酮1转化为对应的式A的脂质如方案1所描述的。
MC3的合成
DLin-M-C3-DMA(即(6Z,9Z,28Z,31Z)-4-(二甲基氨基)丁酸三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-基酯)的制备如下。将(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-醇(0.53g)、4-N,N-二甲基氨基丁酸盐酸盐(0.51g)、4-N,N-二甲基氨基吡啶(0.61g)和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(0.53g)于二氯甲烷(5mL)中的溶液在室温下搅拌过夜。将溶液用稀盐酸洗涤，然后用稀碳酸氢钠水溶液洗涤。将有机级分经无水硫酸镁干燥，过滤并在旋转蒸发仪上去除溶剂。使用1％至5％甲醇/二氯甲烷洗脱梯度将残留物向下通过硅胶柱(20g)。将含有纯化的产物的级分合并并去除溶剂，得到无色油状物(0.54g)。
ALNY-100的合成
使用以下方案3进行缩酮519[ALNY-100]的合成：
515的合成：
在氮气气氛下在0 0C下向LiAlH4(3.74g，0.09852mol)于200ml无水THF的双颈RBF(1L)中的搅拌的悬浮液中缓慢添加514(10g,0.04926mol)于70mL的THF中的溶液。完全添加后，将反应混合物温热到室温，并且然后加热回流4小时。通过TLC监测反应的进程。反应完成后(通过TLC)，将混合物冷却到0℃，并且通过小心添加饱和Na2SO4溶液淬灭。将反应混合物在室温下搅拌4小时并过滤掉。将残留物用THF充分洗涤。将滤液和洗涤液混合并用400mL二噁烷和26mL浓HCl稀释并在室温下搅拌20分钟。将挥发物在真空下剥离以提供呈白色固体的515盐酸盐。产率：7.12g 1H-NMR(DMSO,400MHz):δ＝9.34(宽,2H),5.68(s,2H),3.74(m,1H),2.66-2.60(m,2H),2.50-2.45(m,5H)。
516的合成：
向搅拌的化合物515于250mL双颈RBF中的100mL干DCM溶液中添加NEt3(37.2mL，0.2669mol)，并且在氮气气氛下冷却到0℃。在50mL干DCM中缓慢添加N-(苄氧基-羰基氧基)-琥珀酰亚胺(20g，0.08007mol)后，使反应混合物温热到室温。反应完成后(通过TLC 2小时至3小时)，将混合物依次用1N HCl溶液(1×100mL)和饱和NaHCO3溶液(1×50mL)洗涤。然后将有机层经无水Na2SO4干燥并将溶剂蒸发以得到粗材料，所述粗材料通过硅胶柱色谱法进行纯化以得到呈粘性物质的516。产率：11g(89％)。1H-NMR(CDCl3,400MHz):δ＝7.36-7.27(m,5H),5.69(s,2H),5.12(s,2H),4.96(br.,1H)2.74(s,3H),2.60(m,2H),2.30-2.25(m,2H)。LC-MS[M+H]-232.3(96.94％)。
517A和517B的合成：
将环戊烯516(5g，0.02164mol)溶解于单颈500mL RBF中的220mL丙酮和水(10:1)的溶液中，并且向其中添加N-甲基吗啉-N-氧化物(7.6g，0.06492mol)，随后在室温下添加4.2mL 7.6％的OsO4(0.275g，0.00108mol)于叔丁醇中的溶液。反应完成后(约3小时)，通过添加固体Na2SO3将混合物淬灭，并且将所得混合物在室温下搅拌1.5小时。将反应混合物用DCM(300mL)稀释，并且用水(2×100mL)洗涤，然后用饱和NaHCO3(1×50mL)溶液、水(1×30mL)，并且最后用盐水(1×50mL)洗涤。将有机相经无水Na2SO4干燥，并且在真空中去除溶剂。粗材料的硅胶柱色谱纯化得到非对映异构体的混合物，其通过制备型HPLC分离。产率：-6g粗材料
517A-峰1(白色固体)，5.13g(96％)。1H-NMR(DMSO,400MHz):δ＝7.39-7.31(m,5H),5.04(s,2H),4.78-4.73(m,1H),4.48-4.47(d,2H),3.94-3.93(m,2H),2.71(s,3H),1.72-1.67(m,4H)。LC-MS-[M+H]-266.3,[M+NH4+]-283.5存在，HPLC-97.86％。立体化学通过X射线证实。
518的合成：
使用类似于化合物505的合成所描述的程序，获得了呈无色油状物的化合物518(1.2g，41％)。1H-NMR(CDCl3,400MHz):δ＝7.35-7.33(m,4H),7.30-7.27(m,1H),5.37-5.27(m,8H),5.12(s,2H),4.75(m,1H),4.58-4.57(m,2H),2.78-2.74(m,7H),2.06-2.00(m,8H),1.96-1.91(m,2H),1.62(m,4H),1.48(m,2H),1.37-1.25(br m,36H),0.87(m,6H)。HPLC-98.65％。
化合物519的合成的通用程序：
将化合物518(1当量)于己烷(15mL)中的溶液以逐滴方式添加到LAH于THF(1M，2当量)中的冰冷溶液中。完全添加后，将混合物在40℃下加热0.5小时，然后在冰浴中再次冷却。将混合物用饱和Na2SO4水溶液小心水解，然后通过硅藻土过滤并还原成油。柱色谱法提供纯519(1.3g，68％)，其获得时呈无色油状物。13C NMR＝130.2,130.1(x2),127.9(x3),112.3,79.3,64.4,44.7,38.3,35.4,31.5,29.9(x2),29.7,29.6(x2),29.5(x3),29.3(x2),27.2(x3),25.6,24.5,23.3,226,14.1；电喷雾MS(+ve):C44H80NO2(M+H)+Calc.的分子量为654.6，实测值654.6。
通过标准方法或无挤出方法制备的调配物可以以类似的方式表征。例如，调配物通常通过视觉检查来表征。其应该是发白的半透明溶液，没有聚集体或沉积物。脂质纳米颗粒的粒度和粒度分布可以通过使用例如Malvern Zetasizer Nano ZS(美国马尔文公司(Malvern,USA))的光散射来测量。颗粒的大小应为约20nm至300nm，如40nm至100nm。粒度分布应为单峰的。使用染料排除测定估计调配物中的总dsRNA浓度以及包埋的级分。调配的dsRNA的样品可以在存在或不存在破坏调配物的表面活性剂(例如，0.5％Triton-X100)的情况下与RNA结合染料(如Ribogreen(分子探针公司(Molecular Probes)))一起温育。调配物中的总dsRNA可以通过来自含有表面活性剂的样品的信号(相对于标准曲线)来确定。通过从总dsRNA含量中减去“游离”dsRNA含量(如在不存在表面活性剂的情况下通过信号所测量的)来确定包埋的级分。包埋的dsRNA的百分比通常>85％。对于SNALP调配物，粒度为至少30nm、至少40nm、至少50nm、至少60nm、至少70nm、至少80nm、至少90nm、至少100nm、至少110nm和至少120nm。合适的范围通常为约至少50nm至约至少110nm、约至少60nm至约至少100nm或约至少80nm至约至少90nm。
用于口服施用的组合物和调配物包含粉末或颗粒、微粒、纳米颗粒、在水或非水性介质中的悬浮液或溶液、胶囊、凝胶胶囊、囊剂、片剂或微型片剂。增稠剂、调味剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或粘合剂可以是期望的。在一些实施例中，口服调配物是其中本公开中所提出的dsRNA与一种或多种增渗剂表面活性剂和螯合剂一起施用的那些调配物。合适的表面活性剂包含脂肪酸和/或其酯或盐、胆汁酸和/或其盐。合适的胆汁酸/盐包含鹅脱氧胆酸(CDCA)和熊脱氧鹅脱氧胆酸(UDCA)、胆酸、脱氢胆酸、脱氧胆酸、葡胆酸、甘胆酸、甘脱氧胆酸、牛磺胆酸、牛磺脱氧胆酸、牛磺基-24,25-二氢-富西酸钠和甘二氢富西酸钠。合适的脂肪酸包含花生四烯酸、十一烷酸、油酸、月桂酸、辛酸、癸酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸、三癸酸、单油酸甘油酯、二月桂酸甘油酯、1-单癸酸甘油酯、1-十二烷基氮杂环庚烷-2-酮、酰基肉碱、酰基胆碱或甘油单酯、甘油二酯或其药学上可接受的盐(例如，钠)。在一些实施例中，使用增渗剂的组合，例如脂肪酸/盐与胆汁酸/盐的组合。示例性组合是月桂酸、癸酸和UDCA的钠盐。另外的增渗剂包含聚氧乙烯-9-十二烷基醚、聚氧乙烯-20-鲸蜡醚。本公开中所提出的dsRNA可以口服、以包含喷雾干燥颗粒的颗粒形式递送，或复合以形成微型或纳米颗粒。dsRNA络合剂包含聚氨基酸；聚亚胺；聚丙烯酸酯；聚烷基丙烯酸酯、聚氧乙烷、聚氰基丙烯酸烷基酯；阳离子化明胶、白蛋白、淀粉、丙烯酸酯、聚乙二醇(PEG)和淀粉；聚氰基丙烯酸烷基酯；DEAE衍生的聚胺、支链淀粉、纤维素和淀粉。合适的络合剂包含壳聚糖、N-三甲基壳聚糖、聚-L-赖氨酸、聚组氨酸、聚鸟氨酸、聚精蛋白、鱼精蛋白、聚乙烯吡啶、聚硫二乙基氨基甲基乙烯P(TDAE)、聚氨基苯乙烯(例如，对氨基)、聚(甲基氰基丙烯酸酯)、聚(乙基氰基丙烯酸酯)、聚(丁基氰基丙烯酸酯)、聚(异丁基氰基丙烯酸酯)、聚(异己基丙烯酸酯)、DEAE-甲基丙烯酸酯、DEAE-己基丙烯酸酯、DEAE-丙烯酰胺、DEAE-白蛋白和DEAE-右旋糖酐、聚甲基丙烯酸酯、聚己基丙烯酸酯、聚(D,L-乳酸)、聚(DL-乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、藻酸酯和聚乙二醇(PEG)。dsRNA的口服调配物以及其制备在美国专利6,887,906、美国公开第20030027780号以及美国专利第6,747,014中进行了详细描述，所述文献中的每一个通过引用并入本文。
用于肠胃外、实质内(进入脑)、鞘内、玻璃体内、视网膜下、经巩膜、结膜下、眼球后、前房内、心室内或肝内施用的组合物和调配物可以包含无菌水溶液，所述无菌水溶液也可以含有缓冲液、稀释剂和其它合适的添加剂，如但不限于增渗剂、载剂化合物和其它药学上可接受的载剂或赋形剂。
本公开的药物组合物包含但不限于溶液、乳液和含有脂质体的调配物。这些组合物可以由多种组分产生，所述组分所述方法包含但不限于预成型液体、自乳化固体和自乳化半固体。
本公开中所提出的药物调配物可以方便地以单位剂型存在，可以根据制药工业中众所周知的常规技术制备。此类技术包含使活性成分与药物载剂或赋形剂缔合的步骤。一般而言，通过使活性成分与液体载剂或精细固体载剂或两者均匀充分地缔合并且然后在必要时使产物成形来制备所述调配物。
本公开中所提出的组合物可以调配成许多可能的剂型中的任一种，如但不限于片剂、胶囊、凝胶胶囊、液体糖浆、软凝胶、栓剂和灌肠剂。组合物也可以被调配成在水性、非水性或混合介质中的悬浮液。水性悬浮液可以进一步含有增加悬浮液粘度的物质，包含例如羧甲基纤维素钠、山梨醇和/或右旋糖酐。悬浮液也可以含有稳定剂.
D.另外的调配物
i.乳液
本公开的组合物可以制备并调配成乳液。乳液通常是一种液体以液滴的形式分散在另一种液体中的非均相系统，通常直径超过0.1μm(参见例如，《安塞尔的药物剂型和药物递送系统(Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems)》,Allen,LV.,Popovich NG.和Ansel HC.,2004,纽约州纽约的利平科特·威廉斯·威尔金斯出版公司(Lippincott Williams&Wilkins,New York,NY)(第8版)；Idson,《药物剂型》,Lieberman,Rieger和Banker(编辑),1988,纽约州纽约的马塞尔德克尔公司,第1卷,第199页；Rosoff,《药物剂型》,Lieberman,Rieger和Banker(编辑),1988,纽约州纽约的马塞尔德克尔公司,第1卷,第245页；Block,《药物剂型》,Lieberman,Rieger和Banker(编辑),1988,纽约州纽约的马塞尔德克尔公司,第2卷,第335页；Higuchi等人,《雷明顿药物科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)》,宾夕法尼亚州伊斯顿的马克出版公司(MackPublishing Co.,Easton,Pa.),1985,第301页)。乳液通常是两相系统，包括两个相互紧密混合和分散的不混溶液相。通常，乳液可以是油包水(w/w)或水包油(w/w)类型。当水相被精细地分成微小的液滴并分散到本体油相中时，所得到的组合物被称为油包水(w/o)乳液。可替代地，当油相被精细地分成微小的液滴并分散到本体水相中时，所得到的组合物被称为水包油(o/w)乳液。除了分散相和活性药物之外，乳液还可以含有另外的组分，所述活性药物可以以溶液的形式存在于水相、油相中或其本身作为单独的相。药物赋形剂，如乳化剂、稳定剂、染料和抗氧化剂也可以根据需要存在于乳液中。药物乳液也可以是包含多于两相的多种乳液，例如在油包水包油(o/w/o)和水包油包水(w/o/w)乳液的情况下。此类复杂的调配物通常提供简单的二元乳液所没有的某些优点。其中o/w乳液的单个油滴包围小水滴的多重乳液构成w/o/w乳液。类似地，包围在油状连续相中稳定的水滴中的油滴系统提供o/w/o乳液。
乳液的特征在于几乎没有或没有热力学稳定性。通常，乳液的分散或不连续相很好地分散到外部或连续相中，并且通过乳化剂或调配物的粘度维持这种形式。乳液的任何一个相都可以是半固体或固体，如同乳液型软膏基质和乳膏的情况一样。稳定乳液的其它方法需要使用可以并入乳液任一相中的乳化剂。乳化剂可以大致分为四类：合成表面活性剂、天然存在的乳化剂、吸收碱和精细分散的固体(参见例如，《安塞尔的药物剂型和药物递送系统》,Allen,LV.,Popovich NG.和Ansel HC.,2004,纽约州纽约的利平科特·威廉斯·威尔金斯出版公司(第8版)；Idson,《药物剂型》,Lieberman,Rieger和Banker(编辑),1988,纽约州纽约的马塞尔德克尔公司,第1卷,第199页)。
已发现合成表面活性剂(也称为表面活性药剂)在乳液调配物中具有广泛的适用性，并且已在文献中进行了综述(参见例如，《安塞尔的药物剂型和药物递送系统》,Allen,LV.,Popovich NG.和Ansel HC.,2004,纽约州纽约的利平科特·威廉斯·威尔金斯出版公司(第8版)；Rieger,《药物剂型》,Lieberman,Rieger和Banker(编辑),1988,纽约州纽约的马塞尔德克尔公司,第1卷,第285页；Idson,《药物剂型》,Lieberman,Rieger和Banker(编辑),1988,纽约州纽约的马塞尔德克尔公司,第1卷,第199页)。表面活性剂通常是两亲性的，并且包括亲水性和疏水性部分。表面活性剂的亲水性与疏水性的比率被称为亲水/亲脂平衡(HLB)，并且是在调配物的制备中对表面活性剂进行分类和选择的有价值的工具。表面活性剂可以基于亲水基团的性质分为不同的类别：非离子、阴离子、阳离子和两性(参见例如，《安塞尔的药物剂型和药物递送系统》,Allen,LV.,Popovich NG.和Ansel HC.,2004,纽约州纽约的利平科特·威廉斯·威尔金斯出版公司(第8版)；Rieger,《药物剂型》,Lieberman,Rieger和Banker(编辑),1988,纽约州纽约的马塞尔德克尔公司,第1卷,第285页)。
乳液调配物中使用的天然存在的乳化剂包含羊毛脂、蜂蜡、磷脂、卵磷脂和阿拉伯胶。吸收碱具有亲水特性，使得其可以吸收水形成w/o乳液，但仍保持其半固体稠度，如无水羊毛脂和亲水性矿脂。精细分散的固体也被用作良好的乳化剂，特别是与表面活性剂和粘性制剂组合使用。这些包含极性无机固体，如重金属氢氧化物，非溶胀粘土，如膨润土、凹凸棒石、锂蒙脱石、高岭土、蒙脱石、胶体硅酸铝和胶体硅酸镁铝，颜料和非极性固体，如碳或三硬脂酸甘油酯。
乳液调配物中还包含多种非乳化材料，并且有助于乳液的特性。这些包含脂肪、油、蜡、脂肪酸、脂肪醇、脂肪酸酯、保湿剂、亲水胶体、防腐剂和抗氧化剂(Block,《药物剂型》,Lieberman,Rieger和Banker(编辑),1988,纽约州纽约的马塞尔德克尔公司,第1卷,第335页；Idson,《药物剂型》,Lieberman,Rieger和Banker(编辑),1988,纽约州纽约的马塞尔德克尔公司,第1卷,第199页)。
亲水胶体或水胶体包含天然存在的树胶和合成聚合物，如多糖(例如，阿拉伯胶、琼脂、藻酸、角叉菜胶、瓜尔豆胶、卡拉亚胶和黄芪胶)、纤维素衍生物(例如，羧甲基纤维素和羧丙基纤维素)以及合成聚合物(例如，碳聚合物、纤维素醚和羧乙烯基聚合物)。这些在水中分散或膨胀以形成胶体溶液，所述胶体溶液通过在分散相液滴周围形成强界面膜并通过增加外部相的粘度来稳定乳液。
由于乳液通常含有许多成分，如碳水化合物、蛋白质、甾醇和磷脂，所述成分可以很容易地支持微生物的生长，因此这些调配物通常掺入防腐剂。乳液调配物中包含的常用的防腐剂包含尼泊金甲酯、尼泊金丙酯、季铵盐、苯扎氯铵、对羟基苯甲酸酯和硼酸。抗氧化剂通常也被添加到乳液调配物中，以防止调配物变质。所使用的抗氧化剂可以是自由基清除剂，如生育酚、没食子酸烷基酯、丁基化羟基茴香醚、丁基化羟基甲苯，或还原剂，如抗坏血酸和焦亚硫酸钠，以及抗氧化剂增效剂，如柠檬酸、酒石酸和卵磷脂。
乳液调配物通过皮肤、口服和肠胃外通路的应用以及其制造方法已经在文献中进行了综述(参见例如，《安塞尔的药物剂型和药物递送系统》,Allen,LV.,Popovich NG.和Ansel HC.,2004,纽约州纽约的利平科特·威廉斯·威尔金斯出版公司(第8版)；Idson,《药物剂型》,Lieberman,Rieger和Banker(编辑),1988,纽约州纽约的马塞尔德克尔公司,第1卷,第199页)。用于口服递送的乳液调配物由于易于调配以及从吸收和生物利用度的角度来看的功效而被非常广泛地使用(参见例如，《安塞尔的药物剂型和药物递送系统》,Allen,LV.,Popovich NG.和Ansel HC.,2004,纽约州纽约的利平科特·威廉斯·威尔金斯出版公司(第8版)；Rosoff,《药物剂型》,Lieberman,Rieger和Banker(编辑),1988,纽约州纽约的马塞尔德克尔公司,第1卷,第245页；Idson,《药物剂型》,Lieberman,Rieger和Banker(编辑),1988,纽约州纽约的马塞尔德克尔公司,第1卷,第199页)。矿物油基泻药、油溶性维生素和高脂肪营养制剂通常是作为o/w乳液口服施用的材料。
在本公开的一些实施例中，iRNA和核酸的组合物被调配为微乳液。微乳液可以定义为水、油和两亲物的系统，其是单一的光学各向同性和热力学稳定的液体溶液(参见例如，《安塞尔的药物剂型和药物递送系统》,Allen,LV.,Popovich NG.和Ansel HC.,2004,纽约州纽约的利平科特·威廉斯·威尔金斯出版公司(第8版)；Rosoff,《药物剂型》,Lieberman,Rieger和Banker(编辑),1988,纽约州纽约的马塞尔德克尔公司,第1卷,第245页)。通常，微乳液是通过首先将油分散在表面活性剂水溶液中，并且然后添加足量的第四组分(通常是中链长醇)以形成透明系统而制备的系统。因此，微乳液也被描述为两种不混溶液体的热力学稳定、各向同性透明的分散体，所述两种不混溶液体通过表面活性分子的界面膜来稳定(Leung和Shah,《药物的控制释放：聚合物和聚集系统(Controlled Releaseof Drugs:Polymers and Aggregate Systems)》,Rosoff,M.编辑,1989,纽约的VCH出版社(VCH Publishers,New York),第185-215页)。微乳液通常通过三种至五种组分的组合制备，所述组分包含油、水、表面活性剂、助表面活性剂和电解质。微乳液是油包水(w/o)还是水包油(o/w)类型取决于所用的油和表面活性剂的特性，以及表面活性剂分子的极性头和烃尾的结构和几何堆积(Schott,《雷明顿药物科学》,宾夕法尼亚州伊斯顿的马克出版公司,1985,第271页)。
利用相图的现象学方法已经得到了广泛的研究，并且为本领域技术人员提供了关于如何调配微乳液的全面知识(参见例如，《安塞尔的药物剂型和药物递送系统》,Allen,LV.,Popovich NG.和Ansel HC.,2004,利平科特·威廉斯·威尔金斯出版公司(第8版),纽约州纽约；Rosoff,《药物剂型》,Lieberman,Rieger和Banker(编辑),1988,纽约州纽约的马塞尔德克尔公司,第1卷,第245页；Block,《药物剂型》,Lieberman,Rieger和Banker(编辑),1988,纽约州纽约的马塞尔德克尔公司,第1卷,第335页)。与传统乳液相比，微乳液提供了将水不溶性药物溶解在自发形成的热力学稳定液滴调配物中的优点。
用于制备微乳液的表面活性剂包含但不限于离子表面活性剂、非离子表面活化剂、Brij 96、聚氧乙烯油醚、聚甘油脂肪酸酯、单月桂酸四甘油酯(ML310)、单油酸四甘油酯(MO310)、单油酸六甘油酯(PO310)、五油酸六甘油酯(PO500)、单癸酸十甘油酯(MCA750)、单油酸十甘油酯(MO750)、连续油酸十甘油酯(SO750)、十油酸十甘油酯(DAO750)，单独或与助表面活性剂组合。助表面活性剂，通常是短链醇，如乙醇、1-丙醇和1-丁醇，通过渗透到表面活性剂膜中，并且由于表面活性剂分子之间产生的空隙空间而产生无序膜，从而增加界面流动性。然而，可以在不使用助表面活性剂的情况下制备微乳液，并且本领域已知无醇自乳化微乳液系统。水相通常可以是但不限于水、药物的水溶液、甘油、PEG300、PEG400、聚甘油、丙二醇和乙二醇的衍生物。油相可以包含但不限于材料，如Captex 300、Captex 355、Capmul MCM、脂肪酸酯、中链(C8-C12)单、二和三甘油酯、聚氧乙烯化甘油脂肪酸酯、脂肪醇、聚乙二醇化甘油酯、饱和聚乙二醇化C8-C10甘油酯、植物油和硅酮油。
从药物增溶和增强药物吸收的角度来看，微乳液尤其引人关注。已经提出了基于脂质的微乳液(o/w和w/o两者)来提高包含肽在内的药物的口服生物利用度(参见例如，美国专利第6,191,105号；第7,063,860号；第7,070,802号；第7,157,099号；Constantinides等人,《药物研究(Pharmaceutical Research)》,1994,11,1385-1390；Ritschel,《实验和临床药理学的方法和发现(Meth.Find.Exp.Clin.Pharmacol.)》,1993,13,205)。微乳液具有改善药物增溶、保护药物免受酶水解、由于表面活性剂诱导的膜流动性和渗透性的改变而可能增强药物吸收、易于制备、相对于固体剂型易于口服施用、提高临床效力以及降低的毒性等优点(参见例如，美国专利第6,191,105号；第7,063,860号；第7,070,802号；第7,157,099号；Constantinides等人,《药物研究》,1994,11,1385；Ho等人,《药物科学杂志(J.Pharm.Sci.)》,1996,85,138-143)。当微乳液的组分在环境温度下聚集在一起时，通常可以自发形成微乳液。这在调配不耐热药物、肽或iRNA时可能尤其有利。微乳液在化妆品和药物应用两者中对活性组分的透皮递送也很有效。预期本公开的微乳液组合物和调配物将促进iRNA和核酸从胃肠道的增加的全身吸收，以及改善iRNA和核酸的局部细胞摄取。
本公开的微乳液还可以含有另外的组分和添加剂，如脱水山梨糖醇单硬脂酸酯(Grill 3)、Labrasol和增渗剂，以改善调配物的特性并增强本公开的iRNA和核酸的吸收。本公开的微乳液中使用的增渗剂可以分类为五大类之一——表面活性剂、脂肪酸、胆汁盐、螯合剂和非螯合非表面活性剂(Lee等人,《治疗药物载剂系统的关键综述(CriticalReviews in Therapeutic Drug Carrier Systems)》,1991,第92页)。这些类别中的每一个都已经在上文进行了讨论。
ii.增渗剂
在一些实施例中，本公开使用各种增渗剂来实现核酸，特别是iRNA到动物皮肤的有效递送。大多数药物以电离和非电离两种形式存在于溶液中。然而，通常只有脂溶性或亲脂性药物容易穿过细胞膜。已经发现，如果用增渗剂处理待穿过的膜，即使是非亲脂性药物也可以穿过细胞膜。除了有助于非亲脂性药物穿过细胞膜的扩散外，增渗剂还可以增强亲脂性药物的渗透性。
增渗剂可以分为五大类之一，即表面活性剂、脂肪酸、胆汁盐、螯合剂和非螯合非表面活性剂(参见例如，Malmsten,M.《药物递送中的表面活性剂和聚合物(Surfactantsand polymers in drug delivery)》,纽约州纽约的Informa医疗健康公司(InformaHealth Care,New York,NY),2002；Lee等人,《治疗药物载剂系统的关键综述(CriticalReviews in Therapeutic Drug Carrier Systems)》,1991,第92页)。下面更详细地描述上述每一类增渗剂。
表面活性剂:结合本公开，表面活性剂(surfactant)(或“表面活性剂(surface-active agent)”)是化学实体，当其溶解在水溶液中时，会降低溶液的表面张力或水溶液与另一种液体之间的界面张力，从而增强iRNA通过粘膜的吸收。除了胆汁盐和脂肪酸之外，这些增渗剂还包含例如，十二烷基硫酸钠、聚氧乙烯-9-十二烷基醚和聚氧乙烯-20-鲸蜡醚)(参见例如，Malmsten,M.《药物递送中的表面活性剂和聚合物》,纽约州纽约的Informa医疗健康公司,2002；Lee等人,《治疗药物载剂系统的关键综述》,1991,第92页)；以及全氟化学乳液，如FC-43。Takahashi等人,《药学和药理学杂志(J.Pharm.Pharmacol.)》,1988,40,252)。
脂肪酸:作为增渗剂的各种脂肪酸以及其衍生物包含例如，油酸、月桂酸、癸酸(正癸酸)、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸、三癸酸、单油酸甘油酯(1-单油酰基-rac-甘油)、二月桂酸甘油酯、辛酸、花生四烯酸、1-单癸酸甘油酯、1-十二烷基氮杂环庚烷-2-酮，酰基肉碱、酰基胆碱、其C1-20烷基酯(例如，甲基、异丙基和叔丁基)以及其单甘油酯和二甘油酯(即油酸酯、月桂酸酯、癸酸酯、肉豆蔻酸酯、棕榈酸酯、硬脂酸酯、亚油酸酯等)(参见例如，Touitou,E.等人,《药物递送的增强(Enhancement in Drug Delivery)》,马萨诸塞州丹弗斯的CRC出版社(CRC Press,Danvers,MA),2006；Lee等人,《治疗药物载剂系统的关键综述》,1991,第92页；Muranishi,《治疗药物载剂系统的关键综述》,1990,7,1-33；El Hariri等人,《药学和和药理学杂志》,1992,44,651-654)。
胆汁盐:胆汁的生理作用包含促进脂质和脂溶性维生素的分散和吸收(参见例如，Malmsten,M.《药物递送中的表面活性剂和聚合物》,纽约州纽约的Informa医疗健康公司,2002；Brunton,第38章:《古德曼和吉尔曼治疗学的药理学基础(Goodman&Gilman’s ThePharmacological Basis of Therapeutics)》,第9版,Hardman等人,编辑,纽约的麦格劳·希尔出版社(McGraw-Hill,New York),1996,第934-935页)。各种天然胆汁盐以及其合成衍生物作为增渗剂。因此，术语“胆汁盐”包含胆汁的任何天然存在的组分以及其任何合成衍生物。合适的胆汁盐包含例如，胆酸(或其药学上可接受的钠盐，胆酸钠)、脱氢胆酸(脱氢胆酸钠)、脱氧胆酸(脱氧胆酸钠)、葡胆酸(葡胆酸钠)、甘胆酸(甘胆酸钠)、甘脱氧胆酸(甘脱氧胆酸钠)、牛磺胆酸(牛磺胆酸钠)、牛磺脱氧胆酸(牛磺脱氧胆酸钠)、鹅脱氧胆酸(鹅脱氧胆酸钠)、熊脱氧胆酸(UDCA)、牛磺基-24,25-二氢-富西酸钠(STDHF)、甘二氢富西酸钠和聚氧乙烯-9-十二烷基醚(POE)(参见例如，Malmsten,M.《药物递送中的表面活性剂和聚合物》,纽约州纽约的Informa医疗健康公司,2002；Lee等人,《治疗药物载剂系统的关键综述》,1991,第92页；Swinyard,第39章:《雷明顿药物科学》,第18版，Gennaro编辑,宾夕法尼亚州伊斯顿的马克出版公司,1990,第782-783页；Muranishi,《治疗药物载剂系统的关键综述》,1990,7,1-33；Yamamoto等人,《药理和实验治疗学杂志》,1992,263,25；Yamashita等人,《药物科学杂志》,1990,79,579-583)。
螯合剂:如与本公开结合使用的螯合剂可以定义为通过与溶液形成复合物来从溶液中去除金属离子的化合物，其结果是增强了iRNA通过粘膜的吸收。关于其本公开中作为增渗剂的用途，螯合剂还具有作为DNase抑制剂的另外的优点，因为大多数表征的DNA核酸酶需要二价金属离子进行催化，并且因此被螯合剂抑制(Jarrett,《色谱杂志(J.Chromatogr.)》,1993,618,315-339)。合适的螯合剂包含但不限于乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、柠檬酸、水杨酸酯(例如，水杨酸钠、5-甲氧基水杨酸酯和高香草酸酯)、胶原蛋白的N-酰基衍生物、β-二酮(烯胺)的月桂醇聚醚-9和N-氨基酰基衍生物(参见例如，Katdare,A.等人,《用于药物、生物技术和药物递送的赋形剂开发(Excipient development forpharmaceutical,biotechnology,and drug delivery)》,马萨诸塞州丹弗斯的CRC出版社,2006；Lee等人,《治疗药物载剂系统的关键综述》,1991,第92页；Muranishi,《治疗药物载剂系统的关键综述》,1990,7,1-33；Buur等人,《控释杂志(J.Control Rel.)》,1990,14,43-51)。
非螯合非表面活性剂:如本文所使用的，非螯合非表面活性剂渗透增强化合物可以定义为作为螯合剂或表面活性剂表现出不显著的活性，但仍然增强iRNA通过消化道粘膜的吸收的化合物(参见例如，Muranishi,《治疗药物载剂系统的关键综述》,1990,7,1-33)。此类增渗剂包含例如，不饱和环脲、1-烷基-和1-烯基氮杂环-烷酮衍生物(Lee等人,《治疗药物载剂系统的关键综述》,1991,第92页)；和非甾体抗炎剂，如双氯芬酸钠、吲哚美辛和苯基丁氮酮(Yamashita等人,《药学和药理学杂志》,1987,39,621-626)。
在细胞水平上增强iRNA的摄取的药剂也可以添加到本公开的药物和其它组合物中。例如，阳离子脂质，如lipofectin(Junichi等人,美国专利第5,705,188号)、阳离子甘油衍生物和聚阳离子分子，如聚赖氨酸(Lollo等人,PCT申请WO 97/30731)也已知可增强dsRNA的细胞摄取。可商购获得的转染试剂的实例包含例如LipofectamineTM(加利福尼亚州卡尔斯堡的英杰公司(Invitrogen；Carlsbad,CA))、Lipofectamine 2000TM(加利福尼亚州卡尔斯堡的英杰公司)、293fectinTM(加利福尼亚州卡尔斯堡的英杰公司)、CellfectinTM(加利福尼亚州卡尔斯堡的英杰公司)、DMRIE-CTM(加利福尼亚州卡尔斯堡的英杰公司)、FreeStyleTMMAX(加利福尼亚州卡尔斯堡的英杰公司)、LipofectamineTM2000CD(加利福尼亚州卡尔斯堡的英杰公司)、LipofectamineTM(加利福尼亚州卡尔斯堡的英杰公司)、RNAiMAX(加利福尼亚州卡尔斯堡的英杰公司)、OligofectamineTM(加利福尼亚州卡尔斯堡的英杰公司)、OptifectTM(加利福尼亚州卡尔斯堡的英杰公司)、X-tremeGENE Q2转染试剂(瑞士格赫斯尔的罗氏公司(Roche；Grenzacherstrasse,Switzerland))、DOTAP脂质体转染试剂(瑞士格赫斯尔)、DOSPER脂质体转染试剂(瑞士格赫斯尔)或Fugene(瑞士格赫斯尔)、试剂(威斯康星州麦迪逊市的普洛麦格公司(Promega；Madison,WI))、TransFastTM转染试剂(威斯康星州麦迪逊市的普洛麦格公司)、TfxTM-20试剂(威斯康星州麦迪逊市的普洛麦格公司)、TfxTM-50试剂(威斯康星州麦迪逊市的普洛麦格公司)、DreamFectTM(法国马赛的OZ生物科学公司(OZ Biosciences；Marseille,France))、EcoTransfect(法国马赛的OZ生物科学公司)、TransPassa D1转染试剂(美国马萨诸塞州伊普斯维奇的新英格兰生物实验室(New England Biolabs；Ipswich,MA,USA)、LyoVecTM/LipoGenTM(美国加利福尼亚州圣迭戈的Invivogen公司(Invivogen；San Diego,CA,USA))、PerFectin转染试剂(美国加利福尼亚州圣迭戈的Genlantis公司(Genlantis；San Diego,CA,USA))、NeuroPORTER转染试剂(美国加利福尼亚州圣迭戈的Genlantis公司)、GenePORTER转染试剂(美国加利福尼亚州圣迭戈的Genlantis公司)、GenePORTER 2转染试剂(美国加利福尼亚州圣迭戈的Genlantis公司)、Cytofectin转染试剂(美国加利福尼亚州圣迭戈的Genlantis公司)、BaculoPORTER转染试剂(美国加利福尼亚州圣迭戈的Genlantis公司)、TroganPORTERTM转染试剂(美国加利福尼亚州圣迭戈的Genlantis公司)、RiboFect(美国马萨诸塞州陶顿的Bioline公司(Bioline；Taunton,MA,USA))、PlasFect(美国马萨诸塞州陶顿的Bioline公司)、UniFECTOR(美国加利福尼亚州山景城的B桥国际公司(B-BridgeInternational；Mountain View,CA,USA))、SureFECTOR(美国加利福尼亚州山景城的B桥国际公司)或HiFectTM(美国加利福尼亚州山景城的B桥国际公司)等。
其它药剂可以用于增强施用的核酸的渗透，包含二醇，如乙二醇和丙二醇，吡咯，如2-吡咯、氮酮和萜烯，如柠檬烯和薄荷酮。
iii.载剂
本公开的某些组合物也在调配物中掺入载剂化合物。如本文所使用的，“载剂化合物”可以指核酸或其类似物，其是惰性的(即，本身不具有生物活性)，但通过体内过程被识别为核酸，所述体内过程通过例如降解生物活性核酸或促进其从循环中去除来降低具有生物活性的核酸的生物利用度。核酸和载剂化合物的共同施用(通常与过量的后一种物质一起施用)可以引起在肝、肾或其它循环外贮存器中回收的核酸量显著减少，这可能是由于载剂化合物与核酸之间对共同受体的竞争。例如，当部分硫代磷酸酯dsRNA与聚肌苷酸、硫酸葡聚糖、聚胞苷酸或4-乙酰氨基-4'异硫氰基-二苯乙烯-2,2’-二磺酸共同施用时，可以减少肝组织中部分硫代磷酸酯dsRNA的回收(Miyao等人,《dsRNA研究与开发(DsRNARes.Dev.)》,1995,5,115-121；Takakura等人,《dsRNA和核酸药物开发(DsRNA&Nucl.AcidDrug Dev.)》,1996,6,177-183)。
iv.赋形剂
与载剂化合物相比，药物载剂或赋形剂可以包括例如药学上可接受的溶剂、悬浮剂或任何其它用于将一种或多种核酸递送到动物的药理学惰性媒剂。赋形剂可以是液体的或固体的并且在考虑计划的施用方式的情况下被选择，以便在与核酸和给定药物组合物的其它组分组合时提供期望的体积、一致性等。典型的药物载剂包含但不限于结合剂(例如，预凝胶化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素等)；填充剂(例如，乳糖和其它糖、微晶纤维素、果胶、明胶、硫酸钙、乙基纤维素、聚丙烯酸酯、磷酸氢钙等)；润滑剂(例如，硬脂酸镁、滑石、硅石、胶体二氧化硅、硬脂酸、金属硬脂酸盐、氢化植物油、玉米淀粉、聚乙二醇、苯甲酸钠、乙酸钠等)；崩解剂(例如，淀粉、羟乙酸淀粉钠等)；以及润湿剂(例如，十二烷基硫酸钠等)。
适于非肠胃外施用的不与核酸发生有害反应的药学上可接受的有机或无机赋形剂也可以用于调配本公开的组合物。适合的药学上可接受的载剂包含但不限于水、盐溶液、醇、聚乙二醇、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。
用于局部施用核酸的调配物可以包含无菌和非无菌水溶液、普通溶剂(如醇)中的非水溶液或核酸在液体或固体油基中的溶液。所述溶液还可以含有缓冲液、稀释剂和其它合适的添加剂。可以使用适于非肠胃外施用的不与核酸发生有害反应的药学上可接受的有机或无机赋形剂。
适合的药学上可接受的赋形剂包含但不限于水、盐溶液、醇、聚乙二醇、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。
v.其它组分
本公开的组合物可以另外含有在药物组合物中常规存在的其它附属组分，例如处于其现有技术确定的使用水平。因此，例如，组合物可以含有另外的相容性药物活性材料，例如，止痒药、收敛剂、局部麻醉剂或抗炎剂，或可以含有可用于物理调配本公开的组合物的各种剂型的另外的材料，如染料、调味剂、防腐剂、抗氧化剂、不透明剂、增稠剂和稳定剂。然而，这种材料，在添加时，不应该不适当地干扰本公开的组合物的成分的生物活性。调配物可以进行灭菌，并且如果期望的话，可以与不与所述调配物的核酸有害地相互作用的助剂，例如润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、用于影响渗透压的盐、缓冲液、着色剂、调味剂和/或芳香物质等混合。
水性悬浮液可以含有增加悬浮液粘度的物质，包含例如羧甲基纤维素钠、山梨醇和/或右旋糖酐。悬浮液也可以含有稳定剂.
在一些实施例中，本公开中所提出的药物组合物包含(a)一种或多种iRNA化合物和(b)通过非RNAi机制发挥作用的一种或多种生物药剂。此类生物药剂的实例包含干扰MYOC和至少一种MYOC结合配偶体的相互作用的药剂。
此类化合物的毒性和治疗功效可以通过细胞培养物或实验动物中的标准制药程序测定，例如，用于确定LD50(对50％群体致死的剂量)和ED50(对50％群体治疗有效的剂量)。毒性作用与治疗效果之间的剂量比为治疗指数并且所述治疗指数可以被表示为比率LD50/ED50。表现出高治疗指数的化合物是典型的。
从细胞培养测定和动物研究获得的数据可以用于调配用于在人中使用的剂量范围。本公开中所提出的组合物的剂量通常在包含ED50的循环浓度范围内，几乎没有或没有毒性。剂量可以根据所使用的剂型和所使用的施用途径在此范围内变化。对于本公开中所提出的方法中使用的任何化合物，治疗有效剂量可以最初根据细胞培养测定估计。可以在动物模型中调配剂量，以达到化合物的循环血浆浓度范围，或者在适当的情况下，达到靶序列的多肽产物的循环血浆浓度范围(例如，实现多肽浓度的降低)，所述范围包含细胞培养中确定的IC50(即达到症状的一半最大抑制的测试化合物的浓度)。可以使用此类信息来更精确地确定人体中的有用剂量。可以例如通过高效液相色谱法来测量血浆中的水平。
除了其施用之外，如上文所讨论的，本公开中所提出的iRNA还可以与其它已知的有效治疗与MYOC表达相关的疾病或病症(例如青光眼，例如，原发性开角型青光眼(POAG))的药物组合施用。在任何情况下，施用医师可以基于使用本领域已知或本文所描述的功效的标准测量观察到的结果来调节iRNA施用的量和时间。
VII.治疗与MYOC的表达相关的病症的方法
本公开涉及靶向MYOC以抑制MYOC表达和/或治疗与MYOC表达相关的疾病、病症或病理过程(例如，青光眼，例如，原发性开角型青光眼(POAG))的iRNA的用途。
在一些方面，提供了一种治疗与MYOC的表达相关的病症的方法，所述方法包括将本文所公开的iRNA(例如，dsRNA)施用于有需要的受试者。在一些实施例中，iRNA抑制(降低)MYOC表达。
在一些实施例中，受试者是充当与MYOC表达相关的病症(例如，青光眼，例如，原发性开角型青光眼(POAG))的模型的动物。
A.青光眼
在一些实施例中，与MYOC表达相关的病症是青光眼。可使用本文所描述的方法治疗的青光眼的非限制性实例包含原发性开角型青光眼(POAG)。
青光眼的临床和病理特征包含但不限于视力丧失、视敏度降低(例如，灯光周围的光晕和模糊)以及来自眼睛的房水的渗漏减少。
在一些实施例中，患有青光眼的受试者小于18岁。在一些实施例中，患有青光眼的受试者是成人。在一些实施例中，患有青光眼的受试者超过60岁。在一些实施例中，受试者患有或被鉴定为患有相对于参考水平(例如，大于参考水平的MYOC水平)升高的MYOC mRNA或蛋白质水平。
在一些实施例中，使用来自受试者的样品(例如，水性眼液样品)的分析来诊断青光眼。在一些实施例中，使用选自以下的一种或多种的方法分析样品：荧光原位杂交(FISH)、免疫组织化学、MYOC免疫测定、电子显微镜、激光显微切割和质谱法。在一些实施例中，使用任何合适的诊断测试或技术来诊断青光眼，例如，Goldmann压平眼压计、中央角膜厚度(CCT)的测量、自动化静态阈值视野检查(例如，Humphrey视野分析)、Van Herick技术、前房角镜检查、超声生物显微镜检查和前段光学相干断层扫描(AS-OCT)，血管造影(例如，荧光素血管造影或吲哚菁绿血管造影)、视网膜电描记术、超声检查、厚度测量法、光学相干断层扫描(OCT)、计算机断层扫描(CT)和磁共振成像(MRI)、压力测量法、色觉测试、视野测试、裂隙灯检查、眼底镜检查和身体检查(例如，评估视敏度(例如，通过眼底镜检查或光学相干断层扫描(OCT))。
B.组合疗法
在一些实施例中，本文所公开的iRNA(例如，dsRNA)与已知对治疗与MYOC表达相关的病症(青光眼，例如，原发性开角型青光眼(POAG))或此类病症的症状有效的第二疗法(例如，一种或多种另外的疗法)组合施用。iRNA可以在第二疗法之前、之后或与其同时施用。在一些实施例中，iRNA在第二疗法之前施用。在一些实施例中，在第二疗法之后施用iRNA。在一些实施例中，iRNA与第二疗法同时施用。
第二疗法可以是另外的治疗剂。iRNA和另外的治疗剂可以在相同的组合物中组合施用，或者另外的治疗剂可以作为单独组合物的一部分施用。
在一些实施例中，第二疗法是有效治疗病症或病症的症状的非iRNA治疗剂。
在一些实施例中，iRNA与疗法一起施用。
示例性组合疗法包含但不限于激光小梁成形术外科手术、小梁切除术外科手术、微创青光眼外科手术、在眼睛中放置引流管、口服药物或滴眼液。
施用剂量、途径和定时
可以向受试者(例如，人类受试者，例如，患者)施用治疗量的iRNA。治疗量可以是例如0.05mg/kg至50mg/kg。
在一些实施例中，iRNA被调配用于递送到靶器官，例如，递送到眼睛。
在一些实施例中，iRNA被调配为脂质调配物，例如，如本文所描述的LNP调配物。在一些此类实施例中，治疗量是0.05mg/kg至5mg/kg dsRNA。在一些实施例中，脂质调配物，例如LNP调配物是静脉内施用的。
在一些实施例中，iRNA是GalNAc缀合物的形式，例如，如本文所描述的。在一些此类实施例中，治疗量是0.5mg至50mg dsRNA。在一些实施例中，例如GalNAc缀合物是皮下施用的。
在一些实施例中，例如定期重复施用，如每天、每两周(即每两周)，持续一个月、两个月、三个月、四个月、六个月或更长时间。在初始治疗方案之后，可以在不太频繁的基础上施用治疗。例如，在每两周施用持续三个月后，可以每月重复施用一次，持续六个月或一年或更长时间。
在一些实施例中，iRNA药剂以两个或更多个剂量施用。在一些实施例中，后续剂量的数量或量取决于期望的效果的实现，例如，(a)抑制或减少MYOC的表达或活性；(b)降低错误折叠的MYOC蛋白的水平；(c)减少小梁网细胞死亡；(d)降低眼压；或(e)增加视敏度，或实现治疗或预防效果，例如，减少或预防与病症相关的一种或多种症状。
在一些实施例中，根据时间表施用iRNA药剂。例如，iRNA药剂可以每周施用一次、每周两次、每周三次、每周四次或每周五次。在一些实施例中，时间表涉及有规律间隔的施用，例如，每小时、每四小时、每六小时、每八小时、每十二小时、每天、每2天、每3天、每4天、每5天、每周、每两周或每月。在一些实施例中，iRNA药剂以实现期望的效果所需的频率施用。
在一些实施例中，时间表涉及紧密间隔的施用，随后是较长的时间段，在此期间不施用药剂。例如，时间表可以涉及在相对短的时间段内(例如，约每6小时、约每12小时、约每24小时、约每48小时或约每72小时)施用的初始剂量组，随后是较长的时间段(例如，约1周、约2周、约3周、约4周、约5周、约6周、约7周或约8周)，在此期间不施用iRNA药剂。在一些实施例中，iRNA药剂最初每小时施用，随后以更长的间隔施用(例如，每天、每周、每两周或每月)。在一些实施例中，iRNA药剂最初每天施用，随后以更长的间隔施用(例如，每周、每两周或每月)。在某些实施例中，较长的间隔随着时间的推移而增加，或者基于期望的效果的实现而确定。
在施用全剂量的iRNA之前，可以向患者施用较小的剂量，如5％的输注剂量，并且监测不良反应，如过敏反应，或升高的脂质水平或血压。在另一个实例中，可以监测患者是否有不期望的效果。
VIII.用于调节MYOC的表达的方法
在一些方面，本公开提供了一种用于调节(例如，抑制或激活)MYOC的表达的方法，例如，在细胞中，在组织中或在受试者体内。在一些实施例中，细胞或组织是离体的、体外的或体内的。在一些实施例中，细胞或组织位于眼睛(例如，小梁网组织、睫状体、视网膜色素上皮(RPE)、视网膜组织、星形胶质细胞、周细胞、缪氏细胞、神经节细胞、内皮细胞、光感受器细胞、视网膜血管(例如，包含内皮细胞和血管平滑肌细胞)或脉络膜组织，例如，脉络膜血管)中。在一些实施例中，细胞或组织位于受试者(例如，哺乳动物，例如人)体内。在一些实施例中，受试者(例如，人)处于患有与MYOC表达的表达相关的病症中的风险中或被诊断患有所述病症，如本文所描述的。
在一些实施例中，所述方法包含以有效降低细胞中的MYOC的表达的量将细胞与如本文所描述的iRNA接触。在一些实施例中，使细胞与RNAi药剂接触包含使细胞在体外与RNAi药剂接触或使细胞在体内与RNAi药剂接触。在一些实施例中，通过执行所述方法的个体使RNAi药剂与细胞物理接触，或可以使RNAi药剂处于允许或使其随后与细胞接触的情况。体外接触细胞可以通过例如将细胞与RNAi药剂一起温育来进行。体内接触细胞可以通过例如将RNAi药剂注射到细胞所在的组织中或其附近，或通过将RNAi药剂注射到另一区域，例如眼组织中来进行。例如，RNAi药剂可以含有配体或与配体偶联，例如，一个亲脂性部分或多个亲脂性部分，如文所描述的并进一步详细描述的，例如PCT/US2019/031170中，所述文献通过全文引用的方式并入本文，包含其中描述亲脂性部分的段落，其在所关注的位点处引导或以其它方式稳定RNAi药剂。体外和体内接触方法的组合也是可能的。例如，细胞也可以与RNAi药剂体外接触，并且随后移植到受试者体内。
MYOC的表达可以基于MYOC mRNA、MYOC蛋白的表达的水平或与MYOC的表达的水平功能相关的另一个参数的水平来评估。在一些实施例中，MYOC的表达被抑制至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。在一些实施例中，iRNA的IC50在0.001nM至0.01nM、0.001nM至0.10nM、0.001nM至1.0nM、0.001nM至10nM、0.01nM至0.05nM、0.01nM至0.50nM、0.02nM至0.60nM、0.01nM至1.0nM、0.01nM至1.5nM、0.01nM至10nM的范围内。IC50值可以相对于适当的对照值(例如，非靶向iRNA的IC50)进行归一化。
在一些实施例中，所述方法包含将如本文所描述的iRNA引入细胞或组织中，并且将细胞或组织维持足够的时间以获得MYOC的mRNA转录物的降解，由此抑制细胞或组织中的MYOC的表达。
在一些实施例中，所述方法包含向哺乳动物施用本文所描述的组合物，例如包括与MYOC结合的iRNA的组合物，使得靶MYOC的表达降低，如持续延长的持续时间，例如至少两天、三天、四天或更长时间，例如一周、两周、三周或四周或更长时间。在一些实施例中，在第一次施用的1小时、2小时、4小时、8小时、12小时或24小时内可检测到MYOC的表达的减少。
在一些实施例中，所述方法包含向哺乳动物施用如本文所描述的组合物，使得与未经治疗的动物相比，靶MYOC的表达增加例如至少10％。在一些实施例中，MYOC的激活发生在延长的持续时间内，例如至少两天、三天、四天或更长时间，例如一周、两周、三周、四周或更长时间。不希望受理论束缚，iRNA可以通过稳定MYOC mRNA转录物、与基因组中的启动子相互作用或抑制MYOC表达的抑制剂来激活MYOC表达。
可用于本公开中所提出的方法和组合物的iRNA特别靶向MYOC的RNA(原初或加工的)。使用iRNA抑制MYOC的表达的组合物和方法可以如本文其它地方所描述的制备和进行。
在一些实施例中，所述方法包含施用含有iRNA的组合物，其中所述iRNA包含与待治疗的受试者(例如，哺乳动物，例如，人)的MYOC的RNA转录物的至少一部分互补的核苷酸序列。组合物可以通过本领域已知的任何适当方式施用，包含但不限于眼部(例如，眼内)、局部和静脉内施用。
在某些实施例中，组合物是眼内施用的(例如，通过玻璃体内施用，例如玻璃体内注射；经巩膜施用，如经巩膜注射；结膜下施用，例结膜下注射；眼球后施用，例如眼球后注射；前房内施用，例如前房内注射；或视网膜下施用，例如视网膜下注射)。在其它实施例中，组合物是局部施用的。在其它实施例中，组合物通过静脉内输注或注射施用。
在某些实施例中，组合物通过静脉内输注或注射施用。在一些此类实施例中，组合物包括用于静脉内输注的脂质调配的siRNA(例如，LNP调配物，如LNP11调配物)。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管类似或等效于本文所描述的方法和材料的方法和材料可以用于实践或测试本公开中所提出的iRNA和方法，但下文描述了合适的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献通过引用整体并入。在冲突的情况下，将以本说明书(包含定义)为准。另外，所述材料、方法和实例仅是说明性的并且不旨在进行限制。
具体实施例
1.一种用于抑制肌纤蛋白(MYOC)的表达的双链核糖核酸(dsRNA)药剂，其中所述dsRNA药剂包括形成双链区的有义链和反义链，其中所述有义链包括核苷酸序列，所述核苷酸序列包括具有人MYOC的编码链的部分的0个、1个、2个或3个错配的至少15个连续核苷酸，并且所述反义链包括核苷酸序列，所述核苷酸序列包括具有人MYOC的非编码链的对应部分的0个、1个、2个或3个错配至少15个连续核苷酸，使得所述有义链与所述反义链中的至少15个连续核苷酸互补。
2.根据实施例1所述的dsRNA药剂，其中人MYOC的编码链包括SEQ ID NO:1的序列。
3.根据实施例1或2所述的dsRNA药剂，其中人MYOC的非编码链包括SEQ ID NO:2的序列。
4.一种用于抑制MYOC的表达的双链核糖核酸(dsRNA)药剂，其中所述dsRNA药剂包括形成双链区的有义链和反义链，其中所述反义链包括核苷酸序列，所述核苷酸序列包括具有SEQ ID NO:2的核苷酸序列的部分的0个、1个、2个或3个错配的至少15个连续核苷酸，使得所述有义链与所述反义链中的至少15个连续核苷酸互补。
5.根据实施例4所述的dsRNA药剂，其中所述有义链包括核苷酸序列，所述核苷酸序列包括具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列的对应部分的0个或1个、2个或3个错配的至少15个连续核苷酸。
5a.根据前述实施例中任一项所述的dsRNA药剂，其中所述反义链包括核苷酸序列，所述核苷酸序列包括与双链体AD-1565804的反义链核苷酸序列具有0个、1个、2个或3个错配的至少15个连续核苷酸，并且所述有义链包括核苷酸序列，所述核苷酸序列包括与双链体AD-1565804的有义链核苷酸序列具有0个、1个、2个或3个错配的至少15个连续核苷酸。
5b.根据前述实施例中任一项所述的dsRNA药剂，其中所述反义链包括核苷酸序列，所述核苷酸序列包括与双链体AD-1565837的反义链核苷酸序列具有0个、1个、2个或3个错配的至少15个连续核苷酸，并且所述有义链包括核苷酸序列，所述核苷酸序列包括与双链体AD-1565837的有义链核苷酸序列具有0个、1个、2个或3个错配的至少15个连续核苷酸。
6.根据前述实施例中任一项所述的dsRNA，其中所述dsRNA药剂包括有义链和反义链，其中所述反义链包括核苷酸序列，所述核苷酸序列包括具有SEQ ID NO:2的核苷酸序列的部分的0个、1个、2个或3个错配的至少17个连续核苷酸，使得所述有义链与所述反义链中的至少17个连续核苷酸互补。
7.根据实施例6所述的dsRNA，其中所述有义链包括核苷酸序列，所述核苷酸序列包括具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列的对应部分的0个或1个、2个或3个错配的至少17个连续核苷酸。
8.根据前述实施例中任一项所述的dsRNA，其中所述dsRNA药剂包括有义链和反义链，其中所述反义链包括核苷酸序列，所述核苷酸序列包括具有SEQ ID NO:2的核苷酸序列的部分的0个、1个、2个或3个错配的至少19个连续核苷酸，使得所述有义链与所述反义链中的至少19个连续核苷酸互补。
9.根据实施例8所述的dsRNA，其中所述有义链包括核苷酸序列，所述核苷酸序列包括具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列的对应部分的0个、1个、2个或3个错配的至少19个连续核苷酸。
10.根据前述实施例中任一项所述的dsRNA，其中所述dsRNA药剂包括有义链和反义链，其中所述反义链包括核苷酸序列，所述核苷酸序列包括具有SEQ ID NO:2的核苷酸序列的部分的0个、1个、2个或3个错配的至少21个连续核苷酸，使得所述有义链与所述反义链中的至少21个连续核苷酸互补。
11.根据实施例10所述的dsRNA，其中所述有义链包括核苷酸序列，所述核苷酸序列包括具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列的对应部分的0个或1个、2个或3个错配的至少21个连续核苷酸。
12.根据前述实施例中任一项所述的dsRNA药剂，其中所述有义链的部分是表2A和2B中的任一个中的有义链内的部分。
13.根据前述实施例中任一项所述的dsRNA药剂，其中所述反义链的部分是表2A和2B中的任一个中的反义链内的部分。
14.根据前述实施例中任一项所述的dsRNA药剂，所述反义链包括核苷酸序列，所述核苷酸序列包括与表2A和2B中的任一个中所列出的反义序列中的一个反义序列具有0个、1个、2个或3个错配的至少15个连续核苷酸。
15.根据前述实施例中任一项所述的dsRNA药剂，其中所述有义链包括核苷酸序列，所述核苷酸序列包括与表2A和2B中的任一个中所列出的与所述反义序列对应的有义序列具有0个、1个、2个或3个错配的至少15个连续核苷酸。
16.根据前述实施例中任一项所述的dsRNA药剂，所述反义链包括核苷酸序列，所述核苷酸序列包括与表2A和2B中的任一个中所列出的反义序列中的一个反义序列具有0个、1个、2个或3个错配的至少17个连续核苷酸。
17.根据前述实施例中任一项所述的dsRNA药剂，其中所述有义链包括核苷酸序列，所述核苷酸序列包括与表2A和2B中的任一个中所列出的与所述反义序列对应的有义序列具有0个、1个、2个或3个错配的至少17个连续核苷酸。
18.根据前述实施例中任一项所述的dsRNA药剂，所述反义链包括核苷酸序列，所述核苷酸序列包括与表2A和2B中的任一个中所列出的反义序列中的一个反义序列具有0个、1个、2个或3个错配的至少19个连续核苷酸。
19.根据前述实施例中任一项所述的dsRNA药剂，其中所述有义链包括核苷酸序列，所述核苷酸序列包括与表2A和2B中的任一个中所列出的与所述反义序列对应的有义序列具有0个、1个、2个或3个错配的至少19个连续核苷酸。
20.根据前述实施例中任一项所述的dsRNA药剂，其中所述反义链包括核苷酸序列，所述核苷酸序列包括与表2A和2B中的任一个中所列出的反义序列中的一个反义序列具有0个、1个、2个或3个错配的至少21个连续核苷酸。
21.根据前述实施例中任一项所述的dsRNA药剂，其中所述有义链包括核苷酸序列，所述核苷酸序列包括与表2A和2B中的任一个中所列出的与所述反义序列对应的有义序列具有0个、1个、2个或3个错配的至少21个连续核苷酸。
22.根据前述实施例中任一项所述的dsRNA药剂，其中所述有义链的长度为至少23个核苷酸，例如，长度为23个至30个核苷酸。
23.根据前述实施例中任一项所述的dsRNA药剂，其中所述有义链和所述反义链中的至少一个与一个或多个亲脂性部分缀合。
24.根据实施例23所述的dsRNA药剂，其中所述亲脂性部分与所述dsRNA药剂的所述双链区中的一个或多个位置缀合。
25.根据实施例23或24所述的dsRNA药剂，其中所述亲脂性部分通过接头或载剂缀合。
26.根据实施例23至25中任一项所述的dsRNA药剂，其中所述亲脂性部分的通过logKow测量的亲脂性超过0。
27.根据前述实施例中任一项所述的dsRNA药剂，其中通过双链RNAi药剂的血浆蛋白结合测定中的未结合级分测量的所述双链RNAi药剂的疏水性独立地超过0.2。
28.根据实施例27所述的dsRNA药剂，其中所述血浆蛋白结合测定是使用人血清白蛋白的电泳迁移率偏移测定。
29.根据前述实施例中任一项所述的dsRNA药剂，其中所述dsRNA药剂包括至少一个经修饰的核苷酸。
30.根据实施例29所述的dsRNA药剂，其中有义链核苷酸中的不超过五个有义链核苷酸和所述反义链的所述核苷酸中的不超过五个核苷酸是未经修饰的核苷酸。
31.根据实施例29所述的dsRNA药剂，其中所述有义链的所有核苷酸和所述反义链的所有核苷酸都包括修饰。
32.根据实施例29至31中任一项所述的dsRNA药剂，其中所述经修饰的核苷酸中的至少一个经修饰的核苷酸：脱氧核苷酸、3'末端脱氧胸腺嘧啶(dT)核苷酸、2'-O-甲基修饰的核苷酸、2'-氟修饰的核苷酸、2'-脱氧修饰的核苷酸、锁定核苷酸、解锁核苷酸、构象限制性核苷酸、约束乙基核苷酸、无碱基核苷酸、2'-氨基修饰的核苷酸、2'-O-烯丙基修饰的核苷酸、2'-C-烷基修饰的核苷酸、2'-甲氧基乙基修饰的核苷酸、2'-O-烷基修饰的核苷酸、吗啉代核苷酸、氨基磷酸酯、包括核苷酸的非天然碱基、四氢吡喃修饰的核苷酸、1,5-脱水己糖醇修饰的核苷酸、环己烯基修饰的核苷酸、包括硫代磷酸酯基的核苷酸、包括甲基膦酸酯基的核苷酸、包括5'-磷酸酯的核苷酸、包括5'-磷酸酯模拟物的核苷酸、乙二醇修饰的核苷酸和2-O-(N-甲基乙酰胺)修饰的核苷酸；以及其组合。
33.根据实施例29至31中任一项所述的dsRNA药剂，其中不超过五个所述有义链核苷酸和不超过五个所述反义链的核苷酸包含除2'-O-甲基修饰的核苷酸、2'-氟修饰的核苷酸、2'-脱氧修饰的核苷酸、解锁核酸(UNA)或甘油核酸(GNA)以外的修饰。
34.根据前述实施例中任一项所述的dsRNA药剂，所述dsRNA药剂包括位于所述有义链的两个连续核苷酸之间或所述反义链的两个连续核苷酸之间的非核苷酸间隔子(其中任选地，所述非核苷酸间隔子包括C3-C6烷基)。
35.根据前述实施例中任一项所述的dsRNA药剂，其中每条链的长度不超过30个核苷酸。
36.根据前述实施例中任一项所述的dsRNA药剂，其中至少一条链包括至少1个核苷酸的3'突出端。
37.根据前述实施例中任一项所述的dsRNA药剂，其中至少一条链包括至少2个核苷酸的3'突出端。
38.根据前述实施例中任一项所述的dsRNA药剂，其中所述双链区的长度为15个至30个核苷酸对。
39.根据实施例38所述的dsRNA药剂，其中所述双链区的长度为17个至23个核苷酸对。
40.根据实施例38所述的dsRNA药剂，其中所述双链区的长度为17个至25个核苷酸对。
41.根据实施例38所述的dsRNA药剂，其中所述双链区的长度为23个至27个核苷酸对。
42.根据实施例38所述的dsRNA药剂，其中所述双链区的长度为19个至21个核苷酸对。
43.根据实施例38所述的dsRNA药剂，其中所述双链区的长度为21个至23个核苷酸对。
44.根据前述实施例中任一项所述的dsRNA药剂，其中每条链具有19个至30个核苷酸。
45.根据前述实施例中任一项所述的dsRNA药剂，其中每条链具有19个至23个核苷酸。
46.根据前述实施例中任一项所述的dsRNA药剂，其中每条链具有21个至23个核苷酸。
47.根据前述实施例中任一项所述的dsRNA药剂，其中所述药剂包括至少一个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键。
48.根据实施例47所述的dsRNA药剂，其中所述硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键位于一条链的3'末端处。
49.根据实施例48所述的dsRNA药剂，其中所述链是所述反义链。
50.根据实施例48所述的dsRNA药剂，其中所述链是所述有义链。
51.根据实施例47所述的dsRNA药剂，其中所述硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键位于一条链的5'末端处。
52.根据实施例51所述的dsRNA药剂，其中所述链是所述反义链。
53.根据实施例51所述的dsRNA药剂，其中所述链是所述有义链。
54.根据实施例47所述的dsRNA药剂，其中一条链的5'和3'末端中的每一个都包括硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键。
55.根据实施例54所述的dsRNA药剂，其中所述链是所述反义链。
56.根据前述实施例中任一项所述的dsRNA药剂，其中在所述双链体的所述反义链的5'端的1位置处的碱基对是AU碱基对。
57.根据实施例54所述的dsRNA药剂，其中所述有义链具有总计21个核苷酸，并且所述反义链具有总计23个核苷酸。
58.根据实施例23至57中任一项所述的dsRNA药剂，其中一个或多个亲脂性部分与至少一条链上的一个或多个内部位置缀合。
59.根据实施例58所述的dsRNA药剂，其中所述一个或多个亲脂性部分通过接头或载剂与至少一条链上的一个或多个内部位置缀合。
60.根据实施例59所述的dsRNA药剂，其中所述内部位置包含除了距离所述至少一条链的每一端的末端两个位置以外的所有位置。
61.根据实施例59所述的dsRNA药剂，其中所述内部位置包含除了距离所述至少一条链的每一端的末端三个位置以外的所有位置。
62.根据实施例59至61中任一项所述的dsRNA药剂，其中所述内部位置不包括所述有义链的切割位点区。
63.根据实施例62所述的dsRNA药剂，其中所述内部位置包含从所述有义链的5'端开始计数的除位置9至12以外的所有位置。
64.根据实施例62所述的dsRNA药剂，其中所述内部位置包含从所述有义链的3'端开始计数的除位置11至13以外的所有位置。
65.根据实施例59至61中任一项所述的dsRNA药剂，其中所述内部位置不包括所述反义链的切割位点区。
66.根据实施例65所述的dsRNA药剂，其中所述内部位置包含从所述反义链的5'端开始计数的除位置12至14以外的所有位置。
67.根据实施例59至61中任一项所述的dsRNA药剂，其中所述内部位置包含从3'端开始计数的除所述有义链上的位置11至13以外和从5'端开始计数的除所述反义链上的位置12至14以外的所有位置。
68.根据实施例23至67中任一项所述的dsRNA药剂，其中所述一个或多个亲脂性部分与选自由以下组成的组的所述内部位置中的一个或多个内部位置缀合：从每条链的5'端开始计数的所述有义链上的位置4至8和13至18，以及所述反义链上的位置6至10和15至18。
69.根据实施例68所述的dsRNA药剂，其中所述一个或多个亲脂性部分与选自由以下组成的组的所述内部位置中的一个或多个内部位置缀合：从每条链的5'端开始计数的所述有义链上的位置5、6、7、15和17，以及所述反义链上的位置15和17。
70.根据实施例24所述的dsRNA药剂，其中所述双链区中的所述位置不包括所述有义链的切割位点区。
71.根据实施例23至70中任一项所述的dsRNA药剂，其中所述有义链的长度为21个核苷酸，所述反义链的长度为23个核苷酸，并且所述亲脂性部分与所述有义链的位置21、位置20、位置15、位置1、位置7、位置6或位置2或所述反义链的位置16缀合。
72.根据实施例71所述的dsRNA药剂，其中所述亲脂性部分与所述有义链的位置21、位置20、位置15、位置1或位置7缀合。
73.根据实施例71所述的dsRNA药剂，其中所述亲脂性部分与所述有义链的位置21、位置20或位置15缀合。
74.根据实施例71所述的dsRNA药剂，其中所述亲脂性部分与所述有义链的位置20或位置15缀合。
75.根据实施例71所述的dsRNA药剂，其中所述亲脂性部分与所述反义链的位置16缀合。
76.根据实施例71所述的dsRNA药剂，其中所述亲脂性部分与从所述有义链的5'端计数的位置6缀合。
77.根据实施例23至76中任一项所述的dsRNA药剂，其中所述亲脂性部分是脂肪族、脂环族或聚脂环族化合物。
78.根据实施例77所述的dsRNA药剂，其中所述亲脂性部分选自由以下组成的组：脂质、胆固醇、视黄酸、胆酸、金刚烷乙酸、1-芘丁酸、二氢睾酮、1,3-双-O(十六烷基)甘油、香叶基氧基己醇、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基、棕榈酸、肉豆蔻酸、O3-(油酰基)石胆酸、O3-(油酰基)胆烯酸、二甲氧基三苯甲基或吩噁嗪。
79.根据实施例78所述的dsRNA药剂，其中所述亲脂性部分含有饱和或不饱和C4-C30烃链，以及选自由以下组成的组的任选的官能团：羟基、胺、羧酸、磺酸酯、磷酸酯、硫醇、叠氮化物和炔烃。
80.根据实施例79所述的dsRNA药剂，其中所述亲脂性部分含有饱和或不饱和C6-C18烃链。
81.根据实施例79所述的dsRNA药剂，其中所述亲脂性部分含有饱和或不饱和C16烃链。
82.根据实施例23至81中任一项所述的dsRNA药剂，其中所述亲脂性部分通过置换所述内部位置或所述双链区中的一个或多个核苷酸的载剂缀合。
83.根据实施例82所述的dsRNA药剂，其中所述载剂是选自由以下组成的组的环状基团：吡咯烷基、吡唑啉基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、哌啶基、哌嗪基、[1,3]二氧戊环基、噁唑烷基、异噁唑烷基、吗啉基、噻唑烷基、异噻唑烷基、喹喔啉基、哒嗪酮基、四氢呋喃基和十氢萘基；或是基于丝氨醇主链或二乙醇胺主链的无环部分。
84.根据实施例23至81中任一项所述的dsRNA药剂，其中所述亲脂性部分通过含有醚、硫醚、脲、碳酸酯、胺、酰胺、马来酰亚胺-硫醚、二硫化物、磷酸二酯、磺酰胺键、点击反应的产物或氨基甲酸酯的接头与双链iRNA药剂缀合。
85.根据实施例23至84中任一项所述的双链iRNA药剂，其中所述亲脂性部分与核碱基、糖部分或核苷间键缀合。
86.根据实施例23至85中任一项所述的dsRNA药剂，其中所述亲脂性部分通过选自由以下组成的组的生物可切割接头缀合：DNA、RNA、二硫化物、酰胺、半乳糖胺的官能化单糖或寡糖、葡糖胺、葡萄糖、半乳糖、甘露糖以及其组合。
87.根据实施例23至86中任一项所述的dsRNA药剂，其中所述有义链的3'端通过端盖保护，所述端盖是具有胺的环状基团，所述环状基团选自由以下组成的组：吡咯烷基、吡唑啉基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、哌啶基、哌嗪基、[1,3]二氧戊环基、噁唑烷基、异噁唑烷基、吗啉基、噻唑烷基、异噻唑烷基、喹喔啉基、哒嗪酮基、四氢呋喃基和十氢萘基。
88.根据实施例23至87中任一项所述的dsRNA药剂，其进一步包括靶向配体，例如，靶向眼组织或肝组织的配体。
89.根据实施例88所述的dsRNA药剂，其中所述配体与所述有义链缀合。
90.根据实施例88或89所述的dsRNA药剂，其中所述配体与所述有义链的3'端或5'端缀合。
91.根据实施例88或89所述的dsRNA药剂，其中所述配体与所述有义链的3'端缀合。
92.根据实施例88至91中任一项所述的dsRNA药剂，其中所述眼组织是小梁网组织、睫状体、视网膜组织、视网膜色素上皮(RPE)或脉络膜组织，例如，脉络膜血管。
93.根据实施例88至91中任一项所述的dsRNA药剂，其中所述靶向配体包括N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)。
94.根据实施例88至91中任一项所述的dsRNA药剂，其中所述靶向配体是一种或多种GalNAc缀合物或一种或多种或GalNAc衍生物。
95.根据实施例94所述的dsRNA药剂，其中所述一种或多种GalNAc缀合物或一种或多种GalNAc衍生物通过单价接头或二价、三价或四价支链接头连接。
96.根据实施例94所述的dsRNA药剂，其中所述配体是
97.根据实施例96所述的dsRNA药剂，其中所述dsRNA药剂与所述配体缀合，如以下示意图所示
/>
其中X是O或S。
98.。根据实施例97所述的dsRNA药剂，其中所述X是O。
99.根据实施例1至98中任一项所述的dsRNA药剂，其进一步包括发生在所述反义链的3'端处的第一核苷酸间键处，具有呈Sp构型的键磷原子的末端手性修饰；
发生在所述反义链的5'端处的第一核苷酸间键处，具有呈Rp构型的键磷原子的末端手性修饰；以及
发生在所述有义链的5'端处的第一核苷酸间键处，具有呈Rp构型或Sp构型的键磷原子的末端手性修饰。
100.根据实施例1至98中任一项所述的dsRNA药剂，其进一步包括：
发生在所述反义链的3'端处的第一核苷酸间键和第二核苷酸间键处，具有呈Sp构型的键磷原子的末端手性修饰；
发生在所述反义链的5'端处的第一核苷酸间键处，具有呈Rp构型的键磷原子的末端手性修饰；以及
发生在所述有义链的5'端处的第一核苷酸间键处，具有呈Rp或Sp构型的键磷原子的末端手性修饰。
101.根据实施例1至98中任一项所述的dsRNA药剂，其进一步包括：
发生在所述反义链的3'端处的第一核苷酸间键、第二核苷酸间键和第三核苷酸间键处，具有呈Sp构型的键磷原子的末端手性修饰；
发生在所述反义链的5'端处的第一核苷酸间键处，具有呈Rp构型的键磷原子的末端手性修饰；以及
发生在所述有义链的5'端处的第一核苷酸间键处，具有呈Rp或Sp构型的键磷原子的末端手性修饰。
102.根据实施例1至98中任一项所述的dsRNA药剂，其进一步包括：
发生在所述反义链的3'端处的第一核苷酸间键和第二核苷酸间键处，具有呈Sp构型的键磷原子的末端手性修饰；
发生在所述反义链的3'端处的第三核苷酸间键处，具有呈Rp构型的键磷原子的末端手性修饰；
发生在所述反义链的5'端处的第一核苷酸间键处，具有呈Rp构型的键磷原子的末端手性修饰；以及
发生在所述有义链的5'端处的第一核苷酸间键处，具有呈Rp或Sp构型的键磷原子的末端手性修饰。
103.根据实施例1至98中任一项所述的dsRNA药剂，其进一步包括：
发生在所述反义链的3'端处的第一核苷酸间键和第二核苷酸间键处，具有呈Sp构型的键磷原子的末端手性修饰；
发生在所述反义链的5'端处的第一核苷酸间键和第二核苷酸间键处，具有呈Rp构型的键磷原子的末端手性修饰；以及
发生在所述有义链的5'端处的第一核苷酸间键处，具有呈Rp或Sp构型的键磷原子的末端手性修饰。
104.根据实施例1至103中任一项所述的dsRNA药剂，其进一步包括在所述反义链的5'端处的磷酸酯或磷酸酯模拟物。
105.根据实施例104所述的dsRNA药剂，其中所述磷酸酯模拟物是5'-乙烯基膦酸酯(VP)。
106.一种细胞，其含有根据实施例1至105中任一项所述的dsRNA药剂。
107.一种人眼细胞，例如(小梁网的细胞、睫状体的细胞、RPE细胞、星形胶质细胞、周细胞、缪氏细胞、神经节细胞、内皮细胞或光感受器细胞)与其它类似的未经处理细胞相比，所述人眼细胞包括降低的水平的MYOC mRNA或一定水平的MYOC蛋白，其中任选地所述水平降低至少10％、15％、20％、25％，30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。
108.根据实施例107所述的人细胞，所述人细胞通过包括使人细胞与根据实施例1至94中任一项所述的dsRNA药剂接触的过程产生。
109.一种用于抑制MYOC的表达的药物组合物，所述药物组合物包括根据实施例1至105中任一项所述的dsRNA药剂。
110.一种药物组合物，其包括根据实施例1至105中任一项所述的dsRNA药剂以及脂质调配物。
111.一种抑制细胞中的MYOC的表达的方法，所述方法包括：
(a)使所述细胞与根据实施例1至105中任一项所述的dsRNA药剂或根据实施例109或110所述的药物组合物接触；以及
(b)将在步骤(a)中产生的细胞维持足以使MYOC的所述mRNA转录物降解的时间，由此抑制所述细胞中的MYOC的表达。
112.一种抑制细胞中的MYOC的表达的方法，所述方法包括：
(a)使所述细胞与根据实施例1至105中任一项所述的dsRNA药剂或根据实施例109或110所述的药物组合物接触；以及
(b)将在步骤(a)中产生的细胞维持足以降低MYOC mRNA、MYOC蛋白或MYOC mRNA和蛋白两者的水平的时间，由此抑制MYOC在所述细胞中的表达。
113.根据实施例111或112所述的方法，其中所述细胞在受试者体内。
114.根据实施例113所述的方法，其中所述受试者是人。
115.根据实施例111至114中任一项所述的方法，其中MYOC mRNA的水平被抑制至少50％。
116.根据实施例111至114中任一项所述的方法，其中MYOC蛋白的水平被抑制至少50％。
117.根据实施例114至116中任一项所述的方法，其中抑制MYOC的表达使来自所述受试者的生物样品(例如，水性眼液样品)中的MYOC蛋白水平降低至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。
118.根据实施例114至117中任一项所述的方法，其中所述受试者已被诊断患有MYOC相关病症，例如青光眼，例如原发性开角型青光眼(POAG)。
119.一种抑制眼细胞或组织中的MYOC的表达的方法，所述方法包括：
(a)使所述细胞或组织和与MYOC结合的dsRNA药剂接触；以及
(b)将在步骤(a)中产生的细胞或组织维持足以降低MYOC mRNA、MYOC蛋白或MYOCmRNA和蛋白两者的水平的时间，由此抑制MYOC在所述细胞或组织中的表达。
120.根据实施例119所述的方法，其中所述眼细胞或组织包括小梁网组织、睫状体、RPE细胞、视网膜组织、星形胶质细胞、周细胞、缪氏细胞、神经节细胞、内皮细胞、光感受器细胞、视网膜血管(例如，包含内皮细胞和血管平滑肌细胞)或脉络膜组织，例如，脉络膜血管。
120a.一种降低受试者的眼压的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据实施例1至105中任一项所述的dsRNA药剂或根据实施例109或110所述的药物组合物，由此降低所述受试者的眼压。
120b.一种限制受试者的眼压的增加或维持恒定眼压的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据实施例1至105中任一项所述的dsRNA药剂或根据实施例109或110所述的药物组合物，由此限制所述受试者的眼压的增加，或维持恒定眼压。
121.一种治疗患有或被诊断患有MYOC相关病症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据实施例1至105中任一项所述的dsRNA药剂或根据实施例109或110所述的药物组合物，由此治疗所述病症。
122.根据实施例118或121所述的方法，其中所述MYOC相关病症是青光眼。
122a.一种治疗患有青光眼的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据实施例1至105中任一项所述的dsRNA药剂或根据实施例109或110所述的药物组合物，由此治疗所述青光眼。
123.根据实施例122或122a所述的方法，其中青光眼选自由原发性开角型青光眼(POAG)组成的组。
124.根据实施例121至123中任一项所述的方法，其中治疗包括改善所述病症的至少一种体征或症状。
125.根据实施例124所述的方法，其中青光眼的至少一种体征或症状
包括对视神经损伤、视力丧失、管状视力、视力模糊、眼睛疼痛或MYOC(例如，MYOC基因、MYOC mRNA或MYOC蛋白)的存在、水平或活性中的一种或多种的测量。
126.根据实施例121至123中任一项所述的方法，其中治疗包括所述病症的进展的预防。
127.根据实施例124至126中任一项所述的方法，其中所述治疗包括以下中的一种或多种：(a)抑制或降低MYOC的表达或活性；(b)降低错误折叠的MYOC蛋白的水平；(c)减少小梁网细胞死亡；(d)降低眼压；或(e)增加视敏度。
128.根据实施例127所述的方法，其中所述治疗引起所述小梁网组织、睫状体、视网膜、RPE、视网膜血管(例如，包含内皮细胞和血管平滑肌细胞)或脉络膜组织(例如，脉络膜血管)中的MYOC mRNA从基线平均减少至少30％。
129.根据实施例128所述的方法，其中所述治疗引起所述小梁网组织、睫状体、视网膜、RPE、视网膜血管(例如，包含内皮细胞和血管平滑肌细胞)或脉络膜组织(例如，脉络膜血管)中的MYOC mRNA从基线平均减少至少60％。
130.根据实施例129所述的方法，其中所述治疗引起所述小梁网组织、睫状体、视网膜、RPE、视网膜血管(例如，包含内皮细胞和血管平滑肌细胞)或脉络膜组织(例如，脉络膜血管)中的MYOC mRNA从基线平均减少至少90％。
131.根据实施例124至129中任一项所述的方法，其中所述受试者在单剂量的dsRNA之后经历至少8周的敲低持续时间，如通过所述视网膜中的MYOC蛋白评估的。
132.根据实施例131所述的方法，其中治疗引起在单剂量的dsRNA之后至少12周的敲低持续时间，如通过所述视网膜中的MYOC蛋白评估的。
133.根据实施例132所述的方法，其中治疗引起在单剂量的dsRNA之后至少16周的敲低持续时间，如通过所述视网膜中的MYOC蛋白评估的。
134.根据实施例113至133中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
135.根据实施例114至134中任一项所述的方法，其中所述dsRNA药剂以约0.01mg/kg至约50mg/kg的剂量施用。
136.根据实施例114至135中任一项所述的方法，其中所述dsRNA药剂眼内、静脉内或局部施用于所述受试者。
137.根据实施例136所述的方法，其中所述眼内施用包括玻璃体内施用(例如，玻璃体内注射)、经巩膜施用(例如，经巩膜注射)、结膜下施用(例如，结膜下注射)、眼球后施用(例如，眼球后注射)、前房内施用(例如、前房内注射)或视网膜下施用(例如，视网膜下注射)。
138.根据实施例114至137中任一项所述的方法，其进一步包括测量所述受试者的MYOC(例如，MYOC基因、MYOC mRNA或MYOC蛋白)的水平。
139.根据实施例138所述的方法，其中测量所述受试者的MYOC的水平包括测量来自所述受试者的生物样品(例如，水性眼液样品)中的MYOC基因、MYOC蛋白或MYOC mRNA的水平。
140.根据实施例114至139中任一项所述的方法，其进一步包括进行血液测试、成像测试或水性眼液活检。
141.根据实施例138至140中任一项所述的方法，其中测量所述受试者的MYOC(例如，MYOC基因、MYOC mRNA或MYOC蛋白)的水平的方法在用所述dsRNA药剂或所述药物组合物治疗之前进行。
142.根据实施例141所述的方法，其中在确定受试者的MYOC(例如，MYOC基因、MYOCmRNA或MYOC蛋白)的水平高于参考水平后，向所述受试者施用所述dsRNA药剂或所述药物组合物。
143.根据实施例139至142中任一项所述的方法，其中测量所述受试者的MYOC(例如，MYOC基因、MYOC mRNA或MYOC蛋白)的水平的方法在用所述dsRNA药剂或所述药物组合物治疗之后进行。
144.根据实施例121至143中任一项所述的方法，其进一步包括向所述受试者施用适于治疗或预防MYOC相关病症的另外的药剂和/或疗法。
145.根据实施例144所述的方法，其中所述另外的药剂和/或疗法包括光动力疗法、光凝疗法、类固醇、非甾体抗炎剂、抗MYOC剂和/或玻璃体切除术中的一种或多种。
实例
实例1.MYOC siRNA
本文所提供的核酸序列使用标准命名法表示。参见表1中的缩略语。
表1.用于核酸序列表示的核苷酸单体的缩略语。
应当理解，这些单体当存在于寡核苷酸中时通过5'-3'-磷酸二酯键相互连接。
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1L96的化学结构如下：
实验方法
生物信息学
转录物
产生了四组靶向人MYOC“肌纤蛋白”(人：NCBI refseqID NM_000261.2；NCBIGeneID：4653)的siRNA。人NM_000261.2REFSEQ mRNA的长度为2100个碱基。使用生物信息学方法产生寡核苷酸对并进行排序，并且示例性寡核苷酸对在表2A和表2B中示出。经修饰的序列呈现在表2A中。未经修饰的序列呈现在表2B中。
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实例2.MYOC siRNA的体外筛选
实验方法
细胞培养和转染：
人小梁网细胞(HTMC)细胞转染
通过每孔向5μl siRNA双链体中添加4.9μl Opti-MEM加0.1μl RNAiMAX(加利福尼亚州卡尔斯堡的英杰公司，目录号13778-150)转染HTMC细胞(ATCC)，每个siRNA双链体重复4次，转染到384孔板中，并且在室温下温育15分钟。然后将四十μl含有约5×103个细胞的DMEM：F12培养基(赛默飞世尔公司(ThermoFisher))添加到siRNA转染混合物中。在RNA纯化之前将细胞温育24小时。在10nM、1nM和0.1nM下进行实验。
使用DYNABEADS mRNA分离试剂盒的总RNA分离：
使用DYNABEADs(英杰公司，目录号61012)在BioTek-EL406平台上使用自动化方案分离RNA。简而言之，将70μl的裂解/结合缓冲液和10μl的含有3μl磁珠的裂解缓冲液添加到具有细胞的板中。在室温下将板在电磁振荡器上温育10分钟，并且然后捕获磁珠并去除上清液。然后用150μl洗涤缓冲液A洗涤珠结合RNA 2次，并且用洗涤缓冲液B洗涤一次。然后用150μl洗脱缓冲液洗涤珠，重新捕获并去除上清液。
使用ABI高容量cDNA逆转录试剂盒(加利福尼亚州福斯特市的应用生物系统公司 (Applied Biosystems，Foster City，CA)，目录号4368813)进行cDNA合成：
向上述分离的RNA中添加十μl主混合物，所述主混合物每次反应含有1μl 10X缓冲液、0.4μl 25X dNTP、1μl 10x随机引物、0.5μl逆转录酶、0.5μl RNase抑制剂和6.6μl H2O。将板密封、混合，并且在电磁振荡器上在室温下温育10分钟，然后在37℃下2小时。
实时PCR：
将两μl cDNA和5μl Lightcycler 480探针主混合物(罗氏公司，目录号04887301001)添加到384孔板中的每孔0.5μl人GAPDH TaqMan探针(4326317E)和0.5μlMYOC人探针中(罗氏公司，目录号04887301001)。实时PCR是在LightCycler480实时PCR系统(罗氏公司)中进行的。每个双链体测试至少两次，并且将数据相对于用非靶向对照siRNA转染的细胞归一化。为了计算相对折叠变化，使用ΔΔCt方法分析实时数据，并且将其相对于使用非靶向对照siRNA转染的细胞进行的测定归一化。
结果
使用示例性人MYOC siRNA在人小梁网细胞(HTMC)中进行的多剂量筛选的结果在表3中示出(对应于表2A中的siRNA)。在10nM、1nM和0.1nM最终双链体浓度下进行多剂量实验，并且数据表示为相对于非靶向对照的剩余消息百分比。
在下表3中评估的示例性siRNA双链体中，当以10nM浓度施用时，174在HTMC细胞中实现了≥90％的MYOC的敲低，347实现了≥70％的MYOC的敲低，392实现了≥50％的MYOC的敲低，424实现了≥20％的MYOC的敲低，并且433实现了≥10％的MYOC的敲低。
在下表3中评估的示例性siRNA双链体中，当以1nM浓度施用时，142在HTMC细胞中实现了≥90％的MYOC的敲低，341实现了≥70％的MYOC的敲低，391实现了≥50％的MYOC的敲低，424实现了≥20％的MYOC的敲低，并且431实现了≥10％的MYOC的敲低。
在下表3中评估的示例性siRNA双链体中，当以0.1nM浓度施用时，57在HTMC细胞中实现了≥90％的MYOC的敲低，277实现了≥70％的MYOC的敲低，361实现了≥50％的MYOC的敲低，416实现了≥20％的MYOC的敲低，并且425实现了≥10％的MYOC的敲低。
在下表3中评估的示例性siRNA双链体中，AD-1565448.1、AD-1193175.5、AD-1565798.1、AD-1565452.1、AD-1565453.1、AD-1565454.1、AD-1565456.1、AD-1565492.1、AD-1565493.1、AD-1565503.1、AD-1073418.5、AD-1565804.1、AD-1565806.1、AD-1244366.3、AD-1565589.1、AD-1565837.1、AD-1565624.1、AD-1565626.1在HTMC细胞中显示出对MYOC的优越敲低。
表3.用一组示例性人MYOC siRNA进行MYOC内源性体外多剂量筛选(*双链体名称中的小数点后的数字仅指批量生产编号)
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实例3.人MYOC siRNA在小鼠青光眼模型中的验证
为了在体内测试人MYOC siRNA，使用青光眼小鼠模型：协同激活介体(SAM)小鼠，所述小鼠包括包含Y437H突变的人源化MYOC基因座(SAM-MYOC小鼠)。在这些小鼠中，靶向MYOC启动子的SAM引导RNA(SAM gRNA)可以用于增加包括Y437H突变的人源化MYOC的表达，引起增加的眼压(IOP)。SAM-MYOC小鼠是通过将包括基因组整合的dCas9协同激活介体(SAM)系统组分(dCas9-VP64和MCP-p65-HSF1)作为一种由内源性Rosa26启动子驱动的转录物的小鼠(在US2019/0284572和WO 2019/183123中进行了描述，所述文献中的每一个通过引用并入本文)与包括人源化MYOC基因座的小鼠杂交产生的，所述基因座包括Y437H突变。在这些小鼠中，从起始密码子到终止密码子的小鼠Myoc序列被对应的人MYOC序列取代。插入的人MYOC序列包括Y437H突变，所述突变与升高的IOP和青光眼的发展相关。注射AAV2.Y3F或编码靶向MYOC启动子的SAM引导RNA的慢病毒引起角膜缘环(小梁网(TM)、虹膜和睫状体(CB))中的人源化MYOC Y437H表达增加，并且这与增加的IOP相关，验证了SAM-MYOC小鼠是增加的IOP的合适的MYOC疾病模型(数据未示出)。
测试靶向人MYOC的siRNA，以确定其在用SAM gRNA处理后是否能够降低在包括包含Y437H突变的人源化MYOC基因座的SAM小鼠(SAM-MYOC小鼠)中观察到的高眼压(IOP)。实验设置在图1A中示出。在第0天通过前房内(IC)注射施用SAM gRNA，并且测量基线IOP。然后在接下来的五周内测量IOP。在第五周，通过玻璃体内(IVT)注射施用MYOC siRNA AD-822899(1μL，15μg剂量)，并且在随后几周的各个时间点测量IOP。有三个处理组：(1)原初对照小鼠；(2)用人MYOC siRNA处理的SAM-gRNA处理的小鼠；以及(3)用荧光素酶siRNA处理的SAM-gRNA处理的小鼠。如图1B所示，在用SAM gRNA处理的SAM-MYOC小鼠中，人MYOC siRNA降低了IOP，在siRNA注射后D7开始逆转IOP并将其恢复到基线水平，而荧光素酶siRNA对IOP没有影响。
然后以较低剂量测试靶向人MYOC的若干种另外的siRNA，以确定其是否可以降低用慢病毒SAM gRNA处理后在SAM-MYOC小鼠中观察到的IOP。小鼠双侧注射SAM gRNA和siRNA。实验设置在图2A中示出。在第0天通过前房内(IC)注射施用SAM gRNA，并且测量基线IOP。然后在接下来的五周内测量IOP。在第五周，通过玻璃体内(IVT)注射施用MYOC siRNAAD-822899、AD-1565804、AD-1565837、AD-1193175或AD-1565503(1μL，7.5μg剂量)，并且在随后几周的各个时间点测量IOP。通过qPCR检测角膜缘环中的mRNA敲低，并且进行分析。对照组包含原初对照小鼠、PBS处理的小鼠和LV-SAM gRNA处理的小鼠。如图2B所示，在用SAM gRNA处理的SAM-MYOC小鼠中，每种人MYOC siRNA降低了IOP，在siRNA注射后很快开始逆转IOP并将其恢复到基线水平。如图2C所示，如通过qPCR在来自角膜缘环样品中所测量的，相对于LV-SAM-gRNA组，每种人MYOC siRNA降低了人MYOC mRNA表达。分析证实，siRNA介导了SAM-MYOC小鼠体内的人MYOC mRNA的敲低(图2D)。
然后以甚至更低的剂量测试靶向人MYOC siRNA AD-1565804或AD-1565837，以确定其是否可以降低用慢病毒SAM-g4处理后在SAM-MYOC小鼠中观察到的IOP。小鼠双侧注射SAM gRNA和siRNA。实验设置在图3A中示出。在第0天通过前房内(IC)注射施用SAM-g4，并且测量基线IOP。然后在接下来的五周内测量IOP。在第五周，通过玻璃体内(IVT)注射施用MYOC siRNAAD-1565804或AD-1565837(1μL，3.75μg剂量或1.87μg剂量)，并且在随后几周的各个时间点测量IOP。通过qPCR检测角膜缘环中的mRNA敲低，并且进行分析。对照组包含原初对照小鼠、PBS处理的小鼠和LV-SAM-gRNA处理的小鼠。如图3B所示，在所测试的每个剂量下用SAM gRNA处理的SAM-MYOC小鼠中，每种人MYOC siRNA降低了IOP，在siRNA注射后很快开始逆转IOP并将其恢复到基线水平。如图3C所示，如通过qPCR在来自角膜缘环样品中所测量的，相对于LV-SAM-gRNA组，在所测试的每个剂量下每种人MYOC siRNA降低了人MYOC mRNA表达。
实例4.人MYOC siRNA在非人灵长类动物(NHP)青光眼模型中的验证
测试靶向MYOC的siRNA，以确定其是否可以降低在非人灵长类动物(NHP)青光眼模型中观察到的高眼压(IOP)。研究设计在表4中示出。动物接受PBS对照或各种剂量的双链体AD-1565837或双链体AD-1565804。
在研究前第3天、第8天、第15天、第29天和第57天测量OE和眼压(IOP)，并且在第12周期间测量一次。在研究前、研究中期(第6周)和终止时(第12周)进行视网膜电描记术(ERG)。在给药前、第4周、第8周和终止时收集房水(AH)。在终止时，从右眼收集以下眼睛样品：AH、玻璃体(VH)、角膜、虹膜、小梁网(TM)、睫状体(CB)、巩膜(不含TM的角膜缘环)、视网膜以及眼睛后部的所有剩余组织。在给药前和终止时收集血液两次。对血液样品进行血液学、凝血和临床化学研究。
在终止时收集组织进行组织病理学检查，包含右眼、视神经、眼外和眼周组织：脑，右侧(脑半球)；食道，近端；胃，食管胃交界处；眼睑，上部有眼睑结膜，右侧；眼睑，下部有眼睑结膜，右侧；心脏，心尖；空肠；肾脏，右侧皮质；肝脏，右中叶；泪腺(Lacrimal Gl)，右侧；颈深部，淋巴结，右侧；下颌，淋巴结，右侧；坐骨神经，右侧；肌肉，股直肌；肌肉，膈膜；肌肉，眼外(外直肌和内直肌，右侧)；卵巢，右侧；下颌唾液腺，右侧；脊髓，颈部；脊髓，胸部；脊髓、腰部；甲状腺，右侧；舌；扁桃体，右侧；气管；以及子宫。
表4：NHP DC选择研究设计
*使用最高剂量处理的动物：双眼将接受组织病理学检查。
在第85天分析TM中的MYOC蛋白敲低。敲低结果在图4中示出。使用AD-1565837双链体观察到TM中MYOC蛋白减少约50％，而使用AD-1565804双链体观察到最低程度的敲低。在第-35天、第22天、第50天和第85天(终止时收集)分析房水中的MYOC蛋白。如图5所描绘的，在第50天观察到约50％的MYOC蛋白敲低，但在第85天没有。在第85天(终止时收集)分析玻璃体、虹膜、睫状体和巩膜中的MYOC蛋白敲低。玻璃体和睫状体的结果在图6A中示出，并且虹膜和巩膜的结果在图6B中。在第85天，在MYOC mRNA中未观察到任何评估的双链体的敲低(图7)。

Claims (41)

1.一种用于抑制肌纤蛋白(MYOC)的表达的双链核糖核酸(dsRNA)药剂，其中所述dsRNA药剂包括形成双链区的有义链和反义链，其中所述反义链包括核苷酸序列，所述核苷酸序列包括与表2A和2B中的任一个中所列出的反义序列中的一个反义序列具有0个、1个、2个或3个错配的至少15个连续核苷酸，并且其中所述有义链包括核苷酸序列，所述核苷酸序列包括与表2A和2B中的任一个中所列出的与所述反义序列相对应的有义序列具有0个、1个、2个或3个错配的至少15个连续核苷酸。
2.根据权利要求1所述的dsRNA药剂，其中所述反义链包括核苷酸序列，所述核苷酸序列包括与双链体AD-1565804的反义链核苷酸序列具有0个、1个、2个或3个错配的至少15个连续核苷酸，并且所述有义链包括核苷酸序列，所述核苷酸序列包括与双链体AD-1565804的有义链核苷酸序列具有0个、1个、2个或3个错配的至少15个连续核苷酸。
3.根据权利要求1所述的dsRNA药剂，其中所述反义链包括核苷酸序列，所述核苷酸序列包括与双链体AD-1565837的反义链核苷酸序列具有0个、1个、2个或3个错配的至少15个连续核苷酸，并且所述有义链包括核苷酸序列，所述核苷酸序列包括与双链体AD-1565837的有义链核苷酸序列具有0个、1个、2个或3个错配的至少15个连续核苷酸。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的dsRNA药剂，其中所述有义链和所述反义链中的至少一个与一个或多个亲脂性部分缀合。
5.根据权利要求4所述的dsRNA药剂，其中所述亲脂性部分通过接头或载剂缀合。
6.根据权利要求4或5所述的dsRNA药剂，其中一个或多个亲脂性部分与至少一条链上的一个或多个内部位置缀合。
7.根据权利要求1至3中任一项所述的dsRNA药剂，其中所述有义链和所述反义链中的至少一个与精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)-肽或RGD肽模拟物中的一种或多种缀合。
8.根据权利要求4至6中任一项所述的dsRNA药剂，其中所述亲脂性部分是脂肪族、脂环族或聚脂环族化合物。
9.根据权利要求8所述的dsRNA药剂，其中所述亲脂性部分含有饱和或不饱和C16烃链。
10.根据权利要求4至6中任一项所述的dsRNA药剂，其中所述亲脂性部分通过置换所述内部位置或所述双链区中的一个或多个核苷酸的载剂缀合。
11.根据权利要求4至6中任一项所述的dsRNA药剂，其中所述亲脂性部分通过含有醚、硫醚、脲、碳酸酯、胺、酰胺、马来酰亚胺-硫醚、二硫化物、磷酸二酯、磺酰胺键、点击反应的产物或氨基甲酸酯的接头与双链iRNA药剂缀合。
12.根据权利要求4至6中任一项所述的双链iRNA药剂，其中所述亲脂性部分与核碱基、糖部分或核苷间键缀合。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的dsRNA药剂，其中所述dsRNA药剂包括至少一个经修饰的核苷酸。
14.根据权利要求13所述的dsRNA药剂，其中有义链核苷酸中的不超过五个有义链核苷酸和所述反义链的所述核苷酸中的不超过五个核苷酸是未经修饰的核苷酸。
15.根据权利要求13所述的dsRNA药剂，其中所述有义链的所有核苷酸和所述反义链的所有核苷酸都包括修饰。
16.根据权利要求13至15中任一项所述的dsRNA药剂，其中所述经修饰的核苷酸中的至少一个经修饰的核苷酸选自由以下组成的组：脱氧核苷酸、3'末端脱氧胸腺嘧啶(dT)核苷酸、2'-O-甲基修饰的核苷酸、2'-氟修饰的核苷酸、2'-脱氧修饰的核苷酸、锁定核苷酸、解锁核苷酸、构象限制性核苷酸、约束乙基核苷酸、无碱基核苷酸、2'-氨基修饰的核苷酸、2'-O-烯丙基修饰的核苷酸、2'-C-烷基修饰的核苷酸、2'-甲氧基乙基修饰的核苷酸、2'-O-烷基修饰的核苷酸、吗啉代核苷酸、氨基磷酸酯、包括核苷酸的非天然碱基、四氢吡喃修饰的核苷酸、1,5-脱水己糖醇修饰的核苷酸、环己烯基修饰的核苷酸、包括硫代磷酸酯基的核苷酸、包括甲基膦酸酯基的核苷酸、包括5'-磷酸酯的核苷酸、包括5'-磷酸酯模拟物的核苷酸、乙二醇修饰的核苷酸和2-O-(N-甲基乙酰胺)修饰的核苷酸；以及其组合。
17.根据权利要求1至16中任一项的任一项所述的dsRNA药剂，其中至少一条链包括至少2个核苷酸的3'突出端。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的dsRNA药剂，其中所述双链区的长度为15个至30个核苷酸对。
19.根据权利要求18所述的dsRNA药剂，其中所述双链区的长度为17个至23个核苷酸对。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的dsRNA药剂，其中每条链具有19个至30个核苷酸。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的dsRNA药剂，其中所述药剂包括至少一个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键。
22.根据权利要求4至21中任一项所述的dsRNA药剂，其进一步包括靶向配体，例如，靶向眼组织的配体。
23.根据权利要求22所述的dsRNA药剂，其中所述眼组织是小梁网组织、睫状体、视网膜组织、视网膜色素上皮(RPE)或脉络膜组织，例如，脉络膜血管。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的dsRNA药剂，其进一步包括在所述反义链的5'端处的磷酸酯或磷酸酯模拟物。
25.根据权利要求24所述的dsRNA药剂，其中所述磷酸酯模拟物是5'-乙烯基膦酸酯(VP)。
26.根据权利要求1至25中任一项所述的dsRNA药剂，其中所述dsRNA药剂靶向编码MYOC的mRNA的热点区。
27.一种靶向肌纤蛋白(MYOC)mRNA的热点区的dsRNA药剂。
28.一种细胞，其含有根据权利要求1至27中任一项所述的dsRNA药剂。
29.一种用于抑制MYOC的表达的药物组合物，所述药物组合物包括根据权利要求1至27中任一项所述的dsRNA药剂。
30.一种抑制细胞中的MYOC的表达的方法，所述方法包括：
(a)使所述细胞与根据权利要求1至27中任一项所述的dsRNA药剂或根据权利要求29所述的药物组合物接触；以及
(b)将在步骤(a)中产生的细胞维持足以降低MYOC mRNA、MYOC蛋白或MYOC mRNA和蛋白两者的水平的时间，由此抑制MYOC在所述细胞中的表达。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述细胞在受试者体内。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述受试者是人。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述受试者已被诊断患有MYOC相关病症，例如，青光眼(例如，原发性开角型青光眼(POAG)、闭角型青光眼、先天性青光眼和继发性青光眼)。
34.一种治疗被诊断患有MYOC相关病症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1至27中任一项所述的dsRNA药剂或根据权利要求29所述的药物组合物，由此治疗所述病症。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述MYOC相关病症是青光眼。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述青光眼是原发性开角型青光眼(POAG)。
37.根据权利要求34至36中任一项所述的方法，其中治疗包括改善所述病症的至少一种体征或症状。
38.根据权利要求34至37中任一项所述的方法，其中所述治疗包括：(a)抑制或降低MYOC的表达或活性；(b)降低错误折叠的MYOC蛋白的水平；(c)减少小梁网细胞死亡；(d)降低眼压；或(e)增加视敏度。
39.根据权利要求31至38中任一项所述的方法，其中所述dsRNA药剂眼内、静脉内或局部施用于所述受试者。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述眼内施用包括玻璃体内施用(例如，玻璃体内注射)、经巩膜施用(例如，经巩膜注射)、结膜下施用(例如，结膜下注射)、眼球后施用(例如，眼球后注射)、前房内施用(例如、前房内注射)或视网膜下施用(例如，视网膜下注射)。
41.根据权利要求31至40中任一项所述的方法，其进一步包括向所述受试者施用适于治疗或预防MYOC相关病症的另外的药剂或疗法(例如，激光小梁成形术外科手术、小梁切除术外科手术、微创青光眼外科手术、在眼睛中放置引流管、口服药物或滴眼液)。
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