TW202317148A - 用於靜默myoc表現之組合物及方法 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於靶向MYOC之雙股核糖核酸(dsRNA)組合物，及使用此類dsRNA組合物改變(例如抑制) MYOC表現之方法。

Description

用於靜默MYOC表現之組合物及方法
本發明係關於對MYOC表現之特異性抑制。
青光眼(例如原發性開角型青光眼(POAG))為現今老齡人口中之不可逆視覺喪失的主要原因。MYOC蛋白質錯誤摺疊閉塞其自小梁網狀細胞之分泌，導致眼內壓升高，其繼而壓縮且損害視神經，降低其將視覺資訊傳輸至大腦之能力，由此導致視覺喪失。需要青光眼之新穎療法。
本發明描述用於調節MYOC表現之方法及iRNA組合物。在某些實施例中，使用MYOC特異性iRNA來降低或抑制MYOC表現。此類抑制可適用於治療與MYOC表現相關之病症，諸如眼部病症(例如青光眼，例如原發性開角型青光眼(POAG))。
因此，本文描述諸如在細胞或個體(例如哺乳動物，諸如人類個體)中實現RNA誘導靜默複合物(RISC)介導之MYOC之RNA轉錄本裂解的組合物及方法。亦描述用於治療與MYOC表現相關之病症(諸如青光眼(例如原發性開角型青光眼(POAG))的組合物及方法。
本文提供之組合物中所包括之iRNA (例如dsRNA)包括RNA股(反義股)，該股具有與MYOC (例如人類MYOC)之mRNA轉錄本之至少一部分實質上互補的區域，例如長度為30個核苷酸或更少、一般19-24個核苷酸的區域(本文中亦稱為「MYOC特異性iRNA」)。在一些實施例中，MYOC mRNA轉錄本為人類MYOC mRNA轉錄本，例如本文中之SEQ ID NO: 1。
在實施例中，本文所述之iRNA (例如dsRNA)包含具有與人類MYOC mRNA之區域實質上互補之區域的反義股。在一些實施例中，人類MYOC mRNA具有序列NM_000261.2 (SEQ ID NO: 1)。NM_000261.2序列亦以全文引用之方式併入本文中。SEQ ID NO: 1之反向互補序列在本文中作為SEQ ID NO: 2提供。
在一些態樣中，本發明提供用於抑制肌纖蛋白(MYOC)之表現的雙股核糖核酸(dsRNA)藥劑，其中dsRNA藥劑包含形成雙股區之有義股及反義股，其中有義股包含核苷酸序列，其包含人類MYOC之編碼股之一部分之至少15個連續核苷酸，具有0、1、2或3個錯配，且反義股包含核苷酸序列，其包含人類MYOC之非編碼股之對應部分之至少15個連續核苷酸，具有0、1、2或3個錯配，使得有義股與反義股中之至少15個連續核苷酸互補。
在一些態樣中，本發明提供用於抑制MYOC之表現的雙股核糖核酸(dsRNA)藥劑，其中dsRNA藥劑包含形成雙股區之有義股及反義股，其中反義股包含核苷酸序列，其包含SEQ ID NO: 2之核苷酸序列之一部分的至少15個連續核苷酸，具有0、1、2或3個錯配，使得有義股與反義股中之至少15個連續核苷酸互補。
在一些態樣中，本發明提供一種用於抑制MYOC表現的雙股核糖核酸(dsRNA)藥劑，其中該dsRNA藥劑包含形成雙股區的有義股及反義股，其中該反義股包含含有雙螺旋體AD-1565804之反義股核苷酸序列之至少15個連續核苷酸、具有0、1、2或3個錯配的核苷酸序列，且該有義股包含含有雙螺旋體AD-1565804之有義股核苷酸序列之至少15個連續核苷酸、具有0、1、2或3個錯配的核苷酸序列。
在一些態樣中，本發明提供一種用於抑制MYOC表現的雙股核糖核酸(dsRNA)藥劑，其中該dsRNA藥劑包含形成雙股區的有義股及反義股，其中該反義股包含含有雙螺旋體AD-1565837之反義股核苷酸序列之至少15個連續核苷酸、具有0、1、2或3個錯配的核苷酸序列，且該有義股包含含有雙螺旋體AD-1565837之有義股核苷酸序列之至少15個連續核苷酸、具有0、1、2或3個錯配的核苷酸序列。
在一些態樣中，本發明提供一種人類細胞或組織，其包含與其他類似未處理細胞或組織相比降低之MYOC mRNA含量或MYOC蛋白質含量，其中視情況，該細胞或組織未經基因工程改造(例如其中該細胞或組織包含一或多個天然產生之突變，例如MYOC突變)，其中視情況，含量減少至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%。在一些實施例中，人類細胞或組織為小梁網狀組織、睫狀體、視網膜色素上皮(RPE)、視網膜組織、星形膠質細胞、外被細胞、繆氏細胞(Müller cell)、神經節細胞、內皮細胞、感光細胞、視網膜血管(例如包括內皮細胞及血管平滑肌細胞)或脈絡膜組織，例如脈絡膜血管。
在一些態樣中，本發明亦提供含有本文所述之dsRNA藥劑的細胞。
在另一態樣中，本文提供一種人類眼細胞，例如(小梁網狀結構之細胞、睫狀體之細胞、RPE細胞、視網膜細胞、星形膠質細胞、外被細胞、繆氏細胞、神經節細胞、內皮細胞或感光細胞)，其包含與其他類似的未處理細胞相比降低的MYOC mRNA含量或MYOC蛋白質含量。在一些實施例中，該含量減少至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%。
在一些態樣中，本發明亦提供用於抑制編碼MYOC之基因表現的醫藥組合物，其包含本文所述之dsRNA藥劑。
在一些態樣中，本發明亦提供一種抑制細胞中之MYOC表現的方法，該方法包含： (a)使細胞與本文所述之dsRNA藥劑或本文所述之醫藥組合物接觸；及 (b)將步驟(a)中產生之細胞維持足以獲得MYOC之mRNA轉錄本降解的時間，藉此抑制細胞中之MYOC表現。
在一些態樣中，本發明亦提供一種抑制細胞中之MYOC表現的方法，該方法包含： (a)使細胞與本文所述之dsRNA藥劑或本文所述之醫藥組合物接觸；及 (b)將步驟(a)中產生之細胞維持足以減少MYOC mRNA、MYOC蛋白質、或MYOC mRNA與蛋白質二者之含量的時間，藉此抑制細胞中之MYOC表現。
在一些態樣中，本發明亦提供一種抑制MYOC於眼細胞或組織中之表現的方法，該方法包含： (a)使該細胞或組織與結合MYOC之dsRNA藥劑接觸；及 (b)將步驟(a)中產生之細胞或組織維持足以減少MYOC mRNA、MYOC蛋白質或MYOC mRNA與蛋白質之含量的時間，藉此抑制MYOC於該細胞或組織中之表現。
在一些態樣中，本發明亦提供一種治療診斷患有MYOC相關病症之個體的方法，其包含向該個體投與治療有效量之本文所述之dsRNA藥劑或本文所述之醫藥組合物，藉此治療該病症。
在本文之任一態樣中，例如以上組合物及方法中，可應用本文中(例如下文)之任一實施例。
在一些實施例中，人類MYOC之編碼股具有SEQ ID NO: 1之序列。在一些實施例中，人類MYOC之非編碼股具有SEQ ID NO: 2之序列。
在一些實施例中，有義股包含含有至少15個連續核苷酸的核苷酸序列，該核苷酸序列相對於核苷酸序列SEQ ID NO: 1之相應部分具有0或1、2或3個錯配。
在一些實施例中，dsRNA藥劑包含有義股及反義股，其中該反義股包含含有核苷酸序列SEQ ID NO: 2之一部分之至少17個連續核苷酸、具有0、1、2或3個錯配的核苷酸序列，使得該有義股與該反義股中的至少17個連續核苷酸互補。在一些實施例中，該有義股包含含有核苷酸序列SEQ ID NO: 1之相應部分之至少17個連續核苷酸、具有0或1、2或3個錯配的核苷酸序列。
在一些實施例中，dsRNA藥劑包含有義股及反義股，其中反義股包含核苷酸序列，其包含SEQ ID NO: 2之核苷酸序列之一部分的至少19個連續核苷酸，具有0、1、2或3個錯配，使得有義股與反義股中之至少19個連續核苷酸互補。在一些實施例中，有義股包含核苷酸序列，其包含SEQ ID NO: 1之核苷酸序列之對應部分的至少19個連續核苷酸，具有0或1、2或3個錯配。
在一些實施例中，dsRNA藥劑包含有義股及反義股，其中反義股包含核苷酸序列，其包含SEQ ID NO: 2之核苷酸序列之一部分的至少21個連續核苷酸，具有0、1、2或3個錯配，使得有義股與反義股中之至少21個連續核苷酸互補。在一些實施例中，有義股包含含有核苷酸序列SEQ ID NO: 1之相應部分之至少21個連續核苷酸、具有0或1、2或3個錯配的核苷酸序列。
在一些實施例中，有義股之部分為表2A及2B中之任一者中的有義股內之部分。
在一些實施例中，反義股之部分為表2A及2B中之任一者中的反義股內之部分。
在一些實施例中，反義股包含含有2A及2B中之任一者中所列之反義序列之一之至少15個連續核苷酸、具有0、1、2或3個錯配的核苷酸序列。在一些實施例中，有義股包含含有表2A及2B中之任一者中所列之與反義序列對應之有義序列之至少15個連續核苷酸、具有0、1、2或3個錯配的核苷酸序列。
在一些實施例中，反義股包含含有表2A及2B中之任一者中所列之反義序列之一之至少17個連續核苷酸、具有0、1、2或3個錯配的核苷酸序列。在一些實施例中，有義股包含含有表2A及2B中之任一者中所列之與反義序列對應之有義序列之至少17個連續核苷酸、具有0、1、2或3個錯配的核苷酸序列。
在一些實施例中，反義股包含含有表2A及2B中之任一者中所列之反義序列之一之至少19個連續核苷酸、具有0、1、2或3個錯配的核苷酸序列。在一些實施例中，有義股包含含有表2A及2B中之任一者中所列之與反義序列對應之有義序列之至少19個連續核苷酸、具有0、1、2或3個錯配的核苷酸序列。
在一些實施例中，反義股包含含有2A及2B中之任一者中所列之反義序列之一之至少21個連續核苷酸、具有0、1、2或3個錯配的核苷酸序列。在一些實施例中，有義股包含含有表2A及2B中之任一者中所列之與反義序列對應之有義序列之至少21個連續核苷酸、具有0、1、2或3個錯配的核苷酸序列。
在一些實施例中，dsRNA藥劑之有義股長度為至少23個核苷酸，例如長度為23-30個核苷酸。
在一些實施例中，有義股及反義股中之至少一者結合至一或多個親脂性部分。在一些實施例中，親脂性部分結合至dsRNA藥劑之雙股區中之一或多個位置。在一些實施例中，親脂性部分經由連接子或載劑結合。在一些實施例中，藉由logK ow量測之親脂性部分之親脂性超過0。
在一些實施例中，根據雙股RNAi藥劑在血漿蛋白結合分析中之未結合分率所量測的雙股RNAi藥劑疏水性超過0.2。在一些實施例中，血漿蛋白結合分析為使用人類血清白蛋白進行的電泳遷移率變化分析。
在一些實施例中，dsRNA藥劑包含至少一個經修飾之核苷酸。在一些實施例中，不超過五個有義股核苷酸及不超過五個反義股核苷酸為未經修飾之核苷酸。在一些實施例中，有義股之所有核苷酸及該反義股之所有核苷酸均包含修飾。
在一些實施例中，經修飾之核苷酸中之至少一者選自由以下組成之群：去氧核苷酸、3'端去氧胸腺嘧啶(dT)核苷酸、經2'-O-甲基修飾之核苷酸、經2'-氟修飾之核苷酸、經2'-去氧修飾之核苷酸、鎖定核苷酸、解鎖核苷酸、構形受限核苷酸、受限制乙基核苷酸、無鹼基核苷酸、經2'-胺基修飾之核苷酸、經2'-O-烯丙基修飾之核苷酸、經2'-C-烷基修飾之核苷酸、經2'-甲氧基乙基修飾之核苷酸、經2'-O-烷基修飾之核苷酸、(N-𠰌啉基)核苷酸、胺基磷酸酯、包含非天然鹼基之核苷酸、經四氫哌喃修飾之核苷酸、經1,5-無水己糖醇修飾之核苷酸、經環己烯基修飾之核苷酸、包含硫代磷酸酯基之核苷酸、包含甲基膦酸酯基之核苷酸、包含5'-磷酸酯之核苷酸、包含5'-磷酸酯模擬物之核苷酸、經二醇修飾之核苷酸及經2'-O-(N-甲基乙醯胺)修飾之核苷酸；以及其組合。在一些實施例中，不超過五個有義股核苷酸及不超過五個反義股核苷酸包括除以下者以外之修飾：經2'-O-甲基修飾之核苷酸、經2'-氟修飾之核苷酸、經2'-去氧修飾之核苷酸、解鎖核酸(UNA)或甘油核酸(GNA)。
在一些實施例中，dsRNA包含有義股之兩個連續核苷酸之間或反義股之兩個連續核苷酸之間的非核苷酸間隔子(其中視情況，非核苷酸間隔子包含C3-C6烷基)。
在一些實施例中，各股之長度不超過30個核苷酸。在一些實施例中，至少一個股包含至少1個核苷酸的3'突出物。在一些實施例中，至少一個股包含具有至少2個核苷酸的3'突出物。在一些實施例中，至少一股包含2個核苷酸之3'突出物。
在一些實施例中，雙股區之長度為15-30個核苷酸對。在一些實施例中，雙股區之長度為17-23個核苷酸對。在一些實施例中，雙股區之長度為17-25個核苷酸對。在一些實施例中，雙股區之長度為23-27個核苷酸對。在一些實施例中，雙股區之長度為19-21個核苷酸對。在一些實施例中，雙股區之長度為21-23個核苷酸對。在一些實施例中，各股具有19-30個核苷酸。在一些實施例中，各股具有19-23個核苷酸。在一些實施例中，各股具有21-23個核苷酸。
在一些實施例中，藥劑包含至少一個硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鍵。在一些實施例中，硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鍵在一股之3'端處。在一些實施例中，該股為反義股。在一些實施例中，該股為有義股。
在一些實施例中，硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯位於一個股之5'端處。在一些實施例中，該股為反義股。在一些實施例中，該股為有義股。
在一些實施例中，一股之5'及3'端中之每一者包含硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，該股為反義股。
在一些實施例中，雙螺旋之反義股之5'端之1位置處的鹼基對為AU鹼基對。
在一些實施例中，有義股具有總共21個核苷酸且反義股具有總共23個核苷酸。
在一些實施例中，一或多個親脂性部分與至少一個股上之一或多個內部位置結合。在一些實施例中，一或多個親脂性部分經由連接子或載劑與至少一個股上之一或多個內部位置結合。
在一些實施例中，內部位置包括除了至少一股之各端之兩個末端位置以外的所有位置。在一些實施例中，內部位置包括除了至少一股之各端之三個末端位置以外的所有位置。在一些實施例中，內部位置不包括有義股之裂解位點區。在一些實施例中，內部位置包括除了自有義股之5'端計數的位置9-12以外的所有位置。在一些實施例中，內部位置包括除了自有義股之3'端計數的位置11-13以外的所有位置。在一些實施例中，內部位置不包括反義股之裂解位點區。在一些實施例中，內部位置包括除了自反義股之5'端計數的位置12-14以外的所有位置。在一些實施例中，內部位置包括除了自3'端計數的有義股上之位置11-13及自5'端計數的反義股上之位置12-14以外的所有位置。
在一些實施例中，一或多個親脂性部分結合至選自由以下組成之群的內部位置中之一或多者：自各股之5'端計數的有義股上之位置4-8及13-18，及反義股上之位置6-10及15-18。在一些實施例中，一或多個親脂性部分與選自由以下組成之群的一或多個內部位置結合：自各股之5'端計數的有義股上之位置5、6、7、15及17，及反義股上之位置15及17。
在一些實施例中，雙股區中之位置不包括有義股之裂解位點區。
在一些實施例中，有義股之長度為21個核苷酸，反義股之長度為23個核苷酸，且親脂性部分結合至有義股之位置21、位置20、位置15、位置1、位置7、位置6或位置2或反義股之位置16。在一些實施例中，親脂性部分結合至有義股之位置21、位置20、位置15、位置1或位置7。在一些實施例中，親脂性部分結合至有義股之位置21、位置20或位置15。在一些實施例中，親脂性部分結合至有義股之位置20或位置15。在一些實施例中，親脂性部分結合至反義股之位置16。在一些實施例中，親脂性部分結合至自有義股之5'端計數的位置6。
在一些實施例中，親脂性部分為脂族、脂環或聚脂環化合物。在一些實施例中，親脂性部分選自由以下組成之群：脂質、膽固醇、視黃酸、膽酸、金剛烷乙酸、1-芘丁酸、二氫睪固酮、1,3-雙-O(十六烷基)甘油、香葉氧基己醇、十六烷基甘油、冰片、薄荷腦、1,3-丙二醇、十七烷基、棕櫚酸、肉豆蔻酸、O3-(油醯基)石膽酸、O3-(油醯基)膽烯酸、二甲氧基三苯甲基或啡㗁𠯤。在一些實施例中，親脂性部分含有飽和或不飽和C4-C30烴鏈，及選自由以下組成之群的視情況存在之官能基：羥基、胺、羧酸、磺酸酯、磷酸酯、硫醇、疊氮基及炔。在一些實施例中，親脂性部分含有飽和或不飽和C6-C18烴鏈。在一些實施例中，親脂性部分含有飽和或不飽和C16烴鏈。
在一些實施例中，親脂性部分經由置換內部位置或雙股區中之一或多個核苷酸的載體結合。在一些實施例中，載體為選自由以下組成之群的環狀基團：吡咯啶基、吡唑啉基、吡唑啶基、咪唑啉基、咪唑啶基、哌啶基、哌𠯤基、[1,3]二氧雜環戊烷基、㗁唑啶基、異㗁唑啶基、𠰌啉基、噻唑啶基、異噻唑啶基、喹喏啉基、嗒𠯤酮基、四氫呋喃基及十氫萘基；或為基於絲胺醇主鏈或二乙醇胺主鏈之非環狀部分。
在一些實施例中，親脂性部分經由連接子與雙股iRNA藥劑結合，該連接子含有醚、硫醚、脲、碳酸酯、胺、醯胺、順丁烯二醯亞胺-硫醚、二硫鍵、磷酸二酯、磺醯胺鍵、點擊反應之產物或胺基甲酸酯。
在一些實施例中，親脂性部分與核鹼基、糖部分或核苷間鍵聯結合。
在一些實施例中，親脂性部分經由選自由以下組成之群的生物可裂解連接子結合：DNA、RNA、二硫鍵、醯胺；半乳胺糖、葡糖胺、葡萄糖、半乳糖、甘露糖之官能化單醣或寡醣及其組合。
在一些實施例中，有義股之3'端經由端帽受保護，該端帽為具有胺之環狀基團，該環狀基團選自由以下組成之群：吡咯啶基、吡唑啉基、吡唑啶基、咪唑啉基、咪唑啶基、哌啶基、哌𠯤基、[1,3]二氧雜環戊烷基、㗁唑啶基、異㗁唑啶基、𠰌啉基、噻唑啶基、異噻唑啶基、喹喏啉基、嗒𠯤酮基、四氫呋喃基及十氫萘基。
在一些實施例中，dsRNA藥劑進一步包含靶向配位體，例如靶向眼組織或肝組織之配位體。在一些實施例中，眼組織為小梁網狀組織、睫狀體、視網膜組織、視網膜色素上皮(RPE)或脈絡膜組織，例如脈絡膜血管。
在一些實施例中，配位體結合至有義股。在一些實施例中，配位體結合至有義股之3'端或5'端。在一些實施例中，配位體結合至有義股之3'端。
在一些實施例中，配位體包含N-乙醯基半乳糖胺(GalNAc)。在一些實施例中，靶向配位體包含一或多個GalNAc結合物或一或多個GalNAc衍生物。在一些實施例中，配位體為一或多個GalNAc結合物或一或多個GalNAc衍生物，經由單價連接子或二價、三價或四價分支連接子連接。在一些實施例中，配位體為
Figure 02_image001
。
在一些實施例中，dsRNA藥劑結合至如以下示意圖中所示之配位體
Figure 02_image003
， 其中X為O或S。在一些實施例中，X為O。
在一些實施例中，dsRNA藥劑進一步包含存在於反義股之3'端的第一核苷酸間鍵聯處、具有呈Sp組態之鍵聯磷原子的末端對掌性修飾；存在於反義股之5'端的第一核苷酸間鍵聯處、具有呈Rp組態之鍵聯磷原子的末端對掌性修飾；及存在於有義股之5'端的第一核苷酸間鍵聯處、具有呈Rp組態或Sp組態之鍵聯磷原子的末端對掌性修飾。
在一些實施例中，dsRNA藥劑進一步包含存在於反義股之3'端的第一及第二核苷酸間鍵聯處、具有呈Sp組態之鍵聯磷原子的末端對掌性修飾；存在於反義股之5'端的第一核苷酸間鍵聯處、具有呈Rp組態之鍵聯磷原子的末端對掌性修飾；及存在於有義股之5'端的第一核苷酸間鍵聯處、具有呈Rp或Sp組態之鍵聯磷原子的末端對掌性修飾。
在一些實施例中，dsRNA藥劑進一步包含存在於反義股之3'端的第一、第二及第三核苷酸間鍵聯處、具有呈Sp組態之鍵聯磷原子的末端對掌性修飾；存在於反義股之5'端的第一核苷酸間鍵聯處、具有呈Rp組態之鍵聯磷原子的末端對掌性修飾；及存在於有義股之5'端的第一核苷酸間鍵聯處、具有呈Rp或Sp組態之鍵聯磷原子的末端對掌性修飾。
在一些實施例中，dsRNA藥劑進一步包含存在於反義股之3'端的第一及第二核苷酸間鍵聯處、具有呈Sp組態之鍵聯磷原子的末端對掌性修飾；存在於反義股之3'端的第三核苷酸間鍵聯處、具有呈Rp組態之鍵聯磷原子的末端對掌性修飾；存在於反義股之5'端的第一核苷酸間鍵聯處、具有呈Rp組態之鍵聯磷原子的末端對掌性修飾；及存在於有義股之5'端的第一核苷酸間鍵聯處、具有呈Rp或Sp組態之鍵聯磷原子的末端對掌性修飾。
在一些實施例中，dsRNA藥劑進一步包含存在於反義股之3'端的第一及第二核苷酸間鍵聯處、具有呈Sp組態之鍵聯磷原子的末端對掌性修飾；存在於反義股之5'端的第一及第二核苷酸間鍵聯處、具有呈Rp組態之鍵聯磷原子的末端對掌性修飾；及存在於有義股之5'端的第一核苷酸間鍵聯處、具有呈Rp或Sp組態之鍵聯磷原子的末端對掌性修飾。
在一些實施例中，dsRNA藥劑進一步包含反義股之5'端處的磷酸酯或磷酸酯模擬物。在一些實施例中，磷酸酯模擬物為5'-膦酸乙烯酯(VP)。
在前述dsRNA藥劑之各種實施例中，dsRNA藥劑靶向編碼MYOC之mRNAd的熱點區域。
在另一態樣中，本發明提供一種靶向肌纖蛋白(MYOC) mRNA之熱點區域的dsRNA藥劑。
在一些實施例中，本文所述之細胞，例如人類細胞由包含使人類細胞與本文所述之dsRNA藥劑接觸的方法產生。
在一些實施例中，本文所述之醫藥組合物包含dsRNA藥劑及脂質調配物。
在一些實施例(例如本文所述之方法之實施例)中，細胞存在於個體內。在一些實施例中，個體為人類。在一些實施例中，MYOC mRNA含量被抑制至少50%。在一些實施例中，MYOC蛋白質含量被抑制至少50%。在一些實施例中，MYOC表現被抑制至少50%。在一些實施例中，抑制MYOC表現使個體生物樣品(例如眼房液樣品)中的MYOC蛋白質含量降低至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%。在一些實施例中，抑制MYOC基因表現使個體生物樣品(例如眼房液樣品)中的MYOC mRNA含量降低至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%。
在一些實施例中，個體經診斷患有MYOC相關病症。在一些實施例中，個體符合MYOC相關病症之至少一種診斷標準。在一些實施例中，MYOC相關病症為青光眼。在一些實施例中，MYOC相關病症為原發性開角型青光眼(POAG)。
在一些實施例中，眼細胞或組織為小梁網狀組織、睫狀體、RPE、視網膜細胞、星形膠質細胞、外被細胞、繆氏細胞、神經節細胞、內皮細胞、感光細胞、視網膜血管(例如包括內皮細胞及血管平滑肌細胞)或脈絡膜組織，例如脈絡膜血管。
在一些實施例中，MYOC相關病症為青光眼。在一些實施例中，青光眼由眼壓升高引起或與眼壓升高相關。在一些實施例中，青光眼原發性開角型青光眼(POAG)。
在一些實施例中，治療包含改善病症之至少一種徵象或症狀。在一些實施例中，至少一種徵象或症狀包括視神經損傷、視覺喪失、管狀視覺、視力模糊、眼痛或MYOC (例如MYOC基因、MYOC mRNA或MYOC蛋白質)之存在、含量或活性中之一或多者的量度。
在一些實施例中，MYOC含量高於參考含量指示個體患有青光眼。在一些實施例中，治療包含預防病症惡化。在一些實施例中，治療包含以下中之一或多者：(a)抑制或降低MYOC表現或活性；(b)降低錯誤摺疊之MYOC蛋白質的含量；(c)減少小梁網狀細胞死亡；(d)減少眼內壓；或(e)增加視敏度。
在一些實施例中，治療使得小梁網狀組織、睫狀體、視網膜、RPE、視網膜血管(例如包括內皮細胞及血管平滑肌細胞)或脈絡膜組織(例如脈絡膜血管)中之MYOC mRNA相對於基線平均降低至少30%。在某些實施例中，治療使得小梁網狀組織、睫狀體、視網膜、RPE、視網膜血管(例如包括內皮細胞及血管平滑肌細胞)或脈絡膜組織(例如脈絡膜血管)中之MYOC mRNA相對於基線平均降低至少60%。在某些實施例中，治療使得小梁網狀組織、睫狀體、視網膜、RPE、視網膜血管(例如包括內皮細胞及血管平滑肌細胞)或脈絡膜組織(例如脈絡膜血管)中之MYOC mRNA相對於基線平均降低至少90%。
在一些實施例中，在治療之後，個體在單次劑量dsRNA之後經歷至少持續8週的基因減弱，以藉由視網膜中之MYOC蛋白質所評估。在一些實施例中，在單次劑量dsRNA之後，治療引起至少持續12週的基因減弱，以藉由視網膜中之MYOC蛋白質所評估。在一些實施例中，在單次劑量dsRNA之後，治療引起至少持續16週的基因減弱，以藉由視網膜中之MYOC蛋白質所評估。
在一些實施例中，個體為人類。
在一些實施例中，dsRNA藥劑係以約0.01 mg/kg至約50 mg/kg之劑量投與。
在一些實施例中，dsRNA藥劑向個體眼內投與。在一些實施例中，眼內投與包含玻璃體內投與，例如玻璃體內注射；經鞏膜投與，例如經鞏膜注射；結膜下投與，例如結膜下注射；眼球後投與，例如眼球後注射；前房內投與，例如前房內注射；或視網膜下投與，例如視網膜下注射。
在一些實施例中，dsRNA藥劑向個體靜脈內投與。在一些實施例中，dsRNA藥劑向個體體表投與。
在一些實施例中，本文所描述之方法進一步包含量測個體之MYOC (例如MYOC基因、MYOC mRNA或MYOC蛋白質)之含量。在一些實施例中，量測個體之MYOC含量包含量測個體生物樣品(例如眼房液樣品)中的MYOC蛋白質含量。在一些實施例中，本文所述之方法進一步包含進行血液測試、成像測試或眼房液活檢(例如眼房液放液)。
在一些實施例中，在用dsRNA藥劑或醫藥組合物治療之前，執行本文所描述之方法，進一步量測個體之MYOC (例如MYOC基因、MYOC mRNA或MYOC蛋白質)之含量。在一些實施例中，在確定個體之MYOC含量大於參考含量時，向個體投與dsRNA藥劑或醫藥組合物。在一些實施例中，在用dsRNA藥劑或醫藥組合物治療之後進行量測個體中MYOC之含量。
在一些實施例中，本文所描述之方法進一步包含用適用於治療或預防MYOC相關病症之療法治療個體，例如其中療法包含雷射小梁成形術手術、小梁切除術手術、微創性青光眼手術或眼睛中置放引流管。在一些實施例中，本文所述之方法進一步包含向個體投與適於治療或預防MYOC相關病症之額外藥劑。在一些實施例中，額外藥劑包含碳酸酐酶抑制劑、前列腺素、β阻斷劑、α-腎上腺素激導性促效劑、碳酸酐酶抑制劑、Rho激酶抑制劑或膽鹼激導性藥劑或其任何組合。在一些實施例中，額外藥劑包含口服藥物治療或滴眼劑。
所有公開案、專利申請案、專利及本文所提及之其他參考文獻均以全文引用的方式併入本文中。
相關申請案之交互參考
本申請案主張2021年6月28日申請之美國臨時申請案第63/215,804號的優先權，主張2021年12月8日申請之美國臨時申請案第63/287,404號的優先權且主張2022年6月10日申請之美國臨時申請案第63/351,033號的優先權。前述申請案之全部內容以引用之方式併入本文中。 序列表
本申請案含有序列表，該序列表已以ASCII格式、以電子方式提交且以全文引用的方式併入本文中。該ASCII複本於2022年6月22日創建，命名為A108868_1490WO_SL.txt且大小為596,467個位元組。
iRNA藉由稱為RNA干擾(RNAi)之過程引導mRNA之序列特異性分解。本文描述iRNA及使用其調節(例如抑制) MYOC表現的方法。亦提供用於治療與MYOC表現相關之病症，諸如青光眼(例如原發性開角型青光眼(POAG))之組合物及方法。
人類MYOC為約57 kDa之分泌醣蛋白，其調節相鄰細胞中若干信號傳導路徑之活化以控制不同過程，包括細胞黏附、細胞-基質黏附、細胞骨架組織及細胞遷移。MYOC通常由包括視網膜及涉及水狀液調節之結構(諸如小梁網狀組織及睫狀體)之多種組織表現及分泌。異常MYOC與青光眼，例如原發性開角型青光眼(POAG)相關。不希望受理論所束縛，例如藉由阻礙水狀液排出，因此引起眼內壓增加，異常MYOC會加重青光眼之發病。
以下描述揭示如何製備及使用含有iRNA之組合物以調節(例如抑制)MYOC之表現，以及用於治療與MYOC之表現相關之病症的組合物及方法。
在一些態樣中，本文提供含有MYOC iRNA及醫藥學上可接受之載劑的醫藥組合物、使用該等組合物抑制MYOC表現之方法及使用該等醫藥組合物治療與MYOC表現相關之病症(例如青光眼，例如原發性開角型青光眼(POAG))的方法。
I. 定義為方便起見，下文提供本說明書、實例及隨附申請專利範圍中所用之某些術語及短語之含義。若本說明書其他部分中使用之術語與本章節中提供之其定義之間存在明顯偏差，則將以本章節中之定義為準。
術語「約」在提及數值或數值範圍時，意謂所提及之數值或數值範圍為實驗變異度內(或在實驗統計誤差內)的近似值，且因此，數值或數值範圍將在例如所述數值或數值範圍之1%與15%之間變化。
一個數或一系列數前的術語「或更多」及「至少」應理解為包括與術語「至少」相鄰的數及可邏輯地包括在內的所有後續數或整數，如上下文所明示。舉例而言，核酸分子中之核苷酸數目必須為整數。舉例而言，「20個核苷酸之核酸分子中的至少17個核苷酸」意謂17、18、19或20個核苷酸具有指定特性。當「至少」存在於一系列數或範圍之前時，應理解，「至少」可修飾該系列或範圍中之各個數。
如本文所用，「或更少」及「不超過」應理解為與片語相鄰的值，及上下文邏輯所示的合理較低值或整數至零。舉例而言，與靶點之錯配「不超過2個核苷酸」的雙螺旋體具有2、1或0個錯配。當「不超過」存在於一系列數或範圍之前時，應理解，「不超過」可修飾該系列或範圍中之各個數。
如本文所用，「小於」應理解為與片語相鄰且包括上下文邏輯所示的合理較低值或整數至零的值。舉例而言，與靶點之錯配「小於3個核苷酸」的雙螺旋體具有2、1或0個錯配。當「小於」存在於一系列數或範圍之前時，應理解，「小於」可修飾該系列或範圍中之各個數。
如本文所用，「超過」應理解為與片語相鄰且包括上下文邏輯所示的合理較高值或整數至無窮大的值。舉例而言，與靶點之錯配「超過3個核苷酸」的雙螺旋體具有4、5、6或更多個錯配。當「超過」存在於一系列數或範圍之前時，應理解，「超過」可修飾該系列或範圍中之各個數。
如本文所用，如在「至多10」中之「至多」理解為至多且包括10，亦即0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
本文提供之範圍理解為包括在該範圍內之所有個別整數值及所有子範圍。
術語「活化」、「增強」、「上調表現」、「增加表現」及其類似術語就其在本文中提及MYOC基因而言，係指MYOC基因表現至少部分地被活化，如可自其中MYOC基因已轉錄之第一細胞或細胞群中分離或偵測到之MYOC mRNA之量增加所表明，該第一細胞或細胞群已經處理，使得相較於與第一細胞或細胞群基本上相同、但尚未如此經處理的第二細胞或細胞群(對照細胞)，MYOC基因表現增加。
在一些實施例中，投與如本文所述之iRNA使MYOC基因表現活化至少約10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%或50%。在一些實施例中，投與本發明提供之iRNA使MYOC基因活化至少約60%、70%或80%。在一些實施例中，投與如本文所述之iRNA使MYOC基因表現活化至少約85%、90%或95%或更多。在一些實施例中，使用如本文所述之iRNA處理的細胞中MYOC基因表現相較於未經處理之細胞中的表現提高至少1倍、至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少50倍、至少100倍、至少500倍、至少1000倍或更多倍。藉由小dsRNA活化表現描述於例如Li等人, 2006 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.103:17337-42以及US2007/0111963及US2005/226848中，其各自以引用的方式併入本文中。
術語「靜默」、「抑制表現」、「下調表現」、「遏制表現」及其類似術語就提及MYOC而言，在本文中係指如MYOC之表現的至少部分遏制，例如基於MYOC mRNA表現、MYOC蛋白質表現或與MYOC表現功能上關聯之另一參數所評估。舉例而言，MYOC表現之抑制可由MYOC mRNA之量的減少表明，該MYOC mRNA可在第一細胞或細胞群中分離或偵測到，在該第一細胞或細胞群中轉錄MYOC且已經處理該第一細胞或細胞群以使得MYOC之表現相較於對照組受到抑制。對照組可為與第一細胞或細胞群實質上相同之第二細胞或細胞群，但第二細胞或細胞群未經處理(對照細胞)。抑制程度通常表示為對照水準的百分比，例如，
Figure 02_image005
或者，抑制程度可根據與MYOC表現功能上關聯之參數(例如由MYOC基因編碼之蛋白質的量)的降低給出。與MYOC表現功能上關聯之參數的降低可類似地表示為相對於對照含量之百分比。大體上，可組成性地或藉由基因體工程化，且藉由任何適當分析在任何表現MYOC之細胞中測定MYOC靜默。
舉例而言，在某些情況下，投與本文所揭示之iRNA將MYOC表現抑制至少約10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%或50%。在一些實施例中，投與本文所揭示之iRNA將MYOC抑制至少約60%、65%、70%、75%或80%。在一些實施例中，投與如本文所述之iRNA將MYOC抑制至少約85%、90%、95%、98%、99%或更多。
術語「反義股」或「引導股」係指包括與目標序列實質上互補之區的iRNA (例如dsRNA)之股。
如本文所用，術語「互補區」係指反義股上與如本文所定義之序列(例如目標序列)實質上互補之區。若互補區與目標序列不完全互補，則分子之內部區或末端區中可存在錯配。在一些實施例中，互補區包含0、1或2個錯配。
如本文所用之術語「有義股」或「過客股」係指包括與如本文所定義之彼術語的反義股區實質上互補之區的iRNA之股。
如本文關於dsRNA所用之術語「鈍」或「鈍端」意謂在dsRNA之給定末端處不存在不成對核苷酸或核苷酸類似物，亦即無核苷酸突出物。dsRNA之一端或兩端可為鈍端。若dsRNA之兩端皆為鈍端，則dsRNA稱為鈍端的。應明確，「鈍端」dsRNA為兩端皆鈍之dsRNA，亦即分子之任一端皆無核苷酸突出物。最通常地，此類分子在其整個長度上將為雙股的。
如本文中所使用且除非另有指示，否則如熟習此項技術者將理解，術語「互補」當用於相對於第二核苷酸序列描述第一核苷酸序列時，係指包含第一核苷酸序列之寡核苷酸或聚核苷酸在某些條件下與包含第二核苷酸序列之寡核苷酸或聚核苷酸雜交且形成雙螺旋結構之能力。此類條件可為例如嚴格條件，其中嚴格條件可包括：400 mM NaCl、40 mM PIPES pH 6.4、1 mM EDTA，50℃或70℃，持續12-16小時，隨後洗滌。可應用其他條件，諸如可能在生物體內部遇到的生理學相關條件。熟習此項技術者將能夠確定最適於根據雜交核苷酸之最用應用測試兩個序列之互補性的條件集合。
iRNA內(例如如本文所述之dsRNA內)的互補序列包括包含第一核苷酸序列之寡核苷酸或聚核苷酸與包含第二核苷酸序列之寡核苷酸或聚核苷酸在一個或兩個核苷酸序列的整個長度上的鹼基配對。此類序列在本文中可稱為彼此「完全互補」。然而，若本文中將第一序列稱為關於第二序列「實質上互補」，則兩個序列可完全互補，或其在雜交成高達30個鹼基對之雙螺旋體時可形成一或多個，但一般不超過5、4、3或2個不匹配鹼基對，同時保留在與其最終應用最相關之條件下雜交的能力，例如經RISC路徑抑制基因表現。然而，兩個寡核苷酸經設計以在雜交時形成一或多個單股突出物時，此類突出物不應視為關於互補性判定之錯配。舉例而言，包含長度為21個核苷酸之一個寡核苷酸及長度為23個核苷酸之另一個寡核苷酸的dsRNA (其中較長寡核苷酸包含與較短寡核苷酸完全互補的21個核苷酸之序列)根據本文所述之目的，仍可稱為「完全互補」。
如本文所用，「互補」序列亦可包括非沃森-克里克鹼基對(non-Watson-Crick base pair)及/或由非天然及經修飾核苷酸形成的鹼基對或完全由該等鹼基對形成，只要滿足上文關於其雜交能力之要求即可。此類非沃森-克里克鹼基對包括(但不限於) G:U沃伯或胡格斯坦鹼基對(Wobble或Hoogstein base pairing)。
本文之術語「互補」、「完全互補」及「實質上互補」可關於dsRNA之有義股與反義股之間的鹼基匹配，或iRNA藥劑之反義股與目標序列之間的鹼基匹配使用，如將自其使用情形理解。
如本文所用，「與信使RNA (mRNA)之至少一部分實質上互補」的聚核苷酸係指與所關注mRNA (例如編碼MYOC蛋白質之mRNA)之連續部分實質上互補的聚核苷酸。舉例而言，若序列與編碼MYOC之mRNA之不間斷部分實質上互補，則聚核苷酸與MAPT mRNA之至少一部分互補。術語「互補」係指第一核酸及第二核酸之核鹼基之間配對的能力。
如本文所用，術語「互補區」係指一個核苷酸序列藥劑之與另一序列實質上互補的區域，例如dsRNA之有義序列及對應反義序列或iRNA之反義股及目標序列，例如MYOC核苷酸序列的區域，如本文所定義。在互補區域與目標序列不完全互補之情況下，錯配可在iRNA反義股的內部或末端區域中。一般而言，最能容許之錯配在末端區域中，例如iRNA藥劑之5'端或3'端之5、4、3或2個核苷酸內。
如本文所用，「接觸」包括直接接觸細胞，以及間接接觸細胞。舉例而言，當向個體(例如眼內、局部或靜脈內)投與包含iRNA之組合物時，可接觸個體內之細胞。
當涉及iRNA時，「引入至細胞中」意謂促進或實現向細胞中之攝取或吸收。iRNA之吸收或攝取可藉由未受輔助之擴散或主動細胞過程，或藉由輔助試劑或裝置進行。此術語之含義不限於活體外細胞；當細胞為活有機體之一部分時，亦可將iRNA「引入細胞中」。在此情形中，引入細胞中將包括遞送該生物體。舉例而言，對於活體內遞送，iRNA可注入組織部位中或全身性投與。活體內遞送亦可藉由β-葡聚糖遞送系統進行，諸如美國專利第5,032,401號及第5,607,677號以及美國公開案第2005/0281781號中所述的彼等遞送系統，該等文獻以全文引用的方式併入本文中。活體外引入細胞中包括此項技術中已知之方法，諸如電穿孔及脂質體轉染。其他方法亦在下文中描述或為此項技術中已知。如本文所用，「與MYOC表現相關之病症」、「與MYOC表現相關之疾病」、「與MYOC表現相關之病理過程」、「MYOC相關病症」、「MYOC相關疾病」或其類似者包括其中MYOC表現改變(例如，相對於參考水準(例如未患病個體所特有的水準)降低或增加)的任何病狀、病症或疾病。在一些實施例中，MYOC表現降低。在一些實施例中，MYOC表現提高。在一些實施例中，在來自個體之組織樣品中(例如在眼房液樣品中)，可偵測到MYOC表現減少或增加。可相對於同一個體在產生病症之前觀測到的含量或相對於未患病症之其他個體評估降低或提高。減少或增加可限於身體之特定器官、組織或區域(例如眼部)。MYOC相關病症包括(但不限於)青光眼(例如原發性開角型青光眼(POAG))。
如本文所用，術語「青光眼」意謂視神經損傷所引起或與視神經損傷相關的任何眼疾病。在一些實施例中，青光眼與眼內壓升高相關聯。在一些實施例中，青光眼無症狀。在其他實施例中，青光眼具有一或多種症狀，例如外周視覺喪失、管狀視覺或盲點。可使用本文所提供之方法治療的青光眼之非限制性實例為原發性開角型青光眼(POAG)。
如本文所用，術語「雙股RNA」、「dsRNA」或「siRNA」係指包括具有雜交雙螺旋體區域之RNA分子或分子複合物的iRNA，該雙螺旋體區域包含兩個反平行且實質上互補之核酸股，其將被稱為相對於目標RNA具有「有義」及「反義」定向。雙螺旋體區域可為允許例如藉由RISC路徑特異性分解所要目標RNA之任何長度，但通常將在9至36個鹼基對長度，例如15-30個鹼基對長度的範圍中。考慮到9至36個鹼基對的雙螺旋體，雙螺旋體可為此範圍中之任何長度，例如9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36及其間之任何子範圍，包括(但不限於) 15-30個鹼基對、15-26個鹼基對、15-23個鹼基對、15-22個鹼基對、15-21個鹼基對、15-20個鹼基對、15-19個鹼基對、15-18個鹼基對、15-17個鹼基對、18-30個鹼基對、18-26個鹼基對、18-23個鹼基對、18-22個鹼基對、18-21個鹼基對、18-20個鹼基對、19-30個鹼基對、19-26個鹼基對、19-23個鹼基對、19-22個鹼基對、19-21個鹼基對、19-20個鹼基對、20-30個鹼基對、20-26個鹼基對、20-25個鹼基對、20-24個鹼基對、20-23個鹼基對、20-22個鹼基對、20-21個鹼基對、21-30個鹼基對、21-26個鹼基對、21-25個鹼基對、21-24個鹼基對、21-23個鹼基對或21-22個鹼基對。藉由用Dicer及類似酶加工在細胞中產生之dsRNA一般在19-22個鹼基對長度的範圍內。dsDNA之雙螺旋體區域之一個股包含與目標RNA之區實質上互補的序列。形成雙螺旋體結構之兩個股可來自具有至少一個自身互補區的單個RNA分子，或可由兩個或更多個各別RNA分子形成。在雙螺旋體區域由單個分子之二個股形成之情況下，該分子可具有在形成雙螺旋體結構之一個股之3'端與各別另一股之5'端之間由核苷酸單股鏈間隔開之雙螺旋體區域(在本文中稱為「髮夾環」)。髮夾環可包含至少一個不成對核苷酸；在一些實施例中，髮夾環可包含至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少20個、至少23個或更多個不成對核苷酸。當dsRNA之兩個實質上互補股由不同RNA分子包含時，彼等分子無需，但可共價連接。在一些實施例中，兩股藉由除髮夾環以外的方式共價連接，且連接結構為連接子。
在一些實施例中，iRNA藥劑可為引入至細胞或生物體中以抑制目標mRNA的「單股siRNA」。在一些實施例中，單股RNAi可劑結合至RISC核酸內切酶Argonaute 2，其隨後裂解目標mRNA。單股siRNA通常為15-30個核苷酸且視情況經化學修飾。單股siRNA之設計及測試描述於美國專利第8,101,348號及Lima等人, (2012) Cell150: 883-894中，該等文獻各自之全部內容以引用之方式併入本文中。本文所述之任一種反義核苷酸序列(例如表2A或2B中提供之序列)可用作如本文所述之單股siRNA且視情況經化學修飾，例如如本文所述，例如藉由Lima等人, (2012) Cell150:883-894中所述之方法。
在一些實施例中，RNA干擾劑包括與目標RNA序列相互作用以引導目標RNA裂解的單股RNA。不希望受理論束縛，引入細胞中之長雙股RNA藉由稱為Dicer之III型核酸內切酶分解成siRNA (Sharp等人, Genes Dev.2001, 15:485)。Dicer為核糖核酸酶-III樣酶，其將dsRNA加工成特徵為兩個鹼基3'突出物之19-23個鹼基對的短干擾RNA (Bernstein等人, (2001) Nature409:363)。siRNA接著併入RNA誘導靜默複合物(RISC)中，其中一或多種解螺旋酶展開siRNA雙螺旋體，使得互補反義股能夠引導目標識別(Nykanen等人, (2001) Cell107:309)。當結合於適當目標mRNA時，RISC內之一或多種核酸內切酶裂解目標以誘導靜默(Elbashir等人, (2001) Genes Dev.15:188)。因此，在一些實施例中，本發明係關於一種單股RNA，其促進形成RISC複合物以實現目標基因之靜默。
「G」、「C」、「A」、「T」及「U」各自一般分別代表含有鳥嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸苷及尿嘧啶作為鹼基之核苷酸。然而，應瞭解，術語「去氧核糖核苷酸」或「核糖核苷酸」或「核苷酸」亦可指經修飾之核苷酸，如在下文中進一步詳述，或替代置換部分。熟習此項技術者熟知鳥嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤及尿嘧啶可置換為其他部分而不實質上改變包含攜帶此類置換部分之核苷酸的寡核苷酸的鹼基配對特性。例如(但不限於)包含肌苷作為其鹼基之核苷酸可與含有腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶之核苷酸鹼基配對。因此，含有尿嘧啶、鳥嘌呤或腺嘌呤之核苷酸可在本發明特有的dsRNA之核苷酸序列中由含有例如肌苷之核苷酸置換。在另一實例中，寡核苷酸中任何位置之腺嘌呤及胞嘧啶可分別經鳥嘌呤及尿嘧啶置換以與目標mRNA形成G-U擺動鹼基配對。含有此類置換部分之序列適用於本發明特徵在於之組合物及方法。
如本文所用，術語「iRNA」、「RNAi」、「iRNA藥劑」或「RNAi藥劑」或「RNAi分子」係指含有RNA的藥劑，正如該術語在本文中所定義，且其例如經由RNA誘導靜默複合物(RISC)路徑介導RNA轉錄本發生靶向裂解。在一些實施例中，如本文所述之iRNA實現對例如細胞或哺乳動物中之MYOC表現的抑制。可基於MYOC mRNA含量降低或MYOC蛋白質含量降低評估MYOC表現抑制。
術語「連接子」或「連接子」意謂連接化合物之兩個部分(例如共價連接化合物之兩個部分)的有機部分。
術語「親脂體」或「親脂性部分」廣泛地指對脂質具有親和力之任何化合物或化學部分。表徵親脂性部分之親脂性的一種方式係藉由辛醇-水分配係數logK ow，其中K ow為二相系統在平衡時化學物質在辛醇相中之濃度與其在水相中之濃度的比率。辛醇-水分配係數為實驗室量測之物質特性。然而，其亦可藉由使用歸因於化學物質之結構組分的係數來預測，該等係數係使用第一原理或經驗方法計算(參見例如Tetko等人， J. Chem. Inf. Comput. Sci.41:1407-21 (2001)，該文獻以全文引用之方式併入本文中)。其對物質偏好非水性或油性環境而非水之傾向(亦即，其親水性/親脂性平衡)提供熱力學量度。原則上，當logK ow超過0時，化學物質具有親脂性特徵。通常，親脂性部分之logK ow超過1、超過1.5、超過2、超過3、超過4、超過5或超過10。舉例而言，預測例如6-胺基己醇之logK ow為約0.7。使用相同方法，預測膽固醇基N-(己-6-醇)胺基甲酸酯之logK ow為10.7。
分子之親脂性可相關於其攜帶的官能基而改變。舉例而言，向親脂性部分之末端添加羥基或胺基可增加或降低親脂性部分之分配係數(例如logK ow)值。
或者，與一或多個親脂性部分結合之雙股RNAi藥劑之疏水性可藉由其蛋白質結合特徵量測。舉例而言，在某些實施例中，雙股RNAi藥劑之血漿蛋白結合分析中之未結合部分可以確定為與雙股RNAi藥劑之相對疏水性正相關，該相對疏水性則可以與雙股RNAi藥劑之緘默化活性正相關。
在一些實施例中，測定之血漿蛋白結合分析為使用人類血清白蛋白之電泳遷移率變化分析(EMSA)。此結合分析之例示性方案詳細說明於例如PCT/US2019/031170中。藉由結合分析中未結合之siRNA之分數量測的雙股RNAi藥劑之疏水性超過0.15、超過0.2、超過0.25、超過0.3、超過0.35、超過0.4、超過0.45或超過0.5，以增強siRNA之活體內遞送。
因此，將親脂性部分與雙股RNAi劑之內部位置結合為增強siRNA之活體內遞送提供最佳疏水性。
術語「脂質奈米粒子」或「LNP」為包含囊封醫藥活性分子，諸如核酸分子，例如RNAi劑，或轉錄RNAi劑之質體之脂質層的囊泡。LNP描述於例如美國專利第6,858,225號、第6,815,432號、第8,158,601號及第8,058,069號中，該等文獻的全部內容以引用的方式併入本文中。
如本文所用，術語「調節表現」係指相較於對照細胞中對應基因之表現，在如本文所述之iRNA組合物處理的細胞中至少部分地「抑制」或部分地「活化」基因(例如MYOC基因)表現。對照細胞包括未處理細胞或用非靶向對照iRNA處理之細胞。
熟習此項技術者將認識到術語「RNA分子」或「核糖核酸分子」不僅涵蓋自然界中表現或發現之RNA分子，而且涵蓋如本文所述或如此項技術中已知的包含一或多個核糖核苷酸/核苷類似物或衍生物之RNA類似物及衍生物。嚴格地說，「核苷」包括核苷鹼基及核糖，且「核糖核苷酸」為具有一個、兩個或三個磷酸部分或其類似物(例如硫代磷酸酯)之核苷。然而，如本文所用，術語「核糖核苷」與「核糖核苷酸」可視為等效。RNA之核鹼基結構、核糖結構或核糖-磷酸酯主鏈結構可經修飾，例如如下文所述。然而，包含核苷類似物或衍生物之分子必須保留形成雙螺旋體之能力。作為非限制性實例，RNA分子亦可包括至少一個經修飾核苷，包括但不限於2'-O-甲基修飾之核苷酸、包含5'硫代磷酸酯基之核苷、連接至膽固醇基衍生物或十二烷酸雙癸醯胺基之末端核苷、鎖核苷、無鹼基核苷、非環核苷、二醇核苷酸、2'-去氧-2'-氟修飾之核苷、2'-胺基-修飾之核苷、2'-烷基-修飾之核苷、(N-𠰌啉基)核苷、包含胺基磷酸酯或非天然鹼基之核苷或其任何組合。替代地或組合地，RNA分子可包含至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少15個、至少20個或更多個，直至dsRNA分子之整個長度的經修飾核糖核苷。RNA分子中此類複數個經修飾核糖核苷中之每一者的修飾無需相同。在一些實施例中，預期用於本文所述之方法及組合物中之經修飾RNA為肽核酸(PNA)，其能夠形成必需雙螺旋體結構且允許或介導目標RNA例如經RISC路徑特異性分解。為了清楚起見，應瞭解，術語「iRNA」不涵蓋天然存在之雙股DNA分子或含100%去氧核苷的DNA分子。
在一些態樣中，經修飾核苷包括去氧核苷。在此類實例中，iRNA藥劑可包含一或多個去氧核苷，包括例如去氧核苷突出物，或dsRNA之雙股部分內的一或多個去氧核苷。在某些實施例中，RNA分子例如在一個股或兩個股中包含至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95%或更高(但不為100%)去氧核糖核苷的去氧核糖核苷百分比。
如本文所用，術語「核苷酸突出物」係指自iRNA雙螺旋體結構(例如dsRNA)突出的至少一個不成對核苷酸。例如，當dsRNA之一個股的3'端延伸超出另一股之5'端時，或反之亦然，存在核苷酸突出物。dsRNA可包含具有至少一個核苷酸突出物；或者，突出物可包含至少兩個核苷酸、至少三個核苷酸、至少四個核苷酸、或至少五個或更多個核苷酸。核苷酸突出物可包含核苷酸/核苷類似物或由其組成，包括去氧核苷酸/核苷。突出物可位於有義股上、反義股上或其任何組合。此外，突出物之核苷酸可存在於dsRNA之反義股或有義股之5'端、3'端或兩端上。
在一些實施例中，dsRNA之反義股在3'端及/或5'端具有1-10個核苷酸突出物。在一些實施例中，dsRNA之有義股在3'端及/或5'端具有1-10個核苷酸突出物。在一些實施例中，突出物中之一或多個核苷酸經硫代磷酸核苷置換。
如本文所用，「醫藥組合物」包含藥理學有效量之治療劑(例如iRNA)及醫藥學上可接受之載劑。如本文所用，「藥理學有效量」、「治療有效量」或僅僅「有效量」係指有效產生預期藥理學、治療性或預防性結果之藥劑(例如iRNA)的量。舉例而言，在治療與MYOC表現相關之病症(例如青光眼，例如原發性開角型青光眼(POAG))之方法中，有效量包括有效減少與病症相關之一或多種症狀的量(例如有效(a)抑制或降低MYOC之表現或活性；(b)降低錯誤摺疊MYOC蛋白質之含量；(c)減少小梁網狀細胞死亡；(d)減少眼內壓；或(e)增加視敏度之量。舉例而言，若既定臨床療法使與疾病或病症有關之可量測參數降低至少10%時被視為有效，則用於治療該疾病或病症之藥物的治療有效量為彼參數達成至少10%降幅所必需的量。舉例而言，治療有效量的靶向MYOC之iRNA可將MYOC mRNA含量或MYOC蛋白質含量減少任何可量測的量，例如至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%。
術語「醫藥學上可接受之載劑」係指用於投與治療劑之載劑。此類載劑包括(但不限於)生理食鹽水、緩衝生理食鹽水、右旋糖、水、甘油、乙醇及其組合。該術語尤其不包括細胞培養基。對於經口投與之藥物而言，醫藥學上可接受之載劑包括(但不限於)醫藥學上可接受之賦形劑，諸如惰性稀釋劑、崩解劑、黏合劑、潤滑劑、甜味劑、調味劑、著色劑及防腐劑。適合惰性稀釋劑包括碳酸鈉及碳酸鈣、磷酸鈉及磷酸鈣及乳糖，而玉米澱粉及褐藻酸為適合崩解劑。黏合劑可包括澱粉及明膠，而潤滑劑(若存在)一般為硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石。必要時，錠劑可用諸如單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯之材料包覆包衣以延遲胃腸道中之吸收。藥物調配物中包括之藥劑在下文中進一步描述。
如本文所用，術語「SNALP」係指穩定核酸-脂質粒子。SNALP表示包覆減少之水性內部的脂質囊泡，該水性內部包含諸如iRNA之核酸或轉錄iRNA之質體。SNALP描述於例如美國專利申請公開案第2006/0240093號、第2007/0135372號及國際申請案第WO 2009/082817號中。此等申請案以全文引用之方式併入本文中。在一些實施例中，SNALP為SPLP。如本文所用，術語「SPLP」係指包含囊封於脂質囊泡內之質體DNA之核酸-脂質粒子。
如本文所用，術語「包含序列之股」係指包含藉由使用標準核苷酸命名法提及之序列描述的核苷酸鏈之寡核苷酸。
如本文所用，待根據本文所述之方法治療的「個體」包括人類或非人類動物，例如哺乳動物。哺乳動物可為例如嚙齒動物(例如大鼠或小鼠)或靈長類動物(例如猴)。在一些實施例中，個體為人類。
「有需要之個體」包括患有、疑似患有或處於罹患與MYOC表現(例如過度表現)相關之病症(例如青光眼)之風險下的個體。在一些實施例中，個體患有或疑似患有與MYOC表現或過度表現相關之病症。在一些實施例中，個體處於罹患與MYOC表現或過度表現相關之病症的風險下。
如本文中所使用，「目標序列」係指在基因(例如MYOC)轉錄期間形成的mRNA分子之核苷酸序列的連續部分，包括作為主要轉錄產物之RNA加工產物的mRNA。序列之目標部分將至少足夠長以用作iRNA引導之彼部分處或附近之裂解的受質。舉例而言，目標序列長度一般將為9-36個核苷酸，例如長度為15-30個核苷酸，包括其間之所有子範圍。作為非限制性實例，目標序列可為15-30個核苷酸、15-26個核苷酸、15-23個核苷酸、15-22個核苷酸、15-21個核苷酸、15-20個核苷酸、15-19個核苷酸、15-18個核苷酸、15-17個核苷酸、18-30個核苷酸、18-26個核苷酸、18-23個核苷酸、18-22個核苷酸、18-21個核苷酸、18-20個核苷酸、19-30個核苷酸、19-26個核苷酸、19-23個核苷酸、19-22個核苷酸、19-21個核苷酸、19-20個核苷酸、20-30個核苷酸、20-26個核苷酸、20-25個核苷酸、20-24個核苷酸、20-23個核苷酸、20-22個核苷酸、20-21個核苷酸、21-30個核苷酸、21-26個核苷酸、21-25個核苷酸、21-24個核苷酸、21-23個核苷酸或21-22個核苷酸。
如本文所用，片語「治療有效量」及「預防有效量」及其類似者係指在治療、預防或管理與MYOC表現有關之任何病症或病理學過程(例如青光眼，例如原發性開角型青光眼(POAG))中提供治療益處的量。治療有效之特定量可視此項技術中已知之因素而變化，諸如病症或病理學過程之類型、患者病史及年齡、病症或病理學過程之階段及其他療法之投與。
在本發明之上下文中，術語「治療(treat/treatment)」及其類似術語意謂預防、延遲、減輕或緩解與有關於MYOC表現之病症相關聯的至少一種症狀，或減緩或逆轉此類病症之進展或預期進展。例如，本文中提供之方法當用於治療青光眼時可用於減少或預防如本文所述之青光眼之一或多種症狀，或降低相關病狀之風險或嚴重程度。因此，除非上下文另外明確指示，否則術語「治療」及其類似術語意欲涵蓋防治，例如預防與MYOC表現相關之病症及/或病症的症狀。治療亦可意謂與不存在治療下之預期存活期相比延長的存活期。
疾病標記或症狀情形中之「較低」意謂此類含量中之任何降低，例如統計學上或臨床上顯著降低。降幅可為例如至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少40%，至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%。降幅可低至對無此類病症之個體而言正常範圍內可接受之含量。
如本文所使用，「MYOC」係指「肌纖蛋白」對應的mRNA(「MYOC mRNA」)或對應的蛋白質(「MYOC蛋白質」)。人類MYOC mRNA轉錄本之序列可見於SEQ ID NO: 1中。
II. iRNA藥劑 本文描述調節(例如抑制) MYOC表現之iRNA藥劑。
在一些實施例中，iRNA藥劑活化細胞或哺乳動物中之MYOC表現。
在一些實施例中，iRNA藥劑包括用於抑制細胞或個體(例如哺乳動物，例如人類)中之MYOC表現的雙股核糖核酸(dsRNA)分子，其中dsRNA包括具有互補區之反義股，該互補區與MYOC表現時所形成之mRNA的至少一部分互補，且其中該互補區之長度為30個核苷酸或更小，長度一般為19-24個核苷酸，且其中dsRNA當與表現MYOC之細胞接觸時將MYOC表現抑制例如至少10%、20%、30%、40%或50%。
MYOC表現之調節(例如抑制)可藉由例如基於PCR或分支鏈DNA (bDNA)之方法或藉由基於蛋白質之方法，諸如藉由西方墨點法來分析。細胞培養物(諸如COS細胞、ARPE-19細胞、hTERT RPE-1細胞、希拉(HeLa)細胞、原代肝細胞、HepG2細胞、原代培養細胞或來自個體之生物樣品)中之MYOC表現可如下地分析：藉由量測MYOC mRNA含量，諸如藉由bDNA或TaqMan分析，或藉由量測蛋白質含量，諸如藉由免疫螢光分析，使用例如西方墨點法或流式細胞量測技術。
dsRNA通常包括兩個RNA股，其充分互補以在將使用dsRNA之條件下雜交形成雙螺旋結構。dsRNA之一個股(反義股)通常包括與目標序列實質上互補且一般完全互補之互補區，該目標序列衍生自MYOC表現期間形成之mRNA的序列。另一股(有義股)通常包括與反義股互補之區域，使得兩股在適合條件下組合時雜交且形成雙螺旋結構。一般而言，雙螺旋體結構之長度為15至30 (包括15及30)，更一般為18至25 (包括18及25)，更一般為19至24 (包括19及24)且最一般為19至21 (包括19及21)個鹼基對。類似地，與目標序列互補之區的長度為15至30 (包括15及30)，更一般為18至25 (包括18及25)，更一般為19至24 (包括19及24)且最一般為19至21 (包括19及21)個核苷酸。
在一些實施例中，dsRNA之長度為15至20 (包括15及20)個核苷酸，且在其他實施例中，dsRNA之長度為25至30 (包括25及30)個核苷酸。如一般技術者將瞭解，靶向裂解之RNA的靶向區最通常將為較大RNA分子(通常為mRNA分子)之一部分。若相關，則mRNA目標之「部分」為具有足夠長度之mRNA目標之連續序列，其為RNAi引導之裂解的受質(亦即經RISC路徑裂解)。在一些情況下，具有雙螺旋結構且短至9個鹼基對之dsRNA介導RNAi引導之RNA裂解。目標最通常將為至少15個核苷酸之長度，例如15-30個核苷酸之長度。
熟習此項技術者亦將認識到雙螺旋體區域為dsRNA之主要功能部分，例如9至36，例如15-30個鹼基對之雙螺旋體區域。因此，在一些實施例中，在加工成具有例如15-30個鹼基對且使所要RNA靶向裂解之功能性雙螺旋而言，雙螺旋體區域大於30個鹼基對之RNA分子或RNA分子複合物為dsRNA。因此，一般熟習此項技術者應認識到，在一些實施例中，接著，miRNA為dsRNA。在一些實施例中，dsRNA不為天然存在之miRNA。在一些實施例中，適用於靶向MYOC表現之iRNA藥劑藉由裂解較大dsRNA而不在靶細胞中產生。
如本文所述之dsRNA可進一步包括一或多個單股核苷酸突出物。dsRNA可藉由如下文進一步論述的此項技術中已知之標準方法合成，例如藉由使用自動DNA合成器，諸如購自例如Biosearch, Applied Biosystems, Inc。
在一些實施例中，MYOC為人類MYOC。
在特定實施例中，dsRNA包含有義股及反義股，該有義股包含選自表2A或2B中所提供之有義序列的有義序列或由其組成，該反義股包含選自表2A或2B中所提供之反義序列的反義序列或由其組成。
在一些態樣中，dsRNA至少包括有義股及反義股核苷酸序列，其中有義股係選自表2A或2B中所提供的序列且對應反義股係選自表2A或2B中所提供的序列。
在此等態樣中，兩個序列中之一者與兩個序列中之另一者互補，該等序列中之一者與藉由MYOC表現產生之mRNA序列實質上互補。因而，dsRNA將包括兩個寡核苷酸，其中一個寡核苷酸描述為有義股，且第二寡核苷酸描述為相應反義股。如本文別處所描述且如此項技術中已知，與在不同寡核苷酸上相反，dsRNA之互補序列亦可作為單個核酸分子之自身互補區包含。
熟習此項技術者熟知，具有20至23個，但尤其21個鹼基對之雙螺旋體結構的dsRNA因特別有效誘導RNA干擾而著名(Elbashir等人, EMBO2001, 20:6877-6888)。然而，其他人已發現較短或較長RNA雙螺旋體結構同樣有效。
在上述實施例中，根據表2A及2B中提供之寡核苷酸序列的性質，本文所述之dsRNA可包括長度最少為19個核苷酸的至少一個股。可合理地預期具有表2A及2B之序列之一、但一端或兩端僅減去幾個核苷酸的較短雙螺旋體的有效性將類似於上述dsRNA。
在一些實施例中，dsRNA具有表2A或2B之序列之一的至少15、16、17、18、19、20個或更多個連續核苷酸之部分序列。
在一些實施例中，dsRNA具有反義序列及有義序列，該反義序列包含表2A或2B中所提供之反義序列的至少15、16、17、18或19個連續核苷酸，該有義序列包含表2A或2B中所提供之對應有義序列的至少15、16、17、18或19個連續核苷酸。
在一些實施例中，dsRNA包含反義序列及有義序列，該反義序列包含表2A或2B中所提供之反義序列的至少15、16、17、18、19、20、21、22或23個連續核苷酸，且該有義序列包含表2A或2B中所提供之對應有義序列的至少15、16、17、18、19、20或21個連續核苷酸。
在一些此類實施例中，dsRNA儘管包含表2A或2B中所提供之序列的僅一部分，但在抑制MYOC表現量方面，與包含表2A或2B中所提供之全長序列的dsRNA等效。在一些實施例中，相較於包含本文揭示之完全序列的dsRNA，dsRNA對MYOC表現量的抑制相差不超過5、10、15、20、25、30、35、40、45或50%抑制。
在一些實施例中，本文所述之iRNA包含含有核苷酸序列SEQ ID NO: 2之一部分的至少15個連續核苷酸、具有0、1、2或3個錯配的反義股。在一些實施例中，本文所述之iRNA包含含有核苷酸序列SEQ ID NO: 1之相應部分的至少15個連續核苷酸、具有0或1、2或3個錯配的有義股。
人類MYOC mRNA可具有本文所提供之SEQ ID NO: 1之序列。
智人肌纖蛋白(MYOC) mRNA
Figure 02_image007
Figure 02_image009
SEQ ID NO: 1之反向互補序列在本文中作為SEQ ID NO: 2提供：
Figure 02_image011
Figure 02_image011
Figure 02_image014
在一些實施例中，本文所述之iRNA包括表2A及2B中所提供之序列之一的至少15個連續核苷酸，且可視情況與獲自與MYOC中之所選序列相鄰之區域的額外核苷酸序列偶聯。
儘管目標序列之長度一般為15-30個核苷酸，但此範圍中引導任何既定目標RNA裂解之特定序列之適用性存在廣泛變化。本文所述之多種軟體套裝及準則提供鑑別用於任何既定基因目標之最佳目標序列的指導，但亦可採用經驗方法，其中既定尺寸(作為非限制性實例，21個核苷酸)之「窗」或「遮罩」字面上或象徵性的(包括例如電子雜交)置於目標RNA序列上以鑑別可用作目標序列之尺寸範圍中的序列。藉由將序列「窗」向最初目標序列位置之上游或下游逐漸移動一個核苷酸，可鑑別下一潛在目標序列，直至鑑別出針對任何所選既定目標尺寸的可能序列之完整集合。與全身性合成偶聯且測試經鑑別序列(使用如本文所述之分析法或如此項技術中已知)以鑑別表現最佳之彼等序列的此方法可鑑別當用iRNA藥劑靶向時介導目標基因表現之最佳抑制的RNA序列。因此，經審慎考慮，可藉由將「窗」向給定序列上游或下游逐漸「移動」一個核苷酸以鑑別具有相等或更佳抑制特徵的序列來達成抑制效率之進一步最佳化。
另外，經審慎考慮，對於例如表2A及2B中所鑑別之任何序列，可如下達成進一步優化：系統地添加或移除核苷酸以產生較長或較短序列且對彼等序列及藉由使具有較長或較短尺寸之窗自彼點沿目標RNA向上或向下行進而產生的序列進行測試。此外，將產生新候選目標之此方法與基於如此項技術中已知或如本文所述之抑制分析中之彼等目標序列測試iRNA之有效性結合可使得抑制效率進一步提高。此外，此類優化序列可如下調整：例如引入如本文所述或如此項技術中已知之經修飾核苷酸，添加或改變突出物或如此項技術中已知及/或本文中所述之其他修飾，使分子作為表現抑制劑進一步優化(例如提高血清穩定性或循環半衰期、提高熱穩定性、增強跨膜遞送、靶向特定位置或細胞類型、增加與靜默路徑酶類之相互作用、增加自內體之釋放等)。
在一些實施例中，本發明提供表2B之非修飾或非結合iRNA。在一些實施例中，本發明之RNAi藥劑具有如表2A中所提供之核苷酸序列，但缺乏表中所示之一或多個配位體或部分。配位體或部分(例如親脂性配位體或部分)可包括於本申請案中提供之任一位置中。
如本文所述之iRNA可含有與目標序列之一或多個錯配。在一些實施例中，如本文所述之iRNA含有不超過3個錯配。在一些實施例中，當iRNA之反義股含有與目標序列之錯配時，錯配區域不位於互補區域之中心。在一些實施例中，當iRNA之反義股含有與目標序列之錯配時，錯配侷限於互補區之5'端或3'端的最後5個核苷酸內。舉例而言，對於與MYOC區域互補的23個核苷酸之iRNA藥劑RNA股，該RNA股在中心13個核苷酸內一般不含任何錯配。本文所述之方法或此項技術中已知之方法可用於判定含有與目標序列之錯配的iRNA是否有效地抑制MYOC表現。考慮具有錯配之iRNA在抑制MYOC表現中之功效功效係重要的，尤其在已知MYOC基因中之特定互補區在群體內具有多態序列變異時。
在一些實施例中，dsRNA之至少一個末端具有1至4個，通常1或2個核苷酸之單股核苷酸突出物。在一些實施例中，具有至少一個核苷酸突出物之dsRNA相對於其鈍端對應物具有優良抑制特性。在一些實施例中，iRNA之RNA (例如dsRNA)經化學修飾以增強穩定性或其他有益特徵。本發明提供之核酸可藉由此項技術中充分確立之方法合成及/或修飾，諸如「Current protocols in nucleic acid chemistry」, Beaucage, S.L.等人(編), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, USA中所述之彼等方法，該文獻特此以引用的方式併入本文中。修飾包括例如(a)末端修飾，例如5'端修飾(磷酸化、結合、反向鍵聯等)、3'端修飾(結合、DNA核苷酸、反向鍵聯等)，(b)鹼基修飾，例如用穩定鹼基、失穩化鹼基或與譜系擴增之搭配物形成鹼基配對之鹼基置換，移除鹼基(無鹼基核苷酸)或經結合的鹼基，(c)糖修飾(例如在2'位置或4'位置處或具有非環狀糖)或糖置換，以及(d)主鏈修飾，包括磷酸二酯鍵聯之修飾或置換。適用於本發明之RNA化合物的特定實例包括但不限於含有經修飾主鏈或不含天然核苷間鍵聯之RNA。具有經修飾之主鏈之RNA尤其包括主鏈中不具有磷原子之彼等RNA。出於本說明書之目的，且如此項技術中有時提及，核苷內主鏈中不具有磷原子之經修飾之RNA亦可視為寡核苷。在特定實施例中，經修飾RNA之核苷間主鏈中將具有磷原子。
經修飾之dsRNA主鏈包括例如硫代磷酸酯；對掌性硫代磷酸酯；二硫代磷酸酯；磷酸三酯；胺基烷基磷酸三酯；甲基及其他烷基膦酸酯，包括3'-伸烷基膦酸酯及對掌性膦酸酯；亞膦酸酯；胺基磷酸酯，包括3'-胺基胺基磷酸酯及胺基烷基胺基磷酸酯；硫羰基胺基磷酸酯；硫羰基烷基磷酸三酯；具有標準3'-5'鍵聯之硼烷磷酸酯；此等物之2'-5'鍵聯類似物，及具有反轉極性者，其中相鄰的核苷單元對為3'-5'至5'-3'或2'-5'至5'-2'鍵聯。亦包括各種鹽、混合鹽及游離酸形式。
教示上述含磷鍵之製備的代表性美國專利包括但不限於美國專利第3,687,808號；第4,469,863號；第4,476,301號；第5,023,243號；第5,177,195號；第5,188,897號；第5,264,423號；第5,276,019號；第5,278,302號；第5,286,717號；第5,321,131號；第5,399,676號；第5,405,939號；第5,453,496號；第5,455,233號；第5,466,677號；第5,476,925號；第5,519,126號；第5,536,821號；第5,541,316號；第5,550,111號；第5,563,253號；第5,571,799號；第5,587,361號；第5,625,050號；第6,028,188號；第6,124,445號；第6,160,109號；第6,169,170號；第6,172,209號；第6,239,265號；第6,277,603號；第6,326,199號；第6,346,614號；第6,444,423號；第6,531,590號；第6,534,639號；第6,608,035號；第6,683,167號；第6,858,715號；第6,867,294號；第6,878,805號；第7,015,315號；第7,041,816號；第7,273,933號；第7,321,029號；及美國專利RE39464，該等文獻各自以引用的方式併入本文中。
其中不包括磷原子之經修飾之RNA主鏈具有由短鏈烷基或環烷基核苷間鍵、混合雜原子及烷基或環烷基核苷間鍵，或一或多個短鏈雜原子或雜環核苷間鍵形成之主鏈。此等物包括具有以下之彼等物：𠰌啉基鍵聯(部分地由核苷之糖部分形成)；矽氧烷主鏈；硫化物、亞碸及碸主鏈；甲醯基及硫甲醯基主鏈；亞甲基甲醯基及硫代甲乙醯基主鏈；含烯烴主鏈；胺基磺酸酯主鏈；亞甲基亞胺基及亞甲基肼基主鏈；磺酸酯及磺醯胺主鏈；醯胺主鏈；及具有混合N、O、S及CH 2組成部分之其他主鏈。
教示上述含寡核苷之製備的代表性美國專利包括但不限於美國專利第5,034,506號；第5,166,315號；第5,185,444號；第5,214,134號；第5,216,141號；第5,235,033號；第5,64,562號；第5,264,564號；第5,405,938號；第5,434,257號；第5,466,677號；第5,470,967號；第5,489,677號；第5,541,307號；第5,561,225號；第5,596,086號；第5,602,240號；第5,608,046號；第5,610,289號；第5,618,704號；第5,623,070號；第5,663,312號；第5,633,360號；第5,677,437號；及第5,677,439號，各文獻以引用的方式併入本文中。
在適於或預期用於iRNA中之其他RNA模擬物中，核苷酸單元之糖及核苷間鍵(亦即主鏈)置換為新基團。鹼基單元維持與適當核酸標靶化合物雜交。一種此類寡聚化合物，已展示具有極佳雜交特性之RNA模擬物，稱為肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，RNA之糖主鏈置換為含有醯胺之主鏈，特定言之胺基乙基甘胺酸主鏈。保留核鹼基且直接或間接結合至主鏈之醯胺部分的氮雜氮原子。教示製備PNA化合物之代表性美國專利包括(但不限於)美國專利第5,539,082號；第5,714,331號；及第5,719,262號，該等專利各以引用的方式併入本文中。PNA化合物之進一步教示可見於例如Nielsen等人, Science, 1991, 254, 1497-1500中。
本發明提供之一些實施例包括具有硫代磷酸酯主鏈之RNA及具有雜原子主鏈之寡核苷，且特定言之，上述美國專利第5,489,677號中之--CH 2--NH--CH 2--、--CH 2--N(CH 3)--O--CH 2-- [稱為亞甲基(甲基亞胺基)或MMI主鏈]、--CH 2--O--N(CH 3)--CH 2--、--CH 2--N(CH 3)--N(CH 3)--CH 2--及--N(CH 3)--CH 2--CH 2-- [其中原生磷酸二酯主鏈表示為--O--P--O--CH 2--]，及上述美國專利第5,602,240號中之醯胺主鏈。在一些實施例中，本文所提供之RNA具有上述美國專利第5,034,506號之𠰌啉基主鏈結構。
經修飾的RNA亦可含有一或多個經取代糖部分。本文提供之iRNA (例如dsRNA)可在2'位置處包括以下中之一者：OH；F；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中烷基、烯基及炔基可為經取代或未經取代之C 1至C 10烷基或C 2至C 10烯基及炔基。例示性適合修飾包括O[(CH 2) nO] mCH 3、O(CH 2). nOCH 3、O(CH 2) nNH 2、O(CH 2) nCH 3、O(CH 2) nONH 2及O(CH 2) nON[(CH 2) nCH 3)] 2，其中n及m為1至約10。在其他實施例中，dsRNA在2'位置處包括以下中之一者：C 1至C 10低碳數烷基、經取代之低碳數烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH 3、OCN、Cl、Br、CN、CF 3、OCF 3、SOCH 3、SO 2CH 3、ONO 2、NO 2、N 3、NH 2、雜環烷基、雜環烷芳基、胺基烷基胺基、聚烷基胺基、經取代之矽烷基、RNA裂解基團、報導基團、嵌入劑、改良iRNA之藥物動力學特性之基團，或改良iRNA之藥效學特性之基團，及具有類似特性之其他取代基。在一些實施例中，修飾包括2'-甲氧基乙氧基(2'-O--CH 2CH 2OCH 3，亦稱為2'-O-(2-甲氧基乙基)或2'-MOE) (Martin等人, Helv. Chim. Acta, 1995, 78:486-504)，亦即，烷氧基-烷氧基。另一例示性修飾為2'-二甲基胺基氧基乙氧基，亦即，O(CH 2) 2ON(CH 3) 2基團，亦稱為2'-DMAOE，及2'-二甲基胺基乙氧基乙氧基(在此項技術中亦稱為2'-O-二甲基及胺基乙氧基乙基或2'-DMAEOE)，亦即，2'-O-CH 2-O-CH 2-N(CH 2) 2。
在其他實施例中，iRNA藥劑包含一或多個(例如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個)非環狀核苷酸(或核苷)。在某些實施例中，有義股或反義股或有義股及反義股兩者每股包括少於五個非環狀核苷酸(例如每股四個、三個、兩個或一個非環狀核苷酸)。一或多個非環狀核苷酸可存在於例如iRNA藥劑之有義股或反義股或兩股之雙股區中；iRNA藥劑之有義股或反義股或兩股之5'端、3'端、5'與3'端處。在一些實施例中，一或多個非環狀核苷酸存在於有義股或反義股或兩者之位置1至8處。在一些實施例中，一或多個非環狀核苷酸存在於反義股之5'端之位置4至10 (例如位置6至8)處的反義股中。在一些實施例中，一或多個非環狀核苷酸存在於iRNA藥劑之一個或兩個3'端突出物處。
如本文所用之術語「非環狀核苷酸」或「非環狀核苷」係指具有非環狀糖，例如非環狀核糖的任何核苷酸或核苷。例示性非環狀核苷酸或核苷可包括核鹼基，例如天然存在或經修飾之核鹼基(例如如本文所述之核鹼基)。在某些實施例中，核糖碳(C1、C2、C3、C4或C5)中任一者之間的鍵獨立地或組合地不存在於核苷酸中。在一些實施例中，核糖環之C2-C3碳之間的鍵不存在，例如非環狀2'-3'-斷-核苷酸單體。在其他實施例中，C1-C2、C3-C4或C4-C5之間的鍵不存在(例如1'-2'、3'-4'或4'-5'-斷核苷酸單體)。例示性非環狀核苷酸揭示於US 8,314,227中，其以全文引用的方式併入本文中。舉例而言，非環狀核苷酸可包括US 8,314,227之圖1-2中之單體D-J中之任一者。在一些實施例中，非環狀核苷酸包括以下單體：
Figure 02_image016
其中鹼基為核鹼基，例如天然存在或經修飾之核鹼基(例如如本文所述之核鹼基)。
在某些實施例中，非環狀核苷酸可例如藉由使非環狀核苷酸偶合至另一部分(尤其例如配位體(例如GalNAc、膽固醇配位體)、烷基、多元胺、糖、多肽)經修飾或衍生。
在其他實施例中，iRNA藥劑包括一或多個非環狀核苷酸及一或多個LNA (例如如本文所述之LNA)。舉例而言，一或多個非環狀核苷酸及/或一或多個LNA可存在於有義股、反義股或兩者中。一個股中非環狀核苷酸之數目可與相對股中LNA之數目相同或不同。在某些實施例中，有義股及/或反義股包含少於五個位於雙股區或3'-突出物中之LNA (例如四個、三個、兩個或一個LNA)。在其他實施例中，一個或兩個LNA位於有義股之雙股區或3'-突出物中。或者，或組合的，有義股及/或反義股包含少於五個在雙股區或3'-突出物中之非環狀核苷酸(例如四個、三個、兩個或一個非環狀核苷酸)。在一些實施例中，iRNA藥劑之有義股在有義股之3'-突出物中包含一個或兩個LNA，且在iRNA藥劑之反義股之雙股區中包含一或兩個非環狀核苷酸(例如在反義股之5'端的位置4至10 (例如位置6-8))。
在其他實施例中，iRNA藥劑中包括一或多個非環狀核苷酸(單獨或外加一或多個LNA)引起以下中之一或多者(或全部)：(i)脫靶效應降低；(ii) RNAi中之隨從股參與減少；(iii)引導股對其目標mRNA之特異性提高；(iv)微RNA脫靶效應降低；(v)穩定性提高；或(vi) iRNA分子之抗分解性提高。
其他修飾包括2'-甲氧基(2'-OCH 3)、2'-5胺基丙氧基(2'-OCH 2CH 2CH 2NH 2)及2'-氟(2'-F)。亦可在iRNA之RNA上的其他位置處進行類似修飾，尤其是3'端核苷酸上或2'-5'連接dsRNA中之糖之3'位置及5'端核苷酸之5'位置。iRNA亦可具有糖模擬物，諸如環丁基部分置換戊呋喃糖。教示此類經修飾糖結構之製備的代表性美國專利包括但不限於美國專利第4,981,957號；5,118,800號；第5,319,080號；第5,359,044號；第5,393,878號；第5,446,137號；第5,466,786號；第5,514,785號；第5,519,134號；第5,567,811號；第5,576,427號；第5,591,722號；第5,597,909號；第5,610,300號；第5,627,053號；第5,639,873號；第5,646,265號；第5,658,873號；第5,670,633號；及第5,700,920號，其中某些專利與本申請案共同擁有，且該等專利各自以引用的方式併入本文中。
iRNA亦可包括核鹼基(此項技術中通常簡稱為「鹼基」)修飾或取代。如本文中所使用，「未經修飾」或「天然」核鹼基包括嘌呤鹼基腺嘌呤(A)及鳥嘌呤(G)，及嘧啶鹼基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)及尿嘧啶(U)。經修飾之核鹼基包括其他合成及天然核鹼基，諸如去氧胸腺嘧啶(dT)、5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羥基甲基胞嘧啶、黃嘌呤、次黃嘌呤、2-胺基腺嘌呤、腺嘌呤及鳥嘌呤之6-甲基及其他烷基衍生物、腺嘌呤及鳥嘌呤之2-丙基及其他烷基衍生物、2-硫基尿嘧啶、2-硫基胸腺嘧啶及2-硫基胞嘧啶、5-鹵基尿嘧啶及胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶及胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶及胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-鹵基、8-胺基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羥基及其他在8號位經取代之腺嘌呤及鳥嘌呤、5-鹵基(尤其5-溴、5-三氟甲基及其他在5號位經取代之尿嘧啶及胞嘧啶)、7-甲基鳥嘌呤及7-甲基腺嘌呤、8-氮雜鳥嘌呤及8-氮雜腺嘌呤、7-去氮雜鳥嘌呤及7-去氮雜腺嘌呤以及3-去氮雜鳥嘌呤及3-去氮雜腺嘌呤。
其他核鹼基包括美國專利第3,687,808號中所揭示之彼等核鹼基；Modified Nucleosides in Biochemistry, Biotechnology and Medicine, Herdewijn, P.編 Wiley-VCH, 2008中所揭示之彼等核鹼基；The Concise Encyclopedia of Polymer Science and Engineering, 第858-859頁, Kroschwitz, J. L編, John Wiley & Sons, 1990中所揭示之彼等核鹼基；Englisch等人, Angewandte Chemie, 國際版, 1991, 30, 613所揭示之此等核鹼基；及Sanghvi, Y S., 第15章, dsRNA Research and Applications, 第289-302頁, Crooke, S. T.及Lebleu, B.編, CRC Press, 1993中所揭示之彼等核鹼基。此等核鹼基中的某些核鹼基特別適用於增加本發明所提供之寡聚化合物的結合親和力。此等核鹼基包括在5號位經取代之嘧啶、6-氮雜嘧啶及在N-2、N-6及0-6號位經取代之嘌呤，包括2-胺基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶及5-丙炔基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶取代已顯示可使核酸雙螺旋體穩定性提高0.6至1.2℃ (Sanghvi, Y. S., Crooke, S. T.及Lebleu, B.編, DsRNA Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, 第276-278頁)且為例示性鹼基取代，更尤其與2'-O-甲氧基乙基糖修飾組合時。
教示某些上述經修飾核鹼基以及其他經修飾核鹼基之代表性美國專利包括但不限於上述美國專利第3,687,808號，以及美國專利第4,845,205號；5,130,30號；第5,134,066號；第5,175,273號；第5,367,066號；第5,432,272號；第5,457,187號；第5,459,255號；第5,484,908號；第5,502,177號；第5,525,711號；第5,552,540號；第5,587,469號；第5,594,121, 5,596,091號；第5,614,617號；第5,681,941號；第6,015,886號；第6,147,200號；第6,166,197號；第6,222,025號；第6,235,887號；第6,380,368號；第6,528,640號；第6,639,062號；第6,617,438號；第7,045,610號；第7,427,672號；及第7,495,088號，其各自以引用的方式併入本文中，及美國專利第5,750,692號，該專利亦以引用的方式併入本文中。
iRNA之RNA亦可經修飾以包括一或多個(例如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個)雙環糖部分。「雙環糖」為藉由兩個原子之橋聯修飾之呋喃醣基環。「雙環核苷」(「BNA」)為具有糖部分之核苷，該糖部分包含連接糖環之兩個碳原子的橋鍵，藉此形成雙環系統。在某些實施例中，橋鍵連接糖環之4'-碳與2'-碳。因此，在一些實施例中，本發明之試劑可包括一或多個鎖定核酸(LNA) (在本文中亦稱為「鎖核苷酸」)。在一些實施例中，鎖定核酸為具有經修飾核糖部分之核苷酸，其中核糖部分包含連接例如2'及4'碳的額外橋鍵。此結構將核糖有效地「鎖定」為3'-內結構構形。鎖定核酸添加至siRNA中已顯示可增加血清中的siRNA穩定性、增加熱穩定性及減少脫靶效應(Elmen, J.等人, (2005) Nucleic Acids Research33(1):439-447; Mook, OR.等人, (2007) Mol Canc Ther6(3):833-843; Grunweller, A. 等人, (2003) Nucleic Acids Research31(12):3185-3193)。
用於本發明之聚核苷酸的雙環核苷之實例包括但不限於包含4'與2'核糖基環原子之間的橋鍵的核苷。在某些實施例中，本發明之反義聚核苷酸試劑包括一或多個包含4'至2'橋鍵之雙環核苷。此類4'至2'橋接雙環核苷之實例包括但不限於4'-(CH2)—O-2' (LNA)；4'-(CH2)—S-2'；4'-(CH2)2—O-2' (ENA)；4'-CH(CH3)—O-2' (亦稱作「受限制的乙基」或「cEt」)及4'-CH(CH2OCH3)—O-2' (及其類似物；參見例如美國專利第7,399,845號)；4'-C(CH3)(CH3)—O-2' (及其類似物；參見例如美國專利第8,278,283號)；4'-CH2—N(OCH3)-2' (及其類似物；參見例如美國專利第8,278,425號)；4'-CH2—O—N(CH3)-2' (參見例如美國專利公開案第2004/0171570號)；4'-CH2—N(R)—O-2'，其中R為H、C1-C12烷基或保護基(參見例如美國專利第7,427,672號)；4'-CH2—C(H)(CH3)-2' (參見例如Chattopadhyaya等人 , J. Org. Chem., 2009, 74, 118-134)；及4'-CH2—C(═CH2)-2' (及其類似物；參見例如美國專利第8,278,426號)。前述中之每一者之內容以引用的方式併入本文中以用於本文提供之方法。教示鎖定核酸製備的代表性美國專利包括但不限於以下：美國專利第6,268,490號；第6,670,461號；第6,794,499號；第6,998,484號；第7,053,207號；第7,084,125號；第7,399,845號及第8,314,227號，其各自以全文引用的方式併入本文中。例示性LNA包括但不限於2',4'-C亞甲基雙環核苷酸(參見例如Wengel等人，國際PCT5公開案第WO 00/66604號及第WO 99/14226號)。
前述雙環核苷中之任一者可製備為具有一或多種立體化學糖組態，包括例如α-L-核呋喃糖及β-D-核呋喃糖(參見WO 99/14226)。
本發明之RNAi劑亦可經修飾以包括一或多個受限制乙基核苷酸。如本文所用，「受限制乙基核苷酸」或「cEt」為包含雙環糖部分之鎖定核酸，該雙環糖部分包含4'-CH(CH3)-0-2'橋。在一些實施例中，受限制乙基核苷酸呈在本文中稱為「S-cEt」之S構形。
本發明之RNAi劑亦可包括一或多個「構形受限核苷酸」(「CRN」)。CRN為核苷酸類似物，其具有連接核糖之C2'與C4'碳或核糖之C3'與C5'碳的連接子。CRN將核糖環鎖定成穩定構形且提高對mRNA之雜交親和力。連接子的長度足以將氧置放於對於穩定性及親和力最佳之位置中，從而產生較少核糖環皺折(puckering)。
教示某些上述CRN製備的代表性公開案包括但不限於US 2013/0190383；及WO 2013/036868，其中每一者之內容以引用的方式併入本文中以用於本文提供之方法。
在一些實施例中，本發明之RNAi劑包含一或多個為解鎖核酸(UNA)核苷酸之單體。UNA為解鎖非環狀核酸，其中已移除糖中之任一鍵，從而形成解鎖「糖」殘基。在一個實例中，UNA亦涵蓋C1'-C4'之間的鍵(亦即，C1'與C4'碳之間的共價碳-氧-碳鍵)已移除的單體。在另一實例中，糖之C2'-C3'鍵(亦即，C2'與C3'碳之間的共價碳-碳鍵)已移除(參見 Nuc. Acids Symp. Series, 52, 133-134 (2008)及Fluiter等人， Mol. Biosyst., 2009, 10, 1039)。
教示UNA製備的代表性美國公開案包括但不限於US8,314,227；及美國專利公開案第2013/0096289號；第2013/0011922號；及第2011/0313020號，其中每一者之內容以引用的方式併入本文中以用於本文提供之方法。
在其他實施例中，iRNA藥劑包括一或多個(例如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個) G-鉗核苷酸。G-鉗核苷酸為經修飾的胞嘧啶類似物，其中修飾賦予雙螺旋體內之互補鳥嘌呤的沃森-克里克(Watson-Crick)與胡斯坦(Hoogsteen)面以氫鍵鍵結能力，參見例如Lin及Matteucci, 1998, J. Am. Chem. Soc., 120, 8531-8532。寡核苷酸內之單個G-鉗類似物取代當與互補寡核苷酸雜交時，可引起實質上增強的螺旋熱穩定性及錯配辨別。此類核苷酸納入iRNA分子中可引起對核酸目標、互補序列或模板股之親和力及特異性提高。
RNA分子末端的潛在穩定化修飾可包括N-(乙醯基胺基己醯基)-4-羥基脯胺醇(Hyp-C6-NHAc)、N-(己醯基-4-羥基脯胺醇(Hyp-C6)、N-(乙醯基-4-羥基脯胺醇(Hyp-NHAc)、胸苷-2'-O-去氧胸苷(醚)、N-(胺基己醯基)-4-羥基脯胺醇(Hyp-C6-胺基)、2-二十二烷醯基-尿苷-3"-磷酸酯、反向鹼基dT (idT)及其他。此修飾之揭示內容可見於PCT公開案第WO 2011/005861號中。
本發明之RNAi劑之其他修飾包括5'磷酸酯或5'磷酸酯模擬物，例如RNAi劑之反義股上的5'末端磷酸酯或磷酸酯模擬物。適合的磷酸酯模擬物揭示於例如US 2012/0157511中，其內容以引用的方式併入本文中以用於本文提供之方法。在一個實施例中，本發明之雙股RNAi藥劑進一步在反義股之5'核苷酸包含5'-磷酸酯或5'-磷酸酯模擬物。在另一個實施例中，雙股RNAi藥劑進一步在反義股之5'核苷酸包含5'-磷酸酯模擬物。在一個特定實施例中，5'-磷酸酯模擬物為5'-乙烯基膦酸酯(5'-VP)。在一個實施例中，磷酸酯模擬物為5'-環丙基膦酸酯(VP)。在一些實施例中，雙股iRNA藥劑之反義股的5'端不含有5'-乙烯基膦酸酯(VP)。
在一個實施例中，至少一個經修飾之核苷酸係選自由以下組成之群：去氧核苷酸、2'-O-甲基修飾之核苷酸、2'-氟修飾之核苷酸、2'-去氧修飾之核苷酸、二醇修飾之核苷酸(GNA)(例如Ggn、Cgn、Tgn或Agn)、具有2'磷酸酯之核苷酸(例如G2p、C2p、A2p或U2p)，及乙烯基膦酸酯核苷酸；以及其組合。在其他實施例中，表5及6中之各種雙螺旋體可經特定修飾以提供本發明之另一種雙股iRNA藥劑。在一個實例中，各有義雙螺旋體之3'端可如下修飾：移除3'端L96配位體且使三個3'端核苷酸之間的兩個磷酸二酯核苷酸間鍵聯與硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯發生交換。亦即，下式之有義序列的三個3'端核苷酸(N)： 5'- N1-… -Nn-2Nn-1NnL96 3' 可置換為 5'- N1-… -Nn-2sNn-1sNn 3'。
RNA標靶可具有標靶RNA之核苷酸序列區域或跨距，該等區域比RNA標靶之其他區域相對更容易或更適合經由RNA干擾來介導RNA標靶裂解，該RNA干擾係藉由RNAi藥劑對該區域的結合來誘導。在此類「熱點區域」(或簡稱「熱點」)內對RNA干擾的敏感性增加意謂靶向該區域的iRNA藥劑在誘導iRNA干擾方面的功效可能高於靶向標靶RNA之其他區域的iRNA藥劑。舉例而言，不受理論束縛，標靶RNA之標靶區域的可及性可影響iRNA藥劑靶向該區域的功效，其中一些熱點區域的可及性增加。二級結構，例如RNA標靶中(例如熱點區域內或附近)形成的二級結構，可影響iRNA藥劑結合標靶區域及誘導RNA干擾的能力。
根據本發明之某些態樣，iRNA藥劑可設計成靶向本文所述之任一種標靶RNA之熱點區域，包括標靶RNA的任何已鑑別部分(例如特定外顯子)。如本文所用，熱點區域可指標靶RNA序列之約19-200、19-150、19-100、19-75、19-50、21-200、21-150、21-100、21-75、21-50、50-200、50-150、50-100、50-75、75-200、75-150、75-100、100-200或100-150個核苷酸區域，相對於靶向相同標靶RNA之其他區域，使用RNAi藥劑靶向該核苷酸區域提供可觀測到的更高有效靜默機率。根據本發明之某些態樣，熱點區域可包含標靶RNA的有限區域，且在一些情況下，可包含標靶的實質上有限區域，包括例如標靶RNA的小於一半長度，諸如標靶RNA長度的約5%、10%、15%、20%、25%或30%。反之，據以與熱點比較的其他區域可累積地包含至少大部分的標靶RNA長度。舉例而言，其他區域可累積地包含標靶RNA長度的至少約60%、或至少約70%、或至少約80%、或至少約90%、或至少約95%。
可利用活體外或活體內篩選分析法獲得的功效資料，憑經驗評價標靶RNA的比較區域以鑑別出熱點。舉例而言，可根據有效iRNA藥劑(例如被抑制的靶基因表現量，諸如根據mRNA表現或蛋白質表現所量測)結合各區域的頻率來比較靶向跨越標靶RNA之不同區域的RNAi藥劑。一般而言，可藉由觀測多種有效RNAi藥劑群集結合至RNA標靶之有限區域來識別熱點。因此，可藉由觀測iRNA藥劑的功效來充分表徵熱點，該等iRNA藥劑累積跨越被鑑別為熱點之標靶區域的至少約60%，諸如該區域長度的約70%、約80%、約90%或約95%或更多，包括該區域的兩端(亦即，iRNA藥劑靶向該區域內的至少約60%、70%、80%、90%或95%或更多核苷酸，包括該區域之各端的核苷酸)。根據本發明之一些態樣，對該區域(例如剩餘不超過約50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%或5% mRNA)展現至少約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%抑制的iRNA藥劑可鑑別為有效的。
亦可利用定義尺寸(例如25、30、40、50、60、70、80、90或100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200 nts)之不同區域之抑制量測結果的定量比較，評估靶向RNA區域的順應性。舉例而言，可測定各區域的平均抑制程度且可比較各區域的平均值。熱點區域內的平均抑制程度可實質上高於所有評價區域之平均抑制程度的平均值。根據一些態樣，熱點區域的平均抑制程度可比平均抑制程度的平均值高至少約10%、20%、30%、40%或50%。根據一些態樣，熱點區域的平均抑制程度可比平均抑制程度的平均值高至少約1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2.0個標準差。平均值抑制程度可提高統計顯著(例如p＜0.05)量。根據一些態樣，熱點區域內的各抑制量測值可高於臨限量(例如等於或低於剩餘mRNA的臨限量)。根據一些態樣，該區域內的各抑制量測值可實質上高於所有量測區域之所有抑制量測值的平均值。舉例而言，熱點區域的各抑制量測值可比所有抑制量測值之平均值高至少約10%、20%、30%、40%或50%。根據一些態樣，各抑制量測值可比所有抑制量測值之平均值高至少約1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2.0個標準差。各抑制量測值可比所有抑制量測值之平均值高統計顯著(例如p＜0.05)量。熱點評價標準可包含相容之上述標準的不同組合(例如至少約第一量的平均抑制程度且抑制量測值不低於小於第一量之第二量的臨限水準)。
因此，明確考慮了較佳可選擇靶向標靶RNA之熱點區域的任何iRNA藥劑，包括本文所述之特定例示性iRNA藥劑，用於對標靶mRNA誘導RNA干擾，因為相對於靶向不為熱點區域的區域，靶向此類熱點區域可能展現穩定的抑制反應。靶向基本上重疊(例如靶序列長度的至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%)之靶序列或較佳完全存在於熱點區域內之靶序列的RNAi藥劑可被認為靶向熱點區域。本發明之RNA標靶的熱點區域可包括其中本文所揭示之資料展現有效RNAi藥劑靶向頻率較高的任何區域，包括根據本文中在別處所述之任一標準的區域，不論此類熱點區域的範圍是否被明確指定。
在各種實施例中，本發明之dsRNA藥劑靶向編碼MYOC之mRNA的熱點區域。
III. iRNA 模體在本發明之某些態樣中，本發明之雙股RNAi藥劑包括具有化學修飾之藥劑，該等化學修飾如例如WO 2013/075035中所揭示，其內容以引用的方式併入本文中以用於本文提供之方法。如本文及WO 2013/075035中所示，可藉由將在三個連續核苷酸上具有三個相同修飾之一或多個模體引入至RNAi藥劑之有義股或反義股中，尤其在裂解位點處或附近而獲得優良結果。在一些實施例中，RNAi藥劑之有義股及反義股可以其他方式完全經修飾。此等模體之引入中斷有義股或反義股之修飾模式(若存在)。RNAi藥劑可視情況與親脂性部分或配位體，例如C16部分或配位體結合，例如在有義股上。RNAi藥劑可視情況經(S)-二醇核酸(GNA)修飾，例如在反義股之一或多個殘基上經修飾。所得RNAi藥劑呈現優良基因沉默活性。
在一些實施例中，有義股序列可為由式(I)表示： 5' n p-N a-(X X X ) i-N b-Y Y Y -N b-(Z Z Z ) j-N a-n q3' (I) 其中： i及j各自獨立地為0或1； p及q各自獨立地為0至6； 各N a獨立地表示包含0至25個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列，各序列包含至少兩個經不同方式修飾之核苷酸； 各N b獨立地表示包含0至10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列； 各n p及n q獨立地表示突出端核苷酸； 其中N b及Y不具有相同的修飾；且 XXX、YYY及ZZZ各自獨立地表示三個連續核苷酸上具有三種相同修飾的一個模體。在一些實施例中，YYY皆為經2'-F修飾之核苷酸。
在一些實施例中，N a及/或N b包含交替模式之修飾。
在一些實施例中，YYY模體存在於有義股之裂解位點處或附近。舉例而言，當RNAi藥劑具有長度為17至23個核苷酸的雙螺旋體區域時，YYY模體可存在於有義股之裂解位點處或附近(例如：可存在於位置6、7、8；7、8、9；8、9、10；9、10、11；10、11、12或11、12、13處)，計數始於5'端的第1個核苷酸；或視情況，計數始於雙螺旋體區域內相對於5'端的第1個成對核苷酸。
在一些實施例中，i為1且j為0，或i為0且j為1，或i與j均為1。有義股因此可由下式表示： 5' n p-N a-YYY-N b-ZZZ-N a-n q3'  (Ib)； 5' n p-N a-XXX-N b-YYY-N a-n q3'  (Ic)；或 5' n p-N a-XXX-N b-YYY-N b-ZZZ-N a-n q3'  (Id)。
當有義股由式(Ib)表示時，N b表示包含0-10、0-7、0-5、0-4、0-2或0個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。各N a可獨立地表示包含2-20、2-15或2-10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。
當有義股表示為(Ic)時，N b表示包含0-10、0-7、0-5、0-4、0-2或0個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。各N a可獨立地表示包含2-20、2-15或2-10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。
當有義股表示為式(Id)時，各N b獨立地表示包含0-10、0-7、0-5、0-4、0-2或0個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。在一些實施例中，N b為0、1、2、3、4、5或6。各N a可獨立地表示包含2-20、2-15或2-10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。
X、Y及Z中之每一者可彼此相同或不同。
在其他實施例中，i為0且j為0，且有義股可由下式表示： 5' n p-N a-YYY- N a-n q3'  (Ia)。
當有義股由式(Ia)表示時，各N a可獨立地表示包含2-20、2-15或2-10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。
在一些實施例中，RNAi之反義股序列可由式(Ie)表示： 5' n q'-N a'-(Z'Z'Z') k-N b'-Y'Y'Y'-N b'-(X'X'X') l-N' a-n p' 3' (Ie) 其中： k及l各自獨立地為0或1； p'及q'各自獨立地為0至6； 各N a'獨立地表示包含0至25個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列，各序列包含至少兩個經不同方式修飾之核苷酸； 各N b'獨立地表示包含0至10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列； 各n p'及n q'獨立地表示突出物核苷酸； 其中N b'及Y'不具有相同修飾； 且 X'X'X'、Y'Y'Y'及Z'Z'Z'各自獨立地表示三個連續核苷酸上之三種相同修飾中之一者。
在一些實施例中，N a'及/或N b'包含交替模式之修飾。
Y'Y'Y'模體存在於反義股之裂解位點處或附近。因此，當RNAi藥劑具有長度為17-23個核苷酸的雙螺旋體區域時，Y'Y'Y'模體可存在於反義股之位置9、10、11；10、11、12；11、12、13；12、13、14；或13、14、15處，其中計數始於5'端的第1個核苷酸開始；或視情況，計數始於雙螺旋體區域內相對於5'端的第1個成對核苷酸。在一些實施例中，Y'Y'Y'模體存在於位置11、12、13處。
在一些實施例中，Y'Y'Y'模體皆為經2'-OMe修飾之核苷酸。
在一個實施例中，k為1且l為0，或k為0且l為1，或5 k與l均為1。
反義股可因此由下式表示： 5' n q'-N a'-Z'Z'Z'-N b'-Y'Y'Y'-N a'n p' 3' (Ig)； 5' n q'-N a'-Y'Y'Y'-N b'-X'X'X'-n p' 3'  (Ih)；或 5' n q'-N a'- Z'Z'Z'-N b'-Y'Y'Y'-N b'- X'X'X'-N a'-n p' 3'  (Ii)。
當反義股由式(Ig)表示時，N b'表示包含0-10、0-7、0-5、0-4、0-2個或0個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。各N a'獨立地表示包含2-20、2-15或2-10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。
當反義股表示為式(Ii)時，各N b'獨立地表示包含0-10、0-7、0-5、0-4、0-2個或0個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。各N a'獨立地表示包含2-20、2-15或2-10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。在一些實施例中，N b為0、1、2、3、4、5或6。
在其他實施例中，k為0且l為0，且反義股可由下式表示： 5' n p'-N a'-Y'Y'Y'- N a'-n q' 3' (If)。
當反義股表示為式(If)時，各N a'獨立地表示包含2-20、2-15或2-10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。
X'、Y'及Z'中之每一者可彼此相同或不同。
有義股及反義股之各核苷酸可獨立地經LNA、HNA、CeNA、GNA、2'-甲氧基乙基、2'-O-甲基、2'-O-烯丙基、2'-C-烯丙基、2'-羥基或2'-氟修飾。舉例而言，有義股及反義股之各核苷酸獨立地經2'-O-甲基或2'-氟修飾。各X、Y、Z、X'、Y'及Z'尤其可表示2'-O-甲基修飾或2'-氟修飾。
在一些實施例中，當雙螺旋體區域具有21個nt時，RNAi藥劑之有義股可含有存在於有義股之9、10及11位置處的YYY模體，計數始於5'端的第1個核苷酸，或視情況，計數始於雙螺旋體區域內相對於5'端的第1個成對核苷酸；且Y表示2'-F修飾。有義股可在雙螺旋體區域之相對端另外含有XXX模體或ZZZ模體作為翼修飾；且XXX及ZZZ各自獨立地表示2'-OMe修飾或2'-F修飾。
在一些實施例中，反義股可為存在於該股之位置11、12、13的Y'Y'Y'模體，計數始於5'端的第1個核苷酸，或視情況，計數始於雙螺旋體區域內相對於5'端的第1個成對核苷酸；且Y'表示2'-O-甲基修飾。反義股可在雙螺旋體區域之相對端另外含有X'X'X'模體或Z'Z'Z'模體作為翼修飾；且X'X'X'及Z'Z'Z'各自獨立地表示2'-OMe修飾或2'-F修飾。
由上述式(Ia)、(Ib)、(Ic)及(Id)中之任一者表示的有義股分別與由式(If)、(Ig)、(Ih)及(Ii)中之任一者表示的反義股形成雙螺旋體。
因此，本發明方法中使用的某些RNAi藥劑可包含有義股及反義股，各股具有14至30個核苷酸，該RNAi雙螺旋體由式(Ij)表示： 有義股：5' n p-N a-(XXX)i -N b- YYY -N b-(ZZZ)j-N a-n q3' 反義股：3' n p'-Na'-(X'X'X')k-N b'-Y'Y'Y'-N b'-(Z'Z'Z') l-N a'-n q' 5' (Ij) 其中 i、j、k及l各自獨立地為0或1； p、p'、q及q'各自獨立地為0-6； 各N a及N a'獨立地表示包含0-25個經修飾之核苷酸之寡核苷酸序列，各序列包含至少兩個經不同方式修飾之核苷酸； 各N b及N b'獨立地表示包含0-10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列； 其中 各n p'、n p、n q'及n q，其中每一者可存在或可不存在，獨立地表示突出物核苷酸；且 XXX、YYY、ZZZ、X'X'X'、Y'Y'Y'及Z'Z'Z'各自獨立地表示三個連續核苷酸上具有三個相同修飾的一個模體。
在一些實施例中，i為0且j為0；或i為1且j為0；或i為0且j為1；或i與j均為0；或i與j均為1。在一些實施例中，k為0且l為0；或k為1且l為0；k為0且l為1；或k與l均為0；或k與l均為1。
形成RNAi雙螺旋體之有義股及反義股的例示性組合包括下式： 5' n p-N a-Y Y Y-N a-n q3' 3' n p' -N a'- Y'Y'Y'-N a'n q' 5' (Ik) 5' n p-N a-Y Y Y -N b-Z Z Z -N a-n q3' 3' n p-N a'- Y'Y'Y'-N b'- Z'Z'Z'- Na'-nq' 5' (Il) 5' n p-N a- X X X -N b- Y Y Y -N a-n q3' 3' n p-N a'- X'X'X' -N b'- Y'Y'Y'- Na'-n q' 5' (Im) 5' n p-N a- X X X -N b-Y Y Y - N b- Z Z Z-N a-n q3' 3' n p-N a'- X'X'X'-N b'- Y'Y'Y'-N b'- Z'Z'Z'-Na'-n q' 5' (In)
當RNAi藥劑由式(Ik)表示時，各N a獨立地表示包含2-20、2-15或2-10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。
當RNAi藥劑由式(Il)表示時，各N b獨立地表示包含1-10、1-7、1-5或1-4個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。各N a獨立地表示包含2-20、2-15或2-10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。
當RNAi藥劑用式(Im)表示時，各N b、N b'獨立地表示包含0-10、0-7、0-5、0-4、0-2或0個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。各N a獨立地表示包含2-20、2-15或2-10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。
當RNAi藥劑用式(In)表示時，各N b、N b'獨立地表示包含0-10、0-7、0-5、0-4、0-2或0個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。各N a、N a'獨立地表示包含2-20、2-15或2-10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。N a、N a'、N b及N b'中之每一者獨立地包含交替模式之修飾。
式(Ij)、(Ik)、(Il)、(Im)及(In)中之X、Y及Z中的每一者可彼此相同或不同。
當RNAi藥劑由式(Ij)、(Ik)、(Il)、(Im)及(In)表示時，至少一個Y核苷酸可與一個Y'核苷酸形成鹼基對。或者，至少兩個Y核苷酸與對應Y'核苷酸形成鹼基對；或所有三個Y核苷酸均與對應Y'核苷酸形成鹼基對。
當RNAi藥劑由式(Il)或(In)表示時，至少一個Z核苷酸可與一個Z'核苷酸形成鹼基對。或者，至少兩個Z核苷酸與對應Z'核苷酸形成鹼基對；或所有三個Z核苷酸皆與對應Y'核苷酸形成鹼基對。
當RNAi藥劑用式(Im)或(In)表示時，至少一個X核苷酸可與一個X'核苷酸形成鹼基對。或者，至少兩個X核苷酸與對應Y'核苷酸形成鹼基對；或所有三個X核苷酸皆與對應X'核苷酸形成鹼基對。
在一些實施例中，Y核苷酸上之修飾與Y'核苷酸上之修飾不同，Z核苷酸上之修飾與Z'核苷酸上之修飾不同及/或X核苷酸上之修飾與X'核苷酸上之修飾不同。
在一些實施例中，當RNAi藥劑由式(IIId)表示時，N a修飾為2'-O-甲基或2'-氟修飾。在一些實施例中，當RNAi藥劑由式(In)表示時，N a修飾為2'-O-甲基或2'-氟修飾且n p'＞0且至少一個n p'經由硫代磷酸酯鍵聯連接至相鄰核苷酸。在一些實施例中，當RNAi藥劑由式(In)表示時，N a修飾為2'-O-甲基或2'-氟修飾，n p'＞0且至少一個n p'經由硫代磷酸酯鍵聯連接至相鄰核苷酸，且有義股與一或多個部分或配位體(例如一或多個親脂性部分，視情況，一或多個C16部分或一或多個GalNAc部分)結合，該一或多個部分或配位體經由二價或三價分支連接子連接。在一些實施例中，當RNAi藥劑由式(In)表示時，N a修飾為2'-O-甲基或2'-氟修飾，n p'＞0且至少一個n p'經由硫代磷酸酯鍵聯連接至相鄰核苷酸，有義股包含至少一個硫代磷酸酯鍵聯，且有義股與一或多個部分或配位體(例如一或多個親脂性部分，視情況，一或多個C16部分，或一或多個GalNAc部分)結合，該一或多個部分或配位體經由二價或三價分支連接子連接。
在一些實施例中，當RNAi藥劑由式(IIIa)表示時，N a修飾為2'-O-甲基或2'-氟修飾，n p'＞0且至少一個n p'經由硫代磷酸酯鍵聯連接至相鄰核苷酸，有義股包含至少一個硫代磷酸酯鍵聯，且有義股與一或多個部分或配位體(例如一或多個親脂性部分，視情況，一或多個C16部分，或一或多個GalNAc部分)結合，該一或多個部分或配位體經由二價或三價分支連接子連接。
在一些實施例中，RNAi藥劑為含有至少兩個雙螺旋體的多聚體，該等雙螺旋體由式(Ij)、(Ik)、(Il)、(Im)及(In)表示，其中該等雙螺旋體藉由連接子連接。連接子可為可裂解或不可裂解的。視情況，多聚體進一步包含配位體。雙螺旋體各自可靶向相同基因或兩種不同基因；或雙螺旋體各自可靶向相同基因的兩個不同靶點。
在一些實施例中，RNAi藥劑為含有三個、四個、五個、六個或更多個雙螺旋體的多聚體，該等雙螺旋體由式(Ij)、(Ik)、(Il)、(Im)及(In)表示，其中該等雙螺旋體藉由連接子連接。連接子可為可裂解或不可裂解的。視情況，多聚體進一步包含配位體。雙螺旋體各自可靶向相同基因或兩種不同基因；或雙螺旋體各自可靶向相同基因的兩個不同靶點。
在一些實施例中，由式(Ij)、(Ik)、(Il)、(Im)及(In)表示的兩種RNAi藥劑在5'端及一或兩個3'端處彼此鍵聯，且視情況與配位體結合。藥劑各自可靶向相同基因或兩種不同基因；或藥劑各自可靶向相同基因的兩個不同靶點。
各種公開案描述可用於本發明之方法中的多聚RNAi藥劑。此類公開案包括WO2007/091269、WO2010/141511、WO2007/117686、WO2009/014887及WO2011/031520；及US 7858769，該等公開案各自的內容以引用的方式併入本文中以用於本文提供之方法。在某些實施例中，本發明之RNAi藥劑可包括GalNAc配位體。
如下文更詳細地描述，含有一或多個碳水化合物部分與RNAi藥劑之結合的RNAi藥劑可使RNAi藥劑之一或多種特性最佳化。在許多情況下，碳水化合物部分將連接於RNAi藥劑之經修飾之次單元。舉例而言，dsRNA藥劑之一或多個核糖核苷酸次單元之核糖可由另一部分置換，例如連接碳水化合物配位體之非碳水化合物(較佳環狀)載劑。其中次單元之核糖已如此置換之核糖核苷酸次單元在本文中稱為核糖置換修飾次單元(RRMS)。環狀載劑可為碳環系統，亦即所有環原子均為碳原子；或雜環系統，亦即一或多個環原子可為雜原子，例如氮、氧、硫。環狀載劑可為單環系統，或可含有兩個或更多個環，例如稠環。環狀載劑可為完全飽和環系統，或其可含有一或多個雙鍵。
配位體可經由載劑連接於聚核苷酸。載劑包括(i)至少一個「主鏈連接點」，較佳為兩個「主鏈連接點」及(ii)至少一個「系拴連接點」。如本文所用，「主鏈連接點」係指可用於且適於將載劑併入主鏈(例如核糖核酸之磷酸酯或經修飾之磷酸酯(例如含硫)主鏈)中的官能基，例如羥基，或通常為一鍵。在一些實施例中，「系拴連接點」(TAP)係指環狀載劑之組成環原子，例如碳原子或雜原子(與提供主鏈連接點之原子不同)，其連接選定部分。部分可為例如碳水化合物，例如單醣、雙醣、三醣、四醣、寡醣及多醣。所選部分視情況藉由介入繫鏈連接至環狀載劑。因此，環狀載劑將通常包括官能基，例如胺基，或通常提供鍵，其適於將另一化學個體(例如配位體)併入或系拴至組成環。
RNAi藥劑可經由載劑與配位體結合，其中該載劑可為環狀基團或非環狀基團；環狀基團較佳係選自吡咯啶基、吡唑啉基、吡唑啶基、咪唑啉基、咪唑啶基、哌啶基、哌𠯤基、[1,3]二氧雜環戊烷、㗁唑啶基、異㗁唑啶基、𠰌啉基、噻唑啶基、異噻唑啶基、喹喏啉基、嗒𠯤酮基、四氫呋喃基及十氫萘；非環狀基團較佳係選自絲胺醇主鏈或二乙醇胺主鏈。
在某些特定實施例中，本發明方法中使用的RNAi藥劑為選自表2A及2B中之任一者中所列之藥劑之群的藥劑。此等藥劑可進一步包含配位體。配位體可在3'端、5'端或兩端處連接至有義股、反義股或兩股。舉例而言，配位體可結合至有義股，特定言之，有義股之3'端。
IV. iRNA 結合物本文揭示之iRNA藥劑可呈結合物形式。結合物可在iRNA分子中之任何適合位置處連接，例如有義股或反義股之3'端或5'端。結合物視情況經由連接子連接。
在一些實施例中，本文所述之iRNA藥劑化學連接至一或多個配位體、部分或結合物，其可例如藉由影響(例如提高) iRNA之活性、細胞分佈或細胞攝入而賦予官能性。此類部分包括(但不限於)脂質部分，諸如膽固醇部分(Letsinger等人, Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 1989, 86: 6553-6556)；膽酸(Manoharan等人, Biorg. Med. Chem. Let., 1994, 4:1053-1060)；硫醚，例如己基-S-三苯甲基硫醇(Manoharan等人, Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306-309; Manoharan等人, Biorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765-2770)；硫代膽固醇(Oberhauser等人, Nucl. Acids Res., 1992, 20:533-538)；脂族鏈，例如十二烷二醇或十一烷基殘基(Saison-Behmoaras等人, EMBO J, 1991, 10:1111-1118; Kabanov等人, FEBS Lett., 1990, 259:327-330; Svinarchuk等人, Biochimie, 1993, 75:49-54)；磷脂，例如二-十六烷基-rac-甘油或三乙基銨1,2-二-O-十六烷基-rac-甘油-3-膦酸酯(Manoharan等人, Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654; Shea等人, Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777-3783)；聚胺或聚乙二醇鏈(Manoharan等人, Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969-973)；或金剛烷乙酸(Manoharan等人, Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654)；棕櫚基部分(Mishra等人, Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229-237)；或十八烷基胺或己胺基-羰氧基膽固醇部分(Crooke等人, J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923-937)。
在一些實施例中，配位體改變其所併入之iRNA藥劑的分佈、靶向或使用壽命。在一些實施例中，相較於例如不存在此類配位體之物種，配位體提供增強的針對所選目標(例如分子、細胞或細胞類型；隔室，例如細胞或器官隔室；身體之組織、器官或區域)之親和力。典型配位體將不參與雙螺旋體核酸中之雙螺旋體配對。
配位體可包括天然存在之物質，諸如蛋白質(例如人類血清白蛋白(HSA)、低密度脂蛋白(LDL)或球蛋白)；碳水化合物(例如聚葡萄糖、普魯蘭(pullulan)、幾丁質、聚葡萄胺糖、菊糖、環糊精或玻尿酸)；或脂質。配位體亦可為重組或合成分子，諸如合成聚合物，例如合成聚胺基酸。聚胺基酸之實例包括聚胺基酸為聚離胺酸(PLL)、聚L-天冬胺酸、聚L-麩胺酸、苯乙烯-順丁烯二酸酐共聚物、聚(L-丙交酯-共-乙交酯)共聚物、二乙烯醚-順丁烯二酸酐共聚物、N-(2-羥基丙基)甲基丙烯醯胺共聚物(HMPA)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚胺基甲酸酯、聚(2-乙基丙烯酸)、N-異丙基丙烯醯胺聚合物或聚磷腈。多元胺之實例包括：聚伸乙亞胺、聚離胺酸(PLL)、精胺、精脒、多元胺、偽肽-多元胺、肽模擬物多元胺、樹狀體多元胺、精胺酸、脒、魚精蛋白、陽離子脂質、陽離子卟啉、多元胺之四級鹽或α螺旋肽。
配位體亦可包括靶向基團，例如細胞或組織靶向劑，例如凝集素、糖蛋白、脂質或蛋白質，例如抗體，其結合於特定細胞類型，諸如腎細胞。靶向基團可為促甲狀腺素、促黑素、凝集素、醣蛋白、界面活性劑蛋白A、黏蛋白碳水化合物、多價乳糖、多價半乳糖、N-乙醯基-半乳糖胺、N-乙醯基-半乳糖胺多價甘露糖、多價海藻糖、糖基化聚胺基酸、多價半乳糖、運鐵蛋白、雙膦酸鹽、聚麩胺酸鹽、聚天冬胺酸、脂質、膽固醇、類固醇、膽酸、葉酸、維生素B12、生物素或RGD肽或RGD肽模擬物。
配位體之其他實例包括染料、嵌入劑(例如吖啶)、交聯劑(例如補骨脂素、絲裂黴素C (mitomycin C))、卟啉(TPPC4、德賽卟啉(texaphyrin)、賽卟啉(Sapphyrin))、多環芳族烴(例如吩𠯤、二氫吩𠯤)、人工核酸內切酶(例如EDTA)、親脂性分子，例如膽固醇、膽酸、金剛烷乙酸、1-芘丁酸、二氫睾酮、1,3-雙-O(十六烷基)丙三醇、四異戊二烯基氧基己基、十六烷基丙三醇、冰片(borneol)、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基、棕櫚酸、肉豆蔻酸、O3-(油醯基)石膽酸、O3-(油醯基)膽烯酸、二甲氧基三苯甲基或啡㗁𠯤)及肽結合物(例如觸足肽、Tat肽)、烷基化劑、磷酸酯、胺基、巰基、PEG (例如PEG-40K)、MPEG、[MPEG] 2、聚胺基、烷基、經取代烷基、放射性標記之標記物、酶、半抗原(例如生物素)、輸送/吸收促進劑(例如阿司匹林(aspirin)、維生素E、葉酸)、合成核糖核酸酶(例如咪唑、雙咪唑、組織胺、咪唑簇、吖啶-咪唑結合物、四氮雜大環之Eu3+錯合物)、二硝基苯基、HRP或AP。
配位體可為蛋白質，例如糖蛋白；或肽，例如對共配位體具有特異性親和力之分子；或抗體，例如結合於特定細胞類型，諸如眼細胞之抗體。配位體亦可包括激素及激素受體。其亦可包括非肽物種，諸如脂質、凝集素、碳水化合物、維生素、輔因子、多價乳糖、多價半乳糖、N-乙醯基-半乳胺糖、N-乙醯基-葡糖胺、多價甘露糖或多價岩藻糖。配位體可為例如脂多醣、p38 MAP激酶活化因子或NF-κB活化因子。
配位體可為例如藥物之物質，其可例如藉由破壞細胞之細胞骨架，例如藉由破壞細胞之微管、微絲及/或中間絲(intermediate filament)增強細胞對iRNA藥劑的攝取。藥物可為例如塔克酮(taxon)、長春新鹼(vincristine)、長春鹼(vinblastine)、細胞鬆弛素、諾考達唑(nocodazole)、傑普萘德(japlakinolide)、紅海海綿素A (latrunculin A)、毒傘素(phalloidin)、斯文萘德A(swinholide A)、引達喏新(indanocine)或美瑟文(myoservin)。
在一些實施例中，連接至如本文所述之iRNA的配位體用作藥物動力學調節劑(PK調節劑)。PK調節劑包括親脂體、膽酸、類固醇、磷脂類似物、肽、蛋白質結合劑、PEG、維生素等。例示性PK調節劑包括但不限於膽固醇、脂肪酸、膽酸、石膽酸、二烷基甘油酯、二醯基甘油酯、磷脂、鞘脂、萘普生(naproxen)、布洛芬(ibuprofen)、維生素E、生物素等。包含多個硫代磷酸酯鍵聯的寡核苷酸亦已知結合至血清蛋白質，因此主鏈中包含多個硫代磷酸酯鍵聯的短寡核苷酸(例如約5個鹼基、10個鹼基、15個鹼基或20個鹼基之寡核苷酸)亦適合作為本發明之配位體(例如作為PK調節配位體)。此外，結合血清組分(例如血清蛋白質)之適體亦適用作本文所述之實施例中的PK調節配位體。
本發明之配位體結合之寡核苷酸可藉由使用攜帶側位反應性官能基之寡核苷酸合成，該官能基諸如衍生自鍵聯分子連接至寡核苷酸(下文所述)。此反應性寡核苷酸可與市售配位體、經合成帶有多種保護基中之任一者的配位體或連接有鍵聯部分之配位體直接反應。
本發明之結合物中所用之寡核苷酸可藉由熟知固相合成技術方便地且常規地製備。用於此類合成之設備由若干供應商出售，包括例如Applied Biosystems (Foster City, Calif.)。可另外或替代地採用此項技術中已知用於此類合成之任何其他方式。亦已知使用類似技術製備其他寡核苷酸，諸如硫代磷酸酯及烷基化衍生物。
在本發明之配位體結合之寡核苷酸及帶有配位體分子之序列特異性鍵聯之核苷中，寡核苷酸及寡核苷可利用標準核苷酸或核苷前驅物，或已帶有鍵聯部分之核苷酸或核苷結合物前驅物、已帶有配位體分子之配位體-核苷酸或核苷-結合物前驅物，或帶有非核苷配位體之建構嵌段裝配至適合DNA合成器上。
當使用已具有連接部分之核苷酸-結合物前驅體時，通常完成序列特異性連接核苷的合成，且配位體分子隨後與連接部分反應以形成配位體結合寡核苷酸。在一些實施例中，藉由自動合成器使用配位體-核苷結合物衍生之胺基磷酸酯(除了市售且常規用於寡核苷酸合成之標準胺基磷酸酯及非標準胺基磷酸酯之外)合成本發明之寡核苷酸或連接核苷。
A. 親脂性部分在某些實施例中，親脂性部分為脂族、環狀(諸如脂環族)、或多環(諸如聚脂環化合物)，諸如類固醇(例如固醇)或直鏈或分支鏈脂族烴。親脂性部分可一般包含烴鏈，其可為環狀或非環狀的。烴鏈可包含各種取代基或一或多個雜原子，諸如氧或氮原子。此類親脂性脂族部分包括但不限於飽和或不飽和C 4-C 30烴(例如C 6-C 18烴)、飽和或不飽和脂肪酸、蠟(例如脂肪酸及脂肪二醯胺之一元醇酯)、萜烯類(例如，C 10萜烯、C 15倍半萜烯、C 20二萜烯、C 30三萜烯及C 40四萜烯)及其他聚脂環烴。舉例而言，親脂性部分可含有C 4-C 30烴鏈(例如C 4-C 30烷基或烯基)。在一些實施例中，親脂性部分含有飽和或不飽和C 6-C 18烴鏈(例如直鏈C 6-C 18烷基或烯基)。在一些實施例中，親脂性部分含有飽和或不飽和C16烴鏈(例如直鏈C16烷基或烯基)。
親脂性部分可藉由此項技術中已知之任何方法連接至RNAi藥劑，包括經由已存在於親脂性部分中或引入至RNAi藥劑中之官能基，諸如羥基(例如-CO-CH 2-OH)。已存在於親脂性部分中或引入至RNAi藥劑中之官能基包括但不限於羥基、胺、羧酸、磺酸酯、磷酸酯、硫醇、疊氮基及炔。
RNAi藥劑與親脂性部分之結合可例如經由羥基與烷基R-、烷醯基RCO-或經取代之胺甲醯基RNHCO-之間形成醚或羧基或胺甲醯基酯鍵聯來發生。烷基R可為環狀的(例如環己基)或非環狀的(例如直鏈或分支鏈的；及飽和或不飽和的)。烷基R可為丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基或十八烷基或其類似基團。
在一些實施例中，親脂性部分經由連接子與雙股RNAi藥劑結合，連接子含有醚、硫醚、脲、碳酸酯、胺、醯胺、馬來醯亞胺-硫醚、二硫化物、磷酸二酯、磺醯胺鍵、點擊反應之產物(例如，來自疊氮化物-炔環加成之三唑)或胺基甲酸酯。
在另一個實施例中，親脂性部分為類固醇，諸如固醇。類固醇為含有全氫-1,2-環戊菲環系統之多環化合物。類固醇包括但不限於膽汁酸(例如膽酸、去氧膽酸及去氫膽酸)、皮質酮、地高辛(digoxigenin)、睪固酮、膽固醇及陽離子類固醇，諸如皮質酮。「膽固醇衍生物」係指例如藉由取代、添加或移除取代基衍生自膽固醇之化合物。
在另一個實施例中，親脂性部分為芳族部分。在此上下文中，術語「芳族」泛指單芳烴及多芳烴。芳基包括但不限於包含一至三個芳環之C 6-C 14芳基部分，其可視情況經取代；包含與烷基共價連接之芳基的「芳烷基」或「芳基烷基」，其中之任一者可獨立地視情況經取代或未經取代；及「雜芳基」。如本文所用，術語「雜芳基」係指具有5至14個環原子，較佳5、6、9或10個環原子；在環陣列中共有6、10或14個π電子，且除碳原子外亦具有一至約三個選自由氮(N)、氧(O)及硫(S)組成之群之雜原子的基團。
如本文所用，「經取代之」烷基、環烷基、芳基、雜芳基或雜環基為具有一至約四個、較佳一至約三個、更佳一或兩個非氫取代基之基團。適合取代基包括但不限於鹵基、羥基、硝基、鹵烷基、烷基、烷芳基、芳基、芳烷基、烷氧基、芳氧基、胺基、醯胺基、烷基胺甲醯基、芳基胺甲醯基、胺基烷基、烷氧基羰基、羧基、羥烷基、烷磺醯基、芳磺醯基、烷磺醯胺基、芳磺醯胺基、芳烷基磺醯胺基、烷基羰基、醯氧基、氰基及脲基。
在一些實施例中，親脂性部分為芳烷基，例如2-芳基丙醯基部分。芳烷基之結構特徵經選擇以使得親脂性部分將在活體內與至少一種蛋白質結合。在某些實施例中，芳烷基之結構特徵經選擇以使得親脂性部分與血清、血管或細胞蛋白結合。在某些實施例中，芳烷基之結構特徵促進與白蛋白、免疫球蛋白、脂蛋白、α-2-巨球蛋白或α-1-糖蛋白之結合。
在某些實施例中，配位體為萘普生或萘普生之結構衍生物。合成萘普生(naproxen)之程序可見於美國專利第3,904,682號及美國專利第4,009,197號，該等美國專利以全文引用之方式併入本文中。萘普生之化學名稱為(S)-6-甲氧基-α-甲基-2-萘乙酸，且結構為
Figure 02_image018
。
在某些實施例中，配位體為布洛芬或布洛芬之結構衍生物。合成布洛芬之程序可見於US3,228,831中，其以引用的方式併入本文中以用於本文提供之方法。布洛芬之結構為
Figure 02_image020
。
其他例示性芳烷基說明於US 7,626,014中，其以引用的方式併入本文中以用於本文提供之方法。
在另一個實施例中，適合之親脂性部分包括脂質、膽固醇、視黃酸、膽酸、金剛烷乙酸、1-芘丁酸、二氫睪固酮、1,3-雙-O(十六烷基)甘油、香葉氧基己醇、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基、棕櫚酸、肉豆蔻酸、O3-(油醯基)石膽酸、O3-(油醯基)膽烯酸、布洛芬、萘普生、二甲氧基三苯甲基或啡㗁𠯤。
在某些實施例中，雙股RNAi藥劑中可併入超過一個親脂性部分，特別是當親脂性部分具有低親脂性或疏水性時。在一些實施例中，兩個或更多個親脂性部分併入至雙股RNAi藥劑之同一股中。在一些實施例中，雙股RNAi藥劑之各股具有一或多個併入之親脂性部分。在一些實施例中，兩個或更多個親脂性部分併入至雙股RNAi藥劑之相同位置(亦即，相同核鹼基、相同糖部分或相同核苷間鍵)。此可藉由例如經由載體結合二個或更多個親脂性部分，及/或經由分支鏈連接子結合二個或更多個親脂性部分，及/或經由一或多個連接子結合二個或更多個親脂性部分，使得一或多個連接子連續連接親脂性部分結合來達成。
親脂性部分可經由直接連接於RNAi藥劑之核糖而與RNAi藥劑結合。或者，親脂性部分可經由連接子或載體與雙股RNAi藥劑結合。
在某些實施例中，親脂性部分可經由一或多個連接子(繫鏈)與RNAi藥劑結合。
在一些實施例中，親脂性部分經由連接子與雙股RNAi藥劑結合，連接子含有醚、硫醚、脲、碳酸酯、胺、醯胺、馬來醯亞胺-硫醚、二硫化物、磷酸二酯、磺醯胺鍵、點擊反應之產物(例如，來自疊氮化物-炔環加成之三唑)或胺基甲酸酯。
B. 脂質結合物在一些實施例中，配位體為脂質或基於脂質之分子。此類脂質或基於脂質之分子通常可結合血清蛋白質，諸如人類血清白蛋白(HSA)。HSA結合配位體允許結合物經由血管分佈至目標組織中。例如，目標組織可為眼睛。可結合HSA之其他分子亦可用作配位體。舉例而言，可使用萘普生(neproxin)或阿司匹林。脂質或基於脂質之配位體可(a)提高結合物之降解抗性，(b)增強向目標細胞或細胞膜之靶向或輸送，及/或(c)可用於調節與血清蛋白質(例如HAS)之結合。
基於脂質之配位體可用於調節，例如控制(例如抑制)結合物與目標組織之結合。舉例而言，更牢固結合於HSA之脂質或基於脂質之配位體將較不可能被靶向至腎且因此較不可能被自身體清除。較不牢固結合於HSA之脂質或基於脂質之配位體可用於將結合物靶向至腎。
在一些實施例中，基於脂質之配位體結合HSA。舉例而言，配位體可以足以增強結合物在非腎組織中之分佈的親和力結合HAS。然而，親和力通常沒有強到HSA-配位體結合不可逆轉之程度。
在一些實施例中，基於脂質之配位體與HSA之結合較弱或根本不結合，使得結合物向腎之分佈增強。靶向腎細胞之其他部分亦可用於代替基於脂質之配位體或與基於脂質之配位體一起使用。
在另一態樣中，配位體為例如維生素之部分，其藉由例如增生細胞之目標細胞吸收。其尤其適用於治療特徵在於例如惡性或非惡性類型，例如癌細胞的不合需要細胞增殖之病症。例示性維生素包括維生素A、E及K。其他例示性維生素包括B族維生素，例如葉酸、B12、核黃素、生物素、吡哆醛或癌細胞吸收之其他維生素或養分。亦包括HSA及低密度脂蛋白(LDL)。
C. 細胞滲透劑在另一態樣中，配位體為細胞滲透劑，諸如螺旋細胞滲透劑。在一些實施例中，藥劑為兩親媒性的。例示性藥劑為肽，諸如tat或觸足肽。若藥劑為肽，則其可經修飾，包括肽模擬物、反演體(invertomer)、非肽或假肽鍵，及使用D-胺基酸。螺旋劑通常為α-螺旋劑，且可具有親脂相及疏脂相。
配位體可為肽或肽模擬物。肽模擬物(在本文中亦稱為寡肽模擬物)為能夠摺疊成與天然肽類似之經界定三維結構的分子。肽及肽模擬物與iRNA藥劑之連接可諸如藉由增強細胞識別及吸收影響iRNA之藥物動力學分佈。肽或肽模擬物部分長度可為約5-50個胺基酸，例如長度為約5、10、15、20、25、30、35、40、45或50個胺基酸。
肽或肽模擬物可為例如細胞滲透肽、陽離子肽、兩性肽或疏水性肽(例如主要由Tyr、Trp或Phe組成)。肽部分可為樹狀體肽、受限制肽或交聯肽。在另一替代方案中，肽部分可包括疏水性膜易位序列(MTS)。例示性疏水性含MTS肽為具有胺基酸序列AAVALLPAVLLALLAP (SEQ ID NO: 3)的RFGF。含有疏水性MTS的RFGF類似物(例如胺基酸序列AALLPVLLAAP (SEQ ID NO: 4))亦可為靶向部分。肽部分可為「遞送」肽，其可攜帶大型極性分子，包括肽、寡核苷酸及蛋白質穿過細胞膜。舉例而言，已發現HIV Tat蛋白(GRKKRRQRRRPPQ (SEQ ID NO: 5))及果蠅觸角足( Drosophila Antennapedia)蛋白(RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO: 6))之序列能夠充當遞送肽。肽或肽模擬物可藉由隨機DNA序列編碼，諸如自噬菌體呈現庫或一珠粒一化合物(OBOC)組合庫鑑別之肽(Lam等人, Nature, 354:82-84, 1991)。通常，經由併入之單體單元繫栓至dsRNA藥劑之肽或肽模擬物為細胞靶向肽，諸如精胺酸-甘胺酸-天冬胺酸(RGD)肽或RGD模擬物。肽部分之長度可在約5個胺基酸至約40個胺基酸的範圍內。肽部分可具有結構修飾，諸如以提高穩定性或引導構形特性。可利用下文所述之結構修飾中之任一者。
用於本發明之組合物及方法中之RGD肽可為直鏈或環狀的，且可經修飾(例如糖基化或甲基化)以促進靶向特定組織。含RGD之肽及肽模擬物可包括D-胺基酸，以及合成RGD模擬物。除RGD以外，可使用靶向整合素配位體之其他部分。在一些實施例中，此配位體之結合物靶向PECAM-1或VEGF。
RGD肽部分可用於靶向特定細胞類型，例如腫瘤細胞，諸如內皮腫瘤細胞或乳癌腫瘤細胞(Zitzmann等人, Cancer Res., 62:5139-43, 2002)。RGD肽可促進dsRNA藥劑靶向至多種其他組織，包括肺、腎、脾或肝之腫瘤(Aoki等人，Cancer Gene Therapy 8:783-787, 2001)。通常，RGD肽將促進iRNA藥劑靶向至腎。RGD肽可為線性或環狀肽，且可經修飾，例如糖基化或甲基化，以促進靶向至特定組織。舉例而言，糖基化RGD肽可將iRNA藥劑遞送至表現α Vß 3之腫瘤細胞(Haubner等人, Jour. Nucl. Med., 42:326-336, 2001)。
「細胞滲透肽」能夠滲透細胞，例如微生物細胞，諸如細菌或真菌細胞，或哺乳動物細胞，諸如人類細胞。微生物細胞滲透肽可為，例如α-螺旋線性肽(例如LL-37或Ceropin P1)、含有二硫鍵之肽(例如α-防禦素、β-防禦素或牛抗菌肽(bactenecin))，或僅含有一或兩個主要胺基酸之肽(例如PR-39或肽抗生素(indolicidin))。細胞滲透肽亦可包括核定位信號(NLS)。舉例而言，細胞滲透肽可為二分體兩親媒性肽(諸如MPG)，其源自HIV-1 gp41之融合肽域及SV40大T抗原之NLS (Simeoni等人, Nucl. Acids Res.31:2717-2724, 2003)。
D. 碳水化合物結合物及配位體在本發明之組合物及方法的一些實施例中，iRNA寡核苷酸進一步包含碳水化合物。如本文所述，碳水化合物結合之iRNA有利於核酸以及適用於活體內治療用途之組合物的活體內遞送。如本文所用，「碳水化合物」係指為由一或多個具有至少6個碳原子之單醣單元(其可為直鏈、分支鏈或環狀)與鍵結至各碳原子之氧、氮或硫原子構成的碳水化合物本身之化合物；或具有由一或多個各自具有至少六個碳原子之單醣單元(其可為直鏈、分支鏈或環狀)與鍵結至各碳原子之氧、氮或硫原子構成的碳水化合物作為一部分之化合物。代表性碳水化合物包括糖(含有約4、5、6、7、8或9個單醣單元之單醣、雙醣、三醣及寡醣)及多醣，諸如澱粉、肝糖、纖維素及多醣膠。特定單醣包括C5及C5以上(例如C5、C6、C7或C8)糖；二醣及三醣，包括具有兩個或三個單醣單元之糖(例如C5、C6、C7或C8)。
在某些實施例中，本發明之組合物及方法包括C16配位體。在例示性實施例中，本發明之C16配位體具有以下結構(在下文針對尿嘧啶鹼基例示，但考慮到C16配位體之連接用於呈現任何鹼基(C、G、A等)或具有如本文中所呈現之任何其他修飾的核苷酸，其限制條件為保留2'核糖連接)且在如此修飾之殘基內的核糖之2'位置處連接：
Figure 02_image022
如上所示，C16配位體修飾之殘基在如此修飾之例示性殘基(此處為尿嘧啶)之2'-核糖位置處呈現直鏈烷基。
在一些實施例中，本發明之RNAi藥劑之碳水化合物結合物進一步包含如上文所述之一或多種其他配位體，諸如但不限於PK調節劑或細胞滲透肽。
適用於本發明之額外碳水化合物結合物(及連接子)包括WO 2014/179620及WO 2014/179627中所述之彼等，該等文獻中之每一者的全部內容以引用之方式併入本文中。
在某些實施例中，本發明之組合物及方法包括如本文所描述之RNAi劑之膦酸乙烯酯(VP)修飾。在例示性實施例中，本發明之膦酸乙烯酯具有以下結構：
Figure 02_image024
本發明之膦酸乙烯酯可連接於本發明之dsRNA的反義股或有義股。在某些較佳實施例中，本發明之膦酸乙烯酯連接至dsRNA之反義股，視情況在dsRNA之反義股的5'端處連接。dsRNA藥劑可在有義股或反義股之5'端處包含含磷基團。5'端含磷基團可為5'端磷酸酯(5'-P)、5'端硫代磷酸酯(5'-PS)、5'端二硫代磷酸酯(5'-PS2)、5'端膦酸乙烯酯(5'-VP)、5'端甲基膦酸酯(MePhos)或5'-去氧-5'-C-丙二醯基。當5'端含磷基團為5'端乙烯基膦酸酯(5'-VP)時，5'-VP可為5'-E-VP異構體(亦即，反式乙烯基膦酸酯，
Figure 02_image026
)、5'-Z-VP異構體(亦即，順式乙烯基膦酸酯，
Figure 02_image028
)或其混合物。
磷酸乙烯酯修飾亦考慮用於本發明之組合物及方法。例示性磷酸乙烯酯結構為：
Figure 02_image030
在一些實施例中，碳水化合物結合物包含單醣。在一些實施例中，單醣為N-乙醯基半乳胺糖(GalNAc)。包含一或多種N-乙醯基半乳胺糖(GalNAc)衍生物之GalNAc結合物描述於例如美國專利第8,106,022號中，其全部內容以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，GalNAc結合物用作使iRNA靶向特定細胞之配位體。在一些實施例中，GalNAc結合物例如藉由用做肝臟細胞(例如肝細胞)之去唾液酸醣蛋白受體之配位體使iRNA靶向肝臟細胞。
在一些實施例中，碳水化合物結合物包含一或多種GalNAc衍生物。GalNAc衍生物可經由連接子(例如二價或三價分支鏈連接子)連接。在一些實施例中，GalNAc結合物與有義股之3'端結合。在一些實施例中，GalNAc結合物經連接子(例如如本文所述之連接子)結合至iRNA藥劑(例如有義股之3'端)。
在一些實施例中，GalNAc結合物為
Figure 02_image032
式II。
在一些實施例中，RNAi藥劑經由如以下示意圖所示之連接子連接至碳水化合物結合物，其中X為O或S
Figure 02_image034
在一些實施例中，RNAi藥劑與如表1所定義及下文所示之L96結合：
Figure 02_image036
在一些實施例中，用於本發明之組合物及方法中之碳水化合物結合物係選自由以下組成之群：
Figure 02_image038
式II，
Figure 02_image040
式III，
Figure 02_image042
式IV，
Figure 02_image044
式V，
Figure 02_image046
式VI，
Figure 02_image048
式VII，
Figure 02_image050
式VIII，
Figure 02_image052
式IX，
Figure 02_image054
式X，
Figure 02_image056
式XI，
Figure 02_image058
式XII，
Figure 02_image060
式XIII，
Figure 02_image062
式XIV，
Figure 02_image064
式XV，
Figure 02_image066
式XVI，
Figure 02_image068
式XVII，
Figure 02_image070
式XVIII，
Figure 02_image072
式XIX，
Figure 02_image074
式XX，
Figure 02_image076
式XXI，
Figure 02_image078
式XXII。
用於本文所述實施例中之另一代表性碳水化合物結合物包括但不限於：
Figure 02_image080
(式XXIII)，當X或Y中之一者為寡核苷酸時，另一者為氫。
在一些實施例中，碳水化合物結合物進一步包含如上文所述之一或多種額外配位體，諸如(但不限於)PK調節劑及/或細胞滲透肽。
在一些實施例中，本發明之iRNA經由連接子與碳水化合物結合。具有本發明之組合物及方法之連接子的iRNA碳水化合物結合物之非限制性實例包括但不限於：
Figure 02_image082
(式XXIV)，
Figure 02_image084
(式XXV)，
Figure 02_image086
(式XXVI)，
Figure 02_image088
(式XXVII)，
Figure 02_image090
(式XXVIII)，
Figure 02_image092
(式XXIX)，及
Figure 02_image094
(式XXX)，當X或Y中之一者為寡核苷酸時，另一者為氫。
E. 熱失穩化修飾在某些實施例中，dsRNA分子可藉由在反義股之種子區中(亦即在反義股之5'端的位置2至9處)併入熱失穩化修飾來針對RNA干擾進行優化，以減少或抑制脫靶基因靜默。已發現，具有在自5'端計數反義股之前9個核苷酸位置內包含雙螺旋體之至少一個熱失穩化修飾的反義股之dsRNA具有降低的脫靶基因緘默化活性。因此，在一些實施例中，反義股在反義股之5'區之前9個核苷酸位置內包含雙螺旋體之至少一個(例如一個、兩個、三個、四個、五個或更多個)熱失穩化修飾。在一些實施例中，雙螺旋體之一或多個熱失穩化修飾位於自反義股之5'端開始的位置2-9，或較佳位置4-8。在一些其他實施例中，雙螺旋體之一或多個熱失穩化修飾位於自反義股之5'端的位置6、7或8處。在又一些其他實施例中，雙螺旋體之熱失穩化修飾位於自反義股之5'端的位置7處。術語「熱失穩化修飾」包括在較低整體解鏈溫度(Tm) (較佳為比不具有此類修飾之dsRNA的Tm低1、2、3或4度的Tm下將由dsRNA產生的修飾。在一些實施例中，雙螺旋體之熱失穩化修飾位於自反義股之5'端開始的位置2、3、4、5或9處。
熱失穩化修飾可以包括(但不限於)無鹼基修飾；與相對股中之相對核苷酸的錯配；及糖修飾，諸如2'-去氧修飾或非環狀核苷酸，例如解鎖核酸(UNA)或二醇核酸(GNA)。
例示性無鹼基修飾包括但不限於以下：
Figure 02_image096
其中R = H、Me、Et或OMe；R' = H、Me、Et或OMe；R" = H、Me、Et或OMe
Figure 02_image098
其中B為經修飾或未經修飾之核鹼基。
例示性糖修飾包括但不限於以下：
Figure 02_image100
其中B為經修飾或未經修飾之核鹼基。
在一些實施例中，雙螺旋體之熱失穩化修飾係選自由以下組成之群：
Figure 02_image102
其中B為經修飾或未經修飾之核鹼基，且各結構上之星號表示 R、 S或外消旋。
術語「非環狀核苷酸」係指具有非環狀核糖之任何核苷酸，例如，其中核糖碳之間的鍵中之任一者(例如，C1'-C2'、C2'-C3'、C3'-C4'、C4'-O4'或C1'-O4')不存在或核糖碳或氧中之至少一者(例如，C1'、C2'、C3'、C4'或O4')獨立地或組合地不存在於核苷酸中。在一些實施例中，非環狀核苷酸為
Figure 02_image104
Figure 02_image106
，其中B為經修飾或未經修飾之核鹼基，R 1及R 2獨立地為H、鹵素、OR 3或烷基；且R 3為H、烷基、環烷基、芳基、芳烷基、雜芳基或糖)。術語「UNA」係指解鎖的非環狀核酸，其中糖之任何鍵已移除，形成解鎖的「糖」殘基。在一個實例中，UNA亦涵蓋C1'-C4'之間的鍵(亦即，C1'與C4'碳之間的碳-氧-碳共價鍵)移除的單體。在另一實例中，糖之C2'-C3'鍵(亦即C2'與C3'碳之間的碳-碳共價鍵)被移除(參見Mikhailov等人, Tetrahedron Letters, 26 (17): 2059 (1985)；及Fluiter等人, Mol. Biosyst., 10: 1039 (2009)，該等文獻特此以全文引用之方式併入)。非環狀衍生物提供較大的主鏈柔性而不影響沃森-克里克配對。非環狀核苷酸可經由2'-5'或3'-5'鍵連接。
術語『GNA』係指二醇核酸，其為與DNA或RNA類似，但其「主鏈」組成不同的聚合物，其由藉由磷酸二酯鍵連接之重複甘油單元構成：
Figure 02_image108
。
雙螺旋體之熱失穩化修飾可為dsRNA雙螺旋體內之熱失穩化核苷酸與相對股中之相對核苷酸之間的錯配(亦即，非互補鹼基對)。例示性錯配鹼基對包括G:G、G:A、G:U、G:T、A:A、A:C、C:C、C:U、C:T、U:U、T:T、U:T或其組合。此項技術中已知的其他錯配鹼基對亦適合於本發明。錯配可發生在天然存在之核苷酸或經修飾之核苷酸的核苷酸之間，亦即，錯配鹼基配對可獨立於核苷酸之核糖上的修飾發生在各別核苷酸之核鹼基之間。在某些實施例中，dsRNA分子在錯配的對中含有至少一個為2'-去氧核鹼基的核鹼基；例如，2'-去氧核鹼基處於有義股中。
在一些實施例中，反義股之種子區中之雙螺旋體的熱失穩化修飾包括與目標mRNA上之互補鹼基的W-C H鍵受損的核苷酸，諸如：
Figure 02_image110
。
無鹼基核苷酸、非環狀核苷酸修飾(包括UNA及GNA)及錯配修飾之更多實例已詳細描述於WO 2011/133876中，其以全文引用之方式併入本文中。
熱失穩化修飾亦可包括具有降低或消除的與相對鹼基形成氫鍵之能力的通用鹼基，以及磷酸酯修飾。
在一些實施例中，雙螺旋體之熱失穩化修飾包括具有非典型鹼基之核苷酸，諸如但不限於具有減弱或完全消除的與相對股中之鹼基形成氫鍵之能力的核鹼基修飾。此等核鹼基修飾已針對dsRNA雙螺旋體之中心區的失穩化進行評價，如WO 2010/0011895中所述，其以全文引用之方式併入本文中。例示性核鹼基修飾為：
Figure 02_image112
在一些實施例中，雙螺旋體在反義股之種子區中的熱失穩化修飾包括一或多個與目標mRNA上之鹼基互補的一或多個α-核苷酸，諸如：
Figure 02_image114
其中R為H、OH、OCH 3、F、NH 2、NHMe、NMe 2或O-烷基。
已知與天然磷酸二酯鍵聯相比降低dsRNA雙螺旋體之熱穩定性的例示性磷酸酯修飾為：
Figure 02_image116
R基團之烷基可為C 1-C 6烷基。R基團之特定烷基包括但不限於甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、戊基及己基。
如熟習此項技術者將認識到，鑒於核鹼基之功能性作用係限定本發明之RNAi藥劑之特異性，儘管核鹼基修飾可以如本文中所描述之各種方式進行，例如：將失穩化修飾引入本發明之RNAi藥劑中，例如用於相對於脫靶效應增強中靶效應之目的，但可以利用且通常存在於本發明之RNAi藥劑上的修飾範圍對非核鹼基修飾(例如聚核糖核苷酸之糖基團或磷酸酯主鏈之修飾)而言往往要大得多。此類修飾更詳細地描述於本發明之其他部分中且明確地考慮用於本發明之RNAi藥劑，其具有原生核鹼基或如上文或本文別處所述之經修飾核鹼基。
除包含熱失穩化修飾之反義股以外，dsRNA亦可包含一或多個穩定化修飾。舉例而言，dsRNA可包含至少兩個(例如兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個)穩定化修飾。在無限制之情況下，穩定化修飾可皆存在於一個股中。在一些實施例中，有義股及反義股兩者均包含至少兩個穩定化修飾。穩定化修飾可存在於有義股或反義股之任何核苷酸上。舉例而言，穩定化修飾可存在於有義股或反義股上之每個核苷酸上；各穩定化修飾可依交替模式存在於有義股或反義股上；或有義股或反義股包含呈交替模式之兩種穩定化修飾。有義股上之穩定化修飾之交替模式可與反義股相同或不同，且有義股上之穩定化修飾之交替模式可相對於反義股上之穩定化修飾之交替模式具有偏移。
在一些實施例中，反義股包含至少兩個(例如兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個)穩定化修飾。在無限制的情況下，反義股中之穩定化修飾可存在於任何位置。
在一些實施例中，反義股在相對於5'端的位置2、6、8、9、14及16包含穩定化修飾。在一些其他實施例中，反義股在相對於5'端的位置2、6、14及16包含穩定化修飾。在又一些其他實施例中，反義股在相對於5'端的位置2、14及16包含穩定化修飾。
在一些實施例中，反義股包含與失穩化修飾相鄰之至少一個穩定化修飾。舉例而言，穩定化修飾可為失穩化修飾之5'端或3'端的核苷酸，亦即，相對於失穩化修飾位置，在位置-1或+1處的核苷酸。在一些實施例中，反義股包含失穩化修飾之5'端及3'端中之每一者處的穩定化修飾，亦即，相對於失穩化修飾位置，在位置-1及+1處的穩定化修飾。
在一些實施例中，反義股在失穩化修飾之3'端(亦即，相對於失穩化修飾位置，在位置+1及+2)包含至少兩個穩定化修飾。
在一些實施例中，有義股包含至少兩個(例如兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個)穩定化修飾。在無限制的情況下，有義股中之穩定化修飾可存在於任何位置。在一些實施例中，有義股在相對於5'端之位置7、10及11包含穩定化修飾。在一些其他實施例中，有義股在相對於5'端之位置7、9、10及11包含穩定化修飾。在一些實施例中，有義股包含在與自反義股之5'端開始計數的反義股之位置11、12及15相對或互補之位置處的穩定化修飾。在一些其他實施例中，有義股包含在與自反義股之5'端開始計數的反義股之位置11、12、13及15相對或互補之位置處的穩定化修飾。在一些實施例中，有義股包含兩個、三個或四個穩定化修飾之嵌段。
在一些實施例中，有義股不包含在與反義股中之雙螺旋體之熱失穩化修飾相對或互補之位置中的穩定化修飾。
例示性熱穩定化修飾包括但不限於2'-氟修飾。其他熱穩定化修飾包括但不限於LNA。
在一些實施例中，本發明之dsRNA包含至少四個(例如四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個) 2'-氟核苷酸。在無限制之情況下，2'-氟核苷酸可皆存在於一股中。在一些實施例中，有義股及反義股兩者均包含至少兩個2'-氟核苷酸。2'-氟修飾可存在於有義股或反義股之任何核苷酸上。舉例而言，2'-氟修飾可發生於有義股或反義股上之每個核苷酸上；各2'-氟修飾可以交替模式發生於有義股或反義股上；或有義股或反義股包含呈交替模式之兩種2'-氟修飾。有義股上之2'-氟修飾之交替模式可與反義股相同或不同，且有義股上之2'-氟修飾之交替模式可相對於反義股上之2'-氟修飾之交替模式具有偏移。
在一些實施例中，反義股包含至少兩個(例如，兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個) 2'-氟核苷酸。在無限制的情況下，反義股中之2'-氟修飾可存在於任何位置。在一些實施例中，反義股在相對於5'端的位置2、6、8、9、14及16包含2'-氟核苷酸。在一些其他實施例中，反義股在相對於5'端的位置2、6、14及16包含2'-氟核苷酸。在又一些其他實施例中，反義股在相對於5'端的位置2、14及16包含2'-氟核苷酸。
在一些實施例中，反義股包含與失穩化修飾相鄰之至少一個2'-氟核苷酸。舉例而言，2'-氟核苷酸可為位於失穩化修飾之5'端或3'端的核苷酸，亦即，相對於失穩化修飾位置，在位置-1或+1處的核苷酸。在一些實施例中，反義股在失穩化修飾之5'端及3'端中的每一端(亦即，相對於失穩化修飾位置，在位置-1及+1)包含2'-氟核苷酸。
在一些實施例中，反義股在失穩化修飾之3'端(亦即，相對於失穩化修飾位置，在位置+1及+2)包含至少兩個2'-氟核苷酸。
在一些實施例中，有義股包含至少兩個(例如兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個) 2'-氟核苷酸。在無限制的情況下，有義股中之2'-氟修飾可存在於任何位置。在一些實施例中，反義股在相對於5'端之位置7、10及11包含2'-氟核苷酸。在一些其他實施例中，有義股在相對於5'端之位置7、9、10及11包含2'-氟核苷酸。在一些實施例中，有義股包含在與自反義股之5'端開始計數的反義股之位置11、12及15相對或互補之位置處的2'-氟核苷酸。在一些其他實施例中，有義股包含在與自反義股之5'端開始計數的反義股之位置11、12、13及15相對或互補之位置處的2'-氟核苷酸。在一些實施例中，有義股包含兩個、三個或四個2'-氟核苷酸之嵌段。
在一些實施例中，有義股不包含在與反義股中之雙螺旋體之熱失穩化修飾相對或互補之位置中的2'-氟核苷酸。
在一些實施例中，本發明之dsRNA分子包含21個核苷酸(nt)之有義股及23個核苷酸(nt)之反義股，其中反義股含有至少一個熱失穩化核苷酸，其中至少一個熱失穩化核苷酸存在於反義股之種子區中(亦即，在反義股之5'端的位置2至9處)，其中dsRNA之一端係鈍端，而另一端包含2 nt突出物，且其中dsRNA視情況進一步具有以下特徵中之至少一者(例如一者、兩者、三者、四者、五者、六者或所有七者)：(i)反義股包含2、3、4、5或6個2'-氟修飾；(ii)反義股包含1、2、3、4或5個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯；(iii)有義股與配位體結合；(iv)有義股包含2、3、4或5個2'-氟修飾；(v)有義股包含1、2、3、4或5個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯；(vi) dsRNA包含至少四個2'-氟修飾；及(vii) dsRNA在反義股之5'端處包含鈍端。較佳地，2 nt突出物位於反義股之3'端。
在一些實施例中，dsRNA分子之有義股及反義股中之每一核苷酸可經修飾。各核苷酸可經相同或不同修飾來修飾，修飾可包括非連接型磷酸酯氧中之一或兩者或連接型磷酸酯氧中之一或多者的一或多種變化；核糖組分(例如核糖上的2'羥基)之變化；磷酸酯部分被「去磷酸化」連接子成批置換；天然存在之鹼基的修飾或置換；及核糖-磷酸酯主鏈之置換或修飾。
由於核酸為次單元之聚合物，許多修飾存在於核酸內重複之位置，例如鹼基或磷酸酯部分或磷酸酯部分之非連接O之修飾。在一些情況下，修飾將發生於核酸中之所有目標位置處，但在許多情況下並非如此。舉例而言，修飾可僅發生於3'或5'端位置，可僅發生於末端區域，例如在末端核苷酸上之位置處或在股之最後2、3、4、5或10個核苷酸中。修飾可發生於雙股區域、單股區域或兩者中。修飾可僅發生於RNA之雙股區域中或可僅發生於RNA之單股區域中。舉例而言，非連接O位置處之硫代磷酸酯修飾可僅發生於一個或兩個末端處，可僅發生於末端區域，例如在末端核苷酸上之位置處或在股之最後2、3、4、5或10個核苷酸中，或可發生於雙股及單股區域中，尤其在末端。5'端可經磷酸化。
其可能例如為了增強穩定性，在突出物中包括特定鹼基或在單股突出物中，例如在5'或3'突出物或兩者中包括經修飾之核苷酸或核苷酸代替物。舉例而言，可能需要在突出物中包括嘌呤核苷酸。在一些實施例中，3'或5'突出物中之所有或一些鹼基可經修飾，例如經本文中所描述之修飾來修飾。修飾可包括例如使用此項技術中已知之修飾在核糖之2'位置處進行修飾，例如使用去氧核糖核苷酸，經2'-去氧-2'-氟(2'-F)或2'-O-甲基修飾置換核鹼基之核糖；及磷酸酯基中之修飾，例如硫代磷酸酯修飾。突出物無需與目標序列同源。
在一些實施例中，有義股及反義股中之各殘基獨立地經LNA、HNA、CeNA、2'-甲氧基乙基、2'-O-甲基、2'-O-烯丙基、2'-C-烯丙基、2'-去氧或2'-氟修飾。股可含有超過一個修飾。在一些實施例中，有義股及反義股之各殘基獨立地經2'-O-甲基或2'-氟修飾。應理解，此等修飾為除反義股中存在之雙螺旋體之至少一個熱失穩化修飾之外的修飾。
有義股及反義股上通常存在至少兩個不同修飾。彼等兩個修飾可為2'-去氧、2'-O-甲基或2'-氟修飾、非環狀核苷酸或其他修飾。在一些實施例中，有義股及反義股各自包含兩個選自2'-O-甲基或2'-去氧的經不同修飾之核苷酸。在一些實施例中，有義股及反義股之各殘基獨立地經2'-O-甲基核苷酸、2'-去氧核苷酸、2'-去氧-2'-氟核苷酸、2'-O-N-甲基乙醯胺基(2'-O-NMA)核苷酸、2'-O-二甲基胺基乙氧基乙基(2'-O-DMAEOE)核苷酸、2'-O-胺基丙基(2'-O-AP)核苷酸或2'-ara-F核苷酸修飾。同樣，應理解，此等修飾為除存在於反義股中之雙螺旋體之至少一個熱失穩化修飾之外的修飾。
在一些實施例中，本發明之dsRNA分子包含交替模式之修飾，特定言之在B1、B2、B3、B1'、B2'、B3'、B4'區域中。如本文所用，術語「交替模體」或「交替模式」係指具有一或多個修飾，各修飾存在於一股之交替核苷酸上之模體。交替核苷酸可指每隔一個核苷酸有一個或每三個核苷酸有一個，或類似模式。舉例而言，若A、B及C各自表示對核苷酸之一種修飾類型，則交替模體可為「ABABABABABAB…」、「AABBAABBAABB…」、「AABAABAABAAB…」、「AAABAAABAAAB…」、「AAABBBAAABBB…」或「ABCABCABCABC…」等。
交替模體中所含之修飾類型可相同或不同。舉例而言，若A、B、C、D各自表示對核苷酸之一種修飾類型，則交替模式(亦即每隔一個核苷酸上之修飾)可相同，但有義股或反義股中之每一者可選自交替模體內之若干修飾可能性，諸如「ABABAB…」、「ACACAC…」、「BDBDBD…」或「CDCDCD…」等。
在一些實施例中，本發明之dsRNA分子包含相對於反義股上交替模體之修飾模式偏移的有義股上交替模體的修飾模式。偏移可使得有義股之核苷酸之經修飾群組對應於反義股之核苷酸之經不同修飾群組，且反之亦然。舉例而言，有義股當在與dsRNA雙螺旋體中之反義股成對時，在雙螺旋體區域內，有義股中的交替模體可始於「ABABAB」(該股的5'-3')且反義股中的交替模體可始於「BABABA」(該股的3'-5')。作為另一實例，在雙螺旋體區域內，有義股中之交替模體可始於「AABBAABB」(該股的5'-3')，且反義股中的交替模體可始於「BBAABBAA」(該股的3'-5')，使得修飾模式在有義股與反義股之間存在完全或部分的漂移。
本發明之dsRNA分子可進一步包含至少一個硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯。硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯修飾可存在於股之任何位置中有義股或反義股或兩個股之任何核苷酸上。舉例而言，核苷酸間鍵聯修飾可發生於有義股或反義股之每個核苷酸上；各核苷酸間鍵聯修飾可以交替模式發生於有義股或反義股上；或有義股或反義股包含呈交替模式之兩種核苷酸間鍵聯修飾。有義股上之核苷酸間鍵聯修飾之交替模式可與反義股相同或不同，且有義股上之核苷酸間鍵聯修飾之交替模式可相對於反義股上之核苷酸間鍵聯修飾之交替模式具有偏移。
在一些實施例中，dsRNA分子在突出物區中包含硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯修飾。舉例而言，突出物區包含兩個核苷酸，在兩個核苷酸之間具有硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯。亦可進行核苷酸間鍵聯修飾以將突出物核苷酸與雙螺旋體區域內之末端配對核苷酸連接。舉例而言，至少2、3、4個或所有突出物核苷酸可經由硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯連接，且視情況可存在連接突出物核苷酸與緊靠突出物核苷酸之配對核苷酸的額外硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯。舉例來說，末端三個核苷酸之間可存在至少兩個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯，其中三個核苷酸中之兩個為突出物核苷酸，且第三個為緊靠突出物核苷酸之配對核苷酸。較佳地，此等末端三個核苷酸可處於反義股之3'端。
在一些實施例中，dsRNA分子之有義股包含由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16個磷酸酯核苷酸間鍵聯分離的1至10個具有二至十個硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯之嵌段，其中硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯中之一者置於寡核苷酸序列中之任何位置，且該有義股與包含硫代磷酸酯、甲基膦酸酯及磷酸酯核苷酸間鍵聯之任何組合的反義股或包含硫代磷酸酯或甲基膦酸酯或磷酸酯鍵之反義股配對。
在一些實施例中，dsRNA分子之反義股包含被1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18個磷酸酯核苷酸間鍵聯分隔的兩個硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯之兩個嵌段，其中硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯中之一者定位於寡核苷酸序列中之任何位置，且該反義股與包含硫代磷酸酯、甲基膦酸酯及磷酸酯核苷酸間鍵聯之任何組合的有義股或包含硫代磷酸酯或甲基膦酸酯或磷酸酯鍵聯之反義股成對。
在一些實施例中，dsRNA分子之反義股包含由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16個磷酸酯核苷酸間鍵聯分離的兩個具有三個硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯之嵌段，其中硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯中之一者置於寡核苷酸序列中之任何位置，且該反義股與包含硫代磷酸酯、甲基膦酸酯及磷酸酯核苷酸間鍵聯之任何組合的有義股或包含硫代磷酸酯或甲基膦酸酯或磷酸酯鍵之反義股配對。
在一些實施例中，dsRNA分子之反義股包含由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14個磷酸酯核苷酸間鍵聯分離的兩個具有四個硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯之嵌段，其中硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯中之一者置於寡核苷酸序列中之任何位置，且該反義股與包含硫代磷酸酯、甲基膦酸酯及磷酸酯核苷酸間鍵聯之任何組合的有義股或包含硫代磷酸酯或甲基膦酸酯或磷酸酯鍵之反義股配對。
在一些實施例中，dsRNA分子之反義股包含由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個磷酸酯核苷酸間鍵聯分離的兩個具有五個硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯之嵌段，其中硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯中之一者置於寡核苷酸序列中之任何位置，且該反義股與包含硫代磷酸酯、甲基膦酸酯及磷酸酯核苷酸間鍵聯之任何組合的有義股或包含硫代磷酸酯或甲基膦酸酯或磷酸酯鍵之反義股配對。
在一些實施例中，dsRNA分子之反義股包含由1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個磷酸酯核苷酸間鍵聯分離的兩個具有六個硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯之嵌段，其中硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯中之一者置於寡核苷酸序列中之任何位置，且該反義股與包含硫代磷酸酯、甲基膦酸酯及磷酸酯核苷酸間鍵聯之任何組合的有義股或包含硫代磷酸酯或甲基膦酸酯或磷酸酯鍵之反義股配對。
在一些實施例中，dsRNA分子之反義股包含由1、2、3、4、5、6、7或8個磷酸酯核苷酸間鍵聯分離的兩個具有七個硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯之嵌段，其中硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯中之一者置於寡核苷酸序列中之任何位置，且該反義股與包含硫代磷酸酯、甲基膦酸酯及磷酸酯核苷酸間鍵聯之任何組合的有義股或包含硫代磷酸酯或甲基膦酸酯或磷酸酯鍵之反義股配對。
在一些實施例中，dsRNA分子之反義股包含由1、2、3、4、5或6個磷酸酯核苷酸間鍵聯分離的兩個具有八個硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯之嵌段，其中硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯中之一者置於寡核苷酸序列中之任何位置，且該反義股與包含硫代磷酸酯、甲基膦酸酯及磷酸酯核苷酸間鍵聯之任何組合的有義股或包含硫代磷酸酯或甲基膦酸酯或磷酸酯鍵之反義股配對。
在一些實施例中，dsRNA分子之反義股包含由1、2、3或4個磷酸酯核苷酸間鍵聯分離的兩個具有九個硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯之嵌段，其中硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯中之一者置於寡核苷酸序列中之任何位置，且該反義股與包含硫代磷酸酯、甲基膦酸酯及磷酸酯核苷酸間鍵聯之任何組合的有義股或包含硫代磷酸酯或甲基膦酸酯或磷酸酯鍵之反義股配對。
在一些實施例中，本發明之dsRNA分子進一步在有義股或反義股之1-10個末端位置內包含一或多個硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯修飾。舉例而言，至少2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸可經由硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯在有義股或反義股之一端或兩端連接。
在一些實施例中，本發明之dsRNA分子進一步在有義股或反義股中之每一者之雙螺旋體之內部區域之位置1-10內包含一或多個硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯修飾。舉例而言，至少2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸可經由硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯在自有義股之5'端開始計數的雙螺旋體區域之位置8-16處連接；dsRNA分子可視情況在末端位置之位置1-10內進一步包含一或多個硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯修飾。
在一些實施例中，本發明之dsRNA分子進一步包含有義股之位置1-5內的一至五個硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯修飾及位置18-23內的一至五個硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯修飾(自5'端計數)，以及反義股之位置1及2處的一至五個及位置18-23內的一至五個硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯修飾(自5'端計數)。
在一些實施例中，本發明之dsRNA分子進一步包含有義股之位置1-5內的一個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯修飾及位置18-23內的一個硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯修飾在(自5'端計數)，以及反義股之位置1及2處的一個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯修飾及位置18-23內的兩個硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯修飾在(自5'端計數)。
在一些實施例中，本發明之dsRNA分子進一步包含有義股之位置1-5內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯修飾及位置18-23內的一個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯修飾在(自5'端計數)，以及反義股之位置1或2處的一個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯修飾及位置18-23內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯修飾(自5'端計數)。
在一些實施例中，本發明之dsRNA分子進一步包含有義股之位置1-5內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯修飾及位置18-23內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯修飾(自5'端計數)，以及反義股之位置1及2處的一個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯修飾及位置18-23內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯修飾(自5'端計數)。
在一些實施例中，本發明之dsRNA分子進一步包含有義股之位置1-5內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯修飾及位置18-23內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯修飾(自5'端計數)，以及反義股之位置1及2處的一個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯修飾及位置18-23內的一個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯修飾(自5'端計數)。
在一些實施例中，本發明之dsRNA分子進一步包含有義股之位置1-5內的一個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯修飾及位置18-23內的一個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯修飾在(自5'端計數)，以及反義股之位置1及2處的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯修飾及位置18-23內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯修飾在(自5'端計數)。
在一些實施例中，本發明之dsRNA分子進一步包含有義股之位置1-5內的一個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯修飾及位置18-23內的一個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯修飾在(自5'端計數)，以及反義股之位置1及2處的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯修飾及位置18-23內的一個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯修飾(自5'端計數)。
本發明之dsRNA分子進一步包含有義股之位置1-5內的一個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯修飾(自5'端計數)，以及反義股之位置1及2處的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯修飾及位置18-23內的一個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯修飾(自5'端計數)。
本發明之dsRNA分子進一步包含有義股之位置1-5內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯修飾(自5'端計數)，以及反義股之位置1及2處的一個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯修飾及位置18-23內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯修飾(自5'端計數)。
在一些實施例中，本發明之dsRNA分子進一步包含有義股之位置1-5內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯修飾及位置18-23內的一個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯修飾(自5'端計數)，以及反義股之位置1及2處的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯修飾及位置18-23內的一個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯修飾(自5'端計數)。
在一些實施例中，本發明之dsRNA分子進一步包含有義股之位置1-5內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯修飾及位置18-23內的一個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯修飾(自5'端計數)，以及反義股之位置1及2處的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯修飾及位置18-23內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯修飾(自5'端計數)。
在一些實施例中，本發明之dsRNA分子進一步包含有義股之位置1-5內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯修飾及位置18-23內的一個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯修飾(自5'端計數)，以及反義股之位置1或2處的一個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯修飾及位置18-23內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯修飾(自5'端計數)。
在一些實施例中，本發明之dsRNA分子進一步包含有義股之位置1及2處的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯修飾及位置20及21處的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯修飾在(自5'端計數)，以及反義股之位置1處的一個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯修飾及位置21處的一個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯修飾(自5'端計數)。
在一些實施例中，本發明之dsRNA分子進一步包含有義股之位置1處的一個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯修飾及位置21處的一個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯修飾(自5'端計數)，以及反義股之位置1及2處的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯修飾及位置20及21處的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯修飾(自5'端計數)。
在一些實施例中，本發明之dsRNA分子進一步包含有義股之位置1及2處的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯修飾及位置21及22處的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯修飾(自5'端計數)，以及反義股之位置1處的一個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯修飾及位置21處的一個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯修飾(自5'端計數)。
在一些實施例中，本發明之dsRNA分子進一步包含有義股之位置1處的一個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯修飾及位置21處的一個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯修飾(自5'端計數)，以及反義股之位置1及2處的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯修飾及位置21及22處的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯修飾(自5'端計數)。
在一些實施例中，本發明之dsRNA分子進一步包含有義股之位置1及2處的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯修飾及位置22及23處的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯修飾(自5'端計數)，以及反義股之位置1處的一個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯修飾及位置21處的一個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯修飾(自5'端計數)。
在一些實施例中，本發明之dsRNA分子進一步包含有義股之位置1處的一個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯修飾及位置21處的一個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯修飾(自5'端計數)，以及反義股之位置1及2處的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯修飾及位置22及23處的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯修飾(自5'端計數)。
在一些實施例中，本發明化合物包含主鏈對掌性中心模式。在一些實施例中，主鏈對掌性中心的共同模式包含至少5個呈Sp組態之核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，主鏈對掌性中心的共同模式包含至少6個呈Sp組態之核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，主鏈對掌性中心的共同模式包含至少7個呈Sp組態之核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，主鏈對掌性中心的共同模式包含至少8個呈Sp組態之核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，主鏈對掌性中心的共同模式包含至少9個呈Sp組態之核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，主鏈對掌性中心的共同模式包含至少10個呈Sp組態之核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，主鏈對掌性中心的共同模式包含至少11個呈Sp組態之核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，主鏈對掌性中心的共同模式包含至少12個呈Sp組態之核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，主鏈對掌性中心的共同模式包含至少13個呈Sp組態之核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，主鏈對掌性中心的共同模式包含至少14個呈Sp組態之核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，主鏈對掌性中心的共同模式包含至少15個呈Sp組態之核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，主鏈對掌性中心的共同模式包含至少16個呈Sp組態之核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，主鏈對掌性中心的共同模式包含至少17個呈Sp組態之核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，主鏈對掌性中心的共同模式包含至少18個呈Sp組態之核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，主鏈對掌性中心的共同模式包含至少19個呈Sp組態之核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，主鏈對掌性中心的共同模式包含不超過8個呈Rp組態之核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，主鏈對掌性中心的共同模式包含不超過7個呈Rp組態之核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，主鏈對掌性中心的共同模式包含不超過6個呈Rp組態之核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，主鏈對掌性中心的共同模式包含不超過5個呈Rp組態之核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，主鏈對掌性中心的共同模式包含不超過4個呈Rp組態之核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，主鏈對掌性中心的共同模式包含不超過3個呈Rp組態之核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，主鏈對掌性中心的共同模式包含不超過2個呈Rp組態之核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，主鏈對掌性中心的共同模式包含不超過1個呈Rp組態之核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，主鏈對掌性中心的共同模式包含不超過8個非對掌性核苷酸間鍵聯(作為非限制性實例，磷酸二酯)。在一些實施例中，主鏈對掌性中心的共同模式包含不超過7個非對掌性核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，主鏈對掌性中心的共同模式包含不超過6個非對掌性核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，主鏈對掌性中心的共同模式包含不超過5個非對掌性核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，主鏈對掌性中心的共同模式包含不超過4個非對掌性核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，主鏈對掌性中心的共同模式包含不超過3個非對掌性核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，主鏈對掌性中心的共同模式包含不超過2個非對掌性核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，主鏈對掌性中心的共同模式包含不超過1個非對掌性核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，主鏈對掌性中心的共同模式包含至少10個呈Sp組態之核苷酸間鍵聯，及不超過8個非對掌性核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，主鏈對掌性中心的共同模式包含至少11個呈Sp組態之核苷酸間鍵聯，及不超過7個非對掌性核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，主鏈對掌性中心的共同模式包含至少12個呈Sp組態之核苷酸間鍵聯，及不超過6個非對掌性核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，主鏈對掌性中心的共同模式包含至少13個呈Sp組態之核苷酸間鍵聯，及不超過6個非對掌性核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，主鏈對掌性中心的共同模式包含至少14個呈Sp組態之核苷酸間鍵聯，及不超過5個非對掌性核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，主鏈對掌性中心的共同模式包含至少15個呈Sp組態之核苷酸間鍵聯，及不超過4個非對掌性核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，呈Sp組態之核苷酸間鍵聯為視情況相鄰或不相鄰的。在一些實施例中，呈Rp組態之核苷酸間鍵聯為視情況相鄰或不相鄰的。在一些實施例中，非對掌性核苷酸間鍵聯為視情況相鄰或不相鄰的。
在一些實施例中，本發明化合物包含一種嵌段，其為立體化學嵌段。在一些實施例中，嵌段為Rp嵌段，因為該嵌段之各核苷酸間鍵聯為Rp。在一些實施例中，5'-嵌段為Rp嵌段。在一些實施例中，3'-嵌段為Rp嵌段。在一些實施例中，嵌段為Sp嵌段，因為該嵌段之各核苷酸間鍵聯為Sp。在一些實施例中，5'-嵌段為Sp嵌段。在一些實施例中，3'-嵌段為Sp嵌段。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含Rp與Sp嵌段。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含一或多個Rp，但無Sp嵌段。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含一或多個Sp，但無Rp嵌段。在一些實施例中，所提供之寡核苷酸包含一或多個PO嵌段，其中各核苷酸間鍵聯為天然磷酸酯鍵聯。
在一些實施例中，本發明之化合物包含係Sp嵌段的5'-嵌段，其中各糖部分包含2'-F修飾。在一些實施例中，5'-嵌段為Sp嵌段，其中核苷酸間鍵聯各自為經修飾之核苷酸間鍵聯且各糖部分包含2'-F修飾。在一些實施例中，5'-嵌段為Sp嵌段，其中核苷酸間鍵聯各自為硫代磷酸酯鍵聯且各糖部分包含2'-F修飾。在一些實施例中，5'-嵌段包含4個或更多個核苷單元。在一些實施例中，5'-嵌段包含5個或更多個核苷單元。在一些實施例中，5'-嵌段包含6個或更多個核苷單元。在一些實施例中，5'-嵌段包含7個或更多個核苷單元。在一些實施例中，3'-嵌段為Sp嵌段，其中各糖部分包含2'-F修飾。在一些實施例中，3'-嵌段為Sp嵌段，其中核苷酸間鍵聯各自為經修飾之核苷酸間鍵聯且各糖部分包含2'-F修飾。在一些實施例中，3'-嵌段為Sp嵌段，其中核苷酸間鍵聯各自為硫代磷酸酯鍵聯且各糖部分包含2'-F修飾。在一些實施例中，3'-嵌段包含4個或更多個核苷單元。在一些實施例中，3'-嵌段包含5個或更多個核苷單元。在一些實施例中，3'-嵌段包含6個或更多個核苷單元。在一些實施例中，3'-嵌段包含7個或更多個核苷單元。
在一些實施例中，本發明化合物包含區域或寡核苷酸中一種類型之核苷之後為特定類型之核苷酸間鍵聯，例如天然磷酸酯鍵、經修飾之核苷酸間鍵聯、Rp對掌性核苷酸間鍵聯、Sp對掌性核苷酸間鍵聯等。在一些實施例中，A之後為Sp。在一些實施例中，A之後為Rp。在一些實施例中，A之後為天然磷酸酯鍵(PO)。在一些實施例中，U之後為Sp。在一些實施例中，U之後為Rp。在一些實施例中，U之後為天然磷酸酯鍵(PO)。在一些實施例中，C之後為Sp。在一些實施例中，C之後為Rp。在一些實施例中，C之後為天然磷酸酯鍵(PO)。在一些實施例中，G之後為Sp。在一些實施例中，G之後為Rp。在一些實施例中，G之後為天然磷酸酯鍵(PO)。在一些實施例中，C及U之後為Sp。在一些實施例中，C及U之後為Rp。在一些實施例中，C及U之後為天然磷酸酯鍵(PO)。在一些實施例中，A及G之後為Sp。在一些實施例中，A及G之後為Rp。
在一些實施例中，本發明之dsRNA分子包含與目標、雙螺旋體內或其組合之一或多個錯配。錯配可存在於突出物區域或雙螺旋體區域中。鹼基對可基於其促進解離或解鏈之傾向分級(例如基於特定配對之締合或解離之自由能，最簡單的方法為在個別對之基礎上來檢驗對，但隨後亦可使用鄰近或類似分析)。在促進解離方面，A:U優於G:C；G:U優於G:C；且I:C優於G:C (I=肌苷)。例如非典型或除典型配對以外(如本文中別處描述)的錯配優於典型(A:T、A:U、G:C)配對；且包括通用鹼基之配對優於典型配對。
在一些實施例中，本發明之dsRNA分子包含雙螺旋體區內相對於反義股之5'端的前1、2、3、4或5個鹼基對中之至少一者，其可獨立地選自以下群組：A:U、G:U、I:C及錯配的對，例如非典型對或不為典型對或包括通用鹼基之對，以促進反義股在雙螺旋體之5'端解離。
在一些實施例中，反義股中自5'端之雙螺旋體區域內之1號位置處的核苷酸係選自由以下組成之群：A、dA、dU、U及dT。或者，反義股之自5'端之雙螺旋體區域內之前1、2或3個鹼基對中之至少一者為AU鹼基對。舉例而言，反義股之自5'端之雙螺旋體區域內之第一個鹼基對為AU鹼基對。
發現，在單股或雙股寡核苷酸之任何位置處將經4'修飾之或5'修飾之核苷酸引入二核苷酸之磷酸二酯(PO)、硫代磷酸酯(PS)或二硫代磷酸酯(PS2)鍵之3'端可對核苷酸間鍵聯發揮空間作用，且因此針對核酸酶保護或穩定化該核苷酸間鍵聯。
在一些實施例中，在單股或雙股siRNA之任何位置將5'經修飾之核苷引入二核苷酸之3'端。舉例而言，可在單股或雙股siRNA之任何位置處之二核苷酸之3'端處引入5'烷基化核苷。核糖之5'位置處之烷基可為外消旋或對掌性純R或S異構體。例示性5'烷基化核苷為5'-甲基核苷。5'-甲基可為外消旋或對掌性純 R或 S異構體。
在一些實施例中，4'經修飾之核苷在單股或雙股siRNA之任何位置引入二核苷酸之3'端。舉例而言，可在單股或雙股siRNA之任何位置將4'烷基化核苷引入二核苷酸之3'端。核糖之4'位置處之烷基可為外消旋或對掌性純 R或 S異構體。例示性4'烷基化核苷酸為4'-甲基核苷。4'-甲基可為外消旋或對掌性純 R或 S異構體。或者，4'- O-烷基化核苷酸可在單股或雙股siRNA之任何位置引入二核苷酸之3'端。核糖之4'- O-烷基可為外消旋或對掌性純 R或 S異構體。例示性4'- O-烷基化核苷酸為4'- O-甲基核苷。4'- O-甲基可為外消旋或對掌性純 R或 S異構體。
在一些實施例中，5'烷基化核苷酸引入dsRNA之有義股或反義股上的任何位置，且此類修飾維持或提高dsRNA之效能。5'-烷基可為外消旋或對掌性純 R或 S異構體。例示性5'烷基化核苷為5'-甲基核苷。5'-甲基可為外消旋或對掌性純 R或 S異構體。
在一些實施例中，4'烷基化核苷酸引入dsRNA之有義股或反義股上的任何位置，且此類修飾維持或提高dsRNA之效能。4'-烷基可為外消旋或對掌性純 R或 S異構體。例示性4'烷基化核苷為4'-甲基核苷。4'-甲基可為外消旋或對掌性純 R或 S異構體。
在一些實施例中，4'- O-烷基化核苷酸引入dsRNA之有義股或反義股上的任何位置，且此類修飾維持或提高dsRNA之效能。5'-烷基可為外消旋或對掌性純 R或 S異構體。例示性4'- O-烷基化核苷酸為4'- O-甲基核苷。4'- O-甲基可為外消旋或對掌性純 R或 S異構體。
在一些實施例中，本發明之dsRNA分子可包含2'-5'鍵聯(具有2'-H、2'-OH及2'-OMe，且具有P=O或P=S)。舉例而言，2'-5'鍵聯修飾可用於促進核酸酶抗性或抑制有義股與反義股之結合，或可用在有義股之5'端以避免藉由RISC之有義股活化。
在另一實施例中，本發明之dsRNA分子可包含L糖(例如，L核糖、具有2'-H、2'-OH及2'-OMe之L-阿拉伯糖)。舉例而言，此等L糖修飾可用於促進核酸酶抗性或抑制有義股與反義股之結合，或可用在有義股之5'端以避免藉由RISC之有義股活化。
各種公開案描述全部可與本發明之dsRNA一起使用的多聚siRNA。此類公開案包括WO2007/091269、US 7858769、WO2010/141511、WO2007/117686、WO2009/014887及WO2011/031520，其全文併入本文中。
在一些實施例中，本發明之dsRNA分子為5'磷酸化的或在5'端處包括磷醯基類似物。5'-磷酸酯修飾包括與RISC介導之基因靜默相容的彼等修飾。適合修飾包括：5'-單磷酸酯((HO) 2(O)P -O-5')；5'-二磷酸酯((HO) 2(O)P -O-P(HO)(O)-O-5')；5'-三磷酸酯((HO) 2(O)P-O-(HO)(O)P -O-P(HO)(O)-O-5')；5'-鳥苷帽(7-甲基化或非甲基化)(7m-G-O-5'-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5')；5'-腺苷帽(Appp)，及經修飾或未修飾之任何核苷酸帽結構(N-O-5'-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5')；5'-單硫代磷酸酯(硫代磷酸酯；(HO) 2(S)P -O-5')；5'-單-二硫代磷酸酯(二硫代磷酸酯；(HO)(HS)(S)P -O-5')、5'-硫代磷酸酯((HO)2(O)P-S-5')；氧/硫置換之單磷酸酯、二磷酸酯及三磷酸酯的任何其他組合(例如5'-α-硫代三磷酸酯、5'-γ-硫代三磷酸酯等)、5'-胺基磷酸酯((HO) 2(O)P-NH-5'、(HO)(NH 2)(O)P -O-5')、5'-烷基膦酸酯(R=烷基=甲基、乙基、異丙基、丙基等，例如RP(OH)(O)-O-5'-、5'-烯基膦酸酯(亦即，乙烯基、經取代之乙烯基)、(OH) 2(O)P-5'-CH2-)、5'-烷基醚膦酸酯(R=烷基醚=甲氧基甲基(MeOCH2-)、乙氧基甲基等，例如RP(OH)(O)-O-5'-)。在一個實例中，修飾可定位於dsRNA分子之反義股中。
F. 連接子在一些實施例中，本文所述之結合物或配位體可使用可裂解或不可裂解之多種連接子連接至iRNA寡核苷酸。
連接子通常包含直接鍵或諸如氧或硫之原子、諸如NR8、C(O)、C(O)NH、SO、SO 2、SO 2NH之單元或諸如但不限於以下之原子鏈：經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之烯基、經取代或未經取代之炔基、芳基烷基、芳基烯基、芳基炔基、雜芳基烷基、雜芳基烯基、雜芳基炔基、雜環基烷基、雜環基烯基、雜環基炔基、芳基、雜芳基、雜環基、環烷基、環烯基、烷基芳基烷基、烷基芳基烯基、烷基芳基炔基、烯基芳基烷基、烯基芳基烯基、烯基芳基炔基、炔基芳基烷基、炔基芳基烯基、炔基芳基炔基、烷基雜芳基烷基、烷基雜芳基烯基、烷基雜芳基炔基、烯基雜芳基烷基、烯基雜芳基烯基、烯基雜芳基炔基、炔基雜芳基烷基、炔基雜芳基烯基、炔基雜芳基炔基、烷基雜環基烷基、烷基雜環基烯基、烷基雜環基炔基、烯基雜環基烷基、烯基雜環基烯基、烯基雜環基炔基、炔基雜環基烷基、炔基雜環基烯基、炔基雜環基炔基、烷基芳基、烯基芳基、炔基芳基、烷基雜芳基、烯基雜芳基、炔基雜芳基，該一或多個亞甲基可間雜有O、S、S(O)、SO 2、N(R8)、C(O)、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之雜芳基、經取代或未經取代之雜環或經其封端；其中R8為氫、醯基、脂族或經取代脂族。在一些實施例中，連接子具有約1至24個原子、2至24、3至24、4至24、5至24、6至24、6至18、7至18、8至18個原子、7至17、8至17、6至16、7至16或8至16個原子。
在一些實施例中，本發明之dsRNA與選自式(XXXI)-(XXXIV)中之任一者中所示之結構之群的二價或三價分支連接子結合： 式XXXI                                                   式XXXII
Figure 02_image118
； 式XXXIII                                             式XXXIV 其中： q 2A、q 2B、q 3A、q 3B、q4 A、q 4B、q 5A、q 5B及q 5C在各次出現時獨立地表示0-20且其中重複單元可相同或不同； P 2A、P 2B、P 3A、P 3B、P 4A、P 4B、P 5A、P 5B、P 5C、T 2A、T 2B、T 3A、T 3B、T 4A、T 4B、T 4A、T 5B、T 5C在各次出現時各自獨立地為不存在、CO、NH、O、S、OC(O)、NHC(O)、CH 2、CH 2NH或CH 2O； Q 2A、Q 2B、Q 3A、Q 3B、Q 4A、Q 4B、Q 5A、Q 5B、Q 5C在各次出現時獨立地為不存在、伸烷基、經取代之伸烷基，其中一或多個亞甲基可被O、S、S(O)、SO 2、N(R N)、C(R')=C(R")、C≡C或C(O)中之一或多者間雜或封端； R 2A、R 2B、R 3A、R 3B、R 4A、R 4B、R 5A、R 5B、R 5C在各次出現時各自獨立地為不存在、NH、O、S、CH 2、C(O)O、C(O)NH、NHCH(R a)C(O)、-C(O)-CH(R a)-NH-、CO、CH=N-O、
Figure 02_image120
Figure 02_image122
或雜環基； L 2A、L 2B、L 3A、L 3B、L 4A、L 4B、L 5A、L 5B及L 5C表示配位體；亦即，在各次出現時各自獨立地為單醣(諸如GalNAc)、雙醣、三醣、四醣、寡醣或多醣；且R a為H或胺基酸側鏈。三價結合GalNAc衍生物尤其適於與RNAi藥劑一起使用以抑制目標基因之表現，諸如式(XXXV)之衍生物： 式XXXV
Figure 02_image124
， 其中L 5A、L 5B及L 5C表示單醣，諸如GalNAc衍生物。
結合GalNAc衍生物之適合二價及三價分支鏈連接子之實例包括但不限於上文列舉為式II、VII、XI、X及XIII之結構。
可裂解連接子為在細胞外部充分穩定，但進入目標細胞時裂解以釋放連接子固持在一起之兩個部分的連接子。在一些實施例中，可裂解連接子在目標細胞中或在第一參考條件(其可例如經選擇以模擬或代表細胞內條件)下，或在第二參考條件(其可例如經選擇以模擬或代表細胞內條件)下比在個體之血液中裂解快至少約10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或更多倍，或至少約100倍。
可裂解連接子對裂解因子，例如pH值、氧化還原電位或降解分子之存在敏感。一般而言，裂解劑在細胞內比在血清或血液中更普遍或以更高水準或活性發現。此類降解劑之實例包括：選擇用於特定受質或不具有受質特異性之氧化還原劑，包括例如細胞中存在之氧化或還原酶或還原劑，諸如硫醇，其可藉由還原而使氧化還原可裂解連接基團降解；酯酶；可建立酸性環境之內體或藥劑，例如產生5或更低pH之彼等；可藉由充當通用酸、肽酶(其可為受質特異性的)及磷酸酶而使酸可裂解連接基團水解或降解之酶。
可裂解鍵聯基團(諸如二硫鍵)可對pH值敏感。人類血清之pH為7.4，而平均細胞內pH略低，在約7.1-7.3範圍內。內體具有5.5-6.0範圍內的更大酸性pH，且溶酶體具有約5.0之甚至更大酸性pH。一些連接子將具有在適合pH下裂解之可裂解連接基團，藉此在細胞內部自配位體釋放陽離子脂質或釋放至細胞之所要隔室中。
連接子可包括可由特定酶裂解之可裂解連接子。併入連接子中之可裂解連接子之類型可視待靶向細胞而定。
一般而言，可藉由測試降解因子(或條件)裂解候選連接子之能力來評價候選可裂解連接子之適合性。亦將需要亦測試候選可裂解連接子在血液中或與其他非目標組織接觸時的抗裂解能力。因此，吾人可確定第一與第二條件之間對裂解的相對易感性，其中第一條件經選擇以指示靶細胞中之裂解，且第二條件經選擇以指示其他組織或生物流體(例如血液或血清)中之裂解。評價可在無細胞系統、細胞、細胞培養物、器官或組織培養物或整個動物中進行。其可適用於在無細胞或培養條件中進行初始評價及藉由在整個動物中進一步評價來確認。在一些實施例中，適用候選化合物在細胞中(或在選擇用於模擬細胞內條件之活體外條件下)比在血液或血清中(或在選擇用於模擬胞外條件之活體外條件下)裂解快至少約2倍、4倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或約100倍。
i. 氧化還原可裂解連接子在一些實施例中，可裂解連接子為在還原或氧化下裂解之氧化還原可裂解連接子。還原可裂解連接子之實例為二硫化物連接子(-S-S-)。為了確定候選可裂解連接子是否為適合之「還原可裂解連接子」或例如是否適合與特定iRNA部分及特定靶向劑一起使用，可考慮本文所述之方法。舉例而言，候選物可藉由使用此項技術中已知的試劑，與二硫蘇糖醇(DTT)或其他還原劑一起培育來評價，其模擬將在細胞，例如目標細胞中觀測到的裂解速率。候選物亦可在經選擇以模擬血液或血清條件之條件下進行評價。在一個條件下，候選化合物在血液中裂解至多約10%。在其他實施例中，適用候選化合物在細胞中(或在選擇用於模擬細胞內條件之活體外條件下)比在血液或血清中(或在選擇用於模擬胞外條件之活體外條件下)分解快至少約2倍、4倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或約100倍。候選化合物之裂解速率可使用標準酶動力學分析在經選擇以模擬細胞內介質之條件下測定且與經選擇以模擬細胞外介質之條件比較。
ii. 基於磷酸酯之可裂解連接子在一些實施例中，可裂解連接子包含基於磷酸酯基之可裂解連接子。基於磷酸酯之可裂解連接子藉由降解或水解磷酸酯基之因子裂解。裂解細胞中磷酸酯基之藥劑的實例為細胞中之酶，諸如磷酸酶。基於磷酸酯基之鍵聯基團之實例為-O-P(O)(ORk)-O-、-O-P(S)(ORk)-O-、-O-P(S)(SRk)-O-、-S-P(O)(ORk)-O-、-O-P(O)(ORk)-S-、-S-P(O)(ORk)-S-、-O-P(S)(ORk)-S-、-S-P(S)(ORk)-O-、-O-P(O)(Rk)-O-、-O-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-O-、-S-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-S-、-O-P(S)( Rk)-S-。在一些實施例中，基於磷酸酯基之連接基團為-O-P(O)(OH)-O-、-O-P(S)(OH)-O-、-O-P(S)(SH)-O-、-S-P(O)(OH)-O-、-O-P(O)(OH)-S-、-S-P(O)(OH)-S-、-O-P(S)(OH)-S-、-S-P(S)(OH)-O-、-O-P(O)(H)-O-、-O-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-O、-S-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-S-、-O-P(S)(H)-S-。在一些實施例中，基於磷酸酯之連接基團為-O-P(O)(OH)-O-。此等候選物可使用類似於上文所描述之方法的方法評價。
iii. 酸可裂解連接子在一些實施例中，可裂解連接子包含酸可裂解連接子。酸可裂解連接子為在酸性條件下裂解之連接子。在一些實施例中，酸可裂解連接基團在約6.5或更低之pH(例如約6.0、5.75、5.5、5.25、5.0或更低)的酸性環境中裂解或藉由藥劑(諸如可充當通用酸之酶)裂解。在細胞中，特定的低pH細胞器，諸如內體及溶酶體，可為酸可裂解連接子提供裂解環境。酸可裂解連接基團之實例包括但不限於腙、酯及胺基酸之酯。酸可裂解基團可具有通式-C=NN-、C(O)O或-OC(O)。在一些實施例中，連接至酯之氧(烷氧基)的碳為芳基、經取代之烷基或三級烷基，諸如二甲基戊基或三級丁基。此等候選物可使用類似於上文所描述之方法的方法評價。
iv. 基於酯之可裂解連接基團在一些實施例中，可裂解連接子包含基於酯之可裂解連接基團。基於酯之可裂解連接基團藉由細胞中之諸如酯酶及醯胺酶的酶裂解。基於酯之可裂解連接基團的實例包括但不限於伸烷基、伸烯基及伸炔基之酯。酯可裂解連接基團具有通式-C(O)O-或-OC(O)-。此等候選物可使用類似於上文所描述之方法的方法評價。
v. 基於肽之可裂解連接子在一些實施例中，可裂解連接子包含基於肽之可裂解連接基團。基於肽之可裂解連接基團係藉由細胞中之酶(諸如肽酶及蛋白酶)裂解。基於肽之可裂解連接基團為胺基酸之間形成以獲得寡肽(例如二肽、三肽等)及多肽的肽鍵。基於肽之可裂解基團不包括醯胺基(-C(O)NH-)。醯胺基可在任何伸烷基、伸烯基或伸炔基之間形成。肽鍵為在胺基酸之間形成以產生肽及蛋白質的特殊類型的醯胺鍵。基於肽之裂解基團一般限於在產生肽及蛋白質之胺基酸之間形成的肽鍵(亦即，醯胺鍵)，且不包括整個醯胺官能基。基於肽之可裂解連接基團具有通式-NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)-，其中RA及RB為兩個相鄰胺基酸之R基團。此等候選物可使用類似於上文所描述之方法的方法評價。教示RNA結合物之製備的代表性美國專利包括但不限於美國專利第4,828,979號；第4,948,882號；第5,218,105號；第5,525,465號；第5,541,313號；第5,545,730號；第5,552,538號；第5,578,717, 5,580,731號；第5,591,584號；第5,109,124號；第5,118,802號；第5,138,045號；第5,414,077號；第5,486,603號；第5,512,439號；第5,578,718號；第5,608,046號；第4,587,044號；第4,605,735號；第4,667,025號；第4,762,779號；第4,789,737號；第4,824,941號；第4,835,263號；第4,876,335號；第4,904,582號；第4,958,013號；第5,082,830號；第5,112,963號；第5,214,136號；第5,082,830號；第5,112,963號；第5,214,136號；第5,245,022號；第5,254,469號；第5,258,506號；第5,262,536號；第5,272,250號；第5,292,873號；第5,317,098號；第5,371,241號；第5,391,723號；第5,416,203號；第5,451,463號；第5,510,475號；第5,512,667號；第5,514,785號；第5,565,552號；第5,567,810號；第5,574,142號；第5,585,481號；第5,587,371號；第5,595,726號；第5,597,696號；第5,599,923號；第5,599,928號及第5,688,941號；第6,294,664號；第6,320,017號；第6,576,752號；第6,783,931號；第6,900,297號；第7,037,646號；第8,106,022號，其中之每一者的全部內容以引用的方式併入本文中。
並非必需既定化合物中之所有位置都均勻修飾，且實際上一種以上前述修飾可併入單個化合物中或甚至iRNA內之單個核苷處。本發明亦包括為嵌合化合物之iRNA化合物。
在本發明之上下文中，「嵌合」iRNA化合物或「嵌合體」為含有兩個或更多個化學上獨特區之iRNA化合物(例如dsRNA)，其各自由至少一個單體單元(亦即在dsRNA化合物之情況下的核苷酸)構成。此等iRNA通常含有RNA經修飾之至少一個區以賦予iRNA提高之抗核酸分解性、提高之細胞攝入及/或提高之對目標核酸的結合親和力。iRNA之其他區域可充當能夠裂解RNA:DNA或RNA:RNA雜交體之酶的受質。舉例而言，核糖核酸酶H為細胞核酸內切酶，其裂解RNA:DNA雙螺旋體之RNA股。因此，RNA酶H之活化使得RNA目標裂解，藉此大大增強iRNA抑制基因表現之效率。因此，當使用嵌合dsRNA時，相較於雜交至相同目標區域之硫代磷酸酯去氧dsRNA，通常可使用更短iRNA獲得相當之結果。RNA目標之裂解可藉由凝膠電泳，且必要時此項技術中已知之相關核酸雜交技術常規地偵測。
在某些情況下，iRNA之RNA可經非配位體基團修飾。多種非配位體分子已結合於iRNA以增強iRNA之活性、細胞分佈或細胞吸收，且進行此類結合之程序可在科學文獻中獲得。此類非配位體部分已包括脂質部分，諸如膽固醇(Kubo, T.等人, Biochem. Biophys. Res. Comm., 2007, 365(1):54-61; Letsinger等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86:6553)；膽酸(Manoharan等人, Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994, 4:1053)；硫醚，例如己基-S-三苯甲基硫醇(Manoharan等人, Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306; Manoharan等人, Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765)；硫代膽固醇(Oberhauser等人, Nucl. Acids Res., 1992, 20:533)；脂族鏈，例如十二烷二醇或十一烷基殘基(Saison-Behmoaras等人, EMBO J., 1991, 10:111; Kabanov等人, FEBS Lett., 1990, 259:327; Svinarchuk等人, Biochimie, 1993, 75:49)；磷脂，例如二-十六烷基-rac-甘油或三乙銨1,2-二-O-十六烷基-rac-甘油-3-H-膦酸鹽(Manoharan等人, Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651; Shea等人, Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777)；聚胺或聚乙二醇鏈(Manoharan等人, Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969)；或金剛烷乙酸(Manoharan等人, Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651)；棕櫚基部分(Mishra等人, Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229)；或十八烷基胺或己胺基-羰基-羥膽固醇部分(Crooke等人, J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923)。教示此類RNA結合物之製備的代表性美國專利已列於上文中。典型結合方案涉及在序列之一或多個位置處攜帶胺基連接子之RNA的合成。胺基隨後使用適當偶合或活化試劑與所結合之分子反應。結合反應可在溶液狀態中使用仍結合於固體載體之RNA進行或在RNA裂解後進行。藉由HPLC純化RNA結合物通常得到純結合物。
V. iRNA 遞送iRNA向有需要之個體的遞送可以多種不同方法實現。活體內遞送可藉由向個體投與包含iRNA (例如dsRNA)之組合物直接進行。或者，可藉由投與一或多種編碼iRNA及引導iRNA表現之載體間接進行遞送。此等替代方案在下文中進一步論述。
A. 直接遞送一般而言，遞送核酸分子之任何方法可經調適以與iRNA一起使用(參見例如Akhtar S.及Julian RL. (1992) Trends Cell. Biol.2(5):139-144及WO94/02595，其以全文引用的方式併入本文中)。然而，為了活體內成功遞送iRNA分子，存在三個需要考慮的重要因素：(a)所遞送分子之生物穩定性，(2)防止非特異性作用，及(3)所遞送分子於目標組織中之積累。iRNA之非特異性作用可藉由局部投與而降至最低，例如藉由直接注射或植入至組織(作為非限制性實例，眼睛)或體表投與製劑。局部投與治療部位使藥劑之局部濃度最大，限制藥劑暴露於原本會被藥劑傷害或可使藥劑分解之全身組織，且允許降低待投與之iRNA分子的總劑量。若干研究已證實當局部投與iRNA時基因產物之成功的基因減弱。舉例而言，在年齡相關黃斑變性實驗模型中，藉由食蟹獼猴中之玻璃體內注射(Tolentino, MJ等人 (2004) Retina24:132-138)及小鼠中之視網膜下注射(Reich, SJ.等人, (2003) Mol. Vis.9:210-216)進行VEGF dsRNA的眼內遞送均顯示可預防新血管生成。此外，dsRNA對小鼠的直接瘤內注射減少腫瘤體積(Pille, J.等人, (2005) Mol. Ther.11:267-274)且可延長荷瘤小鼠存活期(Kim, WJ.等人,(2006) Mol. Ther.14:343-350；Li, S.等人, (2007) Mol. Ther.15:515-523)。RNA干擾亦已顯示藉由直接注射可成功局部遞送至CNS (Dorn, G.等人, (2004) Nucleic Acids32:e49；Tan, PH.等人, (2005) Gene Ther.12:59-66；Makimura, H.等人, (2002) BMC Neurosci.3:18；Shishkina, GT.等人, (2004) Neuroscience129:521-528；Thakker, ER.等人, (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.101:17270-17275；Akaneya,Y.等人, (2005) J. Neurophysiol.93:594-602)及藉由鼻內投與而遞送至肺(Howard, KA.等人, (2006) Mol. Ther.14:476-484；Zhang, X.等人, (2004) J. Biol. Chem.279:10677-10684；Bitko, V.等人, (2005) Nat. Med.11:50-55)。當全身性投與iRNA以治療疾病時，RNA可加以修飾或替代地使用藥物遞送系統遞送；兩種方法均用於防止dsRNA在活體內被內切及外切核酸酶快速降解。
RNA之修飾或醫藥載劑亦可允許使iRNA組合物靶向目標組織及避免非所需脫靶作用。iRNA分子可藉由化學結合至其他基團(例如如本文所述之脂質或碳水化合物基團)經修飾。此類結合物可用於使iRNA靶向特定細胞，例如肝臟細胞，例如肝細胞。舉例而言，GalNAc結合物或脂質(例如LNP)調配物可用於使iRNA靶向特定細胞，例如肝臟細胞，例如肝細胞。
iRNA分子亦可藉由與親脂基團(諸如膽固醇)之化學結合來修飾，以增強細胞攝取及阻止分解。舉例而言，針對結合於親脂性膽固醇部分之ApoB的iRNA全身性注射至小鼠且在肝臟及空腸中皆導致apoB mRNA之基因減弱(Soutschek, J.等人,(2004) Nature432:173-178)。在前列腺癌小鼠模型中，iRNA與適體結合已顯示可抑制腫瘤生長及介導腫瘤消退(McNamara, JO.等人, (2006) Nat. Biotechnol.24:1005-1015)。在替代性實施例中，iRNA可使用藥物遞送系統(諸如奈米粒子、樹枝狀聚合物、聚合物、脂質體或陽離子遞送系統)遞送。帶正電陽離子遞送系統促進iRNA分子(帶負電)之結合以及增強帶負電細胞膜處之相互作用，以允許細胞有效攝入iRNA。陽離子脂質、樹枝狀聚合物或聚合物可結合於iRNA或誘導形成包住iRNA之小泡或微胞(參見例如Kim SH.等人, (2008) Journal of Controlled Release129(2):107-116)。形成小泡或微胞進一步防止全身性投與時iRNA分解。製備及投與陽離子型iRNA複合物之方法完全在熟習此項技術者之能力範圍內(參見例如Sorensen, DR.等人,  (2003) J. Mol. Biol327:761-766；Verma, UN.等人, (2003) Clin. Cancer Res.9:1291-1300；Arnold, AS等人 (2007) J. Hypertens.25:197-205，其以全文引用的方式併入本文中)。適用於全身遞送iRNA之藥物遞送系統的一些非限制性實例包括DOTAP (Sorensen, DR.等人, (2003), 同上；Verma, UN.等人, (2003), 同上)；寡非他命(Oligofectamine)，「固體核酸脂質粒子」 (Zimmermann, TS.等人, (2006) Nature441:111-114)、心磷脂(Chien, PY.等人, (2005) Cancer Gene Ther.12:321-328；Pal, A.等人, (2005) Int J. Oncol.26:1087-1091)；聚乙烯亞胺(Bonnet ME.等人, (2008) Pharm. Res.刊載之前於8月16日電子出版; Aigner, A. (2006) J. Biomed. Biotechnol.71659)；Arg-Gly-Asp (RGD)肽(Liu, S. (2006) Mol. Pharm.3:472-487)及聚醯胺胺(Tomalia, DA.等人, (2007) Biochem. Soc. Trans.35:61-67；Yoo, H.等人, (1999) Pharm. Res.16:1799-1804)。在一些實施例中，iRNA與環糊精形成用於全身投與之複合物。iRNA及環糊精之投與方法及醫藥組合物可見於美國專利第7,427,605號中，其以全文引用的方式併入本文中。
B. 載體編碼之 iRNA在另一態樣中，靶向MYOC之iRNA可自插入DNA或RNA載體中之轉錄單元表現(參見例如Couture, A等人, TIG.(1996), 12:5-10；Skillern, A.等人，國際PCT公開案第WO 00/22113號，Conrad, 國際PCT公開案第WO 00/22114號，及Conrad, 美國專利第6,054,299號)。視所用特定構築體及目標組織或細胞類型而定，表現可為短暫(約幾小時至幾週)或持久的(幾週至幾個月或更長)。此等轉殖基因可以線性構築體、環形質體或病毒載體形式引入，該載體可以為整合或非整合載體。轉殖基因亦可構築成允許其作為染色體外質體遺傳(Gassmann等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1995) 92:1292)。
iRNA之一或多個個別股可自表現載體上之啟動子轉錄。當待表現兩個個別股以產生例如dsRNA時，兩個個別表現載體可共引入(例如藉由轉染或感染)至目標細胞中。替代地，dsRNA之各個別股可藉由均位於同一表現質體上之兩個啟動子轉錄。在一些實施例中，dsRNA表現為由連接子聚核苷酸序列接合之倒置重複單元使得dsRNA具有莖環結構(stem and loop structure)。
iRNA表現載體通常為DNA質體或病毒載體。與真核細胞(例如脊椎動物細胞)相容之表現載體可用於產生重組構築體以表現如本文所述之iRNA。真核細胞表現載體為此項技術中所熟知且獲自許多商業來源。通常，此類載體含有用於插入所要核酸片段之適宜限制位點。iRNA表現載體之遞送可為全身遞送，諸如藉由靜脈內或肌肉內投與，藉由向自患者離體種植隨後再引入患者中之目標細胞投與，或藉由允許引入所要目標細胞中的任何其他方式。
iRNA表現質體可與陽離子脂質載劑(例如寡非他命)之複合物或基於非陽離子脂質之載劑(例如Transit-TKO TM)一起以複合物形式轉染至目標細胞中。本發明亦涵蓋經一週或超過一週之時段靶向目標RNA之不同區域的iRNA介導之基因減弱的多種脂質轉染。將宿主細胞成功引入載體中可使用各種已知方法監測。舉例而言，短暫轉染可使用報導子傳導信號，諸如螢光標記物，諸如綠色螢光蛋白(GFP)。可使用向經轉染細胞提供對特定環境因素(例如抗生素及藥物)之抗性(諸如濕黴素B耐藥性)的標記物確保離體穩定轉染細胞。
本文所述之方法及組合物可利用之病毒載體系統包括(但不限於) (a)腺病毒載體；(b)逆轉錄病毒載體，包括(但不限於)慢病毒載體、莫洛尼鼠類白血病病毒(moloney murine leukemia virus)等；(c)腺相關病毒載體；(d)單純性疱疹病毒載體；(e) SV40載體；(f)多瘤病毒載體；(g)乳頭狀瘤病毒載體；(h)小核糖核酸病毒載體；(i)痘病毒載體，諸如天花(orthopox)，例如牛痘病毒載體或禽痘，例如金絲雀痘或家禽痘；及(j)輔助病毒依賴型或無腸腺病毒。複製缺陷型病毒亦可為有利的。不同載體將或將不併入至細胞基因體中。若需要，構築體可包括用於轉染之病毒序列。或者，構築體可併入能夠游離型複製之載體(例如EPV及EBV載體)中。用於重組表現iRNA之構築體一般將需要調控元件(例如啟動子、增強子等)以確保iRNA於目標細胞中表現。下文中進一步描述載體及構築體需考慮之其他態樣。
適用於遞送iRNA之載體將包括足以在所需目標細胞或組織中表現iRNA之調控元件(啟動子、增強子等)。可選擇調控元件以提供構成或調控/誘導性表現。
iRNA之表現可例如藉由使用對某些生理學調控劑(例如循環葡萄糖含量或激素)敏感之誘導性調控序列來精確調控(Docherty等人, 1994, FASEB J.8:20-24)。適於控制細胞或哺乳動物中dsRNA表現之此類誘導性表現系統包括例如藉由蛻皮激素、雌激素、孕酮、四環素、二聚化學誘導劑及異丙基-β-D1-硫代半乳糖苷(IPTG)調節。熟習此項技術者將能夠基於iRNA轉殖基因之預期用途選擇適當管理/啟動子序列。
在一特定實施例中，可使用含有編碼iRNA之核酸序列的病毒載體。舉例而言，可使用逆轉錄病毒載體(參見Miller等人, Meth. Enzymol.217:581-599 (1993))。此等逆轉錄病毒載體含有病毒基因體正確封裝及整合至宿主細胞DNA中所必需的組分。編碼iRNA之核酸序列選殖至一或多個載體中，此促進核酸遞送至患者中。關於逆轉錄病毒載體之更多細節可見於例如Boesen等人, Biotherapy6:291-302 (1994)中，其描述使用逆轉錄病毒載體將mdr1基因遞送至造血幹細胞以使幹細胞更耐化學療法。說明使用逆轉錄病毒載體進行基因療法的其他參考文獻為：Clowes等人, J. Clin. Invest.93:644-651 (1994); Kiem等人, Blood83:1467-1473 (1994); Salmons及Gunzberg, Human Gene Therapy4:129-141 (1993); 及Grossman及Wilson, Curr. Opin. in Genetics and Devel.3:110-114 (1993)。考慮使用之慢病毒載體包括例如美國專利第6,143,520號；第5,665,557號及第5,981,276號中所述之基於HIV之載體，該等文獻以引用的方式併入本文中。
腺病毒亦預期用於遞送iRNA。腺病毒為尤其具有吸引力之媒劑，例如用於將基因遞送至呼吸道上皮。腺病毒天然地感染呼吸道上皮，其在呼吸道上皮引起輕度疾病。基於腺病毒之遞送系統的其他目標為肝臟、中樞神經系統、內皮細胞及肌肉。腺病毒具有能夠感染非分裂細胞之優勢。Kozarsky及Wilson, 1993, Current Opinion in Genetics and Development3:499-503呈現基於腺病毒之基因療法的評述。Bout等人, Human Gene Therapy5:3-10 (1994)證明腺病毒載體將基因轉移至恆河猴(rhesus monkey)之呼吸道上皮細胞中之用途。在基因療法中使用腺病毒的其他例子可見於Rosenfeld等人, Science252:431-434 (1991); Rosenfeld等人, Cell68:143-155 (1992); Mastrangeli等人, J. Clin. Invest.91:225-234 (1993); PCT Publication WO94/12649; 及Wang等人, Gene Therapy2:775-783 (1995)。適用於表現本發明所提供之iRNA的AV載體、用於構築重組型AV載體之方法及用於將載體遞送至目標細胞中之方法描述於Xia H等人. (2002), Nat. Biotech.20: 1006-1010中。
亦考慮使用腺相關病毒(AAV)載體(Walsh等人, Proc. Soc. Exp. Biol. Med.204:289-300 (1993)；美國專利第5,436,146號)。在一些實施例中，iRNA可以兩個各別互補單股RNA分子自具有例如U6或H1 RNA啟動子或細胞巨大病毒(CMV)啟動子之重組型AAV載體表現。適用於表現本發明所提供之dsRNA的AAV載體、構築重組型AV載體之方法及將載體遞送至目標細胞中之方法描述於Samulski R等人, (1987), J. Virol.61: 3096-3101；Fisher K J等人, (1996), J. Virol., 70: 520-532；Samulski R等人, (1989), J. Virol.63: 3822-3826；美國專利第5,252,479號；美國專利第5,139,941號；國際專利申請案第WO 94/13788號；及國際專利申請案第WO 93/24641號中，其全部揭示內容以引用的方式併入本文中。
另一典型病毒載體為痘病毒，諸如牛痘病毒，例如減毒牛痘，諸如經修飾病毒Ankara (MVA)或NYVAC；鳥類痘病毒，諸如家禽痘或金絲雀痘。
病毒載體之向性可藉由使用來自其他病毒之包膜蛋白或其他表面抗原對載體進行假型化或藉由按需要取代不同病毒衣殼蛋白來修飾。舉例而言，慢病毒載體可使用來自水泡性口炎病毒(VSV)、狂犬病、埃博拉病毒(Ebola)、莫科拉病毒(Mokola)及其類似物的表面蛋白質假模式化。可藉由對載體進行工程改造以表現不同衣殼蛋白血清型來製備AAV載體以靶向不同細胞；參見例如Rabinowitz J E等人, (2002), J Virol76:791-801，其全部揭示內容以引用的方式併入本文中。
載體之醫藥製劑可包括在可接受稀釋劑中之載體，或可包括嵌入有基因遞送工具之緩釋基質。或者，若可自重組型細胞(例如逆轉錄病毒載體)完整製造全部基因遞送載體，則醫藥製劑可包括一或多種產生基因遞送系統之細胞。
VI. 含有 iRNA 之醫藥組合物在一些實施例中，本發明提供醫藥組合物，其含有如本文所述之iRNA及醫藥學上可接受之載劑。含有iRNA之醫藥組合物適用於治療與MYOC之表現或活性相關的疾病或病症(例如青光眼，例如原發性開角型青光眼(POAG))。此類醫藥組合物係基於遞送模式調配。在一些實施例中，組合物可經調配以用於局部遞送，例如藉由眼內遞送(例如玻璃體內投與，例如玻璃體內注射；經鞏膜投與，例如經鞏膜注射；結膜下投與，例如結膜下注射；眼球後投與，例如眼球後注射；前房內投與，例如前房內注射；或視網膜下投與，例如視網膜下注射)。在其他實施例中，組合物可經調配用於局部遞送。在另一實例中，組合物可經調配以用於經由非經腸遞送(例如藉由靜脈內(IV)遞送)全身投與。在一些實施例中，本文提供之組合物(例如包含GalNAc結合物或LNP調配物之組合物)調配用於靜脈內遞送。
本文特性化之醫藥組合物以足以抑制MYOC表現之劑量投與。一般而言，iRNA的適合劑量將在每天每公斤接受者體重0.01至200.0毫克範圍內。醫藥組合物可每天投與一次，或iRNA可以兩次、三次或更多次亞劑量、在全天的適當間隔時間投與或甚至利用連續輸注或遞送、經由控制釋放調配物投與。在彼情況下，各亞劑量中所含之iRNA必須相應地較小以達到每日總劑量。劑量單元亦可複合以經若干天遞送，例如使用經若干天提供iRNA持續釋放之習知持續釋放調配物。持續釋放調配物在此項技術中熟知且尤其適用於在特定部位遞送藥劑，諸如可與本發明之藥劑一起使用。在此實施例中，劑量單元含有相應的多個日劑量。
單次劑量對MYOC含量之作用可為長效的，使得後續劑量以不超過3、4或5天時間間隔，或不超過1、2、3、4、12、24或36週時間間隔投與。
熟練技術人員將瞭解某些因素可能影響有效治療個體所必需之劑量及時程，包括(但不限於)疾病或病症之嚴重程度、先前治療、個體之一般健康狀況及/或年齡及存在之其他疾病。此外，用治療有效量之組合物治療個體可包括單一治療或一系列治療。本發明所涵蓋之個別iRNA之有效劑量及活體內半衰期的估算可使用習知方法或基於活體內測試使用適合之動物模型進行。
適合之動物模型，例如小鼠或食蟹獼猴，例如含有表現人類MYOC之轉基因的動物，可用於確定MYOC siRNA之治療有效劑量及/或有效劑量方案投藥。
本發明亦包括包含本文特性化之iRNA化合物的醫藥組合物及調配物。本發明之醫藥組合物可以多種方式投與，此視需要局部抑或全身性治療及所治療之區域而定。投與可為局部(例如藉由眼內注射)、體表(例如藉由滴眼劑溶液)或非經腸。非經腸投藥包括靜脈內、動脈內、皮下、腹膜內或肌肉內注射或輸注；真皮下，例如經由植入裝置；或顱內，例如藉由腦實質內、鞘內或室內投與。
用於體表投與之醫藥組合物及調配物可包括經皮貼、軟膏、洗劑、乳膏、凝膠、滴劑、栓劑、噴霧劑、液體及散劑。習知醫藥載劑、水性、散劑或油性基劑、增稠劑及其類似物可為必需或合需要的。經塗佈之保險套、手套及其類似物亦可為有用的。適合之表面調配物包括本發明特性化之iRNA與表面遞送劑(諸如脂質、脂質體、脂肪酸、脂肪酸酯、類固醇、螯合劑及界面活性劑)混雜者。適合的脂質及脂質體包括中性(例如二油醯基磷脂醯DOPE乙醇胺、二肉豆蔻醯基磷脂醯膽鹼DMPC、二硬脂醯基磷脂醯膽鹼)、陰離子型(例如二肉豆蔻醯基磷脂醯甘油DMPG)及陽離子型(例如二油醯基四甲基胺基丙基DOTAP及二油醯基磷脂醯乙醇胺DOTMA)。本發明所提供之iRNA可囊封於脂質體內或可與其形成複合物(尤其與陽離子脂質體)。或者，iRNA可與脂質，尤其陽離子脂質複合。適合脂肪酸及酯包括但不限於花生四烯酸、油酸、花生酸、月桂酸、辛酸、癸酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞麻油酸、次亞麻油酸、二癸酸酯、三癸酸酯、單油酸甘油酯、二月桂酸甘油酯、1-單癸酸甘油酯、1-十二烷基氮雜環庚-2-酮、醯基肉鹼、醯基膽鹼或C 1-20烷基酯(例如異丙基肉豆蔻酸酯IPM)、單甘油酯、二甘油酯或其醫藥學上可接受之鹽。體表調配物詳細描述於美國專利第6,747,014號中，其以引用的方式併入本文中。
A. 脂質調配物除微乳液之外亦存在許多組織化界面活性劑結構已經研究及用於藥物之調配物。此等物包括單層、微胞、雙層及微脂粒。就藥物遞送之觀點而言，微脂粒(諸如脂質體)因為其特異性及其提供之持續作用時間而已吸引較大的關注。如本發明中所使用，術語「脂質體」意謂由以一或多個球形雙層排列之兩親媒性脂質構成之小泡。
脂質體為單層或多層微脂粒，其具有由親脂性材料形成之膜及水性內部。水性部分含有待遞送之組合物。陽離子脂質體具有能夠融合至細胞壁之優勢。非陽離子脂質體儘管不能與細胞壁有效融合，但由巨噬細胞活體內吸收。
為了穿越完整哺乳動物皮膚，脂質小泡必須在適合經皮梯度影響下穿過各自直徑小於50 nm的一連串細孔。因此，希望使用高度可變形且及穿過此類細孔之脂質體。
脂質體之其他優勢包括：獲自天然磷脂之脂質體為生物相容且可生物降解的；脂質體可併入多種水及脂質可溶性藥物中；脂質體可保護囊封於其固有隔室中之藥物免於代謝及分解(Rosoff, Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger及Banker (編), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 第1卷, 第245頁)。製備脂質體調配物之重要考慮因素為脂質體之脂質表面電荷、囊泡大小及水性體積。
脂質體適用於將活性成分轉移及遞送至作用部位。因為脂質膜結構上類似於生物膜，所以當脂質體施用至組織時，脂質體開始與細胞膜合併且隨著脂質體與細胞之合併進展，脂質內容物排空至細胞中，活性劑可在細胞中起作用。
大量調查已致力於研究脂質調配物作為許多藥物之遞送模式。愈來愈多的證據表明對於表面投與，脂質體存在若干優於其他調配物之優勢。此類優勢包括降低與所投與藥物之高全身吸收的副作用、增加所投與藥物在所要目標處之積累及向皮膚投與多種藥物(親水性及疏水性兩者)之能力。
若干報導已詳述脂質體向皮膚遞送藥劑(包括高分子量DNA)之能力。已向皮膚投與包括鎮痛劑、抗體、激素及高分子量DNA之化合物。大部分施用導致靶向上部表皮。
脂質體分為兩大類。陽離子脂質體為帶正電脂質體，其與帶負電DNA分子相互作用形成穩定複合物。帶正電DNA/脂質體複合物結合至帶負電細胞表面且在核內體中內化。由於內體內之pH呈酸性，因此脂質體破裂，將其內容物釋放至細胞質(Wang等人, Biochem. Biophys. Res. Commun., 1987, 147, 980-985)。
對pH敏感或帶負電之脂質體捕獲DNA而非與其複合。因為DNA及脂質皆帶類似電荷，發生斥力而非複合物形成。儘管如此，一些DNA包覆於此等脂質體之水性內部中。對pH敏感之脂質體已用於向培養物中之細胞單層遞送編碼胸苷激酶基因之DNA。在目標細胞中偵測到外源基因之表現(Zhou等人, Journal of Controlled Release, 1992, 19, 269-274)。
一種主要類型之脂質體組合物包括除天然衍生之磷脂醯膽鹼以外的磷脂。舉例而言，中性脂質體組合物可由二肉豆蔻醯基磷脂醯膽鹼(DMPC)或二棕櫚醯基磷脂醯膽鹼(DPPC)形成。陰離子脂質體組合物一般由二肉豆蔻醯基磷脂醯甘油形成，而陰離子促融脂質體主要由二油醯基磷脂醯乙醇胺(DOPE)形成。另一類型之脂質體組合物由磷脂醯膽鹼(PC)，諸如大豆PC及蛋PC形成。另一類型由磷脂及/或磷脂醯膽鹼及/或膽固醇之混合物形成。
若干研究已評估脂質藥物調配物至皮膚之表面遞送。含有干擾素之脂質體向天竺鼠皮膚之施用導致皮膚疱疹潰瘍減少，而經其他方式(例如作為溶液或作為乳液)遞送干擾素為低效的(Weiner等人, Journal of Drug Targeting, 1992, 2, 405-410)。此外，額外研究測試作為脂質調配物之部分投與干擾素相較於使用水性系統投與干擾素之功效，且得出結論脂質調配物優於水性投與(du Plessis等人, Antiviral Research, 1992, 18, 259-265)。
亦檢驗非離子脂質體系統以測定其在遞送藥物至皮膚中之效用，尤其包含非離子界面活性劑及膽固醇之系統。包含Novasome TMI (二月桂酸甘油酯/膽固醇/聚氧化乙烯-10-硬脂基醚)及Novasome TMII (二硬脂酸甘油酯/膽固醇/聚氧化乙烯-10-硬脂基醚)之非離子脂質體調配物用於向小鼠皮膚之真皮中遞送環孢素-A。結果指示此類非離子脂質系統有效促進環孢素A沈積至皮膚的不同層中(Hu等人. S.T.P. Pharma. Sci., 1994, 4, 6, 466)。
脂質體亦包括「空間穩定化」脂質體，該術語如本文所用係指包含一或多種在併入脂質體中時使得循環壽命相對於不具有此類特殊化脂質之脂質體延長的特殊化脂質之脂質體。空間穩定化脂質體之實例為其中脂質體之囊泡形成脂質部分的一部分(A)包含一或多種糖脂，諸如單唾液酸神經節苷脂G M1；或(B)經一或多種親水性聚合物，諸如聚乙二醇(PEG)部分衍生之脂質體。儘管不希望受任何特定理論約束，但此項技術中認為至少對於含有神經節苷脂、鞘磷脂或PEG衍生之脂質的空間穩定脂質體，此等空間穩定脂質體的延長之循環半衰期源於網狀內皮系統(RES)之細胞中的攝入減少(Allen等人, FEBS Letters, 1987, 223, 42；Wu等人, Cancer Research, 1993, 53, 3765)。
包含一或多種糖脂之多種脂質體為此項技術中已知。Papahadjopoulos等人( Ann. N.Y. Acad. Sci., 1987, 507, 64)報導單唾液酸神經節苷脂G M1、半乳糖腦苷脂硫酸鹽及磷脂醯肌醇改善脂質體之血液半衰期之能力。Gabizon等人( Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1988, 85, 6949)對此等研究結果進行了詳細說明。頒予Allen等人之美國專利第4,837,028號及WO 88/04924揭示包含以下之脂質體：(1)鞘磷脂及(2)神經節苷脂G M1或半乳糖腦苷脂硫酸酯。美國專利第5,543,152號(Webb等人)揭示包含鞘磷脂之脂質體。包含1,2-sn-二肉豆蔻醯基磷脂醯膽鹼之脂質體揭示於WO 97/13499 (Lim等人)中。
經一或多種親水性聚合物衍生之許多包含脂質之脂質體及其製備方法為此項技術中已知。Sunamoto等人(Bull. Chem. Soc. Jpn., 1980, 53, 2778)描述包含含有PEG部分之非離子型洗滌劑2C 1215G的脂質體。Illum等人( FEBS Lett., 1984, 167, 79)注意到使用聚合二醇親水性塗佈聚苯乙烯粒子使得血液半衰期顯著延長。Sears (美國專利第4,426,330號及第4,534,899號)描述藉由連接聚伸烷二醇(例如PEG)之羧基而修飾之合成磷脂。Klibanov等人( FEBS Lett., 1990, 268, 235)描述的實驗證明包含經PEG或PEG硬脂酸酯衍生之磷脂醯乙醇胺(PE)的脂質體具有顯著延長的血液循環半衰期。Blume等人( Biochimica et Biophysica Acta, 1990, 1029, 91)將此類觀察結果擴展至其他PEG衍生化磷脂，例如由二硬脂醯基磷脂醯乙醇胺(DSPE)與PEG之組合形成的DSPE-PEG。外表面上具有共價結合之PEG部分的脂質體描述於頒予Fisher之歐洲專利第EP 0 445 131 B1號及WO 90/04384中。Woodle等人(美國專利第5,013,556號及第5,356,633號)及Martin等人(美國專利第5,213,804號及歐洲專利第EP 0 496 813 B1號)描述含有1-20莫耳% PEG衍生化PE的脂質體組合物及其使用方法。包含多種其他脂質-聚合物結合物之脂質體揭示於WO 91/05545及美國專利第5,225,212號(皆頒予Martin等人)及WO 94/20073 (Zalipsky等人)中。包含PEG修飾之神經醯胺脂質的脂質體描述於WO 96/10391 (Choi等人)中。美國專利第5,540,935號(Miyazaki等人)及美國專利第5,556,948號(Tagawa等人)描述含有PEG之脂質體，其可經其表面上之官能部分進一步衍生。
許多包含核酸之脂質體為此項技術中已知。Thierry等人之WO 96/40062揭示用於將高分子量核酸囊封至脂質體中之方法。頒予Tagawa等人之美國專利第5,264,221號揭示蛋白質鍵結之脂質體且確證此類脂質體之內容物可包括dsRNA。頒予Rahman等人之美國專利第5,665,710號描述將寡去氧核苷酸囊封於脂質體中之某些方法。Love等人之WO 97/04787揭示包含靶向raf基因之dsRNA的脂質體。
轉移體為另一類型之脂質體，且為作為用於藥物遞送媒劑之有吸引力候選物的高度可變形脂質聚集物。轉移體可描述為脂質滴，其高度可變形使得能夠容易穿過小於液體之孔。轉移體可適應於其使用環境，例如其自行最佳化(適應皮膚中孔之形狀)、自行修復、通常到達其目標而不片段化，且通常自行裝載。為了製備轉移體，可向標準脂質體組合物添加表面邊緣活化劑，通常界面活性劑。轉移體已用於向皮膚遞送血清白蛋白。轉移體介導之血清白蛋白遞送已展示為與皮下注射含有血清白蛋白之溶液一樣有效。
界面活性劑廣泛應用於諸如乳液(包括微乳液)及脂質體之調配物中。許多不同類型之界面活性劑(天然及合成)之特性的最常見分類及分級方式係藉由使用親水/親油平衡(HLB)。親水性基團(亦稱為「頭(head)」)之性質提供將調配物中所用不同界面活性劑分類之最適用方式(Rieger, Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker Inc., New York, N.Y., 1988, 第285頁)。
若界面活性劑分子未經離子化，則其歸類為非離子界面活性劑。非離子界面活性劑在醫藥及化妝產品中有廣泛應用且可在廣泛pH值範圍下使用。一般而言，視其結構而定，其HLB值在2至約18範圍內。非離子界面活性劑包括非離子酯，諸如乙二醇酯、丙二醇酯、甘油酯、聚甘油酯、脫水山梨糖醇酯、蔗糖酯及乙氧化酯。此類別中亦包括非離子烷醇醯胺及醚，諸如脂肪醇乙氧化物、丙氧化醇及乙氧化/丙氧化嵌段聚合物。聚氧化乙烯界面活性劑為非離子界面活性劑類別之最常用成員。
若界面活性劑分子當其溶解或分散於水中時攜帶負電荷，則界面活性劑分類為陰離子型。陰離子界面活性劑包括羧酸酯，諸如皂類；乳酸醯基酯；胺基酸之醯胺；硫酸酯，諸如硫酸烷基酯及硫酸乙氧化烷基酯；磺酸酯，諸如烷基苯磺酸酯、羥乙基磺酸醯基酯、牛磺酸醯基酯及磺基丁二酸醯基酯；及磷酸酯。陰離子界面活性劑類別之最重要成員為硫酸烷基酯及皂類。
若界面活性劑分子當其溶解或分散於水中時攜帶正電荷，則界面活性劑分類為陽離子型。陽離子界面活性劑包括四級銨鹽及乙氧化胺。四級銨鹽為此類別之最常用成員。
若界面活性劑分子能夠攜帶正電荷或負電荷，則界面活性劑分類為兩性型。兩性界面活性劑包括丙烯酸衍生物、經取代之烷基醯胺、N-烷基甜菜鹼及磷脂。
已綜述藥品、調配物及乳液中界面活性劑之用途(Rieger, Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker Inc., New York, N.Y., 1988, 第285頁)。
B. 核酸脂質粒子在一些實施例中，本發明所提供之MYOC dsRNA完全囊封於脂質調配物中，例如以形成SPLP、pSPLP、SNALP或其他核酸-脂質粒子。SNALP及SPLP通常含有陽離子脂質、非陽離子脂質及防止粒子聚集之脂質(例如PEG-脂質結合物)。SNALP及SPLP極其適用於全身施用，因為其在靜脈內(i.v.)注射後展現延長的循環壽命且在遠端部位積累(例如身體上與投與部位分開之部位)。SPLP包括「pSPLP」，包括如PCT公開案第WO 00/03683號中所述之經囊封的濃縮劑-核酸複合物。本發明之粒子通常具有約50 nm至約150 nm，更通常約60 nm至約130 nm，更通常約70 nm至約110 nm，最通常約70 nm至約90 nm之平均直徑且基本上無毒。此外，核酸當存在於本發明之核酸-脂質粒子中時，在水性溶液中對核酸酶降解具有抗性。核酸-脂質粒子及其製備方法揭示於例如美國專利第5,976,567號；第5,981,501號；第6,534,484號；第6,586,410號；第6,815,432號及PCT公開案第WO 96/40964號中。
在一些實施例中，脂質:藥物比(質量/質量比) (例如脂質:dsRNA比)將在約1:1至約50:1、約1:1至約25:1、約3:1至約15:1、約4:1至約10:1、約5:1至約9:1或約6:1至約9:1範圍內。
陽離子型脂質可為例如氯化N,N-二油基-N,N-二甲基銨(DODAC)、溴化N,N-二硬脂基-N,N-二甲基銨(DDAB)、氯化N-(1-(2,3-二油醯氧基)丙基)-N,N,N-三甲基銨(DOTAP)、氯化N-(1-(2,3-二油烯基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基銨(DOTMA)、N,N-二甲基-2,3-二油烯基氧基)丙胺(DODMA)、1,2-二次亞油基氧基-N,N-二甲基胺基丙烷(DLinDMA)、1,2-二次亞麻油基氧基-N,N-二甲基胺基丙烷(DLenDMA)、1,2-二亞油基胺甲醯基氧基-3-二甲基胺基丙烷(DLin-C-DAP)、1,2-二亞油基氧基-3-(二甲胺基)乙醯氧基丙烷(DLin-DAC)、1,2-二亞油基氧基-3-𠰌啉基丙烷(DLin-MA)、1,2-二亞油醯基-3-二甲基胺基丙烷(DLinDAP)、1,2-二亞油基硫基-3-二甲基胺基丙烷(DLin-S-DMA)、1-亞油醯基-2-亞油基氧基-3-二甲基胺基丙烷(DLin-2-DMAP)、氯化1,2-二亞油基氧基-3-三甲基胺基丙烷鹽(DLin-TMA.Cl)、氯化1,2-二亞油醯基-3-三甲基胺基丙烷鹽(DLin-TAP.Cl)、1,2-二亞油基氧基-3-(N-甲基哌𠯤基)丙烷(DLin-MPZ)或3-(N,N-二亞油基胺基)-1,2-丙二醇(DLinAP)、3-(N,N-二油基胺基)-1,2-丙二醇(DOAP)、1,2-二亞油基側氧基-3-(2-N,N-二甲胺基)乙氧基丙烷(DLin-EG-DMA)、1,2-二次亞麻油基氧基N,N-二甲基胺基丙烷(DLinDMA)、2,2-二亞麻油基-4-二甲胺基甲基-[1,3]-二氧雜環戊烷(DLin -K-DMA)或其類似物、(3aR,5s,6aS)-N,N-二甲基-2,2-二((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基)四氫-3aH-環戊并[d][1,3]二氧雜環戊烯-5-胺(ALN100)、4-(二甲胺基)丁酸(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基酯(MC3)、1,1'-(2-(4-(2-((2-(雙(2-羥基十二烷基)胺基)乙基)(2-羥基十二烷基)胺基)乙基)哌𠯤-1-基)乙基氮烷二基)二十二烷-2-醇(Tech G1)，或其混合物。陽離子脂質可占粒子中存在之總脂質的約20 mol%至約50 mol%或約40 mol%。
在一些實施例中，化合物2,2-二亞油基-4-二甲胺基乙基-[1,3]-二氧戊環可用於製備脂質-siRNA奈米粒子。2,2-二亞油基-4-二甲胺基乙基-[1,3]-二氧雜環戊烷之合成描述於2008年10月23日申請之美國臨時專利申請案第61/107,998號中，其以引用的方式併入本文中。
在一些實施例中，脂質-siRNA粒子包括40% 2,2-二亞麻油基-4-二甲胺基乙基-[1,3]-二氧雜環戊烷:10% DSPC:40%膽固醇:10% PEG-C-DOMG (莫耳百分比)，粒度為63.0±20 nm且siRNA/脂質比為0.027。
非陽離子脂質可為陰離子脂質或中性脂質，包括但不限於二硬脂醯基磷脂醯膽鹼(DSPC)、二油醯基磷脂醯膽鹼(DOPC)、二棕櫚醯基磷脂醯膽鹼(DPPC)、二油醯基磷脂醯丙三醇(DOPG)、二棕櫚醯基磷脂醯丙三醇(DPPG)、二油醯基-磷脂醯乙醇胺(DOPE)、棕櫚醯基油醯基磷脂醯膽鹼(POPC)、棕櫚醯基油醯基磷脂醯乙醇胺(POPE)、二油醯基-磷脂醯乙醇胺4-(N-馬來醯亞胺基甲基)-環己烷-l-甲酸酯(DOPE-mal)、二棕櫚醯基磷脂醯乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻醯基磷乙醇胺(DMPE)、二硬脂醯基-磷脂醯基-乙醇胺(DSPE)、16-O-單甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反PE、1-硬脂醯基-2-油醯基-磷脂醯乙醇胺(SOPE)、膽固醇或其混合物。若包括膽固醇，則非陽離子脂質可為粒子中存在之總脂質的約5莫耳%至約90莫耳%，約10莫耳%，或約58莫耳%。
抑制粒子聚集之結合脂質可為例如聚乙二醇(PEG)-脂質，包括(但不限於)PEG-二醯基甘油(DAG)、PEG-二烷氧基丙基(DAA)、PEG-磷脂、PEG-神經醯胺(Cer)或其混合物。PEG-DAA結合物可為例如PEG-二月桂基氧基丙基(Ci 2)、PEG-二肉豆蔻基氧基丙基(Ci 4)、PEG-二棕櫚基氧基丙基(Ci 6)或PEG-二硬脂基氧基丙基(Ci 8)。防止粒子聚集之結合脂質可為粒子中存在之總脂質的約0莫耳%至約20莫耳%或約2莫耳%。
在一些實施例中，核酸-脂質粒子進一步包含例如占粒子中存在之總脂質的約10莫耳%至約60莫耳%或約48莫耳%的膽固醇。
在一些實施例中，iRNA在脂質奈米粒子(LNP)中調配。
LNP01在一些實施例中，類脂質ND98∙4HCl (MW 1487) (參見2008年3月26日申請之美國專利申請案第12/056,230號，其以引用的方式併入本文中)、膽固醇(Sigma-Aldrich)及PEG-神經醯胺C16 (Avanti Polar Lipids)可用於製備脂質-dsRNA奈米粒子(例如LNP01粒子)。各自於乙醇中之儲備溶液可如下製備：ND98，133 mg/ml；膽固醇，25 mg/ml；PEG-神經醯胺C16，100 mg/ml。ND98、膽固醇及PEG-神經醯胺C16儲備溶液接著可以例如42:48:10莫耳比合併。合併的脂質溶液可與水性dsRNA混合(例如在乙酸鈉pH 5中)，使得最終乙醇濃度為約35-45%且最終乙酸鈉濃度為約100-300 mM。脂質-dsRNA奈米粒子通常在混合時自發形成。視所要粒徑分佈而定，所得奈米粒子混合物可使用Thermobarrel擠壓機，諸如Lipex擠壓機(Northern Lipids, Inc)經聚碳酸酯膜(例如100 nm截止)擠出。在一些情形下，擠壓步驟可為省略。可藉由例如透析或切向流過濾實現乙醇移除及同時緩衝液交換。緩衝液可用例如約pH 7，例如約pH 6.9、約pH 7.0、約pH 7.1、約pH 7.2、約pH 7.3或約pH 7.4之磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)交換。
Figure 02_image126
式1
LNP01調配物描述於例如國際申請公開案第WO 2008/042973號中，其以引用的方式併入本文中。
其他例示性脂質-dsRNA調配物提供於下表中。 表 4 ：例示性脂質調配物
陽離子脂質 陽離子脂質/ 非陽離子脂質/ 膽固醇/PEG- 脂質結合物 脂質:siRNA 比率
SNALP 1,2-二次亞麻油氧基-N,N-二甲基胺基丙烷(DLinDMA) DLinDMA/DPPC/膽固醇/PEG-cDMA (57.1/7.1/34.4/1.4) 脂質:siRNA ~ 7:1
S-XTC 2,2-二次亞油基-4-二甲胺基乙基-[1,3]-二氧雜環戊烷(XTC) XTC/DPPC/膽固醇/PEG-cDMA 57.1/7.1/34.4/1.4 脂質:siRNA ~ 7:1
LNP05 2,2-二次亞油基-4-二甲胺基乙基-[1,3]-二氧雜環戊烷(XTC) XTC/DSPC/膽固醇/PEG-DMG 57.5/7.5/31.5/3.5 脂質:siRNA ~ 6:1
LNP06 2,2-二次亞油基-4-二甲胺基乙基-[1,3]-二氧雜環戊烷(XTC) XTC/DSPC/膽固醇/PEG-DMG 57.5/7.5/31.5/3.5 脂質:siRNA ~ 11:1
LNP07 2,2-二次亞油基-4-二甲胺基乙基-[1,3]-二氧雜環戊烷(XTC) XTC/DSPC/膽固醇/PEG-DMG 60/7.5/31/1.5, 脂質:siRNA ~ 6:1
LNP08 2,2-二次亞油基-4-二甲胺基乙基-[1,3]-二氧雜環戊烷(XTC) XTC/DSPC/膽固醇/PEG-DMG 60/7.5/31/1.5, 脂質:siRNA ~ 11:1
LNP09 2,2-二次亞油基-4-二甲胺基乙基-[1,3]-二氧雜環戊烷(XTC) XTC/DSPC/膽固醇/PEG-DMG 50/10/38.5/1.5 脂質:siRNA 10:1
LNP10 (3aR,5s,6aS)-N,N-二甲基-2,2-二((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基)四氫-3aH-環戊并[d][1,3]二氧雜環戊烯-5-胺(ALN100) ALN100/DSPC/膽固醇/PEG-DMG 50/10/38.5/1.5 脂質:siRNA 10:1
LNP11 4-(二甲基胺基)丁酸(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基酯(MC3) MC-3/DSPC/膽固醇/PEG-DMG 50/10/38.5/1.5 脂質:siRNA 10:1
LNP12 1,1'-(2-(4-(2-((2-(雙(2-羥基十二烷基)胺基)乙基)(2-羥基十二烷基)胺基)乙基)哌𠯤-1-基)乙基氮烷二基)二十二烷-2-醇(C12-200) C12-200/DSPC/膽固醇/PEG-DMG 50/10/38.5/1.5 脂質:siRNA 10:1
LNP13 XTC XTC/DSPC/Chol/PEG-DMG 50/10/38.5/1.5 脂質:siRNA：33:1
LNP14 MC3 MC3/DSPC/Chol/PEG-DMG 40/15/40/5 脂質:siRNA：11:1
LNP15 MC3 MC3/DSPC/Chol/PEG-DSG/GalNAc-PEG-DSG 50/10/35/4.5/0.5 脂質:siRNA：11:1
LNP16 MC3 MC3/DSPC/Chol/PEG-DMG 50/10/38.5/1.5 脂質:siRNA：7:1
LNP17 MC3 MC3/DSPC/Chol/PEG-DSG 50/10/38.5/1.5 脂質:siRNA：10:1
LNP18 MC3 MC3/DSPC/Chol/PEG-DMG 50/10/38.5/1.5 脂質:siRNA：12:1
LNP19 MC3 MC3/DSPC/Chol/PEG-DMG 50/10/35/5 脂質:siRNA：8:1
LNP20 MC3 MC3/DSPC/Chol/PEG-DPG 50/10/38.5/1.5 脂質:siRNA：10:1
LNP21 C12-200 C12-200/DSPC/Chol/PEG-DSG 50/10/38.5/1.5 脂質:siRNA：7:1
LNP22 XTC XTC/DSPC/Chol/PEG-DSG 50/10/38.5/1.5 脂質:siRNA：10:1
DSPC：二硬脂醯基磷脂醯膽鹼 DPPC：二棕櫚醯基磷脂醯膽鹼 PEG-DMG：PEG-二-二肉豆蔻醯基甘油(C14-PEG或PEG-C14) (PEG之平均莫耳重量為2000) PEG-DSG：PEG-二苯乙烯基甘油(C18-PEG或PEG-C18) (PEG之平均莫耳重量為2000) PEG-cDMA：PEG-胺甲醯基-1,2-二肉豆蔻基氧基丙基胺(PEG之平均莫耳重量為2000)
包含SNALP (l,2-二次亞麻油基氧基-N,N-二甲基胺基丙烷(DLinDMA))之調配物描述於2009年4月15日申請之國際公開案第WO2009/127060號中，其以引用的方式併入本文中。
包含XTC之調配物描述於例如2009年1月29日申請之美國臨時第61/148,366號；2009年3月2日申請之美國臨時第61/156,851號；2009年6月10日申請之美國臨時第61/185,712號；2009年7月24日申請之美國臨時第61/228,373號；2009年9月3日申請之美國臨時第61/239,686號及2010年1月29日申請之國際申請案第PCT/US2010/022614號中,其以引用的方式併入本文中。
包含MC3之調配物描述於例如2009年9月22日申請之美國臨時第61/244,834號；2009年6月10日申請之美國臨時第61/185,800號及2010年6月10日申請之國際申請案第PCT/US10/28224號，其以引用的方式併入本文中。
包含ALNY-100之調配物描述於例如2009年11月10日申請之國際專利申請案第PCT/US09/63933號中，其以引用的方式併入本文中。
包含C12-200之調配物描述於2009年5月5日申請之美國臨時第61/175,770號及2010年5月5日申請之國際申請案第PCT/US10/33777號中，其以引用的方式併入本文中。
C. 合成陽離子脂質本發明所提供之核酸-脂質粒子中所用之化合物(例如陽離子脂質及其類似物)中之任一者可藉由已知有機合成技術製備。除非另外規定，否則所有取代基如下文所定義。
「烷基」意謂含有1至24個碳原子的直鏈或分支鏈非環狀或環狀飽和脂族烴。代表性飽和直鏈烷基包括甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基及其類似基團；而飽和分支鏈烷基包括異丙基、二級丁基、異丁基、三級丁基、異戊基及其類似基團。代表性飽和環烷基包括環丙基、環丁基、環戊基、環己基及其類似基團；而不飽和環烷基包括環戊烯基及環己烯基及其類似基團。
「烯基」意謂相鄰碳原子之間含有至少一個雙鍵的如上文所定義之烷基。烯基包含順式及反式異構體兩者。代表性直鏈及分支鏈烯基包括乙烯基、丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、異丁烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-甲基-1-丁烯基、2-甲基-2-丁烯基、2,3-二甲基-2-丁烯基及其類似烯基。
「炔基」意謂相鄰碳之間額外含有至少一個參鍵的如上文所定義之任何烷基或烯基。代表性直鏈及分支鏈炔基包括乙炔基、丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、3-甲基-1-丁炔基及其類似炔基。
「醯基」意謂連接點處之碳經側氧基取代的任何烷基、烯基或炔基，如下文所定義。舉例而言，-C(=O)烷基、-C(=O)烯基及-C(=O)炔基為醯基。
「雜環」意謂5至7員單環或7至10員雙環雜環，其為飽和、不飽和或芳族的且含有1或2個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子，且其中氮及硫雜原子可視情況經氧化，且氮雜原子可視情況經四級銨化，包括上述雜環中之任一者稠合至苯環的雙環。雜環可經任何雜原子或碳原子連接。雜環包括如下所定義之雜芳基。雜環包括𠰌啉基、吡咯啶酮基、吡咯啶基、哌啶基、哌𠯤基(piperizynyl)、內醯脲基、戊內醯胺基、環氧乙基、氧雜環丁烷基、四氫呋喃基、四氫哌喃基、四氫吡啶基、四氫嘧啶基、四氫噻吩基、四氫硫代哌喃基、四氫嘧啶基、四氫噻吩基、四氫硫代哌喃基及其類似雜環。
術語「視情況經取代之烷基」、「視情況經取代之烯基」、「視情況經取代之炔基」、「視情況經取代之醯基」及「視情況經取代之雜環」意謂當經取代時，至少一個氫原子置換為取代基。在側氧基取代基(=O)之情況下，兩個氫原子經置換。就此而言，取代基包括側氧基、鹵素、雜環、-CN、-OR x、-NR xR y、-NR xC(=O)R y、-NR xSO 2R y、-C(=O)R x、-C(=O)OR x、-C(=O)NR xR y、-SO nR x及-SO nNR xR y，其中n為0、1或2，R x及R y相同或不同且獨立地為氫、烷基或雜環，且該烷基及雜環取代基各自可經以下中之一或多者進一步取代：側氧基、鹵素、-OH、-CN、烷基、-OR x、雜環、-NR xR y、-NR xC(=O)R y、-NR xSO 2R y、-C(=O)R x、-C(=O)OR x、-C(=O)NR xR y、-SO nR x及-SO nNR xR y。
「鹵素」意謂氟、氯、溴及碘。
在一些實施例中，本發明所提供之方法可能需要使用保護基。保護基方法為熟習此項技術者所熟知(參見例如PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS, Green, T.W.等人, Wiley-Interscience, New York City, 1999)。簡言之，本發明上下文中之保護基為降低或消除官能基之非所需反應性的任何基團。在某些反應期間可向官能基添加保護基以遮蔽其反應性，接著移除以揭示原始官能基。在一些實施例中，使用「醇保護基」。「醇保護基」為降低或消除醇官能基之非所需反應性的任何基團。可使用此項技術中熟知之技術添加及移除保護基。
合成式 A在一些實施例中，使用式A之陽離子脂質調配本發明所提供之核酸-脂質粒子：
Figure 02_image128
, 其中R1及R2獨立地為烷基、烯基或炔基，其各自可視情況經取代，且R3及R4獨立地為低碳烷基或R3與R4可結合在一起形成視情況經取代之雜環。在一些實施例中，陽離子脂質為XTC (2,2-二次亞油基-4-二甲胺基乙基-[1,3]-二氧雜環戊烷)。一般而言，除非另外規定，否則上述式A之脂質可藉由以下反應流程1或2製備，其中全部取代基如上文所定義。
流程1
Figure 02_image130
脂質A可根據流程1製備，其中R 1及R 2獨立地為各自可視情況經取代之烷基、烯基或炔基，且R 3及R 4獨立地為低碳數烷基或R 3與R 4可結合在一起形成視情況經取代之雜環。可購買或根據一般技術者已知之方法製備酮1及溴化物2。1與2反應產生縮酮3。用胺4處理縮酮3產生式A之脂質。式A之脂質可使用式5之有機鹽轉化為相應銨鹽，其中X為選自鹵素、氫氧根、磷酸根、硫酸根或其類似離子的陰離子相對離子。
流程2
Figure 02_image132
或者，酮1起始物質可根據流程2製備。格林納試劑(格林納試劑) 6及氰化物7可購買或根據一般技術者已知之方法製備。6與7反應產生酮1。如流程1中所描述將酮1轉化成相應式A之脂質。
合成 MC3如下製備DLin-M-C3-DMA (亦即，(4-(二甲胺基))丁酸(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基酯)。(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-醇(0.53 g)、4-N,N-二甲基胺基丁酸鹽酸鹽(0.51 g)、4-N,N-二甲胺基吡啶(0.61 g)及1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(0.53 g)於二氯甲烷(5 mL)中之溶液在室溫下攪拌隔夜。溶液用稀鹽酸，隨後稀碳酸氫鈉水溶液洗滌。有機溶離份經無水硫酸鎂乾燥，過濾且在旋轉蒸發儀上移除溶劑。使用1-5%甲醇/二氯甲烷溶離梯度，使殘餘物向下通過矽膠管柱(20 g)。將含有經純化產物之溶離份合併且移除溶劑，產生無色油狀物(0.54 g)。
合成 ALNY-100使用以下流程3進行縮酮519[ALNY-100]之合成：
Figure 02_image134
合成515： 在氮氣氛圍下，在0℃下，向二頸RBF (1 L)中LiAlH4 (3.74 g，0.09852 mol)於200 ml無水THF中之攪拌懸浮液中緩慢添加514 (10 g，0.04926 mol)於70 mL THF中之溶液。完全添加之後，將反應混合物升溫至室溫且接著加熱至回流維持4小時。藉由TLC監測反應進程。反應完成(根據TLC)後，使混合物冷卻至0℃且藉由小心添加飽和Na2SO4溶液淬滅。在室溫下攪拌反應混合物4小時且濾出。殘餘物用THF充分洗滌。混合濾液及洗滌液且用400 mL二㗁烷及26 mL濃HCl稀釋，且在室溫下攪拌20分鐘。在真空下去除揮發物，得到呈白色固體狀之515鹽酸鹽。產量：7.12 g 1H-NMR (DMSO, 400MHz): δ= 9.34 (寬, 2H), 5.68 (s, 2H), 3.74 (m, 1H), 2.66-2.60 (m, 2H), 2.50-2.45 (m, 5H)。
合成516： 向250 mL二頸RBF中的化合物515於100 mL無水DCM中之攪拌溶液中添加NEt3 (37.2 mL，0.2669 mol)且在氮氣氛圍下冷卻至0℃。緩慢添加含N-(苯甲氧基-羰氧基)-丁二醯亞胺(20 g，0.08007 mol)之50 mL無水DCM後，使反應混合物升溫至室溫。反應完成後(2-3小時，根據TLC)，混合物依序用1 N HCl溶液(1×100 mL)及NaHCO3飽和溶液(1×50 mL)洗滌。有機層接著經無水Na2SO4乾燥且蒸發溶劑，獲得粗物質，藉由矽膠管柱層析純化，獲得呈黏塊狀之516。產量：11 g (89%)。1H-NMR (CDCl3, 400MHz): δ = 7.36-7.27(m, 5H), 5.69 (s, 2H), 5.12 (s, 2H), 4.96 (br., 1H) 2.74 (s, 3H), 2.60(m, 2H), 2.30-2.25(m, 2H)。LC-MS [M+H] -232.3 (96.94%)。
合成517A及517B： 在單頸500 mL RBF中將環戊烯516 (5 g，0.02164 mol)溶解於220 mL丙酮及水(10:1)溶液中，且在室溫下向其中添加N-甲基𠰌啉-N-氧化物(7.6 g，0.06492 mol)，隨後添加4.2 mL 7.6% OsO4 (0.275 g，0.00108 mol)於三級丁醇中之溶液。反應完成後(約3小時)，藉由添加固體Na2SO3淬滅混合物且在室溫下攪拌所得混合物1.5小時。反應混合物用DCM (300 mL)稀釋且用水(2×100 mL)洗滌，隨後用飽和NaHCO3 (1×50 mL)溶液、水(1×30 mL)及最終用鹽水(1×50 mL)洗滌。有機相經Na2SO4乾燥且在真空中移除溶劑。對粗物質進行矽膠管柱層析純化，獲得非對映異構體之混合物，其藉由製備型HPLC分離。產量：- 6 g粗物質
517A - 峰-1 (白色固體), 5.13 g (96%). 1H-NMR (DMSO, 400MHz): δ= 7.39-7.31(m, 5H), 5.04(s, 2H), 4.78-4.73 (m, 1H), 4.48-4.47(d, 2H), 3.94-3.93(m, 2H), 2.71(s, 3H), 1.72- 1.67(m, 4H). LC-MS - [M+H]-266.3, [M+NH4 +]-283.5存在, HPLC-97.86%。藉由X射線確認立體化學。
合成518： 利用與針對化合物505合成所述類似之程序，獲得呈無色油狀之化合物518 (1.2 g，41%)。1H-NMR (CDCl3, 400MHz): δ= 7.35-7.33(m, 4H), 7.30-7.27(m, 1H), 5.37-5.27(m, 8H), 5.12(s, 2H), 4.75(m,1H), 4.58-4.57(m,2H), 2.78-2.74(m,7H), 2.06-2.00(m,8H), 1.96-1.91(m, 2H), 1.62(m, 4H), 1.48(m, 2H), 1.37-1.25(br m, 36H), 0.87(m, 6H)。HPLC-98.65%。
用於合成化合物519之通用程序： 以逐滴方式將化合物518 (1當量)於己烷(15 mL)中之溶液添加至LAH於THF中之冰冷之溶液(1 M，2當量)。完成添加後，混合物在40℃下加熱0.5小時，接著再於冰浴上冷卻。混合物用Na2SO4飽和水溶液小心地水解，接著經矽藻土過濾且縮減成油狀物。管柱層析得到呈無色油狀之純519 (1.3 g，68%)。13C NMR  = 130.2, 130.1 (x2), 127.9 (x3), 112.3, 79.3, 64.4, 44.7, 38.3, 35.4, 31.5, 29.9 (x2), 29.7, 29.6 (x2), 29.5 (x3), 29.3 (x2), 27.2 (x3), 25.6, 24.5, 23.3, 226, 14.1; 電噴霧MS (+ve)：C44H80NO2 (M + H)+分子量計算值654.6，實驗值654.6。
藉由標準方法或無擠壓方法製備之調配物可以類似方式表徵。舉例而言，調配物通常經目測表徵。其應為不含聚集物或沈降物之半透明發白溶液。脂質-奈米粒子之粒徑及粒徑分佈可使用例如Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern, USA)藉由光散射量測。粒子之尺寸應為約20-300 nm，諸如40-100 nm。粒徑分佈應為單峰式的。使用染料排斥分析法估算調配物中之總dsRNA濃度以及截留分率。經調配dsRNA之樣品可與RNA結合染料(諸如Ribogreen (Molecular Probes))一起在破壞調配之界面活性劑(例如0.5% Triton-X100)存在或不存在下培育。調配物中之總dsRNA可利用含有界面活性劑之樣品的信號、相對於標準曲線測定。藉由自總dsRNA含量減去「游離」dsRNA含量(以藉由在無界面活性劑存在下之信號所量測)測定捕獲分數。截留之dsRNA百分比通常＞85%。SNALP調配物的粒度為至少30 nm、至少40 nm、至少50 nm、至少60 nm、至少70 nm、至少80 nm、至少90 nm、至少100 nm、至少110 nm及至少120 nm。適合範圍通常為至少約50 nm至至少約110 nm、至少約60 nm至至少約100 nm、或至少約80 nm至至少約90 nm。
用於經口投與之組合物及調配物包括粉末或顆粒、微粒、奈米微粒、水或非水性介質中之懸浮液或溶液、膠囊、凝膠膠囊、藥囊、錠劑或微錠劑。可能需要增稠劑、調味劑、稀釋劑、乳化劑、分散助劑或黏合劑。在一些實施例中，經口調配物為本發明所提供之dsRNA與一或多種穿透增強界面活性劑及螯合劑聯合投與的調配物。適合的界面活性劑包括脂肪酸及/或其酯或鹽、膽酸及/或其鹽。適合的膽酸/鹽包括鵝膽酸(CDCA)及熊去氧鵝去氧膽酸(UDCA)、膽酸、去氫膽酸、去氧膽酸、穀胺膽酸, 甘胺膽酸、甘胺去氧膽酸、牛磺膽酸、牛磺去氧膽酸、牛磺-24,25-二氫-夫西地酸鈉及甘胺二氫夫西地酸鈉。適合的脂肪酸包括花生四烯酸、十一烷酸、油酸、月桂酸、辛酸、癸酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞麻油酸、次亞麻油酸、二癸酸酯、三癸酸酯、單油酸甘油酯、二月桂酸甘油酯、1-單癸酸甘油酯、1-十二烷基氮雜環庚-2-酮、醯基肉鹼、醯基膽鹼或單甘油酯、二甘油酯或其醫藥學上可接受之鹽(例如鈉)。在一些實施例中，使用穿透增強劑之組合，例如脂肪酸/鹽與膽酸/鹽之組合。一個例示性組合為月桂酸、癸酸及UDCA之鈉鹽。其他穿透增強劑包括聚氧化乙烯-9-月桂基醚、聚氧化乙烯-20-鯨蠟基醚。本發明所提供之DsRNA可以包括噴霧乾燥粒子之顆粒形式或複合形成微米或奈米粒子之顆粒形式經口遞送。DsRNA複合劑包括聚胺基酸；聚亞胺；聚丙烯酸酯；聚烷基丙烯酸酯、聚氧雜環丁烷、聚烷基氰基丙烯酸酯；陽離子化明膠、白蛋白、澱粉、丙烯酸酯、聚乙二醇(PEG)及澱粉；聚烷基氰基丙烯酸酯；DEAE衍生之聚亞胺、短梗黴多糖(pollulan)、纖維素及澱粉。適合複合劑包括聚葡萄胺糖、N-三甲基聚葡萄胺糖、聚-L-離胺酸、聚組胺酸、聚鳥胺酸、聚精胺、魚精蛋白、聚乙烯吡啶、聚硫代二乙基胺基甲基乙烯P (TDAE)、聚胺基苯乙烯(例如對胺基)、聚(甲基氰基丙烯酸酯)、聚(乙基氰基丙烯酸酯)、聚(丁基氰基丙烯酸酯)、聚(異丁基氰基丙烯酸酯)、聚(異己基氰基丙烯酸酯)、DEAE-甲基丙烯酸脂、DEAE-丙烯酸己酯、DEAE-丙烯醯胺、DEAE-白蛋白及DEAE-聚葡萄糖、聚丙烯酸甲酯、聚丙烯酸己酯、聚(D,L-乳酸)、聚(DL-乳酸-共-乙醇酸(PLGA)、海藻酸酯及聚乙二醇(PEG)。dsRNA口服調配物及其製備詳細描述於美國專利6,887,906、美國公開案第20030027780號及美國專利第6,747,014號，其各自以引用的方式併入本文中。
用於非經腸、腦實質內(腦中)、鞘內、玻璃體內、視網膜下、經鞏膜、結膜下、眼球後、前房內、室內或肝內投與之組合物及調配物可包括無菌水溶液，其亦可含有緩衝劑、稀釋劑及其他適合的添加劑，諸如但不限於滲透增強劑、載劑化合物及其他醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。
本發明之醫藥組合物包括但不限於溶液、乳液及含有脂質體之調配物。此等組合物可由多種組分產生，包括(但不限於)預成型液體、自身乳化固體及自身乳化半固體。
本發明特性化之醫藥調配物宜呈單位劑型，其可根據醫藥行業中熟知之習知技術製備。此類技術包括使活性成分與一或多種醫藥載劑或一或多種賦形劑結合之步驟。一般而言，藉由使活性成分與液體載劑或細粉狀固體載劑或兩者均勻且緊密結合且隨後必要時使產物成形來製備調配物。
本發明特性化之組合物可調配成許多可能劑型中之任一者，諸如但不限於錠劑、膠囊、凝膠膠囊、液體糊漿、軟凝膠、栓劑及灌腸劑。組合物亦可在水性、非水性或混合介質中調配成懸浮液。水性懸浮液可另外含有提高懸浮液黏度之物質，包括例如羧基甲基纖維素鈉、山梨糖醇及/或聚葡萄糖。懸浮液亦可含有穩定劑。
D. 額外調配物 i. 乳液
本發明之組合物可製備及調配為乳液。乳液通常為一種液體以直徑通常超過0.1 μm之微滴形式分散於另一液體中之非均質系統(參見例如Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., 及Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (第8版), New York, NY; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger及Banker (編), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 第1卷, 第199頁; Rosoff, 於Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger及Banker (編), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 第1卷, 第245頁; Block於 Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger及Banker (編), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 第2卷, 第335頁; Higuchi等人, 於Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, 第301頁)。乳液通常為包含兩個彼此緊密混合及分散的不可混溶之液相的兩相系統。一般而言，乳液可為油包水(w/o)或水包油(o/w)變體。當水相細分成微小液滴且作為微小液滴分散至主體油相中時，所得組合物稱為油包水(w/o)乳液。或者，當油相細分成微小液滴且作為微小液滴分散至主體水相中時，所得組合物稱為水包油(o/w)乳液。乳液可另外含有除分散相之外的組分，及可以水相、油相或本身呈分離相之溶液的形式存在的活性藥物。乳液中亦可根據需要存在如乳化劑、穩定劑、染料及抗氧化劑之醫藥賦形劑。醫藥乳液亦可為由兩個以上相構成的多種乳液，諸如油包水包油(o/w/o)及水包油包水(w/o/w)乳液的情形。此類複雜調配物通常提供簡單二元乳液不能提供之某些優勢。其中o/w乳液之個別小油滴圍封小水滴的多種乳液構成w/o/w乳液。同樣，圍封小油之水珠穩定存在於連續油相中的系統提供o/w/o乳液。
乳液之特徵在於熱力學穩定性極低或無熱力學穩定性。通常，乳液之分散相或不連續相良好分散於外部或連續相中且藉助於乳化劑或調配物之黏度維持此形式。如乳液型軟膏基劑及乳霜之情形中，乳液之任一相可為半固體或固體。其他穩定乳液之方式需要使用可併入中乳液中之任一相中的乳化劑。乳化劑可寬泛地分為四個類別：合成界面活性劑、天然存在之乳化劑、吸收基質及精細分散固體(參見例如Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen, LV., Popovich NG., 及Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (第8版), New York, NY; Idson, 於 Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger及Banker (編), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 第1卷, 第199頁)。
合成界面活性劑，亦稱為表面活性劑，已廣泛應用於乳液調配且已評述於文獻中(參見Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., 及Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (第8版), New York, NY; Rieger, 於 Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (編), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 第1卷, 第285頁; Idson, 於 Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger及Banker (編), Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, 第1卷, 第199頁)。界面活性劑通常為兩親媒性的且包含親水性及疏水性部分。界面活性劑之親水性/疏水性比率被稱為親水/親油平衡(HLB)且為調配物製備中分類及選擇界面活性劑的重要工具。界面活性劑可基於親水性基團之性質分為不同類別：非離子、陰離子、陽離子及兩性(參見例如Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., 及Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (第8版), New York, NY Rieger, 於 Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger及Banker (編), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 第1卷, 第285頁)。
乳液調配物中所用之天然存在之乳化劑包括羊毛脂、蜂蠟、磷脂、卵磷脂及阿拉伯膠。吸收基劑具有親水性特性使得其可吸取水以形成w/o乳液，但仍保留其半固體稠度，諸如無水羊毛脂及親水性石蠟脂。細粉狀固體亦已用作良好乳化劑，尤其與界面活性劑組合及在黏稠製備物中。此等包括極性無機固體，諸如重金屬氫氧化物；不膨脹黏土，諸如膨潤土、綠坡縷石、鋰皂石、高嶺土、蒙脫石、膠態矽酸鋁及膠態矽酸鎂鋁；顏料及非極性固體，諸如碳或三硬脂酸甘油酯。
乳液調配物中亦包括多種非乳化物質且該等物質有助於乳液之特性。此等物質包括脂肪、油、蠟、脂肪酸、脂肪醇、脂肪酯、保濕劑、親水性膠體、防腐劑及抗氧化劑(Block, 於 Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger及Banker (編), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 第1卷, 第335頁; Idson, 於 Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger及Banker (編), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 第1卷, 第199頁)。
親水性膠體或親水膠體包括天然存在之膠及合成聚合物，諸如多醣(例如阿拉伯膠、瓊脂、海藻酸、角叉菜膠、瓜爾膠、加拉亞膠(karaya gum)及黃蓍膠)、纖維素衍生物(例如羧基甲基纖維素及羧甲基丙基纖維素)，及合成聚合物(例如卡波姆(carbomer)、纖維素醚及羧基乙烯基聚合物)。此等膠體在水中分散或膨脹以形成膠態溶液，其藉由在分散相微滴周圍形成強界面膜且藉由提高外相之黏度穩定化乳液。
因為乳液通常含有許多容易支持微生物生長之成分，諸如碳水化合物、蛋白質、固醇及磷脂，所以此等調配物通常併入有防腐劑。乳液調配物中包括的常用防腐劑包括對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、四級銨鹽、氯化苯甲烴銨、對羥基苯甲酸酯及硼酸。亦通常向乳液調配物中添加抗氧化劑以防止調配物變質。所用抗氧化劑可為自由基清除劑，諸如生育酚、沒食子酸烷基酯、丁基化羥基甲氧苯、丁基化羥基甲苯或還原劑(諸如抗壞血酸及偏亞硫酸氫鈉)，及抗氧化性增效劑(諸如檸檬酸、酒石酸及卵磷脂)。
經由皮膚、經口及非經腸途徑施用乳液調配物及其製造方法已評述於文獻中(參見例如Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., 及Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (第8版), New York, NY; Idson, 於 Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger及Banker (編), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 第1卷, 第199頁)。經口遞送之乳液調配物由於容易調配以及功效(從吸收及生物可用性的角度看)而得到極廣泛使用(參見例如Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., 及Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (第8版), New York, NY; Rosoff, 於 Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger及Banker (編), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 第1卷, 第245頁; Idson, 於 Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger及Banker (編), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 第1卷, 第199頁)。通常作為o/w乳液經口投與之材料中有礦物油基輕瀉劑、油溶性維生素及高脂肪營養製劑。
在本發明之一些實施例中，iRNA及核酸之組合物調配為微乳液。微乳液可定義為水、油及兩親分子之系統，其為具有單一光學等向性且熱力學穩定之液體溶液(參見例如Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., 及Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (第8版), New York, NY; Rosoff, 於 Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger及Banker (編), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 第1卷, 第245頁)。微乳液通常為首先在水性界面活性劑溶液中分散油，接著添加充分量之第四組分(一般中等鏈長度醇)形成透明系統製備的系統。因此，微乳液亦已描述為兩種不混溶液體的熱力學穩定、具有等向性的透明分散液，其藉由表面活性分子之界面膜穩定化(Leung及Shah, 於: Controlled Release of Drugs: Polymers and Aggregate Systems, Rosoff, M.編, 1989, VCH Publishers, New York, 第185-215頁)。微乳液通常經由組合包括油、水、界面活性劑、輔助界面活性劑及電解質的三至五種組分製備。微乳液視所用油及界面活性劑之特性以及界面活性劑分子之極性頂部及烴尾部的結構及幾何封裝而定為油包水(w/o)或水包油(o/w)類型(Schott, 於Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, 第271頁)。
已廣泛研究利用相圖之現象方法，且熟習此項技術者已獲得如何調配微乳液之綜合知識(參見例如Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., 及Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (第8版), New York, NY; Rosoff, 於 Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger及Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 第1卷, 第245頁; Block, 於 Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger及Banker (編), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 第1卷, 第335頁)。相較於習知乳液，微乳液提供使水不溶性藥物溶解於自發形成之熱力學穩定微滴之調配物中的優勢。
用於製備微乳液之界面活性劑包括但不限於單獨或與輔助界面活性劑組合之離子界面活性劑、非離子界面活性劑、Brij 96、聚氧化乙烯油醚、聚脂肪酸甘油酯、單月桂酸四甘油酯(ML310)、單油酸四甘油酯(MO310)、單油酸六甘油酯(PO310)、五油酸六甘油酯(PO500)、單癸酸十甘油酯(MCA750)、單油酸十甘油酯(MO750)、倍半油酸十甘油酯(SO750)、十油酸十甘油酯(DAO750)。輔助界面活性劑通常為短鏈醇，諸如乙醇、1-丙醇及1-丁醇，其用於藉由穿透至界面活性劑膜中且因此因為在界面活性劑分子當中產生空隙產生無序膜而提高界面流動性。然而，微乳液可不使用輔助界面活性劑製備且無醇自身乳化微乳液系統為此項技術中已知。水相通常可為(但不限於)水、藥物水溶液、甘油、PEG300、PEG400、聚甘油、丙二醇及乙二醇衍生物。油相可包括(但不限於)諸如Captex 300、Captex 355、Capmul MCM、脂肪酸酯、中鏈(C8-C12)單、二及三-甘油酯、聚氧乙基化甘油基脂肪酸酯、脂肪醇、聚二醇化甘油酯、飽和聚二醇化C8-C10甘油酯、植物油及聚矽氧油。
自藥物溶解及提高藥物吸收之觀點，尤其關注微乳液。已提出基於脂質之微乳液(o/w與w/o)可增強藥物之口服生物可用性，包括肽(參見例如美國專利第6,191,105號；第7,063,860號；第7,070,802號；第7,157,099號；Constantinides等人, Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385-1390；Ritschel, Meth. Find. Exp. Clin. Pharmacol., 1993, 13, 205)。微乳液提供的優點為改良藥物溶解、防止藥物被酶水解、因界面活性劑誘導膜流動性及通透性變化而可增強藥物吸收、容易製備、比固體劑型容易經口投與、提高臨床效能及降低毒性(參見例如美國專利第6,191,105號；第7,063,860號；第7,070,802號；第7,157,099號；Constantinides等人, Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385；Ho等人, J. Pharm. Sci., 1996, 85, 138-143)。當在環境溫度下將微乳液組分置於一起時，通常可自發地形成微乳液。當調配不耐熱藥物(肽或iRNA)時，此尤其有利。微乳液亦在化妝品及醫藥應用兩者中有效地經皮遞送活性組分。預期本發明之微乳液組合物及調配物將促進iRNA及核酸自胃腸道的提高的全身吸收，以及提高iRNA及核酸的局部細胞攝入。
本發明之微乳液亦可含有額外組分及添加劑(諸如脫水山梨糖醇單硬脂酸酯(Grill 3)、拉巴索(Labrasol)及穿透增強劑)來改良調配物特性及提高本發明之iRNA及核酸的吸收。本發明微乳液中所用之穿透增強劑可分類為屬於五種廣泛類別中之一者：界面活性劑、脂肪酸、膽汁鹽、螯合劑及非螯合非界面活性劑(Lee等人，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, 第92頁)。上文已論述此等類別中之每一者。
ii. 滲透增強劑在一些實施例中，本發明採用多種穿透增強劑以向動物皮膚有效遞送核酸，尤其iRNA。大多數藥物以離子化及非離子化形式存在於溶液中。然而，一般僅脂質可溶性或親脂性藥物容易穿過細胞膜。已發現若待穿過之膜經穿透增強劑處理，則即使非親脂性藥物亦可穿過細胞膜。除了幫助非親脂性藥物擴散穿過細胞膜之外，穿透增強劑亦提高親脂性藥物之滲透率。
穿透增強劑可歸類為屬於五種寬泛類別之一，亦即，界面活性劑、脂肪酸、膽汁鹽、螯合劑及非螯合非界面活性劑(參見例如Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee等人, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, 第92頁)。下文中更詳細描述上述類別之穿透增強劑中之每一者。
界面活性劑：關於本發明，界面活性劑(或「表面活性劑」)為當溶解於水溶液中時減少溶液表面張力或水溶液與另一液體之間的界面張力、引起iRNA通過黏膜之吸收增強的化學實體。除膽汁鹽及脂肪酸之外，此等穿透增強劑包括例如月桂基硫酸鈉、聚環氧乙烷-9-月桂基醚及聚環氧乙烷-20-鯨蠟基醚)(參見例如Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee等人, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, 第92頁)；及全氟化學乳液，諸如FC-43。Takahashi等人, J. Pharm. Pharmacol., 1988, 40, 252)。
脂肪酸：充當穿透增強劑的各種脂肪酸及其衍生物包括例如油酸、月桂酸、癸酸(正癸酸)、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞麻油酸、次亞麻油酸、二癸酸酯、三癸酸酯、油酸單甘油酯(1-單油醯基-外消旋-甘油)、二月桂酸甘油酯、羊脂酸、二十碳四烯酸、1-單癸酸甘油酯、1-十二烷基氮雜環庚-2-酮、醯基肉鹼、醯基膽鹼、其C 1-20烷基酯(例如甲基、異丙基及三級丁基)，及其單甘油酯及二甘油酯(亦即，油酸酯、月桂酸酯、癸酸酯、肉豆蔻酸酯、棕櫚酸酯、硬脂酸酯、亞麻油酸酯等)(參見例如Touitou, E.等人, Enhancement in Drug Delivery, CRC Press, Danvers, MA, 2006; Lee等人, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; El Hariri等人, J. Pharm. Pharmacol., 1992, 44, 651-654)。
膽汁鹽 ：膽汁的生理作用包括促進脂質及脂溶性維生素分散及吸收(參見例如Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Brunton, Chapter 38 於: Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 第9版, Hardman等人編, McGraw-Hill, New York, 1996, 第934-935頁)。各種天然膽汁鹽及其合成衍生物充當穿透增強劑。因此，術語「膽汁鹽」包括膽汁之任何天然存在之組分以及其任何合成衍生物。適合的膽汁鹽包括例如膽酸(或其醫藥學上可接受之鈉鹽、膽酸鈉)、去氫膽酸(去氫膽酸鈉)、去氧膽酸(去氧膽酸鈉)、穀胺膽酸(穀胺膽酸鈉)、甘胺膽酸(甘胺膽酸鈉)、甘胺去氧膽酸(甘胺去氧膽酸鈉)、牛膽酸(牛膽酸鈉)、牛去氧膽酸(牛去氧膽酸鈉)、鵝膽酸(鵝去氧膽酸鈉)、熊去氧膽酸(UDCA)、牛磺-24,25-二氫-褐酶酸鈉(STDHF)、二醇二氫褐酶酸鈉及聚環氧乙烷-9-月桂基醚(POE)(參見例如Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee等人, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, 第92頁; Swinyard, Remington ' s Pharmaceutical Sciences第39章, 第18版, Gennaro編, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990, 第782-783頁; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Yamamoto等人, J. Pharm. Exp. Ther., 1992, 263, 25; Yamashita等人, J. Pharm. Sci., 1990, 79, 579-583)。
螯合劑：與本發明結合使用之螯合劑可定義為藉由與溶液形成複合物自溶液移除金屬離子，引起iRNA經由黏膜之吸收增強的化合物。關於其在本發明中作為穿透增強劑之用途，螯合劑具有亦充當去氧核糖核酸酶抑制劑之附加優勢，因為大多數所表徵之DNA核酸酶需要二價金屬離子來催化且因此被螯合劑抑制(Jarrett, J. Chromatogr., 1993, 618, 315-339)。適合螯合劑包括(但不限於)乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、檸檬酸、水楊酸鹽(例如水楊酸鈉、5-甲氧基水楊酸鹽及高香草酸鹽)、膠原蛋白之N-醯基衍生物、月桂醇醚-9及β-二酮之N-胺基醯基衍生物(烯胺)(參見例如Katdare, A.等人, Excipient development for pharmaceutical, biotechnology, and drug delivery, CRC Press, Danvers, MA, 2006; Lee等人, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, 第92頁; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Buur等人, J. Control Rel., 1990, 14, 43-51)。
非螯合非界面活性劑：如本文中所使用，非螯合非界面活性劑型穿透增強化合物可定義為不與螯合劑或界面活性劑展示同樣的顯著活性，但仍然增強經由消化黏膜之iRNA吸收的化合物(參見例如Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33)。此類穿透增強劑包括例如不飽和環脲、1-烷基-及1-烯基氮雜環烷酮衍生物(Lee等人, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, 第92頁)；及非類固醇消炎劑，諸如雙氯芬酸鈉(diclofenac sodium)、吲哚美辛(indomethacin)及苯基丁氮酮(Yamashita等人, J. Pharm. Pharmacol., 1987, 39, 621-626)。
提高iRNA在細胞水準之攝取的試劑亦可添加至本發明之醫藥組合物及其他組合物中。舉例而言，亦已知陽離子脂質，諸如脂質體(Junichi等人，美國專利第5,705,188號)、陽離子甘油衍生物及聚陽離子分子，諸如聚離胺酸(Lollo等人, PCT申請案WO 97/30731)會增強dsRNA之細胞攝取。市售轉染試劑之實例尤其包括例如Lipofectamine™ (Invitrogen; Carlsbad, CA)；Lipofectamine 2000™ (Invitrogen; Carlsbad, CA)；293fectin™ (Invitrogen; Carlsbad, CA)；Cellfectin™ (Invitrogen; Carlsbad, CA)；DMRIE-C™ (Invitrogen; Carlsbad, CA)；FreeStyle™ MAX (Invitrogen; Carlsbad, CA)；Lipofectamine™ 2000 CD (Invitrogen; Carlsbad, CA)；Lipofectamine™ (Invitrogen; Carlsbad, CA)；RNAiMAX (Invitrogen; Carlsbad, CA)；Oligofectamine™ (Invitrogen; Carlsbad, CA)；Optifect™ (Invitrogen; Carlsbad, CA)；X-tremeGENE Q2轉染試劑(Roche; Grenzacherstrasse, Switzerland)；DOTAP脂質體轉染試劑(Grenzacherstrasse, Switzerland)；DOSPER脂質體轉染試劑(Grenzacherstrasse, Switzerland)或Fugene (Grenzacherstrasse, Switzerland)；Transfectam®試劑(Promega; Madison, WI)；TransFast™轉染試劑(Promega; Madison, WI)；Tfx™-20試劑(Promega; Madison, WI)；Tfx™-50試劑(Promega; Madison, WI)；DreamFect™ (OZ Biosciences; Marseille, France)；EcoTransfect (OZ Biosciences; Marseille, France)；TransPass aD1轉染試劑(New England Biolabs; Ipswich, MA, USA)；LyoVec™/LipoGen™ (Invivogen; San Diego, CA, USA)；PerFectin轉染試劑(Genlantis; San Diego, CA, USA)；NeuroPORTER轉染試劑(Genlantis; San Diego, CA, USA)；GenePORTER轉染試劑(Genlantis; San Diego, CA, USA)；GenePORTER 2轉染試劑(Genlantis; San Diego, CA, USA)；Cytofectin轉染試劑(Genlantis; San Diego, CA, USA)；BaculoPORTER轉染試劑(Genlantis; San Diego, CA, USA)；TroganPORTER™轉染試劑(Genlantis; San Diego, CA, USA )；RiboFect (Bioline; Taunton, MA, USA)；PlasFect (Bioline; Taunton, MA, USA)；UniFECTOR (B-Bridge International; Mountain View, CA, USA)；SureFECTOR (B-Bridge International; Mountain View, CA, USA)或HiFect™ (B-Bridge International, Mountain View, CA, USA)。
可用於增強所投與核酸之穿透的其他試劑包括二醇，諸如乙二醇及丙二醇；吡咯，諸如2-吡咯；氮酮及萜類，諸如檸檬烯及薄荷酮。
iii. 載體本發明之某些組合物亦在調配物中併入載劑化合物。如本文所用，「載劑化合物」或「載劑」可指為惰性的(亦即本身不具有生物活性)但藉由活體內過程識別為核酸的核酸或其類似物，該活體內過程藉由例如分解生物活性核酸或促進其自循環移除來降低具有生物活性之核酸的生物可用性。共投與核酸及載劑化合物(載劑化合物通常過量)可導致肝臟、腎臟或其他循環外儲集器官中回收之核酸量實質上減少，此可能由於載劑化合物與核酸之間對共用受體之競爭。舉例而言，當與聚肌苷酸、硫酸葡聚糖、聚胞嘧啶核苷酸或4-乙醯胺基-4'異硫氰基-二苯乙烯-2,2'-二磺酸共投與時，可減少偏硫代磷酸dsRNA在肝組織中的恢復(Miyao等人, DsRNA Res. Dev., 1995, 5, 115-121; Takakura等人, DsRNA & Nucl. Acid Drug Dev., 1996, 6, 177-183)。
iv. 賦形劑與載劑化合物相比，醫藥載劑或賦形劑可包含例如用於向動物遞送一或多種核酸之醫藥學上可接受之溶劑、懸浮劑或任何其他藥理學惰性媒劑。賦形劑可為液體或固體且根據打算之計劃投與方式選擇從而當與核酸及既定醫藥組合物之其他組分組合時提供所要容積、稠度等。典型醫藥載劑包括(但不限於)黏合劑(例如預膠凝玉米澱粉、聚乙烯吡咯啶酮或羥基丙基甲基纖維素等)；填充劑(例如乳糖及其他糖、微晶纖維素、果膠、明膠、硫酸鈣、乙基纖維素、聚丙烯酸酯或磷酸氫鈣等)；潤滑劑(例如硬脂酸鎂、滑石、二氧化矽、膠態二氧化矽、硬脂酸、金屬硬脂酸鹽、氫化植物油、玉米澱粉、聚乙二醇、苯甲酸鈉、乙酸鈉等)；崩解劑(例如澱粉、羥基乙酸澱粉鈉等)；及濕潤劑(例如月桂基硫酸鈉等)。
適於非非經腸投與且不與核酸發生有害反應的醫藥學上可接受之有機或無機賦形劑亦可用於調配本發明之組合物。適合的醫藥學上可接受之載劑包括但不限於水、鹽溶液、醇、聚乙二醇、明膠、乳糖、直鏈澱粉、硬脂酸鎂、滑石、矽酸、黏稠石蠟、羥基甲基纖維素、聚乙烯吡咯啶酮及其類似物。
用於體表投與核酸之調配物可包括無菌及非無菌水溶液、常用溶劑(諸如醇)中之非水溶液或核酸於液體或固體油基質中之溶液。溶液亦可含有緩衝劑、稀釋劑及其他適合添加劑。可使用適於非非經腸投與且不與核酸發生有害反應的醫藥學上可接受之有機或無機賦形劑。
適合的醫藥學上可接受之賦形劑包括但不限於水、鹽溶液、醇、聚乙二醇、明膠、乳糖、直鏈澱粉、硬脂酸鎂、滑石、矽酸、黏稠石蠟、羥基甲基纖維素、聚乙烯吡咯啶酮及其類似物。
v. 其他組分本發明之組合物可另外含有醫藥組合物中習知存在之其他佐劑組分，例如以其技術中確定的使用量。因此，舉例而言，組合物可另外含有相容的醫藥學活性材料，諸如止癢劑、收斂劑、局部麻醉劑或消炎劑，或可含有適用於物理調配本發明組合物之多種劑型的額外材料，諸如染料、調味劑、防腐劑、抗氧化劑、遮光劑、增稠劑及穩定劑。然而，此類材料在添加時不應不恰當地干擾本發明組合物之組分的生物活性。調配物可經滅菌，且需要時與例如潤滑劑、防腐劑、穩定劑、濕潤劑、乳化劑、用於影響滲透壓之鹽、緩衝劑、著色劑、調味劑及/或芳族物質及其類似物的助劑混合，該等助劑不會與調配物之核酸有害地相互作用。
水性懸浮液可含有提高懸浮液黏度之物質，包括例如羧基甲基纖維素鈉、山梨糖醇及/或聚葡萄糖。懸浮液亦可含有穩定劑。
在一些實施例中，本發明所提供之醫藥組合物包括(a)一或多種iRNA化合物及(b)一或多種藉由非RNAi機制起作用的生物藥劑。此類生物劑之實例包括干擾MYOC與至少一種MYOC結合搭配物之相互作用的試劑。
可藉由標準醫藥程序測定此類化合物在細胞培養物或實驗動物中之毒性及治療功效，例如測定LD50 (群體50%致死劑量)及ED50 (群體50%有效治療劑量)。毒性與治療作用之間的劑量比率為治療指數且其可表示為比率LD50/ED50。呈現高治療指數之化合物為典型的。
自細胞培養分析及動物研究獲得之資料可用於調配一系列用於人類之劑量。本發明所提供之組合物的劑量通常在包括幾乎不具有毒性或不具有毒性之ED50的循環濃度範圍內。劑量可視所用劑型及所用投與途徑而在此範圍內變化。對於本發明所提供之方法中所用的任何化合物，可自細胞培養分析初始估算治療有效劑量。可在動物模型中調配劑量以達到化合物或適當時目標序列之多肽產品的循環血漿濃度範圍(例如實現降低濃度之多肽)，該範圍包括如細胞培養物中測得之IC50 (亦即實現症狀之一半最大抑制的測試化合物濃度)。此類資訊可用於更精確地測定人類中之適用劑量。血漿中之含量可例如藉由高效液相層析來量測。
除其如上文所論述之投與以外，本發明特性化之iRNA可與有效治療與MYOC表現相關之疾病或病症(例如青光眼，例如原發性開角型青光眼(POAG))的其他已知藥劑組合投與。在任何情況下，投藥醫師可基於使用此項技術中已知或本文所述之標準功效量測觀測到的結果調整iRNA投與之量及時間安排。
VII. 治療與 MYOC 表現相關之病症的方法本發明係關於靶向MYOC之iRNA用於抑制MYOC表現及/或治療與MYOC表現相關之疾病、病症或病理過程(例如青光眼，例如原發性開角型青光眼(POAG))的用途。
在一些態樣中，提供治療與MYOC表現相關之病症的方法，該方法包含向有需要之個體投與本文揭示之iRNA (例如dsRNA)。在一些實施例中，iRNA抑制(降低)MYOC表現。
在一些實施例中，個體為充當與MYOC表現相關之病症(例如青光眼，例如原發性開角型青光眼(POAG))之模型的動物。
A. 青光眼在一些實施例中，與MYOC相關之病症為青光眼。可使用本文所述之方法治療的青光眼之非限制性實例為原發性開角型青光眼(POAG)。
青光眼之臨床及病理學特徵包括(但不限於)視覺喪失、視敏度降低(例如圍繞光有光圈及模糊)及水狀液自眼睛之滲漏減少。
在一些實施例中，患有青光眼之個體不到18歲。在一些實施例中，患有青光眼之個體為成人。在一些實施例中，患有青光眼之個體超過60歲。在一些實施例中，個體具有或鑑別為具有相對於參考含量升高之MYOC mRNA或蛋白質含量(例如，大於參考含量之MYOC含量)。
在一些實施例中，使用來自個體之樣品(例如眼房液樣品)的分析來診斷青光眼。在一些實施例中，使用選自以下中之一或多者的方法來分析樣品：螢光原位雜交(FISH)、免疫組織化學、MYOC免疫分析、電子顯微法、雷射顯微切割及質譜。在一些實施例中，使用任何適合診斷測試或技術診斷青光眼，例如Goldmann壓平眼壓測量法、中心角膜厚度(CCT)之量測、自動化靜態臨限視野測量(例如Humphrey視野分析)、Van Herick技術、前房角鏡檢查、超音波活組織檢視法及前段光學同調斷層掃描(AS-OCT)、血管攝影術(例如螢光素血管攝影術或靛青綠血管攝影術)、視網膜電圖描記、超音波檢查術、角膜測厚、光學同調斷層掃描(OCT)、電腦斷層掃描(CT)及磁共振成像(MRI)、壓力量測術、色覺測試、視野測試、裂隙燈檢查、檢眼鏡檢查法及身體檢查(例如評估視敏度(例如藉由眼底鏡檢查或光學同調斷層掃描(OCT))。
B. 組合療法在一些實施例中，本文揭示之iRNA (例如dsRNA)與已知有效治療與MYOC表現相關之病症(青光眼，例如原發性開角型青光眼(POAG))或此類病症之症狀的第二療法(例如一或多種額外療法)組合投與。iRNA可在第二療法之前、之後或同時投與。在一些實施例中，iRNA在第二療法之前投與。在一些實施例中，iRNA在第二療法之後投與。在一些實施例中，iRNA與第二療法同時投與。
第二療法可為另一種治療劑。iRNA及另一種治療劑可在相同組合物中組合投與或另一種治療劑可作為各別組合物之部分投與。
在一些實施例中，第二療法為有效治療病症或病症之症狀的非iRNA治療劑。
在一些實施例中，iRNA與療法一起投與。
例示性組合療法包括(但不限於)雷射小梁成形術手術、小梁切除術手術、微創傷性青光眼手術、眼睛中放置引流管、口服藥物治療或滴眼劑。
投與劑量、途徑及時序可向個體(例如人類個體，例如患者)投與治療量之iRNA。治療量可為例如0.05-50 mg/kg。
在一些實施例中，調配iRNA以便遞送至目標器官，例如眼部。
在一些實施例中，iRNA調配為脂質調配物，例如如本文所述之LNP調配物。在一些此類實施例中，治療量為0.05-5 mg/kg dsRNA。在一些實施例中，靜脈內投與脂質調配物(例如LNP調配物)。
在一些實施例中，iRNA呈GalNAc結合物形式，例如如本文所述。在一些此類實施例中，治療量為0.5-50 mg dsRNA。在一些實施例中，例如皮下投與GalNAc結合物。
在一些實施例中，例如定期(諸如每天、每兩週(亦即每兩週一次))重複投與，持續一個月、兩個月、三個月、四個月、六個月或更長時間。最初治療方案之後，可以較低頻率投與治療。舉例而言，在每兩週投與持續三個月之後，投與可每月重複一次持續六個月或一年或一年以上。
在一些實施例中，iRNA藥劑分兩次或更多次劑量投與。在一些實施例中，後續劑量之次數或量取決於達成所需作用，例如(a)抑制或降低MYOC之表現或活性；(b)降低錯誤摺疊MYOC蛋白質之含量；(c)減少小梁網狀細胞死亡；(d)降低眼內壓；或(e)增加視敏度；或達成治療性或防治性作用，例如減少或預防與所述病症相關之一或多個症狀。
在一些實施例中，根據時間表投與iRNA藥劑。舉例而言，iRNA藥劑可每週一次、每週兩次、每週三次、每週四次或每週五次投與。在一些實施例中，時程涉及有規律間隔投與，例如每小時、每四小時、每六小時、每八小時、每十二小時、每天、每兩天、每三天、每四天、每五天、每週、每兩週或每月。在一些實施例中，iRNA藥劑以達成所需作用所需之頻率投與。
在一些實施例中，時間表涉及以緊密間隔投藥，隨後在較長時段內不投與藥劑。舉例而言，時間表可涉及在相對端時間段(例如約每6小時、約每12小時、約每24小時、約每48小時或約每72小時)投與最初劑量組，隨後較長時段不投與iRNA藥劑(例如約1週、約2週、約3週、約4週、約5週、約6週、約7週或約8週)。在一些實施例中，iRNA藥劑最初每小時投與且隨後以較長時間間隔(例如每天、每週、每兩週或每月)投與。在一些實施例中，iRNA藥劑最初每天投與且隨後以較長時間間隔(例如每週、每兩週或每月)投與。在某些實施例中，較長間隔隨時間增加或基於所需作用之達成來測定。
在投與全部劑量之iRNA之前，可向患者投與較小劑量，諸如5%輸注劑量，且監測副作用，諸如過敏反應，或升高之脂質含量或血壓。在另一實例中，可監測患者之非所需作用。
VIII. 用於調節 MYOC 之表現的方法在一些態樣中，本發明提供一種用於調節(例如抑制或活化)MYOC例如在細胞中、在組織中或在個體中之表現的方法。在一些實施例中，細胞或組織為離體、活體外或活體內的。在一些實施例中，細胞或組織為小梁網狀組織、睫狀體、視網膜色素上皮(RPE)、視網膜組織、星形膠質細胞、外被細胞、繆氏細胞、神經節細胞、內皮細胞、感光細胞、視網膜血管(例如包括內皮細胞及血管平滑肌細胞)或脈絡膜組織，例如脈絡膜血管。在一些實施例中，細胞或組織存在於個體(例如哺乳動物，諸如人類)中。在一些實施例中，個體(例如人類)處於與如本文所述之MYOC表現的表現有關之病症的風險中或診斷為患有該病症。
在一些實施例中，該方法包括使細胞與有效降低MYOC在細胞中表現之量的如本文所述之iRNA接觸。在一些實施例中，使細胞與RNAi藥劑接觸包括使細胞與RNAi藥劑活體外接觸或使細胞與RNAi藥劑活體內接觸。在一些實施例中，藉由進行該方法之個體使RNAi藥劑與細胞實體接觸，或可將RNAi藥劑置於允許或使得其隨後與細胞接觸之情形中。活體外細胞接觸可例如藉由將細胞與RNAi藥劑一起培育來進行。活體內接觸細胞可例如藉由將RNAi藥劑注射至細胞所位於之組織中或附近或藉由將RNAi藥劑注射至另一區域(例如眼組織)中來進行。舉例而言，RNAi藥劑可含有配位體或偶合至配位體，例如如下文所述且進一步詳述於例如以全文引用之方式併入本文中之PCT/US2019/031170中的一或多個親脂性部分，包括其中描述親脂性部分之段落，該一或多個親脂性部分在所關注位點處導引RNAi藥劑或以其他方式使RNAi藥劑穩定。活體外及活體內接觸方法之組合亦為可能的。舉例而言，細胞亦可與RNAi藥劑活體外接觸且隨後移植至個體中。
MYOC之表現可基於MYOC mRNA、MYOC蛋白質之表現量或與MYOC之表現量功能上關聯之另一參數的量進行評估。在一些實施例中，MYOC表現被抑制至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%。在一些實施例中，iRNA之IC 50在0.001-0.01 nM、0.001-0.10 nM、0.001-1.0 nM、0.001-10 nM、0.01-0.05 nM、0.01-0.50 nM、0.02-0.60 nM、0.01-1.0 nM、0.01-1.5 nM、0.01-10 nM範圍內。IC 50值可相對於適當對照值(例如非靶向iRNA之IC 50)標準化。
在一些實施例中，該方法包括向細胞或組織中引入如本文所述之iRNA且維持細胞或組織持續足以獲得MYOC之mRNA轉錄本降解的時間，由此抑制MYOC在細胞或組織中之表現。
在一些實施例中，該方法包括向哺乳動物投與本文所述之組合物，例如包含結合MYOC之iRNA的組合物，使得目標MYOC之表現減少，諸如持續一段延長時間，例如至少兩天、三天、四天或更長時間，例如一週、兩週、三週或四週或更長時間。在一些實施例中，MYOC之表現降低可在第一次投藥的1小時、2小時、4小時、8小時、12小時或24小時內偵測到。
在一些實施例中，該方法包括向哺乳動物投與如本文所述之組合物，使得目標MYOC之表現相比於未治療之動物增加例如至少10%。在一些實施例中，MYOC之活化可長時間進行，例如至少兩天、三天、四天或四天以上，例如一週、兩週、三週、四週或大於四週。不希望受理論所束縛，iRNA可藉由使MYOC mRNA轉錄本穩定、與基因體中之啟動子相互作用或抑制MYOC表現之抑制劑，來活化MYOC表現。
適用於本發明已特性分析之方法及組合物的iRNA特異性靶向MYOC之RNA (初級或經加工)。使用iRNA來抑制MYOC表現之組合物及方法可如本文中其他地方所述地製備及進行。
在一些實施例中，該方法包括投與含有iRNA之組合物，其中iRNA包括與待治療之個體(例如哺乳動物，例如人類)之MYOC之RNA轉錄本的至少一部分互補的核苷酸序列。組合物可藉由此項技術中已知之任何適當手段投與，包括但不限於經眼(例如，眼內)、表面及靜脈內投與。
在某些實施例中，組合物係眼內投與(例如藉由玻璃體內投與，例如玻璃體內注射；經鞏膜投與，例如經鞏膜注射；結膜下投與，例如結膜下注射；眼球後投與，例如眼球後注射；前房內投與，例如前房內注射；或視網膜下投與，例如視網膜下注射。在其他實施例中，組合物係表面投與。在某些實施例中，藉由靜脈內輸注或注射來投與組合物。
在某些實施例中，組合物藉由靜脈內輸注或注射來投與。在一些此類實施例中，組合物包含脂質調配之siRNA(例如LNP調配物，諸如LNP11調配物)用於靜脈內輸注。
除非另外定義，否則本文所用之所有技術及科學術語均具有與一般熟習本發明所屬領域者通常所理解相同的含義。儘管可使用與本文所述之方法及材料類似或等效的方法及材料實施或測試本發明特性化之iRNA及方法，但下文描述適合方法及材料。所有公開案、專利申請案、專利及本文所提及之其他參考文獻均以全文引用的方式併入本文中。在有矛盾的情況下，將以本發明(包括定義)為準。另外，材料、方法及實例僅具說明性且不希望具限制性。
特定實施例1. 一種用於抑制肌纖蛋白(MYOC)表現的雙股核糖核酸(dsRNA)藥劑，其中該dsRNA藥劑包含形成雙股區之有義股及反義股，其中該有義股包含含有人類MYOC之編碼股之一部分之至少15個連續核苷酸、具有0、1、2或3個錯配的核苷酸序列，且該反義股包含含有人類MYOC之非編碼股之相應部分之至少15個連續核苷酸、具有0、1、2或3個錯配的核苷酸序列，使得該有義股與該反義股中的該等至少15個連續核苷酸互補。 2. 如實施例1之dsRNA藥劑，其中人類MYOC之編碼股包含序列SEQ ID NO: 1。 3. 如實施例1或2之dsRNA藥劑，其中人類MYOC之非編碼股包含序列SEQ ID NO: 2。 4. 一種用於抑制MYOC表現之雙股核糖核酸(dsRNA)藥劑，其中該dsRNA劑包含形成雙股區之有義股及反義股，其中該反義股包含含有核苷酸序列SEQ ID NO: 2之一部分之至少15個連續核苷酸、具有0、1、2或3個錯配的核苷酸序列，使得該有義股與該反義股中的該等至少15個連續核苷酸互補。 5. 如實施例4之dsRNA藥劑，其中該有義股包含含有核苷酸序列SEQ ID NO: 1之相應部分之至少15個連續核苷酸、具有0或1、2或3個錯配的核苷酸序列。 5a. 如任一前述實施例之dsRNA藥劑，其中該反義股包含含有雙螺旋體AD-1565804之反義股核苷酸序列之至少15個連續核苷酸、具有0、1、2或3個錯配的核苷酸序列，且該有義股包含含有雙螺旋體AD-1565804之有義股核苷酸序列之至少15個連續核苷酸、具有0、1、2或3個錯配的核苷酸序列。 5b. 如任一前述實施例之dsRNA藥劑，其中該反義股包含含有雙螺旋體AD-1565837之反義股核苷酸序列之至少15個連續核苷酸、具有0、1、2或3個錯配的核苷酸序列，且該有義股包含含有雙螺旋體AD-1565837之有義股核苷酸序列之至少15個連續核苷酸、具有0、1、2或3個錯配的核苷酸序列。 6. 如任一前述實施例之dsRNA，其中該dsRNA藥劑包含有義股及反義股，其中該反義股包含含有核苷酸序列SEQ ID NO: 2之一部分之至少17個連續核苷酸、具有0、1、2或3個錯配的核苷酸序列，使得該有義股與該反義股中的至少17個連續核苷酸互補。 7. 如實施例6之dsRNA，其中該有義股包含含有核苷酸序列SEQ ID NO: 1之相應部分之至少17個連續核苷酸、具有0或1、2或3個錯配的核苷酸序列。 8. 如任一前述實施例之dsRNA，其中該dsRNA藥劑包含有義股及反義股，其中該反義股包含含有核苷酸序列SEQ ID NO: 2之一部分之至少19個連續核苷酸、具有0、1、2或3個錯配的核苷酸序列，使得該有義股與該反義股中的至少19個連續核苷酸互補。 9. 如實施例8之dsRNA，其中該有義股包含含有核苷酸序列SEQ ID NO: 1之相應部分之至少19個連續核苷酸、具有0、1、2或3個錯配的核苷酸序列。 10. 如任一前述實施例之dsRNA，其中該dsRNA藥劑包含有義股及反義股，其中該反義股包含含有核苷酸序列SEQ ID NO: 2之一部分之至少21個連續核苷酸、具有0、1、2或3個錯配的核苷酸序列，使得該有義股與該反義股中的至少21個連續核苷酸互補。 11. 如實施例10之dsRNA，其中該有義股包含含有核苷酸序列SEQ ID NO: 1之相應部分之至少21個連續核苷酸、具有0或1、2或3個錯配的核苷酸序列。 12. 如任一前述實施例之dsRNA藥劑，其中該有義股之該部分為表2A及2B中之任一者的有義股內之部分。 13. 如任一前述實施例之dsRNA藥劑，其中該反義股之該部分為表2A及2B中之任一者中之反義股內的部分。 14. 如任一前述實施例之dsRNA藥劑，其中該反義股包含含有表2A及2B中之任一者中所列之反義序列之一之至少15個連續核苷酸、具有0、1、2或3個錯配的核苷酸序列。 15. 如任一前述實施例之dsRNA藥劑，其中該有義股包含含有表2A及2B中之任一者中所列之與反義序列對應之有義序列之至少15個連續核苷酸、具有0、1、2或3個錯配的核苷酸序列。 16. 如任一前述實施例之dsRNA藥劑，其中該反義股包含含有表2A及2B中之任一者中所列之反義序列之一之至少17個連續核苷酸、具有0、1、2或3個錯配的核苷酸序列。 17. 如任一前述實施例之dsRNA藥劑，其中該有義股包含含有表2A及2B中之任一者中所列之與反義序列對應之有義序列之至少17個連續核苷酸、具有0、1、2或3個錯配的核苷酸序列。 18. 如任一前述實施例之dsRNA藥劑，其中該反義股包含含有表2A及2B中之任一者中所列之反義序列之一之至少19個連續核苷酸、具有0、1、2或3個錯配的核苷酸序列。 19. 如任一前述實施例之dsRNA藥劑，其中該有義股包含含有表2A及2B中之任一者中所列之與反義序列對應之有義序列之至少19個連續核苷酸、具有0、1、2或3個錯配的核苷酸序列。 20. 如任一前述實施例之dsRNA藥劑，其中該反義股包含含有表2A及2B中之任一者中所列之反義序列之一之至少21個連續核苷酸、具有0、1、2或3個錯配的核苷酸序列。 21. 如任一前述實施例之dsRNA藥劑，其中該有義股包含含有表2A及2B中之任一者中所列之與反義序列對應之有義序列之至少21個連續核苷酸、具有0、1、2或3個錯配的核苷酸序列。 22.  如任一前述實施例之dsRNA藥劑，其中該有義股具有至少23個核苷酸的長度，例如23-30個核苷酸的長度。 23. 如任一前述實施例之dsRNA藥劑，其中有義股及反義股中之至少一者與一或多個親脂性部分結合。 24. 如實施例23之dsRNA藥劑，其中親脂性部分與dsRNA藥劑之雙股區中之一或多個位置結合。 25. 如請求項23或24之dsRNA藥劑，其中該親脂性部分經由連接子或載劑結合。 26. 如實施例23至25中任一例之dsRNA藥劑，其中藉由logKow量測之親脂性部分之親脂性超過0。 27. 如任一前述實施例之dsRNA藥劑，其中根據雙股RNAi藥劑在血漿蛋白結合分析中的未結合分率量測的雙股RNAi藥劑之疏水性超過0.2。 28. 如實施例27之dsRNA藥劑，其中該血漿蛋白結合分析為使用人類血清白蛋白進行的電泳遷移率變化分析。 29. 如任一前述實施例之dsRNA藥劑，其中該dsRNA藥劑包含至少一個經修飾之核苷酸。 30. 如請求項29之dsRNA藥劑，其中該有義股中不超過五個核苷酸及該反義股中不超過五個核苷酸為未經修飾之核苷酸。 31. 如請求項29之dsRNA藥劑，其中該有義股之所有核苷酸及該反義股之所有核苷酸均包含修飾。 32. 如實施例29至31中任一例之dsRNA藥劑，其中至少一個經修飾之核苷酸係選自由以下組成之群：去氧核苷酸、3'端去氧胸腺嘧啶(dT)核苷酸、經2'-O-甲基修飾之核苷酸、經2'-氟修飾之核苷酸、經2'-去氧修飾之核苷酸、鎖定核苷酸、解鎖核苷酸、構形受限核苷酸、受限制乙基核苷酸、無鹼基核苷酸、經2'-胺基修飾之核苷酸、經2'-O-烯丙基修飾之核苷酸、經2'-C-烷基修飾之核苷酸、經2'-甲氧基乙基修飾之核苷酸、經2'-O-烷基修飾之核苷酸、(N-𠰌啉基)核苷酸、胺基磷酸酯、包含非天然鹼基之核苷酸、經四氫哌喃修飾之核苷酸、經1,5-無水己糖醇修飾之核苷酸、經環己烯基修飾之核苷酸、包含硫代磷酸酯基之核苷酸、包含甲基膦酸酯基之核苷酸、包含5'-磷酸酯之核苷酸、包含5'-磷酸酯模擬物之核苷酸、經二醇修飾之核苷酸及經2-O-(N-甲基乙醯胺)修飾之核苷酸；以及其組合。 33. 如實施例29至31中任一例之dsRNA藥劑，其中有義股核苷酸中不超過五個及反義股核苷酸中不超過五個包括除以下者之外的修飾：經2'-O-甲基修飾之核苷酸、經2'-氟修飾之核苷酸、經2'-去氧修飾之核苷酸、解鎖核酸(UNA)或甘油核酸(GNA)。 34. 如任一前述實施例之dsRNA藥劑，其包含有義股之兩個連續核苷酸之間或反義股之兩個連續核苷酸之間的非核苷酸間隔子(其中視情況，非核苷酸間隔子包含C3-C6烷基)。 35. 如任一前述實施例dsRNA藥劑，其中各股具有不超過30個核苷酸的長度。 36. 如任一前述實施例之dsRNA藥劑，其中至少一個股包含至少1個核苷酸之3'突出物。 37. 如任一前述實施例之dsRNA藥劑，其中至少一個股包含至少2個核苷酸之3'突出物。 38. 如任一前述實施例之dsRNA藥劑，其中該雙股區具有15-30個核苷酸對的長度。 39. 如實施例38之dsRNA藥劑，其中該雙股區具有17-23個核苷酸對的長度。 40. 如實施例38之dsRNA藥劑，其中該雙股區具有17-25個核苷酸對的長度。 41. 如實施例38之dsRNA藥劑，其中該雙股區具有23-27個核苷酸對的長度。 42. 如實施例38之dsRNA藥劑，其中該雙股區具有19-21個核苷酸對的長度。 43. 如實施例38之dsRNA藥劑，其中該雙股區具有21-23個核苷酸對的長度。 44. 如任一前述實施例之dsRNA藥劑，其中各股具有19-30個核苷酸。 45. 如任一前述實施例之dsRNA藥劑，其中各股具有19-23個核苷酸。 46. 如任一前述實施例之dsRNA藥劑，其中各股具有21-23個核苷酸。 47. 如任一前述實施例之dsRNA藥劑，其中該藥劑包含至少一個硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯。 48. 如實施例47之dsRNA藥劑，其中硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯位於一個股之3'端。 49. 如實施例48之dsRNA藥劑，其中該股為反義股。 50. 如實施例48之dsRNA藥劑，其中該股為有義股。 51. 如實施例47之dsRNA藥劑，其中該硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯位於一個股的5'端。 52. 如實施例51之dsRNA藥劑，其中該股為反義股。 53. 如實施例51之dsRNA藥劑，其中該股為有義股。 54. 如實施例47之dsRNA藥劑，其中一個股的5'端及3'端中之每一者包含硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯。 55. 如實施例54之dsRNA藥劑，其中該股為反義股。 56. 如任一前述實施例之dsRNA藥劑，其中雙螺旋體之反義股之5'端之1位置處的鹼基對為AU鹼基對。 57. 如實施例54之dsRNA藥劑，其中該有義股具有總共21個核苷酸且該反義股具有總共23個核苷酸。 58. 如實施例23至57中任一項之dsRNA藥劑，其中一或多個親脂性部分與至少一個股上之一或多個內部位置結合。 59. 如實施例58之dsRNA藥劑，其中該一或多個親脂性部分經由連接子或載劑與至少一個股上之一或多個內部位置結合。 60. 如實施例59之dsRNA藥劑，其中該等內部位置包括除至少一個股之各端之末端兩個位置以外的所有位置。 61. 如實施例59之dsRNA藥劑，其中該等內部位置包括除至少一個股之各端之末端三個位置以外的所有位置。 62. 如實施例59至61中任一例之dsRNA藥劑，其中該等內部位置不包括有義股之裂解位點區。 63. 如實施例62之dsRNA藥劑，其中該等內部位置包括除了自有義股之5'端計數的位置9-12以外的所有位置。 64. 如實施例62之dsRNA藥劑，其中該等內部位置包括除了自有義股之3'端計數的位置11-13以外的所有位置。 65. 如實施例59至61中任一例之dsRNA藥劑，其中該等內部位置不包括反義股之裂解位點區。 66. 如實施例65之dsRNA藥劑，其中該等內部位置包括除了自反義股之5'端計數的位置12-14以外的所有位置。 67. 如實施例59至61中任一例之dsRNA藥劑，其中該等內部位置包括除了自3'端計數的有義股上之位置11-13及自5'端計數的反義股上之位置12-14以外的所有位置。 68. 如實施例23至67中任一例之dsRNA藥劑，其中一或多個親脂性部分與選自由以下組成之群的一或多個內部位置結合：自各股之5'端計數的有義股上之位置4-8及13-18，及反義股上之位置6-10及15-18。 69. 如實施例68之dsRNA藥劑，其中一或多個親脂性部分與選自由以下組成之群之一或多個內部位置結合：自各股之5'端計數的有義股上之位置5、6、7、15及17，以及反義股上之位置15及17。 70. 如實施例24之dsRNA藥劑，其中該雙股區中之位置不包括有義股之裂解位點區。 71. 如實施例23至70中任一項之dsRNA藥劑，其中有義股具有21個核苷酸的長度，反義股具有23個核苷酸的長度，且親脂性部分與有義股之位置21、位置20、位置15、位置1、位置7、位置6或位置2或反義股之位置16結合。 72. 如實施例71之dsRNA藥劑，其中親脂性部分與有義股之位置21、位置20、位置15、位置1或位置7結合。 73. 如實施例71之dsRNA藥劑，其中親脂性部分與有義股之位置21、位置20或位置15結合。 74. 如實施例71之dsRNA藥劑，其中親脂性部分與有義股之位置20或位置15結合。 75. 如實施例71之dsRNA藥劑，其中親脂性部分與反義股之位置16結合。 76. 如實施例71之dsRNA藥劑，其中親脂性部分與自有義股之5'端計數的位置6結合。 77. 如實施例23至76中任一例之dsRNA藥劑，其中該親脂性部分為脂族、脂環族或聚脂環族化合物。 78. 如實施例77之dsRNA藥劑，其中親脂性部分選自由以下組成之群：脂質、膽固醇、視黃酸、膽酸、金剛烷乙酸、1-芘丁酸、二氫睪固酮、1,3-雙-O(十六烷基)甘油、香葉氧基己醇、十六烷基甘油、冰片、薄荷腦、1,3-丙二醇、十七烷基、棕櫚酸、肉豆蔻酸、O3-(油醯基)石膽酸、O3-(油醯基)膽烯酸、二甲氧基三苯甲基或啡㗁𠯤。 79. 如實施例78之dsRNA藥劑，其中該親脂性部分含有飽和或不飽和C4-C30烴鏈，及選自由以下組成之群的視情況存在之官能基：羥基、胺、羧酸、磺酸酯、磷酸酯、硫醇、疊氮化物及炔烴。 80. 如實施例79之dsRNA藥劑，其中該親脂性部分含有飽和或不飽和C6-C18烴鏈。 81. 如實施例79之dsRNA藥劑，其中該親脂性部分含有飽和或不飽和C16烴鏈。 82. 如實施例23至81中任一例之dsRNA藥劑，其中該親脂性部分經由置換該(等)內部位置或該雙股區中之一或多個核苷酸的載劑結合。 83. 如實施例82之dsRNA藥劑，其中該載劑為選自由以下組成之群的環狀基團：吡咯啶基、吡唑啉基、吡唑啶基、咪唑啉基、咪唑啶基、哌啶基、哌𠯤基、[1,3]二氧雜環戊烷基、㗁唑啶基、異㗁唑啶基、𠰌啉基、噻唑啶基、異噻唑啶基、喹喏啉基、嗒𠯤酮基、四氫呋喃基及十氫萘基；或為基於絲胺醇主鏈或二乙醇胺主鏈之非環狀部分。 84. 如實施例23至81中任一例之dsRNA藥劑，其中該親脂性部分經由連接子與雙股iRNA藥劑結合，該連接子含有醚、硫醚、脲、碳酸酯、胺、醯胺、順丁烯二醯亞胺-硫醚、二硫鍵、磷酸二酯、磺醯胺鍵聯、點擊反應之產物或胺基甲酸酯。 85. 如實施例23至84中任一例之雙股iRNA藥劑，其中該親脂性部分與核鹼基、糖部分或核苷間鍵聯結合。 86. 如實施例23至85中任一例之dsRNA藥劑，其中親脂性部分經由選自由以下組成之群的生物可裂解連接子結合：DNA、RNA、二硫鍵、醯胺；半乳胺糖、葡糖胺、葡萄糖、半乳糖、甘露糖之官能化單醣或寡醣，及其組合。 87. 如實施例23至86中任一例之dsRNA藥劑，其中該有義股之3'端經由端帽受保護，該端帽為具有胺之環狀基團，該環狀基團選自由以下組成之群：吡咯啶基、吡唑啉基、吡唑啶基、咪唑啉基、咪唑啶基、哌啶基、哌𠯤基、[1,3]二氧雜環戊烷基、㗁唑啶基、異㗁唑啶基、𠰌啉基、噻唑啶基、異噻唑啶基、喹喏啉基、嗒𠯤酮基、四氫呋喃基及十氫萘基。 88. 如實施例23至87中任一項之dsRNA藥劑，其進一步包含靶向配位體，例如靶向眼組織或肝臟組織之配位體。 89. 如實施例88之dsRNA劑，其中該配位體與該有義股結合。 90. 如實施例88或89之dsRNA藥劑，其中該配位體與該有義股之3'端或5'端結合。 91. 如實施例88或89之dsRNA藥劑，其中該配位體與該有義股之3'端結合。 92. 如實施例88至91中任一例之dsRNA藥劑，其中該眼組織為小梁網狀組織、睫狀體、視網膜組織、視網膜色素上皮(RPE)或脈絡膜組織，例如脈絡膜血管。 93. 如實施例88至91中任一例之dsRNA藥劑，其中該靶向配位體包含N-乙醯基半乳糖胺(GalNAc)。 94. 如實施例88至91中任一例之dsRNA藥劑，其中該靶向配位體為一或多種GalNAc結合物或一或多種GalNAc衍生物。 95. 如實施例94之dsRNA藥劑，其中該一或多種GalNAc結合物或一或多種GalNAc衍生物經由單價連接子或二價、三價或四價分支連接子連接。 96. 如實施例94之dsRNA藥劑，其中該配位體為
Figure 02_image136
。 97. 如實施例96之dsRNA藥劑，其中該dsRNA藥劑與如以下示意圖中所示之配位體結合
Figure 02_image138
， 其中X為O或S。 98. 如實施例97之dsRNA藥劑，其中X為O。 99. 如實施例1至98中任一例之dsRNA藥劑，其進一步包含末端對掌性修飾，該修飾存在於該反義股之3'端的第一核苷酸間鍵聯處，具有呈Sp組態之鍵聯磷原子， 末端對掌性修飾，該修飾存在於反義股之5'端的第一核苷酸間鍵聯處，具有呈Rp組態之鍵聯磷原子，及 末端對掌性修飾，該修飾存在於有義股之5'端的第一核苷酸間鍵聯處，具有呈Rp組態或Sp組態之鍵聯磷原子。 100. 如實施例1至98中任一例之dsRNA藥劑，其進一步包含 末端對掌性修飾，該修飾存在於反義股之3'端的第一及第二核苷酸間鍵聯處，具有呈Sp組態之鍵聯磷原子， 末端對掌性修飾，該修飾存在於反義股之5'端的第一核苷酸間鍵聯處，具有呈Rp組態之鍵聯磷原子，及 末端對掌性修飾，該修飾存在於有義股之5'端的第一核苷酸間鍵聯處，具有呈Rp或Sp組態之鍵聯磷原子。 101. 如實施例1至98中任一例之dsRNA藥劑，其進一步包含 末端對掌性修飾，該修飾存在於反義股之3'端的第一、第二及第三核苷酸間鍵聯處，具有呈Sp組態之鍵聯磷原子， 末端對掌性修飾，該修飾存在於反義股之5'端的第一核苷酸間鍵聯處，具有呈Rp組態之鍵聯磷原子，及 末端對掌性修飾，該修飾存在於有義股之5'端的第一核苷酸間鍵聯處，具有呈Rp或Sp組態之鍵聯磷原子。 102. 如實施例1至98中任一例之dsRNA藥劑，其進一步包含 末端對掌性修飾，該修飾存在於反義股之3'端的第一及第二核苷酸間鍵聯處，具有呈Sp組態之鍵聯磷原子， 末端對掌性修飾，該修飾存在於反義股之3'端的第三核苷酸間鍵聯處，具有呈Rp組態之鍵聯磷原子， 末端對掌性修飾，該修飾存在於反義股之5'端的第一核苷酸間鍵聯處，具有呈Rp組態之鍵聯磷原子，及 末端對掌性修飾，該修飾存在於有義股之5'端的第一核苷酸間鍵聯處，具有呈Rp或Sp組態之鍵聯磷原子。 103. 如實施例1至98中任一例之dsRNA藥劑，其進一步包含 末端對掌性修飾，該修飾存在於反義股之3'端的第一及第二核苷酸間鍵聯處，具有呈Sp組態之鍵聯磷原子， 末端對掌性修飾，該修飾存在於反義股之5'端的第一及第二核苷酸間鍵聯處，具有呈Rp組態之鍵聯磷原子，及 末端對掌性修飾，該修飾存在於有義股之5'端的第一核苷酸間鍵聯處，具有呈Rp或Sp組態之鍵聯磷原子。 104. 如實施例1至103中任一例之dsRNA藥劑，其進一步包含反義股之5'端處的磷酸酯或磷酸酯模擬物。 105. 如實施例104之dsRNA藥劑，其中該磷酸酯模擬物為膦酸5'-乙烯酯(VP)。 106. 一種細胞，其含有如實施例1至105中任一例之dsRNA藥劑。 107. 一種人類眼細胞，例如(小梁網狀結構之細胞、睫狀體之細胞、RPE細胞、星形膠質細胞、外被細胞、繆氏細胞、神經節細胞、內皮細胞或感光細胞)，相較於在其他方面類似的未處理細胞，其包含降低的MYOC mRNA含量或MYOC蛋白質含量，其中視情況，含量降低至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%。 108. 如實施例107之人類細胞，其由包含使人類細胞與如實施例1至94中任一例之dsRNA藥劑接觸的方法產生。 109. 一種用於抑制MYOC表現之醫藥組合物，其包含如實施例1至105中任一例之dsRNA藥劑。 110. 一種醫藥組合物，其包含如實施例1至105中任一例之dsRNA藥劑及脂質調配物。 111. 一種用於抑制細胞中之MYOC表現的方法，該方法包含： (a) 使該細胞與如實施例1至105中任一例之dsRNA藥劑或如實施例109或110之醫藥組合物接觸；及 (b) 將步驟(a)中產生之該細胞維持足以獲得MYOC之mRNA轉錄本降解的時間，藉此抑制該細胞中之MYOC表現。 112. 一種用於抑制細胞中之MYOC表現的方法，該方法包含： (a) 使該細胞與如實施例1至105中任一例之dsRNA藥劑或如實施例109或110之醫藥組合物接觸；及 (b) 將步驟(a)中產生之該細胞維持足以減少MYOC mRNA、MYOC蛋白質或MYOC mRNA與蛋白質之含量的時間，藉此抑制該細胞中之MYOC表現。 113. 如實施例111或112之方法，其中該細胞存在於個體內。 114. 如實施例113之方法，其中該個體為人類。 115. 如實施例111至114中任一例之方法，其中MYOC mRNA之含量被抑制至少50%。 116. 如實施例111至114中任一例之方法，其中MYOC蛋白質之含量被抑制至少50%。 117. 如實施例114至116之方法，其中抑制MYOC表現使該個體之生物樣品(例如眼房液樣品)中之MYOC蛋白質含量降低至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%。 118. 如實施例114至117中任一例之方法，其中該個體已診斷患有MYOC相關病症，例如青光眼，例如原發性開角型青光眼(POAG)。 119. 一種抑制MYOC於眼細胞或組織中之表現的方法，該方法包含： (a)使該細胞或組織與結合MYOC之dsRNA藥劑接觸；及 (b)將步驟(a)中產生之該細胞或組織維持足以減少MYOC mRNA、MYOC蛋白質或MYOC mRNA與蛋白質之含量的時間，藉此抑制MYOC於該細胞或組織中之表現。 120. 如實施例119之方法，其中該眼細胞或組織包含小梁網狀組織、睫狀體、RPE細胞、視網膜組織、星形膠質細胞、外被細胞、繆氏細胞、神經節細胞、內皮細胞、感光細胞、視網膜血管(例如包括內皮細胞及血管平滑肌細胞)或脈絡膜組織(例如脈絡膜血管)。 120a. 一種降低個體之眼內壓之方法，其包含向該個體投與治療有效量之如實施例1至105中任一例之dsRNA藥劑或如實施例109或110之醫藥組合物，藉此降低該個體之眼內壓。 120b. 一種在個體中限制眼內壓升高或維持恆定眼內壓之方法，其包含向該個體投與治療有效量之如實施例1至105中任一例之dsRNA藥劑或如實施例109或110之醫藥組合物，藉此限制該個體之眼內壓升高或維持恆定眼內壓。 121. 一種治療經診斷患有MYOC相關病症之個體的方法，其包含向該個體投與治療有效量之如請求項1至105中任一例之dsRNA藥劑或如請求項109或110之醫藥組合物，藉此治療該病症。 122. 如實施例118或121之方法，其中該MYOC相關病症為青光眼。 122a. 一種治療患有青光眼之個體的方法，其包含向該個體投與治療有效量之如請求項1至105中任一例之dsRNA藥劑或如請求項109或110之醫藥組合物，藉此治療該青光眼。 123. 如實施例122或122a之方法，其中青光眼係選自由原發性開角型青光眼(POAG)組成之群。 124. 如實施例121至123中任一例之方法，其中治療包含改善該病症之至少一種徵象或症狀。 125. 如實施例124之方法，其中青光眼之至少一種徵象或症狀包含視神經損傷、視力損失、管狀視覺、視力模糊、眼痛或MYOC (例如MYOC基因、MYOC mRNA或MYOC蛋白質)之存在、含量或活性中之一或多者的量測。 126. 如實施例121至123中任一例之方法，其中治療包含防止該病症惡化。 127. 如實施例124至126中任一例之方法，其中該治療包含以下中之一或多者：(a)抑制或降低MYOC表現或活性；(b)降低錯誤摺疊之MYOC蛋白質的含量；(c)減少小梁網狀細胞死亡；(d)降低眼內壓；或(e)增加視敏度。 128. 如實施例127之方法，其中該治療使得小梁網狀組織、睫狀體、視網膜、RPE、視網膜血管(例如包括內皮細胞及血管平滑肌細胞)或脈絡膜組織(例如脈絡膜血管)中之MYOC mRNA相對於基線平均降低至少30%。 129. 如實施例128之方法，其中該治療使得小梁網狀組織、睫狀體、視網膜、RPE、視網膜血管(例如包括內皮細胞及血管平滑肌細胞)或脈絡膜組織(例如脈絡膜血管)中之MYOC mRNA相對於基線平均降低至少60%。 130. 如實施例129之方法，其中該治療使得小梁網狀組織、睫狀體、視網膜、RPE、視網膜血管(例如包括內皮細胞及血管平滑肌細胞)或脈絡膜組織(例如脈絡膜血管)中之MYOC mRNA相對於基線平均降低至少90%。 131. 如實施例124至129中任一例之方法，其中在治療之後，該個體在單次劑量之dsRNA之後經歷持續至少8週的基因減弱，如根據視網膜中之MYOC蛋白質所評估。 132. 如實施例131之方法，其中在單次劑量之dsRNA之後，治療引起持續至少12週的基因減弱，如根據視網膜中之MYOC蛋白質所評估。 133. 如實施例132之方法，其中在單次劑量之dsRNA之後，治療引起持續至少16週的基因減弱，如根據視網膜中之MYOC蛋白質所評估。 134. 如實施例113至133中任一例之方法，其中該個體為人類。 135. 如實施例114至134中任一例之方法，其中該dsRNA藥劑以約0.01 mg/kg至約50 mg/kg之劑量投與。 136. 如實施例114至135中任一例之方法，其中向該個體眼內、靜脈內或體表投與該dsRNA藥劑。 137.  如實施例136之方法，其中該眼內投與包含玻璃體內投與(例如玻璃體內注射)、經鞏膜投與(例如經鞏膜注射)、結膜下投與(例如結膜下注射)、眼球後投與(例如眼球後注射)、前房內投與(例如前房內注射)或視網膜下投與(例如視網膜下注射)。 138. 如實施例114至137中任一例之方法，其進一步包含量測個體之MYOC(例如MYOC基因、MYOC mRNA或MYOC蛋白質)含量。 139. 如實施例138之方法，其中量測該個體中之MYOC含量包含量測來自該個體之生物樣品(例如眼房液樣品)中的MYOC基因、MYOC蛋白質或MYOC mRNA含量。 140. 如實施例114至139中任一例之方法，其進一步包含進行血液測試、成像測試或眼房液切片檢查。 141. 如實施例138至140中任一例之方法，其中量測該個體中之MYOC (例如MYOC基因、MYOC mRNA或MYOC蛋白質)含量係在用dsRNA藥劑或醫藥組合物治療之前進行。 142. 如實施例141之方法，其中在測定個體之MYOC (例如MYOC基因、MYOC mRNA或MYOC蛋白質)含量大於參考含量之後，向該個體投與dsRNA藥劑或醫藥組合物。 143. 如實施例139至142中任一例之方法，其中量測該個體中之MYOC (例如MYOC基因、MYOC mRNA或MYOC蛋白質)含量係在用dsRNA藥劑或醫藥組合物治療之後進行。 144. 如實施例121至143中任一例之方法，其進一步包含向該個體投與適用於治療或預防MYOC相關病症之另一種藥劑及/或療法。 145. 如實施例144之方法，其中該另一種藥劑及/或療法包含光動力療法、光凝療法、類固醇、非類固醇消炎劑、抗MYOC藥劑及/或玻璃體切除術中之一或多者。
實例 實例 1. MYOC siRNA本文提供之核酸序列使用標準命名法表示。參見表1之縮寫。 表 1. 核酸序列表示 中所用之核苷酸單體縮寫應理解，此等單體當存在於寡核苷酸中時藉由5'-3'磷酸二酯鍵相互連接。
縮寫 核苷酸
A 腺苷-3'-磷酸酯
Ab β-L-腺苷-3'-磷酸酯
Abs β-L-腺苷-3'-硫代磷酸酯
Af 2'-氟腺苷-3'-磷酸酯
Afs 2'-氟腺苷-3'-硫代磷酸酯
(Ahd) 2'-O-十六烷基-腺苷-3'-磷酸酯
(Ahds) 2'-O-十六烷基-腺苷-3'-硫代磷酸酯
As 腺苷-3'-硫代磷酸酯
(A2p) 腺苷2'-磷酸酯
(A2ps) 腺苷-2'-硫代磷酸酯
C 胞苷-3'-磷酸酯
Cb β-L-胞苷-3'-磷酸酯
Cbs β-L-胞苷-3'-硫代磷酸酯
Cf 2'-氟胞苷-3'-磷酸酯
Cfs 2'-氟胞苷-3'-硫代磷酸酯
(Chd) 2'-O-十六烷基-胞苷-3'-磷酸酯
(Chds) 2'-O-十六烷基-胞苷-3'-硫代磷酸酯
Cs 胞苷-3'-硫代磷酸酯
(C2p) 胞嘧啶2'-磷酸酯
(C2ps) 胞苷-2'-硫代磷酸酯
G 鳥苷-3'-磷酸酯
Gb β-L-鳥苷-3'-磷酸酯
Gbs β-L-鳥苷-3'-硫代磷酸酯
Gf 2'-氟鳥苷-3'-磷酸酯
Gfs 2'-氟鳥苷-3'-硫代磷酸酯
(Ghd) 2'-O-十六烷基-鳥苷-3'-磷酸酯
(Ghds) 2'-O-十六烷基-鳥苷-3'-硫代磷酸酯
Gs 鳥苷-3'-硫代磷酸酯
(G2p) 鳥苷2'-磷酸酯
(G2ps) 鳥苷-2'-硫代磷酸酯
T 5'-甲基尿苷-3'-磷酸酯
Tb β-L-胸苷-3'-磷酸酯
Tbs β-L-胸苷-3'-硫代磷酸酯
Tf 2'-氟-5-甲基尿苷-3'-磷酸酯
Tfs 2'-氟-5-甲基尿苷-3'-硫代磷酸酯
Tgn 胸苷-二醇核酸(GNA) S-異構體
Agn 腺苷-二醇核酸(GNA) S-異構體
Cgn 胞苷-二醇核酸(GNA) S-異構體
Ggn 鳥苷-二醇核酸(GNA) S-異構體
Ts 5-甲基尿苷-3'-硫代磷酸酯
(T2p) 胸苷2'-磷酸酯
U 尿苷-3'-磷酸酯
Ub β-L-尿苷-3'-磷酸酯
Ubs β-L-尿苷-3'-硫代磷酸酯
Uf 2'-氟尿苷-3'-磷酸酯
Ufs 2'-氟尿苷-3'-硫代磷酸酯
(Uhd) 2'-O-十六烷基-尿苷-3'-磷酸酯
(Uhds) 2'-O-十六烷基-尿苷-3'-硫代磷酸酯
Us 尿苷-3'-硫代磷酸酯
(U2p) 尿嘧啶2'-磷酸酯
(U2ps) 尿苷-2'-硫代磷酸酯
N 任何核苷酸(G、A、C、T或U)
VP 膦酸乙烯酯
a 2'-O-甲基腺苷-3'-磷酸酯
as 2'-O-甲基腺苷-3'-硫代磷酸酯
c 2'-O-甲基胞苷-3'-磷酸酯
cs 2'-O-甲基胞苷-3'-硫代磷酸酯
g 2'-O-甲基鳥苷-3'-磷酸酯
gs 2'-O-甲基鳥苷-3'-硫代磷酸酯
t 2'-O-甲基-5-甲基尿苷-3'-磷酸酯
ts 2'-O-甲基-5-甲基尿苷-3'-硫代磷酸酯
u 2'-O-甲基尿苷-3'-磷酸酯
us 2'-O-甲基尿苷-3'-硫代磷酸酯
dA 2'-去氧腺苷-3'-磷酸酯
dAs 2'-去氧腺苷-3'-硫代磷酸酯
dC 2'-去氧胞苷-3'-磷酸酯
dCs 2'-去氧胞苷-3'-硫代磷酸酯
dG 2'-去氧鳥苷-3'-磷酸酯
dGs 2'-去氧鳥苷-3'-硫代磷酸酯
dT 2'-去氧胸苷
dTs 2'-去氧胸苷-3'-硫代磷酸酯
dU 2'-去氧尿苷
s 硫代磷酸酯鍵聯
L96 1 N-[參(GalNAc-烷基)-醯胺基癸醯基)]-4-羥基脯胺醇Hyp-(GalNAc-烷基)3
(Aeo) 2'-O-甲氧基乙基腺苷-3'-磷酸酯
(Aeos) 2'-O-甲氧基乙基腺苷-3'-硫代磷酸酯
(Geo) 2'-O-甲氧基乙基鳥苷-3'-磷酸酯
(Geos) 2'-O-甲氧基乙基鳥苷-3'-硫代磷酸酯
(Teo) 2'-O-甲氧基乙基-5-甲基尿苷-3'-磷酸酯
(Teos) 2'-O-甲氧基乙基-5-甲基尿苷-3'-硫代磷酸酯
(m5Ceo) 2'-O-甲氧基乙基-5-甲基胞啶-3'-磷酸酯
(m5Ceos) 2'-O-甲氧基乙基-5-甲基胞啶-3'-硫代磷酸酯
1L96之化學結構如下：
Figure 02_image140
實驗方法 生物資訊 轉錄本產生靶向人類MYOC「肌纖蛋白」之四組siRNA (人類：NCBI refseqID NM_000261.2；NCBI基因ID：4653)。人類NM_000261.2 REFSEQ mRNA具有2100個鹼基之長度。使用生物資訊學方法產生寡核苷酸對且將其排序，且例示性寡核苷酸對顯示於表2A及表2B中。經修飾之序列展現於表2A中。未修飾之序列展現於表2B中。 表 2A. 例示性人類 MYOC siRNA 修飾之單股及雙螺旋體序列第1欄指示雙螺旋體名稱且雙螺旋體名稱中之小數點之後的數字僅指生產批號。第2欄指示有義序列之名稱。第3欄指示第4欄之序列的序列ID。第4欄提供適用於本文所述之雙螺旋體之有義股的經修飾序列。第5欄指示反義序列名稱。第6欄指示第7欄之序列的序列ID。第7欄提供適用於本文所述之雙螺旋體(例如包含表之同一列中之有義序列的雙螺旋體)的經修飾之反義股之序列。第8欄指示與第7欄之反義股互補之目標mRNA (NM_000261.2)中的位置。第9欄指示第8欄之序列的序列ID。
雙螺旋體名稱 有義序列名稱 Seq ID NO: (有義) 有義序列 (5'-3') 反義序列名稱 Seq ID NO: (反義) 反義序列 (5'-3') NM_000261.2中的mRNA目標序列 SEQ ID NO: (mRNA目標)
AD-1565444.1 A-2893965.1 7 csuscuc(Ahd)GfcAfCfAfgcagagcususa A-2893966.1 451 VPusAfsadGc(Tgn)cugcuguGfcUfgagagsgsu ACCUCUCAGCACAGCAGAGCUUU 895
AD-1565445.1 A-2893965.1 8 csuscuc(Ahd)GfcAfCfAfgcagagcususa A-2893967.1 452 VPusAfsagcdTc(Tgn)gcuguGfcUfgagagsgsu ACCUCUCAGCACAGCAGAGCUUU 896
AD-1565692.1 A-2893965.1 9 csuscuc(Ahd)GfcAfCfAfgcagagcususa A-2894431.1 453 VPusAfsagdCu(C2p)ugcuguGfcUfgagagsgsu ACCUCUCAGCACAGCAGAGCUUU 897
AD-1565446.1 A-2893968.1 10 uscsucag(Chd)aCfAfGfcagagcuususa A-2893969.1 454 VPusAfsaadGc(Tgn)cugcugUfgCfugagasgsg CCUCUCAGCACAGCAGAGCUUUC 898
AD-1565447.1 A-2893970.1 11 csasgcag(Ahd)gCfUfUfuccagaggsasa A-2893971.1 455 VPusUfsccdTc(Tgn)ggaaagCfuCfugcugsusg CACAGCAGAGCUUUCCAGAGGAA 899
AD-1565448.1 A-2893972.1 12 asasug(Ahd)gGfuUfCfUfucugugcascsa A-2893973.1 456 VPusGfsudGc(Agn)cagaagaAfcCfucauusgsc GCAAUGAGGUUCUUCUGUGCACG 900
AD-1565693.1 A-2893972.1 13 asasug(Ahd)gGfuUfCfUfucugugcascsa A-2894432.1 457 VPusGfsugdCa(C2p)agaagaAfcCfucauusgsc GCAAUGAGGUUCUUCUGUGCACG 901
AD-1565449.1 A-2893974.1 14 asusgagg(Uhd)uCfUfUfcugugcacsgsa A-2893975.1 458 VPusCfsgudGc(Agn)cagaagAfaCfcucaususg CAAUGAGGUUCUUCUGUGCACGU 902
AD-1565450.1 A-2893976.1 15 usgsagg(Uhd)UfcUfUfCfugugcacgsusa A-2893977.1 459 VPusAfscgudGc(Agn)cagaaGfaAfccucasusu AAUGAGGUUCUUCUGUGCACGUU 903
AD-1565694.1 A-2893976.1 16 usgsagg(Uhd)UfcUfUfCfugugcacgsusa A-2894433.1 460 VPusAfscgdTg(C2p)acagaaGfaAfccucasusu AAUGAGGUUCUUCUGUGCACGUU 904
AD-1565695.1 A-2894434.1 17 gsasggu(Uhd)CfuUfCfUfgugcacgususa A-2894435.1 461 VPusAfsacdGu(G2p)cacagaAfgAfaccucsasu AUGAGGUUCUUCUGUGCACGUUG 905
AD-1193175.5 A-2058874.1 18 asgsguu(Chd)UfuCfUfGfugcacguusgsa A-1801665.1 462 VPusCfsaacGfuGfCfacagAfaGfaaccuscsa UGAGGUUCUUCUGUGCACGUUGC 906
AD-1565793.1 A-2893978.1 19 asgsguu(Chd)uuCfUfGfugcacguusgsa A-2894582.1 463 VPusdCsaadCgdTgcacdAgAfagaaccuscsg UGAGGUUCUUCUGUGCACGUUGC 907
AD-1565795.1 A-2058874.1 20 asgsguu(Chd)UfuCfUfGfugcacguusgsa A-2894585.1 464 VPusCfsaadCg(Tgn)gcacagAfaGfaaccuscsg UGAGGUUCUUCUGUGCACGUUGC 908
AD-1565796.1 A-2058874.1 21 asgsguu(Chd)UfuCfUfGfugcacguusgsa A-2894586.1 465 VPudCsaadCg(Tgn)gcacdAgAfagaaccuscsg UGAGGUUCUUCUGUGCACGUUGC 909
AD-1565797.1 A-2894587.1 22 asgsgua(Chd)UfuCfUfGfugcacguusgsa A-2894588.1 466 VPusCfsaadCg(Tgn)gcacagAfaGfuaccuscsg UGAGGUUCUUCUGUGCACGUUGC 910
AD-1565798.1 A-2894589.1 23 asgsgau(Chd)UfuCfUfGfugcacguusgsa A-2894590.1 467 VPusCfsaadCg(Tgn)gcacagAfaGfauccuscsg UGAGGUUCUUCUGUGCACGUUGC 911
AD-1565799.1 A-2894591.1 24 asgscuu(Chd)UfuCfUfGfugcacguusgsa A-2894592.1 468 VPusCfsaadCg(Tgn)gcacagAfaGfaagcuscsg UGAGGUUCUUCUGUGCACGUUGC 912
AD-1565451.1 A-2893978.1 25 asgsguu(Chd)uuCfUfGfugcacguusgsa A-2893979.1 469 VPusdCsaadCgdTgcacdAgAfagaaccuscsa UGAGGUUCUUCUGUGCACGUUGC 913
AD-1565452.1 A-2893980.1 26 gsgsuuc(Uhd)ucUfGfUfgcacguugscsa A-2893981.1 470 VPusdGscadAcdGugcadCaGfaagaaccsusc GAGGUUCUUCUGUGCACGUUGCU 914
AD-1565696.1 A-2894436.1 27 gsgsuuc(Uhd)UfcUfGfUfgcacguugscsa A-2894437.1 471 VPusGfscadAc(G2p)ugcacaGfaAfgaaccsusc GAGGUUCUUCUGUGCACGUUGCU 915
AD-1565794.1 A-2894583.1 28 gsusucu(Uhd)CfUfGfugcacguusgsa A-2894584.1 472 VPusdCsaadCgdTgcacdAgAfagaacscsu AGGUUCUUCUGUGCACGUUGC 916
AD-1565453.1 A-2893982.1 29 gsusucu(Uhd)cuGfUfGfcacguugcsusa A-2893983.1 473 VPusdAsgcdAadCgugcdAcAfgaagaacscsu AGGUUCUUCUGUGCACGUUGCUG 917
AD-1565454.1 A-2893984.1 30 ususcuu(Chd)ugUfGfCfacguugcusgsa A-2893985.1 474 VPusdCsagdCadAcgugdCaCfagaagaascsc GGUUCUUCUGUGCACGUUGCUGC 918
AD-1565455.1 A-2893986.1 31 uscsuuc(Uhd)GfuGfCfAfcguugcugscsa A-2893987.1 475 VPusGfscadGc(Agn)acgugcAfcAfgaagasasc GUUCUUCUGUGCACGUUGCUGCA 919
AD-1565456.1 A-2893988.1 32 uscsuuc(Uhd)guGfCfAfcguugcugscsa A-2893989.1 476 VPusdGscadGcdAacgudGcAfcagaagasasc GUUCUUCUGUGCACGUUGCUGCA 920
AD-1565457.1 A-2893990.1 33 csusucug(Uhd)gCfAfCfguugcugcsasa A-2893991.1 477 VPusUfsgcadGc(Agn)acgugCfaCfagaagsasa UUCUUCUGUGCACGUUGCUGCAG 921
AD-1565697.1 A-2893990.1 34 csusucug(Uhd)gCfAfCfguugcugcsasa A-2894438.1 478 VPusUfsgcdAg(C2p)aacgugCfaCfagaagsasa UUCUUCUGUGCACGUUGCUGCAG 922
AD-1565698.1 A-2894439.1 35 ususcug(Uhd)GfcAfCfGfuugcugcasgsa A-2894440.1 479 VPusCfsugdCa(G2p)caacguGfcAfcagaasgsa UCUUCUGUGCACGUUGCUGCAGC 923
AD-1565458.1 A-2893992.1 36 uscsugug(Chd)aCfGfUfugcugcagscsa A-2893993.1 480 VPusGfscudGc(Agn)gcaacgUfgCfacagasasg CUUCUGUGCACGUUGCUGCAGCU 924
AD-1565459.1 A-2893994.1 37 csusgug(Chd)AfcGfUfUfgcugcagcsusa A-2893995.1 481 VPusAfsgcudGc(Agn)gcaacGfuGfcacagsasa UUCUGUGCACGUUGCUGCAGCUU 925
AD-1565699.1 A-2893994.1 38 csusgug(Chd)AfcGfUfUfgcugcagcsusa A-2894441.1 482 VPusAfsgcdTg(C2p)agcaacGfuGfcacagsasa UUCUGUGCACGUUGCUGCAGCUU 926
AD-1565700.1 A-2894442.1 39 usgsugc(Ahd)CfgUfUfGfcugcagcususa A-2894443.1 483 VPusAfsagdCu(G2p)cagcaaCfgUfgcacasgsa UCUGUGCACGUUGCUGCAGCUUU 927
AD-1565460.1 A-2893996.1 40 gsusgca(Chd)GfuUfGfCfugcagcuususa A-2893997.1 484 VPusAfsaadGc(Tgn)gcagcaAfcGfugcacsasg CUGUGCACGUUGCUGCAGCUUUG 928
AD-1565461.1 A-2893998.1 41 gscsacg(Uhd)ugCfUfGfcagcuuugsgsa A-2893999.1 485 VPusdCscadAadGcugcdAgCfaacgugcsasc GUGCACGUUGCUGCAGCUUUGGG 929
AD-1565462.1 A-2894000.1 42 csascgu(Uhd)gcUfGfCfagcuuuggsgsa A-2894001.1 486 VPusdCsccdAadAgcugdCaGfcaacgugscsa UGCACGUUGCUGCAGCUUUGGGC 930
AD-1565701.1 A-2894444.1 43 gsasgaug(Chd)cAfGfCfuguccagcsusa A-2894445.1 487 VPusAfsgcdTg(G2p)acagcuGfgCfaucucsasg CUGAGAUGCCAGCUGUCCAGCUG 931
AD-1565463.1 A-2894002.1 44 gsasugc(Chd)AfgCfUfGfuccagcugscsa A-2894003.1 488 VPusGfscadGc(Tgn)ggacagCfuGfgcaucsusc GAGAUGCCAGCUGUCCAGCUGCU 932
AD-1565464.1 A-2894004.1 45 csusguc(Chd)agCfUfGfcugcuucusgsa A-2894005.1 489 VPusdCsagdAadGcagcdAgCfuggacagscsu AGCUGUCCAGCUGCUGCUUCUGG 933
AD-1565465.1 A-2894006.1 46 cscsagc(Uhd)GfcUfGfCfuucuggccsusa A-2894007.1 490 VPusAfsggdCc(Agn)gaagcaGfcAfgcuggsasc GUCCAGCUGCUGCUUCUGGCCUG 934
AD-1565466.1 A-2894008.1 47 csusggc(Chd)UfgCfCfUfggugugggsasa A-2894009.1 491 VPusUfscdCc(Agn)caccaggCfaGfgccagsasa UUCUGGCCUGCCUGGUGUGGGAU 935
AD-1565467.1 A-2894008.1 48 csusggc(Chd)UfgCfCfUfggugugggsasa A-2894010.1 492 VPusUfscccdAc(Agn)ccaggCfaGfgccagsasa UUCUGGCCUGCCUGGUGUGGGAU 936
AD-1565702.1 A-2894008.1 49 csusggc(Chd)UfgCfCfUfggugugggsasa A-2894446.1 493 VPusUfsccdCa(C2p)accaggCfaGfgccagsasa UUCUGGCCUGCCUGGUGUGGGAU 937
AD-1565468.1 A-2894011.1 50 usgsgcc(Uhd)GfcCfUfGfgugugggasusa A-2894012.1 494 VPusAfsucdCc(Agn)caccagGfcAfggccasgsa UCUGGCCUGCCUGGUGUGGGAUG 938
AD-1565469.1 A-2894013.1 51 gscscug(Chd)CfuGfGfUfgugugaugsusa A-2894014.1 495 VPusAfscadTcdAcacaccAfgGfcaggcscsa UGGCCUGCCUGGUGUGGGAUGUG 939
AD-1565703.1 A-2894447.1 52 gscscug(Chd)CfuGfGfUfgugggaugsusa A-2894448.1 496 VPusAfscadTc(C2p)cacaccAfgGfcaggcscsa UGGCCUGCCUGGUGUGGGAUGUG 940
AD-1565704.1 A-2894449.1 53 asgsag(Uhd)gGfcCfGfAfugccaguasusa A-2894450.1 497 VPusAfsuadCu(G2p)gcaucgGfcCfacucusgsg CCAGAGUGGCCGAUGCCAGUAUA 941
AD-1565705.1 A-2894451.1 54 asgsug(Uhd)gGfcCfAfGfucccaaugsasa A-2894452.1 498 VPusUfscadTu(G2p)ggacugGfcCfacacusgsa UCAGUGUGGCCAGUCCCAAUGAA 942
AD-1565470.1 A-2894015.1 55 gsusgugg(Chd)cAfGfUfcccaaugasasa A-2894016.1 499 VPusUfsucdAu(Tgn)gggacuGfgCfcacacsusg CAGUGUGGCCAGUCCCAAUGAAU 943
AD-1565471.1 A-2894015.1 56 gsusgugg(Chd)cAfGfUfcccaaugasasa A-2894017.1 500 VPusdTsucdAudTgggadCuGfgccacacsusg CAGUGUGGCCAGUCCCAAUGAAU 944
AD-1565472.1 A-2894018.1 57 gscscagg(Chd)cAfUfGfucagucauscsa A-2894019.1 501 VPusGfsadTg(Agn)cugacauGfgCfcuggcsusc GAGCCAGGCCAUGUCAGUCAUCC 945
AD-1565473.1 A-2894018.1 58 gscscagg(Chd)cAfUfGfucagucauscsa A-2894020.1 502 VPusGfsaugdAc(Tgn)gacauGfgCfcuggcsusc GAGCCAGGCCAUGUCAGUCAUCC 946
AD-1565706.1 A-2894018.1 59 gscscagg(Chd)cAfUfGfucagucauscsa A-2894453.1 503 VPusGfsaudGa(C2p)ugacauGfgCfcuggcsusc GAGCCAGGCCAUGUCAGUCAUCC 947
AD-1565474.1 A-2894021.1 60 gsgscca(Uhd)GfuCfAfGfucauccausasa A-2894022.1 504 VPusUfsaudGg(Agn)ugacugAfcAfuggccsusg CAGGCCAUGUCAGUCAUCCAUAA 948
AD-1565707.1 A-2894454.1 61 gsascc(Uhd)gGfaGfGfCfcaccaaagscsa A-2894455.1 505 VPusGfscudTu(G2p)guggccUfcCfaggucsusa UAGACCUGGAGGCCACCAAAGCU 949
AD-1565475.1 A-2894023.1 62 csusgg(Ahd)gGfcCfAfCfcaaagcucsgsa A-2894024.1 506 VPusCfsgadGc(Tgn)uuggugGfcCfuccagsgsu ACCUGGAGGCCACCAAAGCUCGA 950
AD-1565476.1 A-2894025.1 63 gsasaac(Chd)CfaAfAfCfcagagagususa A-2894026.1 507 VPusAfsacdTc(Tgn)cugguuUfgGfguuucscsa UGGAAACCCAAACCAGAGAGUUG 951
AD-1565477.1 A-2894027.1 64 csasgca(Ahd)CfcUfCfCfuccgagacsasa A-2894028.1 508 VPusUfsgdTc(Tgn)cggaggaGfgUfugcugsusa UACAGCAACCUCCUCCGAGACAA 952
AD-1565708.1 A-2894027.1 65 csasgca(Ahd)CfcUfCfCfuccgagacsasa A-2894456.1 509 VPusUfsgudCu(C2p)ggaggaGfgUfugcugsusa UACAGCAACCUCCUCCGAGACAA 953
AD-1565478.1 A-2894029.1 66 gscsaac(Chd)UfcCfUfCfcgagacaasgsa A-2894030.1 510 VPusCfsudTg(Tgn)cucggagGfaGfguugcsusg CAGCAACCUCCUCCGAGACAAGU 954
AD-1565479.1 A-2894029.1 67 gscsaac(Chd)UfcCfUfCfcgagacaasgsa A-2894031.1 511 VPusCfsuugdTc(Tgn)cggagGfaGfguugcsusg CAGCAACCUCCUCCGAGACAAGU 955
AD-1565709.1 A-2894029.1 68 gscsaac(Chd)UfcCfUfCfcgagacaasgsa A-2894457.1 512 VPusCfsuudGu(C2p)ucggagGfaGfguugcsusg CAGCAACCUCCUCCGAGACAAGU 956
AD-1565480.1 A-2894032.1 69 asgsaca(Ahd)guCfAfGfuucuggagsgsa A-2894033.1 513 VPusdCscudCcdAgaacdTgAfcuugucuscsg CGAGACAAGUCAGUUCUGGAGGA 957
AD-1565481.1 A-2894034.1 70 csasagu(Chd)AfgUfUfCfuggaggaasgsa A-2894035.1 514 VPusCfsuudCc(Tgn)ccagaaCfuGfacuugsusc GACAAGUCAGUUCUGGAGGAAGA 958
AD-1565482.1 A-2894036.1 71 gsuscag(Uhd)UfcUfGfGfaggaagagsasa A-2894037.1 515 VPusUfscudCu(Tgn)ccuccaGfaAfcugacsusu AAGUCAGUUCUGGAGGAAGAGAA 959
AD-1565483.1 A-2894038.1 72 asgsaau(Chd)ugGfCfCfaggagguusgsa A-2894039.1 516 VPusdCsaadCcdTccugdGcCfagauucuscsa UGAGAAUCUGGCCAGGAGGUUGG 960
AD-1565484.1 A-2894040.1 73 usgsgcc(Ahd)GfgAfGfGfuuggaaagscsa A-2894041.1 517 VPusGfscdTu(Tgn)ccaaccuCfcUfggccasgsa UCUGGCCAGGAGGUUGGAAAGCA 961
AD-1565710.1 A-2894040.1 74 usgsgcc(Ahd)GfgAfGfGfuuggaaagscsa A-2894458.1 518 VPusGfscudTu(C2p)caaccuCfcUfggccasgsa UCUGGCCAGGAGGUUGGAAAGCA 962
AD-1565711.1 A-2894459.1 75 csasgcc(Ahd)GfgAfGfGfuagcaaggscsa A-2894460.1 519 VPusGfsccdTu(G2p)cuaccuCfcUfggcugscsu AGCAGCCAGGAGGUAGCAAGGCU 963
AD-1565485.1 A-2894042.1 76 usgscca(Chd)CfaGfGfCfuccagagasasa A-2894043.1 520 VPusUfsucdTc(Tgn)ggagccUfgGfuggcascsa UGUGCCACCAGGCUCCAGAGAAG 964
AD-1565486.1 A-2894044.1 77 asasuu(Uhd)gGfaCfAfCfuuuggccususa A-2894045.1 521 VPusAfsaggdCc(Agn)aagugUfcCfaaauuscsc GGAAUUUGGACACUUUGGCCUUC 965
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AD-1565713.1 A-2894462.1 79 ascsacu(Uhd)UfgGfCfCfuuccaggasasa A-2894463.1 523 VPusUfsucdCu(G2p)gaaggcCfaAfaguguscsc GGACACUUUGGCCUUCCAGGAAC 967
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AD-1565672.1 A-2894396.1 414 csuscuug(Chd)aUfGfUfuacauggususa A-2894397.1 858 VPusAfsacdCa(Tgn)guaacaUfgCfaagagscsa UGCUCUUGCAUGUUACAUGGUUA 1302
AD-1565673.1 A-2894396.1 415 csuscuug(Chd)aUfGfUfuacauggususa A-2894398.1 859 VPusdAsacdCadTguaadCaUfgcaagagscsa UGCUCUUGCAUGUUACAUGGUUA 1303
AD-1565674.1 A-2894399.1 416 uscsuug(Chd)AfuGfUfUfacaugguusasa A-2894400.1 860 VPusUfsaadCc(Agn)uguaacAfuGfcaagasgsc GCUCUUGCAUGUUACAUGGUUAC 1304
AD-1565787.1 A-1577564.1 417 csusugc(Ahd)UfgUfUfAfcaugguuascsa A-2894573.1 861 VPusGfsuadAc(C2p)auguaaCfaUfgcaagsasg CUCUUGCAUGUUACAUGGUUACC 1305
AD-1565675.1 A-1577564.1 418 csusugc(Ahd)UfgUfUfAfcaugguuascsa A-2894401.1 862 VPusGfsuaadCc(Agn)uguaaCfaUfgcaagsasg CUCUUGCAUGUUACAUGGUUACC 1306
AD-1565788.1 A-1577566.1 419 ususgca(Uhd)GfuUfAfCfaugguuacscsa A-2894574.1 863 VPusGfsgudAa(C2p)cauguaAfcAfugcaasgsa UCUUGCAUGUUACAUGGUUACCA 1307
AD-1565676.1 A-1577566.1 420 ususgca(Uhd)GfuUfAfCfaugguuacscsa A-2894402.1 864 VPusGfsgdTa(Agn)ccauguaAfcAfugcaasgsa UCUUGCAUGUUACAUGGUUACCA 1308
AD-1565677.1 A-2894403.1 421 ususgca(Uhd)guUfAfCfaugguuacscsa A-2894404.1 865 VPusdGsgudAadCcaugdTaAfcaugcaasgsa UCUUGCAUGUUACAUGGUUACCA 1309
AD-1565678.1 A-2894405.1 422 usgscaug(Uhd)uAfCfAfugguuaccsasa A-2894406.1 866 VPusUfsggdTa(Agn)ccauguAfaCfaugcasasg CUUGCAUGUUACAUGGUUACCAC 1310
AD-1565679.1 A-1577580.1 423 gscsaug(Uhd)UfaCfAfUfgguuaccascsa A-2894407.1 867 VPusGfsugdGu(Agn)accaugUfaAfcaugcsasa UUGCAUGUUACAUGGUUACCACA 1311
AD-1565680.1 A-2894408.1 424 gscsaug(Uhd)uaCfAfUfgguuaccascsa A-2894409.1 868 VPusdGsugdGudAaccadTgUfaacaugcsasa UUGCAUGUUACAUGGUUACCACA 1312
AD-1565681.1 A-2894410.1 425 csasugu(Uhd)AfcAfUfGfguuaccacsasa A-2894411.1 869 VPusUfsgudGg(Tgn)aaccauGfuAfacaugscsa UGCAUGUUACAUGGUUACCACAA 1313
AD-1565789.1 A-2894575.1 426 asusguu(Ahd)CfaUfGfGfuuaccacasasa A-2894576.1 870 VPusUfsugdTg(G2p)uaaccaUfgUfaacausgsc GCAUGUUACAUGGUUACCACAAG 1314
AD-1565790.1 A-2894577.1 427 usgsuua(Chd)AfuGfGfUfuaccacaasgsa A-2894578.1 871 VPusCfsuudGu(G2p)guaaccAfuGfuaacasusg CAUGUUACAUGGUUACCACAAGC 1315
AD-1565682.1 A-2894412.1 428 csusccu(Chd)ugGfCfCfagcaucgasasa A-2894413.1 872 VPusdTsucdGadTgcugdGcCfagaggagscsu AGCUCCUCUGGCCAGCAUCGAAU 1316
AD-1565791.1 A-2894579.1 429 asusaua(Ahd)GfuAfAfGfaugcauuusasa A-2894580.1 873 VPusUfsaadAu(G2p)caucuuAfcUfuauaususc GAAUAUAAGUAAGAUGCAUUUAC 1317
AD-1565683.1 A-2894414.1 430 usasuaag(Uhd)aAfGfAfugcauuuascsa A-2894415.1 874 VPusdGsuadAadTgcaudCuUfacuuauasusu AAUAUAAGUAAGAUGCAUUUACU 1318
AD-1565684.1 A-2894416.1 431 asusaag(Uhd)aaGfAfUfgcauuuacsusa A-2894417.1 875 VPusdAsgudAadAugcadTcUfuacuuausasu AUAUAAGUAAGAUGCAUUUACUA 1319
AD-1565685.1 A-2894418.1 432 usasagu(Ahd)agAfUfGfcauuuacusasa A-2894419.1 876 VPusdTsagdTadAaugcdAuCfuuacuuasusa UAUAAGUAAGAUGCAUUUACUAC 1320
AD-1565867.1 A-2894420.1 433 asasgua(Ahd)GfaUfGfCfauuuacuascsa A-1804926.1 877 VPusGfsuagUfaAfAfugcaUfcUfuacuusasu AUAAGUAAGAUGCAUUUACUACA 1321
AD-1565868.1 A-2894420.1 434 asasgua(Ahd)GfaUfGfCfauuuacuascsa A-2894696.1 878 VPusdGsuadGudAaaugdCaUfcuuacuusgsu AUAAGUAAGAUGCAUUUACUACA 1322
AD-1565869.1 A-2894420.1 435 asasgua(Ahd)GfaUfGfCfauuuacuascsa A-2894697.1 879 VPusGfsuadGu(Agn)aaugcaUfcUfuacuusgsu AUAAGUAAGAUGCAUUUACUACA 1323
AD-1565870.1 A-2894420.1 436 asasgua(Ahd)GfaUfGfCfauuuacuascsa A-2894698.1 880 VPusGfsuadGu(A2p)aaugcaUfcUfuacuusgsu AUAAGUAAGAUGCAUUUACUACA 1324
AD-1565871.1 A-2894422.1 437 asasgua(Ahd)gaUfGfCfauuuacuascsa A-2894697.1 881 VPusGfsuadGu(Agn)aaugcaUfcUfuacuusgsu AUAAGUAAGAUGCAUUUACUACA 1325
AD-1565872.1 A-2894699.1 438 asasgua(Ahd)gadTgCfdAuuuacuascsa A-2894700.1 882 VPusdGsuadGu(Agn)aaugdCaUfcUfuacuusgsu AUAAGUAAGAUGCAUUUACUACA 1326
AD-1565873.1 A-2894422.1 439 asasgua(Ahd)gaUfGfCfauuuacuascsa A-2894700.1 883 VPusdGsuadGu(Agn)aaugdCaUfcUfuacuusgsu AUAAGUAAGAUGCAUUUACUACA 1327
AD-1565874.1 A-2894701.1 440 asasguu(Ahd)gaUfGfCfauuuacuascsa A-2894702.1 884 VPusGfsuadGu(Agn)aaugcaUfcUfaacuusgsu AUAAGUAAGAUGCAUUUACUACA 1328
AD-1565875.1 A-2894703.1 441 asasgaa(Ahd)gaUfGfCfauuuacuascsa A-2894704.1 885 VPusGfsuadGu(Agn)aaugcaUfcUfuucuusgsu AUAAGUAAGAUGCAUUUACUACA 1329
AD-1565876.1 A-2894705.1 442 asascua(Ahd)gaUfGfCfauuuacuascsa A-2894706.1 886 VPusGfsuadGu(Agn)aaugcaUfcUfuaguusgsu AUAAGUAAGAUGCAUUUACUACA 1330
AD-1565686.1 A-2894420.1 443 asasgua(Ahd)GfaUfGfCfauuuacuascsa A-2894421.1 887 VPusGfsuadGu(Agn)aaugcaUfcUfuacuusasu AUAAGUAAGAUGCAUUUACUACA 1331
AD-1565687.1 A-2894422.1 444 asasgua(Ahd)gaUfGfCfauuuacuascsa A-2894423.1 888 VPusdGsuadGudAaaugdCaUfcuuacuusasu AUAAGUAAGAUGCAUUUACUACA 1332
AD-1565688.1 A-2894424.1 445 asgsuaag(Ahd)uGfCfAfuuuacuacsasa A-2894425.1 889 VPusUfsgudAg(Tgn)aaaugcAfuCfuuacususa UAAGUAAGAUGCAUUUACUACAG 1333
AD-1565877.1 A-2894707.1 446 gsusaag(Ahd)UfGfCfauuuacuascsa A-2894708.1 890 VPusGfsuadGu(Agn)aaugcaUfcUfuacsusu AAGUAAGAUGCAUUUACUACA 1334
AD-1565689.1 A-2894426.1 447 ususggc(Uhd)UfcUfAfAfugcuucagsasa A-2894427.1 891 VPusUfscudGa(Agn)gcauuaGfaAfgccaascsu AGUUGGCUUCUAAUGCUUCAGAU 1335
AD-1565792.1 A-2894428.1 448 csusucu(Ahd)AfuGfCfUfucagauagsasa A-2894581.1 892 VPusUfscudAu(C2p)ugaagcAfuUfagaagscsc GGCUUCUAAUGCUUCAGAUAGAA 1336
AD-1565690.1 A-2894428.1 449 csusucu(Ahd)AfuGfCfUfucagauagsasa A-2894429.1 893 VPusUfscdTa(Tgn)cugaagcAfuUfagaagscsc GGCUUCUAAUGCUUCAGAUAGAA 1337
AD-1565691.1 A-2894428.1 450 csusucu(Ahd)AfuGfCfUfucagauagsasa A-2894430.1 894 VPusUfscuadTc(Tgn)gaagcAfuUfagaagscsc GGCUUCUAAUGCUUCAGAUAGAA 1338
表 2B. 未經例示性人類 MYOC siRNA 修飾之單股及雙螺旋體序列第1欄指示雙螺旋體名稱；雙螺旋體名稱中之十進制小數點之後的數字僅指生產批號。第2欄指示有義序列名稱。第3欄指示第4欄之序列的序列ID。第4欄提供適用於本文所述之雙螺旋體之有義股的未修飾序列。第5欄提供第4欄之有義股之目標mRNA (NM_000261.2)中的位置。第6欄指示反義序列名稱。第7欄指示第8欄之序列的序列ID。第8欄提供適用於本文所述之雙螺旋體的反義股序列，其未指定化學修飾。第9欄指示與第8欄之反義股互補之目標mRNA (NM_000261.2)中的位置。
雙螺旋體名稱 有義序列名稱 Seq ID NO: (有義) 有義序列(5'-3') NM_000261.2中的mRNA目標範圍 反義序列名稱 Seq ID NO: (反義) 反義序列(5'-3') NM_000261.2中的mRNA目標範圍
AD-1565444.1 A-2893965.1 1339 CUCUCAGCACAGCAGAGCUUA 29-49 A-2893966.1 1783 UAAGCTCUGCUGUGCUGAGAGGU 27-49
AD-1565445.1 A-2893965.1 1340 CUCUCAGCACAGCAGAGCUUA 29-49 A-2893967.1 1784 UAAGCTCTGCUGUGCUGAGAGGU 27-49
AD-1565692.1 A-2893965.1 1341 CUCUCAGCACAGCAGAGCUUA 29-49 A-2894431.1 1785 UAAGCUCUGCUGUGCUGAGAGGU 27-49
AD-1565446.1 A-2893968.1 1342 UCUCAGCACAGCAGAGCUUUA 30-50 A-2893969.1 1786 UAAAGCTCUGCUGUGCUGAGAGG 28-50
AD-1565447.1 A-2893970.1 1343 CAGCAGAGCUUUCCAGAGGAA 38-58 A-2893971.1 1787 UUCCTCTGGAAAGCUCUGCUGUG 36-58
AD-1565448.1 A-2893972.1 1344 AAUGAGGUUCUUCUGUGCACA 77-97 A-2893973.1 1788 UGUGCACAGAAGAACCUCAUUGC 75-97
AD-1565693.1 A-2893972.1 1345 AAUGAGGUUCUUCUGUGCACA 77-97 A-2894432.1 1789 UGUGCACAGAAGAACCUCAUUGC 75-97
AD-1565449.1 A-2893974.1 1346 AUGAGGUUCUUCUGUGCACGA 78-98 A-2893975.1 1790 UCGUGCACAGAAGAACCUCAUUG 76-98
AD-1565450.1 A-2893976.1 1347 UGAGGUUCUUCUGUGCACGUA 79-99 A-2893977.1 1791 UACGUGCACAGAAGAACCUCAUU 77-99
AD-1565694.1 A-2893976.1 1348 UGAGGUUCUUCUGUGCACGUA 79-99 A-2894433.1 1792 UACGTGCACAGAAGAACCUCAUU 77-99
AD-1565695.1 A-2894434.1 1349 GAGGUUCUUCUGUGCACGUUA 80-100 A-2894435.1 1793 UAACGUGCACAGAAGAACCUCAU 78-100
AD-1193175.5 A-2058874.1 1350 AGGUUCUUCUGUGCACGUUGA 81-101 A-1801665.1 1794 UCAACGUGCACAGAAGAACCUCA 79-101
AD-1565793.1 A-2893978.1 1351 AGGUUCUUCUGUGCACGUUGA 81-101 A-2894582.1 1795 UCAACGTGCACAGAAGAACCUCG 79-101
AD-1565795.1 A-2058874.1 1352 AGGUUCUUCUGUGCACGUUGA 81-101 A-2894585.1 1796 UCAACGTGCACAGAAGAACCUCG 79-101
AD-1565796.1 A-2058874.1 1353 AGGUUCUUCUGUGCACGUUGA 81-101 A-2894586.1 1797 UCAACGTGCACAGAAGAACCUCG 79-101
AD-1565797.1 A-2894587.1 1354 AGGUACUUCUGUGCACGUUGA 81-101 A-2894588.1 1798 UCAACGTGCACAGAAGUACCUCG 79-101
AD-1565798.1 A-2894589.1 1355 AGGAUCUUCUGUGCACGUUGA 81-101 A-2894590.1 1799 UCAACGTGCACAGAAGAUCCUCG 79-101
AD-1565799.1 A-2894591.1 1356 AGCUUCUUCUGUGCACGUUGA 81-101 A-2894592.1 1800 UCAACGTGCACAGAAGAAGCUCG 79-101
AD-1565451.1 A-2893978.1 1357 AGGUUCUUCUGUGCACGUUGA 81-101 A-2893979.1 1801 UCAACGTGCACAGAAGAACCUCA 79-101
AD-1565452.1 A-2893980.1 1358 GGUUCUUCUGUGCACGUUGCA 82-102 A-2893981.1 1802 UGCAACGUGCACAGAAGAACCUC 80-102
AD-1565696.1 A-2894436.1 1359 GGUUCUUCUGUGCACGUUGCA 82-102 A-2894437.1 1803 UGCAACGUGCACAGAAGAACCUC 80-102
AD-1565794.1 A-2894583.1 1360 GUUCUUCUGUGCACGUUGA 83-101 A-2894584.1 1804 UCAACGTGCACAGAAGAACCU 81-101
AD-1565453.1 A-2893982.1 1361 GUUCUUCUGUGCACGUUGCUA 83-103 A-2893983.1 1805 UAGCAACGUGCACAGAAGAACCU 81-103
AD-1565454.1 A-2893984.1 1362 UUCUUCUGUGCACGUUGCUGA 84-104 A-2893985.1 1806 UCAGCAACGUGCACAGAAGAACC 82-104
AD-1565455.1 A-2893986.1 1363 UCUUCUGUGCACGUUGCUGCA 85-105 A-2893987.1 1807 UGCAGCAACGUGCACAGAAGAAC 83-105
AD-1565456.1 A-2893988.1 1364 UCUUCUGUGCACGUUGCUGCA 85-105 A-2893989.1 1808 UGCAGCAACGUGCACAGAAGAAC 83-105
AD-1565457.1 A-2893990.1 1365 CUUCUGUGCACGUUGCUGCAA 86-106 A-2893991.1 1809 UUGCAGCAACGUGCACAGAAGAA 84-106
AD-1565697.1 A-2893990.1 1366 CUUCUGUGCACGUUGCUGCAA 86-106 A-2894438.1 1810 UUGCAGCAACGUGCACAGAAGAA 84-106
AD-1565698.1 A-2894439.1 1367 UUCUGUGCACGUUGCUGCAGA 87-107 A-2894440.1 1811 UCUGCAGCAACGUGCACAGAAGA 85-107
AD-1565458.1 A-2893992.1 1368 UCUGUGCACGUUGCUGCAGCA 88-108 A-2893993.1 1812 UGCUGCAGCAACGUGCACAGAAG 86-108
AD-1565459.1 A-2893994.1 1369 CUGUGCACGUUGCUGCAGCUA 89-109 A-2893995.1 1813 UAGCUGCAGCAACGUGCACAGAA 87-109
AD-1565699.1 A-2893994.1 1370 CUGUGCACGUUGCUGCAGCUA 89-109 A-2894441.1 1814 UAGCTGCAGCAACGUGCACAGAA 87-109
AD-1565700.1 A-2894442.1 1371 UGUGCACGUUGCUGCAGCUUA 90-110 A-2894443.1 1815 UAAGCUGCAGCAACGUGCACAGA 88-110
AD-1565460.1 A-2893996.1 1372 GUGCACGUUGCUGCAGCUUUA 91-111 A-2893997.1 1816 UAAAGCTGCAGCAACGUGCACAG 89-111
AD-1565461.1 A-2893998.1 1373 GCACGUUGCUGCAGCUUUGGA 93-113 A-2893999.1 1817 UCCAAAGCUGCAGCAACGUGCAC 91-113
AD-1565462.1 A-2894000.1 1374 CACGUUGCUGCAGCUUUGGGA 94-114 A-2894001.1 1818 UCCCAAAGCUGCAGCAACGUGCA 92-114
AD-1565701.1 A-2894444.1 1375 GAGAUGCCAGCUGUCCAGCUA 117-137 A-2894445.1 1819 UAGCTGGACAGCUGGCAUCUCAG 115-137
AD-1565463.1 A-2894002.1 1376 GAUGCCAGCUGUCCAGCUGCA 119-139 A-2894003.1 1820 UGCAGCTGGACAGCUGGCAUCUC 117-139
AD-1565464.1 A-2894004.1 1377 CUGUCCAGCUGCUGCUUCUGA 127-147 A-2894005.1 1821 UCAGAAGCAGCAGCUGGACAGCU 125-147
AD-1565465.1 A-2894006.1 1378 CCAGCUGCUGCUUCUGGCCUA 131-151 A-2894007.1 1822 UAGGCCAGAAGCAGCAGCUGGAC 129-151
AD-1565466.1 A-2894008.1 1379 CUGGCCUGCCUGGUGUGGGAA 144-164 A-2894009.1 1823 UUCCCACACCAGGCAGGCCAGAA 142-164
AD-1565467.1 A-2894008.1 1380 CUGGCCUGCCUGGUGUGGGAA 144-164 A-2894010.1 1824 UUCCCACACCAGGCAGGCCAGAA 142-164
AD-1565702.1 A-2894008.1 1381 CUGGCCUGCCUGGUGUGGGAA 144-164 A-2894446.1 1825 UUCCCACACCAGGCAGGCCAGAA 142-164
AD-1565468.1 A-2894011.1 1382 UGGCCUGCCUGGUGUGGGAUA 145-165 A-2894012.1 1826 UAUCCCACACCAGGCAGGCCAGA 143-165
AD-1565469.1 A-2894013.1 1383 GCCUGCCUGGUGUGUGAUGUA 147-167 A-2894014.1 1827 UACATCACACACCAGGCAGGCCA 145-167
AD-1565703.1 A-2894447.1 1384 GCCUGCCUGGUGUGGGAUGUA 147-167 A-2894448.1 1828 UACATCCCACACCAGGCAGGCCA 145-167
AD-1565704.1 A-2894449.1 1385 AGAGUGGCCGAUGCCAGUAUA 205-225 A-2894450.1 1829 UAUACUGGCAUCGGCCACUCUGG 203-225
AD-1565705.1 A-2894451.1 1386 AGUGUGGCCAGUCCCAAUGAA 231-251 A-2894452.1 1830 UUCATUGGGACUGGCCACACUGA 229-251
AD-1565470.1 A-2894015.1 1387 GUGUGGCCAGUCCCAAUGAAA 232-252 A-2894016.1 1831 UUUCAUTGGGACUGGCCACACUG 230-252
AD-1565471.1 A-2894015.1 1388 GUGUGGCCAGUCCCAAUGAAA 232-252 A-2894017.1 1832 UTUCAUTGGGACUGGCCACACUG 230-252
AD-1565472.1 A-2894018.1 1389 GCCAGGCCAUGUCAGUCAUCA 271-291 A-2894019.1 1833 UGATGACUGACAUGGCCUGGCUC 269-291
AD-1565473.1 A-2894018.1 1390 GCCAGGCCAUGUCAGUCAUCA 271-291 A-2894020.1 1834 UGAUGACTGACAUGGCCUGGCUC 269-291
AD-1565706.1 A-2894018.1 1391 GCCAGGCCAUGUCAGUCAUCA 271-291 A-2894453.1 1835 UGAUGACUGACAUGGCCUGGCUC 269-291
AD-1565474.1 A-2894021.1 1392 GGCCAUGUCAGUCAUCCAUAA 275-295 A-2894022.1 1836 UUAUGGAUGACUGACAUGGCCUG 273-295
AD-1565707.1 A-2894454.1 1393 GACCUGGAGGCCACCAAAGCA 327-347 A-2894455.1 1837 UGCUTUGGUGGCCUCCAGGUCUA 325-347
AD-1565475.1 A-2894023.1 1394 CUGGAGGCCACCAAAGCUCGA 330-350 A-2894024.1 1838 UCGAGCTUUGGUGGCCUCCAGGU 328-350
AD-1565476.1 A-2894025.1 1395 GAAACCCAAACCAGAGAGUUA 471-491 A-2894026.1 1839 UAACTCTCUGGUUUGGGUUUCCA 469-491
AD-1565477.1 A-2894027.1 1396 CAGCAACCUCCUCCGAGACAA 503-523 A-2894028.1 1840 UUGTCTCGGAGGAGGUUGCUGUA 501-523
AD-1565708.1 A-2894027.1 1397 CAGCAACCUCCUCCGAGACAA 503-523 A-2894456.1 1841 UUGUCUCGGAGGAGGUUGCUGUA 501-523
AD-1565478.1 A-2894029.1 1398 GCAACCUCCUCCGAGACAAGA 505-525 A-2894030.1 1842 UCUTGTCUCGGAGGAGGUUGCUG 503-525
AD-1565479.1 A-2894029.1 1399 GCAACCUCCUCCGAGACAAGA 505-525 A-2894031.1 1843 UCUUGTCTCGGAGGAGGUUGCUG 503-525
AD-1565709.1 A-2894029.1 1400 GCAACCUCCUCCGAGACAAGA 505-525 A-2894457.1 1844 UCUUGUCUCGGAGGAGGUUGCUG 503-525
AD-1565480.1 A-2894032.1 1401 AGACAAGUCAGUUCUGGAGGA 518-538 A-2894033.1 1845 UCCUCCAGAACTGACUUGUCUCG 516-538
AD-1565481.1 A-2894034.1 1402 CAAGUCAGUUCUGGAGGAAGA 521-541 A-2894035.1 1846 UCUUCCTCCAGAACUGACUUGUC 519-541
AD-1565482.1 A-2894036.1 1403 GUCAGUUCUGGAGGAAGAGAA 524-544 A-2894037.1 1847 UUCUCUTCCUCCAGAACUGACUU 522-544
AD-1565483.1 A-2894038.1 1404 AGAAUCUGGCCAGGAGGUUGA 568-588 A-2894039.1 1848 UCAACCTCCUGGCCAGAUUCUCA 566-588
AD-1565484.1 A-2894040.1 1405 UGGCCAGGAGGUUGGAAAGCA 574-594 A-2894041.1 1849 UGCTUTCCAACCUCCUGGCCAGA 572-594
AD-1565710.1 A-2894040.1 1406 UGGCCAGGAGGUUGGAAAGCA 574-594 A-2894458.1 1850 UGCUTUCCAACCUCCUGGCCAGA 572-594
AD-1565711.1 A-2894459.1 1407 CAGCCAGGAGGUAGCAAGGCA 596-616 A-2894460.1 1851 UGCCTUGCUACCUCCUGGCUGCU 594-616
AD-1565485.1 A-2894042.1 1408 UGCCACCAGGCUCCAGAGAAA 661-681 A-2894043.1 1852 UUUCTCTGGAGCCUGGUGGCACA 659-681
AD-1565486.1 A-2894044.1 1409 AAUUUGGACACUUUGGCCUUA 693-713 A-2894045.1 1853 UAAGGCCAAAGUGUCCAAAUUCC 691-713
AD-1565712.1 A-2894044.1 1410 AAUUUGGACACUUUGGCCUUA 693-713 A-2894461.1 1854 UAAGGCCAAAGUGUCCAAAUUCC 691-713
AD-1565713.1 A-2894462.1 1411 ACACUUUGGCCUUCCAGGAAA 700-720 A-2894463.1 1855 UUUCCUGGAAGGCCAAAGUGUCC 698-720
AD-1565487.1 A-2894046.1 1412 CUUUGGCCUUCCAGGAACUGA 703-723 A-2894047.1 1856 UCAGTUCCUGGAAGGCCAAAGUG 701-723
AD-1565714.1 A-2894048.1 1413 AGGAACUGAAGUCCGAGCUAA 715-735 A-2894464.1 1857 UUAGCUCGGACUUCAGUUCCUGG 713-735
AD-1565488.1 A-2894048.1 1414 AGGAACUGAAGUCCGAGCUAA 715-735 A-2894049.1 1858 UUAGCTCGGACUUCAGUUCCUGG 713-735
AD-1565715.1 A-2894465.1 1415 GAAGUCCGAGCUAACUGAAGA 722-742 A-2894466.1 1859 UCUUCAGUUAGCUCGGACUUCAG 720-742
AD-1565716.1 A-2894467.1 1416 GCUAACUGAAGUUCCUGCUUA 731-751 A-2894468.1 1860 UAAGCAGGAACUUCAGUUAGCUC 729-751
AD-1565489.1 A-2894050.1 1417 CUAACUGAAGUUCCUGCUUCA 732-752 A-2894051.1 1861 UGAAGCAGGAACUUCAGUUAGCU 730-752
AD-1565717.1 A-2894469.1 1418 GAAGUUCCUGCUUCCCGAAUA 738-758 A-2894470.1 1862 UAUUCGGGAAGCAGGAACUUCAG 736-758
AD-1565718.1 A-2894052.1 1419 GAGAACUAGUUUGGGUAGGAA 814-834 A-2894471.1 1863 UUCCTACCCAAACUAGUUCUCCA 812-834
AD-1565490.1 A-2894052.1 1420 GAGAACUAGUUUGGGUAGGAA 814-834 A-2894053.1 1864 UUCCUACCCAAACUAGUUCUCCA 812-834
AD-1565719.1 A-2894054.1 1421 ACUAGUUUGGGUAGGAGAGCA 818-838 A-2894472.1 1865 UGCUCUCCUACCCAAACUAGUUC 816-838
AD-1565491.1 A-2894054.1 1422 ACUAGUUUGGGUAGGAGAGCA 818-838 A-2894055.1 1866 UGCTCTCUACCCAAACUAGUUC 816-837
AD-1565720.1 A-2894473.1 1423 GGGUAGGAGAGCCUCUCACGA 826-846 A-2894474.1 1867 UCGUGAGAGGCUCUCCUACCCAA 824-846
AD-1565721.1 A-2894475.1 1424 GUAGGAGAGCCUCUCACGCUA 828-848 A-2894476.1 1868 UAGCGUGAGAGGCUCUCCUACCC 826-848
AD-1565492.1 A-2894056.1 1425 GUAGGAGAGCCUCUCACGCUA 828-848 A-2894057.1 1869 UAGCGUGAGAGGCUCUCCUACCC 826-848
AD-1565493.1 A-2894058.1 1426 UAGGAGAGCCUCUCACGCUGA 829-849 A-2894059.1 1870 UCAGCGTGAGAGGCUCUCCUACC 827-849
AD-1565722.1 A-2894477.1 1427 AGGAGAGCCUCUCACGCUGAA 830-850 A-2894478.1 1871 UUCAGCGUGAGAGGCUCUCCUAC 828-850
AD-1565723.1 A-2894060.1 1428 GCCUCUCACGCUGAGAACAGA 836-856 A-2894479.1 1872 UCUGTUCUCAGCGUGAGAGGCUC 834-856
AD-1565494.1 A-2894060.1 1429 GCCUCUCACGCUGAGAACAGA 836-856 A-2894061.1 1873 UCUGUTCUCAGCGUGAGAGGCUC 834-856
AD-1565495.1 A-2894060.1 1430 GCCUCUCACGCUGAGAACAGA 836-856 A-2894062.1 1874 UCUGUTCTCAGCGUGAGAGGCUC 834-856
AD-1565724.1 A-2894480.1 1431 CACGCUGAGAACAGCAGAAAA 842-862 A-2894481.1 1875 UUUUCUGCUGUUCUCAGCGUGAG 840-862
AD-1565496.1 A-2894063.1 1432 ACGCUGAGAACAGCAGAAACA 843-863 A-2894064.1 1876 UGUUTCTGCUGUUCUCAGCGUGA 841-863
AD-1565725.1 A-2894065.1 1433 CGCUGAGAACAGCAGAAACAA 844-864 A-2894482.1 1877 UUGUTUCUGCUGUUCUCAGCGUG 842-864
AD-1565497.1 A-2894065.1 1434 CGCUGAGAACAGCAGAAACAA 844-864 A-2894066.1 1878 UUGTUTCUGCUGUUCUCAGCGUG 842-864
AD-1565498.1 A-2894067.1 1435 GCUGAGAACAGCAGAAACAAA 845-865 A-2894068.1 1879 UUUGTUTCUGCUGUUCUCAGCGU 843-865
AD-1565499.1 A-2894069.1 1436 CUGAGAACAGCAGAAACAAUA 846-866 A-2894070.1 1880 UAUUGUTUCUGCUGUUCUCAGCG 844-866
AD-1565500.1 A-2894071.1 1437 UGAGAACAGCAGAAACAAUUA 847-867 A-2894072.1 1881 UAAUTGTUUCUGCUGUUCUCAGC 845-867
AD-1565726.1 A-2894483.1 1438 GAGAACAGCAGAAACAAUUAA 848-868 A-2894484.1 1882 UUAATUGUUUCUGCUGUUCUCAG 846-868
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AD-1565502.1 A-2894075.1 1440 AGAACAGCAGAAACAAUUACA 849-869 A-2894076.1 1884 UGUAAUTGUUUCUGCUGUUCUCA 847-869
AD-1565503.1 A-2894077.1 1441 GAACAGCAGAAACAAUUACUA 850-870 A-2894078.1 1885 UAGUAATUGUUTCUGCUGUUCUC 848-870
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AD-1565802.1 A-1991726.1 1443 AACAGCAGAAACAAUUACUGA 851-871 A-2894596.1 1887 UCAGTAAUUGUUUCUGCUGUUCU 849-871
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AD-1565805.1 A-2894601.1 1446 AAGAGCAGAAACAAUUACUGA 851-871 A-2894602.1 1890 UCAGTAAUUGUTUCUGCUCUUCU 849-871
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AD-1565504.2 A-2894079.1 1449 AACAGCAGAAACAAUUACUGA 851-871 A-2894080.1 1893 UCAGTAAUUGUTUCUGCUGUUCU 849-871
AD-1565505.1 A-2894081.1 1450 ACAGCAGAAACAAUUACUGGA 852-872 A-2894082.1 1894 UCCAGUAAUUGTUUCUGCUGUUC 850-872
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AD-1565514.1 A-2894096.1 1464 GGCAAGUAUGGUGUGUGGAUA 870-890 A-2894098.1 1908 UAUCCACACACCAUACUUGCCAG 868-890
AD-1565732.1 A-2894099.1 1465 CAAGUAUGGUGUGUGGAUGCA 872-892 A-2894493.1 1909 UGCATCCACACACCAUACUUGCC 870-892
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AD-1565517.1 A-2894103.1 1469 AGUAUGACCUCAUCAGCCAGA 976-996 A-2894104.1 1913 UCUGGCTGAUGAGGUCAUACUCA 974-996
AD-1565734.1 A-2894105.1 1470 GUAUGACCUCAUCAGCCAGUA 977-997 A-2894496.1 1914 UACUGGCUGAUGAGGUCAUACUC 975-997
AD-1565518.1 A-2894105.1 1471 GUAUGACCUCAUCAGCCAGUA 977-997 A-2894106.1 1915 UACUGGCTGAUGAGGUCAUACUC 975-997
AD-1565735.1 A-2894497.1 1472 UAUGACCUCAUCAGCCAGUUA 978-998 A-2894498.1 1916 UAACTGGCUGAUGAGGUCAUACU 976-998
AD-1565736.1 A-2894499.1 1473 AUGACCUCAUCAGCCAGUUUA 979-999 A-2894500.1 1917 UAAACUGGCUGAUGAGGUCAUAC 977-999
AD-1565519.1 A-2894107.1 1474 UGACCUCAUCAGCCAGUUUAA 980-1000 A-2894108.1 1918 UUAAACTGGCUGAUGAGGUCAUA 978-1000
AD-1565520.1 A-2894109.1 1475 GACCUCAUCAGCCAGUUUAUA 981-1001 A-2894110.1 1919 UAUAAACUGGCTGAUGAGGUCAU 979-1001
AD-1565521.1 A-2894111.1 1476 ACCUCAUCAGCCAGUUUAUGA 982-1002 A-2894112.1 1920 UCAUAAACUGGCUGAUGAGGUCA 980-1002
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AD-1565522.1 A-2894113.1 1478 CCUCAUCAGCCAGUUUAUGCA 983-1003 A-2894114.1 1922 UGCATAAACUGGCUGAUGAGGUC 981-1003
AD-1565806.1 A-2298063.1 1479 CCUCAUCAGCCAGUUUAUGCA 983-1003 A-2894603.1 1923 UGCATAAACUGGCUGAUGAGGUC 981-1003
AD-1565807.1 A-2298063.1 1480 CCUCAUCAGCCAGUUUAUGCA 983-1003 A-2894604.1 1924 UGCATAAACUGGCUGAUGAGGUC 981-1003
AD-1565808.1 A-2894113.1 1481 CCUCAUCAGCCAGUUUAUGCA 983-1003 A-2894605.1 1925 UGCATAAACUGGCUGAUGAGGUC 981-1003
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AD-1565810.1 A-2894607.1 1483 CCUCAUCAGCCAGUUUAUGCA 983-1003 A-2894608.1 1927 UGCATAAACUGGCUGAUGAGGUC 981-1003
AD-1565812.1 A-2894611.1 1484 CCUCUUCAGCCAGUUUAUGCA 983-1003 A-2894612.1 1928 UGCATAAACUGGCUGAAGAGGUC 981-1003
AD-1565813.1 A-2894613.1 1485 CCUGAUCAGCCAGUUUAUGCA 983-1003 A-2894614.1 1929 UGCATAAACUGGCUGAUCAGGUC 981-1003
AD-1565814.1 A-2894615.1 1486 CCACAUCAGCCAGUUUAUGCA 983-1003 A-2894616.1 1930 UGCATAAACUGGCUGAUGUGGUC 981-1003
AD-1565522.2 A-2894113.1 1487 CCUCAUCAGCCAGUUUAUGCA 983-1003 A-2894114.1 1931 UGCATAAACUGGCUGAUGAGGUC 981-1003
AD-1565523.1 A-2894115.1 1488 CUCAUCAGCCAGUUUAUGCAA 984-1004 A-2894116.1 1932 UTGCAUAAACUGGCUGAUGAGGU 982-1004
AD-1565811.1 A-2894609.1 1489 UCAUCAGCCAGUUUAUGCA 985-1003 A-2894610.1 1933 UGCATAAACUGGCUGAUGAGG 983-1003
AD-1565524.1 A-2894117.1 1490 UCAUCAGCCAGUUUAUGCAGA 985-1005 A-2894118.1 1934 UCUGCATAAACUGGCUGAUGAGG 983-1005
AD-1565525.1 A-2894119.1 1491 UCAUCAGCCAGUUUAUGCAGA 985-1005 A-2894120.1 1935 UCUGCATAAACTGGCUGAUGAGG 983-1005
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AD-1565738.1 A-2894502.1 1495 UCAGCCAGUUUAUGCAGGGCA 988-1008 A-2894503.1 1939 UGCCCUGCAUAAACUGGCUGAUG 986-1008
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AD-1565584.1 A-2894229.1 1577 CUGUGGCACCUUGUACACCGA 1373-1393 A-2894230.1 2021 UCGGTGTACAAGGUGCCACAGAU 1371-1393
AD-1565756.1 A-2894231.1 1578 CUACCGUCAACUUUGCUUAUA 1417-1437 A-2894527.1 2022 UAUAAGCAAAGUUGACGGUAGCA 1415-1437
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AD-1565787.1 A-1577564.1 1749 CUUGCAUGUUACAUGGUUACA 1911-1931 A-2894573.1 2193 UGUAACCAUGUAACAUGCAAGAG 1909-1931
AD-1565675.1 A-1577564.1 1750 CUUGCAUGUUACAUGGUUACA 1911-1931 A-2894401.1 2194 UGUAACCAUGUAACAUGCAAGAG 1909-1931
AD-1565788.1 A-1577566.1 1751 UUGCAUGUUACAUGGUUACCA 1912-1932 A-2894574.1 2195 UGGUAACCAUGUAACAUGCAAGA 1910-1932
AD-1565676.1 A-1577566.1 1752 UUGCAUGUUACAUGGUUACCA 1912-1932 A-2894402.1 2196 UGGTAACCAUGUAACAUGCAAGA 1910-1932
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AD-1565678.1 A-2894405.1 1754 UGCAUGUUACAUGGUUACCAA 1913-1933 A-2894406.1 2198 UUGGTAACCAUGUAACAUGCAAG 1911-1933
AD-1565679.1 A-1577580.1 1755 GCAUGUUACAUGGUUACCACA 1914-1934 A-2894407.1 2199 UGUGGUAACCAUGUAACAUGCAA 1912-1934
AD-1565680.1 A-2894408.1 1756 GCAUGUUACAUGGUUACCACA 1914-1934 A-2894409.1 2200 UGUGGUAACCATGUAACAUGCAA 1912-1934
AD-1565681.1 A-2894410.1 1757 CAUGUUACAUGGUUACCACAA 1915-1935 A-2894411.1 2201 UUGUGGTAACCAUGUAACAUGCA 1913-1935
AD-1565789.1 A-2894575.1 1758 AUGUUACAUGGUUACCACAAA 1916-1936 A-2894576.1 2202 UUUGTGGUAACCAUGUAACAUGC 1914-1936
AD-1565790.1 A-2894577.1 1759 UGUUACAUGGUUACCACAAGA 1917-1937 A-2894578.1 2203 UCUUGUGGUAACCAUGUAACAUG 1915-1937
AD-1565682.1 A-2894412.1 1760 CUCCUCUGGCCAGCAUCGAAA 1976-1996 A-2894413.1 2204 UTUCGATGCUGGCCAGAGGAGCU 1974-1996
AD-1565791.1 A-2894579.1 1761 AUAUAAGUAAGAUGCAUUUAA 1995-2015 A-2894580.1 2205 UUAAAUGCAUCUUACUUAUAUUC 1993-2015
AD-1565683.1 A-2894414.1 1762 UAUAAGUAAGAUGCAUUUACA 1996-2016 A-2894415.1 2206 UGUAAATGCAUCUUACUUAUAUU 1994-2016
AD-1565684.1 A-2894416.1 1763 AUAAGUAAGAUGCAUUUACUA 1997-2017 A-2894417.1 2207 UAGUAAAUGCATCUUACUUAUAU 1995-2017
AD-1565685.1 A-2894418.1 1764 UAAGUAAGAUGCAUUUACUAA 1998-2018 A-2894419.1 2208 UTAGTAAAUGCAUCUUACUUAUA 1996-2018
AD-1565867.1 A-2894420.1 1765 AAGUAAGAUGCAUUUACUACA 1999-2019 A-1804926.1 2209 UGUAGUAAAUGCAUCUUACUUAU 1997-2019
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AD-1565688.1 A-2894424.1 1777 AGUAAGAUGCAUUUACUACAA 2000-2020 A-2894425.1 2221 UUGUAGTAAAUGCAUCUUACUUA 1998-2020
AD-1565877.1 A-2894707.1 1778 GUAAGAUGCAUUUACUACA 2001-2019 A-2894708.1 2222 UGUAGUAAAUGCAUCUUACUU 1999-2019
AD-1565689.1 A-2894426.1 1779 UUGGCUUCUAAUGCUUCAGAA 2021-2041 A-2894427.1 2223 UUCUGAAGCAUUAGAAGCCAACU 2019-2041
AD-1565792.1 A-2894428.1 1780 CUUCUAAUGCUUCAGAUAGAA 2025-2045 A-2894581.1 2224 UUCUAUCUGAAGCAUUAGAAGCC 2023-2045
AD-1565690.1 A-2894428.1 1781 CUUCUAAUGCUUCAGAUAGAA 2025-2045 A-2894429.1 2225 UUCTATCUGAAGCAUUAGAAGCC 2023-2045
AD-1565691.1 A-2894428.1 1782 CUUCUAAUGCUUCAGAUAGAA 2025-2045 A-2894430.1 2226 UUCUATCTGAAGCAUUAGAAGCC 2023-2045
實例 2. MYOC siRNA 之活體外篩選 實驗方法 細胞培養及轉染： 人類小梁網狀結構細胞 (HTMC) 細胞轉染
藉由向384孔盤中每孔5 µl siRNA雙螺旋體中添加每孔4.9 µl Opti-MEM加0.1 µl RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad CA.目錄號13778-150)(各siRNA雙螺旋體進行4次重複實驗)且在室溫培育15分鐘來轉染HTMC細胞(ATCC)。接著將含有約5×10 3個細胞之四十微升DMEM:F12培養基(ThermoFisher)添加至siRNA轉染混合物中。在RNA純化之前培育細胞24小時。在10 nM、1 nM及0.1 nM下進行實驗。
使用 DYNABEADS mRNA 分離套組進行的總 RNA 分離：
在BioTek-EL406平台上使用DYNABEADs (Invitrogen，目錄號61012)、使用自動化方案分離RNA。簡言之，將70 μl溶解/結合緩衝液及10 μl溶解緩衝液(含有3 μl磁性珠粒)添加至具有細胞的培養盤中。培養盤在室溫下、在電磁振盪器上培育10分鐘，且隨後捕捉磁性珠粒且移除上清液。珠粒結合的RNA隨後用150 μl洗滌緩衝液A洗滌2次且用洗滌緩衝液B洗滌一次。珠粒隨後用150 μl溶離緩衝液洗滌，再捕捉且移除上清液。
使用 ABI 高容量 cDNA 逆轉錄套組 (Applied Biosystems, Foster City, CA, 目錄號 4368813) 進行的 cDNA 合成 ：
每次反應向如上分離之RNA中添加十微升預混液，其含有1 μl 10X緩衝液、0.4 μl 25X dNTP、1 μl 10x隨機引子、0.5 μl逆轉錄酶、0.5 μl核糖核酸酶抑制劑及6.6 μl H2O。將培養盤密封，混合，且在電磁振盪器上、在室溫下培育10分鐘，隨後在37℃下培育2小時。
即時 PCR ：
在384孔盤(Roche目錄號04887301001)中，每孔添加2 µl cDNA及5 µl Lightcycler 480探針預混液(Roche目錄號04887301001)至0.5 µl人類GAPDH TaqMan探針(4326317E)及0.5 µl MYOC人類探針中。在LightCycler480即時PCR系統(Roche)中進行即時PCR。各雙螺旋體測試至少兩次且將資料相對於經非靶向對照siRNA轉染之細胞標準化。為了計算相對倍數變化，即時資料使用ΔΔCt方法分析且相對於用非靶向對照siRNA轉染之細胞進行之分析標準化。
結果
使用例示性人類MYOC siRNA對人類小梁網狀細胞(HTMC)進行多劑量篩選的結果顯示於表3中(對應於表2A中的siRNA)。多劑量實驗係在10 nM、1 nM及0.1 nM最終雙螺旋體濃度下進行且資料用相對於非靶向對照之剩餘訊息百分比表示。
當以10 nM濃度投與HTMC細胞時，在下表3所評價的例示性siRNA雙螺旋體中，174種達成≥90%的MYOC基因減弱，347種達成≥70%的MYOC基因減弱，392種達成≥50%的MYOC基因減弱，424種達成≥20%的MYOC基因減弱，且433種達成≥10%的MYOC基因減弱。
當以1 nM濃度投與HTMC細胞時，在下表3所評價的例示性siRNA雙螺旋體中，142種達成≥90%的MYOC基因減弱，341種達成≥70%的MYOC基因減弱，391種達成≥50%的MYOC基因減弱，424種達成≥20%的MYOC基因減弱，且431種達成≥10%的MYOC基因減弱。
當以0.1 nM濃度投與HTMC細胞時，在下表3所評價的例示性siRNA雙螺旋體中，57種達成≥90%的MYOC基因減弱，277種達成≥70%的MYOC基因減弱，361種達成≥50%的MYOC基因減弱，416種達成≥20%的MYOC基因減弱，且425種達成≥10%的MYOC基因減弱。
在下表3所評價的例示性siRNA雙螺旋體中，AD-1565448.1、AD-1193175.5、AD-1565798.1、AD-1565452.1、AD-1565453.1、AD-1565454.1、AD-1565456.1、AD-1565492.1、AD-1565493.1、AD-1565503.1、AD-1073418.5、AD-1565804.1、AD-1565806.1、AD-1244366.3、AD-1565589.1、AD-1565837.1、AD-1565624.1、AD-1565626.1對HTMC細胞中的MYOC顯示優良的基因減弱作用。 表 3. 使用一組例示性人類 MYOC siRNA 進行的內源 MYOC 活體外多劑量篩選(*雙螺旋體名稱中之十進制小數點之後的數字僅指生產批號)
雙螺旋體名稱 * 10 nM 1 nM 0.1 nM
剩餘訊息 % St. Dev. 剩餘訊息 % St. Dev. 剩餘訊息 % St. Dev.
AD-1565444.1 13.58 1.84 14.71 7.84 26.73 7.48
AD-1565445.1 10.87 6.23 13.16 4.98 25.60 5.38
AD-1565692.1 16.41 2.08 18.61 0.75 25.71 4.17
AD-1565446.1 14.37 7.51 6.94 1.71 14.17 3.72
AD-1565447.1 10.38 3.76 10.19 3.32 23.50 6.92
AD-1565448.1 9.24 5.79 4.13 2.66 5.97 2.52
AD-1565693.1 3.99 1.51 6.10 1.34 12.35 2.47
AD-1565449.1 7.20 2.64 3.83 1.28 7.08 3.96
AD-1565450.1 8.78 4.45 6.72 1.51 12.08 2.48
AD-1565694.1 4.18 2.71 9.79 5.26 8.35 1.68
AD-1565695.1 7.35 3.15 6.28 1.55 9.28 3.23
AD-1193175.5 2.63 0.72 2.84 1.11 9.95 4.58
AD-1565793.1 5.77 0.80 2.63 0.70 9.78 3.84
AD-1565795.1 3.59 2.06 6.15 1.52 8.48 3.62
AD-1565796.1 1.04 0.24 3.44 1.14 5.75 1.09
AD-1565797.1 2.72 0.83 3.58 2.60 8.08 3.77
AD-1565798.1 3.95 2.69 2.43 1.56 3.53 1.68
AD-1565799.1 4.64 3.39 3.82 0.78 4.90 2.65
AD-1565451.1 5.31 1.89 4.64 1.66 10.31 5.68
AD-1565452.1 6.08 2.03 7.09 1.62 7.98 5.26
AD-1565696.1 5.58 2.54 9.52 3.27 8.31 3.16
AD-1565794.1 6.22 1.99 4.53 2.58 6.90 3.64
AD-1565453.1 6.30 1.27 8.30 1.28 10.41 6.07
AD-1565454.1 19.20 4.92 6.07 1.17 9.34 1.31
AD-1565455.1 16.24 3.57 6.52 3.62 13.11 3.35
AD-1565456.1 10.95 4.22 4.41 1.79 9.13 3.28
AD-1565457.1 16.55 3.00 5.13 2.63 13.24 6.40
AD-1565697.1 6.35 1.94 9.23 3.77 10.72 0.63
AD-1565698.1 5.42 2.65 12.12 1.42 6.99 1.98
AD-1565458.1 11.01 3.72 4.33 2.88 11.84 3.86
AD-1565459.1 42.85 5.80 36.24 26.02 45.00 15.33
AD-1565699.1 8.28 2.74 10.34 4.26 18.07 7.91
AD-1565700.1 7.73 4.21 11.72 4.13 9.75 1.96
AD-1565460.1 8.30 1.22 8.69 2.89 12.07 3.01
AD-1565461.1 14.00 3.46 5.33 2.92 16.28 3.37
AD-1565462.1 21.75 3.70 20.28 2.83 31.62 4.90
AD-1565701.1 8.93 5.10 9.40 3.76 13.18 1.17
AD-1565463.1 71.43 19.78 76.54 8.03 82.89 9.94
AD-1565464.1 16.39 4.06 10.09 2.80 31.39 3.54
AD-1565465.1 20.94 5.18 12.50 2.79 45.66 3.05
AD-1565466.1 82.31 6.76 75.73 28.49 92.65 18.60
AD-1565467.1 102.55 23.01 84.98 22.44 116.91 27.98
AD-1565702.1 116.28 14.85 85.92 14.00 76.00 18.38
AD-1565468.1 121.69 34.80 86.60 5.71 79.45 23.26
AD-1565469.1 46.82 18.05 34.92 10.42 53.10 9.35
AD-1565703.1 40.06 8.59 41.08 11.27 50.91 16.81
AD-1565704.1 23.10 2.72 32.11 12.42 49.32 8.69
AD-1565705.1 20.82 4.90 14.51 3.79 54.80 11.30
AD-1565470.1 58.45 4.61 77.51 21.21 78.93 12.11
AD-1565471.1 8.36 2.25 14.98 3.23 29.42 6.67
AD-1565472.1 67.13 22.48 107.96 18.35 81.66 15.72
AD-1565473.1 17.14 6.70 12.35 2.42 52.91 13.13
AD-1565706.1 12.69 1.44 17.98 1.45 33.72 10.29
AD-1565474.1 7.35 1.92 11.57 0.74 12.54 0.65
AD-1565707.1 14.28 5.67 12.45 3.33 16.18 4.97
AD-1565475.1 104.91 17.03 92.52 25.04 68.96 7.03
AD-1565476.1 13.25 5.61 10.71 3.39 13.33 2.98
AD-1565477.1 20.62 5.16 21.71 6.04 39.44 2.72
AD-1565708.1 20.35 7.28 34.51 0.60 46.23 16.06
AD-1565478.1 113.51 34.51 84.19 13.48 93.61 8.41
AD-1565479.1 120.66 38.76 113.47 21.10 107.18 23.97
AD-1565709.1 96.03 16.16 82.56 20.98 34.55 10.86
AD-1565480.1 9.45 3.51 15.47 2.78 25.03 4.12
AD-1565481.1 11.63 2.84 8.17 1.49 24.18 8.77
AD-1565482.1 55.07 21.96 62.38 10.34 76.05 18.42
AD-1565483.1 42.47 1.01 32.88 6.07 40.92 10.70
AD-1565484.1 41.71 8.56 35.08 6.28 47.77 12.25
AD-1565710.1 14.95 7.13 25.67 5.90 22.93 2.01
AD-1565711.1 23.82 14.98 23.65 4.48 19.78 3.54
AD-1565485.1 25.24 2.83 19.83 6.64 25.74 2.78
AD-1565486.1 10.05 1.20 14.31 1.72 31.42 7.60
AD-1565712.1 5.20 2.02 19.24 6.00 20.42 4.82
AD-1565713.1 9.27 2.63 19.11 2.21 25.72 3.81
AD-1565487.1 46.68 5.49 28.42 4.77 77.47 6.44
AD-1565714.1 5.67 1.97 5.35 2.39 11.46 2.28
AD-1565488.1 9.36 2.02 11.25 2.36 20.20 1.78
AD-1565715.1 3.35 1.88 5.60 2.17 18.53 6.10
AD-1565716.1 3.87 1.95 8.41 5.17 10.69 3.07
AD-1565489.1 9.86 1.57 14.64 3.55 19.00 5.75
AD-1565717.1 3.41 0.66 2.37 0.59 12.97 3.81
AD-1565718.1 2.99 0.86 3.53 2.40 8.04 3.91
AD-1565490.1 24.04 8.60 11.67 1.80 31.96 10.18
AD-1565719.1 6.39 5.62 2.51 0.45 8.90 2.14
AD-1565491.1 88.01 24.84 75.92 22.03 84.59 11.40
AD-1565720.1 8.86 1.70 4.23 2.27 13.61 2.34
AD-1565721.1 2.67 0.90 4.76 0.47 12.89 4.11
AD-1565492.1 9.24 3.51 4.60 2.16 9.33 1.80
AD-1565493.1 5.01 2.24 6.54 2.52 25.69 11.06
AD-1565722.1 16.33 5.69 19.52 3.24 66.71 10.30
AD-1565723.1 4.09 1.77 10.11 5.93 10.33 2.92
AD-1565494.1 40.03 5.07 32.09 5.50 64.47 10.72
AD-1565495.1 9.19 5.03 12.26 3.30 29.55 9.26
AD-1565724.1 3.97 1.66 3.08 1.67 5.45 1.50
AD-1565496.1 10.35 2.39 20.15 3.54 23.78 8.91
AD-1565725.1 10.58 5.58 4.90 2.19 16.16 7.18
AD-1565497.1 12.46 5.89 10.46 3.87 16.17 5.75
AD-1565498.1 12.18 4.54 8.54 1.66 12.85 5.36
AD-1565499.1 28.70 6.47 25.63 9.41 33.18 6.95
AD-1565500.1 5.40 1.94 4.31 1.08 7.40 2.30
AD-1565726.1 4.06 1.69 2.85 0.29 9.86 5.60
AD-1565501.1 38.18 13.02 39.37 15.62 49.41 13.10
AD-1565502.1 10.38 6.35 10.28 5.46 32.08 11.21
AD-1565503.1 5.08 2.84 7.82 2.01 7.77 0.71
AD-1565801.1 18.47 3.93 10.99 7.48 22.01 4.67
AD-1565802.1 3.76 1.21 4.21 1.61 7.43 1.97
AD-1565803.1 7.26 4.22 7.65 1.94 12.10 3.11
AD-1565804.1 1.84 0.46 1.46 0.81 4.34 0.27
AD-1565805.1 1.81 1.74 1.62 1.12 7.02 3.33
AD-1073418.5 1.66 0.30 2.82 1.23 7.78 4.94
AD-1565504.1 3.08 1.15 3.44 1.47 7.77 2.53
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AD-1565605.1 114.63 37.42 90.22 23.73 51.30 6.16
AD-1565606.1 10.93 4.65 19.08 6.65 16.70 4.41
AD-1565764.1 4.24 0.65 4.49 2.04 5.61 2.08
AD-1565607.1 27.14 6.06 36.08 7.73 64.66 4.95
AD-1565608.1 14.35 6.24 31.28 7.21 44.69 9.15
AD-1565609.1 9.04 3.66 20.95 7.58 25.35 5.78
AD-1565766.1 7.96 1.91 9.92 1.72 19.25 1.48
AD-1565611.1 15.58 4.66 25.13 8.99 27.02 3.88
AD-1565767.1 7.79 5.06 13.20 3.78 14.68 3.73
AD-1565612.1 27.72 4.59 35.45 10.64 49.10 6.99
AD-1565613.1 32.54 7.98 63.94 9.99 64.04 15.15
AD-1565614.1 14.27 6.39 25.57 1.52 43.23 30.00
AD-1565768.1 4.44 1.76 5.23 1.23 14.17 5.16
AD-1565615.1 55.18 8.55 79.04 23.74 78.22 6.99
AD-1565616.1 15.40 4.47 35.68 7.48 51.99 10.44
AD-1565617.1 3.84 2.17 11.03 1.79 34.82 1.45
AD-1565769.1 5.91 3.78 3.71 0.60 6.10 2.19
AD-1565618.1 7.81 3.67 7.98 3.83 22.24 8.77
AD-1565770.1 17.14 1.76 14.94 0.31 51.38 16.55
AD-1565619.1 65.85 13.72 60.46 19.23 51.34 12.11
AD-1565620.1 4.02 3.39 4.75 3.11 18.39 8.53
AD-1565771.1 5.16 1.04 6.21 1.84 11.84 4.85
AD-1565621.1 83.75 17.64 64.18 12.51 110.01 8.38
AD-1565772.1 2.83 0.68 4.28 1.68 12.04 3.51
AD-1565836.1 3.31 1.54 6.47 2.88 13.20 3.79
AD-1565837.1 4.13 1.20 4.14 0.94 14.83 4.25
AD-1565838.1 6.38 1.77 5.75 2.18 15.94 4.66
AD-1565840.1 7.19 3.59 5.53 1.80 32.45 6.46
AD-1565841.1 4.72 1.31 8.47 2.00 18.97 8.19
AD-1565842.1 3.04 1.48 4.60 3.10 14.00 3.53
AD-822899.17 3.51 1.21 5.57 2.82 12.90 3.86
AD-1565772.2 2.85 0.87 4.95 1.83 13.34 9.42
AD-1565622.1 9.09 3.35 11.85 1.77 21.74 5.30
AD-1565843.1 9.58 4.09 8.54 1.89 15.97 7.50
AD-1565844.1 2.75 1.37 4.20 1.48 8.94 4.30
AD-1565845.1 27.92 5.48 26.58 6.38 57.51 9.61
AD-1565846.1 48.68 10.51 49.20 29.92 71.91 11.76
AD-1565848.1 94.29 22.52 111.68 12.87 111.38 29.52
AD-1565849.1 37.68 9.68 17.51 5.53 45.10 16.47
AD-1565850.1 57.87 9.01 36.20 10.32 63.68 16.98
AD-822926.4 7.22 4.66 4.35 1.48 17.62 7.83
AD-1565623.1 8.25 3.03 11.68 4.46 14.42 3.89
AD-1565839.1 6.07 2.22 5.99 5.16 11.18 3.84
AD-1565624.1 6.10 1.35 8.89 1.90 9.85 2.62
AD-1565847.1 9.04 3.53 6.91 2.93 38.22 4.27
AD-1565625.1 60.76 1.13 51.43 8.88 33.00 0.71
AD-1565626.1 8.87 3.65 8.36 3.19 9.48 1.76
AD-1565773.1 6.64 1.30 13.77 6.02 38.32 6.58
AD-1565627.1 7.68 2.90 8.60 2.57 9.19 3.34
AD-1565628.1 27.35 5.83 27.90 9.21 42.72 13.86
AD-1565629.1 12.25 4.89 42.80 12.64 37.72 0.21
AD-1565774.1 17.59 5.54 5.12 0.90 18.54 7.94
AD-1565630.1 12.95 1.09 29.20 7.37 36.41 6.87
AD-1565631.1 14.87 4.36 29.86 5.00 30.09 6.35
AD-1565775.1 12.20 0.98 10.60 2.86 11.61 3.39
AD-1565632.1 34.01 6.07 33.10 1.65 43.01 7.59
AD-1565776.1 59.47 10.06 46.53 13.29 76.25 10.64
AD-1565777.1 3.25 3.60 4.24 1.29 7.38 4.40
AD-1565634.1 19.64 6.63 24.71 9.68 12.30 3.61
AD-1565778.1 18.08 3.67 20.05 8.75 19.26 5.00
AD-1565635.1 24.90 4.36 27.27 3.30 17.01 6.09
AD-1565636.1 18.08 5.60 26.04 6.67 19.12 5.80
AD-1565637.1 24.19 7.75 22.69 7.34 22.00 7.85
AD-1565638.1 20.13 4.33 21.73 5.82 23.78 7.73
AD-1565639.1 19.98 6.07 17.46 5.27 17.52 4.96
AD-1565779.1 16.57 5.59 23.11 7.46 18.57 2.30
AD-1565640.1 24.23 7.16 24.86 4.78 22.95 5.65
AD-1565641.1 14.78 4.59 20.27 7.35 15.40 4.17
AD-1565642.1 22.92 7.06 27.36 1.86 22.58 4.00
AD-1565643.1 21.33 5.08 25.45 4.54 21.06 4.94
AD-1565644.1 21.50 4.66 28.68 4.46 21.57 3.60
AD-1565645.1 20.71 1.23 30.21 6.14 24.39 5.16
AD-1565646.1 25.16 2.74 21.62 2.13 26.27 4.91
AD-1565851.1 32.51 12.05 25.85 3.74 28.17 4.26
AD-1565852.1 23.35 2.52 24.85 2.61 25.45 1.40
AD-1565853.1 20.79 5.56 15.58 2.51 23.92 2.07
AD-1565854.1 21.35 2.18 16.74 4.57 37.31 10.98
AD-1565857.1 89.72 24.46 60.67 10.16 72.79 19.16
AD-1565858.1 32.39 5.99 20.22 3.18 34.87 11.29
AD-1565859.1 44.64 4.32 28.84 7.42 41.43 14.25
AD-1565647.1 33.50 6.27 23.93 7.48 20.42 3.95
AD-1565648.1 17.96 3.05 16.97 2.55 15.90 1.48
AD-1565855.1 24.15 5.54 18.07 0.61 37.07 7.91
AD-1565856.1 32.83 3.41 20.30 3.88 46.01 8.44
AD-1565649.1 21.70 5.38 31.01 4.14 14.39 2.35
AD-1565650.1 14.11 2.91 16.32 3.70 13.62 10.74
AD-1565651.1 15.70 3.79 23.56 8.66 14.00 4.41
AD-1565652.1 28.65 5.13 32.11 6.96 41.78 11.65
AD-1565653.1 18.91 3.29 22.20 8.89 16.74 4.17
AD-1565780.1 21.89 7.89 22.48 5.59 25.73 7.52
AD-1565654.1 28.76 5.80 27.06 9.35 36.78 10.64
AD-1565655.1 14.26 1.84 16.84 2.93 22.57 3.51
AD-1565781.1 22.73 5.86 23.64 7.88 26.26 4.73
AD-1565656.1 8.05 3.17 18.34 3.69 20.89 1.60
AD-1565657.1 37.82 7.32 34.46 4.71 46.82 15.41
AD-1565658.1 20.16 5.46 22.60 1.17 33.74 16.69
AD-1565659.1 21.80 5.01 32.48 6.03 27.19 5.57
AD-1565660.1 18.96 4.48 25.75 6.04 33.55 9.37
AD-1565782.1 19.49 5.05 13.48 3.51 23.54 5.97
AD-1565661.1 23.24 4.21 30.64 8.86 21.49 5.88
AD-1565662.1 22.44 1.52 29.91 6.54 23.11 6.46
AD-1565663.1 19.51 3.82 19.55 2.35 22.06 6.15
AD-1565664.1 20.84 2.90 14.97 3.73 16.29 4.16
AD-1565783.1 19.12 7.35 16.94 6.39 19.67 8.30
AD-1565665.1 17.64 0.62 29.45 9.88 29.19 7.74
AD-1565784.1 16.20 5.45 15.66 5.02 13.24 3.05
AD-1565666.1 17.38 4.44 22.81 7.48 24.53 5.40
AD-1565667.1 17.79 4.54 26.44 5.86 16.24 2.00
AD-1565785.1 18.10 7.14 10.86 5.66 17.76 6.07
AD-1565668.1 41.49 8.93 43.99 2.72 37.17 6.96
AD-1565669.1 24.91 3.24 25.11 4.53 14.49 3.34
AD-1565670.1 14.17 6.35 21.96 9.65 29.29 2.34
AD-1565860.1 12.24 3.88 14.80 4.75 36.53 4.17
AD-1565861.1 19.87 5.39 14.91 8.45 25.82 7.66
AD-1565862.1 16.77 5.82 23.11 4.79 28.52 8.22
AD-1565863.1 20.42 7.47 23.10 8.82 22.00 7.25
AD-1565864.1 23.64 12.69 17.75 5.07 21.37 4.31
AD-1565866.1 21.29 7.65 17.97 4.76 25.56 4.55
AD-1565670.2 20.00 4.48 19.21 5.61 15.66 2.61
AD-1565671.1 34.15 10.48 35.84 7.21 26.67 12.46
AD-1565865.1 22.15 7.26 22.19 5.76 29.14 5.04
AD-1565786.1 19.30 7.79 15.01 4.01 23.94 1.39
AD-1565672.1 18.40 4.74 28.01 8.90 16.08 3.92
AD-1565673.1 11.46 5.01 19.74 4.14 18.41 3.39
AD-1565674.1 22.27 7.50 26.45 5.36 22.47 7.98
AD-1565787.1 20.36 2.47 9.49 3.21 18.01 2.96
AD-1565675.1 28.40 5.05 34.29 3.63 29.59 10.48
AD-1565788.1 15.79 4.25 15.72 4.64 16.69 0.95
AD-1565676.1 22.39 5.86 24.17 3.94 28.08 5.73
AD-1565677.1 22.77 5.35 26.27 7.04 22.49 7.99
AD-1565678.1 14.89 2.15 17.14 5.83 19.52 5.04
AD-1565679.1 17.93 3.69 18.38 3.92 21.25 4.78
AD-1565680.1 16.07 3.75 20.49 2.95 19.02 1.58
AD-1565681.1 66.05 9.80 45.76 2.54 76.24 17.73
AD-1565789.1 17.89 6.69 17.09 1.75 15.21 4.11
AD-1565790.1 15.85 0.71 12.83 5.40 24.07 8.61
AD-1565682.1 28.99 9.62 28.53 6.54 34.55 13.61
AD-1565791.1 13.75 1.62 12.50 3.96 34.69 3.47
AD-1565683.1 33.85 9.82 28.85 2.71 27.77 9.17
AD-1565684.1 46.44 16.14 47.20 12.01 92.00 26.93
AD-1565685.1 44.46 12.33 36.23 5.10 58.69 23.40
AD-1565867.1 24.71 5.92 23.04 2.85 31.52 3.79
AD-1565868.1 33.54 8.52 31.27 12.38 37.03 4.99
AD-1565869.1 27.19 9.45 33.17 9.74 30.69 5.68
AD-1565870.1 22.23 4.78 21.55 2.08 29.63 9.89
AD-1565871.1 22.89 4.89 24.65 0.94 21.11 1.91
AD-1565872.1 28.60 9.58 27.43 10.76 23.01 5.72
AD-1565873.1 15.65 4.07 30.34 7.91 29.58 6.70
AD-1565874.1 77.37 12.83 106.84 16.49 58.43 2.43
AD-1565875.1 77.77 23.99 44.29 12.88 55.96 13.56
AD-1565876.1 114.72 42.05 55.55 13.12 52.88 7.61
AD-1565686.1 23.56 4.75 40.73 8.81 43.94 3.80
AD-1565687.1 23.34 1.87 21.53 3.56 22.50 4.26
AD-1565688.1 27.59 6.13 27.27 2.35 24.05 3.29
AD-1565877.1 21.23 2.76 37.13 7.45 45.66 6.89
AD-1565689.1 26.48 4.22 22.79 6.21 24.67 3.21
AD-1565792.1 10.48 2.13 8.23 1.24 21.07 8.93
AD-1565690.1 28.90 2.94 27.49 4.31 22.85 4.91
AD-1565691.1 30.69 8.84 33.68 2.31 34.86 6.66
實例 3. 在小鼠青光眼模型中驗證人類 MYOC siRNA
為了活體內測試人類MYOC siRNA，使用青光眼小鼠模型：包含含有Y437H突變之人類化 MYOC基因座的協同活化介體(SAM)小鼠(SAM-MYOC小鼠)。在此等小鼠中，可利用靶向 MYOC啟動子的SAM嚮導RNA (SAM gRNA)增強包含Y437H突變之人類化 MYOC的表現，從而引起眼內壓(IOP)提高。藉由使包含基因體整合之dCas9協同活化介體(SAM)系統組件(dCas9-VP64及MCP-p65-HSF1)作為一個由內源 Rosa26啟動子驅動之轉錄本(描述於US 2019/0284572及WO 2019/183123中，該等文獻各自以引用的方式併入本文中)的小鼠與包含含有Y437H突變之人類化 MYOC基因座的小鼠雜交來產生SAM-MYOC小鼠。在此等小鼠中，自起始密碼子至終止密碼子的小鼠 Myoc序列用相應的人類 MYOC序列置換。所插入之人類 MYOC序列包含Y437H突變，其為與IOP升高及青光眼發展相關之突變。編碼靶向 MYOC啟動子之SAM嚮導RNA的AAV2.Y3F或慢病毒注射使得角膜緣環(小梁網狀結構(TM)、虹膜及睫狀體(CB))中的人類化 MYOCY437H表現增加，且此與升高的IOP相關，從而驗證SAM-MYOC小鼠係IOP升高的適合MYOC疾病模型(資料未展示)。
測試靶向人類 MYOC的siRNA，以便確定其是否能降低經SAM gRNA處理之後之SAM小鼠中所觀測的高眼內壓(IOP)，該等SAM小鼠包含含有Y437H突變的人類化 MYOC基因座(SAM-MYOC小鼠)。實驗配置顯示於 圖 1A中。第0天經由前房內(IC)注射來投與SAM gRNA，且量測基線IOP。接著在之後五週期間量測IOP。第五週，經由玻璃體內(IVT)注射來投與MYOC siRNA AD-822899 (1 μL，15 μg劑量)，且在後續數週的多個時間點量測IOP。存在三個處理組：(1)未處理的對照小鼠；(2)經SAM-gRNA處理、經人類 MYOCsiRNA處理的小鼠；以及(3)經SAM-gRNA處理、經螢光素酶siRNA處理的小鼠。如 圖 1B中所示，人類 MYOCsiRNA使經SAM gRNA處理之SAM-MYOC小鼠中的IOP降低，siRNA注射之後D7開始使IOP逆轉且恢復至基線水準，而螢光素酶siRNA對IOP無影響。
接著以較低劑量測試靶向人類 MYOC的若干其他siRNA，以便確定其是否能降低經慢病毒SAM gRNA處理之後之SAM-MYOC小鼠中所觀測的IOP。向小鼠兩側注射SAM gRNA及siRNA。實驗配置顯示於 圖 2A中。第0天經由前房內(IC)注射來投與SAM gRNA，且量測基線IOP。接著在之後五週期間量測IOP。第五週，經由玻璃體內(IVT)注射來投與MYOC siRNAs AD-822899、AD-1565804、AD-1565837、AD-1193175或AD-1565503 (1 μL，7.5 μg劑量)，且在後續數週的多個時間點量測IOP。藉由qPCR測試角膜緣環中的mRNA基因減弱，且進行RNASCOPE®分析。對照組包括未處理對照小鼠、經PBS處理的小鼠及經LV-SAM gRNA處理的小鼠。如 圖 2B中所示，各人類 MYOCsiRNA使經SAM gRNA處理之SAM-MYOC小鼠的IOP降低，在siRNA注射之後不久，使IOP逆轉且恢復至基線水準。如 圖 2C中所示，相對於LV-SAM-gRNA組，各人類 MYOCsiRNA減少人類 MYOCmRNA表現，以藉由對角膜緣環樣品進行qPCR所量測。RNASCOPE®分析證實，siRNA介導SAM-MYOC小鼠中之人類 MYOCmRNA基因減弱( 圖 2D)。
接著在甚至更低的劑量下測試人類 MYOCsiRNA AD-1565804或AD-1565837，以確定其是否能降低經慢病毒SAM-g4處理之後之SAM-MYOC小鼠中所觀測的IOP。向小鼠兩側注射SAM gRNA及siRNA。實驗配置顯示於 圖 3A中。第0天經由前房內(IC)注射來投與SAM-g4，且量測基線IOP。接著在之後五週期間量測IOP。第五週，經由玻璃體內(IVT)注射來投與MYOC siRNA AD-1565804或AD-1565837 (1 μL，3.75 μg劑量或1.87 μg劑量)，且在後續數週的多個時間點量測IOP。藉由qPCR測試角膜緣環中的mRNA基因減弱，且進行RNASCOPE®分析。對照組包括未處理對照小鼠、經PBS處理之小鼠及經LV-SAM-gRNA處理之小鼠。如 圖 3B中所示，各人類 MYOCsiRNA使經各種測試劑量之SAM gRNA處理之SAM-MYOC小鼠的IOP降低，在siRNA注射之後不久，使IOP逆轉且恢復至基線水準。如 圖 3C中所示，相對於LV-SAM gRNA組，各人類 MYOCsiRNA在各種測試劑量下減少人類 MYOCmRNA表現，以藉由對角膜緣環樣品進行qPCR所量測。
實例 4. 在非人類靈長類動物 (NHP) 青光眼模型中驗證人類 MYOC siRNA
測試靶向 MYOC的siRNA，以確定其是否能降低非人類靈長類動物(NHP)青光眼模型中所觀測的高眼內壓(IOP)。研究設計顯示於表4中。動物接受PBS對照物或各種劑量的雙螺旋體AD-1565837或雙螺旋體AD-1565804。
在研究前、第3天、第8天、第15天、第29天及第57天量測OE及眼內壓(IOP)，且第12週量測一次。在研究前、研究中(第6週)及終止(第12週)時進行視網膜電描記術(ERG)。在給藥前、第4週、第8週及終止時收集眼房液(AH)。終止時，自右眼收集以下眼樣品：AH、玻璃狀液(VH)、角膜、虹膜、小梁網狀結構(TM)、睫狀體(CB)、鞏膜(不含TM的角膜緣環)、視網膜及眼後段中的所有剩餘組織。給藥前及終止時收集血液兩次。對血液樣品進行血液學、凝血及臨床化學研究。
為了瞭解組織病理學，終止時收集組織，包括右眼、視神經及眼外及眼周組織：右腦(大腦半球)；近端食道；胃、食道-胃接合部；右上眼瞼與眼瞼結膜；右下眼瞼與眼瞼結膜；心尖；空腸；腎臟，右皮質；肝臟，右正中葉；右側淚腺；子宮頸深部，右淋巴結；下頜，右淋巴結；右坐骨神經；股直肌；隔膜肌；眼外肌(外直肌及內直肌，右側)；右側卵巢；右側下頜唾液腺；頸椎脊髓；胸部脊髓；腰椎脊髓；右側甲狀腺；舌；右側扁桃體；氣管；以及子宮。 表 4 ： NHP DC 選擇研究設計
群組 測試物 劑量水準 (µg/ 眼 ) 猴數目 總數
1 PBS 0 3 31
2 AD-1565837 10 3
3 30 3
4 100 3
5 300 3
6 1000* 2
7 AD-1565804 10 3
8 30 3
9 100 3
10 300 3
11 1000* 2
* 經最高劑量處理的動物：根據組織病理學讀數檢查雙眼。
第85天分析TM中的MYOC蛋白質基因減弱。基因減弱結果顯示於 圖 4中。在AD-1565837雙螺旋體存在下發現TM中的MYOC蛋白質出現約50%減少，而在AD-1565804雙螺旋體存在下觀測到最低程度的基因減弱。第-35天、第22天、第50天及第85天(終末收集)分析眼房液中的MYOC蛋白質。如 圖 5中所描繪，第50天、而非在第85天觀測到約50%的MYOC蛋白質基因減弱。第85天(終末收集)分析玻璃狀液、虹膜、睫狀體及鞏膜中的MYOC蛋白質基因減弱。玻璃狀液及睫狀體的結果顯示於 圖 6A中，且虹膜及鞏膜的結果顯示於 圖 6B中。第85天，對於所評價的雙螺旋體而言，未觀測到MYOC mRNA出現基因減弱( 圖 7)。
併入本說明書中且構成本說明書之一部分的附圖說明本發明之若干特徵。 專利或申請案文件含有至少一個彩製圖式。在申請且支付必要費用後，專利局將提供附有彩圖之此專利或專利申請公開案之複本。 圖 1A顯示用於測試人類 MYOCsiRNA AD-822899對SAM小鼠眼內壓(IOP)之影響的實驗配置，該等SAM小鼠包含含有Y437H突變的人類化 MYOC基因座(SAM-MYOC小鼠，對於各種對偶基因而言為同型接合的)且經AAV2.Y3F-SAM-g4處理。 圖 1B顯示經AAV2.Y3F-SAM-g4處理或未經任何物質處理(未處理)之SAM小鼠的眼內壓(IOP)，該等SAM小鼠包含含有Y437H突變的人類化 MYOC基因座(SAM-MYOC小鼠，對於各種對偶基因而言為同型接合的)，且經AAV2.Y3F-SAM-g4處理的小鼠隨後用人類 MYOCsiRNA或對照螢光素酶siRNA處理。 圖 2A顯示用於測試人類 MYOCsiRNA AD-822899、AD-1565804、AD-1565837、AD-1193175及AD-1565503對SAM小鼠眼內壓(IOP)之影響的實驗配置，該等SAM小鼠包含含有Y437H突變的人類化 MYOC基因座(SAM-MYOC小鼠，對於各種對偶基因而言為同型接合的)且經LV-SAM-g4處理。 圖 2B顯示經LV-SAM-g4或PBS處理之SAM小鼠的眼內壓(IOP)，該等SAM小鼠包含含有Y437H突變的人類化 MYOC基因座(SAM-MYOC小鼠，對於各種對偶基因而言為同型接合的)，且經LV-SAM-g4處理的小鼠隨後用人類 MYOCsiRNA AD-822899、AD-1565804、AD-1565837、AD-1193175或AD-1565503處理。 圖 2C顯示qPCR結果，該等qPCR結果顯示經LV-SAM-g4或PBS處理之SAM小鼠中的人類 MYOCmRNA表現相對於 Gapdh之百分比，該等SAM小鼠包含含有Y437H突變的人類化 MYOC基因座(SAM-MYOC小鼠，對於各種對偶基因而言為同型接合的)，且經LV-SAM-g4處理的小鼠隨後用人類 MYOCsiRNA AD-822899、AD-1565804、AD-1565837、AD-1193175或AD-1565503處理。 圖 2D顯示經LV-SAM-g4或PBS處理之SAM小鼠之眼中之人類 MYOCmRNA表現的RNASCOPE®分析，該等SAM小鼠包含含有Y437H突變的人類化 MYOC基因座(SAM-MYOC小鼠，對於各種對偶基因而言為同型接合的)，且經LV-SAM-g4處理的小鼠隨後用人類 MYOCsiRNA AD-1565804或AD-1565837處理。 圖 3A顯示用於測試人類 MYOCsiRNA AD-1565804或AD-1565837對SAM小鼠眼內壓(IOP)之影響的實驗配置，該等SAM小鼠包含含有Y437H突變的人類化 MYOC基因座(SAM-MYOC小鼠，對於各種對偶基因而言為同型接合的)且經LV-SAM-g4處理。 圖 3B顯示經LV-SAM-g4或PBS處理之SAM小鼠的眼內壓(IOP)，該等SAM小鼠包含含有Y437H突變的人類化 MYOC基因座(SAM-MYOC小鼠，對於各種對偶基因而言為同型接合的)，且經LV-SAM-g4處理的小鼠隨後用人類 MYOCsiRNA AD-1565804或AD-1565837處理。 圖 3C顯示qPCR結果，該等qPCR結果顯示經LV-SAM-g4或PBS處理之SAM小鼠中的人類 MYOCmRNA表現相對於 Gapdh之百分比，該等SAM小鼠包含含有Y437H突變的人類化 MYOC基因座(SAM-MYOC小鼠，對於各種對偶基因而言為同型接合的)，且經LV-SAM-g4處理的小鼠隨後用人類 MYOCsiRNA AD-1565804或AD-1565837處理。 圖 4顯示AD-1565837雙螺旋體或AD-1565804雙螺旋體給與非人類靈長類動物(NHP)模型之後的第85天，TM中之剩餘MYOC蛋白質相對於PBS的百分比。顯示兩種不同MYOC抗體R&D及Abnova是結果。 圖 5描繪AD-1565837雙螺旋體或AD-1565804雙螺旋體給與非人類靈長類動物(NHP)模型之後的第35、22、50及85天，眼房液中之剩餘MYOC蛋白質相對於給藥前的百分比。 圖 6A顯示AD-1565837雙螺旋體或AD-1565804雙螺旋體給與非人類靈長類動物(NHP)模型之後的第85天，玻璃狀液及睫狀體中之剩餘MYOC蛋白質相對於PBS的百分比。 圖 6B顯示AD-1565837雙螺旋體或AD-1565804雙螺旋體給與非人類靈長類動物(NHP)模型之後的第85天，虹膜及鞏膜中之剩餘MYOC蛋白質相對於PBS的百分比。 圖 7描繪AD-1565837雙螺旋體或AD-1565804雙螺旋體給與非人類靈長類動物(NHP)模型之後的第85天，眼房液中之剩餘MYOC mRNA相對於PBS的百分比。 本發明之各種實施例之細節闡述於以下實施方式中。本發明之其他特徵、目標及優勢將自描述及圖式及申請專利範圍而顯而易見。 

          <![CDATA[<110> 美商艾拉倫製藥公司(ALNYLAM PHARMACEUTICALS, INC.)]]>
          <![CDATA[<120> 用於靜默MYOC表現之組合物及方法]]>
          <![CDATA[<130> A108868 1490WO]]>
          <![CDATA[<140>]]>
          <![CDATA[<141>]]>
          <![CDATA[<150> 63/351,033]]>
          <![CDATA[<151> 2022-06-10]]>
          <![CDATA[<150> 63/287,404]]>
          <![CDATA[<151> 2021-12-08]]>
          <![CDATA[<150> 63/215,804]]>
          <![CDATA[<151> 2021-06-28]]>
          <![CDATA[<160> 2226  ]]>
          <![CDATA[<170> PatentIn version 3.5]]>
          <![CDATA[<210> 1]]>
          <![CDATA[<211> 2100]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 智人]]>
          <![CDATA[<400> 1]]>
          gagccagcaa ggccacccat ccaggcacct ctcagcacag cagagctttc cagaggaagc       60
          ctcaccaagc ctctgcaatg aggttcttct gtgcacgttg ctgcagcttt gggcctgaga      120
          tgccagctgt ccagctgctg cttctggcct gcctggtgtg ggatgtgggg gccaggacag      180
          ctcagctcag gaaggccaat gaccagagtg gccgatgcca gtataccttc agtgtggcca      240
          gtcccaatga atccagctgc ccagagcaga gccaggccat gtcagtcatc cataacttac      300
          agagagacag cagcacccaa cgcttagacc tggaggccac caaagctcga ctcagctccc      360
          tggagagcct cctccaccaa ttgaccttgg accaggctgc caggccccag gagacccagg      420
          aggggctgca gagggagctg ggcaccctga ggcgggagcg ggaccagctg gaaacccaaa      480
          ccagagagtt ggagactgcc tacagcaacc tcctccgaga caagtcagtt ctggaggaag      540
          agaagaagcg actaaggcaa gaaaatgaga atctggccag gaggttggaa agcagcagcc      600
          aggaggtagc aaggctgaga aggggccagt gtccccagac ccgagacact gctcgggctg      660
          tgccaccagg ctccagagaa gtttctacgt ggaatttgga cactttggcc ttccaggaac      720
          tgaagtccga gctaactgaa gttcctgctt cccgaatttt gaaggagagc ccatctggct      780
          atctcaggag tggagaggga gacaccggat gtggagaact agtttgggta ggagagcctc      840
          tcacgctgag aacagcagaa acaattactg gcaagtatgg tgtgtggatg cgagacccca      900
          agcccaccta cccctacacc caggagacca cgtggagaat cgacacagtt ggcacggatg      960
          tccgccaggt ttttgagtat gacctcatca gccagtttat gcagggctac ccttctaagg     1020
          ttcacatact gcctaggcca ctggaaagca cgggtgctgt ggtgtactcg gggagcctct     1080
          atttccaggg cgctgagtcc agaactgtca taagatatga gctgaatacc gagacagtga     1140
          aggctgagaa ggaaatccct ggagctggct accacggaca gttcccgtat tcttggggtg     1200
          gctacacgga cattgacttg gctgtggatg aagcaggcct ctgggtcatt tacagcaccg     1260
          atgaggccaa aggtgccatt gtcctctcca aactgaaccc agagaatctg gaactcgaac     1320
          aaacctggga gacaaacatc cgtaagcagt cagtcgccaa tgccttcatc atctgtggca     1380
          ccttgtacac cgtcagcagc tacacctcag cagatgctac cgtcaacttt gcttatgaca     1440
          caggcacagg tatcagcaag accctgacca tcccattcaa gaaccgctat aagtacagca     1500
          gcatgattga ctacaacccc ctggagaaga agctctttgc ctgggacaac ttgaacatgg     1560
          tcacttatga catcaagctc tccaagatgt gaaaagcctc caagctgtac aggcaatggc     1620
          agaaggagat gctcagggct cctgggggga gcaggctgaa gggagagcca gccagccagg     1680
          gcccaggcag ctttgactgc tttccaagtt ttcattaatc cagaaggatg aacatggtca     1740
          ccatctaact attcaggaat tgtagtctga gggcgtagac aatttcatat aataaatatc     1800
          ctttatcttc tgtcagcatt tatgggatgt ttaatgacat agttcaagtt ttcttgtgat     1860
          ttggggcaaa agctgtaagg cataatagtt tcttcctgaa aaccattgct cttgcatgtt     1920
          acatggttac cacaagccac aataaaaagc ataacttcta aaggaagcag aatagctcct     1980
          ctggccagca tcgaatataa gtaagatgca tttactacag ttggcttcta atgcttcaga     2040
          tagaatacag ttgggtctca cataaccctt tacattgtga aataaaattt tcttacccaa     2100
          <![CDATA[<210> 2]]>
          <![CDATA[<211> 2100]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 智人]]>
          <![CDATA[<400> 2]]>
          ttgggtaaga aaattttatt tcacaatgta aagggttatg tgagacccaa ctgtattcta       60
          tctgaagcat tagaagccaa ctgtagtaaa tgcatcttac ttatattcga tgctggccag      120
          aggagctatt ctgcttcctt tagaagttat gctttttatt gtggcttgtg gtaaccatgt      180
          aacatgcaag agcaatggtt ttcaggaaga aactattatg ccttacagct tttgccccaa      240
          atcacaagaa aacttgaact atgtcattaa acatcccata aatgctgaca gaagataaag      300
          gatatttatt atatgaaatt gtctacgccc tcagactaca attcctgaat agttagatgg      360
          tgaccatgtt catccttctg gattaatgaa aacttggaaa gcagtcaaag ctgcctgggc      420
          cctggctggc tggctctccc ttcagcctgc tccccccagg agccctgagc atctccttct      480
          gccattgcct gtacagcttg gaggcttttc acatcttgga gagcttgatg tcataagtga      540
          ccatgttcaa gttgtcccag gcaaagagct tcttctccag ggggttgtag tcaatcatgc      600
          tgctgtactt atagcggttc ttgaatggga tggtcagggt cttgctgata cctgtgcctg      660
          tgtcataagc aaagttgacg gtagcatctg ctgaggtgta gctgctgacg gtgtacaagg      720
          tgccacagat gatgaaggca ttggcgactg actgcttacg gatgtttgtc tcccaggttt      780
          gttcgagttc cagattctct gggttcagtt tggagaggac aatggcacct ttggcctcat      840
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          caccccaaga atacgggaac tgtccgtggt agccagctcc agggatttcc ttctcagcct      960
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          catccgtgcc aactgtgtcg attctccacg tggtctcctg ggtgtagggg taggtgggct     1200
          tggggtctcg catccacaca ccatacttgc cagtaattgt ttctgctgtt ctcagcgtga     1260
          gaggctctcc tacccaaact agttctccac atccggtgtc tccctctcca ctcctgagat     1320
          agccagatgg gctctccttc aaaattcggg aagcaggaac ttcagttagc tcggacttca     1380
          gttcctggaa ggccaaagtg tccaaattcc acgtagaaac ttctctggag cctggtggca     1440
          cagcccgagc agtgtctcgg gtctggggac actggcccct tctcagcctt gctacctcct     1500
          ggctgctgct ttccaacctc ctggccagat tctcattttc ttgccttagt cgcttcttct     1560
          cttcctccag aactgacttg tctcggagga ggttgctgta ggcagtctcc aactctctgg     1620
          tttgggtttc cagctggtcc cgctcccgcc tcagggtgcc cagctccctc tgcagcccct     1680
          cctgggtctc ctggggcctg gcagcctggt ccaaggtcaa ttggtggagg aggctctcca     1740
          gggagctgag tcgagctttg gtggcctcca ggtctaagcg ttgggtgctg ctgtctctct     1800
          gtaagttatg gatgactgac atggcctggc tctgctctgg gcagctggat tcattgggac     1860
          tggccacact gaaggtatac tggcatcggc cactctggtc attggccttc ctgagctgag     1920
          ctgtcctggc ccccacatcc cacaccaggc aggccagaag cagcagctgg acagctggca     1980
          tctcaggccc aaagctgcag caacgtgcac agaagaacct cattgcagag gcttggtgag     2040
          gcttcctctg gaaagctctg ctgtgctgag aggtgcctgg atgggtggcc ttgctggctc     2100
          <![CDATA[<210> 3]]>
          <![CDATA[<211> 16]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
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          <![CDATA[<400> 3]]>
          Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro 
          1               5                   10                  15      
          <![CDATA[<210> 4]]>
          <![CDATA[<211> 11]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 未知序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 未知序列之描述：RFGF類似物序列]]>
          <![CDATA[<400> 4]]>
          Ala Ala Leu Leu Pro Val Leu Leu Ala Ala Pro 
          1               5                   10      
          <![CDATA[<210> 5]]>
          <![CDATA[<211> 13]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人類免疫缺乏病毒]]>
          <![CDATA[<400> 5]]>
          Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln 
          1               5                   10              
          <![CDATA[<210> 6]]>
          <![CDATA[<211> 16]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 果蠅屬]]>
          <![CDATA[<400> 6]]>
          Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 
          1               5                   10                  15      
          <![CDATA[<210> 7]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 7]]>
          cucucagcac agcagagcuu a                                                 21
          <![CDATA[<210> 8]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 8]]>
          cucucagcac agcagagcuu a                                                 21
          <![CDATA[<210> 9]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 9]]>
          cucucagcac agcagagcuu a                                                 21
          <![CDATA[<210> 10]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 10]]>
          ucucagcaca gcagagcuuu a                                                 21
          <![CDATA[<210> 11]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 11]]>
          cagcagagcu uuccagagga a                                                 21
          <![CDATA[<210> 12]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 12]]>
          aaugagguuc uucugugcac a                                                 21
          <![CDATA[<210> 13]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 13]]>
          aaugagguuc uucugugcac a                                                 21
          <![CDATA[<210> 14]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 14]]>
          augagguucu ucugugcacg a                                                 21
          <![CDATA[<210> 15]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 15]]>
          ugagguucuu cugugcacgu a                                                 21
          <![CDATA[<210> 16]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 16]]>
          ugagguucuu cugugcacgu a                                                 21
          <![CDATA[<210> 17]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 17]]>
          gagguucuuc ugugcacguu a                                                 21
          <![CDATA[<210> 18]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 18]]>
          agguucuucu gugcacguug a                                                 21
          <![CDATA[<210> 19]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>]]> 人工序列之描述：合成寡核苷酸
          <![CDATA[<400> 19]]>
          agguucuucu gugcacguug a                                                 21
          <![CDATA[<210> 20]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 20]]>
          agguucuucu gugcacguug a                                                 21
          <![CDATA[<210> 21]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 21]]>
          agguucuucu gugcacguug a                                                 21
          <![CDATA[<210> 22]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 22]]>
          agguacuucu gugcacguug a                                                 21
          <![CDATA[<210> 23]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 23]]>
          aggaucuucu gugcacguug a                                                 21
          <![CDATA[<210> 24]]>
          <![CDATA[<211]]>> 21]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;212&gt; RNA]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;213&gt; 人工序列]]&gt;
          <br/>
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;220&gt;]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;223&gt; 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]&gt;
          <br/>
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;400&gt; 24]]&gt;
          <br/><![CDATA[agcuucuucu gugcacguug a                                                 21
          <![CDATA[<210> 25]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 25]]>
          agguucuucu gugcacguug a                                                 21
          <![CDATA[<210> 26]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 26]]>
          gguucuucug ugcacguugc a                                                 21
          <![CDATA[<210> 27]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 27]]>
          gguucuucug ugcacguugc a                                                 21
          <![CDATA[<210> 28]]>
          <![CDATA[<211> 19]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 28]]>
          guucuucugu gcacguuga                                                    19
          <![CDATA[<210> 29]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 29]]>
          guucuucugu gcacguugcu a                                                 21
          <![CDATA[<210> 30]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 30]]>
          uucuucugug cacguugcug a                                                 21
          <![CDATA[<210> 31]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 31]]>
          ucuucugugc acguugcugc a                                                 21
          <![CDATA[<210> 32]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 32]]>
          ucuucugugc acguugcugc a                                                 21
          <![CDATA[<210> 33]]>
          <![CDATA[<211> 2]]>1
          <![CDATA[<212> RNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 33]]>
          cuucugugca cguugcugca a                                                 21
          <![CDATA[<210> 34]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 34]]>
          cuucugugca cguugcugca a                                                 21
          <![CDATA[<210> 35]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 35]]>
          uucugugcac guugcugcag a                                                 21
          <![CDATA[<210> 36]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 36]]>
          ucugugcacg uugcugcagc a                                                 21
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          caagucaguu cuggaggaag a                                                 21
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          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
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          gucaguucug gaggaagaga a                                                 21
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          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
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          agaaucuggc caggagguug a                                                 21
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          uggccaggag guuggaaagc a                                                 21
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          uggccaggag guuggaaagc a                                                 21
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          cagccaggag guagcaaggc a                                                 21
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          ugccaccagg cuccagagaa a                                                 21
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          aauuuggaca cuuuggccuu a                                                 21
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          <![CDATA[<400> 78]]>
          aauuuggaca cuuuggccuu a                                                 21
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          acacuuuggc cuuccaggaa a                                                 21
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          <![CDATA[<400> 80]]>
          cuuuggccuu ccaggaacug a                                                 21
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          <![CDATA[<212> RNA]]>
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          <![CDATA[<400> 81]]>
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          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<211> 21]]>
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          <![CDATA[<400> 83]]>
          gaaguccgag cuaacugaag a                                                 21
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          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
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          <![CDATA[<400> 84]]>
          gcuaacugaa guuccugcuu a                                                 21
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          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400> 85]]>
          cuaacugaag uuccugcuuc a                                                 21
          <![CDATA[<210> 86]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
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          <![CDATA[<210> 87]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
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          gagaacuagu uuggguagga a                                                 21
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          <![CDATA[<400> 89]]>
          acuaguuugg guaggagagc a                                                 21
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          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
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          <![CDATA[<400> 90]]>
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          <![CDATA[<212> RNA]]>
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          ggguaggaga gccucucacg a                                                 21
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          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400> 92]]>
          guaggagagc cucucacgcu a                                                 21
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          aggagagccu cucacgcuga a                                                 21
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          <![CDATA[<400> 96]]>
          gccucucacg cugagaacag a                                                 21
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          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400> 97]]>
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          <![CDATA[<211> 21]]>
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          gccucucacg cugagaacag a                                                 21
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          <![CDATA[<211> 21]]>
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          <![CDATA[<400> 99]]>
          cacgcugaga acagcagaaa a                                                 21
          <![CDATA[<210> 100]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 100]]>
          acgcugagaa cagcagaaac a                                                 21
          <![CDATA[<210> 101]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 10]]>1
          cgcugagaac agcagaaaca a                                                 21
          <![CDATA[<210> 102]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 102]]>
          cgcugagaac agcagaaaca a                                                 21
          <![CDATA[<210> 103]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 103]]>
          gcugagaaca gcagaaacaa a                                                 21
          <![CDATA[<210> 104]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 104]]>
          cugagaacag cagaaacaau a                                                 21
          <![CDATA[<210> 105]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 105]]>
          ugagaacagc agaaacaauu a                                                 21
          <![CDATA[<210> 106]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
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          <![CDATA[<400> 106]]>
          gagaacagca gaaacaauua a                                                 21
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          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
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          <![CDATA[<400> 107]]>
          agaacagcag aaacaauuac a                                                 21
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          <![CDATA[<211> 21]]>
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          <![CDATA[<400> 108]]>
          agaacagcag aaacaauuac a                                                 21
          <![CDATA[<210> 109]]>
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          <![CDATA[<400> 109]]>
          gaacagcaga aacaauuacu a                                                 21
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          <![CDATA[<211> 21]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400> 110]]>
          aacagcagaa acaauuacug a                                                 21
          <![CDATA[<210> 111]]>
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          aacagcagaa acaauuacug a                                                 21
          <![CDATA[<210> 112]]>
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          aacaccagaa acaauuacug a                                                 21
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          <![CDATA[<400> 113]]>
          aacugcagaa acaauuacug a                                                 21
          <![CDATA[<210> 114]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
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          <![CDATA[<400> 114]]>
          aagagcagaa acaauuacug a                                                 21
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          aacagcagaa acaauuacug a                                                 21
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400> 117]]>
          aacagcagaa acaauuacug a                                                 21
          <![CDATA[<210> 118]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400> 118]]>
          acagcagaaa caauuacugg a                                                 21
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          <![CDATA[<211> 19]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
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          <![CDATA[<400> 119]]>
          cagcagaaac aauuacuga                                                    19
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          <![CDATA[<212> RNA]]>
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          cagcagaaac aauuacuggc a                                                 21
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          agcagaaaca auuacuggca a                                                 21
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          gcagaaacaa uuacuggcaa a                                                 21
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          <![CDATA[<400> 123]]>
          cagaaacaau uacuggcaag a                                                 21
          <![CDATA[<210> 124]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
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          <![CDATA[<400> 124]]>
          cagaaacaau uacuggcaag a                                                 21
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          <![CDATA[<400> 125]]>
          agaaacaauu acugucaagu a                                                 21
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          <![CDATA[<400> 126]]>
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          aaacaauuac uggcaaguau a                                                 21
          <![CDATA[<210> 128]]>
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          <![CDATA[<212> RNA]]>
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          <![CDATA[<400> 128]]>
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          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
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          ggcaaguaug guguguggau a                                                 21
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          <![CDATA[<212> RNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400> 131]]>
          ggcaaguaug guguguggau a                                                 21
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          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
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          <![CDATA[<400> 132]]>
          ggcaaguaug guguguggau a                                                 21
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          <br/>&lt;![CDATA[&lt;211&gt; 21]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;212&gt; RNA]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;213&gt; 人工序列]]&gt;
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          <br/>&lt;![CDATA[&lt;220&gt;]]&gt;
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          <br/>
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;400&gt; 133]]&gt;
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          ugaguaugac cucaucagcc a                                                 21
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          gaguaugacc ucaucagcca a                                                 21
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400> 137]]>
          aguaugaccu caucagccag a                                                 21
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          <![CDATA[<212> RNA]]>
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          guaugaccuc aucagccagu a                                                 21
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          <![CDATA[<400> 139]]>
          guaugaccuc aucagccagu a                                                 21
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          uaugaccuca ucagccaguu a                                                 21
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          augaccucau cagccaguuu a                                                 21
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          ugaccucauc agccaguuua a                                                 21
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          <![CDATA[<400> 143]]>
          gaccucauca gccaguuuau a                                                 21
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400> 144]]>
          accucaucag ccaguuuaug a                                                 21
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          ccucaucagc caguuuaugc a                                                 21
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          ccucaucagc caguuuaugc a                                                 21
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400> 149]]>
          ccucaucagc caguuuaugc a                                                 21
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          <![CDATA[<212> RNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 150]]>
          ccucaucagc caguuuaugc a                                                 21
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          <![CDATA[<220>]]>
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          ccucaucagc caguuuaugc a                                                 21
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400> 152]]>
          ccucuucagc caguuuaugc a                                                 21
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          ccugaucagc caguuuaugc a                                                 21
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          ccacaucagc caguuuaugc a                                                 21
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          ccucaucagc caguuuaugc a                                                 21
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          cucaucagcc aguuuaugca a                                                 21
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          <![CDATA[<400> 157]]>
          ucaucagcca guuuaugca                                                    19
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          <![CDATA[<220>]]>
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          ucaucagcca guuuaugcag a                                                 21
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400> 159]]>
          ucaucagcca guuuaugcag a                                                 21
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          caucagccag uuuaugcagg a                                                 21
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          <![CDATA[<220>]]>
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          aucagccagu uuaugcaggg a                                                 21
          <![CDATA[<210> 162]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400> 162]]>
          aucagccagu uuaugcaggg a                                                 21
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          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400> 163]]>
          ucagccaguu uaugcagggc a                                                 21
          <![CDATA[<210> 164]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400> 164]]>
          cagccaguuu augcagggcu a                                                 21
          <![CDATA[<210> 165]]>
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          agccaguuua ugcagggcua a                                                 21
          <![CDATA[<210> 166]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 166]]>
          agccaguuua ugcagggcua a                                                 21
          <![CDATA[<210> 167]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]>
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          gccaguuuau gcagggcuac a                                                 21
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          <![CDATA[<220>]]>
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          gccaguuuau gcagugcuac a                                                 21
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          ccaguuuaug cagggcuacc a                                                 21
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          ccaguuuaug caggucuacc a                                                 21
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          <![CDATA[<400> 191]]>
          ugaguccaga acugucauaa a                                                 21
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400> 192]]>
          gaguccagaa cugucauaag a                                                 21
          <![CDATA[<210> 193]]>
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          <![CDATA[<400> 193]]>
          gaguccagaa cugucauaag a                                                 21
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          <br/>
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;220&gt;]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;223&gt; 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]&gt;
          <br/>
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;400&gt; 194]]&gt;
          <br/><![CDATA[aguccagaac ugucauaaga a                                                 21
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          <![CDATA[<400> 195]]>
          aguccagaac ugucauaaga a                                                 21
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          guccagaacu gucauaagau a                                                 21
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          <![CDATA[<212> RNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
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          <![CDATA[<400> 198]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223]]>> 人工序列]]&gt;<![CDATA[之描述：合成寡核苷酸
          <![CDATA[<400> 199]]>
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          <![CDATA[<211> 21]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 200]]>
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          <![CDATA[<211> 21]]>
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          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 201]]>
          guccugaacu gucauaagau a                                                 21
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          gucgagaacu gucauaagau a                                                 21
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          gugcagaacu gucauaagau a                                                 21
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          guccagaacu gucauaagau a                                                 21
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          guccagaacu gucauaagau a                                                 21
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          uccagaacug ucauaagaua a                                                 21
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          ccagaacugu cauaagaua                                                    19
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          ccagaacugu cauaagauau a                                                 21
          <![CDATA[<210> 209]]>
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          <![CDATA[<400> 209]]>
          cagaacuguc auaagauaug a                                                 21
          <![CDATA[<210> 210]]>
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          agaacuguca uaagauauga a                                                 21
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          aacugucaua agauaugagc a                                                 21
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          acugucauaa gauaugagcu a                                                 21
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          cugucauaag auaugagcug a                                                 21
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          cugucauaag auaugagcug a                                                 21
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          cugucauaag auaugagcug a                                                 21
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          ugucauaaga uaugagcuga a                                                 21
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          cauaagauau gagcugaaua a                                                 21
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          cugaauaccg agacagugaa a                                                 21
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          uaccgagaca gugaaggcug a                                                 21
          <![CDATA[<210> 224]]>
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          <![CDATA[<212> RNA]]>
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          uaccgagaca gugaaggcug a                                                 21
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          acagugaagg cugagaagga a                                                 21
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          acagugaagg cugagaagga a                                                 21
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          ugagaaggaa aucccuggag a                                                 21
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          gccaaaggug ccauuguccu a                                                 21
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          ccaaacugaa cccagagaau a                                                 21
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          caaacugaac ccagagaauc a                                                 21
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          <![CDATA[<400> 234]]>
          uccguaagca gucagucgcc a                                                 21
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          uccguaagca gucagucgcc a                                                 21
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          <![CDATA[<400> 236]]>
          uccguaagca gucagucgcc a                                                 21
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          uccguaagca gucagucgcc a                                                 21
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          uaagcaguca gucgccaaug a                                                 21
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          <![CDATA[<400> 239]]>
          cagucagucg ccaaugccuu a                                                 21
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          <![CDATA[<212> RNA]]>
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          ucagucgcca augccuucau a                                                 21
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          agucgccaau gccuucauca a                                                 21
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          gccaaugccu ucaucaucug a                                                 21
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          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          ccuucaucau cuguggcacc a                                                 21
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          ccuucaucau cuguggcacc a                                                 21
          <![CDATA[<210> 245]]>
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          cuguggcacc uuguacaccg a                                                 21
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          uaccgucaac uuugcuuaug a                                                 21
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          uaccgucaac uuugcuuaug a                                                 21
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          gccugggaca acuugaacau a                                                 21
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          gccugggaca acuugaacau a                                                 21
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          gccugggaca acuugaacau a                                                 21
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          ggacaacuug aacaugguca a                                                 21
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          gacaacuuga acauggucac a                                                 21
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          gacaacuuga acauggucac a                                                 21
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          acaacuugaa cauggucacu a                                                 21
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          acaacuugaa cauggucacu a                                                 21
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          acuugaacau ggucacuuau a                                                 21
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          cuugaacaug gucacuuaug a                                                 21
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          <![CDATA[<220>]]>
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          cauugcucuu gcauguuaca a                                                 21
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          cauugcucuu gcauguuaca a                                                 21
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          cuugcauguu acaugguuac a                                                 21
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          uugcauguua caugguuacc a                                                 21
          <![CDATA[<210> 421]]>
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          auguuacaug guuaccacaa a                                                 21
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          auauaaguaa gaugcauuua a                                                 21
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          uauaaguaag augcauuuac a                                                 21
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          auaaguaaga ugcauuuacu a                                                 21
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<211> 23]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
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          ugugtcauaa gcaaaguuga cgg                                               23
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          uugugucaua agcaaaguug acg                                               23
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          uuugcugaua ccugugccug ugu                                               23
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400> 723]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          uucuatctga agcauuagaa gcc                                               23
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          <![CDATA[<212> RNA]]>
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          <![CDATA[<400> 895]]>
          accucucagc acagcagagc uuu                                               23
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          <![CDATA[<211> 23]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
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          accucucagc acagcagagc uuu                                               23
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          cacagcagag cuuuccagag gaa                                               23
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          gcaaugaggu ucuucugugc acg                                               23
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          caaugagguu cuucugugca cgu                                               23
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          aaugagguuc uucugugcac guu                                               23
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          gagguucuuc ugugcacguu gcu                                               23
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          <![CDATA[<212>]]> RNA
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          <![CDATA[<400> 915]]>
          gagguucuuc ugugcacguu gcu                                               23
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          <![CDATA[<212> RNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
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          <![CDATA[<400> 925]]>
          uucugugcac guugcugcag cuu                                               23
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          uucugugcac guugcugcag cuu                                               23
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          uacagcaacc uccuccgaga caa                                               23
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          uacagcaacc uccuccgaga caa                                               23
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          cagcaaccuc cuccgagaca agu                                               23
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          <![CDATA[<400> 958]]>
          gacaagucag uucuggagga aga                                               23
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          aagucaguuc uggaggaaga gaa                                               23
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          ugagaaucug gccaggaggu ugg                                               23
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          ucuggccagg agguuggaaa gca                                               23
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          ugagaacagc agaaacaauu acu                                               23
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          accucaucag ccaguuuaug cag                                               23
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          ccucaucagc caguuuaugc a                                                 21
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          ccucaucagc caguuuaugc agg                                               23
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          aucagccagu uuaugcaggg cua                                               23
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          cagccaguuu augcagggcu acc                                               23
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          cagccaguuu augcagggcu acc                                               23
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          agccaguuua ugcagggcua ccc                                               23
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          acgggugcug ugguguacuc ggg                                               23
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          ugaguccaga acugucauaa gau                                               23
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          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]>
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          gaguccagaa cugucauaag aua                                               23
          <![CDATA[<210> 1093]]>
          <![CDATA[<211> 23]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400> 1093]]>
          gaguccagaa cugucauaag aua                                               23
          <![CDATA[<210> 1094]]>
          <![CDATA[<211> 23]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400> 1094]]>
          aguccagaac ugucauaaga uau                                               23
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          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
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          <![CDATA[<400> 1095]]>
          guccagaacu gucauaagau a                                                 21
          <![CDATA[<210> 1096]]>
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          <![CDATA[<212> RNA]]>
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          <![CDATA[<400> 1096]]>
          guccagaacu gucauaagau aug                                               23
          <![CDATA[<210> 1097]]>
          <![CDATA[<211> 23]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400> 1097]]>
          uccagaacug ucauaagaua uga                                               23
          <![CDATA[<210> 1098]]>
          <![CDATA[<211> 23]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400> 1098]]>
          uccagaacug ucauaagaua uga                                               23
          <![CDATA[<210> 1099]]>
          <![CDATA[<211> 23]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400> 1099]]>
          uccagaacug ucauaagaua uga                                               23
          <![CDATA[<210> 1100]]>
          <![CDATA[<211> 23]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400> 1100]]>
          ccagaacugu cauaagauau gag                                               23
          <![CDATA[<210> 11]]>01
          <![CDATA[<211> 23]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
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          <![CDATA[<400> 1101]]>
          ccagaacugu cauaagauau gag                                               23
          <![CDATA[<210> 1102]]>
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          <![CDATA[<212> RNA]]>
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          <![CDATA[<400> 1102]]>
          cagaacuguc auaagauaug agc                                               23
          <![CDATA[<210> 1103]]>
          <![CDATA[<211> 23]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
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          agaacuguca uaagauauga gcu                                               23
          <![CDATA[<210> 1104]]>
          <![CDATA[<211> 23]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400> 1104]]>
          gaacugucau aagauaugag cug                                               23
          <![CDATA[<210> 1105]]>
          <![CDATA[<211> 23]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
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          <![CDATA[<400> 1105]]>
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          <![CDATA[<210> 1106]]>
          <![CDATA[<211> 23]]>
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          <![CDATA[<211> 23]]>
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          acugucauaa gauaugagcu gaa                                               23
          <![CDATA[<210> 1109]]>
          <![CDATA[<211> 23]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400> 1109]]>
          gucauaagau augagcugaa uac                                               23
          <![CDATA[<210> 1110]]>
          <![CDATA[<211> 23]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
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          agcugaauac cgagacagug aag                                               23
          <![CDATA[<210> 1111]]>
          <![CDATA[<211> 23]]>
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          aauaccgaga cagugaaggc uga                                               23
          <![CDATA[<210> 1112]]>
          <![CDATA[<211> 23]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
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          aauaccgaga cagugaaggc uga                                               23
          <![CDATA[<210> 1113]]>
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          <![CDATA[<400> 1113]]>
          agacagugaa ggcugagaag gaa                                               23
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          <![CDATA[<212> RNA]]>
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          aggccaaagg ugccauuguc cuc                                               23
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          <![CDATA[<211> 23]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400> 1118]]>
          cuccaaacug aacccagaga auc                                               23
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          <![CDATA[<211> 23]]>
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          <![CDATA[<400> 1119]]>
          cuccaaacug aacccagaga auc                                               23
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          cuccaaacug aacccagaga auc                                               23
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          uccaaacuga acccagagaa ucu                                               23
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          cauccguaag cagucagucg cca                                               23
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          cauccguaag cagucagucg cca                                               23
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          cauccguaag cagucagucg cca                                               23
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          <br/>&lt;![CDATA[&lt;211&gt; 23]]&gt;
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          <br/>&lt;![CDATA[&lt;213&gt; 人工序列]]&gt;
          <br/>
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;220&gt;]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;223&gt; 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]&gt;
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          <br/>&lt;![CDATA[&lt;400&gt; 1125]]&gt;
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          cguaagcagu cagucgccaa ugc                                               23
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          agcagucagu cgccaaugcc uuc                                               23
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          agucagucgc caaugccuuc auc                                               23
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          ucagucgcca augccuucau cau                                               23
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          ucgccaaugc cuucaucauc ugu                                               23
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          ugccuucauc aucuguggca ccu                                               23
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          ugccuucauc aucuguggca ccu                                               23
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          ugcuaccguc aacuuugcuu aug                                               23
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          <![CDATA[<211> 23]]>
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          cuaccgucaa cuuugcuuau gac                                               23
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          <![CDATA[<211> 23]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400> 1147]]>
          cuaccgucaa cuuugcuuau gac                                               23
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          <![CDATA[<212> RNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          uaccgucaac uuugcuuaug a                                                 21
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          uaccgucaac uuugcuuaug aca                                               23
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          <![CDATA[<210> 1151]]>
          <![CDATA[<211> 23]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          ccgucaacuu ugcuuaugac aca                                               23
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          <![CDATA[<211> 23]]>
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          <![CDATA[<210> 1153]]>
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          cgucaacuuu gcuuaugaca cag                                               23
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          <![CDATA[<211> 23]]>
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          gucaacuuug cuuaugacac agg                                               23
          <![CDATA[<210> 1155]]>
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          <![CDATA[<400> 1155]]>
          ucaacuuugc uuaugacaca ggc                                               23
          <![CDATA[<210> 1156]]>
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          <![CDATA[<400> 1156]]>
          caacuuugcu uaugacacag gca                                               23
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          <![CDATA[<400> 1157]]>
          aacuuugcuu augacacagg cac                                               23
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          acacaggcac agguaucagc aag                                               23
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          cuauaaguac agcagcauga uug                                               23
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          uauaaguaca gcagcaugau uga                                               23
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          auaaguacag cagcaugauu gac                                               23
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          auaaguacag cagcaugauu gac                                               23
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          auaaguacag cagcaugauu gac                                               23
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          uaaguacagc agcaugauug acu                                               23
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          uaaguacagc agcaugauug acu                                               23
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          aaguacagca gcaugauuga cua                                               23
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          aguacagcag caugauugac uac                                               23
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          guacagcagc augauugacu a                                                 21
          <![CDATA[<210> 1178]]>
          <![CDATA[<211> 23]]>
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          guacagcagc augauugacu aca                                               23
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          guacagcagc augauugacu aca                                               23
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          uacagcagca ugauugacua caa                                               23
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          <![CDATA[<400> 1182]]>
          acagcagcau gauugacuac aac                                               23
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          <![CDATA[<212> RNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400> 1183]]>
          cagcagcaug auugacuaca acc                                               23
          <![CDATA[<210> 1184]]>
          <![CDATA[<211> 23]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400> 1184]]>
          agcagcauga uugacuacaa ccc                                               23
          <![CDATA[<210> 1185]]>
          <![CDATA[<211> 23]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 1185]]>
          cagcaugauu gacuacaacc ccc                                               23
          <![CDATA[<210> 1186]]>
          <![CDATA[<211> 23]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 1186]]>
          gaagcucuuu gccugggaca acu                                               23
          <![CDATA[<210> 1187]]>
          <![CDATA[<211> 23]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 1187]]>
          gaagcucuuu gccugggaca acu                                               23
          <![CDATA[<210> 1188]]>
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          <![CDATA[<400> 1188]]>
          uugccuggga caacuugaac aug                                               23
          <![CDATA[<210> 1189]]>
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          uugccuggga caacuugaac aug                                               23
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          uugccuggga caacuugaac aug                                               23
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          gccugggaca acuugaacau ggu                                               23
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          ccugggacaa cuugaacaug guc                                               23
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          cugggacaac uugaacaugg uca                                               23
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          cugggacaac uugaacaugg uca                                               23
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          ugggacaacu ugaacauggu cac                                               23
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          gggacaacuu gaacaugguc acu                                               23
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          gggacaacuu gaacaugguc acu                                               23
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          ggacaacuug aacaugguca cuu                                               23
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          ggacaacuug aacaugguca cuu                                               23
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          gacaacuuga acauggucac uua                                               23
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          <![CDATA[<211> 23]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          acaacuugaa cauggucacu uau                                               23
          <![CDATA[<210> 1202]]>
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          caacuugaac auggucacuu aug                                               23
          <![CDATA[<210> 1203]]>
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          <![CDATA[<400> 1203]]>
          aacuugaaca uggucacuua uga                                               23
          <![CDATA[<210> 1204]]>
          <![CDATA[<211> 23]]>
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          aacuugaaca uggucacuua uga                                               23
          <![CDATA[<210> 1205]]>
          <![CDATA[<211> 23]]>
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          <![CDATA[<400> 1205]]>
          aacuugaaca uggucacuua uga                                               23
          <![CDATA[<210> 1206]]>
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          aacuugaaca uggucacuua uga                                               23
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          acuugaacau ggucacuuau gac                                               23
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          acuugaacau ggucacuuau gac                                               23
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          <![CDATA[<400> 1217]]>
          acuugaacau ggucacuuau gac                                               23
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          <![CDATA[<400> 1218]]>
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          acuugaacau ggucacuuau gac                                               23
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          <![CDATA[<211> 21]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400> 1222]]>
          cuugaacaug gucacuuaug a                                                 21
          <![CDATA[<210> 1223]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          cuugaacaug gucacuuaug aca                                               23
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          uugaacaugg ucacuuauga c                                                 21
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          uugaacaugg ucacuuauga cau                                               23
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          ugaacauggu cacuuaugac auc                                               23
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          gaacaugguc acuuaugaca uca                                               23
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          cagcauuuau gggauguuua aug                                               23
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          gauguuuaau gacauaguuc aag                                               23
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          gauguuuaau gacauaguuc aag                                               23
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          auguuuaaug acauaguuca agu                                               23
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          uguuuaauga cauaguucaa guu                                               23
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          ugacauaguu caaguuuucu ugu                                               23
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          ugacauaguu caaguuuucu ugu                                               23
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          ugacauaguu caaguuuucu ugu                                               23
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          gacauaguuc aaguuuucuu gug                                               23
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          acauaguuca aguuuucuug u                                                 21
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          acauaguuca aguuuucuug u                                                 21
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          cauaguucaa guuuucuugu gau                                               23
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          auaguucaag uuuucuugug auu                                               23
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          aguucaaguu uucuugugau uug                                               23
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          guucaaguuu ucuugugauu ugg                                               23
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          uucaaguuuu cuugugauuu ggg                                               23
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          ucaaguuuuc uugugauuug ggg                                               23
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          ccugaaaacc auugcucuug cau                                               23
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          cugaaaacca uugcucuugc aug                                               23
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          cugaaaacca uugcucuugc aug                                               23
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          ugaaaaccau ugcucuugca ugu                                               23
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          aaccauugcu cuugcauguu aca                                               23
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          accauugcuc uugcauguua cau                                               23
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          accauugcuc uugcauguua cau                                               23
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          ccauugcucu ugcauguuac aug                                               23
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          cauugcucuu gcauguuaca ugg                                               23
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          auugcucuug cauguuacau ggu                                               23
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          uugcucuugc auguuacaug g                                                 21
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          uugcauguua caugguuacc aca                                               23
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          auaaguaaga ugcauuuacu aca                                               23
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          auaaguaaga ugcauuuacu aca                                               23
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          uaaguaagau gcauuuacua cag                                               23
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          ggcuucuaau gcuucagaua gaa                                               23
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          cucucagcac agcagagcuu a                                                 21
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          ucucagcaca gcagagcuuu a                                                 21
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          cagcagagcu uuccagagga a                                                 21
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          aaugagguuc uucugugcac a                                                 21
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          augagguucu ucugugcacg a                                                 21
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          guguggccag ucccaaugaa a                                                 21
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          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
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          <![CDATA[<400> 1389]]>
          gccaggccau gucagucauc a                                                 21
          <![CDATA[<210> 1390]]>
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          gccaggccau gucagucauc a                                                 21
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          <![CDATA[<211> 21]]>
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          gccaggccau gucagucauc a                                                 21
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          <![CDATA[<211> 21]]>
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          ggccauguca gucauccaua a                                                 21
          <![CDATA[<210> 1393]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
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          gaccuggagg ccaccaaagc a                                                 21
          <![CDATA[<210> 1394]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
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          cuggaggcca ccaaagcucg a                                                 21
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          <![CDATA[<212> RNA]]>
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          <![CDATA[<400> 1395]]>
          gaaacccaaa ccagagaguu a                                                 21
          <![CDATA[<210> 1396]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
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          <![CDATA[<400> 1396]]>
          cagcaaccuc cuccgagaca a                                                 21
          <![CDATA[<210> 1397]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
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          <![CDATA[<400> 1397]]>
          cagcaaccuc cuccgagaca a                                                 21
          <![CDATA[<210> 1398]]>
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          <![CDATA[<400> 1398]]>
          gcaaccuccu ccgagacaag a                                                 21
          <![CDATA[<210> 1399]]>
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          <![CDATA[<400> 1399]]>
          gcaaccuccu ccgagacaag a                                                 21
          <![CDATA[<210> 1400]]>
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          gcaaccuccu ccgagacaag a                                                 21
          <![CDATA[<210> 1401]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400> 1401]]>
          agacaaguca guucuggagg a                                                 21
          <![CDATA[<210> 1402]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 1402]]>
          caagucaguu cuggaggaag a                                                 21
          <![CDATA[<210> 1403]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 1403]]>
          gucaguucug gaggaagaga a                                                 21
          <![CDATA[<210> 1404]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
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          <![CDATA[<400> 1404]]>
          agaaucuggc caggagguug a                                                 21
          <![CDATA[<210> 1405]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
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          uggccaggag guuggaaagc a                                                 21
          <![CDATA[<210> 1406]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
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          uggccaggag guuggaaagc a                                                 21
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          cagccaggag guagcaaggc a                                                 21
          <![CDATA[<210> 1408]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
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          <![CDATA[<400> 1408]]>
          ugccaccagg cuccagagaa a                                                 21
          <![CDATA[<210> 1409]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
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          <![CDATA[<400> 1409]]>
          aauuuggaca cuuuggccuu a                                                 21
          <![CDATA[<210> 1410]]>
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          aauuuggaca cuuuggccuu a                                                 21
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          acacuuuggc cuuccaggaa a                                                 21
          <![CDATA[<210> 1412]]>
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          cuuuggccuu ccaggaacug a                                                 21
          <![CDATA[<210> 1413]]>
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          aggaacugaa guccgagcua a                                                 21
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          aggaacugaa guccgagcua a                                                 21
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          <![CDATA[<400> 1415]]>
          gaaguccgag cuaacugaag a                                                 21
          <![CDATA[<210> 1416]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
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          gcuaacugaa guuccugcuu a                                                 21
          <![CDATA[<210> 1417]]>
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          cuaacugaag uuccugcuuc a                                                 21
          <![CDATA[<210> 1418]]>
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          gaaguuccug cuucccgaau a                                                 21
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          gagaacuagu uuggguagga a                                                 21
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          gagaacuagu uuggguagga a                                                 21
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          acuaguuugg guaggagagc a                                                 21
          <![CDATA[<210> 1422]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 1422]]>
          acuaguuugg guaggagagc a                                                 21
          <![CDATA[<210> 1423]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成]]>寡核苷酸
          <![CDATA[<400> 1423]]>
          ggguaggaga gccucucacg a                                                 21
          <![CDATA[<210> 1424]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 1424]]>
          guaggagagc cucucacgcu a                                                 21
          <![CDATA[<210> 1425]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 1425]]>
          guaggagagc cucucacgcu a                                                 21
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          uaggagagcc ucucacgcug a                                                 21
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          <![CDATA[<400> 1427]]>
          aggagagccu cucacgcuga a                                                 21
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          <![CDATA[<400> 1431]]>
          cacgcugaga acagcagaaa a                                                 21
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          <![CDATA[<220>]]>
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          acgcugagaa cagcagaaac a                                                 21
          <![CDATA[<210> 1433]]>
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          cgcugagaac agcagaaaca a                                                 21
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          <![CDATA[<212> RNA]]>
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          <![CDATA[<400> 1435]]>
          gcugagaaca gcagaaacaa a                                                 21
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          <![CDATA[<211> 21]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          cugagaacag cagaaacaau a                                                 21
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          ugagaacagc agaaacaauu a                                                 21
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          <![CDATA[<211> 21]]>
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          <![CDATA[<400> 1438]]>
          gagaacagca gaaacaauua a                                                 21
          <![CDATA[<210> 1439]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400> 1439]]>
          agaacagcag aaacaauuac a                                                 21
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          agaacagcag aaacaauuac a                                                 21
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          gaacagcaga aacaauuacu a                                                 21
          <![CDATA[<210> 1442]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400> 1442]]>
          aacagcagaa acaauuacug a                                                 21
          <![CDATA[<210> 1443]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400> 1443]]>
          aacagcagaa acaauuacug a                                                 21
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          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400> 1444]]>
          aacaccagaa acaauuacug a                                                 21
          <![CDATA[<210> 1445]]>
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          <![CDATA[<212> RNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 1445]]>
          aacugcagaa acaauuacug a                                                 21
          <![CDATA[<210> 1446]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400> 1446]]>
          aagagcagaa acaauuacug a                                                 21
          <![CDATA[<210> 1447]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
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          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 1447]]>
          aacagcagaa acaauuacug a                                                 21
          <![CDATA[<210> 1448]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 1448]]>
          aacagcagaa acaauuacug a                                                 21
          <![CDATA[<210> 1449]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400> 1449]]>
          aacagcagaa acaauuacug a                                                 21
          <![CDATA[<210> 1450]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 1450]]>
          acagcagaaa caauuacugg a                                                 21
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          <![CDATA[<211> 19]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 1451]]>
          cagcagaaac aauuacuga                                                    19
          <![CDATA[<210> 1452]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]>
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          cagcagaaac aauuacuggc a                                                 21
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          agcagaaaca auuacuggca a                                                 21
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          ccucaucagc caguuuaugc a                                                 21
          <![CDATA[<210> 1488]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
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          <![CDATA[<400> 1488]]>
          cucaucagcc aguuuaugca a                                                 21
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          <![CDATA[<211> 19]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
          <![CDATA[<213> 人]]>工序列
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          <![CDATA[<400> 1489]]>
          ucaucagcca guuuaugca                                                    19
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          ucaucagcca guuuaugcag a                                                 21
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          ucaucagcca guuuaugcag a                                                 21
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          caucagccag uuuaugcagg a                                                 21
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          aucagccagu uuaugcaggg a                                                 21
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          aucagccagu uuaugcaggg a                                                 21
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          ucagccaguu uaugcagggc a                                                 21
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          cagccaguuu augcagggcu a                                                 21
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          <![CDATA[<400> 1497]]>
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          <![CDATA[<212> RNA]]>
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          agccaguuua ugcagggcua a                                                 21
          <![CDATA[<210> 1499]]>
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          <![CDATA[<400> 1499]]>
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          gccaguuuau gcagugcuac a                                                 21
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 1501]]>
          ccaguuuaug cagggcuacc a                                                 21
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          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 1502]]>
          ccaguuuaug caggucuacc a                                                 21
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          <![CDATA[<212> RNA]]>
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          gagccucuau uuccagggcg a                                                 21
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          <![CDATA[<400> 1508]]>
          ccucuauuuc cagggcgcug a                                                 21
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          <![CDATA[<400> 1509]]>
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          <![CDATA[<211> 21]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]>
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          agggcgcuga guccagaacu a                                                 21
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          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 1513]]>
          gggcgcugag uccagaacug a                                                 21
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          <![CDATA[<210> 1517]]>
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          <![CDATA[<400> 1517]]>
          gcgcugaguc cagaacuguc a                                                 21
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          <![CDATA[<400> 1518]]>
          cgcugagucc agaacuguca a                                                 21
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          cugucauaag auaugagcug a                                                 21
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          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]>
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          ugucauaaga uaugagcuga a                                                 21
          <![CDATA[<210> 1553]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 1553]]>
          cauaagauau gagcugaaua a                                                 21
          <![CDATA[<210> 1554]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]>
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          cugaauaccg agacagugaa a                                                 21
          <![CDATA[<210> 1555]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
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          <![CDATA[<400> 1555]]>
          uaccgagaca gugaaggcug a                                                 21
          <![CDATA[<210> 1556]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
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          uaccgagaca gugaaggcug a                                                 21
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          acagugaagg cugagaagga a                                                 21
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          acagugaagg cugagaagga a                                                 21
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          acagugaagg cugagaagga a                                                 21
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          ugagaaggaa aucccuggag a                                                 21
          <![CDATA[<210> 1561]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400> 1561]]>
          gccaaaggug ccauuguccu a                                                 21
          <![CDATA[<210> 1562]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：]]>合成寡核苷酸
          <![CDATA[<400> 1562]]>
          ccaaacugaa cccagagaau a                                                 21
          <![CDATA[<210> 1563]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 1563]]>
          ccaaacugaa cccagagaau a                                                 21
          <![CDATA[<210> 1564]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 1564]]>
          ccaaacugaa cccagagaau a                                                 21
          <![CDATA[<210> 1565]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 1565]]>
          caaacugaac ccagagaauc a                                                 21
          <![CDATA[<210> 1566]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 1566]]>
          uccguaagca gucagucgcc a                                                 21
          <![CDATA[<210> 1567]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 1567]]>
          uccguaagca gucagucgcc a                                                 21
          <![CDATA[<210> 1568]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
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          <![CDATA[<400> 1568]]>
          uccguaagca gucagucgcc a                                                 21
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          uccguaagca gucagucgcc a                                                 21
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          uaagcaguca gucgccaaug a                                                 21
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          <![CDATA[<400> 1571]]>
          cagucagucg ccaaugccuu a                                                 21
          <![CDATA[<210> 1572]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
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          <![CDATA[<400> 1572]]>
          ucagucgcca augccuucau a                                                 21
          <![CDATA[<210> 1573]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400> 1573]]>
          agucgccaau gccuucauca a                                                 21
          <![CDATA[<210> 1574]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 1574]]>
          gccaaugccu ucaucaucug a                                                 21
          <![CDATA[<210> 1575]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400> 1575]]>
          ccuucaucau cuguggcacc a                                                 21
          <![CDATA[<210> 1576]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          ccuucaucau cuguggcacc a                                                 21
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          cuguggcacc uuguacaccg a                                                 21
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          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 1578]]>
          cuaccgucaa cuuugcuuau a                                                 21
          <![CDATA[<210> 1579]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          cuaccgucaa cuuugcuuau a                                                 21
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          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
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          uaccgucaac uuugcuuaug a                                                 21
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          uaccgucaac uuugcuuaug a                                                 21
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          uaccgucaac uuugcuuaug a                                                 21
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          uaccgucaac uuugcuuaug a                                                 21
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          uacccucaac uuugcuuaug a                                                 21
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          uacggucaac uuugcuuaug a                                                 21
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          uagcgucaac uuugcuuaug a                                                 21
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          uaccgucaac uuugcuuaug a                                                 21
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          accgucaacu uugcuuauga a                                                 21
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          gucaacuuug cuuaugacac a                                                 21
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          <![CDATA[<212> RNA]]>
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          ucaacuuugc uuaugacaca a                                                 21
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          caacuuugcu uaugacacag a                                                 21
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          <![CDATA[<210> ]]>1600
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          acuuugcuua ugacacaggc a                                                 21
          <![CDATA[<210> 1601]]>
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          cuuugcuuau gacacaggca a                                                 21
          <![CDATA[<210> 1602]]>
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          acaggcacag guaucagcaa a                                                 21
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          auaaguacag cagcaugauu a                                                 21
          <![CDATA[<210> 1604]]>
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          uaaguacagc agcaugauug a                                                 21
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          aguacagcag caugauugac a                                                 21
          <![CDATA[<210> 1609]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
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          aguacagcag caugauugac a                                                 21
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          guacagcagc augauugacu a                                                 21
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          guacagcagc augauugacu a                                                 21
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          <![CDATA[<212> RNA]]>
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          <![CDATA[<400> 1613]]>
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          guacagcagc augauugacu a                                                 21
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          guagagcagc augauugacu a                                                 21
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          guucagcagc augauugacu a                                                 21
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          guacagcagc augauugacu a                                                 21
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          uacagcagca ugauugacua a                                                 21
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          acagcagcau gauugacua                                                    19
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          acagcagcau gauugacuac a                                                 21
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          cagcagcaug auugacuaca a                                                 21
          <![CDATA[<210> 1626]]>
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          agcagcauga uugacuacaa a                                                 21
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          cagcaugauu gacuacaacc a                                                 21
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          gcaugauuga cuacaacccc a                                                 21
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          agcucuuugc cugggacaac a                                                 21
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          agcucuuugc cugggacaac a                                                 21
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          gccugggaca acuugaacau a                                                 21
          <![CDATA[<210> 1633]]>
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          gccugggaca acuugaacau a                                                 21
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          gccugggaca acuugaacau a                                                 21
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          cugggacaac uugaacaugg a                                                 21
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          ugggacaacu ugaacauggu a                                                 21
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          ggacaacuug aacaugguca a                                                 21
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          gacaacuuga acauggucac a                                                 21
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          acaacuugaa cauggucacu a                                                 21
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          acaacuugaa cauggucacu a                                                 21
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          caacuugaac auggucacuu a                                                 21
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          aacuugaaca uggucacuua a                                                 21
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          acuugaacau ggucacuuau a                                                 21
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          cuugaacaug gucacuuaug a                                                 21
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          cuugaacaug gucacuuaug a                                                 21
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          cuugaacaug gucacuuaug a                                                 21
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          uucaaguuuu cuugugauuu a                                                 21
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          cuugcauguu acaugguuac a                                                 21
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          aguaagaugc auuuacuaca a                                                 21
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          <![CDATA[<400> 1778]]>
          guaagaugca uuuacuaca                                                    19
          <![CDATA[<210> 1779]]>
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          uuggcuucua augcuucaga a                                                 21
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          uagcgugaga ggcucuccua ccc                                               23
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          uuugauguca uaagugacca ugu                                               23
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          ugcutgaugu cauaagugac cau                                               23
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          <![CDATA[<220>]]>
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          uuugaacuau gucauuaaac auc                                               23
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          <![CDATA[<400> 2218]]>
          uguaguaaau gcaucuuagu ugu                                               23
          <![CDATA[<210> 2219]]>
          <![CDATA[<211> 23]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 2219]]>
          uguaguaaau gcaucuuacu uau                                               23
          <![CDATA[<210> 2220]]>
          <![CDATA[<211> 23]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 2220]]>
          uguaguaaau gcaucuuacu uau                                               23
          <![CDATA[<210> 2221]]>
          <![CDATA[<211> 23]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 組合式DNA/RNA分子之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 2221]]>
          uuguagtaaa ugcaucuuac uua                                               23
          <![CDATA[<210> 2222]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 2222]]>
          uguaguaaau gcaucuuacu u                                                 21
          <![CDATA[<210> 2223]]>
          <![CDATA[<211> 23]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400> 2223]]>
          uucugaagca uuagaagcca acu                                               23
          <![CDATA[<210> 2224]]>
          <![CDATA[<211> 23]]>
          <![CDATA[<212> RNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400> 2224]]>
          uucuaucuga agcauuagaa gcc                                               23
          <![CDATA[<210> 2225]]>
          <![CDATA[<211> 23]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400> 2225]]>
          uuctatcuga agcauuagaa gcc                                               23
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          <![CDATA[<211> 23]]>
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Claims (41)

  1. 一種抑制肌纖蛋白(MYOC)表現的雙股核糖核酸(dsRNA)藥劑，其中該dsRNA藥劑包含形成雙股區之有義股及反義股，其中該反義股包含含有表2A及2B中之任一者中所列之反義序列之一之至少15個連續核苷酸、具有0、1、2或3個錯配的核苷酸序列，且其中該有義股包含含有與該反義序列對應之表2A及2B中之任一者中所列之有義序列之至少15個連續核苷酸、具有0、1、2或3個錯配的核苷酸序列。
  2. 如請求項1之dsRNA藥劑，其中該反義股包含含有雙螺旋體AD-1565804之反義股核苷酸序列之至少15個連續核苷酸、具有0、1、2或3個錯配的核苷酸序列，且該有義股包含含有雙螺旋體AD-1565804之有義股核苷酸序列之至少15個連續核苷酸、具有0、1、2或3個錯配的核苷酸序列。
  3. 如請求項1之dsRNA藥劑，其中該反義股包含含有雙螺旋體AD-1565837之反義股核苷酸序列之至少15個連續核苷酸、具有0、1、2或3個錯配的核苷酸序列，且該有義股包含含有雙螺旋體AD-1565837之有義股核苷酸序列之至少15個連續核苷酸、具有0、1、2或3個錯配的核苷酸序列。
  4. 如請求項1至3中任一項之dsRNA藥劑，其中該有義股及該反義股中之至少一者與一或多個親脂性部分結合。
  5. 如請求項4之dsRNA藥劑，其中該親脂性部分經由連接子或載劑結合。
  6. 如請求項4或5之dsRNA藥劑，其中一或多個親脂性部分與至少一個股上之一或多個內部位置結合。
  7. 如請求項1至3中任一項之dsRNA藥劑，其中該有義股及該反義股中的至少一者與精胺酸-甘胺酸-天冬胺酸(RGD)-肽或RGD肽模擬物中之一或多者結合。
  8. 如請求項4至6中任一項之dsRNA藥劑，其中該親脂性部分為脂族、脂環族或聚脂環族化合物。
  9. 如請求項8之dsRNA藥劑，其中該親脂性部分含有飽和或不飽和C16烴鏈。
  10. 如請求項4至6中任一項之dsRNA藥劑，其中該親脂性部分經由置換該內部位置或該雙股區中之一或多個核苷酸的載劑而結合。
  11. 如請求項4至6中任一項之dsRNA藥劑，其中該親脂性部分經由連接子與該雙股iRNA藥劑結合，該連接子含有醚、硫醚、脲、碳酸酯、胺、醯胺、順丁烯二醯亞胺-硫醚、二硫鍵、磷酸二酯、磺醯胺鍵聯、點擊反應產物、或胺基甲酸酯。
  12. 如請求項4至6中任一項之雙股iRNA藥劑，其中該親脂性部分與核鹼基、糖部分或核苷間鍵聯結合。
  13. 如請求項1至12中任一項之dsRNA藥劑，其中該dsRNA藥劑包含至少一個經修飾之核苷酸。
  14. 如請求項13之dsRNA藥劑，其中該有義股中不超過五個核苷酸及該反義股中不超過五個核苷酸為未經修飾之核苷酸。
  15. 如請求項13之dsRNA藥劑，其中該有義股之所有核苷酸及該反義股之所有核苷酸均包含修飾。
  16. 如請求項13至15中任一項之dsRNA藥劑，其中該等經修飾之核苷酸中之至少一者選自由以下組成之群：去氧核苷酸、3'端去氧胸腺嘧啶(dT)核苷酸、經2'-O-甲基修飾之核苷酸、經2'-氟修飾之核苷酸、經2'-去氧修飾之核苷酸、鎖定核苷酸、解鎖核苷酸、構形受限核苷酸、受限制乙基核苷酸、無鹼基核苷酸、經2'-胺基修飾之核苷酸、經2'-O-烯丙基修飾之核苷酸、經2'-C-烷基修飾之核苷酸、經2'-甲氧基乙基修飾之核苷酸、經2'-O-烷基修飾之核苷酸、(N-𠰌啉基)核苷酸、胺基磷酸酯、包含非天然鹼基之核苷酸、經四氫哌喃修飾之核苷酸、經1,5-無水己糖醇修飾之核苷酸、經環己烯基修飾之核苷酸、包含硫代磷酸酯基之核苷酸、包含甲基膦酸酯基之核苷酸、包含5'-磷酸酯之核苷酸、包含5'-磷酸酯模擬物之核苷酸、經二醇修飾之核苷酸及經2-O-(N-甲基乙醯胺)修飾之核苷酸；以及其組合。
  17. 如請求項1至16中任一項之dsRNA藥劑，其中至少一個股包含至少2個核苷酸之3'突出物。
  18. 如請求項1至17中任一項之dsRNA藥劑，其中該雙股區具有15至30個核苷酸對的長度。
  19. 如請求項18之dsRNA藥劑，其中該雙股區具有17至23個核苷酸對的長度。
  20. 如請求項1至19中任一項之dsRNA藥劑，其中各股具有19至30個核苷酸。
  21. 如請求項1至20中任一項之dsRNA藥劑，其中該藥劑包含至少一個硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯。
  22. 如請求項4至21中任一項之dsRNA藥劑，其進一步包含靶向配位體，例如靶向眼組織之配位體。
  23. 如請求項22之dsRNA藥劑，其中該眼組織為小梁網狀組織、睫狀體、視網膜組織、視網膜色素上皮(RPE)或脈絡膜組織，例如脈絡膜血管。
  24. 如請求項1至23中任一項之dsRNA藥劑，其進一步包含位於該反義股之5'端的磷酸酯或磷酸酯模擬物。
  25. 如請求項24之dsRNA藥劑，其中該磷酸酯模擬物為膦酸5'-乙烯酯(VP)。
  26. 如請求項1至25中任一項之dsRNA，其中該dsRNA藥劑靶向編碼MYOC之mRNA的熱點區域。
  27. 一種dsRNA藥劑，其靶向肌纖蛋白(MYOC) mRNA的熱點區域。
  28. 一種細胞，其含有如請求項1至27中任一項之dsRNA藥劑。
  29. 一種抑制MYOC表現之醫藥組合物，其包含如請求項1至27中任一項之dsRNA藥劑。
  30. 一種抑制細胞中之MYOC表現的方法，該方法包含： (a)     使該細胞與如請求項1至27中任一項之dsRNA藥劑或如請求項29之醫藥組合物接觸；及 (b)    將步驟(a)中所產生之該細胞維持足以減少MYOC mRNA、MYOC蛋白質、或MYOC mRNA與蛋白質二者之含量的時間，藉此抑制該細胞中之MYOC表現。
  31. 如請求項30之方法，其中該細胞存在於個體內。
  32. 如請求項31之方法，其中該個體為人類。
  33. 如請求項32之方法，其中該個體已診斷患有MYOC相關病症，例如青光眼(例如原發性開角型青光眼(POAG)、閉角型青光眼、先天性青光眼及繼發性青光眼)。
  34. 一種治療經診斷患有MYOC相關病症之個體的方法，其包含向該個體投與治療有效量之如請求項1至27中任一項之dsRNA藥劑或如請求項29之醫藥組合物，藉此治療該病症。
  35. 如請求項34之方法，其中該MYOC相關病症為青光眼。
  36. 如請求項35之方法，其中青光眼為原發性開角型青光眼(POAG)。
  37. 如請求項34至36中任一項之方法，其中治療包含改善該病症之至少一種徵象或症狀。
  38. 如請求項34至37中任一項之方法，其中該治療包含：(a)抑制或降低MYOC之表現或活性；(b)減少錯誤摺疊之MYOC蛋白質的含量；(c)減少小梁網狀細胞死亡；(d)降低眼內壓；或(e)增加視敏度。
  39. 如請求項31至38中任一項之方法，其中向該個體眼內、靜脈內或體表投與該dsRNA藥劑。
  40. 如請求項39之方法，其中該眼內投與包含玻璃體內投與(例如玻璃體內注射)、經鞏膜投與(例如經鞏膜注射)、結膜下投與(例如結膜下注射)、眼球後投與(例如眼球後注射)、前房內投與(例如前房內注射)或視網膜下投與(例如視網膜下注射)。
  41. 如請求項31至40中任一項之方法，其進一步包含向該個體投與適於治療或預防MYOC相關病症之另一種藥劑或療法(例如雷射小梁成形術手術、小梁切除術手術、微創性青光眼手術、眼中置放引流管、口服藥物或滴眼劑)。
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