PT1857555E - Processo para a produção de um medicamento específico de células e/ou de tecidos e/ou de estádios patológicos - Google Patents

Processo para a produção de um medicamento específico de células e/ou de tecidos e/ou de estádios patológicos Download PDF

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PT1857555E PT07013576T PT07013576T PT1857555E PT 1857555 E PT1857555 E PT 1857555E PT 07013576 T PT07013576 T PT 07013576T PT 07013576 T PT07013576 T PT 07013576T PT 1857555 E PT1857555 E PT 1857555E
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Description

1
DESCRIÇÃO "PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE UM MEDICAMENTO ESPECÍFICO DE CÉLULAS E/OU DE TECIDOS E/OU DE ESTÁDIOS PATOLÓGICOS" A presente invenção é relativa a um processo para a produção de um medicamento especifico de células e/ou de tecidos e/ou de estádios patológicos, adequado ao tratamento de inflamações crónicas.
Antecedentes da Invenção
As inflamações crónicas representam uma esfera problemática a nivel médico cada vez maior com um grande impacto sócio-económico. Neste âmbito estão sobretudo incluídos os seguintes grupos de patologias: doenças auto-imunes e doenças do foro reumático (manifestações, por exemplo, na pele, nos pulmões, rins, sistema vascular, sistema nervoso, tecido conjuntivo, sistema locomotor, sistema endócrino) reacções alérgicas imediatas e asma doenças pulmonares obstrutivas crónicas (DPOC) arteriosclerose psoríase e eczema de contacto reacções de rejeição crónicas após o transplante de órgãos, medula óssea
Muitas destas patologias mostram nas últimas décadas uma prevalência crescente não apenas nos países industrializados como em certa medida a nível mundial. Assim, na Europa, na América do Norte, no Japão e na Austrália, mais de 20% da população sofre entretanto de 2 doenças alérgicas e asma. As doenças pulmonares obstrutivas crónicas são actualmente a quinta causa de morte a nivel mundial e irão representar no ano de 2020, segundo cálculos da OMS, a terceira causa de morte mais frequente. A arteriosclerose com as subsequentes patologias enfarte cardíaco, ataque apopléctico e doença arterial oclusiva periférica tomam o primeiro lugar na estatística mundial de morbilidade e mortalidade. A psoríase e o eczema de contacto são em conjunto com a neurodermite as doenças inflamatórias crónicas da pele mais comuns.
Devido a uma falta de entendimento suficiente até aos dias de hoje acerca das interacções entre factores ambientais e uma predisposição genética, ocorrem desregulações continuadas do sistema imunitário. Neste contexto, é possível constatar para estas diferentes patologias os seguintes princípios comuns: (A) Desenvolve-se uma resposta imunitária excessiva contra antigénios normalmente inofensivos para os humanos. Estes antigénios poderão ser elementos ambientais (por exemplo, alergénios como pólenes, pêlos de animais, alimentos, ácaros, substâncias químicas como conservantes, corantes, detergentes). Nestes casos, desenvolve-se nos doentes uma reacção alérgica. No caso, por exemplo, de fumadores activos e passivos, ocorrem doenças pulmonares obstrutivas crónicas (DPOC). Por outro lado, o sistema imunitário também pode reagir contra componentes do seu próprio organismo, reconhecendo-os como estranhos e despoletando contra eles uma reacção inflamatória. Nestes casos, desenvolve-se uma doença auto-imune. Em todos os casos, 3 antigénios inofensivos e não tóxicos são indevidamente reconhecidos como estranhos ou perigosos, e acciona-se uma reacção inflamatória desmedida. (B) As patologias passam por estádios que incluem iniciação, progressão, portanto evolução da reacção inflamatória, e a destruição a isso associada e a remodelação com perda de funcionalidade orgânica (designada por remodeling). (C) As patologias mostram caracteristicas de especificidade sub-fenotipicas especificas dos doentes. (D) Tomam efectivamente parte na iniciação, manutenção e nos processos de destruição e remodelação, componentes da imunidade inata e adquirida. Sob a influência da imunidade inata (componentes importantes: células que apresentam antigénios com as respectivas diversas populações e o sistema complemento), ocorre uma activação e uma diferenciação celular do sistema imunitário adaptativo (componentes importantes: linfócitos T e B). As células T assumem funções centrais na progressão, ao se diferenciarem em efectores altamente especializados. Neste caso, activam e adquirem certos mecanismos efectores, a que pertencem sobretudo as seguintes funções: produção de anticorpos, controlo da funcionalidade das células efectoras do sistema imunitário (como, por exemplo, granulócitos neutrófilos, basófilos, eosinófilos), retrocontrolo de funções do sistema 4 imunitário inato, influência da funcionalidade de células não hematopoiéticas, como, por exemplo, epitélio, endotélio, tecido conjuntivo, osso e cartilagem e, sobretudo, células neuronais. Aqui ocorre uma interacção particular entre o sistema imunitário e o sistema nervoso, a partir da qual se desenvolveu o conceito da interacção neuroimunológica no caso das inflamações crónicas.
Devido à complexidade e aos múltiplos aspectos dos quadros clinicos relacionados como inflamações crónicas, é necessário colocar os seguintes requisitos a um medicamento óptimo para o tratamento de doenças: (1) As patologias manifestam-se em (sub)-fenótipos específicos do doente. Por isso, é necessário que os medicamentos apresentem uma grande especificidade relativamente ao doente ou ao caso. (2) As patologias passam por fases e estádios. Por isso, é necessário que os medicamentos tenham uma especificidade para os estádios ou fases. (3) As patologias são reguladas por células diferentemente especializadas. Por isso, é necessário que os medicamentos intervenham a nível específico das células. (4) As patologias manifestam-se em diferentes órgãos e compartimentos. Por isso, é necessário que os medicamentos tenham uma especificidade de compartimento ou de órgão. (5) Os medicamentos devem ser adequados a uma terapia de longo prazo. Deve-se assim evitar reacções do sistema imunitário contra os medicamentos. (6) 0 perfil de efeitos secundários dos medicamentos 5 deve estar numa relação médica e ética para com o nivel de gravidade, o prognóstico e a evolução das patologias numa relação aceitável.
Nenhuma das terapias estabelecidas hoje em dia disponíveis contra inflamações crónicas satisfaz estes critérios de forma ideal. A partir do documento DE 695 11 245 T2, conhece-se o tratamento com a imunoglobulina A e, a partir do documento DE 695 18 667 T2, a inibição da fosfolipase A2 (PLA2) e/ou da transacilase independente da coenzima A (CoA-IT). No centro dos conceitos terapêuticos actualmente estabelecidos encontram-se, para esta patologia, a terapia anti-inflamatória não especifica e a imunossupressão. Assim, muitas das substâncias de acção anti-inflamatória não-especificas empregues, tais como o ibuprofeno, o ácido acetilsalicilico e o paracetamol não são suficientemente eficazes ou acarretam uma taxa elevada de efeitos secundários indesejados. Em contrapartida, os esteróides têm uma maior potência de eficácia, mas acarretam por seu lado efeitos secundários graves, como hipertonia, diabetes e osteoporose. Os medicamentos imunossupressores da nova geração, como, por exemplo, a ciclosporina e o tacrolimus, mostram hepatotoxicidade e nefrotoxicidade.
Esta situação levou à pesquisa e a testes clínicos de uma série de moléculas mais recentes, que deverão intervir de forma específica nas desregulações imunológicas e citobiológicas. A estas pertencem as citoquinas, os receptores das citoquinas e as anti-citoquinas. Os problemas, associados a estas aplicações terapêuticas mais recentes, incluem a falta de especificidade a nível das células e dos órgãos, o desenvolvimento de reacções imunitárias indesejadas contra estas moléculas, assim como 6 uma eficácia duvidosa em diversos fenótipos.
Procura-se mais recentemente empregar uma nova classe de moléculas catalíticas, as denominadas "desoxirribozimas" (ou "ADNzimas") (Santoro, 1997), como agentes terapêuticos para a desactivação de genes cuja expressão provoca doenças. As desoxirribozimas são moléculas de cadeia simples, que se podem em principio ligar a regiões complementares do ARN e desactiva-las por clivagem. A utilização especifica de desoxirribozimas como agentes terapêuticos pressupõe, porém, que os genes que originam a patologia e o respectivo ARNm sejam conhecidos com a maior precisão possivel. No entanto, tal apenas se verifica até à data no caso de poucas doenças. A desoxirribozima descrita no documento WO 01/11023A1 liga o RelA (p65) mONA e está assim dirigida contra o factor de transcrição NF-KB, no documento WO 00/42173 é revelada uma desoxirribozima de ligação do ARNm do EGR-1. O documento WO 99/50452 revela uma desoxirribozima 10 - 23, que pode ser utilizada num método de diagnóstico para encontrar mutações de ácidos nucleicos. Nenhuma das moléculas anti-sentido e desoxirribozimas actualmente conhecidas pode ser utilizada na produção de um medicamento destinado ao tratamento de inflamações crónicas nos doentes.
Objectivo da invenção O objectivo da presente invenção é o de preparar medicamentos específicos de células e/ou de tecidos e/ou de estádios patológicos, que levem à desactivação funcional de moléculas de ácido ribonucleico de factores de transcrição e factores das vias de transdução de sinal, cuja expressão 7 está envolvida no aparecimento de reacções inflamatórias crónicas e de doenças auto-imunes, e que sejam adequados ao tratamento de reacções inflamatórias crónicas e de doenças auto-imunes, sendo eliminadas as desvantagens descritas no estado da técnica.
Além disso, a invenção tem por objecto um processo para a produção de medicamentos específicos de células e/ou de tecidos e/ou de estádios de doença, o qual identifique as moléculas de ácido ribonucleico de factores de transcrição e de factores das vias de transdução de sinal, cuja expressão está envolvida no aparecimento de reacções inflamatórias crónicas e de doenças auto-imunes, e as desactiva funcionalmente nas células-alvos. 0 objectivo é atingido, em conformidade com a invenção, por meio de desoxirribozimas específicas de acordo com as reivindicações 1 a 5, um processo de acordo com a reivindicação 6, e um medicamento e a sua utilização de acordo com as reivindicações 7 a 9. A vantagem da invenção consiste numa desactivação funcional de moléculas de ácido ribonucleico de factores de transcrição e factores das vias de transdução de sinal, para diferenciação e/ou expressão de citoquinas envolvidas no surgimento de reacções inflamatórias crónicas e de doenças auto-imunes, por meio de desoxirribozimas específicas e/ou de ARNsi. Esta estratégia distingue-se das preparações convencionais, mas também das de terapia genética, por uma máxima selectividade e uma máxima especificidade de células e/ou de tecidos e/ou de estádios patológicos, uma grande estabilidade das moléculas e uma antigenicidade desprezável. Conseguem-se condições prévias óptimas para uma terapia de longa duração talhada à medida no caso de doentes com doenças inflamatórias crónicas.
Outros detalhes e vantagens da presente invenção tornam-se evidentes a partir das figuras e da descrição que se seguem. As figuras mostram:
Fig. 1
Fig. 2
Fig. 3
Fig. 4
Representação esquemática da transdução de sinal na diferenciação de células CD4+ em célula TH1 ou TH2 (modificadas de acordo com Ho I. C. e Glimcher L. H., "Cell" 2002/ 109: pág. 109 - 120) .
Sequência nucleotidica do domínio catalítico da desoxirribozima 10 - 23 e ligação a um ARN-alvo, por meio de emparelhamento de Watson-Crick. (R = A ou G; Y = U ou C, N = A, G, U ou G) . A seta mostra o ponto de clivagem no ARNm alvo.
Pool de moléculas específicas de ácido ribonucleico de acordo com a etapa b) , em particular as desoxirribozimas tdl a td70 contra T-bet e as respectivas sequências nucleotídicas (A = adenina, G = guanina, C = citosina, T = timina)
Sequências nucleotídicas do gene T-bet humano no alinhamento
Sequência 1: T-bet humano da base de dados n.°: NM_013351.
Sequência 2: T-bet humano (sequenciado de pBluescript-SK).
As bases divergentes estão com fundo a cinzento. As localizações dos primers (iniciadores) para a clonagem do T-bet estão sublinhadas. As localizações de primers para a quantificação 9 relativa no LightCycler estão envoltas por um risco. A localização das desoxirribozimas td54 e td69 encontra-se ao mesmo tempo destacada a cinzento e sublinhada, a td70 está ainda evidenciada em letras gordas (A = adenina, G = guanina, C = citosina, T = timina)
Fig. 4A: Sequência nucleotidica 1 do gene T-bet humano da Figura 4, por sua vez estão identificados com o fundo a cinzento os pares de nucleótidos GT e AT, entre os quais se encontram outros locais de clivagem de desoxirribozimas.
Fig. 5: A electrof orese em gel mostra a clivagem de um ARNm-alvo (neste caso ARNm de T-bet) com moléculas específicas de ácido ribonucleico de acordo com a etapa b), aqui desoxirribozimas modificadas [(td54m (vestígio 3), td69m (vestígio 4) e td70m (vestígio 5) ] . As desoxirribozimas modificadas (0,25 μΜ) são incubadas durante 30 min nos 37°C com ARNm de T-bet (0,025 μΜ) transcrito in vitro num volume de 10 pL com a seguinte composição de reacção: 50 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 10 mM MgCl2· Em seguida, separa-se os produtos por electroforese em gel. O vestígio M contém o padrão de comprimento também introduzido de 3 000 bases e 2 000 bases, o vestígio 2 contém como controlo ARNm sem a adição de desoxirribozima. A seta A indica a banda com substrato (neste caso ARNm de T-bet) , a seta B indica o maior produto de clivagem. O segundo 10 produto de clivagem é mais pequeno e já não se encontra nesta figura.
Fig. 6: Qualificação de quantidades de ARNm de T-bet e de GAPDH no LightCycler, com células tratadas com as desoxirribozimas td54 (A), td69 (B) e td70 (C) . As células Jurkat E6.1 são transfectadas duas vezes num intervalo de 24 h com as desoxirribozimas especificas de T-bet td54 (A) , td69 (B) e td70 (C) ou com desoxirribozima sem sentido como controlo (não representado). Em seguida, purifica-se ARN, realiza-se uma transcrição reversa e emprega-se o ADN obtido no LightCycler. Como padrão interno, usa-se o GAPDH (curvas a tracejado). Mostra-se por sua vez determinações quádruplas de células tratadas com desoxirribozimas especificas de T-bet ou com desoxirribozima sem sentido. As curvas continuas mostram a quantidade de T-bet nas células tratadas com desoxirribozimas especificas de T-bet, as linhas ponteadas mostram a quantidade de T-bet nas células tratadas com desoxirribozimas sem sentido.
Fig. 7: Diagrama da quantificação relativa do ARNm de T-bet nas células Jurkat E6.1. As células Jurkat E6.1 são transfectadas duas vezes com as desoxirribozimas especificas de T-bet td54, td69 e td70 e isola-se ARN passadas 48 h. Após uma transcrição reversa, determina-se a quantidade de ARNm por meio do LightCycler. Como controlo usa-se a desoxirribozima sem sentido. A quantificação relativa do ARNm de T-bet e de GAPDH é realizada 11 de acordo com instruções [descritas no "User Bulletin" #2 ("ABI Prism 7 700 Sequence detection System User Bulletin" #2 (2001). Quantificação relativa da expressão genética.
Http : / /does.appliedbiosystems.com/pebiodocs/043038 59.pdf)]. Neste caso, põe-se a quantidade de ARNm de T-bet da experiência de controlo com desoxirribozima sem sentido igual a 100%. A Figura 1 mostra numa representação esquemática, modificada de acordo com Ho I. C. und Glimcher L. H. ("Cell" 2 0 02; 109: pág. 109 - 120), as relações da transdução de sinal na diferenciação de células CD4+ em células THl ou células TH2. A estimulação através do receptor das células T por meio do respectivo complexo de péptido-MHC induz a expansão clonal e a diferenciação programada de linfócitos T CD4+ em células T auxiliares TH1 ou TH2. A distinção entre estes dois subtipos é feita com base nos seus perfis de citoquinas. As células TH1 produzem interferão γ (INFy) , interleucina 2 (IL-2) e factor de necrose tumoral β, enquanto as células TH2 segregam IL-4, IL-5, IL-9 e IL-13. As infecções bacterianas e virais induzem uma resposta imunitária, que é dominada pelas células TH1. Por outro lado, as células TH2 regulam a produção de IgE contra parasitas. Neste caso, existe um equilíbrio entre as células TH1 e as TH2. A destruição deste equilíbrio origina doenças, estando uma resposta excessiva das células THl associada a doenças auto-imunes, enquanto as doenças alérgicas têm por base uma resposta mais forte das células TH2.
Sabe-se que as citoquinas de THl estão envolvidas na patogénese de doenças auto-imunes, como, por exemplo, 12 uveíte auto-imune, encefalomielite alérgica experimental, Diabetes mellitus tipo 1 ou doença de Crohn, enquanto as citoquinas de TH2 (IL A, IL-5, IL-13 ou IL-9) estão envolvidas no aparecimento de doenças das vias respiratórias inflamatórias crónicas, como, por exemplo, eosinofilia das vias respiratórias, hipersecreção de muco e hiperreactividade das vias respiratórias. A base destas doenças consiste em alterações patofisiológicas durante a produção de citoquinas características, por meio de células TH especificas de antigénio. Assim, os ratos transgénicos, que sobreexprimem de forma constitutiva nos epitélios das vias respiratória as citoquinas de TH2 IL-4, IL-5, IL-13 ou IL-9, mostram reacções inflamatórias alérgicas tipicas. Subpopulações das células TH2 nos pulmões e nas vias respiratórias provocam nas células TH2 no modelo animal os sintomas caracteristicos da asma brônquica.
Descobriu-se de forma surpreendente que ao tratamento, especifico de células e/ou de tecidos, de inflamações crónicas e/ou de doenças auto-imunes, se adequam de forma ideal factores de transcrição e factores das vias de transdução de sinal para a diferenciação e/ou expressão de citoquinas, que estão envolvidas no aparecimento de reacções inflamatórias crónicas e de doenças auto-imunes, como, por exemplo, o factor de transcrição especifico das células TH1 T-bet e o factor de transcrição especifico das células TH2 GATA-3. 0 factor de transcrição especifico das células TH1 T-bet é sobretudo responsável pela diferenciação das células T CD+ naive em células TH1. A sua expressão é controlada pelas vias de transdução de sinal dos receptores das células T (TCR) e pelo receptor de INFy/STATl. 0 T-bet transactiva o 13 gene do INFy endógeno e induz a produção do INFy. Além disso, induz a alta regulação da expressão proteica de cadeias de IL-12RP2 e leva à remodelação da cromatina de alelos individuais do INFy. A função in vivo do T-bet é confirmada em ratos knock-out (T-bet“/_) . Embora os ratos com deficiência em T-bet apresentem um desenvolvimento normal dos linfócitos, as células T CD4+ destes ratos não produzem INFy, nem com a estimulação com anti-CD3/CD28 nem com PMA/ionomicina. Os ratos deficientes em T-bet não mostram resposta imunitária a uma infecção por L. major, estando aumentada a quantidade de citoquinas das TH2. Conhece-se a função do T-bet em células T das mucosas no aparecimento de patologias inflamatórias do intestino. Estudos no modelo animal mostram um agravamento da colite em ratos com SCID (severe combined immunodeficiency = imunodeficiência combinada severa) reconstituída após transdução retroviral do T-bet em células T CD4+CD26L+ e, ao inverso, a transferência de células T deficientes em T-bet não leva a uma indução da colite. 0 factor de transcrição T-bet induz de forma específica o desenvolvimento de células TH1 e controla a produção do INFy nestas células. Através da inibição do T-bet, muda-se o equilíbrio entre as células TH1 e TH2 a favor das células TH2 .
Outros factores de transcrição, que desempenham um papel na diferenciação em células TH1 ou células TH2 e que participam na origem das reacções inflamatórias crónicas e de doenças auto-imunes, apresentam uma expressão que é numa célula-alvo diferente da expressão numa célula de controlo e, de acordo com a invenção, também são empregues na concepção de desoxirribozimas específicas e/ou de ARNsi 14 para a aplicação terapêutica no caso de doenças inflamatórias crónicas: • STAT4, STAT5a e STAT1 (signal transducer and activator of transcription = transdutor de sinal e activador de transcrição) • c-Rel • CREB2 (cAMP response element-binding protein 2 = proteína de ligação ao elemento de resposta ao cAMP 2) • ATF-2, ATF-2 • Hlx • IRF-1 (interferon regulatory factor-1 = factor regulador do interferão 1) • c-Maf • NFAT (Nuclear factor of activated T cells = factor nuclear de células T activadas) • NIP45 (NF-AT interacting protein 45 = proteina de interacção NF-AT 45) • AP1 (Activator Protein 1 = proteína activadora 1) • Mel-18 • SKAT-2 (SCAN box, KRAB domain associated with a TH2 phenotype = SCAN box, domínio KRAB associado a um fenótipo TH2) • CTLA-4 (Cytolytic T lymphocyte-associated antigen 4_ = antigénio 4 associado aos linfócitos T citolíticos)
Outros factores das vias de transdução de sinal, responsáveis pela diferenciação e/ou pela expressão das citoquinas e que estão envolvidos no aparecimento de reacções inflamatórias crónicas e de doenças auto-imunes, apresentam uma expressão que é numa célula-alvo diferente da expressão numa célula de controlo e são igualmente empregues, de acordo com a invenção, na concepção de 15 desoxirribozimas específicas e/ou de ARNsi com vista à aplicação terapêutica em doenças inflamatórias crónicas: • Src quinase • Tec quinase
Rlk (Txk nos humanos)
Itk
Tec • RIBP (proteína de ligação Rlk/Itk) • PLCy (fosfolipase Cyl) • MAP quinase (proteína quinase activada por mitogénios)
ERK
JNK P38 • MKK (MAP quinase quinase) MKK1 MKK 2 MKK 3 MKK 4 MKK 6 MKK 7 • Rac2 • GADD45 (Growth arrest and DNA damage gene 45 = gene de interrupção do crescimento e de ADN danificado 45) GADD45p 16 GADD45y • SOCS (Suppressors of cytokine signalling = supressores da sinalização mediada por citoquinas) CIS (Cytokine-induced SH2 protein = proteína SH2 induzida por citoquinas) S0CS1 S0CS2 S0CS3 • JAK (Janus quinase) JAK1 JAK 3 • NIP45 (NF-AT interacting protein = proteína de interaeção NF-AT)
Em conformidade com a invenção, prepara-se um medicamento específico de células e/ou de tecidos e/ou de estádios patológicos, adequado ao tratamento de inflamações crónicas. O medicamento actua preferencialmente nos pontos de intervenção das cascatas complexas das desregulações imunológicas e citobiológicas na base das reacções inflamatórias crónicas e das doenças auto-imunes. Em termos preferenciais, trata-se de pontos de intervenção da regulação da diferenciação dos factores de transcrição envolvidos, como, por exemplo, o factor de transcrição T-bet específico das células TH1. 0 efeito terapêutico atingido consiste numa desactivação funcional de moléculas de ARNm por meio de desoxirribozimas específicas e/ou de 17 ARNsi. Esta estratégia proporciona uma série de vantagens em relação a preparações convencionais mas também de terapia genética: uma enorme especificidade e uma enorme selectividade, grande estabilidade das moléculas e uma antigenicidade desprezável. Consegue-se condições de base óptimas para uma terapia de longo prazo talhada à medida no caso de doentes com doenças inflamatórias crónicas.
Em conformidade com a invenção, arranja-se um processo para a produção de um medicamento especifico de células e/ou de tecidos e/ou de estádios de doença, que inclui as seguintes etapas: a) Identificação de moléculas de ácido ribonucleico, cuja expressão se distingue numa célula-alvo em relação à expressão numa célula de controlo. b) Concepção de moléculas específicas de ácido ribonucleico, que se ligam a moléculas de ácido ribonucleico da etapa a) e as desactivam em termos funcionais. c) Introdução das moléculas específicas de ácido ribonucleico da etapa b) em células-alvos. d) Formulação das moléculas específicas de ácido ribonucleico da etapa b) e/ou de uma célula-alvo da etapa c) num medicamento. 0 conceito "especifico de células e/ou de tecidos e/ou de estádios patológicos" significa, no sentido da presente invenção, que o medicamento produzido pelo processo de acordo com a invenção é, essencialmente, apenas eficaz no caso de um certo tipo de células (células-alvos) e/ou em certos tecidos ou órgãos e/ou em certos estádios patológicos, e tem uma influência desprezável noutras 18 células (células de controlo), noutros tecidos ou órgãos. Em termos preferenciais, o medicamento é eficaz em pelo menos 2/3 das células-alvos. Com maior preferência em pelo menos 80% e, com total preferência, em pelo menos 98% das células-alvos. Prefere-se ainda que o medicamento produza efeito em 10%, no máximo, das células-alvos, com maior preferência em 5% no máximo e, com total preferência, em < 1% das células de controlo. O conceito "identificação de moléculas de ácido ribonucleico, cuja expressão numa célula-alvo é diferente da expressão numa célula de controlo" abrange na presente invenção os seguintes pontos: i) células-alvos são células em tecidos e órgãos, que levam de forma conhecida ao aparecimento de uma patologia, contribuem para ela ou a reforçam, que sustentam os processos que mantêm a doença, contribuem para eles ou os reforçam, ou que levam a sequelas tardias de uma doença, contribuem para elas ou as reforçam. Destas fazem parte, por exemplo, as células que apresentam certos factores de transcrição, segregam hormonas, citoquinas e factores de crescimento específicos, ou células com receptores de superfície tipicos. ii) As células-alvos podem ser isoladas, por exemplo, por meio de tecnologias que se baseiem na ligação de anticorpos específicos. Aplica-se neste caso magnetic beads, que podem ser obtidos da empresa Miltenyi (Macs-System), Dynal (DynaBeads) ou BD-Bioscience (iMAG). Em alternativa, isto ocorre pela purificação celular através de anticorpos marcados com fluorescência em locais de células, por exemplo, da 19 empresa Cytomation (MOFLO) ou BD-Bioscience (FACS-Vantage). A pureza das células-alvos é de preferência de pelo menos 80%, com maior preferência de pelo menos 95% e, com total preferência, de pelo menos 99%. iii) Processos para o isolamento do ARN encontram-se descritos, por exemplo, in Sambrook and Russel, "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", 3.a edição, Cold Spring Harbor Laboratory (2001), Nova Iorque e Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular
Biology", John Wiley & Sons (1998), Nova Iorque. Além disso, é possível ao especialista médio utilizar kits (Silika-Technology) disponibilizados no mercado, por exemplo, o RNeasy Kit da empresa Qiagen, para o isolamento do ARN. Além disso, prefere-se purificar directamente o ARNm das células-alvos por meio da utilização de kits comerciais, por exemplo, das empresas Qiagen (Oligotex mRNA kit), Promega (PolyATractmRNA Isolation System) ou Miltenyl (mRNAdirect).
iv) A identificação de ARNm, diferentes entre si, ou seja, ARNm cuja expressão na célula-alvo é maior do que na célula de controlo, ocorre, por exemplo, com chips genéticos disponíveis no mercado (por exemplo, MWG, CLONTECH) ou com um processo de hibridização de filtro (ex.: Unigene) de acordo com as instruções do fabricante. Em alternativa, produz-se ARNm diferenciais por meio da hibridização substractiva de ADNc, originados anteriormente de ARNm por reacção de TR (RT-reaction). A estes processos conhecidos do especialista pertencem, por exemplo, o método SSH (empresa Clontech) ou o método RDA. A uma forma de aplicação também preferida pertence a combinação de tecnologia de chips e hibridização substractiva. A 20 identificação dos genes expressos de forma diferencial ocorre pela utilização da tecnologia de chips recorrendo a programas disponíveis no mercado, por exemplo, com o programa Vector Xpression da empresa InforMax. Aquando da utilização da hibridização substractiva, ocorre, depois do isolamento dos genes expressos de forma diferencial com base em processos convencionais familiares ao especialista, como a clonagem e o posterior sequenciamento (ver, por exemplo, Sambrook and Russel, "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", 3.a edição, Cold Spring Harbor Laboratory" (2001), Nova Iorque e Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons (1998), Nova Iorque), um alinhamento de sequências numa base de dados, como, por exemplo, o banco de genes (www.ncbi.nlm.nih.gov). A expressão na célula-alvo distingue-se da expressão numa célula de controlo. Numa forma de execução do processo segundo a invenção, a expressão na célula-alvo é maior do que a expressão numa célula de controlo, de preferência pelo menos 1,5 vezes maior. Numa forma de execução particularmente preferida, a expressão na célula-alvo é pelo menos 5 vezes maior do que a expressão numa célula de controlo e, numa forma de execução totalmente preferida, a expressão apenas pode ser detectada na célula-alvo e não na célula de controlo. O conceito "concepção de moléculas de ácido ribonucleico, que se ligam a moléculas de ácido ribonucleico da etapa a) e as desactivam em termos funcionais" abrange, no sentido da presente invenção, a utilização de enzimas de ADN desactivadoras de ARN (desoxirribozimas) e/ou ARN small- 21 interfering (ARNsi), que desactivam moléculas de ácido ribonucleico em termos funcionais. 0 conceito desoxirribozimas abrange, neste caso e segundo a invenção, moléculas de ADN que reconhecem e clivam de forma especifica a sequência-alvo do ácido nucleico, tanto ADN como ARN. Um modelo geral de desoxirribozimas é representado pelo modelo "10 - 23". As desoxirribozimas do modelo 10 - 23 - também denominadas "desoxirribozimas 10 -23" - têm um domínio 25 catalítico de 15 ácidos desoxirribonucleicos, tendo por vizinhos dois domínios de ligação do substrato. O comprimento dos domínios de ligação do substrato é variável, podendo ter o mesmo comprimento ou diferentes comprimentos. Numa execução preferida, o comprimento dos domínios de ligação do substrato vai de 6 a 14 nucleótidos. Numa execução particularmente preferida, os domínios de ligação do substrato são completamente complementares à região que está contígua ao ponto de clivagem. De modo a ligar o ARN-alvo e a clivá-lo, não é contudo imprescindível que a desoxirribozima seja totalmente complementar. Estudos in vitro mostram que as desoxirribozimas do tipo 10 - 23 clivam o ARNm-alvo em sequências de purina-pirimidina.
De modo a utilizar as desoxirribozimas no tratamento de doenças, é preferível que essas desoxirribozimas estejam estabilizadas tanto quanto possível contra degradação no organismo (no sangue, no meio intracelular, etc.). Uma execução preferida é a introdução de uma inversão 3'-3' numa ou em mais extremidades da desoxirribozima. O conceito inversão 3'-3' designa uma ligação covalente de fosfato entre os carbonos 3' do nucleótido terminal e do nucleótido adjacente. Este tipo de ligação contrasta com a ligação fosfato normal entre os carbonos 3' e 5' de nucleótidos 22 sequenciais. Em conformidade com isso, prefere-se que o nucleótido na extremidade 3' seja inverso ao dominio de ligação do substrato adjacente à extremidade 3' do dominio catalítico. Além das inversões, as desoxirribozimas podem conter nucleótidos modificados ou compostos nucleotídicos. Os nucleótidos modificados contêm, por exemplo, compostos de amidato de N3'-P5'-fósforo, substituições de 2'-0-metilo e compostos de péptidos-ácidos nucleicos. A sua produção é familiar ao especialista.
Embora os pontos de clivagem de desoxirribozimas potenciais existam de forma ubíqua, estes encontram-se com frequência bloqueadas pela estrutura secundária do ARN e logo inacessíveis às desoxirribozimas. Por conseguinte, selecciona-se dum pool de desoxirribozimas aquelas cujos pontos de clivagem são de livre acesso. Estas desoxirribozimas seleccionadas estão activas, clivam o ARNm-alvo e desactivam-no com isso em termos funcionais. A eficiência da clivagem do ARNm pelas diferentes desoxirribozimas é mostrada pelo teste individual de cada desoxirribozima ou por teste conjunto de várias desoxirribozimas em "ensaios multiplexing" (descrito, por exemplo, in Cairns et al., 1999). 0 conceito ARNsi abrange, segundo a invenção, moléculas de ARN compridas de 21 - 23 bases de cadeia dupla, que levam a uma degradação específica do ARNm-alvo complementar in vitro e também in vivo. 0 especialista conhece, com base na literatura (por exemplo, http://www.mpibpc.gwdg.de/abteilungen/100/105/índex.html, como produzir moléculas de ARNsi a partir da sequência do ARNm-alvo. 23 A probabilidade de que, entre três moléculas de ARNsi escolhidas, se encontre pelo menos uma altamente activa (inibição do ARN-alvo em pelo menos 80%) é indicada na literatura com o valor de pelo menos 70%. De um pool de moléculas de ARNsi, selecciona-se aquelas que levam a uma degeneração especifica do ARNm-alvo complementar tanto in vitro como in vivo. O conceito "introdução das moléculas especificas de ácido ribonucleico da etapa b) em células-alvos" abrange, no sentido da presente invenção, a transfecção de vectores, em particular de plasmideos, cosmideos, virus ou bacteriófagos, que contêm as moléculas de ácido ribonucleico específicas de acordo com a invenção acima descritas, nas células-alvos. Em termos preferenciais, os vectores adequam-se à transformação de células animais e humanas e permitem a integração das moléculas de ácido ribonucleico segundo a invenção. Os processos de transfecção, como, por exemplo, lipofecção por meio de DMRIE-C da empresa Invitrogen são conhecidos do especialista a partir da literatura. Em princípio, adequam-se a este fim também os vectores lipossómicos. As moléculas-alvos são factores de transcrição, células que segregam hormonas, citoquinas e factores de crescimento, mas também células que têm receptores expressos na superfície.
Como células de controlo recorre-se, no sentido da invenção, a células saudáveis do tecido alvo, células do mesmo tipo de outros compartimentos do mesmo doente ou também de indivíduos saudáveis. A cultura das células-alvos é feita em meios de cultura adaptados de forma correspondente às necessidades dessas células-alvos em termos de pH, temperatura, concentração salina, antibióticos, vitaminas, oligoelementos e arejamento. 0 conceito doente diz do mesmo modo respeito a humanos e animais vertebrados. Deste modo, o medicamento pode ser utilizado na medicina humana e veterinária. 0 conceito "formulação das moléculas especificas de ácido ribonucleico da etapa b) ou de uma célula-alvo da etapa c) num medicamento" inclui composições aceitáveis a nivel farmacêutico, que contenham modificações e "prodrugs", desde que não causem, depois de uma avaliação médica fiável, uma toxicidade excessiva, irritações ou reacções alérgicas no doente. 0 termo "prodrug" é relativo a compostos que são transformados para melhorar a absorção, como, por exemplo, através de hidrólise, no sangue.
Em termos preferenciais, a formulação permite que as moléculas específicas de ácido ribonucleico sejam ministradas ao doente na forma de uma composição aceitável a nivel farmacêutico, seja por via oral, rectal, parenteral, intravenosa, intramuscular ou subcutânea, intracisternal, intravaginal, intraperitoneal, intratecal, intravascular, local (pós, pomadas ou gotas) ou na forma de pulverização.
As formas de dosagem para a administração local do medicamento desta invenção incluem pomadas, pós, pulverizadores ou inaladores. 0 componente activo é misturado sob condições estéreis com uma substância de suporte aceitável a nivel fisiológico e com possíveis conservantes, tampões ou agentes de expansão, em função do necessário. 0 tipo de dosagem é determinado pelo médico responsável pelo tratamento em conformidade com os factores 25 clínicos. 0 especialista sabe que o tipo de dosagem depende de diversos factores, tais como, por exemplo, tamanho corporal, peso, superfície corporal, idade, sexo ou do estado geral de saúde do doente, mas também do meio a ser administrado de forma especial, da duração e do tipo de administração e de outros medicamentos, que sejam possivelmente ministrados em paralelo. 0 medicamento produzido pelo processo de acordo com a invenção apresenta uma elevada especificidade relativamente a doente, doença, estádio ou fase. Provoca uma intervenção específica das células e é específico de compartimentos e órgãos. Não surgem reacções ou apenas muito poucas do sistema imunitário contra o medicamento, e o perfil de efeitos secundários fica numa relação aceitável em relação ao grau de gravidade, ao prognóstico e à evolução da doença. 0 medicamento pode ser aplicado na terapia contra um conjunto de grupos de patologias relacionados com inflamações crónicas, como, por exemplo, doenças auto-imunes, doenças do foro reumático (manifestações, por exemplo, na pele, nos pulmões, rins, sistema vascular, sistema nervoso, tecido conjuntivo, sistema de locomoção, sistema endócrino), reacções alérgicas do tipo imediato e asma, doenças pulmonares obstrutivas crónicas (DPOC), arteriosclerose, psoríase e eczema de contacto, assim como contra reacções de rejeição crónicas após transplante de órgãos e de medula óssea.
Exemplo a) Identificação de moléculas de ácido ribonucleico, cuja expressão muna célula-alvo é diferente da expressão numa célula de controlo 26 i) como células-alvos, emprega-se as células CD4+ naives responsáveis pelo aparecimento de reacções inflamatórias crónicas. ii) As células-alvos CD4+ são isoladas através de magnetic beads (empresa Miltenyi (Macs-System) Dynal (DynaBeads) ou BD-Bioscience (iMAG), em alternativa por meio de anticorpos marcados com fluorescência em locais de células, por exemplo, da empresa Cytomation (MOFLO) ou BD-Bioscience (FACS-Vantage). iii) 0 isolamento do ARN ocorre por um método padrão, ver Sambrook and Russell, "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", 3.a edição, Cold Spring Harbor Laboratory (2001), Nova Iorque e Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons (1998), Nova Iorque. Em alternativa, emprega-se um kit RNeasy da empresa Qiagen, ou é feito o isolamento directo do ARNm de células-alvos CD4+ com o Oligotex mRNA Kit da empresa Qia-20 gen de acordo com as instruções do fabricante. iv) A identificação de ARNm, que são distintos de forma diferencial, ou seja, ARNm cuja expressão na célula-alvo é maior do que na célula de controlo, é feita por meio de chips de genes (por exemplo, MWG, CLONTECH) e a identificação dos genes expressos de forma diferencial é feita por meio do Programa Vector Xpression da empresa Infor-Max.
Os processos de hibridização por filtro (por exemplo, Unigene) de acordo com as instruções do fabricante. O isolamento dos genes expressos de forma diferencial inclui clonagem, sequenciamento (de acordo com instruções padrão, ver, por exemplo, Sambrook and Russell, "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", 3. a 27 edição, Cold Spring Harbor Laboratory (2001) e o alinhamento de sequências na base de dados de genes (www.ncbi.nlm.nih.gov). A expressão do T-bet distingue-se na célula-alvo (célula TH1) comparativamente à expressão numa célula de controlo (por exemplo, célula ThO) . b) Concepção de moléculas especificas de ácido ribonucleico, que se ligam às moléculas de ácido ribonucleico da etapa a) e as desactivam em termos funcionais A Figura 3 mostra o pool tdl - td7 8, de acordo com a invenção, de desoxirribozimas especificas contra o ARNm do T-bet. As desoxirribozimas apresentam um comprimento total de 33 nucleótidos, indo o domínio catalítico central de 15 nucleótidos (em letras minúsculas) corresponder ao domínio catalítico da desoxirribozima 10 - 23 conhecida (Figura 2). Este domínio catalítico tem adjacentes dois domínios de ligação do substrato, esquerdo e direito, compostos por 9 nucleótidos, respectivamente (em letras maiúsculas). A sequência nucleotídica dos domínios de ligação do substrato esquerdo e direito é distinta e varia nas desoxirribozimas tdl a td78, ocorrendo uma ligação específica diferente por meio de emparelhamento de Watson-Crick ao ARNm de T-bet. A Figura 2 mostra o modelo geral de ligação da desoxirribozima 10 - 23 a um ARN-alvo opcional marcado com N, indicando a seta o ponto de clivagem no ARNm-alvo.
Visto saber-se com base na literatura que as desoxirribozimas separam de forma eficaz o ARNm-alvo em ligações de purina-uracilo na forma de ligações de purina- 28 citosina, constrói-se preferencialmente 5 desoxirribozimas que separam em ligações de purina-uracilo. 0 modelo mostrado na Figura 2 pode ser transferido em termos do seu funcionamento para a ligação das desoxirribozimas tdl a td78 ao ARNm do T-bet.
As desoxirribozimas tdl a td78 são empregues sem modificação em experiências in vitro, em experiências em culturas de células providas de modificações (disponíveis no mercado pela empresa Eurogentec). Como modificações para estabilizar e proteger, emprega-se: 1) uma timidina inversa estabilizadora na extremidade 3' 2) uma marcação FAM na extremidade 5' para avaliar a eficiência de transfecção das células por meio de análise FACS.
Com vista à representação das propriedades de clivagem das desoxirribozimas e à desactivação funcional do ARNm-alvo do ARNm de T-bet, a transcrição in vitro do ARNm de T-bet de sangue completo EDTA humano é realizada por meio do QIAamp-RNA-Blood-Mini-Kit (Qiagen, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. A Figura 4 mostra a sequência nucleotidica do T-bet humano, como se pode ver nas entradas da base de dados [PubMed (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Nucleotid e) ] n.°: NM_013351, sequência 1. A transcrição reversa tem lugar com o primer de avanço CGGCCCGCTGGA-GAGGAAGC e o primer reverso CACACACCCACACACAACC de acordo com os procedimentos padrão (ThermoScript da Invitrogen), amplificando-se um produto PCR com um comprimento de 2 450 nucleótidos. Este produto PCR é clonado por meio de processos padrão no plasmideo pBluescript-SK (Stratagene) e 29 sequenciado para fins de teste. A Figura 4 mostra uma comparação da sequência de ácidos nucleicos do T-bet n.° NM_013351 (sequência 1) e da sequência sequenciada (sequência 2). Neste caso, verifica-se que as duas sequências não são completamente idênticas, estando em vez trocadas bases individuais. A sequência de ácidos nucleicos 2 do T-bet da Figura 4 constitui nesta invenção a base da construção de desoxirribozimas contra o ARNm do T-bet. A Figura 4A mostra a sequência nucleotidica da sequência 1 do gene do T-bet humano da Figura 4 e estão ai identificados com fundo a cinzento por sua vez dois nucleótidos GT ou AT, entre os quais se encontram outros pontos de clivagem de desoxirribozima potenciais. A produção do ARNm do T-bet é feita pela linearização do plasmideo que contém o T-bet pBluescript-SK, por clivagem com a enzima de restrição Xba I (Fermentas) e por transcrição in vitro de acordo com as instruções do fabricante (Ambion) . O ARNm do T-bet encontra-se com um comprimento de 2 550 nucleótidos ao todo.
As experiências de clivagem in vitro do ARNm do T-bet com as desoxirribozimas (tdl a td78) são realizadas num volume de 10 pL da seguinte composição de reacção: 50 mM Tris, pH = 7,4, 150 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 0,25 μΜ desoxirribozimas e 0, 025 μΜ de ARNm de GATA-3 transcrito in vitro (numa relação de substrato para desoxirribozimas de 1 : 10) . As reacções são incubadas nos 37°C durante os períodos de tempo indicados, respectivamente. Através da adição de RNA-Sample-Loading-Buffer (Sigma) contendo formamida e EDTA, a reacção é interrompida. As amostras desnaturadas são separadas em géis de agarose-TAE a 1,3% e são analisadas no 30 transiluminador de UV. A Figura 5 mostra, como resultado da electroforese em gel, a clivagem do ARNm-alvo do T-bet com desoxirribozimas modificadas [td54-M (vestígio 3) , td69-M (vestígio 4) , td70-M (vestígio 5) ] . O vestígio 2 contém como controlo ARNm-alvo do T-bet sem a adição de desoxirribozima. Um padrão de comprimento também veiculado (vestígio M) mostra tamanhos de banda de 2 000 bp e 3 000 bp. As setas indicam em A as bandas com o substrato (neste caso ARNm de T-bet) e B um dos dois produtos de clivagem (o outro produto de clivagem não pode ser visto nesta figura). A comparação entre todas as 78 desoxirribozimas mostra que as td54, td69 e td70 são particularmente activas, em que as modificações não reduzem a eficácia dessas desoxirribozimas. A tabela seguinte mostra a classificação das desoxirribozimas tdl a td78 contra o ARNm de T-bet 3 em 4 grupos. Esta classificação por grupos é feita com base em testes de actividade realizados in vitro das desoxirribozimas contra ARNm de T-bet. O grupo 1: grande actividade de clivagem, grupo 2: actividade média de clivagem, grupo 3: fraca actividade de clivagem e grupo 4: sem actividade de clivagem mensurável.
Grupo td Actividade contra ARNm de T-bet 1 54, 69, 70 Grande actividade de clivagem 2 21, 24, 28, 29, 30, 45, 71, 72, 77, 78 Actividade de clivagem média 3 13, 19, 22, 23, 25, 27, 31, 32, 44, 46, 47, 48, 50, 51, 53, 55, 56, 57, 58, 60, 61, 62, 65, 67, 68, 73, 74, 75 Fraca actividade de clivagem 31 4 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, Sem actividade de 14, 15, 16, 17, 18, 20, 26, 33, 34, clivagem 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 c) Introdução das moléculas especificas de ácido ribonucleico da etapa b) em células-alvos
Emprega-se as desoxirribozimas td54, td69 e td70, com e sem as modificações descritas, em células-alvos.
Nesse intuito, faz-se a cultura de células Jurkat E6.1 (human acute T cell leukemia cells) em meio RPMI com 100 U/mL de penicilina, 0,1 mg/mL de estreptomicina e 10% de FKS nos 37°C, em atmosfera de CO2 a 5% humidificada. As transfecções são realizadas em placas de 6 cavidades. Para isso, transfere-se 2 x 106 células Jurkat E6.1 para meio de cultura celular Opti-MEM I (Invitrogen) e transfecta-se por meio de DMRIE-C (Invitrogen) com as desoxirribozimas modificadas (0,3 μΜ) (segundo as instruções do fabricante Invitrogen). Passadas 10 horas de incubação na incubadora sob as condições anteriormente referidas, adiciona-se meio RPMI (com os aditivos acima indicados) e continua-se a incubação durante mais 14 horas. As células são lavadas com meio Opti-MEM e depois de novo transfectadas de acordo com o protocolo acima descrito. Após cada transfecção, avalia-se a eficiência de transfecção por meio de análise FACS.
Após a transfecção das células Jurkat E6.1, determina-se quantitativamente a quantidade de ARNm de T-bet relativamente a expressão do ARNm de GAPDH por meio de PCR em tempo real (LightCycler, Roche), de modo a obter informações reais acerca da eficácia in vitro das 32 desoxirribozimas.
Para fins de análise do LightCycler, purifica-se o ARN das células Jurkat E6.1 por meio do RNeasy Mini Kit (Qiagen, Alemanha) e normaliza-se seguidamente por fotometria. Após transcrição reversa com SuperScript II (Gibco) de acordo com as instruções do fabricante, segue-se a análise quantitativa do T-bet e do ARNm de GAPDH no LightCycler. 0 volume total para a PCR é de 20 pL, em que estão contidos 1 pL de ADN, 1 pL (0,5 pM) de primer sentido e primer anti-sentido cada, e 10 pL de QuantiTect-SYBR-Green-PCR-Master-Mix (Qiagen, Alemanha). Os primers de PCR utilizados para o T-bet são: sentido 5'-CCCACCATGTCCTACTACCG-3'; anti-sentido 5' -GCAATCTCAGTCCACACCAA-3' . Os primers de PCR para GAPDH são: sentido 5'-TCTTCTTTTGCGTCGCCAG-3' e anti-sentido 5'-AGCCCCAGCCTTCTCCA-3'. As condições de PCR são: desnaturação (15 min, 95°C), amplificação (15 s nos 95°C, 25 s nos 59°C, 25 s nos 72°C de 50 ciclos) e depois extensão final de 2 min nos 72°C. A curva de fusão que se segue é gerada do seguinte modo: 0 s nos 95°C, 15 s nos 60°C, e depois aumenta-se a temperatura em etapas de 0,2°C para os 97°C, medindo-se ao mesmo tempo em continuo a fluorescência. A curva de fusão serve para fins de controlo interno, visto que todos os produtos PCR têm uma temperatura de fusão especifica. O SYBR-Green é um corante fluorescente (contido no QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix), que se liga à cadeia dupla de ADN. Se durante a extensão ocorrer a duplicação do ADN, o SYBR-Green ligar-se-lhe-á e gerará um sinal de fluorescência dependente de ligação, que é detectado pelo LightCycler na extremidade de cada extensão. Quanto maior a quantidade de matéria-prima, mais cedo se detecta o aumento 33 significativo da fluorescência. 0 software do LightCycler representa em gráfico niveis registados de intensidade de fluorescência contra os ciclos.
Na Fig. 6 encontram-se representadas curvas de amplificação do LightCycler de ARNm de T-bet e de GAPDH, após o tratamento de células Jurkat E6.1 com as desoxirribozimas td54m, td69m e td70m, em comparação com a desoxirribozima sem sentido. 0 respectivo "Crossing point" (Ct), definido como ciclo PCR, no qual a fluorescência se distingue pela primeira vez de forma significativa da fluorescência de fundo, é determinado manualmente com o método de Fit-Point do software do LightCycler. A quantificação relativa do ARNm de T-bet e de GAPDH em células tratadas com desoxirribozimas, em comparação com células tratadas com desoxirribozima sem sentido, é realizada de acordo com as instruções descritas no "User Bulletin" #2 (ABI Prism 7 700 Sequence detection System User Bulletin #2 (2001) Relative quantification of gene expression http://does.appliedbiosystems.com/pebiodocs/04303859.pdQf). Neste caso, a quantidade de ARNm de T-bet da experiência de controlo é definida para igual a 100%. Os dados da quantificação relativa encontram-se representados em gráfico na Fig. 7.
Em comparação com o tratamento com a desoxirribozima sem sentido, verifica-se que a desoxirribozima td69m leva a uma supressão de 81,3%, e a desoxirribozima td70m a uma supressão de 81,0%, enquanto a desoxirribozima td54m não produz qualquer efeito de supressão sobre o ARNm de T-bet. 34
Isso significa que a desoxirribozima td54m não está activa in vivo, enquanto as desoxirribozimas td69m e td70m também desactivam em meio celular o ARNm de T-bet. A redução especifica do ARNm de T-bet in vivo pelas desoxirribozimas td69m e td70m representa assim uma ferramenta terapêutica eficaz no tratamento de doenças inflamatórias crónicas. d) Formulação do ácido ribonucleico especifico da etapa b) e/ou de uma célula-alvo da etapa c) num medicamento A análise de diversas desoxirribozimas com dominio de ligação do substrato especifico de T-bet mostra que as desoxirribozimas td69 e td70 inibem especificamente a expressão do T-bet in vivo e se adequam, como ácido ribonucleico especifico, à produção de um medicamento especifico de células e/ou de tecidos e/ou de estádios patológicos.
Para isso, a td69 (GGCAATGAAggctagctacaacgaTGGGTTTCT) ou a td7 0 (TCACGGCAAggctagetacaacgaGAACTGGGT) ou células transfectadas com a td69m ou a td70m são providas, numa composição farmacêutica, de um veiculo aceitável a nivel farmacêutico, por exemplo, lipossomas ou polímeros biodegradáveis.
Em alternativa às desoxirribozimas, propõe-se para a inibição específica da expressão do T-bet e para a produção de um medicamento específico de células e/ou de tecidos e/ou de estádios patológicos, a utilização de ARNsi.
Preferencialmente, trata-se de ARNsi para a inibição do T-bet humano. A produção do ARNsi é conhecida do especialista 35 e encontra-se descrita na literatura. Um exemplo de sequência de ARNsi:
Fonte Sequências de ácidos nucleicos T-bet humano Cadeia sentido: UCAGCACCAGACAGAGAUGdTdT Cadeia anti-sentido: CAUCUCUGUCUGGUGCUGAdTdT É evidente ao especialista que, com o saber da presente invenção, também se possa produzir facilmente desoxirribozimas especificas ou ARNsi como medicamento no caso de doenças inflamatórias crónicas e de doenças auto-imunes, que estejam dirigidas contra outros factores de transcrição, os quais desempenham um papel na diferenciação em células TH1 ou em células TH2, por exemplo, STAT4, STAT5a, STAT1, c-Rel, CREB2, ATF-2, ATF-2, Hlx, IRF-1, c-
Maf, NFAT, NIP45, AP1, Mel-18, SKAT-2, CTLA-4 ou contra outros factores das vias de transdução de sinal na diferenciação e/ou na expressão de citoquinas, por exemplo, Src quinase, Tec quinase, Rlk (Txk nos humanos) , Itk, Tec, RIBP, PLCy, MAP quinase, ERK, JNK, P38, MKK, MKK1, MKK2, MKK3, MKK4, MKK6, MKK7, Rac2, GADD45, ΘΑΌϋ45β, GADD45y, SOCS, CIS, S0CS1, S0CS2, S0CS3, JAK, JAK1, JAK3, NIP45.
Estas proteínas apresentam uma expressão que é maior numa célula-alvo do que a expressão numa célula de controlo.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Philipps-Universitát Marburg <120> Processo para a produção de um medicamento especifico de células e/ou de tecidos e/ou de estádios patológicos <130> desconhecido 36 <140> PCT/DE2004/002197 <141> 2004-10-01 <150> DE 10346487.5 <151> 2003-10-02 <160> 80 <17 0> Patentln version 3 <210> 1 <211> 33 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> desoxirribozima tdl contra ARNm de T-bet <222> (1)..(33) <4 0 0> 1 tggcttctag gctagctaca acgagccctc gtc 33
<210> 2 <211> 33 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> desoxirribozima td2 contra ARNm de T-bet <222> (1)..(33) <400> 2 37 gggctctgag gctagctaca acgagcctgg ctt 37 33 <210> 3 <211> 33 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> desoxirribozima td3 contra ARNm <222> (D . . (33) <4 0 0> 3 gggaccccag gctagctaca acgacggagc ccg <210> 4 <211> 33 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> desoxirribozima td4 contra ARNm <222> (D · · (33) <4 0 0> 4 ggtgggggag gctagctaca acgacccacc gga <210> 5 <211> 33 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> desoxirribozima td5 contra ARNm 33 33 38 <222> (1)..(33) < 4 Ο Ο > 5 ggcgggggag gctagctaca acgaccgagg gcc 33 <210> 6 <211> 33 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> desoxirribozima td6 contra ARNm de T-bet <222> (1)..(33) <4 0 0> 6 gggctgggag gctagctaca acgagggcag gga 33 <210> 7 <211> 33 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> desoxirribozima td7 contra ARNm de T-bet <222> (1)..(33) <400> 7 cgtcgaggag gctagctaca acgaccgccc ctc 33
<210> 8 <211> 33 <212> ADN <213> Homo sapiens 39 <22 0> <221> desoxirribozima td8 contra ARNm de T-bet <222> (D · · (33) <4 0 0> 8 gggctggcag gctagctaca acgacttccc gta <210> 9 <211> 33 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> desoxirribozima td9 contra ARNm de T-bet <222> (D · · (33) <4 0 0> 9 cgatgcccag gctagctaca acgaccgggg cgg <210> 10 <211> 33 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> φ <221> desoxirribozima tdlO contra ARNm de T-bet <222> (D . . (33) <4 0 0> 10 gctccacgag gctagctaca acgagcccat ccg 33 <210> 11 40 <211> 33 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> desoxirribozima tdl 1 contra ARNm <222> (D .. _ (33) <4 0 0> 11 ccggctccag gctagctaca acgagatgcc cat <210> 12 <211> 33 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> desoxirribozima tdl2 contra ARNm <222> (D .. _ (33) <4 0 0> 12 tctccgcaag gctagctaca acgaccggct cca <210> 13 <211> 33 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> desoxirribozima tdl3 contra ARNm <222> (D .. (33) <4 0 0> 13 ccgtcagcag gctagctaca acgagtctcc gca 33 33 33 41 <210> 14 <211> 33 <212> ADN <213> Homo s <22 0> <221> desoxirribozima tdl4 contra ARNm de T-bet <222> (1)..(33) <4 0 0> 14 tccccggcag gctagctaca acgacggctc ggt 33
<210> 15 <211> 33 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> desoxirribozima tdl5 contra ARNm de T-bet <222> (1)..(33) <4 0 0> 15 cccccgcgag gctagctaca acgagctcgt ccg 33
<210> 16 <211> 33 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> desoxirribozima tdl6 contra ARNm de T-bet <222> (1)..(33) 42 <4 0 0> 16 gtagggagag gctagctaca acgacccagg ctg <210> 17 <211> 33 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> desoxirribozima tdl7 contra ARNm <222> (D .. (33) <4 0 0> 17 gggcgggcag gctagctaca acgacaaggc gcc <210> 18 <211 > 33 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> desoxirribozima tdl8 contra ARNm <222> (D .. (33) <4 0 0> 18 cgggaaggag gctagctaca acgatcgccc gcg <210 > 19 <211> 33 <212> ADN <213> Homo sapiens 33 33 <22 0> 33 43 <221> desoxirribozima tdl9 contra ARNm de T-bet <222> (1)..(33) <4 0 0> 19 tagtcctcag gctagctaca acgagcggcc ccg 33
<210> 20 <211> 33 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> desoxirribozima td20 contra ARNm de T-bet <222> (1)..(33) <400> 20 tccccgacag gctagctaca acgactccag tcc 33
<210> 21 <211> 33 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> desoxirribozima td21 contra ARNm de T-bet <222> (1)..(33) <400> 21 tttccccgag gctagctaca acgaacctcc agt 33
<210> 22 <211> 33 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> desoxirribozima td22 contra ARNm de T-bet <222> (1)..(33) <400> 22 tgagcgcgag gctagctaca acgacctcag ttt 33 <210> 23 <211> 33 44
<212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> desoxirribozima td23 contra ARNm de T-bet <222> (1)..(33) <400> 23 ggaccacaag gctagctaca acgaaggtgg ttg 33
<210> 24 <211> 33 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> desoxirribozima td24 contra ARNm de T-bet <222> (1)..(33) <400> 24 cttggaccag gctagctaca acgaaacagg tgg 33 <210> 25 <211> 33 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> desoxirribozima td25 contra ARNm de T-bet <222> (D · · (33) <4 0 0> 25 aaacttggag gctagctaca acgacacaac agg <210> 26 <211> 33 <212> ADN <213> Homo sapiens 45 <22 0> <221> desoxirribozima td26 contra ARNm de T-bet <222> (1)..(33) <400> 26 33 ctgattaaag gctagctaca acgattggac cac
<210> 27 <211> 33 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> desoxirribozima td27 contra ARNm de T-bet <222> (1)..(33) <400> 27 33 tggtgctgag gctagctaca acgataaact tgg
<210> 28 <211> 33 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> desoxirribozima td28 contra ARNm de T-bet <222> (1)..(33) <400> 28 tgatgatcag gctagctaca acgactctgt ctg <210> 29 <211> 33 33 46
<212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> desoxirribozima td29 contra ARNm de T-bet <222> (1)..(33) <400> 29 tggtgatgag gctagctaca acgacatctc tgt 33
<210> 30 <211> 33 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> desoxirribozima td30 contra ARNm de T-bet <222> (1)..(33) <400> 30 gcttggtgag gctagctaca acgagatcat ctc 33
<210> 31 <211> 33 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> desoxirribozima td31 contra ARNm de T-bet <222> (1)..(33) <400> 31 33 atgggaacag gctagctaca acgaccgccg tcc 47 <210> 32 <211 > 33 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> desoxirribozima td32 contra ARNm <222> (D · · (33) <4 0 0> 32 gaatgggaag gctagctaca acgaatccgc cgt <210 > 33 <211> 33 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> desoxirribozima td33 contra ARNm <222> (D . . (33) <4 0 0> 33 tgacaggaag gctagctaca acgagggaac ate <210> 34 <211> 33 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> desoxirribozima td34 contra ARNm <222> (D · · (33) 33 33 48 <4Ο0> 34 agtaaatgag gctagctaca acgaaggaat ggg 33
<210> 35 <211> 33 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> desoxirribozima td35 contra ARNm de T-bet <222> (1)..(33) <400> 35 cacagtaaag gctagctaca acgagacagg aat 33 <210> 36 <211> 33
<212> DNA <213> Homo sapiens <22 0> <221> desoxirribozima td36 contra ARNm de T-bet <222> (1)..(33) <400> 36 gcccggccag gctagctaca acgaagtaaa tga 33
<210> 37 <211> 33 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> desoxirribozima td37 contra ARNm de T-bet 49 <222> (1) .. (33) <4 0 0> 37 ccacaaacag gctagctaca acgacctgta gtg <210 > 38 <211> 33 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> desoxirribozima td38 contra ARNm <222> (D .. (33) <4 0 0> 38 gtccacaaag gctagctaca acgaatcctg tag <210> 39 <211> 33 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> desoxirribozima td39 contra ARNm <222> (D .. (33) <4 0 0> 39 ccacgtccag gctagctaca acgaaaacat cct 33 33 <210> 40 <211> 33 33 50 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> desoxirribozima td4 0 contra ARNm <222> (D · · (33) <4 0 0> 40 ccaagaccag gctagctaca acgagtccac clclcl <210> 41 <211> 33 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> desoxirribozima td41 contra ARNm <222> (D · ·_ (33) <4 0 0> 41 ccaccaagag gctagctaca acgacacgtc cac <210> 42 <211> 33 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> desoxirribozima td42 contra ARNm <222> (D · · (33) <4 0 0> 42 gctggtccag gctagctaca acgacaagac cac 33 33 33 51 <210> 43 <211 > 33 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> desoxirribozima td43 contra ARNm <222> (D · · (33) <4 0 0> 43 gctctggtag gctagctaca acgacgccag tgg <210> 44 <211 > 33 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> desoxirribozima td44 contra ARNm <222> (D · · (33) <4 0 0> 44 ctgcacccag gctagctaca acgattgccg ctc <210 > 45 <211> 33 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> desoxirribozima td45 contra ARNm <222> (D · · (33) 33 33 52 <4 0 0> 45 cacactgcag gctagctaca acgaccactt gcc <210> 46 <211> 33 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> desoxirribozima td46 contra ARNm <222> (D .. (33) <4 0 0> 46 ctttccacag gctagctaca acgatgcacc cac <210> 47 <211 > 33 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> desoxirribozima td47 contra ARNm <222> (D .. (33) <4 0 0> 47 gcctttccag gctagctaca acgaactgca ccc <210 > 48 <211> 33 <212> ADN <213> Homo sapiens 33 33 <22 0> 33 53 <221> desoxirribozima td4 8 contra ARNm <222> (D . . (33) <4 0 0> 48 ttcctggcag gctagctaca acgagctgcc ctc <210 > 49 <211> 33 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> desoxirribozima td4 9 contra ARNm <222> (D . ·_(33) <4 0 0> 49 gtggacgtag gctagctaca acgaaggcgg ttt <210> 50 <211> 33 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> deso: xirribozima td50 contra ARNm <222> (D . . (33) <4 0 0> 50 ccgggtggag gctagctaca acgagtacag gcg <210 > 51 <211> 33 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> desoxirribozima td51 contra ARNm <222> (D . . (33) <4 0 0> 51 cctggcgcag gctagctaca acgaccagtg cgc 33 33 33 33 54
<210> 52 <211> 33 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> desoxirribozima td52 contra ARNm de T-bet <222> (1)..(33) <400> 52 caaatgaaag gctagctaca acgattcctg gcg 33
<210> 53 <211> 33 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> desoxirribozima td53 contra ARNm de T-bet <222> (1)..(33) <400> 53 tttcccaaag gctagctaca acgagaaact tcc 33
<210> 54 <211> 33 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> desoxirribozima td54 contra ARNm de T-bet <222> (1)..(33) <400> 54 attgttggag gctagctaca acgagccccc ttg 33 <210> 55 <211> 33 55
<212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> desoxirribozima td55 contra ARNm de T-bet <222> (1)..(33) <400> 55 tgggtcacag gctagctaca acgatgttgg acg 33
<210> 56 <211> 33 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> desoxirribozima td56 contra ARNm de T-bet <222> (1)..(33) <400> 56 tctgggtcag gctagctaca acgaattgtt gga 33
<210> 57 <211> 33 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> desoxirribozima td57 contra ARNm de T-bet <222> (1)..(33) <400> 57 gcacaatcag gctagctaca acgactgggt cac 33 56 <210> 58 <211 > 33 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> desoxirribozima td58 contra ARNm <222> (D · · (33) <4 0 0> 58 ggagcacaag gctagctaca acgacatctg ggt <210 > 59 <211> 33 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> desoxirribozima td5 9 contra ARNm <222> (D . . (33) <4 0 0> 59 actggagcag gctagctaca acgaaatcat ctg <210> 60 <211> 33 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> desoxirribozima td60 contra ARNm <222> (D · · (33) 33 33 57 <4 0 0> 60 atggagggag gctagctaca acgatggagc aca <210> 61 <211> 33 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> desoxirribozima td61 contra ARNm <222> (D .. (33) <4 0 0> 61 tggtacttag gctagctaca acgaggaggg act <210 > 62 <211> 33 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> desoxirribozima td62 contra ARNm <222> (D .. (33) <4 0 0> 62 gggctggtag gctagctaca acgattatgg agg <210> 63 <211> 33 <212> ADN <213> Homo sapiens 33 33 33 58 <22 0> <221> desoxirribozima td63 contra ARNm de T-bet <222> (1)..(33) <400> 63 33 tcaacgatag gctagctaca acgagcagcc ggg
<210> 64 <211> 33 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> desoxirribozima td64 contra ARNm de T-bet <222> (1)..(33) <400> 64 33 cctcaacgag gctagctaca acgaatgcag ccg
<210> 65 <211> 33 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> desoxirribozima td65 contra ARNm de T-bet <222> (1)..(33) <400> 65 tcacctcaag gctagctaca acgagatatg cag <210> 66 <211> 33 33 59
<212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> desoxirribozima td66 contra ARNm de T-bet <222> (1)..(33) <4 0 0> 6 6 cgtcgttcag gctagctaca acgactcaac gat 33
<210> 67 <211> 33 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> desoxirribozima td67 contra ARNm de T-bet <222> (1)..(33) <400> 67 gtaaagatag gctagctaca acgagcgtgt tgg 33 <210> 68 <211> 33
<212> DNA <213> Homo sapiens <22 0> <221> desoxirribozima td68 contra ARNm de T-bet <222> (1)..(33) <4 0 0> 68 33 aagtaaagag gctagctaca acgaatgcgt gtt 60 <210> 69 <211> 33 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> desoxirribozima <222> (D . . (33) <4 0 0> 69 ggcaatgaag gctagctaca <210> 70 <211> 33 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> desoxirribozima <222> (D · · (33) <4 0 0> 70 tcacggcaag gctagctaca <210> 71 <211> 33 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> desoxirribozima <222> (D . . (33) <4 0 0> 71 33 33 aggcagtcag gctagctaca acgaggcaat gaa 33 61 <210> 72 <211 > 33 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> desoxirribozima td72 contra ARNm <222> (D · · (33) <4 0 0> 72 atctcggcag gctagctaca acgatctggt agg <210 > 73 <211> 33 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> desoxirribozima td7 3 contra ARNm <222> (D . . (33) <4 0 0> 73 gctgagtaag gctagctaca acgactcggc att <210> 74 <211> 33 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> desoxirribozima td7 4 contra ARNm <222> (D · · (33) 33 33 62 <4 0 0> 74 tattatcaag gctagctaca acgatttcag ctg <210> 75 <211> 33 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> desoxirribozima td75 contra ARNm <222> (D .. (33) <4 0 0> 75 gggttattag gctagctaca acgacaattt tca <210 > 76 <211> 33 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> desoxirribozima td76 contra ARNm <222> (D .. (33) <4 0 0> 76 aaggggttag gctagctaca acgatatcaa ttt <210 > 77 <211> 33 <212> ADN <213> Homo sapiens 33 33 <22 0> 33 <221> desoxirribozima td77 contra ARNm de T-bet <222> (1)..(33) <400> 77 ctcccggaag gctagctaca acgacctttg gca
<210> 78 <211> 33 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> desoxirribozima td78 contra ARNm de T-bet <222> (1)..(33) <400> 78 gtacatggag gctagctaca acgatcaaag ttc 33
<210> 79 <211> 2588 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> Local de ligação da td54 <222> (952) ..(970) <22 0> <221> Local de ligação da td69 <222> (1096) . . (1114) <22 0> <221> Local de ligação da td70 64 <222> (1100) .. (1118) <400> 79 cggcccgctg gagaggaagc ccgagagctg ccgcgcgcct gccggacgag ggcgtagaag 60 ccaggcgtca gagcccgggc tccggtgggg tcccccaccc ggccctcggg tcccccgccc 120 cctgctccct gcccatccca gcccacgcga ccctctcgcg cgcggagggg cgggtccteg 180 acggctacgg gaaggtgcca gcccgccecg gatgggcate gtggagccgg gttgcggaga 240 catgctgacg ggeaccgage cgatgccggg gagcgacgag ggccgggcgc ctggcgccga 300 cccgeagcac cgctacttct acccggagcc gggegcgcag gacgcggacg agcgtcgcgg 360 gggcggcagc ctggggtctc cctacccggg gggcgccttg gtgcccgccc cgccgagccg 420 cttccttgga gcctacgcct acccgccgcg accccaggcg gccggcttcc ccggcgcggg 480 cgagtccttc ccgccgcccg cggaegccga gggctaccag ccgggcgagg gctacgccgc 540 cccggacccg cgcgccgggc tctacccggg gccgcgtgag gactacgcgc tacccgcggg 600 actggaggtg tcggggaaac tgagggtcgc gctcaacaac cacctgttgt ggtccaagtt 660 taatcagcac cagacagaga tgatcatcac caagcaggga cggcggatgt tccçattcct 720 gtcatttact gtggccgggc tggagcccac cagccactac aggatgtttg tggacgtggt 780 cttggtggac cagcaccact ggcggtacca gagcggcaag tgggtgcagt gtggaaaggc 840 cgagggcagc atgccaggaa accgcctgta cgtccacccg gactccccca acacaggagc 900 gcactggatg egecaggaag tttcatttgg gaaactaaag ctcacaaaca acaagggggc $60 gtccaacaat gtgaeceaga tgattgtgct ccagtccctc cataagtacc agccccggct 1020 geatatcgtt gaggtgaacg acggagagcc agaggcagcc tgeaacgett ccaacacgca 1080 tatctttact ttccaagaaa eccagttcat tgccgtgact gcctaccaga atgccgagat 1140 tactcagctg aaaattgata ataacccctt tgccaaagga ttccgggaga actttgagtc 1200 catgtacaca tctgttgaca ccagcatccc ctccccgcct ggacccaact gtcaattcct 1260 tgggggagat cactactctc ctctcctacc caaccagtat cctgttccca gccgcttcta 1320 ccccgacctt cctggceagg cgaaggatgt ggttccccag gcttactggc tgggggcccc 1380 ecgggaeeac agetatgagg ctgagtttcg agcagtcagc atgaagcctg cattcttgcc 1440 ctctgcccct gggcccacca tgtcctacta ccgaggccag gaggtcctgg cacctggagc 1500 tggctggcct gtggcacccc agtaccetcc caagatgggc ccggccagct ggttccgccc 1560 tatgcggact ctgcccatgg aacccggccc tggaggctca gagggacggg gaccagagga 1620 ccagggtccc cccttggtgt ggactgagat tgcececatc eggccggaat ccagtgattc 1680 aggactgggc gaaggagact ctaagaggag gcgcgtgtcc ccctatcctt ccagtggtga 1740 cagctcctcc cctgctgggg ccccttctcc ttttgataag gaagctgaag gacagtttta 1800 taactatttt cccaactgag cagatgaeat gatgaaagga acagaaacag tgttattagg 1860 ttggaggaca ccgactaatt tgggaaacgg atgaaggact gagaãggccc ccgctccctc 1920 tggcccttct ctgtttagta gttggttggg gaagtggggc tcaagaagga ttttggggtt 1980 caccagatgc ttcctggccc acgatgaaac ctgagagggg tgtccccttg ccccatcctc 2040 acctggtgct gcgtctígct ggcatgaagg agctttttgc aggagactcc actttcttcc taatccctga tccaaaaaga agggaaagga ctcacctgac ggggateaga gaaaaggggc ttgtttgtgg tggttgtgtg tgaatggggg aggctattta catcactttc tgaaataaac tttggtttcc agctggagaa atctagtggg tgggaggggt tttgtacagt aactttcaac acaaatacac gtatgttata tttggacâgc tggcctgggc tggaaagggg ggaatggccc tgggtgtgtg ttttttcttt ttgtactgag agtggtgtct ataaaactgt taaaaaaaaa tgecctaact acagtegttt aagaagacaa gaaagtcttg caggtgtggg acatgggagc cttttcgttg gcatgtgtgt accatcagcc cgceagggtc tccccctgct eaaacacagt acatctcaag aagcaagata ttctttcttt ttattttttt ggatatattc cttttgtctt aaaaaaaa
2100 2160 2220 2280 2340 2400 2460 2520 2580 258S
<210> 80 <211> 2450 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> mutação <222> (134) .. (134) <22 0> <221> mutação <222> (310) . . (310) <22 0> <221> Local de ligação da td54 <222> (952) .. (970) <220> <221> Local de ligação da td69 <222> (1096) .. (1114) <22 0> <221> Local de ligação da td70 66 <222> (1100) .. (1118) <22 0> <221> mutação <222> (1399) .. (1399) <22 0> <221> mutação <222> (1556) .. (1556) <400> 80 cggcccgctg gagaggaagc ccgagagctg ccgcgcgcct gccggacgag ggcgtagaag €0 ceaggcgtca gagcccgggc tceggtgggg tcccccaccc ggceetcggg tcccccgccc 120 cctgctccct gcctatccca gceeacgcga ccctctcgcg cgcggagggg cgggtcctcg 180 acggctacgg gaaggtgcca gcccgccccg gatgggcatc gtggagccgg gttgcggaga 240 catgctgacg ggçaccgagc çgatgccggg gagcgacgag ggçcgggege ctggçgççga 300 cccgcageag cgctacttct acccggagcc gggcgegeag gacgcggacg agcgtcgcgg 360 S99C89cagc ctggggtctc cctacccggg gggcgccttg gtgcccgccc cgccgagccg 420 cttccttgga gcctacgcct acccgccgcg accccaggcg gccggcttcc ccggcgcggg 480 cgagtccttc ccgccgcccg cggacgtcga gggctaccag ccgggcgagg gctacgccgc 540
cccggacccg cgcgccgggc tctacccggg gccgcgtgag gactacgçgc tacccgcggg ÇOO actggaggtg tcggggaaac tgagggtcgc gctcaacaac cacctgttgt ggtccaagtt 660 taatcagcac cagacagaga tgatcatcac caagcaggga cggcggatgt tcccattcct 720 gtcatttact gtggccgggc tggagcccac cagccactac aggatgtttg tggacgtggt 780 cttggtggac cagcaccact ggcggtacca gagcggcaag tgggtgcagt gtggaaaggc 840 cgagggcagc atgccaggaa accgcctgta cgtccacccg gactccccca acacaggagc 900 gcactggatg cgccaggaag tttcatttgg gaaactaaag ctcacaaaca acaagggggc 960 gtccaaeaat gtgacccaga tgattgtgct ccagtccctc cataagtacc agccccggct 1020 gcatatcgtt gaggtgaacg acggagagcc agaggcagcc tgcaacgctt ccaacacgca 1080 tatctttact ttccaagaaa cccagttcat tgccgtgact gcctaccaga atgccgagat 1140 67 tactcagctg aaaattgata ataacecxtt catgtacaca tctgttgaca ccagcatccc tgggggagat cactactctx ctctcctacc ccccgacctt cctggccagg cgaaggatgt ccgggaccac agctatgggg ctgagtttcg ctctgcccct gggcccacca tgtcctacta tggctggcct gtggcacccc agtaccctce tatgcggact ctgcccatgg aacccggccc ccagggtccc cccttggtgt ggactgagat aggactgggc gaaggagact ctaagaggag cagctcctcc cctgctgggg ccccttctcc taaetatttt cccaactgag cagatgacat ttggaggaca ccgactaatt tgggaaacgg tggcccttct ctgtttagta gttggttggg caccagatgc ttcctggccc acgatgaaac tgccctaact acagtcgttt acctggtgct aagaagacaa gaaagtcttg ggcatgaagg caggtgtggg acatgggagc aggagactcc cttttcgttg gcatgtgtgt taatccctga accatcagcc cgecagggtc agggaaagga tccccctgct caaacacagt ggggatçaga acatctcaag aagcaagata ttgtttgtgg tgccaaagga ttecgggaga actttgagtc ctccccgcct ggacccaact gtcaattcct caaccagtat cctgttccca gccgcttcta ggttccccag gcttactggc tgggggcccc agcagtcagc axgaagcctg cattcttgcc ccgaggccag gaggtcctgg eacctggagc caagatgggc ccggccagct ggttcagccc tggaggctca gagggacggg gaccagagga tgcccccatc cggccggaat ccagtgattc gcgcgtgtcc ccctatcctt ccagtggtga ttttgataag gaagctgaag gacagtttta gatgaaagga acagaaacag tgttattagg atgaaggact gagaaggccc ccgctccctc gaagtggggc tcaagaagga ttttggggtt ctgagagggg tgtccccttg ccccatcctc gcgtcttgct tttggtttcc agctggagaa agctttttgc atctagtggg tgggaggggt actttcttcc tttgtacagt aactttcaac tceaaaaaga acaaatacac gtatgttaca ctcacctgac tttggacage tggcctgggc gaaaaggggc tggaaagggg ggaatggccc tggttgtgtg tgggtgtgtg 1200 1260 1320 1380 1440 150Ô 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2400 2450
Lisboa, 27 de Março de 2009

Claims (9)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Desoxirribozimas, caracterizadas por serem compostas por um domínio catalítico com a sequência nucleotídica GGCTAGCTACAACGA ou com uma sequência modificada com uma acção biológica equiparável, que cliva o ARNm de T-bet em todos os pontos de ligação de purina-pirimidina a que esteja ligado, um domínio de ligação do substrato direito, que se junta na extremidade 3' do domínio catalítico e um domínio de ligação do substrato esquerdo que se junta à extremidade 5' do domínio catalítico, sendo os dois domínios de ligação de substrato por sua vez complementares a duas regiões do ARNm de T-bet, pelo que hibridizam com o ARNm, serem activas in vivo e conterem a sequência td69 GGCAATGAA GGCTAGCTACAACGA TGGGTTTCT ou a td70 TCACGGCAA GGCTAGCTACAACGA GAACTGGGT.
2. Desoxirribozimas de acordo com a reivindicação 1, caracterizadas por clivarem o domínio catalítico do ARNm do T-bet num local de ligação de purina-uracilo.
3. Desoxirribozimas de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizadas por estarem estabilizadas contra a decomposição no organismo, por meio da introdução de uma inversão 3'-3'.
4. Desoxirribozimas de acordo com as reivindicações 1 a 3, 2 caracterizadas por estarem estabilizadas contra a decomposição no organismo pela introdução de nucleótidos modificados ou de compostos nucleotidicos.
5. Desoxirribozimas de acordo com as reivindicações 1 a 4, caracterizadas por apresentarem, como modificação, uma timidina inversa na extremidade 3' e/ou uma marcação FAM na extremidade 5' .
6. Processo para a produção de um medicamento destinado ao tratamento de inflamações crónicas, caracterizado por se determinar células-alvos, nas quais a expressão do ARNm do T-bet é maior do que nas células saudáveis do corpo, se desenvolverem desoxirribozimas activas in vivo de acordo com a reivindicação 1, que se ligam ao ARNm de T-bet e o desactivam em termos funcionais, se introduzir as desoxirribozimas activas in vivo em células-alvos e se formular medicamentos que contêm as desoxirribozimas activas in vivo.
7. Medicamentos que contêm uma desoxirribozima de acordo com as reivindicações 2 a 5 e um veiculo aceitável a nivel farmacêutico.
8. Utilização de uma desoxirribozima de acordo com uma ou mais das reivindicações 1 a 5, na produção de um medicamento destinado ao tratamento de inflamações crónicas.
9. Utilização de uma desoxirribozima de acordo com uma ou 3 mais das reivindicações 1 a 5, na produção de um medicamento para a inibição especifica da expressão do T-bet em células-alvos de doentes, tendo em vista o tratamento de inflamações crónicas. Lisboa, 27 de Março de 2009
PT07013576T 2003-10-02 2004-10-01 Processo para a produção de um medicamento específico de células e/ou de tecidos e/ou de estádios patológicos PT1857555E (pt)

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DE10346487A DE10346487A1 (de) 2003-10-02 2003-10-02 Verfahren zur Herstellung eines Zell- und/oder Gewebe- und/oder Krankheitsphasen-spezifischen Arzneimittels

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