KR20030065206A

KR20030065206A - 시스플라틴에 내성을 보이는 두경부암에 대한 항암증강제

Info

Publication number: KR20030065206A
Application number: KR1020020005714A
Authority: KR
Inventors: 박정우; 정대균; 김성범; 이동석
Original assignee: 주식회사 디엔에이
Priority date: 2002-01-31
Filing date: 2002-01-31
Publication date: 2003-08-06

Abstract

본 발명은 항암제인 시스플라틴에 내성을 보이는 두경부암에 대한 치료 효과를 증대시킬 수 있는 항암증강제에 관한 것이다. 본 발명에 따른 항암증강제는 시스플라틴에 저항성을 갖게된 두경부암 세포의 성장을 억제하는 효과를 갖는다. 따라서, 본 발명의 증강제를 시스플라틴에 내성을 갖는 두경부암 세포에 시스플라틴과 함께 복합 투여할 경우, 두경부암의 치료 효과를 증대시킬 수 있다.

Description

시스플라틴에 내성을 보이는 두경부암에 대한 항암증강제{Agents for increasing anti-cancer activity against cisplatin-resistant head and neck cancer}

본 발명은 항암증강제에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 항암제인 시스플라틴에 내성을 보이는 두경부암에 대한 치료 효과를 증대시킬 수 있는 항암증강제에 관한 것이다.

두경부암(Head and neck cancer)은 비강, 인두, 후두, 침샘, 갑상선 등의 조직에서 발생하는 암으로써, 세계적으로 발생빈도가 전 악성종양의 약 5% 정도를 차지하고 있다. 세계적으로 두경부암의 발생빈도는 점차로 증가하고 있으며, 이러한 두경부암의 치료를 위해서, 현재 임상에서 사용되고 있는 항암제 중 가장 강력한 항암제인 시스플라틴(cisplatin)이 사용되고 있다.

시스플라틴은 두경부암 뿐만 아니라, 폐암, 유방암, 방광암, 위암, 자궁경부암, 골수종 등과 같은 다양한 종류의 암을 치료하는데 매우 효과적이라고 알려져 있다. 시스플라틴은 백금(platinum)을 함유한 중금속 화합물로서 백금 원자를 중심으로 2개의 염소 원자와 2개의 암모니아 분자가 cis-형으로 결합되어 있으며, DNA 가닥상의 인접한 2개의 구아닌(guanine)과 결합하여 인터스트랜드 크로스링크(interstrand crosslink)를 형성하여 DNA 합성을 억제한다. 즉, 암세포의 핵 내에 존재하는 DNA 이중나선 구조에 부착되어 DNA복제를 저해하여 암세포 성장 및 증식을 억제하고 암세포를 제거하여 항암효과를 나타낸다고 알려져 있다.

그러나, 시스플라틴이 다양한 종류의 암에 대하여 매우 효과적인 항암제이긴 하지만 최근 연구에 의하면 그 내성으로 인해 임상적인 문제가 증가하고 있다. 시스플라틴에 내성을 갖는 이유에 대해서는 여러 가지 가설이 있으나, 시스플라틴 유입(cisplatin uptake)의 감소나 유출의 증가로 인해서 발생되거나(Andrewet al.,Cancer Res., 2:35-43, 1990), 다양한 유전자들이 관여한다는 설이 일반적이다. 특히, MDR(multiple drug resistance)과 MRP(multidrug resistance associated protein)의 두 종류 단백질이 시스플라틴에 대한 내성에 관여하는 것으로 알려져 왔다(Taniguchiet al.,Cancer Res., 56:4124-4129, 1996). 즉, 시스플라틴에 내성을 갖는 종양 세포에서는 MRP2 단백질의 발현이 증가하며, MRP2가 글루타티오닌-컨쥬게이티드 시스플라틴(glutathione-conjugated cisplatin)을 세포 밖으로 방출함으로써 세포의 시스플라틴에 대한 내성을 증가시키는 것으로 알려졌다. 그러나, MRP2를 발현하지 않는 암세포에서도 시스플라틴에 대한 내성이 있음이 보고되어 MRP2 이외의 다른 단백질도 시스플라틴 내성에 기여할 수 있음이 확인되었다(Chenet al.,Exp. Cell Res., 240:312-320, 1998). 또한, c-ras, c-fos, c-abl, p53 및 p73 등의 유전자가 시스플라틴에 대한 내성과 관련이 있음이 보고된 바 있다.

따라서, 최근에는 시스플라틴에 대한 내성을 유도하는 암세포의 단백질 및 유전자를 이용하여 시스플라틴에 내성을 갖게된 암을 치료하려는 연구가 다양하게 진행되고 있다.

그러나, 아직까지 시스플라틴에 내성을 보이는 두경부암에서 어떠한 유전자 또는 단백질이 시스플라틴 내성을 유도하는 지에 대한 연구 및 시스플라틴에 내성을 갖는 두경부암을 효과적으로 치료하는 방법에 대해서는 연구가 미흡한 편이다.

따라서, 본 발명에서는 두경부암에서 유래한 암세포주들 중 시스플라틴에 저항성을 보이는 세포와 시스플라틴에 민감함을 보이는 세포를 대상으로 시스플라틴 처리후의 유전자 발현 차이를 확인함으로써 시스플라틴 내성과 관련된 유전자를 밝혀내고자 하였다. 또한, 이러한 유전자들을 이용하여 시스플라틴에 내성을 갖게된 두경부암을 효과적으로 치료할 수 있는 방법을 밝혀냄으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는, 시스플라틴에 내성을 보이는 두경부암을 효과적으로 치료할 수 있는 항암증강제를 제공하는 것이다.

도 1은 시스플라틴에 내성을 갖거나 민감성을 갖는 세포주를 선택하기 위하여, 두경부암 세포주(HN-1, HN-2, HN-3, HN-4, HN-5, HN-7 및 HN-8)에 시스플라틴을 농도별로 투여한 후, 세포 성장 억제율을 본 그래프이다.

도 2는 HN-4 및 HN-7 세포에 시스플라틴을 처리한 후, 각 시간대별로 DNA fragmentation 정도를 비교하여 본 것이다.

도 3a는 HN-4 세포에 시스플라틴을 농도별로 처리하고, 12시간 후 세포고사 정도를 FACS 분석을 이용하여 측정한 것이다.

도 3b는 HN-7 세포에 시스플라틴을 농도별로 처리하고, 12시간 후 세포고사 정도를 FACS 분석을 이용하여 측정한 것이다.

도 4a는 HN-7 세포에 시스플라틴을 처리한 후, 발현되는 유전자를 cDNA 마이크로어레이로 분석한 그림이다.

도 4b는 HN-4 세포에 시스플라틴을 처리한 후, 발현되는 유전자를 cDNA 마이크로어레이로 분석한 그림이다.

도 4c는 HN-4 및 HN-7 세포에 시스플라틴을 처리한 후, 각 세포에서 특이적으로 발현되는 유전자를 cDNA 마이크로어레이로 비교 분석한 그림이다.

(초록색 : HN-7 세포에서만 발현되는 유전자, 붉은색 : HN-4 세포에서만 발현되는 유전자)

도 5a는 HN-4 및 HN-7 세포에 시스플라틴을 처리한 후, 발현되는 유전자를 RT-PCR로 확인한 것이다.

레인 1 : GST1레인 2 : MLH1

레인 3 : Hsp27레인 4 : TMSB4X

레인 5 : IL2RA레인 6 : CTTN

레인 7 : KSR1레인 8 : EPS8

도 5b는 HN-4 및 HN-7 세포에 시스플라틴을 처리한 후, 발현되는 유전자를 RT-PCR로 확인한 것이다.

레인 1 : IL1B레인 2 : PSC5

레인 3 : Hsp86레인 4 : MGST1

레인 5 : EGFR레인 6 : NSEP

레인 7 : DLK레인 8 : BMP5

레인 9 : ETRD레인 10 : DAD

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 시스플라틴에 내성을 보이는 두경부암 세포에서 발현이 증대되는 유전자를 억제시켜 두경부암에 대한 치료 효과를 증대시키는 항암증강제를 제공한다.

또한, 본 발명은 시스플라틴에 민감한 두경부암 세포에서 발현이 증대되는 유전자의 발현을 유도시켜 두경부암에 대한 치료 효과를 증대시키는 항암증강제를 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명하다.

본 발명에서는 시스플라틴에 내성을 보이는 두경부암 세포에서 발현이 증대되는 유전자를 억제시킴으로써 두경부암에 대한 치료 효과를 증대시키는 항암증강제를 제공한다.

상기에서 유전자의 억제 방법은 시스플라틴에 내성을 갖는 두경부암 세포에서 발현이 증대되는 유전자에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드를 사용하는 것이 바람직하다.

상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 시스플라틴에 내성을 갖는 두경부암 세포에서 발현이 증대되는 유전자에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드라면 제한되지 않고 사용될 수 있다. 구체적으로는 서열번호 1 내지 서열번호 4로 표시되는 Hsp86(heat shock protein 86), Hsp27(heat shock protein 27), TMSB4X(thymosin beta 4X chromosome) 및 IL-1(interleukin-1) 유전자에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드인 것이 바람직하다.

또한, 본 발명에서는 시스플라틴에 민감한 두경부암 세포에서 발현이 증대되는 유전자의 발현을 유도시켜 두경부암에 대한 치료 효과를 증대시키는 항암증강제를 제공한다.

상기 유전자의 발현을 유도시키는 방법으로는 시스플라틴에 민감한 두경부암 세포에서 발현이 특이적으로 증대되는 유전자를 벡터에 삽입하고, 체내에 유입하는 방법을 이용하는 것이 바람직하다.

상기에서 유전자는 시스플라틴에 민감한 두경부암 세포에서 발현이 증대되는 유전자라면 제한되지 않고 사용될 수 있다. 구체적으로는 서열번호 5 내지 서열번호 7로 표시되는 EGFR(epidermal growth factor receptor), PSC5(proteaseom component C5) 및 DAD1(defender against cell death 1 protein) 유전자인 것이 바람직하다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

두경부암 세포에서 시스플라틴 내성 관련 유전자의 탐색

1-1) 세포 배양

본 발명에서 사용된 두경부암 세포주들(head and neck cancer cell line)은 아산 의학 센터(Asan Medical Center)에서 분양 받아 사용하였다. 각 세포는 10% FBS(fetal bovine serum), 스트렙토마이신-젠타마이신(streptomycin-gentamycin, 50㎎/ℓand 80㎎/ℓ, GIBCO BRL, USA)이 첨가된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium, GIBCO BRL, USA) 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂조건 하에서 배양하였다.

1-2) 시스플라틴 처리 후 두경부암 세포의 생존률 분석

여러 가지 두경부암 세포주(HN-1, HN-2, HN-3, HN-4, HN-5, HN-7 및 HN-8)를 대상으로 하여 시스플라틴을 농도별로 처리한 후, 세포 성장 억제율을 조사하였다.

각각의 세포들을 1 ×트립신/EDTA로 수확 후 96 웰 플레이트에 각 웰 마다 100㎕씩 세포(1 × 10⁵세포/웰)를 분주하였고, 37℃, 5% CO₂의 조건 하에서 세포가 부착할 때까지 4시간동안 배양하였다. 상기 각 웰에 시스플라틴을 농도별로 처리한 후, 전체 부피가 200㎕가 되도록 DMEM 배지를 첨가하였고, 12시간 동안 배양하였다. 이후, MTT(3-(4,5-di-methylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide, 5mg/ml in PBS)용액을 처리하고 4시간 동안 37℃, 5% CO₂의 조건 하에서 배양하였다. 400g(Clinical centrifuge, Jouan GR 4,11)에서 10분 동안 원심분리 한 후, 실린지 니들(syringe needle)로 상층액을 제거하였다. 0.04N HCl-이소프로판올(HCl-isopropanol)을 100㎕씩 첨가하여 침전물을 녹인 후, 490nm에서 ELISA 리더기로 흡광도를 측정하였고, 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에 도시된 바와 같이, 시스플라틴의 농도에 따라 내성의 정도가 달랐는데, 20μM의 농도에서 시스플라틴에 대한 내성은 HN7>HN1>HN5>HN2 =HN3>HN4>HN8 등과 같은 순서를 보였다. 즉, 상기 7가지 세포주들 중에서 HN-4 및 HN-8 세포는 시스플라틴에 대해 민감성을, HN-7 세포는 내성을 나타내었다.

1-3) 시스플라틴 처리 후 세포 고사 정도 확인

상기 실시예 1-2)에서 시스플라틴에 대해 감수성을 보이는 HN-4와 내성을 보이는 HN-7을 선택하여 시스플라틴을 40μM씩 처리한 후, 세포고사(apoptosis) 정도를 확인하기 위하여 DNA fragmentation 어세이를 수행하였다.

플레이트에 상기 두 세포주를 분주하고, 24시간 후 시스플라틴을 40μM씩 처리하였으며, 각각 12, 24, 36, 48시간 동안 배양시켰다. 시간대별로 약 3 ×10⁶개의 세포를 모은 후 PBS로 세척한 다음 70% 에탄올로 고정시켰다. 세포를 원심분리하여 모은 후 50㎕의 포스페이트-시트레이트 완충용액(phosphate-citrate buffer, 86mM Na₂HPO₄, 6.7mM citric acid)에 현탁 시킨 다음 상온에서 30분간 반응시켰다. 페놀-클로로포름(Phenol-Chloroform, 1:1)으로 추출한 후, 2.5배의 에탄올을 사용하여 침전 시켰다. 침전물을 RNase가 100㎍/㎖의 농도로 들어있는 TE 완충용액에 녹인 후 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 다음 2% 아가로스 겔에 전기영동을 수행하여 DNA fragmentation을 확인하였고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에 도시된 바와 같이, HN-4 세포는 12시간째부터 DNA fragmentation을 보인 반면 HN-7 세포는 24시간째부터 DNA fragmentation을 보였다. 즉, HN-7 세포가 시스플라틴에 보다 내성을 갖기 때문에 시스플라틴을 처리하여도 세포고사가 쉽게 일어나지 않음을 확인할 수 있었다.

1-4) TUNEL 어세이

상기 실시예 1-3)에서 DNA fragmentation을 보인 시간인 12시간을 기준으로 하여 HN-4와 HN-7 세포에 시스플라틴을 처리한 후, 공지된 방법에 따라 TUNEL 어세이를 수행하여 FACS 분석을 수행하였다.

상기 각 세포를 2 ×10⁷세포/㎖로 배양한 후, 시스플라틴을 10, 20, 30, 40,70μM의 농도로 각각 처리하였다. 12시간 후, 각 세포를 96 웰 플레이트에 2 ×10⁶/웰이 되도록 분주하였다. 상기 세포를 파라포름알데히드(paraformaldehyde, 4%, pH7.4)로 고정시킨 뒤 로쉬 프로토콜(Roche Molecular Bio-chemicals Cat. No. 2156792)에 준하여 TUNEL 어세이를 수행하였고, 그 결과를 도 3a 및 도 3b에 나타내었다.

도 3a 및 도 3b에 도시된 바와 같이, HN-4 세포는 30μM에서 세포고사를 보이기 시작했으며, HN-7 세포는 거의 변화가 없음을 확인할 수 있었다. 즉, HN-7 세포가 시스플라틴에 보다 내성을 가져 시스플라틴을 처리하여도 세포고사가 쉽게 일어나지 않음을 확인할 수 있었다.

1-5) 유전자 발현 분석

HN-4 세포와 HN-7 세포에 시스플라틴을 처리했을 때의 유전자 발현 차이를 분석하기 위해서 cDNA 마이크로어레이(cDNA microarray)를 수행하였다.

HN-4와 HN-7 세포에 시스플라틴 40μM을 처리한 후, 12 시간 동안 배양하였고, 각각 세포의 총 RNA를 추출하였다. RNA로부터 cDNA를 합성한 후, 이 DNA를 프로브로 이용하여 클론테크(Clontech)사의 Human 3.6 array kit(Cat.No.7870-1 CLONTECH, USA) 프로토콜에 준하여 cDNA 마이크로어레이 실험을 수행하였다.

그 결과, 도 4a 내지 도 4c에 도시된 바와 같이 HN-4 및 HN-7 세포에 시스플라틴을 처리하였을 때, 세포마다 유전자가 달리 발현됨을 확인할 수 있었다. 즉,Hsp27, Hsp86, TMSB4X 및 IL-1 유전자들은 시스플라틴에 저항성이 있는 HN-7 세포에서 많이 발현되었으며, EGFR, PSC5 및 DAD1 유전자들은 시스플라틴에 민감성이 있는 HN-4 세포에서 발현이 증가되었음을 확인할 수 있었다.

1-6) RT-PCR

상기 실시예 1-5)에서 얻은 결과를 확인하기 위해서 각 세포의 cDNA를 주형으로 이용하여 RT-PCR을 수행하였다. Guanidium thiocyanate-acid phenol-chloroform 방법(Chomczynskiet al., 1987)을 사용하여 총 RNA를 추출하였고, 각 유전자에 대한 프라이머는 프로메가(Promega)에서 구입하여 사용하였다.

단일층(monolayer)으로 자란 HN-4와 HN-7 세포에 시스플라틴을 처리한 세포를 배양하였다. 12시간 후에 배지를 제거하고 PBS(Phosphate buffered saline)로 세척한 후 변성 용액(Denaturing solution, 4M guanidium thiocyanate, 0.5% SDS, 25mM sodium citrate pH7.0, 0.1M 2-mercaptoehanol)을 첨가하여 세포를 용해시켰다. 세포의 침전물에 소디움 아세테이트(sodium acetate, pH4.0)를 0.2M이 되도록 첨가한 후, 변성 용액과 동량의 페놀-클로로포름-이소아밀 알코올(phenol-chloform-isoamyl alcohol, 25:24:1)을 첨가하였고, 원심분리 후 상층액을 취하였다. 99% 에탄올로 RNA를 침전시킨 후 DEPC 용액(diethylpyrocarbonate treated water)으로 녹였다.

PCR(Polymerase Chain Reaction)을 위한 cDNA는 SUPER-SCRIPT TMⅡ RNase H-Reverse Transcriptase(GIBCOBRL, USA)를 사용하여 합성하였다. 키트를 이용한cDNA 합성은 GIBCOBRL사의 프로토콜(Cat No.18064-014)에 준하여 수행하였다. 실험 과정은 다음과 같았다. 튜브에 총 RNA 2㎍, 올리고-(dT)₁₅(500㎍/㎖) 1㎕ 그리고, 증류수 10㎕를 넣고 섞은 후, 70℃에서 10분간 변성(denaturation)시켰다. 여기에 4㎕의 5 × First Strand Buffer[250mM Tris-HCl(pH8.3 at room temperature), 375mM KCl, 15mM MgCl2], 2㎕ 0.1M DTT 그리고, 1㎕ 10mM dNTP 혼합물을 첨가하여 잘 섞은 후 42℃에서 50분간 반응시켰다. 반응 후 70℃에서 15분간 열 불활성화(heat-inactivation)시켰다. 그리고 RNase H(2unit)를 첨가하여 37℃에서 30분간 반응시켰다. PCR은 95℃, 15분(1 사이클); 그리고 94℃, 30초; 50℃, 30초; 72℃, 30초(30 사이클)의 조건으로 수행하였다.

상기 RT-PCR결과, 도 5a 및 도 5b에 도시된 바와 같이, cDNA 마이크로어레이에서 얻은 결과와 동일한 결과를 확인할 수 있었다. 즉, Hsp27, Hsp86, TMSB4X 및 IL-1 같은 유전자들은 시스플라틴에 저항성이 있는 HN-7 세포에서 많이 발현되었으며, EGFR, PSC5 및 DAD1같은 유전자들은 시스플라틴에 민감한 HN-4 세포에서 발현이 증가함을 확인할 수 있었다.

<실시예 2>

시스플라틴에 내성을 갖는 세포에서 발현이 증대되는 유전자에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드를 이용한 암 세포 성장 억제 효과

상기 실시예 1-5) 및 1-6)에서와 같이, 시스플라틴에 내성을 갖는 두경부암세포주에서 발현이 증대된 유전자인 Hsp86, Hsp27, TMSB4X 및 IL-1의 cDNA 클론 뉴클레오티드 서열(서열번호 1 내지 서열번호 4)을 기초로 하여, 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제작하였다. 상기 뉴클레오티드 제작은 문헌(Stecet al.,J. Am. Chem. Soc., 106:6077-6079, 1984)에 설명된 방법에 따라 포스포로아미다이트법(phosphoroamidite method)과 자동화된 합성기(모델 380-B, Applied Biosystems, Inc., 미국 캘리포니아주 포스터 시티)를 이용하여 수행되었다.

시스플라틴에 내성을 갖는 두경부암 세포주인 HN-7을 대상으로 상기 제작된 각 올리고뉴클레오티드를 시스플라틴과 함께 복합 투여한 결과, 시스플라틴 단독으로 투여하였을 때보다 암 세포의 성장이 감소되었음을 확인할 수 있었다.

<실시예 3>

시스플라틴에 민감한 세포에서 발현이 증대되는 유전자를 이용한 암 세포 성장 억제 효과

상기 실시예 1-5) 및 1-6)에서와 같이, 시스플라틴에 민감한 두경부암 세포주에서 발현이 증대된 유전자인 EGFR, PSC5 및 DAD1(서열번호 5 내지 서열번호 7)을 이용하여 암 세포 성장 억제 효과를 측정하였다.

상기 각 유전자를 유전자 치료용 벡터에 삽입하였고, 시스플라틴에 내성을 갖는 두경부암 세포주인 HN-7을 대상으로 상기 각 유전자가 도입된 벡터를 시스플라틴과 함께 복합 투여한 결과, 시스플라틴 단독으로 투여하였을 때보다 암 세포의성장이 감소되었음을 확인할 수 있었다.

본 발명에 따른 항암증강제는 시스플라틴에 저항성을 갖게된 두경부암 세포의 성장을 억제하는 효과를 갖는다. 따라서, 시스플라틴에 내성을 보이는 두경부암에 시스플라틴과 함께 복합 투여할 경우 두경부암의 치료 효과를 증대시킬 수 있다.

Claims

시스플라틴에 내성을 갖는 두경부암 세포에서 발현이 증대되는 유전자를 억제시켜 두경부암에 대한 치료 효과를 증대시키는 항암증강제.
제 1항에 있어서, 상기 유전자의 발현 억제는 시스플라틴에 내성을 갖는 두경부암 세포에서 발현이 증대되는 유전자에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의한 것임을 특징으로 하는 항암증강제.
제 2항에 있어서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 서열번호 1로 표시되는 Hsp86 유전자에 대한 올리고뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 항암증강제.
제 2항에 있어서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 서열번호 2로 표시되는 Hsp27 유전자에 대한 올리고뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 항암증강제.
제 2항에 있어서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 서열번호 3으로 표시되는 TMSB4X 유전자에 대한 올리고뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 항암증강제.
제 2항에 있어서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 서열번호 4로 표시되는 IL-1 유전자에 대한 올리고뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 항암증강제.
시스플라틴에 민감한 두경부암 세포에서 발현이 증대되는 유전자의 발현을 유도시켜 두경부암에 대한 치료 효과를 증대시키는 항암증강제.
제 7항에 있어서, 시스플라틴에 민감한 두경부암 세포에서 발현이 증대되는 유전자를 벡터에 삽입하고, 체내에 유입하여 두경부암에 대한 치료 효과를 증대시키는 항암증강제.
제 7항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 5로 표시되는 EGFR 유전자인 것을 특징으로 하는 항암증강제.
제 7항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 6으로 표시되는 PSC5 유전자인 것을 특징으로 하는 항암증강제.
제 7항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 7로 표시되는 DAD1 유전자인 것을 특징으로 하는 항암증강제.