CN103739678B - 抑制粘附斑激酶多肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及药物领域，具体涉及具有抑制粘附斑激酶活性，治疗急性淋巴细胞性白血病的多肽。其序列为DGSLLEEITKMQISE是全新的序列，它们可以体外抑制粘附斑激酶活性，并在体内试验中提高荷瘤小鼠生存率，具有潜在的新药开发价值。

Description

抑制粘附斑激酶多肽及其应用

技术领域

本发明涉及抑制粘附斑激酶多肽及其应用，具体涉及具有抑制粘附斑激酶活性、治疗急性淋巴细胞性白血病的多肽。

背景技术

急性淋巴细胞性白血病（ALL）是一种进行性恶性疾病，其特征为大量的类似于淋巴母细胞的未成熟白细胞。这些细胞可在血液、骨髓、淋巴结、脾脏和其它器官中发现。急性淋巴细胞性白血病占儿童急性白血病的80%，发病率高峰在3岁至7岁之间。ALL也可发生于成年人，占所有成年人白血病的20%。近年来随着医学研究的深入，对急性淋巴细胞性白血病的认识和治疗取得了很大进展。其中，粘附斑激酶在急性淋巴细胞性白血病中扮演着重要角色。

粘附斑激酶( focal adhesion kinase， FAK )是一种胞质非受体蛋白酪氨酸激酶， 是粘附斑复合物家族( focal adhesion complex family) 的一员。具有酪氨酸激酶活性， 在受到原癌基因产物和胞外基质-整合素的刺激后发生磷酸化。此外， 小神经肽、内皮素和血管升压素等都能使其磷酸化FAK参与了多条细胞信号通路， 它是胞内外信号转导的中枢。它可以整合来自胞外的营养、压力、细胞粘着等方面的信号， 调节下游分子的活性， 控制细胞的代谢、增殖， 甚至是细胞的命运。近年的研究表明FAK 可以调控细胞的生长、锚定、迁移、恶变和凋亡等过程， 与肿瘤的发生密切相关。

    目前发现有FAK 表达或者活性增强的肿瘤有结肠癌、乳腺癌、胸腺癌、胃癌以及胶质母细胞瘤和黑色素瘤等。用FAK 特异性抑制剂处理体外培养的肿瘤细胞， 可以抑制细胞的增殖、生长、扩散和迁移。磷酸化的FAK 与Src形成复合体， 可以激活或抑制多条下游通路， 包括PI3K /Akt、RIP、p53 和RAS-Erk等， 起始肿瘤发生或诱导细胞凋亡。Wu等用shRNA 技术处理神经母细胞瘤细胞发现，FAK 可以抑制整合素A5B1诱导的细胞迁移， 并且FAK还可以通过其激酶结构域活化Src。当小鼠乳腺缺失了FAK后， 不影响乳腺上皮细胞的正常发育， 但却能抑制由PyMT 激发的乳腺癌的发生; 敲出体外培养的人乳腺癌细胞的FAK， 可以阻止癌细胞的生长、诱导细胞衰老(cell senescent) 。用ATP 竞争性FAK和PYK2 抑制剂， 如PF-562， 271、PF-573， 228 等， 处理体外培养的肿瘤细胞， 可以抑制细胞迁移。一期临床试验结果表明， FAK 抑制剂对多种肿瘤有明显的治疗作用。FAK 是肿瘤发生、增殖、迁移等过程的关键蛋白， 研究新的特异性FAK 抑制剂将是癌症研究和治疗的途径之一。但目前未见有FAK抑制剂治疗急性淋巴细胞性白血病。

因此，需要设计特异性强的粘附斑激酶抑制剂用于治疗急性淋巴细胞白血病。粘附斑激酶抑制剂包括大分子和小分子。 大分子抑制剂的制备和使用限制了它们的发展，例如重组人粘附斑激酶抑制因子的体内半衰期短。很多成功的小分子抑制剂，可以在纳摩尔水平上抑制粘附斑激酶的活力，但小分子抑制剂缺乏特异性，如果在慢性疾病中长期使用缺乏特异性的粘附斑激酶抑制剂可产生较大副作用。 因而，从粘附斑激酶抑制剂的应用角度来看，以急性淋巴细胞白血病作为研究对象是正确的选择。在急性反应期，机体能够耐受短期的、粘附斑激酶广谱抑制剂对正常生理功能的抑制，同时使关键组织器官的生理结构免受破坏，增加了生存几率。

本专利中的抑制粘附斑激酶多肽已证明在急性淋巴细胞白血病中有效，具有在其他肿瘤模型中开发的前景。

发明内容

发明目的

    本发明提供全新的序列，该序列粘附斑激酶抑制剂，对急性淋巴细胞白血病具有很好的疗效。

技术方案

    抑制粘附斑激酶多肽，其特征在于其序列为DGSLLEEITKMQISE。

抑制粘附斑激酶多肽在治疗急性淋巴细胞白血病药物中的应用。

有益效果

利用固相合成法化学合成抑制粘附斑激酶多肽，该多肽具有全新的序列，该多肽可体外抑制粘附斑激酶，治疗急性淋巴细胞白血病。在内毒素休克模型实验中成功的增加了小鼠的生存率。我们发现的多肽抑制剂可以同时抑制粘附斑激酶活力，并在体内试验中提高荷瘤小鼠生存率，具有潜在的新药开发价值。

具体实施方式

本发明涉及多肽由吉尔生化(上海)有限公司合成。

实施例1

抑制粘附斑激酶多肽对体外粘附斑激酶活性的作用。

取新鲜牛脑组织，剥去脑膜和大的血管，剪碎，用冷 MES 缓冲液洗涤 1-2 次，以每克脑组织 0.5-1ml 的比例加入 MES 缓冲液，在 4℃下，用电动匀浆器匀浆;4℃，105000g 离心 1h，取上清，加入等体积的微管聚合缓冲液，37℃水浴保温 30min。26℃，105000g 离心 1h，取沉淀，加入约 1/10 匀浆体积的冷 MES 缓冲液，轻轻搅拌或用匀浆器将沉淀碾碎；将悬液放冰浴 30min，使沉淀完全溶解。用 Lowry’s法测定蛋白含量（SDS 聚酰胺凝胶电泳法）。粘附斑激酶用 MES 缓冲液稀释至 4-5mg/ml，置液氮中保存。取冷冻的粘附斑激酶溶液，快速用常温水冲其壁，使之融化，放入冰浴，用 MES 缓冲液稀释至所需浓度（2-3mg/ml），加入 ATP至 1mmol/l。以从冰浴中马上取出的粘附斑激酶溶液在分光光度计 350nm处调定为“0”点。然后将比色杯在37℃温度下测定粘附斑激酶溶液的 OD值，连续 20-30min，记录温度-吸光值曲线（T-OD 曲线），重复三次。

抑制率计算：抑制率（%）=（对照管“OD”值－加药管“OD”值）／对照管“OD”

实验组设五个剂量：0.75μM、1.5μM、3μM、12μM、24μM，阳性对照组长春新碱剂量3μM，空白组加入等体积的溶剂DMSO；按上述操作测定吸光值。结果，随抑制粘附斑激酶多肽浓度增加，抑制率逐渐升高，说明有抑制粘附斑激酶活性随药物浓度的增加而不断增加。

实施例2

抑制粘附斑激酶多肽对体外培养肿瘤细胞的生长和存活IC50。

采用MTT 比色法。将对数生长的U937细胞，以 1.0×105加入 96 孔培养板中，培养 24h，实验孔、阳性药物对照孔分别加入不同浓度的实验药物抑制粘附斑激酶多肽和阳性对照药物长春新碱；空白组加入相同体积的溶剂。每孔设五个复孔，培养 48h，分别在0h、2h、8h、14h、20h、24h、36h、，48h 每孔加入MTT，作用4h后，加入 DMSO，孵育 30min，在酶标仪 620nm 处测定吸光度 A 值，按公式肿瘤细胞生长抑制率＝（1-实验组吸光值/对照组吸光值）×100％。计算出实验药物的 IC50 为31.11μM。

实施例3

用肿瘤模型检测抑制粘附斑激酶多肽的体内活力。

建立U937肿瘤模型，阳性对照药物长春新碱；空白组加入相同体积的溶剂，实验组设3个剂量：0.75、1.5μM、3μM mg/Kg。21天后，观察小鼠存活数量，计算存活率。结果显示，抑制粘附斑激酶多肽可有效地保护小白鼠，提高荷瘤小鼠的生存率，生存率达到76.2%。

                   SEQUENCE LISTING

 

<110>  瑞雪, 罗

 

<120>  抑制粘附斑激酶多肽及其应用

 

<130> 

 

<160>  1    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  15

<212>  PRT

<213>  人工序列

 

<400>  1

 

Asp Gly Ser Leu Leu Glu Glu Ile Thr Lys Met Gln Ile Ser Glu

1               5                   10                  15 

 

Claims (2)

1.抑制粘附斑激酶多肽，其特征在于其序列为DGSLLEEITKMQISE。

2. 如权利要求1所述的抑制粘附斑激酶多肽在治疗急性淋巴细胞性白血病药物中的应用。