JP2016518358A - ポリプレックス - Google Patents

Abstract

本開示は、(i)所定のpHにおいて電荷を有する活性剤と、(ii)前記所定のpHにおいて前記活性剤とは反対の電荷を有するポリマーと、(iii)前記所定のpHにおいて静電結合したペプチド及びポリマーを含むポリプレックスを含む化合物に関する。いくつかの実施態様において、活性剤は、ペプチド、例えばMAPKAPキナーゼII阻害ペプチドを含むペプチドであり、いくつかの実施態様において、ペプチドは、細胞浸透性ペプチドを含む。更なる実施態様において、本開示は、本開示による組成物を、それを必要とする対象に投与することによって疾患又は状態を治療する方法を提供する。【選択図】図１

Description

関連出願
本願は、2013年4月11日に提出された米国仮特許出願番号61/811,078 (参照により開示全体が本明細書に組み込まれる)の優先権を主張する。

米国政府の権益
本開示の主題は、米国心臓学会議による助成第11SDG4890030号、米国国立衛生研究所による助成第1R21HL110056-01号、米国国立科学財団による研究補助金第DGE-090966号の下、米国政府の支援でなされたものである。米国政府は、本開示の主題について一定の権利を有する。

技術分野
本願で開示する主題は、ポリプレックスに関する。具体的には、本願で開示する主題は、反対の電荷を有するポリマーと、ペプチドであり得る活性剤とを含むポリプレックスを含む組成物に関する。

イントロダクション
ペプチドは、合成小分子と比較して、より特異的及び/又は強力な薬剤開発のための相当な潜在的能力を有する。しかしながら、送達の障壁によりペプチドベース薬剤の応用性は制限されている。例えば、ペプチドは、典型的には、小分子の薬剤よりも大きな分子量を有し、より親水性であるため、細胞膜を通じて直接拡散するそれらの能力は阻害される。結果として、それらは、エンドソーム経路によって内在化するか(リソソーム分解の標的とされた小胞中におけるトラップをしばしばもたらす)、又はエキソサイトーシスによって細胞外に出てリサイクルされる。実際、非効率的な細胞浸透性及び細胞内における薬物動態の乏しさは、ペプチド療法の幅広い臨床的応用性に対する大きな制限となっているが、この制限がなければ、それらの特異性、安全性及び製造の容易性に基づいて、細胞内におけるタンパク質-タンパク質相互作用を破壊するために望ましい薬剤である。

例えば、MAPKAPキナーゼII阻害ペプチド(MK2i)は、薬剤として相当な潜在的能力を有し得るペプチドである。MAPKAPキナーゼII (MK2)のシグナル伝達は、血管平滑筋細胞(VSMC)において起こる。MK2の活性化は、血管収縮及び病的なVSMC増殖、移動及びECMの過剰産生をもたらし、グラフト閉塞に導く。したがって、MK2iは、理論的には、ヒト伏在静脈(HSV)において血管収縮及びその後の内膜過形成を低減すると考えられる。

この点について、MK2のシグナル伝達は、環境的及び機械的ストレス、例えば外科的な移植中にグラフトを移植するときのストレスによって、しばしば惹起される。かくして、自家血管を用いる冠動脈バイパスグラフティングは依然として多枝冠動脈疾患の標準的治療であるが、これら伏在静脈グラフトのほぼ半分が内膜過形成に起因して最初の18カ月以内に失敗する。MK2iを送達して、グラフトによって引き起こされる内膜過形成を治療する現行の方法は成功していない。これは、現行の組成物中のペプチドが、エキソサイトーシス又はリソソーム分解のために輸送され、エンドソーム-リソソーム小胞にしばしば隔離されるからである。

それゆえ、活性剤、具体的にはペプチドを、それを必要とする対象に投与するための組成物及び方法を改良するというニーズが残されている。

要約
この要約は、本願に開示される主題のいくつかの実施態様を記載し、多くの場合、これらの実施態様の変形及び置換を挙げている。この要約は、数々の様々な実施態様の例示に過ぎない。所与の実施態様についての１又はそれより多くの代表的特徴に関する言及も同様に例示である。このような実施態様は、典型的には、言及された特徴を伴っていてもよいし、伴っていなくてもよい；同様に、これらの特徴は、この要約に列挙されているか否かを問わず、本願に開示される主題のその他の実施態様に適用してもよい。冗長な繰り返しを避けるために、この要約は、可能性ある特徴の組合せの全てを列挙又は示唆することはしない。

本願で開示する主題は、いくつかの実施態様において、(i)所定のpHにおいて電荷を有する活性剤と、(ii)前記所定のpHにおいて前記活性剤とは反対の電荷を有するポリマーとを含む化合物を提供する。いくつかの実施態様においては、前記所定のpHにおいて、前記活性剤と前記ポリマーとの間に静電結合が形成されており、いくつかの実施態様において、活性剤及びポリマーの結合体はポリプレックスと呼ばれる。いくつかの実施態様において、所定のpHは、約6.5〜約8である。更に、いくつかの実施態様において、活性剤(例えばペプチド)とポリマーとの間の静電結合は、所定のpHよりも低いpH又は約6.5よりも低いpHであり得る活性化pHにおいて破壊される。

いくつかの実施態様において、前記活性剤は、前記所定のpHにおいてカチオン性であり、前記ポリマーは、前記所定のpHにおいてアニオン性であり、その他の実施態様において、前記活性剤は、前記所定のpHにおいてアニオン性であり、前記ポリマーは、前記所定のpHにおいてカチオン性である。いくつかの実施態様において、活性剤は、ペプチド、例えばMAPKAPキナーゼII阻害ペプチドを含む。他の実施態様において、ペプチドは、配列番号１〜４から選択される１以上の配列を含む。いくつかの実施態様において、組成物は、第２の活性剤、例えばペプチド、ポリヌクレオチド及びそれらの組合せ(いくつかの実施態様においてはsiRNA、DNA及びそれらの組合せを含む)を更に含み得る。

いくつかの実施態様において、組成物は、ポリ((C₁-C₆)アルキル-アクリル酸)、ポリ((C₁-C₆)アルキル-メタクリル酸)、ポリ((C₁-C₆)アルキル-エタクリル酸)又はそれらの組合せを含むポリマーを含む。特定の実施態様において、ポリマーは、ポリ(プロピルアクリル酸) (PPAA)を含む。ポリマーの例としては、更に、ポリエチレングリコール(「PEG」)、N-(2-ヒドロキシプロピル)メタクリルアミド(「HPMA」)、ポリ(N,N-ジメチルアクリルアミド) (「pDMA」)、ポリ(PEGメタクリレート) (「pPEGMA」)又はそれらの組合せを含み得る親水性ブロックを含み得る。

更に、本開示のいくつかの実施態様は、約10:1〜約1:10のポリマー：ペプチド電荷比を含む。更に、特定の実施態様において、ポリマー：ペプチド電荷比は約1:3である。

ポリプレックスは、いくつかの実施態様において、少なくとも１次元、例えば直径において、約50 nm〜約500 nmのサイズを有し得る。

特定の実施態様において、本開示は、本開示に記載される組成物と共に医薬的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。

更に他の実施態様において、本願で開示する主題は、本明細書に記載される実施態様に従う組成物を含む血管グラフトを提供する。

更なる実施態様において、本開示は、疾患又は状態、例えば血管の状態を治療する方法を提供する。これらの方法は、本開示の組成物の有効量を、それを必要とする対象に投与することを少なくとも含む。特定の実施態様において、血管の状態は、内膜過形成である。

最後に、特定の実施態様において、本開示は、本明細書に記載される組成物を合成する方法を提供する。

カチオン性ペプチド、例えばMAPKAPキナーゼ2 (MK2i)を含むペプチド及びアニオン性のエンドソーム分解性ポリマー、例えばPPAAを含むポリプレックスの実施態様の合成スキームを提供する。 pH-依存性膜破壊機構によってエンドソーム-リソソーム経路を回避するように実施態様のポリプレックスをチューニングできることを示す溶血アッセイの結果を提示する。 コントロールのポリプレックス及びヒト冠動脈血管平滑筋細胞(HCAVSMC)中の遊離MK2iよりもインターロイキン-6 (IL-6)産生を抑止する本開示のポリプレックスのいくつかの実施態様を示す。図３に示す全てのデータは、細胞数に対して正規化されている。更に、「NT」は、処理なしを意味する。NT+TNFαとの比較において^*p<0.05、 NT+TNFαとの比較において^*p<0.01、同一濃度のMK2iとの比較において#p<0.05、同一濃度のCPPポリプレックスとの比較において## p<0.05、n=4。 ブランクのポリプレックス、MK2i単独、PPAA単独又はMK2iを含む実施態様のポリプレックスで処理したヒト伏在静脈(HSV)サンプルの弛緩増大のパーセントを説明する棒グラフを示す。コントロールとの比較において^*p<0.05、100μm MK2iとの比較において^**p<0.05、n = 3。 未処理、MK2i単独で処理又は様々な実施態様のMK2iポリプレックスで処理したHSVサンプルの組織切片を示す。暗色の線は、血管内膜の厚みの境界である。スケールバーは長さ100μmである。 HPLCで精製したCPP-MK2i融合ペプチド(配列番号１：YARAAARQARA-KALARQLGVAA)についてのエレクトロスプレーイオン化質量分析(ESI-MS)の質量スペクトルを示す。分子量は2283.67 g/molである。この質量スペクトルは、全長ペプチド配列のフラグメントにそれぞれ対応する３つの主要なピークを示す。 D₆MSO中のポリ(アクリル酸) (PAA)の¹H NMRスペクトルである。分子量は、連鎖移動剤に関連付けられるピーク(すなわち、PAAについてのピークc,d及びPPAAについてのピークb)の面積を、アクリル酸/プロピルアクリル酸に関連付けられるピーク(すなわち、PAAについてのピークa及びPPAAについてのピークc)と比較することによって測定した：PAAの重合度 = 106、PPAAの重合度 = 190。 ポリ(アクリル酸) (PAA)のGPCクロマトグラムである：M_n = 10830 (g/mol)、PDI = 1.27、dη/dC = 0.09 (mL/g)。トレースは、重合で用いた4-シアノ-4-(エチルスルファニルチオカルボニル)スルファニルペンタン酸(ECT)連鎖移動剤中に存在するトリチオカーボネート部分の特徴的な吸収ピーク(310 nm)におけるUV吸収を示す。 D₆MSO中のポリ(プロピルアクリル酸) (PPAA)ホモポリマーの¹H NMRスペクトルを示す。分子量は、連鎖移動剤に関連付けられるピーク(すなわち、PAAについてのピークc,d及びPPAAについてのピークb)の面積を、アクリル酸/プロピルアクリル酸に関連付けられるピーク(すなわち、PAAについてのピークa及びPPAAについてのピークc)と比較することによって測定した：PAAの重合度 = 106、PPAAの重合度 = 190、MW = 21,950 g/mol。 ポリ(プロピルアクリル酸) (PPAA)のGPCクロマトグラムである：Mn = 22010 (g/mol)、PDI =1.471、dη/dC = 0.087 (mL/g) DMF中のポリマー。トレースは、重合で用いた4-シアノ-4-(エチルスルファニルチオカルボニル)スルファニルペンタン酸(ECT)連鎖移動剤中に存在するトリチオカーボネート部分に特徴的な吸収ピークにおけるUV吸収(310 nm)を示す。 MK2iポリプレックスの設計及び機能的特徴に関する説明を示す。ここで、MK2iNPは、エンドソーム回避の媒介及び細胞内におけるペプチド療法剤の放出のために最適化されている。 処理比較のまとめを示す：MK2i-NPは、エンドソーム分解性PPAAポリマーで形成されている。一方、NE-MK2i-NPは、PPAAに構造上類似するが、より低いpKaに起因してエンドソーム分解性ではないPAAポリマーで形成されている。MK2i-NP及びNE-MK2i-NPは、いずれも、示された配列を有するMK2iペプチドで作られている(上の列= 改変されたTAT模倣性の細胞浸透性ペプチド配列、下の列 = MK2阻害配列)。 種々の電荷比([NH₃ ⁺]/[COO^-])で調製されたポリプレックスのゼータ電位を示す。イメージング及び取込み研究のために、NPは、Alexa(登録商標)-488蛍光体で標識したMK2iペプチドから形成される。NE-NPは、非エンドソーム分解性(NE)のPAAポリマーで形成されている。示した値は、少なくとも３回の独立した測定の平均である。 119 ± 26 nmの直径を有するMK2i-NPの動的光散乱(DLS)解析を示す。 114 ± 14 nmの直径を有するNE-MK2i-NPの動的光散乱解析を示す。 酢酸ウラニルで対比染色したMK2i-NP及びNE-MK2i-NPの透過型電子顕微鏡(TEM)イメージの例を示す。スケールバーは、長さ100 nmである。 DLS解析により示されたように、エンドソームのpH範囲でMK2i-NPのpH惹起性の分解が起こることを示す。 蛍光標識されたMK2i、MK2i-NP及びNE-MK2i-NPの細胞内取込み及び保持の定量を示すグラフを示す。^*p<0.001 対MK2i、 n=3。MK2i-NPの形成は、MK2iの細胞内取込みを増大し、細胞内保持を増大し、エンドソーム-リソソーム共局在を低減する。
MK2i-NPによって送達された蛍光標識MK2iペプチドの細胞内取込みの増大及び保持時間がより長いことを示すフローヒストグラムの例を示す。 赤血球溶血アッセイの結果を示す。ここでは、MK2i-NPは、PPAAポリマーに類似するが、NE-MK2i-NP及びMK2iペプチド単独には類似しないpH依存的な膜破壊活性を有する。 赤血球溶血のフルデータセットを示す。赤血球溶血アッセイは、MK2i-NPが、PPAAポリマーに類似するが、NE-MK2i-NP及びMK2iペプチド単独には類似しないpH依存的かつ用量依存的な膜破壊活性を有することを示す。 処理後24時間におけるAlexa Fluor(登録商標)-488標識MK2iとLysoTracker(登録商標)レッドとの共局在の共焦点顕微鏡イメージの例を示す。イメージは、MK2i-NPがエンドソーム-リソソーム共局在を低減していることを示す。スケールバー = 20μm。 処理後0、12及び24時間におけるMK2iペプチドと、エンドソーム-リソソーム色素であるLysoTracker(登録商標)レッドとの共局在の定量を示すグラフを示す。^*p<0.01 対 MK2i、 n ≧ 3の独立したイメージ。
種々のペプチド構造体での処理後24時間のMK2i含有細胞内区画の平均サイズを示す。区画の面積は、ImageJ softwareを用いて定量した。^*p<0.001 対 MK2i、 少なくとも３つの独立したイメージからのn=50の小胞。
MK2i-NP構造体が、Alexa(登録商標) 568-MK2iのHSV送達を増大したことを示す。 ２時間処理し、14日間組織培養で維持したVerhoeff Van-Gieson (VVG)染色したHSV切片の顕微鏡イメージの例を示す。これは、MK2i-NPが内膜新生を効果的にブロックすることを示す。赤色のバーは、血管内膜厚みの境界を定める。スケールバーは、長さ100μmである。 VVG染色した組織切片からの血管内膜の厚みの定量を示す；測定値は、別々のドナーからの少なくとも３つの静脈リングからの6〜12の径方向に平行な位置での測定値(radially parallel mesurement)の平均である。^*p < 0.01 対 NT、同一濃度における ２時間処理し、14日間組織培養で維持したHSVエクスプラントの血管内膜厚みの測定を示す。少なくとも３人の異なるドナーからn ≧ 3。処理なしのコントロール(NT)との比較において^*p ≦ 0.01。NTとの比較において^**p ≦ 0.001。 MTTアッセイにより評価されたように、２時間処理し、１又は14日間組織培養で維持したHSVリングの細胞生存能を示す。少なくとも３人の別々のドナーからのn ≧ 3の静脈リング。 ウェスタンブロット解析の結果を示す。これは、MK2i-NPが処理後２時間のヒト伏在静脈においてHnRNP A0のリン酸化を低減したことを示す。^*p < 0.05 対NT。 図３０のウェスタンブロット解析の更なる結果を提供する。ここでは、MK2i-NPは、処理後２時間のヒト伏在静脈においてHnRNP A0のリン酸化を低減する。^*p < 0.05 対 NT。 MK2i-NP処理がANG II刺激HCAVSMCにおけるTNFα産生をブロックしたことを示す。全てのデータは、細胞数に対して正規化されている。「NT」は処理なしを意味する。^*p<0.05 対 NT + TNFα、 ^#p<0.05 対 同一濃度のNE-MK2i-NP。MK2i-NP構造体は、HCAVSMCにおけるMK2iの生物活性を向上する。
ANG IIで６時間刺激し、MK2i-NP、NE-MK2i-NP又はMK2iペプチド単独で２時間処理し、フレッシュな培地で24時間培養したHCAVSMCにおけるTNFα産生を示す。全てのデータは、細胞数に対して正規化されている。「NT」は処理なしを意味する。NT + TNFα群との比較において^*p<0.05、 同一濃度のNE-MK2i-NPとの比較において^#p<0.05、n = 4。
MK2i-NPがHCAVSMCにおけるIL-6産生のTNFα誘導性の増大を部分的にブロックすることを説明する。細胞をTNFαで６時間刺激し、MK2i-NP又はMK2iペプチド単独で２時間処理し、フレッシュな培地で24時間培養した。全てのデータは細胞数に対して正規化されている。「NT」は処理なしを意味する。^*p<0.05 対 NT + TNFα、 ^#p<0.05 対 同一濃度のNE-MK2i-NP。
10 μM ANG IIで６時間刺激し、MK2i-NP、NE-MK2i-NP又はMK2iペプチド単独で２時間処理し、フレッシュな培地で24時間培養したHCAVSMCの細胞生存能を示す。「NT」は処理なしを意味する。n = 4。 TNFαで６時間刺激し、MK2i-NP又はMK2iペプチド単独で２時間処理し、フレッシュな培地で24時間培養したHCAVSMCの細胞生存能を示す。n = 4。 MK2i-NP処理が、ANG II刺激に応答してのF-アクチンストレス線維形成をブロックしたことを説明する。データは、２回の別々の実験からのn ≧ 3の細胞について示す。^*p<0.05 対 NT + TNFα、 ^#p<0.05 対 同一濃度のNE-MK2i-NP。全てのデータは細胞数に対して正規化されている。「NT」は処理なしを意味する。^*p<0.05 対NT + TNFα、
^#p<0.05 対 同一濃度のNE-MK2i-NP。
MK2i-NP又はコントロール(25μM MK2i)で１時間処理後のANG II刺激HCAVSMCにおけるF-アクチンストレス線維形成の蛍光顕微鏡イメージの例を示す。 MK2i-NP処理が、スクラッチ創傷形成から24時間後に、走化性物質であるPDGF-BB (50 ng/mL)で刺激したHCAVSMCにおける移動をブロックしたことを示す。n≧3: ^*p<0.05、^**p<0.01 対NT + PDGF、 ^#p<0.05 対 同一濃度のNE-MK2i-NP。全てのデータは細胞数に対して正規化されている。「NT」は処理なし。^*p<0.05 対NT + TNFα、
^#p<0.05 対 同一濃度のNE-MK2i-NP。
Boydenチャンバアッセイにおいて、MK2i-NPが、膜への播種から８時間後に、走化性物質PDGF-BBに向かっての細胞の移動を阻害することを示す。7回の別々のBoydenチャンバアッセイからのn=4のイメージ。^*p<0.05、^**p<0.01 対 NT + PDGF、 ^#p<0.05 対 同一濃度のNE-MK2i-NP。全てのデータは細胞数に対して正規化されている。「NT」は処理なしに等しい。^*p<0.05 対NT + TNFα、
^#p<0.05 対 同一濃度のNE-MK2i-NP。
トランスウェルインサートを介して移動した細胞の顕微鏡イメージの例を表す。イメージは10xの倍率で得た。処理用量は100μM MK2i、MK2i-NP又はNE-MK2i-NPである；PDGF-BBの用量は50 ng/mLである。 MK2iペプチド単独、MK2i-NP又はNE-MK2i-NPで30分間処理し、50 ng/mL PDGF-BBを含むか(+)又は含まない(-)フレッシュな培地で24時間培養した刺激HCAVSMCの細胞増殖を示す。「NT」は処理なしを意味する。n = 4。 静脈グラフトのVVG染色した組織切片のイメージの例に示すように、MK2i-NP処理が内膜新生を低減したことを説明する。実際、手術中のMK2i-NP処理は、移植された静脈グラフトにおいてインビボで内膜新生及びマクロファージの残留性を低減する。 術後28日目の潅流固定した頸静脈挿置グラフトにおける血管内膜厚みの定量を示す。^*p<0.01 対NT, n ≧ 7 グラフト/処理群。
静脈グラフトについてのRAM-11免疫組織化学を用いて示すように、MK2i-NP処理によっても新生血管内膜におけるマクロファージの残留性が低減したことを示す。矢印は、正に染色された細胞の境界を定める。左カラムのスケールバー = 100μm、右カラムの拡大画像のスケールバー = 50μm。 各処理群についてのウサギ頸静脈グラフトエクスプラントのRAM-11染色イメージの例を示す。矢印は、正に染色された細胞の境界を定める。左カラムのスケールバー = 100μm、右カラムの拡大画像のスケールバー = 50μm。 頸静脈グラフト切片中のRAM-11陽性マクロファージ染色の定量を示す。4つの静脈セグメントからのn = 16の組織イメージ。^*p<0.05 対 NT。 Zetasizer Nano ZSで測定された種々の電荷比([NH₃ ⁺]/[COO^-])で調製したポリプレックスのζ電位を示す。値は、少なくとも３回の独立した測定値の平均を示す。 [NH₃ ⁺]/[COO^-] = 1:3の電荷比で調製したポリプレックスのpH依存的な溶血を説明する。著しい溶血が初期〜後期エンドソーム小胞に代表的なpH値(すなわちpH < 6.8)で示されたが、7.4の生理的なpHでは著しい溶血は観られなかった。YARA-MK2iペプチド単独又はAAポリプレックスは、いずれも、DLS解析で解析した[NH₃ ⁺]/[COO^-] = 1:3の電荷比で調製したポリプレックスのPH依存性のサイズ変化を試験したpH値では著しい溶血を示さなかった。 ポリプレックスがpH 7.4において単峰型サイズ分布を示すことを説明する。示されるように、pHが低減すると、ポリプレックスが個々のYARA-MK2iペプチド及びPPAAポリマーのユニマーに解離し始める。 10 μM ANG IIで６時間刺激し、PPAAポリプレックス、AAポリプレックス又はYARA-MK2iペプチド単独で２時間処理し、フレッシュな培地で24時間培養したHCAVSMCの生存能を示す。「NT」は処理なしを意味する。n = 4。 ANG IIで６時間刺激し、PPAA ポリプレックス、AAポリプレックス又は融合MK2iペプチド単独で２時間処理し、フレッシュな培地で24時間培養したHCAVSMCにおけるTNF-α産生を示す。処理は、10、25、50又は100μMのペプチド濃度に対して正規化した。LDHアッセイによって測定された全てのデータは細胞数に対して正規化されている。NT= 処理なし。NT + TNFα群との比較において^*p<0.05、同一濃度のMK2iとの比較において^*p<0.05、同一濃度のAAポリプレックスとの比較において^**p<0.05。 Mander係数M1を算出することによって測定した緑色蛍光体と赤色蛍光体との共局在のパーセンテージを示す(本質的には、イメージ中、赤色蛍光と重複する緑色蛍光の％、すなわちエンドソーム小胞中に含まれるペプチドの％)。YARA-MK2iの用量は全てのサンプルについて25μMである。示される値は、n=3の別々のイメージの平均値 ± SEMである。同一時点におけるYARA-MK2iとの比較において^*p<0.05、同一時点におけるYARA-MK2iとの比較において^**p<0.01。このグラフは、HCAVSMCによるポリプレックス取込みの顕微鏡分析結果であり、ポリプレックスがMK2iペプチドを取込み、そのエンドソーム回避を向上することを示す。 図５３のデータに関し、共局在の定量に用いた蛍光イメージの例を示す。左の数は、２時間処理した細胞のフレッシュな培地中におけるインキュベート時間を表し、赤色及び緑色チャネルの増幅率は、いずれも、得られた全てのイメージについて一定に保った。 PPAAポリプレックスの経時的な平均蛍光強度のプロットを示す。 PPAAポリプレックスの経時的な蛍光強度のヒストグラムを示す。 YARA-MK2iペプチド単独の経時的な平均蛍光強度のプロットを示す。 YARA-MK2iペプチド単独の経時的な蛍光強度のヒストグラムである。 AAポリプレックスの経時的な平均蛍光強度のプロットである。 AAポリプレックスの経時的な蛍光強度のヒストグラムを示す。 ニトロプルシドナトリウム(SNP)による弛緩増大のパーセンテージを示す棒グラフを示す。HSVリングをフェニレフリン(PE, 10^-6 M)で収縮させ、その後SNPで弛緩させた(^10-8-10^-6 M)。次いでHSVリングを２時間処理し、PEで再び収縮させ、SNPで弛緩させ、処理後の弛緩増大を測定した。処理後の収縮の後、全てのリングをKClで収縮させ、平滑筋の機能維持を確認した。コントロールとの比較において^*p<0.05、100μM MK2iとの比較において^**p<0.05、n = 3。 HSVリングの細胞生存能を示す。２時間処理し、組織培養で24時間維持し、MTTアッセイによって評価した。n = 1。 HSVリングの細胞生存能を示す。２時間処理し、組織培養で14日間維持し、MTTアッセイによって評価した。n = 1。 ２時間処理し、組織培養で14日間維持したHSVエクスプラントの血管内膜の厚みを示す。n = 3。コントロール(未処理)との比較において^*p ≦ 0.01、コントロールとの比較において^**p ≦ 0.001、 ２時間処理し、組織培養で14日間維持したHSVエクスプラントの血管内膜/中膜(I/M)比のプロットを示す。n = 3。コントロール(未処理)との比較において^*p ≦ 0.01、コントロールとの比較において^**p ≦ 0.001、 3:1の電荷比で調製されたAZX-100ポリプレックスのDLSサイズ分布を示す。 酢酸ウラニルで染色したAZX-100ポリプレックスのTEMイメージの例を示す。DLSの結果に一致するサイズ分布を示す。 様々な電荷比で調製されたAZX-100ポリプレックスのゼータ電位のまとめを示す。3:1よりも高い電荷比において、ゼータ電位は、電荷比に正比例することが見出された。ゼータ電位の予想外のシフトが、おそらくはマクロ分子再構成に起因して、3:1の電荷比でみられた。 AZX-100ポリプレックスが、アンギオテンシンIIで刺激されたヒト冠動脈血管平滑筋細胞におけるストレス線維形成のAZX-100媒介性阻害を向上したことを示す。細胞を１時間処理し、その後アンギオテンシンIIで２時間刺激した。ファロイジンで染色され固定されたサンプル中のアクチンストレス線維を可視化し、各処理群からの個々の細胞の蛍光強度比を用いて、アクチンストレス線維形成を定量した。 AZX-100ポリプレックスが、アンギオテンシンIIで刺激されたヒト冠動脈血管平滑筋細胞におけるストレス線維形成のAZX-100媒介性阻害を向上したことを示す。細胞を１時間処理し、その後アンギオテンシンIIで２時間刺激した。ファロイジンで染色され固定されたサンプル中のアクチンストレス線維を可視化し、各処理群からの個々の細胞の蛍光強度比を用いて、アクチンストレス線維形成を定量した。 コントロール、AZ100ペプチド又はAZXポリプレックスで処理したラット大動脈平滑筋において起こった阻害のパーセントを示す。 ラット大動脈平滑筋の収縮を示す。 AZXポリプレックスで処理したラット大動脈平滑筋における収縮の用量依存的な阻害を示す。 ラット大動脈平滑筋における力のトレース及びカルシウム蛍光のトレースの例を示す。 ラット大動脈平滑筋において起こった細胞内カルシウムの変化の大きさ及び力の阻害を測定する累積的データを示す。 種々の濃度のAZX-100ペプチド又はAZXポリプレックスで処理後のHSVにおける弛緩向上の％を示す。 AZX-100 NPがヒト気管支気道平滑筋のAZX-100媒介性弛緩を向上することを説明する。 RN22含有ポリプレックスの直径、多分散指数(PDI)及びゼータ電位に対する種々の電荷比の効果を示す表及びチャートを示す。 ペネトラチン-BAK-BH3含有ポリプレックスの直径、多分散指数(PDI)及びゼータ電位に対する種々の電荷比の効果を示す表及びチャートを示す。

例示的な実施態様に関する詳細な説明
本願に開示される主題の１以上の実施態様の詳細を本明細書で説明する。本明細書に記載の実施態様の変更及びその他の実施態様は、本明細書に提供される情報に触れた当業者にとって明らかである。本明細書に提供される情報及び特に、記載された例示的実施態様の具体的詳細は、主に明確な理解のために提供され、不必要な限定がそこから理解されてはならない。矛盾する場合には、定義を含めて、本明細書の記載が制する。

各実施例は、本開示の説明のために提供され、それに限定するものではない。事実、本開示の教示に対して、本開示の範囲を逸脱することなく様々な変更及び変形が可能であることが当業者に明らかである。例えば、１つの実施態様の一部として説明又は記載された特徴を別の実施態様に適用して、更に別の実施態様とすることができる。

本開示の単数形の特徴又は限定に関する全ての言及は、反対のことが記載されているか又は言及がなされた文脈によって反対のことが明確に示唆されていない限り、対応する複数形の特徴又は限定を含むものとし、その逆もまた然りとする。

本明細書で用いる方法又はプロセス工程の全ての組合せは、反対のことが記載されているか又は言及がなされた文脈によって反対のことが明確に示唆されていない限り、任意の順序で行ってもよい。

本開示の方法及び組成物(それらの構成要件を含む)は、本明細書に記載の実施態様の必須要素及び限定並びに本明細書に記載の更なる若しくは最適な構成要件又はその他有用なものを含むか、それらからなるか、又はそれらから本質的になっていてもよい。

エンドソーム経路を回避でき、細胞質中の標的へのアクセスが改善されており、細胞内での保持時間が増大されており、細胞内で作用するペプチド薬剤のバイオアベイラビリティが改善されているペプチドを含む、活性剤を送達するための組成物及び方法のニーズがある。本開示の主題は、少なくともこれらのニーズの各々を満たす。

本願で開示する主題は、ペプチド及びポリマーを含む組成物であって、前記ペプチド及び前記ポリマーは、前記所定のpHにおいて、互いに静電結合してポリプレックスを形成する、前記組成物を含む。用語「ポリプレックス」は、クラスタ、粒子、凝集物等を形成する、静電結合したペプチド及びポリマーを指すために本明細書で用いられる。よって、本願で開示する主題の実施態様は、ペプチド及びポリマーのポリプレックスを含む組成物を含む。

ポリマー
用語「ポリマー」は、(同じタイプであるか異なるタイプであるかに拘らず)モノマーを重合することによって製造されるポリマー化合物を指すために本明細書で用いられる。よって、包括的な用語「ポリマー」は、用語ホモポリマー又は同じタイプのモノマーユニットから形成されたポリマー、及び用語コポリマー又は２以上の異なるタイプのモノマーユニットから形成されたポリマーを含む。

いくつかの実施態様において、ポリマーは、(C₁-C₆)アルキル-アクリル酸、(C₁-C₆)アルキル-メタクリル酸及び(C₁-C₆)アルキル-エタクリル酸並びにそれらの組合せから選択される１以上のモノマーを含み得る。例えば、いくつかの実施態様において、(C₁-C₆)アルキル-アクリル酸モノマーは、プロピルアクリル酸(PAA)、プロピルアクリル酸、ブチルアクリル酸等を含む。得られるポリマーは、ポリ((C₁-C₆)アルキル-アクリル酸)、ポリ((C₁-C₆)アルキル-メタクリル酸)及びポリ((C₁-C₆)アルキル-エタクリル酸)並びにそれらの組合せからなるか、又はそれらを含み得る。特定の実施態様において、ポリマーは、ポリ(プロピルアクリル酸)(PPAA)ポリマーである。

用語「アルキル」は、一般式C_nH_2n+1 (式中、n= 約1〜約18又はそれ以上)のアルキル基を指す。この基は、直鎖状であってもよいし、分枝鎖状であってもよい。アルキルは、本明細書で用いるとき、「低級アルキル」も含み、これは一般式C_nH_2n+1 (式中、n= 1〜約6)のアルキル基を指す。いくつかの実施態様において、n= 1〜約3である。例としては、メチル, エチル, プロピル, イソプロピル, n-ブチル, sec-ブチル, t-ブチル, イソブチル, n-ペンチル, イソペンチル, ネオペンチル, n-ヘキシル等を含む。この点につき、用語「シクロアルキル」は、少なくとも３つの炭素原子から構成される炭素ベースの非芳香族環、例えばシクロプロピル、シクロヘキシル等を指す。用語アルキルは、シクロアルキルを含む。

いくつかの実施態様においては、官能化モノマーが本発明のポリマーにおいて任意に用いられる。官能化モノマーは、本明細書で用いるように、マスクしたか又はしていない官能基、例えば重合後その他の部分が付加され得る基を含むモノマーである。このような非限定的な例は、１級アミノ基、カルボキシル基、チオール基、ヒドロキシル基、アジド基及びシアノ基である。いくつかの適切なマスク用の基が利用可能である(例えばT. W. Greene & P. G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis (第2版) J. Wiley & Sons, 1991. P. J. Kocienski, Protecting Groups, Georg Thieme Verlag, 1994を参照)。

いくつかの実施態様において、ポリマーは、pH応答性ポリマーである。特定の例においては、本明細書で用いられる用語ポリマーは、pH応答性ポリマーを含む。pH応答性ポリマーは、pHに依存してその電荷が変化するポリマーを含む。ポリマーは、所定のpH (これは、具体的なpH、pHの範囲、特定のpHを超えるpHおよび/または特定のpH未満のpHを含み得る)において、カチオン性であってもよいし、アニオン性であってもよい。例えば、ポリ(アルキルアクリル酸)はカルボン酸基を含み、ポリ(プロピルアクリル酸)は約6.7のpKaを有する。ポリ(プロピルアクリル酸)は、そのpKaよりも高いpHにおいてアニオン性である。しかしながら、そのpKa程度又はそれ未満のpHにおいては、カルボン酸基がプロトン化され、ポリ(プロピルアクリル酸)はもはやアニオン性ではなくなるか、又は少なくとも上記所定のpHほど強力なアニオン性ではない。この電荷の変化のために、ポリ(プロピルアクリル酸)及びその他のポリ(アルキルアクリル酸)は、例示的なpH応答性ポリマーである。

当業者は、ポリマーの環境pHに依存して異なる電荷を有する基を含むその他のポリマーを理解する。ポリマーの電荷が変化するpHは、そのpKa未満であるか、それに等しいか、又はそれを超えるpHであり得る。よって、所定のpHにおいて荷電する基を有するポリマーは、ポリプレックス形成において用いるのに望ましい可能性がある。本開示の特定の実施態様において、ポリマーは、生理的なpHにおいて帯電する。

よって、例示的なモノマー及びポリマーは、生理的なpH近傍及び/又は約pH 6.0、約pH 7.0、約pH 8.0、エンドソーム性のpH近傍(例えば約pH 5〜pH 6)又はそれらの組合せにおいて、アニオン性又はカチオン性のいずれかであり得る。いくつかの実施態様において、モノマーは、約pH 7.4未満、約pH 7.0未満、約pH 6.5未満、約pH 6.0未満、約pH 5.0未満、約pH 4.5未満、又は約pH 4.0未満のpHにおいてプロトン化が漸増する。

ポリプレックスの少なくとも部分的な分解により、ポリプレックスのコアに結合するポリヌクレオチドを周囲環境に曝露することができる。よって、ポリプレックスの少なくとも部分的な分解により、ポリヌクレオチドを最終的な標的に送達することが可能である。また、少なくとも部分的な分解により、カチオン性モノマー及び/又は疎水性モノマーを周囲環境に曝露することができる。カチオン性モノマー及び/又は疎水性モノマーは、膜破壊特性を有することができる。よって、これらモノマーの曝露は、ポリプレックスを含む膜の破壊を誘導し得る。いくつかの実施態様において、ポリプレックスが細胞に取り込まれた後、ポリプレックスは少なくとも部分的に分解し、pH応答性の様式で細胞質にポリヌクレオチドを送達できる。いくつかの実施態様において、ポリプレックスは、エンドソーム性のpH近傍又はそれより少ないpHで少なくとも部分的に分解し、少なくとも部分的に分解したポリプレックスは、エンドソーム又はリソソームの膜を破壊して、ポリヌクレオチドを特定の細胞の細胞質に送達することができる。

この点につき、モノマー及びポリマーは、膜破壊特性を有し得る。よって、これらモノマーの曝露は、ポリプレックスを含む膜の破壊を誘導し得る。いくつかの実施態様において、ポリプレックスが細胞に取り込まれた後、ポリプレックスは、少なくとも部分的に分解し、pH応答性の様式で細胞質にポリヌクレオチドを送達することができる。いくつかの実施態様において、ポリプレックスは、所定のpH近傍(例えばエンドソーム性のpH)又はそれより少ないpHにおいて、少なくとも部分的に分解し、少なくとも部分的に分解したポリプレックスは、エンドソーム又はリソソームの膜を破壊し得、活性剤は、特定の細胞の細胞質に送達され得る。

更に、実施態様のポリマーは、１以上の親水性ブロックを含むコポリマーを含む。用語「親水性ブロック」は、少なくとも約50 mol％の水溶性及び/又は水分散性モノマーを含むブロックを意味する。このような実施態様において、上記に記載した残りのモノマーは、本明細書において「pH応答性ブロック」と呼ばれるものを形成する。いくつかの実施態様において、親水性ブロックを含むポリマーは、親水性ブロックを実質的に含むコロナとポリマーのpH応答性ブロックを実質的に含むコアとを含む粒子(例えばポリプレックス)を形成できる。

かくして、ポリマーの親水性ブロック及び残りのブロックは、当該ポリマーを親水性ポリマーブロックからなる親水性表面基(すなわちコロナ)を含むミセルに組み立てることができる。親水性ポリマーブロックは、ポリエチレングリコール(PEG)、N-(2-ヒドロキシプロピル)メタクリルアミド(HPMA)、ポリ(N,N-ジメチルアクリルアミド) (pDMA)、ポリ(PEGメタクリレート) (pPEGMA)、それらの組合せ等から選択されるモノマーを含み得る。ポリマー中に親水性ブロックを含むいくつかの組成物は、静脈内、動脈内等に投与されるとき、ペプチドのより高い安定性及び送達の向上を達成し得る。いくつかの実施態様において、その他のモノマー(すなわちpH応答性モノマー)に対する親水性モノマーのモル比は、約10 mol%, 15 mol%, 20 mol%, 25 mol%, 30 mol%, 35 mol%, 40 mol%, 45 mol%, 50 mol%, 55 mol%, 60 mol%, 65 mol%, 70 mol%, 75 mol%, 80 mol%, 85 mol%及び/又は95 mol%であり得る。

ポリマーのサイズは変化し得る。サイズは、治療対象、送達される活性剤、ポリマーを形成するモノマーなどに依存してもよいし、又は依存しなくてもよい。例示的なポリマーは、約10,000 Da, 15,000 Da, 20,000 Da, 25,000 Da, 30,000 Da, 35,000 Da, 40,000 Da, 45,000 Da又は50,000 Daのサイズを含み得る。ポリマーが親水性ブロックを含む特定の実施態様において、親水性ブロックは、約500 Da, 5,000 Da, 10,000 Da, 15,000 Da又は20,000 Daであり得、pH応答性ブロックは、約5,000 Da, 10,000 Da, 15,000 Da, 20,000 Da, 25,000 Da, 30,000 Da, 35,000 Da, 40,000 Da, 45,000 Da又は50,000 Daであり得る。

活性剤
本願で開示する主題は、本実施態様のポリマーと共に用いられる活性剤を更に含む。いくつかの実施態様において、活性剤は、所定のpHに等しいか、それ未満であるか、又はそれを超えるとき、静電的電荷を帯びる。用語「活性剤」は、対象における生物学的又は化学的事象を変更、促進、加速、延長、阻害、活性化、排除、あるいは影響する化合物又は物体を指すために本明細書で用いられる。いくつかの実施態様において、本発明のポリプレックスは、第２の活性剤又は更なる活性剤を更に含む。特定の実施態様において、活性剤は、ペプチド、核酸(例えばDNA、siRNA)、抗生物質等である。

用語「ポリペプチド」、「タンパク質」及び「ペプチド」は、そのサイズ又は機能に拘りなく、アミノ酸又はアミノ酸類似体のポリマーを指すために本明細書で互換可能に用いられる。「タンパク質」は比較的大きなポリペプチドに関連付けてしばしば用いられ、「ペプチド」は小さなポリペプチドに関連付けてしばしば用いられるが、当該分野においてこれらの用語の用法は重複及び変化する。本明細書で用いる用語「ペプチド」は、そうでないと特記しない限り、ペプチド、ポリペプチド及びタンパク質を指す。用語「タンパク質」、「ポリペプチド」及び「ペプチド」は、遺伝子産物について言及するときに、本明細書において互換可能に用いられる。よって、例示的なポリペプチドは、遺伝子産物、自然に生じるタンパク質、自然に生じないタンパク質、ホモログ、オルソログ、パラログ、フラグメント及びその他等価物、これらの変異体及び類似体を含む。更に、用語「融合ポリペプチド」は、２以上の区別可能なポリペプチドから形成されたポリペプチドを包括的に指すために本明細書で用いられる。

いくつかの実施態様において、活性剤であるペプチドは、MAPKAPキナーゼII阻害ペプチド(MK2i)を含む。理論又はメカニズムに拘束されないが、MK2iペプチドは、抗炎症物質としての活性を有し、平滑筋細胞の移動を活発にするF-アクチンストレス線維形成 (これは、内膜新生及び血管収縮を引き起こし得る)を阻害すると考えられる。したがって、MK2iは、血管の弛緩を亢進し、内膜新生を低減すると考えられる。よって、MK2iは、血管グラフト手術、特に伏在静脈グラフティングと併用するときに有益であり得る。

MK2ペプチド及び/又はMK2iペプチドに関する更なる情報については、米国特許出願公開第2012/0263680, 2011/0288036及び2008/0293640号(これらは全体が参照により本明細書に組み込まれる)を参照されたい。

ペプチドは、静電的に荷電することができる。いくつかの実施態様において、本開示のペプチドは、所定のpHにおいて、静電的に荷電する。例えば、ペプチドは、所定のpHにおいて、それ未満のpHで、又はそれを超えるpHで、カチオン性又はアニオン性であり得る。当業者は、ペプチドのpKa未満であるか、それに等しいか、又はそれを超えるpHにおいて少なくとも、電荷を有する官能基(例えばアミン基)を有する様々なペプチドを理解する。いくつかの好ましい実施態様は、生理的なpHで荷電する(例えば、カチオン性)ペプチドを含む。

本開示の組成物のいくつかの例示的な実施態様は、当該１級アミンのpKa (すなわち約pH 9〜約pH 12)未満のpHであるときに、MK2iをカチオン性とする１級アミンを含むMK2iペプチドを含む。他の例示的なペプチドは、BH3模倣性Bakインヒビター(これは、がん細胞のアポトーシスを惹起するために用いることができ、所定のpHにおいて荷電することができる)を含む。別の例示的なペプチドは、気道の弛緩に利用できるAZX100ペプチド(配列番号2)を含む。更に他の実施態様においては、活性剤は、限定されないが、RN22ペプチド(配列番号3)及びペネトラチン-Bak-BH3ペプチド(配列番号4)を含むアポトーシス促進性ペプチドであり得る。よって、組成物において用いられるペプチドに依存して、組成物は、多様な異なる状態及び/又は疾患を治療するために用いることができる。

いくつかの実施態様において、ペプチドは、２つの区別可能なペプチドを含む融合ペプチドであってもよい。融合ペプチドであるペプチドは、活性剤を含む第１のペプチドと、細胞浸透性ペプチドを含む第２のペプチドを含み得る。細胞浸透性ペプチドは、一般に、細胞浸透性ペプチド及び/又はそれに結合した任意の分子の細胞への取り込みを惹起、加速、活性化又は促進するペプチドである。

例えば、いくつかの実施態様において、細胞浸透性ペプチドは、「YARA」である。YARAは、活性剤を含む第１のペプチドに結合することができる。その他の細胞浸透性ペプチドは、TATペプチド、アンテナペディア(AntP)ペプチド、及び当該分野で公知のその他の細胞浸透性ペプチドを含む。いくつかの実施態様において、細胞浸透性ペプチド及び活性剤としてのペプチドは、それぞれYARA及びMK2iである。本明細書で用いるように、「YARA-MK2i」(配列番号1)は、細胞浸透性ペプチド(YARA)及びMAPKAPキナーゼIIインヒビターペプチド(MK2i)の両方を含むペプチドを指す。

したがって、いくつかの実施態様において、活性剤はペプチドである。いくつかの実施態様において、ペプチドは細胞浸透性ペプチドを更に含む。細胞浸透性ペプチドは、活性剤としてのペプチドと同一のペプチドであってもよいし、異なるペプチドであってもよい。更に、いくつかの実施態様において、活性剤は、活性剤としてのペプチドである部分と、細胞浸透性ペプチドである別の部分とを含む融合ペプチドである。

ポリプレックス
更に、本願で開示する主題は、本明細書に記載されるポリマーと活性剤とを含むポリプレックスを含む。いくつかの実施態様において、ポリマー及び活性剤は、所定のpHにおいて反対の電荷を有し、したがって、前記所定のpHにおいて、静電結合してポリプレックスを形成することができる。所定のpHは、活性剤(例えばペプチド)又はポリマーのpKaを超えていてもよいし、他方の活性剤又はポリマーのpKa未満であってもよい。例えば、所定のpHは、約6.5〜約8.0のpH、より具体的には約pH 6.5, 約pH 6.6, 約pH 6.7, 約pH 6.8, 約pH 6.9, 約pH 7.0, 約pH 7.1, 約pH 7.2, 約pH 7.3, 約pH 7.4, 約pH 7.5, 約pH 7.6, 約pH 7.7, 約pH 7.8, 約pH 7.9又は約pH 8.0であり得る。また、所定のpHは、対象の生理的なpHであってもよい。本明細書に記載されるように、用語「所定のpHにおいて」は、特定のpHであるか、特定のpH未満であるか、特定のpHを超えるか、又はpHの範囲内であるpHを指し得る。

本実施態様のポリプレックスは、特定のポリマー及び所定のpHにおいて反対に荷電する活性剤で形成され得る。本実施態様のポリプレックスの形成は、ポリマー及び活性剤が所定のpHにおいて両方とも存在するときに起こり得る。よって、いくつかの実施態様において、ポリプレックスは、少なくとも静電相互作用によって結合するポリマー及び活性剤を含む。本明細書に記載されるように、本発明のポリマー及び/又は活性剤の電荷は、pHが所定のpHから当該所定のpHでないpHまで変化するときに中和し、増強し又は正から負に若しくは負から正に変化し得る。これが起こるとき、ポリマー及び活性剤は、もはや反対の電荷を有しないか、及び/又は反対の電荷が弱くなるように変化し、それによりポリプレックスの分解が可能となる。

この点につき、ポリプレックスの少なくとも部分的な分解により、ポリプレックスに結合して包含された活性剤(例えばポリヌクレオチド)を周囲環境に曝露することができる。よって、ポリプレックスの少なくとも部分的な分解は、活性剤を最終的な標的に送達することを可能にする。また、本明細書に記載されるように、少なくとも部分的な分解は、膜破壊特性を有し得るポリマーを曝露することができる。いくつかの実施態様において、細胞へのポリプレックスの取込み後、ポリプレックスは、少なくとも部分的に分解し、pH応答性の様式で活性剤を細胞質に送達することができる。いくつかの実施態様において、ポリプレックスは、エンドソーム性のpH近傍又はそれより低いpHで少なくとも部分的に分解し、少なくとも部分的に分解したポリプレックスがエンドソーム又はリソソームの膜を破壊することで、活性剤を特定の細胞の細胞質に送達することができる。したがって、活性剤と共にポリプレックスを形成する本実施態様のポリマーはエンドソーム分解性であり、それによりポリプレックスによって細胞に入った活性剤の細胞質への送達が可能になるか、及び/又は亢進できる。

ポリプレックスの具体的な実施態様は、MK2i及びポリ(プロピルアクリル酸)の組成物を含む。約6.5〜約8.0の所定のpHにおいて、MK2iはアニオン性であり、ポリ(プロピルアクリル酸)はカチオン性である。したがって、組成物は、約6.5〜約8.0の所定のpHにおいて、MK2i及びポリ(プロピルアクリル酸)のポリプレックスを形成できるか、及び/又は含むことができる。

組成物は、活性化pHにあるときに活性化することができる。いくつかの実施態様において、活性化pHは、所定のpH未満のpHである。いくつかの実施態様において、活性化pHは、対象の細胞の初期エンドソームにおいて見られるpH近傍である。組成物が活性化pHにあるとき、前記ペプチドと前記ポリマーとの間に形成される静電結合を破壊(例えば、開裂)できる。結合は、結合した２以上の分子が互いに解離し得る程に弱まるか又は排除されたときはいつでも破壊される。

例えば、MK2iペプチド及びポリ(プロピルアクリル酸)ポリマーを含むいくつかの実施態様の組成物は、約6.5以下の活性化pHも有する。よって、MK2i及びポリ(プロピルアクリル酸)ポリプレックスが6.5以下のpHに曝露するとき、MK2i及びポリ(プロピルアクリル酸)は、互いに解離し得る。

活性化pHで活性化されることによって、活性化pHにあるポリプレックスの組成物は、不活性な結合状態から活性な非結合状態へと、活性剤を活性化することができる。また、ポリマー及び活性剤の解離は、エンドソーム相互作用及び/又は破壊並びにエンドソーム-リソソーム又はリサイクル経路からのペプチドの回避を可能にする膜破壊活性も活性化することができ、それによりエンドソームなどからの細胞質中へのペプチド送達を可能にする。その後、活性剤は、細胞内の１以上の細胞質又はその他の標的を標的化することができる。

よって、従来の組成物とは異なり、理論又はメカニズムに拘束されないが、本願で開示する主題の実施態様は、まず標的細胞のエンドソーム経路に入ることができ、次いでpHで活性化されて標的細胞のエンドソームから細胞質に少なくとも部分的に逃れることができる。このことは、ペプチド活性剤の効果を増大するという利点を有する。また、このことにより、単独で投与されたか又は細胞浸透性ペプチドだけに結合したペプチドよりもペプチドの細胞内保持時間及び/又はバイオアベイラビリティを増大することができる。

更に、組成物及び/又はポリプレックスは、広範囲の異なる濃度の活性剤及びポリマーを含み得る。いくつかの実施態様において、活性剤及び/又はポリマーの濃度比は、電荷比、又はポリマーの荷電した基のモル比に対する活性剤の荷電した基のモル比によって決まる。例えば、組成物がMK2i及びポリ(アクリル酸)を含む場合、電荷比は、[NH₃ ⁺]:[COO^-]のモル比として定義することができる。例示的な組成物は、約10:1, 約9:1, 約8:1, 約7:1, 約6:1, 約5:1, 約4:1, 約3:1, 約2:1, 約1:1,約1:2, 約1:3, 約1:4, 約1:5, 約1:6, 約1:7, 約1:8, 約1:9又は約1:10の電荷比を含む。

ペプチドの生物活性は、いくつかの実施態様において、血管平滑筋細胞中の疾病シグナルであるアンギオテンシンII (Ang II)に応答しての炎症シグナル(TNF-α)産生の阻害の観点から示される。ヒトの伏在静脈 (HSV)において、PPAAポリプレックスは、HSVの血管弛緩を亢進すること、及びHSVにおける内膜新生を低減することが示される。

特定の実施態様において、所定のpHは、ペプチド活性剤に存在する１級アミン及び/又はポリマーに存在するカルボン酸基のpKa値に関連付けて選択される。特定の実施態様において、ペプチドのpKaは約9〜約12であり、及び/又はポリマーのpKaは約6〜約7である。これらの混合は、ポリプレックスの形成をもたらす。

いくつかの実施態様において、本開示の組成物/化合物は、少なくともナノスケール又はその他のサブミクロンスケールで測定することができる次元を有するポリプレックスを含む。ポリプレックスのサイズは、細胞への送達のために、とりわけエンドソーム経路による細胞への送達のために最適化することができる。その他の実施態様において、組成物は、少なくとも１次元において、約50 nm、約 60 nm、約 70 nm、約 80 nm、約 90 nm、約 100 nm、約 110 nm、約 120 nm、約 130 nm、約 140 nm、約150 nm、約 160 nm、約 170 nm、約 180 nm、約 190 nm、約200 nm、約 210 nm、約 220 nm、約 230 nm、約 240 nm、約250 nm、約 260 nm、約 270 nm、約 280 nm、約 290 nm、約300 nm、約 310 nm、約 320 nm、約 330 nm、約 340 nm、約350 nm、約 360 nm、約 370 nm、約 380 nm、約 390 nm、約400 nm、約 410 nm、約 420 nm、約 430 nm、約 440 nm、約450 nm、約 460 nm、約 470 nm、約 480 nm、約 490 nm又は約500 nmのポリプレックスを含み得る。特定の実施態様において、ポリプレックスは、少なくとも１次元、例えば直径において、約90 nm〜約200 nmのサイズを有する。特定のポリプレックスはナノスケールで測定することができるので、ポリプレックスは、本明細書においてナノ粒子又はナノポリプレックスとも呼ばれ得る。

いくつかの実施態様において、ポリマーは、ポリプレックスの外殻(コロナ)を形成でき、かつ、ポリプレックスを保護できる親水性ブロックを含む。いくつかの実施態様において、ポリマーのこのようなブロックは、ポリプレックスがタンパク質を吸着する範囲内で減らしたり、なくしたりすることができる。また、例示的なポリプレックスの親水性の外殻は、赤血球の溶血又は凝集を阻害でき、免疫系の刺激を回避でき、循環時間を改善でき、貨物(例えば、活性剤)を酵素による分解から保護でき、コロイド安定性及び「潜伏」を提供でき、又はこれらを組み合わせて発揮することができる。

更に、本願で開示する主題は、本明細書に記載されるポリプレックス及び/又はその医薬組成物を含む、本明細書に記載される組成物を合成する方法を含む。いくつかの実施態様において、方法は、所定のpHにおいて、ポリマー及びペプチドが部分的に又は完全に反対に荷電するポリマーと活性剤とを混合し、静電結合させて少なくとも１つのポリプレックスを形成させることを含む。組成物の形成に用いるポリマー及びペプチドの濃度は、特に限定されない。いくつかの実施態様において、ポリマー及びペプチドを、２つの成分によって得られる電荷比が約10：1〜約1：10となる濃度で混合する。いくつかの実施態様において、ポリマー及びペプチドは、バッファー、例えばPBSバッファー中で混合する。

本明細書に記載されるように、いくつかの実施態様において、活性剤は、細胞浸透性ペプチドを更に含むペプチドを含み得る。この点につき、細胞浸透性ペプチドを含むポリプレックスを合成する方法は、活性剤とポリマーとを混合する工程の前に、活性剤(例えば、ペプチド)を細胞浸透性ペプチドに融合する工程を含んでいてもよい。したがって、得られる組成物は、ペプチド活性剤としての融合ペプチド及び細胞浸透性ペプチドのポリマーを含む少なくとも１つのポリプレックスを含む。

いくつかの実施態様において、本開示は、所定のpHにおいて、活性剤、例えばペプチド(例えばYARA-MK2i融合ペプチド)と、ポリマー、例えばpH応答性のエンドソーム分解性ポリマーPPAAとを混合する工程を含む、ポリプレックス組成物を合成する方法に関する。

治療方法において用いるとき、又はポリプレックスを分解するために、ポリプレックスを、所定のpH (pHの範囲であってもよい)から活性化pH (pHの範囲であってもよい)へと移行することができる。この移行は、ポリマー及び活性剤を含有するポリプレックスの少なくとも部分的な分解を促進することができる。

組成物及び装置
更に、本願で開示する主題は、本明細書に開示される組成物、ポリプレックス、ペプチド及び/又はポリマーの医薬組成物を含む。更に、本願で開示する主題は、医薬的に許容される塩、溶媒、生理的に機能性の誘導体及び/又は本明細書に記載される化合物の医薬的に許容される誘導体も含む。

このような医薬組成物は、医薬的に許容される担体を含んでいてもよい。この点につき、用語「医薬的に許容される担体」は、滅菌した水性又は非水性の溶液、分散液、懸濁液又は乳液及び滅菌した注射可能な溶液又は分散液中で使用直前に再構成するための滅菌した粉体を指す。例えばレシチンのようなコーティング剤を用いることによって、分散液の場合には必要とされる粒子サイズに維持することによって、及び界面活性剤を用いることによって、適切な流動性を維持することができる。また、これらの組成物は、保存剤、湿潤剤、乳化剤及び分散剤のようなアジュバントを含んでいてもよい。パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸等のような様々な抗菌剤及び抗真菌剤を含ませることによって、微生物の作用を防ぐことを確実にすることもできる。また、糖類、塩化ナトリウム等のような等張化剤を含ませることも望ましいことであり得る。モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンのような吸収を遅らせる物質を含ませることによって、吸収が延長された注射製剤を得てもよい。注入可能なデポ製剤は、ポリラクチド-ポリグリコリド、ポリ(オルトエステル)及びポリ(無水物)のような生分解性ポリマーにおいて薬剤のマイクロカプセル化マトリクスを形成させることによって製造することができる。ポリマーに対する薬剤の比及び用いる具体的ポリマーの性質に依存して、薬剤の放出速度を制御してもよい。また、注入可能なデポ製剤は、生体組織に適合可能なリポソーム又はマイクロエマルジョン中に薬剤をトラップすることによっても製造することができる。例えば細菌捕捉フィルターを用いて濾過することによって、又は滅菌水又はその他の滅菌した注射用媒体中に使用直前に溶解又は分散できる滅菌固体組成物の形態に滅菌剤を導入することによって、注入可能な製剤を滅菌してもよい。適切な不活性の担体としては、ラクトースのような糖類を含み得る。

適切な製剤は、抗酸化剤、緩衝化剤、静菌剤、殺菌用抗生物質及び製剤と意図される受容者の体液とを等張化する溶剤を含み得る水性及び非水性の滅菌注射用液；及び懸濁剤及び増粘剤を含み得る水性及び非水性の滅菌懸濁液を含む。

組成物は、油性又は水性のビヒクル中の懸濁液、溶液又は乳液の形態であってもよく、懸濁剤、安定剤及び/又は分散剤のような製剤用添加剤を含んでいてもよい。あるいは、活性成分は、適切なビヒクル、例えば滅菌したパイロジェンフリーの水を用いて使用前に構成するための粉体であってもよい。

製剤は、単回用量又は複数回用量用の容器、例えば密封したアンプル及びバイアル中にあってもよいし、滅菌した液状担体を使用直前に添加することのみを必要とする凍結状態又は凍結乾燥状態で保管されていてもよい。

また、組成物は、移植又は注入のための製剤として製剤化されてもよい。よって、例えば、組成物は、適切なポリマー材料又は疎水性材料と共に(例えば許容される油中の乳液として)製剤化されていてもよい。いくつかの実施態様において、組成物は、移植のためのデバイス又は材料と共に、又はそれらによって製剤化される。実施態様の組成物と共に用いることができるデバイスの例としては、組成物、例えばMK2iを含有する組成物を含む血管グラフト(例えば伏在静脈グラフト)を含む。組成物は、デバイスを形成する材料中、デバイス等の表面に提供されてもよい。組成物を含む本実施態様のグラフトデバイスは、グラフトが内膜過形成等を引き起こし得る位置に組成物を直接送達する能力を有し得る。デバイスは、対象に移植するための多岐にわたる医薬デバイスを含んでいてもよい。また、デバイスは、対象の内部又は表面に移植され得る材料(生体材料を含む)を含む。

更に、本願で開示する主題は、組成物又は医薬組成物の投与に有用なデバイスと共に梱包された、本明細書に記載される組成物又は医薬組成物を含み得るキットを含む。当業者が認識するように、適切な投与補助デバイスは、組成物又は医薬組成物の製剤並びに選択された投与部位及び/又は所望の投与部位に依存する。例えば、組成物の製剤が対象に注射するために適切である場合、デバイスはシリンジであり得る。別の例としては、所望の投与部位が細胞培養培地である場合、デバイスは滅菌したピペットであり得る。更に別の例としては、所望の投与部位が静脈又は動脈である場合、デバイスはグラフトであり得る。

更に、例示的な組成物は、関連するペプチドの効果を増大できるので、いくつかの実施態様の組成物は、ペプチドの服用が対象において活性を示す時間を延長することができる。このことは、投与が困難であるか又は回数が限られている適用において特に役立ち得る。例えば、血管グラフトは、典型的には、活性剤で１回のみ(すなわち、外科手術及び/又は移植中に)治療されるので、組成物は、関連するペプチドが生物活性を示す時間を延長することができる血管グラフトと併せて投与することが望ましい。

使用方法
更に、本願で開示する主題は、組成物を用いて状態及び/又は疾患を治療する方法を含む。本開示の方法は、本明細書に記載される組成物(すなわち、ポリマー及び活性剤を含む組成物)の有効量を対象に投与することを含む。いくつかの実施態様において、治療される状態は、血管の状態、例えば内膜過形成である。また、当業者は、血管に影響するその他の様々な状態、及び本開示に従う活性剤を含む組成物を用いて治療することができるその他のシステムを理解する。いくつかの実施態様において、対象は、細胞浸透性ペプチドであるか又はそれを含むペプチドを含むペプチド活性剤によって治療可能な疾患又は状態を治療される。したがって、特定の実施態様は、特定の状態を治療するために活性剤を投与する方法を提供する。ここでは、組成物を用いて状態を治療する方法は、活性剤の効果、寿命等を増大する。

用語「投与(する)」は、対象に組成物及び/又はその医薬組成物を提供する全ての方法を指す。このような方法は、当業者に周知であり、限定されないが、経口投与、経皮的投与、吸入による投与、鼻腔内投与、局所投与、膣内投与、眼内投与、耳内投与、脳内投与、直腸投与、及び静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与及び皮下投与のような注射を含む非経口投与を含む。投与は、当該組成物を含む溶液中の、治療すべき組織、例えば静脈を浸漬する組成物を局所投与を含んでいてもよい。また、投与は、組成物又はその医薬組成物を含むデバイス又は材料を提供し、次いで対象にデバイス又は材料を移植するか又は提供することによって達成してもよい。投与は、継続的であってもよいし、断続的であってもよい。様々な態様において、製剤は、治療のために投与してもよい；すなわち、存在している疾患又は状態(例えば内膜過形成等)を治療するために投与してもよい。更なる様々な態様においては、製剤は、予防のために投与してもよい；すなわち、疾患又は状態の予防のために投与してもよい。

いくつかの実施態様において、対象は、有効量の組成物を投与される。この点につき、用語「有効量」は、所望の結果を達成するため又は望ましくない状態に対する効果を得るために十分な量を指す。例えば「治療有効量」は、所望の治療結果を達成するため又は望ましくない症状に対する効果を得るために十分であるが、悪性の副作用を引き起こすには一般的に不十分な量を指す。具体的な患者についての具体的な治療上有効な用量レベルは、治療すべき異常及び異常の重篤度；用いる具体的な組成物；患者の年齢、体重、一般的な健康状態、性別及び食事；投与時間；投与経路；用いる具体的組成物の排出速度；治療期間；具体的組成物と組み合わせて又は同時に用いられる薬剤及びこれらに類似する医療分野において周知の要因を含む様々な要因に依存する。例えば、所望の治療効果を達成するために必要とされるレベル未満のレベルの用量の組成物から開始して、所望の効果が得られるまで徐々に服用量を増大することは当業者が通常なし得る。望ましい場合には、投与目的のために、有効な１日の用量を複数回用量に分けてもよい。結果として、単回用量の組成物は、１日の服用量を構成する量又はその複数に分けた量を含んでいてもよい。何らかの禁忌事由がある場合には、個々の医師は、用量を調整してもよい。服用量は変化してもよく、１日に１回以上投与してもよいし、１日又は数日間投与してもよい。所定のクラスの医薬品についての適切な服用量の手引きは、文献に見出すことができる。更なる様々な態様においては、製剤は、「予防有効量」；すなわち、疾患又は状態の予防のために有効な量で投与されてもよい。

また、用語「対象」又は「それを必要とする対象」は、具体的な疾患、病的状態、異常等に関連する症状を示してもよい投与標的を指す。本明細書に開示される方法の対象は、脊椎動物、例えば哺乳動物、魚類、鳥類、爬虫類又は両生類であり得る。よって、本明細書に開示される方法の対象は、ヒト、非ヒト霊長類、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、ヒツジ、ウシ、ネコ、モルモット又はげっ歯類であり得る。この用語は、年齢や性別を特定するものではない。よって、雄性又は雌性に拘りなく、成体及び新生の対象及び胎児を包含することが意図される。患者は、疾患又は異常で冒された対象を指す。用語「対象」は、ヒト及び獣医学的な対象を含む。

用語「治療」又は「治療する」は、疾患、病的状態又は異常を治癒、緩和、安定化又は予防する意図をもってする対象の医学的な管理をいう。この用語は、積極的な治療、すなわち疾患、病的状態又は異常の改善を具体的な目的とする治療を含み、根治療法、すなわち関連する疾患、病的状態又は異常の原因を除去することを目的とする治療も含む。加えて、この用語は、対症療法、すなわち疾患、病的状態又は異常を治癒するよりもむしろ症状を緩和するために設計された治療；予防治療、すなわち関連する疾患、病的状態又は異常の進展を最小化するか又は部分的に若しくは完全に阻害することを目的とする治療；及び補助的治療、すなわち関連する疾患、病的状態又は異常の改善を目的とする別の具体的な治療法を補助するために用いられる治療を含む。

本願で開示する主題を、以下の具体的だが非限定的な実施例によって更に説明する。実施例は、開発段階及び本願で開示する主題に係る実験において様々な時点で収集されたデータの代表であるデータの集積を含み得る。

本開示の発明者らは、エンドソーム分解性のナノポリプレックス(NP)構造体による治療用ペプチドの細胞質への送達及び保持のための一般化可能なアプローチを開発した。この技術は、例えば、抗炎症性の細胞浸透性ペプチド(CPP)、例えばMAPKAPキナーゼ2インヒビター(MK2i)を送達し、血管バイパスグラフトにおいて内膜過形成(IH)をブロックするために用いることができる。

多くのCPPと同様に、MK2iの作用の効力及び寿命はエンドソーム-リソソーム経路におけるトラップ及び細胞質標的に対するバイオアベイラビリティが制限されている点で劣っている。しかしながら、MK2i-NP構造体が、ペプチドの取込み、エンドソーム回避、細胞内における半減期、及びインビトロでの生物活性を著しく向上することが見出された。実際、MK2i-NPは、炎症シグナル伝達をブロックし、ヒト伏在静脈においてIHをエクスビボで阻害し、ウサギ静脈移植モデルにおいてIHをインビボで著しく低減する。よって、本願に開示するNP技術は、治療用ペプチドの細胞内への送達のためのより広範な使用可能性を有する新たな送達プラットフォームを提供し、本明細書に開示される有望なMK2i-NPデータは、静脈グラフトの失敗を低減するために、このアプローチの臨床的応用の継続を動機付ける。

ここで、新規のペプチド送達システムは、当初、死因の筆頭である冠動脈性心疾患(CHD)の治療に焦点を当てて開発された。自家の伏在静脈及び内胸動脈を用いる冠動脈バイパスグラフティングは、現行の標準的な多枝CHD治療である；しかしながら、ほぼ半分の伏在静脈グラフトは、内膜過形成 (IH)に起因して18月以内に失敗する。IHの原因の１つは、回収中のグラフトに対する機械的及び生化学的ストレス及びより速く、より脈動する心臓の血流への移植後の適応/動脈化に起因する血管平滑筋細胞(VSMC)中のp38マイトジェン活性化プロテーンキナーゼ経路の活性化である。活性化されたp38はMAPKAPキナーゼII (MK2)をリン酸化し、リン酸化MK2の核から細胞質への転移を惹起し、そこで炎症反応、血管収縮及び病的なVSMC表現型を誘導するシグナル(これらは、合わさってIH及び究極的にはグラフト閉塞及び生着不全に導く)を伝達する。血管再建術中、自家静脈は、典型的には、移植の30分前に摘出される。結果として、摘出中の治療は、標的外の全身性の効果を制限しつつ標的組織への送達を向上する局所的治療のための状況を提供する。しかしながら、この簡単な治療のための好機は、静脈グラフトの動脈化/適応段階全体を通じて取込み及び作用時間を最大化する治療アプローチからの恩恵を受けて、治療の効果を確実にする。

p38インヒビターの臨床試験は、上流のメディエータの多面発現効果の阻害に関連付けられる毒性のために失敗している。このことは、抗炎症標的としてのMK2の追跡を動機付けるが、小分子であるMK2インヒビターもまた、特異性及び水溶性の欠如に起因してFDA認可を得るのに失敗している。しかしながら、ヒト伏在静脈中でいくらか活性を有する効果的な細胞浸透性ペプチド(CPP) MK2インヒビター(MK2i)が開発された；不運にも、MK2iの効力は、細胞内への取込み及び後期エンドソーム/初期リソソームへの隔離の乏しさにより妨害されており、細胞質に局在する活性化MK2に対して非効率な細胞内でのバイオアベイラビリティをもたらす。

本明細書では、血管細胞及び組織中にMK2iを効率的に送達し、ペプチドのバイオアベイラビリティをインビトロ、エクスビボ及びインビボで１桁向上する、静電的に複合体化したエンドソーム分解性ポリプレックスを形成させるための単純かつ応用性のある方法を開示する。MK2i-NPは、血管バイパスグラフトの性能を改善する臨床的応用のために強力な可能性を有し、NPアプローチは、医療技術において、一般に使用するための生物活性ペプチド送達用ベクターの著しい革新に相当する。

実施例１
可逆的付加開裂連鎖移動(RAFT)重合によって、ポリ(プロピルアクリル酸)(PPAA)ホモポリマー(Mn = 22,000, PDI = 1.47)を合成した。標準的なFMOC化学によってMK2iペプチド(配列：YARAAARQARAKALARQLGVAA)を合成し、逆相高速液体クロマトグラフィ(HPLC)によって精製した。MK2iペプチド及びPPAAポリマーを10:1〜1:10の電荷比(CR, [NH₃ ⁺]/[COO^-]で定義される)で混合し、ポリプレックスを形成させた。

ポリプレックスのサイズ、多分散性及びゼータ電位を動的光散乱(DLS)を用いて測定した。更なる研究のために最適な構造体として、1:3の電荷比を選択し、約119 ± 27 nmの流体力学直径及び約-11.9 ± 3.2 mVのゼータ電位(ζ)を有するポリプレックスを作製した。ポリプレックスのpH-依存的なペプチド放出及び膜破壊性(すなわちエンドソーム分解性)の挙動は、DLS及び赤血球溶血アッセイを用いて特徴決定した。インビトロMK2阻害は、TNFαで刺激されたヒト冠動脈血管平滑筋細胞(HCAVSMC)におけるインターロイキン-6 (IL-6)産生の下流での阻害を定量するELISAによって評価した。ヒト伏在静脈(HSV)エクスプラントを、同意が得られたヒト患者から取得し、1 mm厚静脈リングセグメントの血管弛緩を筋肉浴槽(muscle bath)/力変換器を用いてエクスビボでアッセイした。

MK2iポリプレックス、MK2i単独又はコントロールで2時間リングを処理し、その後フェニレフリン(10^-6〜10^-7 M)で収縮させ、次いでニトロプルシドナトリウムの累積ログ用量を用いて弛緩させ、弛緩のパーセントを測定した。別の静脈グラフトを14日間培養し、固定し、パラフィンに包埋し、切片化し、Verhoeff-van Gieson染色し、これを用いて血管内膜及び中膜の厚みを定量し、グラフト内膜過形成を抑止するポリプレックスの治療能力を評価した。

動的光散乱の結果は、ポリプレックス(CR=1:3)は、pH 7.4において約119 nmのサイズであり、pH 6.8以下で個々のポリマー及びペプチドユニマーに解離することを示し、エンドソーム中のポリプレックスからのペプチド放出の効果的なメカニズムを提供する。ポリプレックスは、pH 7.4又は6.8で溶血性の挙動を示さないが、pH 6.2及び5.6においてスイッチ様のロバストな溶血を示す。これらのデータは、ポリプレックスの解離及びペプチド放出の後、エンドソーム小胞の更なる酸性化がpH-依存的なエンドソーム分解活性を惹起し、ペプチドの細胞質への送達を可能にすることを示唆する(図2)。

MK2iポリプレックスの生物活性をインビトロで確認した。MK2iを含むポリプレックスは、MK2i単独と比較して、HCAVSMCにおけるTNFα誘導性IL-6分泌を阻害することが観察された(図3)。

また、MK2i-ポリプレックスで処理したHSVエクスプラント中の平滑筋の生理的特性は、MK2i単独に曝露されたHSVエクスプラントよりも著しい弛緩を示す。更に、あるポリプレックスは、10分の１の用量で、MK2iと同じレベルの弛緩向上を達成した。例えば、図4に示されるように、約10μMのMK2iを含むポリプレックス及び用量100μMの非ポリプレックスMK2iは、いずれも約15%〜20%の弛緩を示した。

図５は、MK2i単独と比較して、MK2iポリプレックスが内膜過形成を予防する能力が向上していることを証明しており、血管内膜の厚みが低減していることを示す。組織培養の14日後、MK2iポリプレックスで処理したHSV切片は、63.8±8 nmの血管内膜厚みを有する一方、非ポリプレックスMK2iで処理したHSV切片は、10μM (p = 0.05)で89.5±13.9 nmの血管内膜厚みを有する。組織培養の14日後において、MK2iポリプレックスで処理したHSVの血管内膜/中膜比は0.459±0.058である一方、MK2i単独で処理したHSV切片は、10μMで0.736±0.132の血管内膜/中膜比(p = 0.03)を有していた。

実施例2：MK2i-NPの合成及び物理化学的な特徴決定
MK2iペプチド(YARAAARQARAKALARQLGVAA)を固相合成によって合成し、エレクトロスプレーイオン化質量分析によって純度を確認した(図6)。可逆的付加開裂連鎖移動(RAFT)重合を用いて、ポリ(アクリル酸)(PAA)[Mn = 10,830 (GPC), Mn = 7,640 (H1 NMR), PDI = 1.27 (GPC) (図7及び図8)]及びポリ(プロピルアクリル酸)(PPAA)[Mn = 22,010 (GPC), Mn = 21,950 (H1 NMR), PDI = 1.47 (GPC) (図9及び図10)]を合成した。ナノポリプレックス(NP)を、PAA又はPPAAホモポリマーとMK2iペプチドとをpH 8.0 (これは、MK2iペプチド中に存在する１級アミンのpKa値とPPAAポリマー中のカルボン酸部分のpKa値との間である)のPBS中で単純に混合することによって形成させた。PAAをベクターコントロールとして用いる。なぜなら、それはPPAAに類似の構造を有するが、その低いpKa (pKa 〜4.3)に起因して生理的に関連する範囲においてpH応答性を欠いたアニオン性ポリマーだからである。

最適なポリプレックス形成条件を決定するため、MK2i-NPライブラリを電荷比[すなわち、CR = ([NH₃ ⁺]_MK2i:[COO^-]_PPAA)]の範囲で調製し、サイズ分布及び粒子の表面電荷を、それぞれ動的光散乱(DLS)及びζ電位分析によって特徴決定した。MK2i-NPのζ電位はCRに正比例し、CR 〜2:1で見掛け等電点を有していた(図13)。また、CRは、MK2i-NPのサイズに著しく影響し、CR範囲が狭い場合のみ単峰型サイズ分布(すなわち、CR = 1:2及び1:3、表1)を生じた。

表1．異なる電荷比([NH₃ ⁺]/[COO^-])において調製されたMK2i-NPのサイズのまとめ。DLS分析によって測定した。アスタリスク(^*)は、多峰型サイズ分布を指す。1:3 (Alexa)ポリプレックスをAlexa488-コンジュゲートMK2iペプチドを用いて形成させ、細胞内取込み研究に用いた。ビヒクルコントロールとして用いて、1:3 (NE)ポリプレックスを、エンドソーム性のpH範囲においてpH-依存的な膜破壊活性を示さない非エンドソーム分解性(NE)ポリ(アクリル酸)ポリマーを用いて形成させた。

最小の粒子サイズ及び多分散性を有する単峰型サイズ分布を一貫して生じるので、この実施例では1:3のCRを選択した(d_h=119 ± 28 nm, ζ = -11.9±3.2 mV)。生物学的研究のためのビヒクルコントロールとして、PAAを用いて非エンドソーム分解性なMK2iナノポリプレックス(NE-MK2i-NP)を形成させた。PAAを用いてCR=1:3で調製したNE-MK2i-NPは、エンドソーム分解性MK2i-NPと統計的に等価のサイズ及びζ電位(d_h=114 ± 38 nm, ζ = -16.4 ± 5.1 mV)を有していた。細胞内での追跡を可能にするために、1:3のCRでAlexa(登録商標)-488コンジュゲートMK2iペプチドを用いて蛍光MK2i-NP及びNE-MK2i-NPを調製した。これらは非標識NPに類似のサイズ及び電荷を生じた。CR = 1:3で調製されたNPをTEMイメージング(図14、図15、図16)によって更に特徴決定した。その結果は、DLSの結果と一致していた。

エンドソーム-リソソームの条件下で梱包されないMK2i-NPを、pH範囲でDLSを用いて評価した。その結果、細胞外のpHから、PPAAのカルボン酸のpKa (pH 〜6.7)に向かってpHが低くなるにつれてMK2i-NPが解離することが明らかとなった：これは初期エンドソームの条件とも相関する(図17)。理論に縛られないが、より低いpHではPPAAポリマーがプロトン化/脱イオン化され、ペプチドの正味の正電荷が静電反発及びMK2i-NPの分解を引き起こす。初期エンドソームに似た条件下におけるNP分解は、ペプチドの生物活性及び/又はPPAAのエンドソーム膜破壊機能が、ポリマーとペプチドとの相互作用によって立体的に妨害される可能性を低減する。

実施例3：MK2i-NPの細胞内在化、エンドソーム回避及び細胞内での保持
2時間処理し、洗浄し、フレッシュな培地中で5日間維持したHCAVSMCのフローサイトメトリーによって、経時的なMK2i-NP取込み量及び細胞内保持量を評価した。ペプチド取込みの１桁を超える増大を、MK2i-NPで処理した細胞において測定し、NE-MK2i-NP及びMK2iと比較した(図18)。NE-MK2i-NPの取込みは遊離ペプチドと等価であったため、これらのデータは、細胞内在化における違いがNP組成物に起因し、粒子の形状及び電荷に依存しないことを示す。また、MK2i-NPで処理したHCAVSMCは、細胞内におけるペプチドのより安定な保持を示す一方、NE-MK2i-NP及びMK2i処理細胞は、おそらくはエンドソーム-リソソーム経路におけるペプチドの分解又は細胞外へのエキソサイトーシスのための輸送に起因して、細胞内ペプチドをより急速に喪失した(図19)。MK2i-NPは、処理/洗浄後の最初の72時間のインキュベーション期間にわたって蛍光増大を示した。この効果は、細胞の外側の膜に結合したMK2i-NPの内在化の遅延に起因するものではない。この蛍光増大は、細胞内においてMK2iがNPから徐々に非梱包化される間に減衰するAlexa(登録商標)-488自己消光機構に起因すると仮定する。

赤血球溶血アッセイを用いて、エンドソーム回避機能の指標としての、MK2i-NPのpH依存的な膜破壊活性を評価した。PPAAは、そのpKa以下のpH (〜6.7)で赤血球膜を破壊した(図20)。細胞外のpH (7.4)及び初期エンドソームのpH (6.8)において、MK2i-NPは、わずかな膜破壊活性を示した。しかしながら、後期エンドソームに代表的なpH (6.2)及びリソソームに代表的なpH (5.6)においては、溶血の著しい増大が観られた。後期エンドソーム/リソソームのpHにおけるMK2i-NPの溶血性の挙動は、40 μg/mL MK2i-NPにおいてpH 5.6で起こる>90%の赤血球溶解をもって、ポリマー濃度に正比例した(図21)。NP構造体は、pH 6.8における遊離PPAAに比して膜破壊活性をわずかに隠したが、MK2i-NPは、PPAAポリマーに固有の膜破壊活性を保持する。MK2iペプチド単独も非エンドソーム分解性NE-MK2i-NP構造体も、エンドソーム-リソソームのpH範囲において膜破壊活性を示さなかった。

ヒト冠動脈血管平滑筋細胞(HCAVSMC)中においてMK2i-NPのエンドソーム回避をイメージングし、インビトロで定量した(図22)。遊離ペプチドとして、又はNE-MK2i-NPによって送達した殆ど全て(〜90%)のMK2iは、LysoTracker(登録商標)色素と共局在化した。しかしながら、MK2i-NP構造体は、MK2iとエンドソームとの共局在を著しく低減した。2時間処理し、洗浄後、MK2i/LysoTracker(登録商標)共局在の長期定量を行い、全ての時点においてMK2i-NP構造体についてのMK2i/LysoTracker(登録商標)共局在が著しく低減され、NP構造体によって送達されたMK2iとLysoTracker(登録商標)との共局在は経時的に低減したことが明らかとなった(図23)。区画サイズの定量は、NE-MK2i-NP又はMK2iで処理した細胞がエンドソームに代表的な小胞内におけるMK2i局在を示すが、MK2i-NPを介して送達されたMK2iは、漏れやすく、膨潤したエンドソームのマクロピノソーム又は細胞質領域に代表的であり得るより大きな区画において見られることを明らかにした(図24)。

実施例4：ヒト伏在静脈における内膜過形成の阻害
静脈IHのエクスビボ組織培養モデルにおいて、ヒト伏在静脈(HSV)リングを2時間処理し、その後高血清状態で維持し、内膜新生を加速させた。Alexa^*r(-568 コンジュゲートMK2iペプチドを用いて、血管壁へのMK2i送達を評価した。インビトロでの結果と同様に、MK2i-NPは、一貫して、遊離MK2iよりも向上した取込みを示した(図25)。培養の14日後、弾力性のある層のVerhoeff-Van Gieson (VVG)染色を組織切片について行った(図26)。複数のドナーからの血管内膜の厚み測定により、MK2i-NPが、用量依存的に、かつ、遊離MK2iよりも１桁低量のペプチド用量で、IHを著しく阻害することが明らかとなった(図27、図28のフルデータセット)。100μM MK2iでのMK2i-NP療法は、IHを完全に抑止する唯一の処理であり、回収直後に組織学的研究用に調製したコントロール組織に統計的に等価(p=0.49)な血管内膜の厚みを生じた。処理の1及び14日後にMTTアッセイを行い、組織培養の結果が組織の細胞毒性によって影響されないことを確認する(図29)。

実施例5：MK2i-NP生物活性の機構解明
MK2の炎症作用は、下流のエフェクター、すなわち転写後遺伝子調節因子であるトリステトラプロリン(TTP)及びヘテロ核リボヌクレオタンパク質A0 (hnRNPA0) (これは炎症性サイトカインのmRNAの発現を安定化及び亢進する)を介して作用する。MK2i-NPがこの機構のブロックによって作用することを確認するために、HnRNP A0のリン酸化を評価した。ウェスタンブロットにより、MK2i-NPがHSVにおいてHnRNP A0リン酸化を著しく阻害することを確認した(図30、図31)。アンギオテンシンIIで刺激したHCAVSMCにおけるサイトカイン産生のインビトロELISA分析によりこの機構を確認した。MK2i-NPは、主要なhnRNPA0の標的であるTNFα²¹の分泌を効果的に阻害した(図32、図33)。MK2i-NPは、１桁低量で、NE-MK2i-NP及びMK2iに等価なTNFα阻害を達成し(すなわち、10 μM MK2iが100 μM MK2iと等価の効果を奏した)、100 μM MK2i-NPは、アンギオテンシンIIで刺激したTNFα産生を完全に抑止する。また、TNFα刺激HCAVSMCにおけるインターロイキン-6産生の阻害は、遊離ペプチド単独に比して、MK2i-NPの生物活性の著しい増大を示した(図34)。いずれの処理も著しい毒性を引き起こさなかった(図35、図36)。

また、MK2活性は、Limキナーゼ(LIM-K)及びヒートショックプロテイン27 (HSP-27)の下流におけるリン酸化によって、ストレス線維形成及び細胞の移動を惹起した。ストレス線維形成は、アンギオテンシンII刺激HCAVSMCにおいてMK2i-NPにより著しく阻害され、NE-MK2i-NP及びMK2iに比して著しく向上した生物活性を示した(図37)。MK2i-NP処理細胞は、刺激なしのコントロール細胞と同様に表層アクチン染色を示したが、NE-MK2i-NP及びMK2i処理は、ストレス線維形成を完全にブロックしなかった(図38)。MK2i-NPがIHの病的なVSMC移動特性を妨げることを確認するため、スクラッチ創傷及びBoydenチャンバ移動アッセイの両方を、HCAVSMCについてPDGF-BB存在下で行った(図39、図40、図41)。両アッセイにおいて、MK2i-NPは、遊離MK2iペプチドよりも１桁低量で細胞移動を阻害した。増殖アッセイにより、これらの結果が細胞増殖に対する治療の効果に寄与しないことを確認した(図42)。

実施例6：ウサギ静脈グラフト挿置モデルにおけるインビボ生物活性
MK2i-NPのインビボにおける治療効果を、ポリマーカフ方法を用いて血流の乱れを誘導し、グラフトIHを加速するウサギ両側頸静脈グラフト挿置移植モデルで評価した。このモデルにおいて、グラフトが典型的な血管再建術中に摘出される最小時間に相当する30分間、エクスビボで頸静脈グラフトを処理した。各ウサギについて、１つのグラフトを処理し、対側グラフトがビヒクルコントロールを受けた。術後28日でグラフトを回収し、VVG染色した組織切片を血管内膜の厚み測定に用いた(図43)。30μM MK2i-NPでの処理は、未処理の細胞及び遊離MK2iペプチド(これらは、単独では内膜新生における顕著な変化をもたらさなかった)に比して、新生血管内膜の成長を著しく阻害した(図44)。

移植された静脈グラフトにおけるMK2i-NPの抗炎症効果を確認するために、ウサギマクロファージ特異的抗体であるRAM-11を用いて、組織切片を染色した(図45、図46)。MK2は、炎症性サイトカイン、例えばTNFαの産生を上方調節する転写後遺伝子調節因子であるhnRNP A0を活性化し、TNFα産生は、静脈グラフトに存在する平滑筋細胞、内皮細胞、線維芽細胞及び白血球中の単球走化性タンパク質-1 (MCP-1)の発現を誘導する。MCP-1は、循環炎症細胞の強力な走化性物質であり、MCP-1 mRNAレベルは、静脈グラフトのグラフティングから8週後でさえも上昇し、単球及び組織マクロファージの静脈壁への動員及びIHの発病をもたらすことが示された。最後に、移植から4週後に行ったマクロファージ分析により、MK2i-NP処理グラフトにおいて血管内膜マクロファージの残留性が著しく低減することが示され、MCP-1によるTNFα誘導性のマクロファージの動員が治療により阻害されることを示唆した(図47)。

ディスカッション
MK2iペプチドの細胞による取込み及び生物活性は、治療用ペプチドの天然構造を変更せず、標的の結合及び生物活性に対する潜在的に有害な効果を回避することによって１桁向上した。また、これらの結果は、VSMCの活性化された病的表現型のIHへの移行及びグラフトの失敗をもたらすp38 MAPK/MK2経路が担う役割に焦点を当てる。

更に、CPPは、治療用ペプチドにコンジュゲートして、細胞の取込みを増大することができるが、CPPの同一性は、標的の特異性に著しく影響することが示されており、殆どのCPPはエンドソーム-リソソーム輸送経路を回避することができない。核酸送達のために正に荷電したCPP配列又はポリマートランスフェクション剤を用いるパラダイムとは対照的に、正に荷電したCPP-ベースMK2iペプチドからの正味に負に荷電したポリプレックス構造体の形成がVSMCへの取込みを著しく向上することが見出された。

VSMCは、負に荷電した粒子(例えばLDL)を取り込む多様なスカベンジャー受容体を発現し、血管ストレスは、これら受容体の発現を上方調節する。インビトロでの結果は、高レベルのMK2i細胞内在化及びMK2i-NPを用いて達成されたエンドソーム-リソソーム輸送経路からの回避が、ポリプレックスの形状及び電荷によって純粋に決まるというよりも、むしろ具体的なPPAA組成物に依存的であることを示唆する。このことは、MK2i-NPに類似のサイズ及び電荷を有するNE-MK2i-NPによるMK2iペプチドの細胞内への取込みの増大が観られなかったという観察結果から推定することができる。

理論に拘束されることを望まないが、MK2i-NPの細胞内在化の加速は、細胞表面の相互作用及び/又は取込みの機構の変化に起因し得る。理論に拘束されることを望まないが、複数のエンドサイトーシス経路によってMK2i-NPが平滑筋細胞に入ること及びMK2i-NPの内在化においてマクロピノサイトーシスが機能し得るが、NE-MK2i-NP又はMK2iでは機能し得ないことを示唆する。ここでは、PPAAベースのポリプレックスが、マクロピノサイトーシス及びエンドソームの漏れを併せて惹起し、細胞質へのアクセスを向上すると報告されたアデノウイルスの内在化機構を生体模倣し得ることを示唆する。

マクロピノソームは、酸性化された区画に輸送され、他のエンドソーム小胞よりも漏れやすい可能性がある。この内在化経路は、PPAAのpH依存性の膜破壊活性と合わされば、MK2i-NPによる送達時におけるMK2iの細胞内での半減期の著しい増大の主な原因となり得る。

MK2iの細胞内での半減期(T_1/2)は、MK2i-NPへの組込みによって14倍増大した(MK2i-NP T_1/2 = 57.8日 対 MK2i T_1/2 = 4.1日；処理から0及び5日後における細胞内ペプチドの蛍光に基づいて算出)。このT_1/2増大は、潜在的にグラフティング時の１回の治療で急性炎症段階及び治癒段階の両方の全期間に治療の効果を延長できるので、静脈グラフティング用途等に適用可能である。

MK2i-NPの細胞内での半減期がおよそ8週と推定されるため、移植前の１回の治療は、静脈グラフト適応期間中IHを阻害して、長期的性能を著しく改善し得る。手術中のエクスビボグラフト治療は、標的組織への送達を向上するための治療ストラテジとして有用であり、標的外の効果又は全身の毒性の可能性を回避する。

本開示の主題は、PPAAとのポリプレックス構造体がMK2iペプチドの細胞内への送達及び生物活性を著しく増大すること、及びこのシステムが血管グラフト移植中に適用してIHを阻害するための予防治療として顕著な臨床的潜在能力を有することを確からしめる。

材料及び方法
細胞浸透性MK2阻害ペプチドの合成
配列YARAAARQARAKALARQLGVAAを有するMK2阻害ペプチド(MK2i)は、標準的なFMOC化学を利用するPS3 peptide synthesizer (Protein Technologies, Inc. Tucson, AZ)を用いて合成した。ペプチド合成において、N-メチルピロリドン(NMP, Fischer Scientific)を溶媒として用いた。N-メチルモルホリンの存在下でHCTUをアクチベータ(Chempep, Wellington, FL)として用いた。収率及び純度を最大化するため、全てのアミノ酸を２回カップリングさせた。TFA/フェノール/H₂O/トリイソプロピルシラン(88/5/5/2)中でペプチドを開裂/脱保護した。次いで、拡張フローキット、Waters 2489 UV/Visible検出器及びphenomenex Luna C18(2) AXIAパックカラム(100A, 250 x 21.2 mm, 5ミクロン)を取り付けたWaters 1525 ２溶媒系HPLCを用いる逆相HPLCによってペプチドを更に精製した。0.05%ギ酸を含むHPLCグレードの水及びHPLCグレードのアセトニトリルを移動相として用い、90% A〜90% B勾配を用いて、ペプチドを25分以上精製した(16 mL/分)。回転蒸発機を用いてアセトニトリルを精製画分から除去し、次いで精製画分を凍結乾燥させた。Waters Synapt ESI-MSを用いるエレクトロスプレーイオン化質量分析(ESI-MS)によってペプチドの純度を確認した。

モノマー及びポリマー合成
全ての試薬は、Sigmaから購入し、そうでないと記載しない限り分析グレードであった。Ferritoらにより概説される手順に従って、ジエチルプロピルマロネート(Alfa Aesar)を前駆体として用いて2-プロピルアクリル酸を合成した。上記のとおりにして、4-シアノ-4-(エチルスルファニルチオカルボニル)スルファニルペンタン酸(ECT)連鎖移動剤(CTA)を合成した。2,2’-アゾ-ビス-イソブチリルニトリル(AIBN)を遊離基開始剤として用いて、窒素雰囲気の容器中で、70℃で48時間、PPAAホモポリマーのRAFT重合を行った。

反応混合物を３回の凍結-真空化-融解サイクルに付し、重合前の30分間窒素でパージした。CTA：AIBNのモル比は1：1であり、モノマー：CTA比は、25,000 g/molの分子量が100%変換時に達成されるように設定した。重合後、得られたポリマーをDMFに溶解し、エーテル中で5回沈殿させ、真空中で一晩乾燥させた。PAAホモポリマーのRAFT重合は、AIBNを遊離基開始剤として用いて、蒸留したジオキサン中で、窒素雰囲気下に70℃で18時間行った。重合前の30分間、反応混合物を窒素でパージした。CTA：AIBNのモル比は5：1であり、モノマー：CTA比は、8,000 g/molの分子量が100%変換時達成されるように設定した。重合後、得られたポリマーをジオキサン中に溶解し、エーテル中で5回沈殿させ、真空中で一晩乾燥させた。0.1% LiBrを含むHPLCグレードのDMFを60℃で移動相として用いるゲル濾過クロマトグラフィ(GPC, Agilent)を用いて、PPAA及びPAAホモポリマーの分子量及び多分散性(M_w/M_n, PDI)を測定した。分子量の算出はASTRA Vソフトウェア(Wyatt Technology)を用いて行い、屈折率検出器によるポリマーの手作業の注入によって実験的に測定されたdn/dc値に基づいていた(算出されたPPAA dn/dc = 0.087 mL/g, 算出されたPAA dn/dc = 0.09 mL/g)。

MK2iナノポリプレックス(MK2i-NP)の合成及び特徴決定
PPAAを1 M NaOH中に溶解させ、リン酸緩衝液(pH 8)に希釈し、ストック溶液を得た。精製したMK2iペプチドをリン酸緩衝液(pH 8)中に溶解させた。MK2iペプチド及びPPAAポリマーを[NH3+]:[COO-] = 10:1〜1:10のCR範囲で混合し、MK2i-NPを形成させた。0.45μm PTFEフィルターを用いて、得られたポリプレックスをシリンジ濾過し、再利用可能な細胞浸漬キットを有するMalvern Zetasizer Nano-ZS (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, U.K.)を用いて流体力学直径及びζ電位を特徴決定した。

次いで、1:3のCRを選択し、その後のインビトロ、エクスビボ及びインビボ研究において用いた。非エンドソーム分解性ポリマーPAAと共に同じCRで形成させたナノポリプレックス(すなわち、NE-MK2i-NP)をDLSによって分析し、ビヒクルコントロールとして用いた。DLS分析によって示されたサイズを確認するため、1:3の電荷比でMK2i-NP及びNE-MK2i-NPを透過型電子顕微鏡(TEM)イメージングによって可視化した。ポリプレックス水性懸濁液(1 mg/mL)の液滴20μLにカーボンフィルム支持膜を有する銅製グリッド(Ted Pella)をのせてTEMサンプルを調製し、拭き取って乾燥させた。次いで、全てのサンプルを3%酢酸ウラニルの液滴20μLにのせて2分間染色した。サンプルを拭き取って乾燥させた後、サンプルを真空中で2時間乾燥させ、200 kVで作動するPhilips CM20 systemを用いてイメージングした。AMT Image capture Engine software (Advanced Microscopy Techniques, Danvers, MA)を備えたCCDカメラを用いてイメージを収集した。次いで、1:3のCRでポリプレックスのpH-依存的なサイズの変化を、PBS -/-中の様々なpH値(すなわち、pH 7.4, 6.8, 6.2及び5.6)でDLS分析によって定量した。

pH-依存的な膜破壊溶血アッセイ
MK2i-NPのエンドソーム破壊能力を評価するため、赤血球溶血アッセイを用いて、MK2i-NPによる脂質二重層のpH-依存的な破壊を測定した。ヒト全血を匿名のドナーから採取し、遠心分離によって血漿を除去し、生理食塩水で洗浄した。残った赤血球を150 mM NaClで3回洗浄し、生理的(pH 7.4)、初期エンドソーム(pH 6.8)、初期/後期エンドソーム(pH 6.2)及び後期エンドソーム/リソソーム(pH 5.8)の環境に相当するリン酸緩衝液中に再懸濁した。MK2i-NP、NE-MK2i-NP、MK2iペプチド単独(1〜40μg/mL)、PBS (ネガティブコントロール)又は1% Triton X-100 (ポジティブコントロール)を赤血球懸濁液に加え、37℃で1時間インキュベートした。遠心分離によってインタクトな赤血球をペレットにし、上清を新たな96ウェルプレートに移した。次いで、541 nmでの吸収によって上清中のヘモグロビン含有量を測定した。Triton X-100及びPBSコントロールと比較によって溶血のパーセントを決定した。

細胞培養
初代HCAVSMCはLonzaから取得した； 5% FBS、ヒト塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF, 5 ng/mL)、ヒトインスリン(5μg/mL)、アスコルビン酸(50μg/mL)、L-グルタミン(10 mM)、ヒト上皮成長因子(EGF, 5 ng/mL)及び1% ペニシリン-ストレプトマイシン]を補った血管細胞塩基性培地(ATCC)(完全培地)中でHCAVSMCを培養した。

全ての培養物は、75cm²ポリスチレン組織培養フラスコ中で、37℃及び5% CO₂の環境で、細胞培養培地を１日置きに交換して維持した。80〜90%コンフルエンスになるまで細胞を成長させ、回収し、継代した。全ての細胞は、それぞれの具体的実験に応じて、20,000〜30,000細胞/cm²の密度で播種した。実験では、早い代からの細胞(番号3〜8)だけを用いた。

炎症性サイトカインの分析
200μLの細胞懸濁液(10,000細胞/ウェル)を96ウェルプレートに播種し、およそ70%コンフルエンス/ウェルを得た。細胞を一晩プレートに付着させた。

腫瘍壊死因子-α ELISA
10μM ANG-IIを含む低血清培地(DMEM, 1% FBS及び1% P/S, 細胞を分裂停止させるため)中で4時間細胞を処理し、MK2i-NP、MK2i又はNE-MK2i-NPで2時間処理した。処理後、各ウェルをアスピレートし、フレッシュな培地を補った。24時間後、100μLの上清を回収し、サイトカイン分析を行うまで−80℃で凍結させた。ヒトTNF-α (cat#900-K25) ELISA development kit (Peprotech; Rocky Hill, NJ)を用いて、製造業者のプロトコルに従って処理した細胞から回収した上清中のサイトカインレベルを測定した。次いで、製造業者のプロトコルに従ってCytoTox-ONE Homogenous Membrane Integrity Assay (Promega)により測定した細胞の生存能に対して全てのデータを正規化した。

インターロイキン-6 ELISA
20 ng/mL TNF-αを含む低血清培地中で4時間細胞を処理し、MK2i-NP、MK2i又はNE-MK2i-NPで2時間処理した。処理後、各ウェルをアスピレートし、フレッシュな培地を補った。24時間後、100μLの上清を回収し、サイトカイン分析を行うまで−80℃で凍結させた。ヒトTNF-α (cat#900-K16) ELISA development kit (Peprotech; Rocky Hill, NJ)を用いて、製造業者のプロトコルに従って処理した細胞から回収した上清中のサイトカインレベルを測定した。製造業者のプロトコルに従ってCytoTox-ONE Homogenous Membrane Integrity Assay (Promega) により測定した細胞の生存能に対して全てのデータを正規化した。

F-アクチンストレス線維アッセイ
Lab-Tek II 8-ウェルチャンバカバーガラス(Thermo Scientific Nunc)中に15,000細胞/ウェルでHCAVSMCを播種し、一晩付着させた。次いで、10、25及び50μMの濃度のMK2i-NP、NE-MK2i-NP又はMK2iペプチド単独を含む低血清培地中で1時間細胞を処理した。処理後、PBS -/-で細胞を洗浄2xし、その後1μMアンギオテンシンII (Sigma Aldrich)又はPBS -/- (ネガティブコントロール)で2時間処理した。ANG-II刺激後、細胞をPBSで洗浄2xし、4%パラホルムアルデヒド中で5分間固定し、0.4% Triton-X 100で10分間透過化処理し、PBS -/-中の1% BSAで15分間ブロックした。次いで、細胞をHoechst溶液(PBS -/-中1/5000希釈)で10分間染色し、Alexa-488-ファロイジンで30分間染色した。次いで、染色したカバースリップをProLong Gold antifade mounting medium (Invitrogen)を含むガラスカバースライドにのせた。スライドを24時間乾燥させ、密封し、イメージングした。処理した細胞は、NIS Elements imaging softwareを備えたNikon Eclipse Ti倒立蛍光顕微鏡(Nikon Instruments Inc, Melville, NY)を用いてイメージングした。ゲインの設定及び露光時間は、撮像した全てのイメージについて一定に保った。個々の細胞を任意に選択し、各処理群について2回の独立した実験から、n ≧ 5細胞の蛍光強度比を算出するimageJ softwareを用いて、ストレス線維形成を定量した。

走化性移動アッセイ：スクラッチ創傷アッセイ
Lab-TEK II 8-ウェルチャンバカバーガラス中の250μl 低血清培養培地中に20,000細胞/ウェルの密度でHCAVSMCを播種し、一晩付着させ、ほぼコンフルエント(90〜95%)な単層を得た。MK2i-NP、NE-MK2i-NP、MK2iペプチド又はPBS -/-で30分間細胞を処理した。処理後、10μLピペットチップで各細胞単層の中央にスクラッチ創傷を作った。次いで、培地を、CellTracker(商標) Green BODIPY(登録商標)色素(Invitrogen)を含む低血清培養培地に置き換え、移動した細胞を可視化するために、製造業者のプロトコルに従って30分間細胞質を染色した。色素で処理後、培地を、50 ng/ml PDGF-BBを含む低血清培養培地 (又はネガティブコントロール用のPBS -/-)で置き換えた。次いで、NIS Elements imaging softwareを備えたNikon Eclipse Ti倒立蛍光顕微鏡 (Nikon Instruments Inc, Melville, NY)を用いて、0、3、6、12及び24時間におけるスクラッチ創傷領域を撮像した。imageJ softwareを用いて、移動した細胞の周辺のスクラッチ創傷領域面積(元のスクラッチ創傷エリアに対して正規化した)を定量することによって閉じた傷を算出した。スクラッチ創傷アッセイは、各処理群について、3回の独立した実験を行った。

走化性移動アッセイ：Boydenチャンバアッセイ
24ウェルプレート中の低血清培地に30,000細胞/ウェルの密度でHCAVSMCを播種し、一晩付着させた。MK2i-NP、NE-MK2i-NP、MK2iペプチド又はPBS -/-で30分間細胞を処理した。処理後、各ウェルをPBS -/-で洗浄2xし、トリプシン処理し、100μl低血清培養培地に再懸濁し、下側チャンバ中の、50 ng/ml PDGF-BBを含む600μl低血清培養培地(又はネガティブコントロール用PBS-/-)を含む24ウェルプレート中の6.5 mm, 8μm孔ポリカーボネートインサート(Corning)に置いた。細胞を8時間移動させ、次いで各インサートの上側の細胞を綿布で穏やかに取り除いた。次いで、各インサートの下側の細胞を固定し、Modified Giemsa Differential Quik Stain Kit (Polysciences)を用いて染色した。簡潔には、インサートを溶液A中で少なくとも10秒間固定し、溶液Bに5回浸漬し、次いで溶液Cに5回浸漬した。各インサートについての４つの四分割領域から4つのイメージを撮像し、imageJにおいて各イメージの閾値を設定し、手作業で細胞を数えることによって、細胞の数/高倍率視野を定量した。各処理を３連で(in triplicate)行い、平均細胞数/HPFを算出する。

細胞増殖アッセイ
96ウェルプレート中の低血清培地に10,000細胞/ウェルでHCAVSMCを播種し、一晩付着させた。MK2i-NP、NE-MK2i-NP、(ポジティブ及びネガティブコントロール用の)MK2iペプチド又はPBS -/-で30分間細胞を処理した。次いで、各処理物をアスピレートし、100 μl 低血清培養培地 ± 50 ng/mL PDGF-BBで置き換えた。24時間のインキュベーション後、製造業者のプロトコルに従ってCellTiter 96(登録商標) Aqueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (Promega)を行った。簡潔には、100μlフェナジンメトスルフェート(PMS)溶液を2.0 ml MTS溶液に添加し、混合した。次いで、20μlのPMS/MTS溶液を、100μlの培地を含む96ウェルプレートの各ウェルに添加し、加湿した5% CO₂雰囲気中、37℃で4時間プレートをインキュベートした。インキュベーション後、TECAN Infinite M1000 Proプレートリーダーを用いて490 nmで各ウェルの吸光度を記録し、処理群間の増殖速度比を測定した。

細胞内への取込み及び細胞内輸送の顕微鏡分析
アミン反応性のAlexa-488スクシンイミジルエステルをDMSO中に溶解させ、100 mM重炭酸ナトリウムバッファー (pH = 8.3)中でMK2iペプチドと1：3のモル比で混合した。PD-10 miditrap G-10脱塩カラムを用いて、反応していない蛍光体及び有機溶媒を除去し、蛍光標識されたペプチドを凍結乾燥させた。PPAA及びPAAポリマーを、蛍光標識したMK2iペプチドと[NH₃ ⁺]/[COO^-] = 1:3のCRで混合し、0.45μm PTFEフィルターでシリンジ濾過し、蛍光MK2i-NP及びコントロールNE-MK2i-NPをそれぞれ形成させた。蛍光MK2i-NP及びNE-MK2i-NP 流体力学直径及び表面電荷を、それぞれDLS及びゼータ電位分析によって測定した。蛍光MK2i-NP、NE-MK2i-NP又はMK2iペプチド単独を、Lab-Tek II 8-ウェルチャンバカバーガラス(Thermo Scientific Nunc)上で成長したHCAVSMCに、1% FBS及び1% P/Sを補ったDMEM培地中10μMのMK2iペプチド濃度でアプライした。細胞を2時間処理し、PBS -/-で洗浄2xし、培地を置き換える。次いで、フレッシュな培地中で更に0、2、4、10又は22時間細胞をインキュベートした。インキュベーションの最後の2時間、細胞内の酸性エンドソーム/リソソーム小胞を可視化するために、50 nM LysoTracker(登録商標) Red DND-99 (Invitrogen)を各ウェルに添加した。インキュベーション後、0.1%トリパンブルーで1分間細胞を洗浄し、細胞外の蛍光を消光し、PBS -/-で更に2回洗浄した。次いで、ZEN imaging software (Carl Zeiss Thornwood, NY)を備えたLSM 710 META蛍光顕微鏡を用いて細胞を撮像した。ゲインの設定は、各処理群について得られた全てのイメージについて一定に保った。

imageJ softwareを用いて全てのイメージを加工し、Just Another Colocalization Plugin (JACoP)を用いて共局在を分析する。次いで、Mander重複係数(両方の蛍光チャネルにおいて正のピクセル値を有するピクセルの割合)を各処理群につきn ≧ 3の別個のイメージについて算出し、共局在を定量した。ペプチドが観察された区画のサイズに対する治療の効果を測定するために、ImageJのフリーハンド選択ツールを用いて、各処理群につき≧50の個々の細胞内区画の外縁をとり、各々の面積を定量し、平均をとった。

細胞内への取込み及び保持のフローサイトメトリーによる定量
HCAVSMCを80〜90%コンフルエンスまで増殖させ、回収し、24ウェルプレート中に20,000細胞/ウェルで播種し、低血清培地中で一晩付着させた。蛍光MK2iペプチド、MK2i-NP及びNE-MK2i-NPを、顕微鏡分析について上記したとおりにして合成し、濃度10μMのMK2iでHCAVSMCを2時間処理した。処理後、細胞をPBS -/-で洗浄し、CellScrubバッファー(Genlantis)を用いて10分間室温で洗浄し、細胞外のポリプレックス及び/又はペプチドを除去し、PBS -/-で洗浄2xし、培地を、完全培地で置き換えた。次いで、細胞を更に0、12、24、72又は120時間インキュベートした。次いで、PBS -/-で細胞を洗浄し、トリプシン処理し、BD CellQuest(商標) Pro software (V 5.2)を備えたFACSCalibur flow cytometer (Becton Dickinson)で分析するために、PBS (-/-)中の0.1%トリパンブルーに再懸濁した。データをエクスポートし、FlowJo software (V 7.6.4)で分析した。全てのサンプルについて３連で行った。

ヒト伏在静脈
冠動脈又は末梢血管バイパス手術を受けた患者から同意を得て、不特定の廃棄HSVセグメントを回収した。外科的切除後、手術の終わりまで(この時点では、それらは、冷えた移植片回収バッファー(100 mMラクトビオン酸カリウム, 25 mM KH₂PO₄, 5 mM MgSO₄, 30 mMラフィノース, 5 mMアデノシン, 3 mMグルタチオン, 1 mMアロプリノール, 50 g/L ヒドロキシエチルスターチ, pH 7.4)中に置かれた)、HSVセグメントを生理食塩水中で保管した。全てのHSVセグメントは、回収から24時間以内に用いた。滅菌培養フード中の滅菌技術を用いて、HSVセグメントを60 mmペトリ皿に移した。各セグメントの端(0.5 mm)をブレードで取り除き、余分な外膜および脂肪組織を最小操作で除去した。HSV セグメントをおよそ1.0 mm幅の一続きのリングに切断し、組織培養又は筋肉浴槽実験において用いた。各セグメントにつき2つのリングを直ちに10%ホルマリン中37℃で30分間固定し、培養前の血管内膜の厚みを測定した。

HSV 組織培養及びエクスビボIHアッセイ
静脈セグメントの機能維持を試験するための準備として、HSVリングの重量を測定し、長さを記録した。次いで、95% O2及び5% CO2を用いて37℃で平衡化した重炭酸バッファー (120mM NaCl, 4.7 mM KCl, 1.0 mM MgSO₄, 1.0 mM NaH₂PO₄, 10 mMグルコース, 1.5 mM CaCl₂及び25 mM Na₂HCO₃, pH 7.4)を含む筋肉浴槽にHSVリングを懸垂した。リングを伸ばし、最大の張力が得られるまで長さを少しずつ調整した。各血管セグメントについて受動的な長さ-張力の関係を測定することによって、規格化された反応性を得た。1 gの静止張力(これは、収縮性アゴニストに対して最大の応答を生じる)でリングを維持し、バッファー中で2 h平衡化した。Powerlab data acquisition system及びChart software (AD Instruments, Colorado Spリング, CO)に接続したRadnoti Glass Technology (Monrovia, CA)力変換器(159901A)を用いて、力を測定した。

まず、110 mM KCl (重炭酸バッファー中のNaClを等モルで置き換え)を用いてHSVリングを収縮させ、生じた力を測定した。110 mM KClは膜の脱分極を引き起こし、機能を維持した平滑筋を含む血管の収縮をもたらした。複数回のKClチャレンジで血管の機能維持を確認した後、更にリングをカットし、24ウェルプレートに置き、30% FBS、1% L-グルタミン及び1%ペニシリン/ストレプトマイシンを補ったRPMI 1640培地中に、14日間37℃、エアー中5%のCO₂雰囲気下で維持した。リングを処理しないか又はMK2i-NP、NE-MK2i-NP、MK2iペプチド若しくはバッファー単独で2時間処理し、洗浄し、フレッシュな培地に置いた。処理なしの培養培地は、14日間2日おきに置き換えた。

HSV機能維持
HSVリングについて、処理後1及び14日目にMTTアッセイを行った。HSVリングを調製し、上記したとおりに処理し、1又は14日間組織培養し、HSVリングの重量を測定し、次いでDPBS中に溶解された0.01% メチルテトラゾリウム250μL中に置いた。37℃インキュベータ中に1時間リングを置いた。リングを蒸留水中に置くことによって反応を止めた。次いで、1 mLのCelloSolve中にリングを置き、37℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、溶液中でリングを混合し、CelloSolveを抜き取り、キュベットに置き、570 nmでの光学密度を測定した。機能維持比の算出は、リングの湿重量に対して正規化された光学密度に基づいた。

血管の形態計測
組織培養の14日後、0.5 mlの10%ホルマリン中で、37℃で30分間静脈セグメントを固定し、切片作製のためにパラフィン中に包埋した。各リングの中央部から開始して、5 μm間隔で5つの横断切片を各検体からカットした。次いで、Verhoeff-van Gieson染色で切片を染色した。Nikon Eclipse Ti倒立蛍光顕微鏡(Nikon Instruments Inc, Melville, NY)を用いて組織切片をイメージングし、NIS Elements imaging softwareを用いて、各切片から血管内膜および中膜の厚みの６つの径方向に平行な位置での測定値をランダムに取得した(別個のドナーにつき合計6〜12測定/リング、n≧3 リング/処理群)。血管内膜は、内側弾性層の内腔側の組織又は弾性層に含まれる細胞からなる無秩序な組織体と定義する一方で、中膜層は、内膜層と外側弾性層との間に含まれる。各切片について、顕微鏡のコンピュータ化されたイメージ分析ソフトウェアを用いて10xの倍率で血管内膜及び中膜の厚みを測定した。

MK2i血管浸透性
機能維持を確認後、Alexa-568標識したMK2iペプチド、MK2i-NP又はNE-MK2i-NPで30分間HSVリングを処理し、PBS -/-で洗浄2xし、直ちにOCTコンパウンド中に包埋し、ドライアイスで凍結させた。処理した血管の各々の中央から5μmの凍結切片をカットし、血管壁へのペプチド送達分析のために顕微鏡スライドに乗せた。血管浸透性は、imageJにおいて、各切片からの平均血管内膜蛍光を算出し、血管内膜面積に対して正規化することによって定量した(各処理群につきn=3の別個のドナー)。

ウェスタンブロット分析
2時間処理し、フレッシュな培地中で24時間組織培養した後、処理したHSVリングの一部を液体窒素で瞬間凍結し、粉砕し、尿素-DTT-CHAPSバッファーを用いてホモジナイズした。ライゼートを遠心分離し(6000 g, 20分)、HnRNP A0リン酸化の評価のために上清を回収した。等量のタンパク質(20μg/レーン)を15、10又は4〜20%のSDS-PAGEゲルにロードした；タンパク質を電気泳動により分離し、次いでイモビロン膜(Millipore, Billerica, MA)に移した。ホスホ-hnRNP A0 (Millipore)及びリン酸化されていないhnRNP A0 (Santa Cruz)に対する一次抗体を用いて、一晩4℃で膜をプローブした。洗浄後、適切な二次抗体(Li-Cor)を用いて1時間室温で膜をインキュベートした。Odyssey direct infrared fluorescence imaging system (Li-Cor)を用いて二次抗体をイメージングし、LiCor Odyssey software v2.1を用いて800及び680 nmの波長での光学密度を測定した。

ウサギ両側頸静脈グラフト挿置モデル
雄性ニュージーランドホワイトウサギ(3.0〜3.5 kg; n = 24)を、塩酸ケタミン(1.4 mg/kg)及びキシラジン(0.2 mg/kg)の筋肉注射によって麻酔した。麻酔は、気管支内挿管及びイソフルラン吸入(2.0〜5.0%)で維持した。高用量のIVヘパリン(250 U/kg)をボーラス投与した直後に頸動脈をクランプした。手術手順は、光学倍率(倍率x2.5)下で無菌技法により行った。

静脈バイパスグラフトは、上記のとおりにして、吻合部カフ技術を用いて構築した。簡潔には、2.0-mmループ体からなるポリマーカフを4-Fr introducer sheath (Terumo Medical, Elkton, MD)から作製した。より小さな支血管を結紮した後、総頸動脈内への挿置グラフトを作製するために、外頸静脈(長さ3.0〜4.0 cm)を回収した。頸静脈の末端をカフに通し、裏返し、6-0絹糸で固定した。その後、静脈グラフトを、30μM MK2i-NP、30μM MK2iペプチド又はPBS (処理せず)のいずれかを含む2 mLのHeparin Plasma-Lyte溶液中で30分間処理した。処理後、頸動脈内腔を2.0-cmの動脈切開により露出させ、カフに巻き付けられ反転した血管の末端を挿入した。3-0絹糸を用いてカフ周囲を動脈に固定した。最後に、カフ間の頸動脈の後壁を1.0 cm切り取り、静脈グラフトを伸ばした。

術後28日目にウサギを安楽死させ、ローラーポンプを用いる〜50 mm Hgの圧力下で、10% 中性緩衝ホルマリンを用いてインサイチュで静脈グラフトを潅流固定した。その後、静脈グラフトを切り取り、グラフトの長さ方向に沿った形態学的変化を評価するために、カフと重複する組織を避けつつ4つのセグメントに切断した。組織切片を調製し、各血管切片の四分割領域のそれぞれについて3回測定(12測定/セグメント = 48測定/グラフト)することによって血管内膜及び中膜の厚みを測定した。ウサギマクロファージ抗体RAM-11 (Dako)を用いて別個の切片を染色し、各グラフトの血管内膜への免疫細胞の侵入に対する治療効果を評価した。血管内膜におけるマクロファージ陽性染色は、染色されたグラフト切片の血管内膜中の正に染色された細胞数を手作業で数えることによって定量した。異なるグラフト切片からの組織のイメージを各処理群について分析した。

統計
一元配置ANOVA後にTukeyポストホック検定を用いて統計解析を行い、実験群を比較した。OriginPro 8 software (Originlab, Northampton, MA)又はMinitab 16 software (State College, PA)を用いて分析を行った。統計的な有意差は、95%信頼区間内で認めた。結果を、算出した平均値±SEMとしてグラフで示した。p値は図面又は図面の説明の中に含まれている。

更なるサポートデータ
図48は、Zetasizer Nano ZSで測定した種々の電荷比([NH₃ ⁺]/[COO^-])で調製されたポリプレックスのζ電位を示す。示された値は、少なくとも3つの独立した測定値の平均である。

ポリプレックスのpH-依存的な膜破壊性の挙動をエンドソーム回避のためにチューニングして、細胞質へのペプチド送達及び保持を促進した。図49は、[NH₃ ⁺]/[COO^-] = 1:3の電荷比で調製したポリプレックスのpH依存的な溶血を説明する。著しい溶血が初期〜後期エンドソーム小胞に代表的なpH値(すなわち、pH < 6.8)において証明されたが、生理的なpH 7.4では見られなかった。YARA-MK2iペプチド単独もAA ポリプレックスも、試験されたpH値では有意な溶血を示さなかった。[NH₃ ⁺]/[COO^-] = 1:3の電荷比で調製されたポリプレックスのpH依存的なサイズ変化をDLS分析により分析した。

図50は、pH 7.4でポリプレックスが単峰型サイズ分布を示すことを説明する。低減するpH下では、ポリプレックスは、個々のYARA-MK2iペプチド及びPPAAポリマーのユニマーに解離し始めた。

ポリプレックス処理は、ヒト冠動脈血管平滑筋細胞(HCAVSMC)における細胞の生存能に対して顕著な効果を有しない。図51は、10μM ANG IIで6時間刺激し、PPAAポリプレックス、AAポリプレックス又はYARA-MK2iペプチド単独で2時間処理し、フレッシュな培地中で24時間培養したHCAVSMCの生存能を示す。NT = 処理なし、n = 4。

図52は、ANG IIで6時間刺激し、PPAAポリプレックス、AAポリプレックス又は融合MK2iペプチド単独で2時間処理し、フレッシュな培地中で24時間培養したHCAVSMCにおけるTNF-α産生を示す。処理は、10、25、50又は100μMのペプチド濃度に対して正規化した。全てのデータは、LDHアッセイで測定された細胞数に対して正規化された。NT= 処理せず。NT + TNFα群と比較して^*p<0.05、同じ濃度のMK2iと比較して^*p<0.05、同じ濃度のAAポリプレックスと比較して^**p<0.05。

HCAVSMCのポリプレックス取込みの顕微鏡分析は、ポリプレックスが、MK2iペプチドの取込み及びエンドソーム回避を向上することを示す。追跡目的のために、ペプチドを緑色蛍光体で標識した。細胞イメージングの前に、エンドソーム-リソソーム経路において細胞内の小胞をマークする赤色LysoTracker(登録商標)色素で細胞を処理した。この分析は、遊離ペプチドで処理した細胞と比較して、エンドソーム-リソソーム輸送経路からの回避を向上するポリプレックスの能力を評価するために行った。図53は、Mander係数M1 (本質的には、赤色蛍光と重複するイメージ中の緑色蛍光の％、すなわちエンドソーム小胞に含まれるペプチドの％)の算出によって測定した、緑色蛍光と赤色蛍光との共局在のパーセンテージを示す。全てのサンプルについてYARA-MK2i 用量 = 25μM。示された値は、n=3の別個のイメージの平均±SEMである。同じ時点におけるYARA-MK2iと比較して^*p<0.05、同じ時点におけるYARA-MK2iと比較して^**p<0.01。このグラフは、HCAVSMCのポリプレックス取込みの顕微鏡分析の結果であり、ポリプレックスがMK2iペプチドの取込み及びエンドソーム回避を向上することを示す。

ペプチドの取込み及び細胞内での半減期は、新規なポリプレックス構造体によって送達されたときに、HCAVSMCにおいて著しく向上した。蛍光標識したペプチド及びフローサイトメトリーを用いて研究を行った。経時的な平均蛍光強度のプロット及び経時的な蛍光強度のヒストグラムを、PPAAポリプレックス(図55、図56)、YARA-MK2iペプチド単独(図57、図58)及びAAポリプレックス(図59、図60)について作成した。各処理群についての蛍光の半減期を測定するために、各データセットを指数関数曲線にフィットさせた。平均蛍光強度値は、処理していないコントロールと比較したMFIの増大(n=3)として報告した。

ポリプレックスは、遊離ペプチドでの処理と比較して、HSV 血管弛緩をより強力に向上する。ポリプレックスは、ニトロプルシドナトリウム(SNP)誘導性のヒト伏在静脈エクスプラントの弛緩を著しく向上した。HSVリングは、フェニレフリン(PE, 10^-6 M)で収縮させ、その後SNP (^10-8-10^-6 M)で弛緩させた。次いで、HSVリングを2時間処理し、PEで再び収縮させ、SNPで弛緩させて、処理後における弛緩の増大を測定した。処理後の収縮の後、全てのリングをKClで収縮させ、平滑筋の機能維持を確認した。図61に示されるように、コントロールと比較して^*p<0.05、100μM MK2iと比較して^**p<0.05、n = 3。

図62は、2時間処理し、組織培養で24時間維持し、MTTアッセイにより評価したHSVリング中の細胞の生存能を示す。n = 1。図63は、2時間処理し、組織培養で14日間維持し、MTTアッセイにより評価したHSVリング中の細胞の生存能を示す。n = 1。

図64は、2時間処理し、次いで組織培養で14日間維持したHSVエクスプラントの血管内膜の厚み(n = 3)を示す。コントロール(未処理)と比較して^*p ≦ 0.01、コントロールと比較して^**p ≦ 0.001、

図65は、2時間処理し、次いで組織培養で14日間維持したHSVエクスプラントの血管内膜/中膜(I/M)比のプロット(n = 3)を提供する。コントロール(未処理)と比較して^*p ≦ 0.01、^**p ≦ 0.001。

実施例7: AZX-100ポリプレックスの特徴決定のまとめ
図66は、3:1の電荷比で調製したAZX-100 ポリプレックスのDLSサイズ分布を提供する。図67は、酢酸ウラニルで染色したAZX-100ポリプレックスのTEMイメージの代表例であり、DLS結果と一致するサイズ分布を示す。図68は、様々な電荷比で調製したAZX-100ポリプレックスのゼータ電位のまとめである。ゼータ電位は、3:1よりも高い電荷比において、電荷比に正比例することが見出された。おそらくはマクロ分子再構成に起因するゼータ電位の予想外のシフトが3:1の電荷比で見られる。

AZX-100ポリプレックスは、アンギオテンシンIIで刺激したヒト冠動脈血管平滑筋細胞におけるストレス線維形成のAZX-100媒介性の阻害を向上した。細胞を1時間処理し、その後アンギオテンシンIIで2時間刺激した。ファロイジンで染色して固定したサンプルにおいてアクチンストレス線維を可視化し、各処理群からの個々の細胞の蛍光強度比を用いて、アクチンストレス線維形成を定量した。図69及び図70は、AZX-100ポリプレックスがアンギオテンシンIIで刺激したヒト冠動脈血管平滑筋細胞においてストレス線維形成のAZX-100媒介性阻害を向上することを示す。

図71〜73は、筋肉浴槽装置にラット大動脈平滑筋を懸垂した実施例の結果を示す。重炭酸バッファー中で組織を平衡化し、KCl (110 mM)でチャレンジして、組織の機能維持を確認した。組織を基礎張力に戻した後、5^*10^-8 Mフェニレフリン(5^*10^-8M)で平滑筋をチャレンジし、次いで重炭酸バッファーで洗浄した。次いで、組織を基礎張力に戻し、その後重炭酸バッファーで洗浄し、次いでコントロール、AZX 100ペプチド又はAZXポリプレックスのいずれかで処理した。30分間インキュベートした後、組織をフェニレフリンでチャレンジし、収縮力を最初の収縮と比較して、起こった阻害のパーセントを測定した。AZX 100ペプチドは、ラット大動脈平滑筋に添加したときに、用量依存的な収縮の阻害を示した。また、AZXポリプレックスは、用量依存的な収縮の阻害を示したが、同じ用量では、より大きな収縮の阻害(およそ5倍の増大)を示した(n=6)。

図74及び図75は、大動脈平滑筋がFluoroplexに懸垂された実施例の結果を示す。重炭酸バッファー中で組織を平衡化し、5μM Fura 2-AMを4時間室温で負荷した。AZXポリプレックスとのプレインキュベーションは、フェニレフリンでチャレンジされたときに細胞内カルシウムの上昇を阻害しない。図74は、力のトレース及びカルシウム蛍光のトレースの代表例を示す。図75は、細胞内カルシウムの変化の大きさ及び起こった力の阻害を測定する累積的データを提供する。

図76は、筋肉浴槽装置にヒト伏在静脈を懸垂した実施例の結果を示す。重炭酸バッファー中で組織を平衡化し、KCl (110 mM)でチャレンジして、組織の機能維持を確認した。組織を基礎張力に戻した後、10^-6 M フェニレフリンで平滑筋をチャレンジし、次いでニトロプルシドナトリウム(10^-7 M)で弛緩させた。次いで、組織を基礎張力に戻し、その後重炭酸バッファーで洗浄し、次いでコントロール、AZX 100ペプチド又はAZXポリプレックスのいずれかで処理した。30分間のインキュベーション後、組織をフェニレフリンでチャレンジし、次いでニトロプルシドナトリウムで弛緩させた。弛緩のパーセントを最初の弛緩と比較し、向上した弛緩のパーセントを測定した。AZX 100ペプチドは、コントロールと比較して、用量依存的な弛緩の向上を示した。また、AZXポリプレックスは、用量依存的な弛緩の向上を示したが、ペプチド単独と比較すると、より大きな弛緩(およそ5倍の増大)を示した(n=3)。

最後に、図77及び表2は、互いに合わさって、AZX-100 NPがヒト気管支気道平滑筋 (HASM)のAZX-100媒介性の弛緩を向上することを説明する。

表2. HASMの弛緩

本明細書で用いる以下の用語は、当業者は熟知していると思われるが、本願に開示される主題の説明を容易にするために定義を説明する。
その他の定義がない限り、本明細書で用いる全ての技術用語及び科学用語は、本願に開示される主題が属する分野の当業者により共通に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書で記載したものと類似又は等価の方法、装置及び材料を本願に開示される主題の実用又は試験において用いることができるが、ここでは代表的な方法、装置及び材料を記載する。

長く続く特許法の慣例に従って、用語「a」、「an」及び「the」は、特許請求の範囲を含む本願の出願書類において用いられるとき、「one or more」を指す。したがって、例えば「a fluorophore」というとき、これの複数形等を含む。

そうでないと示さない限り、本明細書及び特許請求の範囲において量、特性等を表す全ての数字は、用語「約」により全ての実例が修飾されるものと理解すべきである。したがって、反対のことが示されない限り、本明細書及び特許請求の範囲で規定される数値パラメータは、本願に開示される主題により得ようとする所望の特性に依存して変化し得るおおよそのものである。

本明細書で用いるように、用語「約」は、質量、重量、時間、容量、濃度又はパーセンテージの値又は量について言及する場合、記載された方法を行うのに適切であるときには、記載された量から、いくつかの実施態様においては±20％、いくつかの実施態様においては±10％、いくつかの実施態様においては±5％、いくつかの実施態様においては±1％、いくつかの実施態様においては±0.5％、及びいくつかの実施態様においては±0.1％の変動を包含することを意味する。

本明細書で用いるように、範囲は、「約」ある具体的値から、及び/又は「約」別の具体的値までと表すことができる。また、本明細書に開示される多くの値が存在すること、及びその値自体に加えて、各値が「約」具体的値としても本明細書で開示されていると理解される。例えば、値「10」が開示される場合、「約10」も開示されている。また、2つの具体的ユニット間の各ユニットも開示されていると理解される。例えば、10及び15が開示される場合、11、12、13及び14も開示されている。

参照文献
本明細書を通じて、様々な参照文献が記載される。これら全ての参照文献は、以下に列挙するものも含めて、参照により本明細書に組み込まれる。

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49. Li, H., Nelson, C.E., Evans, B.C. & Duvall, C.L. Delivery of intracellular-acting biologics in pro-apoptotic therapies. Curr Pharm Des 17, 293-319 (2011).
50. Ferrito, M.a.T., D. A. Poly(2-ethylacrylic acid). Macromolecular Syntheses 11, 59-62 (1992).
51. Convertine, A.J., Benoit, D.S., Duvall, C.L., Hoffman, A.S. & Stayton, P.S. Development of a novel endosomolytic diblock copolymer for siRNA delivery. J Control Release 133, 221-229 (2009).
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55. Duvall et al. Mol Pharm. 2010;7(2):468-476.

参照による組込み
詳細な説明で言及された全ての刊行物、特許及び特許出願は、個々の刊行物、特許又は特許出願が参照により本明細書に組み込まれると具体的かつ個別に示されたかのように、同一の範囲で参照により本明細書に組み込まれる。

本願で開示する主題の様々な詳細は、本明細書に開示された主題の範囲から逸脱しない限り、変更できることが理解される。更に、上記の詳細な説明は、説明だけを目的とし、限定するものではない。

Claims (29)

1. 所定のpHにおいて電荷を有する活性剤と、
   前記所定のpHにおいて前記活性剤とは反対の電荷を有するポリマーとを含み、
   静電結合が、前記所定のpHにおいて前記活性剤と前記ポリマーとの間に形成されている、組成物。
2. 前記活性剤は、前記所定のpHにおいてカチオン性であり、
   前記ポリマーは、前記所定のpHにおいてアニオン性である、請求項１に記載の組成物。
3. 前記活性剤は、前記所定のpHにおいてアニオン性であり、
   前記ポリマーは、前記所定のpHにおいてカチオン性である、請求項１に記載の組成物。
4. 前記活性剤は、ペプチドを含む、請求項１に記載の組成物。
5. 前記ペプチドは、MAPKAPキナーゼII阻害ペプチドを含む、請求項４に記載の組成物。
6. 前記ペプチドは、配列番号１〜４から選択される１以上の配列を含む、請求項４に記載の組成物。
7. 第２の活性剤を更に含む、請求項１〜６のいずれか１つに記載の組成物。
8. 前記第２の活性剤は、ペプチド、ポリヌクレオチド及びそれらの組合せから選択される、請求項７に記載の組成物。
9. 前記第２の活性剤は、siRNA、DNA及びそれらの組合せから選択される、請求項７に記載の組成物。
10. 前記ポリマーは、ポリ((C₁-C₆)アルキル-アクリル酸), ポリ((C₁-C₆)アルキル-メタクリル酸)、ポリ((C₁-C₆)アルキル-エタクリル酸)又はそれらの組合せを含む、請求項１〜９のいずれか１つに記載の組成物。
11. 前記ポリマーは、ポリ(プロピルアクリル酸) (PPAA)を含む、請求項１０に記載の組成物。
12. 前記ポリマーは、親水性ブロックを更に含む、請求項１〜１１のいずれか１つに記載の組成物。
13. 前記親水性ブロックは、ポリエチレングリコール(PEG)、N-(2-ヒドロキシプロピル)メタクリルアミド(HPMA)、ポリ(N,N-ジメチルアクリルアミド) (pDMA)、ポリ(PEGメタクリレート) (pPEGMA)又はそれらの組合せを含む、請求項１２に記載の組成物。
14. 前記所定のpHは、約6.5〜約8である、請求項１〜１３のいずれか１つに記載の組成物。
15. 前記ペプチドと前記ポリマーとの間に形成される静電結合は、活性化pHにおいて破壊される、請求項１〜１４のいずれか１つに記載の組成物。
16. 前記活性化pHは、約6.5以下である、請求項１５に記載の組成物。
17. 活性剤：ペプチド電荷比が、約10：1〜約1：10である、請求項１〜１６のいずれか１つに記載の組成物。
18. 前記ポリマー：ペプチド電荷比が、約1：3である、請求項１７に記載の組成物。
19. 所定のpHにおいて電荷を有する複数の活性剤と、
    前記所定のpHにおいて前記活性剤とは反対の電荷を有する複数のポリマーとを含み、
    前記複数のペプチド及び前記複数のポリマーは、前記所定のpHにおいて、複数の活性剤に対する複数のペプチドの静電結合を含むポリプレックスを形成する、組成物。
20. 前記活性剤は、ペプチドを含む、請求項１９に記載の組成物。
21. 前記活性剤は、前記所定のpHにおいてカチオン性であり、
    前記ポリマーは、前記所定のpHにおいてアニオン性である、請求項１９に記載の組成物。
22. 前記活性剤は、前記所定のpHにおいてアニオン性であり、
    前記ポリマーは、前記所定のpHにおいてカチオン性である、請求項１９に記載の組成物。
23. 前記ポリプレックスは、約50 nm〜約500 nmのサイズを有する、請求項１９に記載の組成物。
24. 請求項１〜２３のいずれか１つに記載の組成物と、
    医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物。
25. 請求項１〜２３のいずれか１つに記載の組成物を含む血管グラフト。
26. 請求項１〜２３のいずれか１つに記載の組成物の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、血管の状態を治療する方法。
27. 前記血管の状態は、内膜過形成である、請求項２６に記載の方法。
28. 前記投与工程が、請求項１〜２３のいずれか１つに記載の組成物を含む血管グラフトを、それを必要とする対象に移植することを含む、請求項２６又は２７に記載の方法。
29. 請求項１〜２３のいずれか１つに記載の組成物を合成する方法。