CN101709292A - 一种重组腺病毒及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种表达混合系激酶3羧基末端肽段(589～850aa)的重组腺病毒(Ad-MLK3PRD)，该重组腺病毒的表达产物包含了MLK3中富含脯氨酸结构域。本发明还提供Ad-MLK3PRD的制备方法及其作为神经保护药物的应用。本发明研究结果表明在该重组腺病毒的表达可以干扰MLK3与PSD-95的结合，抑制MLK3的活化及其下游JNKs信号通路的激活，对Aβ神经毒性、缺血性神经元损伤有神经保护作用。Ad-MLK3PRD可以作为MLK3抑制剂以及作为退行性脑病(老年痴呆、帕金森病)、脑卒中和癫痫等神经系统疾病的治疗药物。

Description

一种重组腺病毒及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种重组腺病毒及其制备方法和应用，特别涉及一种表达混合系激酶3羧基末端肽段的重组腺病毒及其制备方法和在制备神经保护药物中的应用。

背景技术

载体是基因转移的重要工具，外源基因要进入细胞、逃避溶酶体的降解、穿过核膜、逃避核酸内切酶的降解，最终才能被表达，选择理想的载体系统安全、高效地将目的基因导入靶细胞始终是基因治疗的焦点。目前，应用于基因治疗研究的基因转移载体主要包括病毒载体和非病毒载体两大类。应用非病毒载体的优点是不存在野生型病毒的污染，相对安全，缺点是转染效率较低；病毒载体转染效率高，但其在体内应用可能会出现一些毒副作用。所以应根据靶组织、防治病种的不同，选择合适的转移载体。腺病毒载体在基因治疗临床应用上的研究已得到广泛而深入的开展。腺病毒是一种无包膜的DNA病毒，毒粒直径为60-90nm，由20面体的蛋白质外壳和蛋白质核酸复合核心组成。腺病毒载体的优点：(1)宿主范围广，可感染除淋巴细胞以外的几乎所有细胞；(2)感染效率高，可感染增殖期和静止期的细胞；(3)安全性好，不整合到人的染色体中，无插入致突变性；(4)能同时表达多个基因，可用于联合基因治疗；(5)在包装细胞中能有效增殖，产生滴度高。腺病毒的这些生物学特性使其作为大多数非遗传性疾病基因治疗的载体。

退行性脑病(老年痴呆、帕金森病)、脑卒中、癫痫等神经系统疾病不仅严重影响患者的生活质量，亦给其家庭和社会带来沉重的经济负担。开展脑病神经保护分子机制的研究，并在此基础上筛选药物作用的靶点、开发脑病治疗药物具有重要的理论意义和临床价值。

混合系激酶3(Mixed lineage kinase-3；MLK3)是MLK家族的成员^[1]。MLK家族包括MLKs(1-4)、DLKs和ZAKs亚家族，在结构上该家族成员与丝/苏氨酸蛋白激酶和酪氨酸蛋白激酶均有同源性，因而被命名为混合系激酶家族，但实际上该家族成员只有丝/苏氨酸蛋白激酶的活性^[2-3]。MLK家族是丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases；MAPKs)的重要上游激酶之一。MAPKs广泛存在于各种细胞中，由ERKs(extracellular signal regulatedkinases)、JNKs(c-Jun N-terminal kinases)和P38MAPKs亚家族组成。ERKs在细胞生长和分化中起主要作用，而JNKs和P38MAPKs与多种原因诱发的细胞凋亡密切相关^[4-5]。在所有的MLK家族成员中，只有MLK3可以同时活化JNKs和P38MAPKs^[6-7]。MLK3通过磷酸化激活MKK4/7和MKK3/6，进而分别激活JNKs和P38MAPKs信号通路，最终引起细胞凋亡。MLK3在脑组织中有较高的表达水平。本实验室及国外实验室的研究表明，MLK3-JNKs和MLK3-P38MAPKs通路的活化参与了多种神经退行性疾病，如老年痴呆、帕金森病，并在缺血性脑中风、癫痫等神经系统疾病中有重要作用。

老年痴呆又称阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)，病人典型的病理特征是：神经细胞外大量以Aβ(amyloid-βpeptide)为核心的不溶性淀粉样老年斑、神经细胞内Tau蛋白过度磷酸化所致的神经纤维缠结、神经细胞凋亡所致的胆碱能神经功能障碍和海马广泛的神经元丢失等。Aβ在神经细胞外的聚积，被认为是AD形成和发展的首要因素^[8，9]。Aβ是由39-43个氨基酸残基组成的小肽。在AD患者的老年斑中，大约90％是Aβ1-40，其他10％是Aβ1-42和Aβ1-43，后两者极易纤维化。研究表明，Aβ来自于胞膜上的淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein，APP)，APP在β/γ-分泌酶的作用下水解生成Aβ并分泌至细胞外。单体形式的Aβ在细胞外可被快速代谢(t1/2～2h)而不产生神经毒性^[10]；如果Aβ在细胞外积聚过多，会形成寡聚化或纤维状的Aβ并引起神经元的死亡^[11-13]。因此，以抑制Aβ的产生和聚积为目标是探索AD治疗方式的途径之一^[14]。本发明人注意到，AD病程较长，发病初期症状不明显，大多数临床上确诊的AD病人，其脑中寡聚化或不溶性的淀粉样沉积已经形成，除了设法清除它之外，如何抑制其所造成的神经元损伤也是治疗的主要方向。本发明人前期研究结果表明^[15]，可溶性寡聚化的Aβ激活MLK3-MKK7-JNK3信号通路，在Aβ诱导的神经元凋亡中起着关键性作用，提示MLK3及其下游的信号级联反应是开发AD治疗药物的靶点。

本室研究表明，阻断脑缺血诱导的MLK3-MKK7-JNKs信号通路有显著的神经元保护作用^[16]。另外，GluR6-PSD-95-MLK3信号模块参与了KA诱导的大鼠癫痫，并通过这一模块激活了MLK3、MKK7和JNKs信号通路^[17]。研究表明，PSD-95通过其SH3结构域参与了对MLK3的活性调节^[18]。以上结果提示，MLK3信号通路参与中枢神经系统疾病，它和许多促凋亡和抗凋亡因子相互作用并最终决定细胞的生与死，这种平衡的失常会导致各种疾病的发生。MLK3是中枢神经系统疾病新的治疗靶点。目前虽然K252a可活化并激活Akt抑制MLK3，以抑制细胞的凋亡，促进细胞的生长发育^[19]，但K252a并不是特异性非常强的MLK3抑制剂。因此，开发MLK3特异性的肽抑制剂对开发神经元保护药物及缺血性脑中风、神经退行性疾病等的治疗药物具有重要意义。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种表达MLK3羧基末端肽段的重组腺病毒(Ad-MLK3PRD)，其用于抑制MLK3的活性，从而可用作神经保护药物。

本发明所提供的重组腺病毒，是一种表达混合系激酶3(Mixed lineagekinase-3；MLK3)羧基末端肽段(589～850aa)的重组腺病毒Ad-MLK3PRD，其包含了MLK3中富含脯氨酸结构域(proline-rich domain；PRD)的编码基因。

所述重组腺病毒，含有编码混合系激酶3羧基末端肽第589至850位氨基酸的核苷酸，以及腺病毒载体。

其中，所述编码混合系激酶3羧基末端肽第589至850位氨基酸的核苷酸可具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

其中，所述腺病毒载体可为复制缺陷型腺病毒载体。

本发明的另一个目的是提供所述重组腺病毒(Ad-MLK3PRD)的制备方法。

所述重组腺病毒的制备方法，包括如下步骤：

1)将编码混合系激酶3羧基末端肽段589～850aa的cDNA定向克隆至载体，获得重组质粒；

2)将步骤1)的重组质粒亚克隆至穿梭载体，获得重组腺病毒穿梭载体；

3)将步骤2)的重组腺病毒穿梭载体与复制缺陷型病毒骨架载体同源重组，获得病毒表达载体；以及

4)将步骤3)所获得的病毒表达载体线性化后转染至病毒包装细胞中进行包装、扩增、纯化后获得携带有混合系激酶3羧基末端肽段589～850aa的编码基因的重组腺病毒。

在本发明的一个具体实施方式中，所述重组腺病毒Ad-MLK3PRD的制备方法，包括如下步骤：

(1)将编码MLK3羧基末端肽段(589～850aa)的cDNA定向克隆至载体pcDNA3.1，获得重组质粒pcDNA3.1-MLK3PRD。

(2)将步骤(1)的重组质粒pcDNA3.1-MLK3PRD亚克隆至穿梭载体，获得重组穿梭载体pAdTrack-MLK3PRD。

(3)将步骤(2)的穿梭载体pAdTrack-MLK3PRD与复制缺陷型病毒骨架载体pAdEasy同源重组，获得病毒表达载体pAd-MLK3PRD；

(4)将步骤(3)所获得的病毒表达载体线性化后转染至HEK293细胞中进行包装、扩增、纯化后获得病毒颗粒Ad-MLK3PRD。

在上述具体实施方式中，所述重组腺病毒颗粒的滴度不低于2.5×10¹⁰。

在上述具体实施方式中，所述穿梭载体可为pAdTrack-CMV。

在上述具体实施方式中，所述腺病毒包装细胞可为HEK293细胞。

本发明的还一个目的是提供所述重组腺病毒(Ad-MLK3PRD)的应用。

所述重组腺病毒Ad-MLK3PRD可用于制备MLK3抑制剂。

所述重组腺病毒Ad-MLK3PRD可用于制备神经保护药物，包括用于退行性脑病(老年痴呆、帕金森病)、脑卒中、癫痫等神经系统疾病的治疗药物。

所述重组腺病毒可被制成适于临床应用的制剂形式，例如，注射剂、喷涂剂、滴剂、喷雾剂或冻干粉等。

所述重组腺病毒Ad-MLK3PRD的表达产物为MLK3羧基末端的肽段，其中包含了MLK3的富含脯氨酸结构域。

上述重组腺病毒Ad-MLK3PRD的表达产物可用于制备MLK3抑制剂。

上述重组腺病毒Ad-MLK3PRD的表达产物可用于制备神经保护药物，包括用于退行性脑病(老年痴呆、帕金森病)、脑卒中、癫痫等神经系统疾病的治疗药物。

用于基因治疗的腺病毒载体可分为复制缺陷型和复制型两大类别，其中复制缺陷型腺病毒早期基因E1区缺失，外源基因表达盒被克隆在E1区或复制非必需的E3区。本发明中我们采用的是成熟的、商品化的第一代复制缺陷型腺病毒载体表达系统AdEasy System。AdEasy System系统的优点是：(1)腺病毒基因组于超螺旋状态应用而不需要进行酶切处理；(2)穿梭质粒与腺病毒骨架质粒的同源重组在细菌中而不是在细胞中进行；(3)由于在所选细菌中具有较高效的同源重组机制，在构建腺病毒重组体时不需要连续步骤；(4)该系统可允许插入10kb的基因，而且在同一腺病毒内导入多个目的基因；(5)穿梭质粒携带有绿色荧光蛋白，因此可以直接观察转染和感染效率，使得过去十分困难的腺病毒监测问题变得较为容易，该系统省略了以往繁杂的空斑化程序，大大缩短了腺病毒制备所需的时间。为了便于追踪观察，我们选择了带有GFP基因的穿梭载体Track-CMV。这种载体有两段可分别与AdEasy-1骨架载体发生同源重组的“左臂”(Left arm)和“右臂”(Right arm)。在宿主菌BJ5183中带有GFP基因的穿梭载体Track-CMV与AdEasy-1骨架载体发生同源重组，从而将外源基因插入AdEasy-1骨架中，并经过真核细胞的包装形成完整的有感染能力的腺病毒。由于我们选择的载体带有绿色荧光蛋白(GFP)，使得在整个病毒扩增及下一步的细胞实验中观察就更为方便。

本发明采用基因治疗的方法，构建一种表达混合系激酶3(Mixed lineagekinase-3；MLK3)羧基末端富含脯氨酸结构域(proline-rich domain；PRD)肽段(589～850aa)的重组腺病毒(Ad-MLK3PRD)，该重组腺病毒的表达产物与MLK3竞争结合于突触后密集区蛋白PSD-95(postsynaptic density protein95)，阻断了PSD-95-MLK3-MAPKs信号通路，抑制MLK3的活化，从而起到神经保护作用。

本发明所涉及的重组腺病毒表达产物本质上是MLK3特异性的肽抑制剂，不会有显著的毒副作用。该MLK3抑制剂可用于对其他脑病如脑缺血、退行性脑病(老年痴呆、帕金森病)、癫痫等保护作用的研究，因为MLK3-JNK3信号的激活是多种因素引起神经元损伤的最后的共同的通路。本发明以PSD-95-MLK3的相互作用为药物作用的新靶点，为开发神经元保护药物及治疗缺血性脑中风、神经退行性疾病等提供了新的思路。

综上所述，本发明提供了一种重组腺病毒(Ad-MLK3PRD)，该重组腺病毒的表达产物包含了MLK3中富含脯氨酸结构域。研究结果表明在转染细胞中该重组腺病毒的表达可以干扰MLK3与PSD-95的结合，抑制神经细胞凋亡过程中MLK3的活化及其下游的细胞信号转导，产生神经保护作用。因此，Ad-MLK3PRD可以作为退行性脑病(老年痴呆、帕金森病)、脑卒中和癫痫等神经系统疾病的治疗药物。

附图说明

图1：酶切鉴定重组质粒重组pcDNA3.1-MLK3PRD，1：pcDNA3.1(+)-MLK3PRD/HindIII+Xbal；2∶1Kb DNA Ladder(NEB)；

图2：酶切鉴定重组穿梭质粒pAdTrack-MLK3PRD，1：pAdTrack-MLK3PRD/HindIII+Xbal；2∶1Kb DNA Ladder(TAKARA)；

图3：酶切鉴定重组病毒骨架载体pAd-MLK3PRD，1.1Kb DNAladder(TAKARA)2-4.Recombination/Pacl；

图4：MLK3PRD测序结果，其中，A为PRD5反向图，B为PRD5正向图；

图5：PCR鉴定病毒Ad-MLK3PRD，1：MLK3PRD；2∶1Kb DNALadder(NEB)；

图6：Ad-MLK3PRD在COS7细胞中抑制PSD-95与MLK3的结合；

图7：AD-MLK3PRD抑制Aβ引起的皮质神经元PSD-95与MLK3的相互作用以及下游信号蛋白的调节；

图8：AD-MLK3PRD抑制了Aβ25-35引起的JNK下游核通路的激活；

图9：Ad-MLK3PRD抑制Aβ25-35作用下Bad向线粒体转位；

图10：Ad-MLK3PRD对Aβ25-35刺激后的神经元保护作用；

图11：Ad-MLK3PRD对脑缺血后神经元的保护作用。

具体实施方式

下面的实施例是对本发明的进一步详细说明但不意味着对本发明的任何限制。

一、制备方法

1、重组腺病毒的构建

1.1材料：

试剂：Total RNA Isolation System、RT-PCR System、PCR preps DNAPurification System、琼脂糖(Agarose)、低熔点琼脂糖(Agarose，LMP)均购自Promega公司；限制性内切酶EcoR I、Bgl II、Hind III、PmeI和PacI、T4 DNAligase购自New England Biolab公司。Plasmid Miniprep Kit和Plasmid MidiprepKit、氨苄青霉素(ampicilin)、卡那霉素(Kanamycin)、购自Sigma公司；DNAladder、Lipofectamine 2000、LB培养基(LB broth base)、LB琼脂(LB Agar)购自Invitrogen公司；引物合成，序列分析由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。

菌株、细胞株和质粒：E.coli菌株JM101(ATCC：33876)，JM109(ATCC：53323)，BJ5183(Stratagene公司出售)，腺病毒转化的人胚肾细胞株(含Ad5E1)HEK293细胞(ATCC：CRL-1573)，质粒pAdTrack-CMV(Stratagene公司出售)、pAdEasy-1(默克公司出售)。质粒pGEM-T购自Promega公司。

引物：由上海生物工程有限公司合成引物。

上游引物5’-ggtacctaatgtcagatgactcatcccc-3’

下游引物5’-gaattctcagggccctgcttctggt-3’

1.2方法：

1.2.1MLK3PRD克隆

参考Genbank上MLK3 cDNA序列，采用Primer Premier 5.0分子生物学软件辅助设计RT-PCR引物，在上游引物的5’端KpnI酶切位点(斜体标出)和起始密码子(斜体下划线标出)，上游引物5’-

tcagatgactcatcccc-3’，在下游引物5’端引入Econ I酶切位点(斜体标出)：下游引物5’-

tcagggccctgcttctggt-3’。由上海生物工程有限公司合成引物。

1.2.2MLK3PRD cDNA合成

以SD雄性大鼠海马为材料，RNA抽提试剂盒提取大鼠海马总RNA，分别以P1、P2为上下游引物进行RT-PCR合成MLK3PRD cDNA。RT-PCR反应条件：48℃，45min，94℃，5min，35个循环(94℃，30sec，55℃，1min，68℃，2min)，68℃，7min。1％琼脂糖凝胶电泳鉴定正确的产物经1.5％低熔点琼脂糖凝胶回收，纯化cDNA。

1.2.3质粒载体pcDNA3.1-MLK3PRD的构建

将测序正确的pGEM-T载体克隆经双酶切，收纯化后定向克隆至pcDNA3.1(+)表达载体，转化感受态细胞JM101，氨苄青霉素LB平板筛选，将阳性菌落小量(3-5ml)扩增后提取质粒，提取质粒经酶切鉴定后进行序列测定。

1.2.4携带外源基因的穿梭质粒pAdTrack-MLK3PRD的构建

将上述鉴定正确的质粒pcDNA3.1-MLK3PRD、穿梭质粒pAdTrack-CMV分别经XbaI，HindIII双酶切后，1％的熔点琼脂糖凝胶电泳回收纯化，T4 DNA连接酶16℃，过夜连接，次日将连接产物经感受态细胞JM101转化，氨苄青霉素LB平板筛选，将阳性菌落小量(3-5ml)扩增后提取质粒，然后经Bgl II，HindIII双酶切，1％琼脂糖凝胶电泳鉴定正确的阳性重组子测序鉴定。保存测序结果证实正确的阳性重组子命名为pAdTrack-MLK3PRD备用。

1.2.5在细菌内同源重组法构建病毒载体pAd-MLK3PRD

将含有目的基因的穿梭载体pAdTrack-MLK3PRD用限制性内切酶Pme I线性化后与病毒骨架载体pAdEasy-1在BJ5183大肠杆菌内同源重组，将鉴定正确的重组病毒载体命名为pAd--MLK3PRD。

1.2.6pAd-MLK3PRD在HEK293H细胞中的包装

将病毒表达载体pAd-MLK3PRD用Pac I酶切线性化后通过脂质体转染HEK293细胞。具体方法为：

将293细胞以2×10⁶/ml接种于25mL培养瓶中，于5％CO2孵箱中培养24h至约有50～70％的细胞融合时进行转染，转染前一天将PacI线性化的病毒质粒(通常转染一个25mL的培养瓶需要4μg DNA)纯化后重悬于20μl无菌水中。每转染一个25mL的培养瓶需将4μg PacI线性化的病毒DNA与20μlLipofectamine2000(GIBCO BRL)混合加入到500μl OptiMem I medium中，室温放置15-30分钟。在等待期间，将待转染细胞培养基取出，用4ml无血清培养基洗一遍。加入2.5ml OptiMem I medium，然后放入37℃CO2孵箱中培养约10分钟。4小时后，取出含有Lipofectamine-DNA的混合液，加入6ml新鲜的完全培养基DMEM。7-10天时用细胞刮刮下细胞，转入50ml离心管中，台式离心机离心后用2.0ml PBS重悬沉淀。液氮/37℃水浴反复冻融4次。短暂离心后将上清冻存于-20℃。用上述上清的30-50％可以感染两瓶50-70％融合的25ml细胞培养瓶。感染2-3天后可以看到细胞空斑形成。当有1/3-1/2细胞不贴壁时(通常感染后3-5天)，收集病毒。PCR鉴定(5μl病毒，加10μl PCR级蛋白酶K在55℃煮样品5分钟。短暂离心后，取1-2μl进行PCR)。

1.3结果

将编码MLK3羧基末端肽段的cDNA定向克隆至载体pcDNA3.1，获得重组pcDNA3.1-MLK3PRD(图1)，以亚克隆的方式构建重组穿梭质粒pAdTrack-CMV，酶切鉴定，琼脂糖的凝胶电泳分离后出现两条明亮的条带，一条位置在700bp附近，一条在9kb附近(图2)，分别与目的基因片段(771bp)和载体pAdTrack-CMV(9220bp)的大小相一致，结果表明：重组穿梭质粒中含有目的基因。

穿梭质粒与腺病毒骨架载体同源重组后，转化的菌落进行小量(5～6ml)培养后，制备质粒DNA，用限制性内切酶PacI消化，然后用0.8％的琼脂糖凝胶电泳鉴定。结果如图3，所得DNA片段分别约为30kb和4.5kb。结果表明：穿梭载体与腺病毒骨架载体进行了同源重组。重组质粒委托上海生工生物工程技术服务有限公司测序，结果与目的基因序列一致(图4)。

2、病毒的扩增与纯化

病毒的纯化与浓缩使用Clontech公司的Adeno-X Maxi Purification Kit。

重组后的质粒用PacI线性化，纯化后用脂质体法转染HEK293H细胞，次日细胞可观察到绿色荧光，第8天绝大部分细胞可以观察到绿色荧光并呈现CPE(cytopathic effect)现象，说明已产生具有感染能力的病毒颗粒。纯化后获得滴度为2.58×10¹⁰的腺病毒，将病毒颗粒用蛋白酶K处理后为模板用引物P3，P4(见2.1.2)经PCR克隆出长约700bp的片断(图5)，与目的基因片段(771bp)大小相一致。结果表明，复制缺陷型重组腺病毒载体中包含MLK3PRD结构域。鉴定正确的病毒颗粒分装冻存用于细胞和动物实验。

3、滴度测定

在12孔培养板内接种HEK293H细胞，每孔5×10⁵个细胞。每孔加100μl梯度稀释的腺病毒(10^-2～10^-7)，混匀，48h后在荧光显微镜下计数，选择平均每视野荧光细胞数在5～50的稀释倍数对应孔，计数2孔，每孔至少计数5个视野。按下列公式计算病毒滴度(感染单位/ml，ifu/ml)：

结果表明，病毒颗粒滴度为2.5×10¹⁰。

二、对MLK3-PSD-95相互作用、MLK3活性、MLK3-JNKs通路的抑制作用

1、材料：

MLK3、PSD-95表达质粒：pcDNA3.1-MLK3、pcDNA3.1-PSD-95为本室构建，能表达MLK3、PSD-95，用于研究MLK3-PSD-95相互作用。

腺病毒：上述构建的腺病毒Ad-MLK3PRD

2、方法：

使用Lipofectamine2000将等摩尔的pcDNA3.1-MLK3、pcDNA3.1-PSD-95共转染COS7细胞(ATCC：CRL-1651)中，转染后4h加入腺病毒Ad-MLK3PRD(MOI：50)，转染后48h收细胞。用免疫共沉淀的方法检测PSD-95与MLK3的结合情况、MLK3活性以及MLK3-JNKs通路的调节。

2.1COS-7细胞的培养和质粒转染

在含10％胎牛血清的DMEM中培养。细胞密度为90％左右时用于质粒转染。重组质粒按常规分子克隆方法构建，以LipofectAMINE2000(Invitrogen)转染细胞。用于体外蛋白质相互作用的研究。

2.2组织或细胞样品制备

按已建立方法(Liu Y，et al.Brain Res，2001，909：51-58.)。实验动物迅速断头后，取海马组织，置液氮中冻存。使用前，复温至0℃，置冰冷的匀浆液(50mM MOPS，pH 7.4，100mM KCl，320mM sucrose，0.5mM MgCl2，0.2mMdithiotheitol，phosphatase and protease inhibitors)中，Teflon匀浆器高速匀浆10秒×6，离心(800g/10min)，收集上清样品，Lowry法测定蛋白质浓度，-80℃贮存备用。培养的细胞处理后，弃去培养液，洗涤后迅速收集细胞，超声破碎，收集样品，置-80℃贮存备用。

2.3免疫印迹(immunoblot；IB)

用于检测蛋白质的表达。按裴林等人建立的方法(Acta Pharmacol Sin，2000，21：695-700)。蛋白质样品经SDS-PAGE分离后，电转至NC膜上，1％BSA中封闭3h，一抗4℃孵育过夜，洗膜，二抗30℃孵育2h，洗膜后加入显色剂(BCIP/NBT；Promega，Madison，WI)，流水洗涤终止反应，扫描，图象分析软件(Bio-Rad)分析。

2.4免疫沉淀(immunoprecipitation；IP)

用于检测蛋白质-蛋白质相互作用。按裴林等人建立的方法(ActaPharmacol Sin，2000，21：695-700)。样品蛋白中加入缓冲液稀释四倍。加入蛋白A/G-Sepharose孵育45min/4℃，离心除去非特异结合的蛋白质。上清与特异抗体4℃孵育4h，蛋白A/G-Sepharose孵育2h/4℃，离心收集免疫沉淀物，用上述IP缓冲液洗涤三次，收集沉淀样品用于免疫印迹。

3、结果与讨论

3.1Ad-MLK3PRD在COS7细胞中抑制PSD-95与MLK3的结合

研究表明PSD-95通过其SH3结构域能与MLK3中PRD结构域结合从而调控MLK3的活化。那么Ad-MLK3PRD中PRD肽段的表达是否可以竞争性结合PSD-95，从而抑制PSD-95与MLK3的结合？我们首先在异源表达系统COS7细胞中证实。

将等摩尔的pcDNA3.1-MLK3、pcDNA3.1-PSD-95采用脂质体转染的方法转染至同等代数、同一次传代的COS7细胞中，转染后4h加入Ad-MLK3PRD(MOI：50)，转染后40h收集细胞、裂解、测定蛋白质浓度，用免疫沉淀的方法检测PSD-95与MLK3的结合，结果显示，Ad-MLK3PRD作用组PSD-95与MLK3的结合明显减少(图6)，而对照组PSD-95与MLK3的结合没有影响。结果表明：Ad-MLK3PRD在COS7细胞中抑制PSD-95与MLK3的结合。

3.2AD-MLK3PRD抑制Aβ引起的皮质神经元PSD-95与MLK3的相互作用以及下游信号蛋白的调节

本发明人前期研究证明，MLK3及JNK3的激活参与了Aβ作用下的细胞毒作用。而大量研究表明PSD-95与MLK3的结合可激活MLK3及JNK3。AD-MLK3PRD神经保护作用的机制是否通过抑制PSD95与MLK3的结合从而抑制其下游信号通路而保护神经元的，我们用实验进行了证实。

体外原代培养的皮质神经元，体外培养12-14天用于实验。AD-MLK3PRD(MOI：50)在Aβ25-35刺激前72h使用，免疫共沉淀的方法检测PSD-95与MLK3的结合情况以及用MLK3、JNK3磷酸化特异性抗体免疫印迹分析检测蛋白的磷酸化MLK3、JNK3的水平变化，同批样本同时做免疫印迹分析其相应蛋白的总体水平。结果显示，(1)AD-MLK3PRD可以显著抑制Aβ引起的皮质神经元MLK3-PSD-95的结合；(2)AD-MLK3PRD可以显著抑制Aβ25-35诱导12h时MLK3和JNK3的激活(图7)。

3.3 AD-MLK3PRD对Aβ诱导后的神经元中JNK3下游信号通路的影响

为了检测AD-MLK3PRD对Aβ诱导后的神经元中JNKs的活化及其转位，继而引起下游核通路底物c-Jun的活化情况，采用免疫细胞化学技术，应用p-JNKs和P-c-jun的抗体，检测Ad-MLK3PRD对Aβ25-35(10μmol/L)作用12h时JNKs转位和c-Jun活化的影响。Ad-MLK3PRD均于作用前72h给予，图8.(图中标尺为20μm)显示可以抑制JNKs的磷酸化，减少p-JNKs向细胞核转移，进而使磷酸化c-Jun的水平降低。

p-JNKs可以通过线粒体通路引起细胞凋亡。已知p-JNKs激活下游蛋白Bad后，使Bad转为到线粒体，继而引发凋亡。本实验将腺病毒Ad-MLK3PRD及Ad-GFP分别加入细胞培养基(MOI：50)，72小时后再加入Aβ(10μmol/L)作用12小时。使用Bad的特异性抗体，用免疫印迹的方法检测bad的转位情况，结果显示图9.，Aβ作用神经元12h后，Bad转位至线粒体明显增加，而在Aβ作用前72h给予AD-MLK3PRD可以明显减少Bad向线粒体转位。

结果表明，Ad-MLK3PRD抑制了Aβ引起的JNK下游核通路及线粒体通路的激活。

三、神经保护作用(老年痴呆Aβ神经毒性)

1、材料：

腺病毒：上述构建的腺病毒Ad-MLK3PRD

2、方法：

1.1原代皮质神经元培养

孕17-19天SD大鼠，断头处死，速取胎鼠至冰冷的高糖DMEM中，体视镜下剥取皮质或海马，0.25％胰酶消化，终止反应后分散成单细胞，计数，以0.5-0.8×105的密度接种于多聚赖氨酸预处理的培养瓶或培养板中，3-4h更换无血清培养基，隔日半换液一次，培养12-14日后的细胞用于实验。

1.2脑室给药

按侯筱宇等人建立的方法(Neurosci Lett，2003，343：125-128)。大鼠麻醉后固定于大鼠脑定位仪上，切开头皮暴露颅骨，使其保持水平位置，H₂O₂烧灼暴露前囱点。钻头钻孔，位置为前囱后0.8mm，旁开1.5mm，微量注射针插入，深度为从颅骨表面向下3.5mm。病毒反复注射3天，每24小时注射1次。

1.3 SD大鼠全脑缺血

采用四动脉结扎法，已参照Pulsinelli等人方法(Stroke，1979，10：267-272.)建立(Liu Y，et al.Brain Res，2001，909：51-58.)。

1.4细胞凋亡检测

采用已建立的DAPI法(Jiang Q et al.，Brain Res，2000，887：285-292；Gu Zet al，Neuroreport，2001，12：897-900)。

1.5免疫细胞化学

按我室已建立的方法(Jiang Q et al.，Neuroreport，2001，12：2417-2421)。DAB显色观察有关蛋白质在细胞内的分布或磷酸化水平。

1.6组织学方法

按我室已建立的方法(Hou XY，et al.Neurosci lett，2005，385：230-233)。苏木素/伊红(HE)染色以显示组织中细胞存活与死亡情况。

3、结果与讨论

3.1Ad-MLK3PRD对Aβ25-35刺激后的神经元保护作用

检测Ad-MLK3PRD对Aβ25-35刺激后的神经元保护作用，采用DAPI荧光染色后，细胞核发淡蓝色荧光。正常细胞的细胞核近似圆形，边缘清晰，染色均匀。凋亡细胞核边缘不规则，细胞核染色体浓集，着色较重，并伴有细胞核固缩和细胞核碎片增加现象。

将培养12天的原代皮质神经元用Ad-MLK3PRD(MOI：50)作用72h，再使用老化过的Aβ25-35(10μM)诱导，24h后观察细胞的凋亡情况。结果显示，神经元的自然凋亡率在22左右，Aβ25-35诱导24h后神经元的凋亡率与正常对照组有明显升高(p＜0.05)，凋亡率达71％。但是在AD-MLK3PRD处理组的细胞凋亡率明显降低，凋亡率达40％，而对照组却没有明显变化(图10中，A图为DAPI染色荧光照片，箭头所示为凋亡细胞。图中标尺为20μm。B图是统计图。数据以均数加减标准误表示。以上实验重复6次。^*P＜0.05(n＝6))。

本研究结果表明，Ad-MLK3PRD对Aβ作用下的原代皮质神经元具有保护作用。

3.2 Ad-MLK3PRD对脑缺血后神经元的保护作用

实验动物随机分为3组：假手术组(sham)、缺血/再灌注组(I/R)和缺血/再灌注给药组(Ad-MLK3PRD，48h)。Ad-MLK3PRD滴度为1.78×10¹¹ifu/ml，注射量为10μl，分别于全脑缺血前24h或48h小时脑室注射给药。再灌注5天时，每组各取6只剩下的存活大鼠，苏木素/伊红染色的结果显示Ad-MLK3PRD(48h)组与I/R组相比海马神经元的存活数量明显增加。

本研究结果提示：AD-MLK3PRD对脑缺血后神经元的保护作用(图11)。

总之，本发明研究结果表明在转染细胞中该重组腺病毒的表达可以干扰MLK3与PSD-95的结合，抑制神经细胞凋亡过程中MLK3的活化及其下游的细胞信号转导，从而产生神经保护作用。因此，Ad-MLK3PRD可以作为退行性脑病(老年痴呆、帕金森病)、脑卒中和癫痫等神经系统疾病的治疗药物。

以上对本发明较佳实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

参考文献：

1.Gallo KA，Johnson GL.Nature reviews 2002 Sep；3(9)：663-72.

2.Dorow DS，Devereux L，Dietzch E，et al.Eur J Biochem，1993；213：701-10.

3.Gallo KA，Mark MR，Scadden DT，et al.J Biol Chem，1994；269：15092-100.

4.Davis RJ.TIBS，1994，19：470-473.

5.Kyriakis JM，Avruch J.Physiol Rev，2001，81：807-869.

6.Tibbles LA，Ing YL，Kiefer F，et al.EMBO J 1996；15：7026-35.

7.Buchsbaum RJ，Connolly BA，Feig LA.Mol Cell Biol 2002；22：4073-85.

8.Hardy J and Allsop D.Trends Pharmacol，Sci，199112：383-388

9.Hardy J and Selkoe DJ.Science，2002，297：353-356.

10.Bateman RJ，Munsell LY，Morris JC，et al.Nat Med，2006，12：856-861.

11.Yankner BA，Duffy LK，Kirschner DA.Science，1990，250：279-282.

12.Kowall NW，McKee AC，Yankner BA，et al.Neurobiol Aging，1992，13：537-542.

13.Demuro A，Mina E，Kayed R，et al.J Biol Chem，2005，280：17294-17300.

14.Adessi C，Soto C.Drug Develop Res，2002，56：184-193.

15.Xu Y，Hou XY，Liu Y，et al.J Neurosci Res，2009，87(4)：918-927.

16.Pan J，Zhang QG，Zhang GY.Neuroscience 2005；131(1)：147-59.

17.Liu XM，Pei DS，Guan QH，et al.J Biol Chem，2006，281(25)：17432-17445.

18.Savinainen A，Garcia EP，Dorow D，et al.J Biol Chem，2001，276(14)：11382-6.

19.Kaneko M，Saito Y，Saito H，Matsumoto T，et al.J MedChem，1997，40：1863-1869

序列表

<110>徐州医学院

<120>一种重组腺病毒及其制备方法和应用

<130>SD747-09P106963

<160>1

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>768

<212>DNA

<213>大鼠(Rattus norvegicus)

<400>1

tcagatgact catccccatt agggtctcct tctactcccc cagcactcaa cggtaatcct    60

ccaaggccta gccctgagcc agaggagcca cggcggtctg ggcccacaga acggggcaat    120

agctctggga cgcctaaact gatccaacgt gcattgctcc gggggaccgc tctgctggct    180

tccctaggcc ttggccgaga cctgcagcct ccaggaggcc tgagccgtga acgtggagag    240

tccccgacag caccaccccc tgcacagatg gcttcaccct gtccacctga cctgccctcc    300

accccgctca tccacctctc acaagcaaca cctgatgccc gtggaccact cacccctgca    360

cccttattgc tggacctagg tgtttcctct ggccagccat cagccaagag ccctcggcgg    420

gaagagacac gtggaagaac tgtttcacct ccaccaggaa tatcacgctc tgctcctggc    480

acccctggaa cccctcgctc accacctttg ggcctcatca gccgacctcg gccatcacca    540

ctccgtaacc gtattgaccc atggagcttc gtgtcagctg ggccacggcc ttcacccctg    600

ccctctccac agcctgcacc ccgacgggca ccatggacct tattcccaga ctcagatccc    660

ttctgggact ccccacctgc caaccccttc cggggaggct cccaggactg caggacgcag    720

accaaagatg tgggtgctca ggcgccatgg gcaccagaag cagggccc                 768

Claims (11)

1.一种重组腺病毒，含有编码混合系激酶3羧基末端肽第589至850位氨基酸的核苷酸，以及腺病毒载体。

2.权利要求1所述的重组腺病毒，其特征在于，所述编码混合系激酶3羧基末端肽第589至850位氨基酸的核苷酸具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

3.权利要求1所述的重组腺病毒，其特征在于，所述腺病毒载体为复制缺陷型腺病毒载体。

4.权利要求1～3之一所述重组腺病毒的制备方法，包括如下步骤：

1)将编码混合系激酶3羧基末端肽段589～850aa的cDNA定向克隆至载体，获得重组质粒；

2)将步骤1)的重组质粒亚克隆至穿梭载体，获得重组腺病毒穿梭载体；

3)将步骤2)的重组腺病毒穿梭载体与复制缺陷型病毒载体同源重组，获得病毒表达载体；以及

4)将步骤3)所获得的病毒表达载体线性化后转染至病毒包装细胞中进行包装、扩增、纯化后获得携带有混合系激酶3羧基末端肽段589～850aa的编码基因的重组腺病毒。

5.权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述穿梭载体为pAdTrack-CMV。

6.权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述复制缺陷型病毒载体为pAdEasy。

7.权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述腺病毒包装细胞为HEK293细胞。

8.权利要求1所述重组腺病毒或其表达产物在制备混合系激酶3抑制剂方面的应用。

9.权利要求1所述重组腺病毒或其表达产物在制备神经保护药物方面的应用。

10.权利要求9所述的应用，其特征在于，所述神经保护药物包括用于治疗包括退行性脑病、脑卒中以及癫痫的神经系统疾病的药物。

11.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于，所述重组腺病毒被制备成注射剂、喷涂剂、滴剂、喷雾剂或冻干粉。

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