CN115772543A - 用于将间充质干细胞重编程为胰岛β-细胞的基因组合和表达载体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，公开了一种用于将间充质干细胞重编程为胰岛β‑细胞的基因组合和表达载体及其应用，该基因组合包括来源于犬科动物的Pbx1基因、Pdx1基因、Ngn3基因、Pax4基因、Rfx3基因和MafA基因。该基因组合和表达载体用于重编程胰岛β‑细胞更高效，且获得的重编程的胰岛β‑细胞的胰岛素分泌量更高，减小细胞的死亡率，更有效地应用于治疗犬科动物I型糖尿病的药物中。

Description

用于将间充质干细胞重编程为胰岛β-细胞的基因组合和表达 载体及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种用于将间充质干细胞重编程为胰岛β-细胞的基因组合和表达载体及其应用。

背景技术

Ⅰ型糖尿病是一种代谢紊乱综合征，其特征是由于胰岛素绝对缺乏而引起的高血糖，主要是由于免疫介导的胰岛β-细胞破坏而导致，相对Ⅱ型糖尿病，Ⅰ型糖尿病由于胰岛素的绝对缺乏，危险因素更高，有自发性酮症酸中毒的倾向，急、慢性并发症出现的时间更早，概率更大。近年来，宠物糖尿病的临床病例数也呈现迅猛增长趋势，犬糖尿病的发病率已高达1.2-2％，发病率逐年增加，而且绝大多数病例属于胰岛素依赖性糖尿病，类似于人的Ⅰ型糖尿病。

虽然外源胰岛素治疗可以控制血糖升高，但不能防止血糖波动引起的微血管病变及并发症。胰岛移植是治疗胰岛素依赖性糖尿病(包括全部Ⅰ型糖尿病和必须用外源胰岛素治疗的部分Ⅱ型糖尿病)比较理想的方法，但胰岛供体缺乏和免疫排斥阻碍了该方法的普遍应用。因此，采用MSCs(间充质干细胞)新生胰岛β-细胞，为糖尿病治疗提供特异性干细胞制剂成为急需解决的关键问题。

历年来，众多研究者采用不同的条件诱导液体外诱导MSCs向IPCs(胰岛素分泌细胞)分化，诱导效果各异，诱导后的细胞发育水平远不及胰岛β-细胞，胰岛素的分泌量很少，只能达到尸体分离胰岛胰岛素分泌量的几十分之一，并且细胞死亡率高。通过载体将1-4个胰岛β-胰细胞发育调控基因转入MSCs，体外诱导其向IPCs分化的研究也频见报道，但转入1-4个外源调控基因并不能完全启动MSCs内源性级联调控系统，不足以诱导MSCs分化为真正的胰岛β-细胞。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术存在的细胞发育水平不可控，胰岛素分泌量过低，不能完全诱导MSCs分化为真正的胰岛β-细胞的问题，提供一种将犬科动物间充质干细胞重编程为胰岛β-细胞的基因组合和表达载体及其应用，该基因组合和表达载体能够高效且完全地将犬科动物MSCs重编程为胰岛β-细胞，并且使重编程的胰岛β-细胞具有低免疫原性，高胰岛素分泌量的优点。

为了实现上述目的，本发明第一方面提供了一种用于将间充质干细胞重编程为胰岛β-细胞的基因组合，该基因组合包括来源于犬科动物的Pbx1基因、Pdx1基因、Ngn3基因、Pax4基因、Rfx3基因和MafA基因。

本发明第二方面提供了一种所述的基因组合在将犬科动物的间充质干细胞重编程为胰岛β-细胞中的应用。

本发明第三方面提供了一种用于将间充质干细胞重编程为胰岛β-细胞的表达载体，该表达载体包括连接于至少两个表达载体上的来源于犬科动物的Pbx1基因、Pdx1基因、Ngn3基因、Pax4基因、Rfx3基因和MafA基因。

本发明第四方面提供了一种将间充质干细胞重编程为胰岛β-细胞的方法，该方法包括：使用如上所述的表达载体感染犬科动物的间充质干细胞，使其重编程为胰岛β-细胞。

本发明第五方面提供了如上所述的方法重编程获得的胰岛β-细胞。

本发明第六方面提供了一种用于降低血糖及恢复体重的干细胞制剂，所述干细胞制剂含有如上所述的胰岛β-细胞和犬科动物的间充质干细胞。

本发明第七方面提供了一种如上所述的胰岛β-细胞和/或如上所述的干细胞制剂在制备用于治疗犬科动物的I型糖尿病的药物中的应用。

通过上述技术方案，本发明采用特定的基因组合和表达载体使基因组合中的各基因能够在犬科动物的MSCs中高水平表达，协同激发MSCs的内源性调控系统，使其重编程为胰岛β-细胞，相对于现有的基因诱导MSCs向IPCs分化的效果更好，避免了细胞分化程度低和死亡率高的缺陷，载体(腺病毒)颗粒随着细胞传代被逐渐稀释，最终消失，无遗传毒性，提高了胰岛素的分泌量，不受糖尿病犬科动物自身抗体ICA(胰岛细胞抗体)和GADA(谷氨酸脱羧酶抗体)的影响，施用于机体可以逆转其高血糖。

附图说明

图1是用携带有基因的表达载体感染犬MSCs细胞后，细胞中基因的mRNA和蛋白质表达水平图；

图2是表达载体的免疫荧光检测图；

图3是重编程的胰岛β-细胞的基因mRNA表达水平图；

图4是重编程的胰岛β-细胞的胰岛素分泌量变化图；

图5是重编程的胰岛β-细胞的糖刺激C-肽分泌量变化图；

图6是重编程的胰岛β-细胞的胰岛素和C-肽的免疫荧光染色图；

图7是重编程的胰岛β-细胞免疫表型的流式细胞术检测图；

图8是PBMCs刺激指数变化图；

图9是重编程的胰岛β-细胞凋亡变化图；

图10是GADA和ICA的结合位点免疫荧光检测图；

图11是腹膜炎性浸润试验结果；

图12是模型糖尿病犬细胞移植治疗后的血糖变化；

图13是模型糖尿病犬细胞移植治疗后的体重变化；

图14是模型糖尿病犬细胞移植治疗后的糖耐受试验结果；

图15是病例1的临床糖尿病犬细胞移植治疗后的血糖和体重变化；

图16是病例2的临床糖尿病犬细胞移植治疗后的血糖和体重变化。

具体实施方式

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

在本发明中，在未作相反说明的情况下，使用的方位词如“MSCs”是指间充质干细胞；“IPCs”是指胰岛素分泌细胞；“ICA”是指犬胰岛细胞抗体；“GADA”是指谷氨酸脱羧酶抗体；“PBMCs”是外周血单核细胞；“MOI”是指感染复数，为感染时病毒与细胞数量的比值；“PHA”是指植物血凝素A，可刺激淋巴细胞增殖；“刺激指数”是判断淋巴细胞反应强度的指标，即PHA刺激转化细胞与未刺激对照细胞的平均百分比，计算公式为：刺激指数＝(OD_{混合反应细胞组}—OD_{刺激细胞组})/(OD_{反应细胞组}—OD_{空白对照组})。

本发明中，所述及的间充质干细胞通常指来源于犬科动物(优选犬)的脂肪、骨髓、脐带和胎盘等的间充质干细胞。

本发明一方面提供一种用于将间充质干细胞重编程为胰岛β-细胞的基因组合，该基因组合包括来源于犬科动物的Pbx1基因、Pdx1基因、Ngn3基因、Pax4基因、Rfx3基因和MafA基因。

其中，Pbx1基因指pre-B-cell leukemia homeobox 1基因，如Gene ID:488669；Pdx1基因指pancreatic and duodenal homeobox 1基因，如Gene ID:493994；Ngn3基因指neurogenin 3基因，如Gene ID:489022；Pax4基因指paired box 4基因，如Gene ID:482268；Rfx3基因指regulatory factor X 3基因，如Gene ID:476339；MafA基因指v-mafmusculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homologue A基因，如Gene ID:100684427。

根据本发明的优选实施方式，以上基因进入细胞后表达为蛋白发挥作用，因此，本发明还涉及一种蛋白组合，所述蛋白组合包括来源于犬科动物的Pbx1蛋白、Pdx1蛋白、Ngn3蛋白、Pax4蛋白、Rfx3蛋白和MafA蛋白。可以理解的是，各蛋白的氨基酸序列即为相应各基因编码的氨基酸序列。

本发明第二方面提供一种所述的基因组合在将犬科动物的间充质干细胞重编程为胰岛β-细胞中的应用，或在制备用于将犬科动物的间充质干细胞重编程为胰岛β-细胞的试剂盒中的应用。

本发明第三方面提供一种用于将间充质干细胞重编程为胰岛β-细胞的表达载体，该表达载体包括连接于(至少两个)表达载体上的来源于犬科动物的Pbx1基因、Pdx1基因、Ngn3基因、Pax4基因、Rfx3基因和MafA基因。

根据本发明的优选实施方式，所述表达载体包括携带有Pbx1基因、Pdx1基因、Ngn3基因和Pax4基因的第一表达载体以及携带有Rfx3基因和MafA基因的第二表达载体，如此能够节约成本，更高效的表达目的基因的蛋白。

根据本发明的优选实施方式，以上所述表达载体为两个，与所携带的基因存在多种组合情况，如将上述全部基因随机分成两个组合分别被携带在两个表达载体上，所述可以为任意四个基因和两个基因的组合，也可以为任意三个和三个基因的组合。

根据本发明的优选实施方式，所述表达载体为携带有所述基因的腺病毒载体。

根据本发明的优选实施方式，所述腺病毒载体为pAdTrack-CMV和/或RedTrack-CMV中的至少一种，这两个腺病毒载体能够更好的标记区分上述基因，以便追踪、检测和确认所述表达载体在感染后的MSCs中的存在，其中，所述pAdTrack-CMV的标记为绿色荧光，所述RedTrack-CMV的标记为红色荧光。优选地，第一表达载体为pAdTrack-CMV，第二表达载体为RedTrack-CMV。

本发明第四方面提供一种将间充质干细胞重编程为胰岛β-细胞的方法，该方法包括：使用如上所述的表达载体感染犬科动物的间充质干细胞，使其重编程为胰岛β-细胞。

根据本发明的方法，所述感染前还包括基因的扩增、基因和表达载体的连接、携带有基因的表达载体的重组和包毒，进一步地提高表达载体感染犬科动物的间充质干细胞时的活性，提高目的基因的表达效率。

根据本发明的方法，所述感染犬科动物的间充质干细胞的MOI(也即感染时表达载体与间充质干细胞的数量比值)为90-110。

根据本发明的方法，如上所述重编程获得的胰岛β-细胞。按照本发明方法重编程的胰岛β-细胞表达Pdx1基因、MafA基因、Nkx6.1基因、Nkx2.2基因、Pax4基因、Pcsk1基因和Ins基因等，这些基因为与胰岛β-细胞发育、成熟和胰岛素分泌紧密相关的基因，因此，本发明的胰岛β-细胞具有更高的胰岛素和C-肽分泌量的特点。

本发明重编程获得的胰岛β-细胞单独使用也能够定植于犬体内，对高血糖刺激做出反应，逆转机体的高血糖。但是与间充质干细胞共同使用能够进一步延长重编程获得的胰岛β-细胞发挥作用的时间，因此，本发明第五方面提供了一种用于降低血糖及恢复体重的干细胞制剂，所述干细胞制剂含有如上所述的胰岛β-细胞和犬科动物的间充质干细胞。

根据本发明，所述胰岛β-细胞和间充质干细胞的细胞数量比例为1：1-3。

根据本发明的优选实施方式，所述干细胞制剂为液体制剂，所述制剂中胰岛β-细胞的浓度为1×10⁶-6×10⁶个细胞/mL，其中，所述液体制剂为重编程的胰岛β-细胞和犬科动物间充质干细胞的悬浮混合液。

本发明第六方面提供了一种如上所述的胰岛β-细胞和/或如上所述的干细胞制剂在制备用于治疗犬科动物的I型糖尿病的药物中的应用。

根据本发明，可以按照常规的方式施用重编程的胰岛β-细胞或干细胞制剂。优选地，所述应用的方式为细胞移植，细胞移植的部位可以为双侧腹股沟皮下。可以根据犬的病情、体重等确定施用量，一般地，可以根据血糖水平按照每公斤体重1×10⁶-6×10⁶个重编程的胰岛β-细胞的用量进行施用，能够配合犬MSCs调节免疫反应，促进重编程的胰岛β-细胞发挥功能。

本发明中，所述及的犬科动物可以为常见的各种犬科动物，尤其是犬(Canislupus familiaris)、狼(Canis lupus)、豺(Cuon alpinus)和狐狸(Vulpes)。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中，MOI参数通过的梯度预实验的方法测得；Human/Canine/Porcine Insulin Quantikine ELISA Kit为R&D Systems公司牌号为DINS00的市售品；C-肽测定试剂盒为齐誉生物公司牌号为QY-R1083-1的市售品；pAdTrack-CMV为丰晖生物公司牌号为BR007的市售品；RedTrack-CMV为丰晖生物公司牌号为FH1751的市售品；Easy Geno重组克隆试剂盒为天根生物公司牌号为VI201的市售品；BJ5183-AD-1化学感受态细胞为北京华越洋生物公司牌号为GX890的市售品；内切酶BglⅡ和HindⅢ均购自TaKaRa公司；内切酶PmeⅠ为New England Biolabs公司牌号为R0560V的市售品；内切酶PacⅠ为New England Biolabs公司牌号为R0547V的市售品。

制备例：

(1)通过PCR技术使用如表1所示序列的正向和反向引物对相应基因(Pbx1基因、Pdx1基因、Ngn3基因、Pax4基因、Rfx3基因和MafA基因的序列分别为Gene ID:488669、GeneID:493994、Gene ID:489022、Gene ID:482268、Gene ID:476339、Gene ID:100684427)的序列进行扩增。

表1.Pbx1、Pdx1、Ngn3、Pax4、Rfx3和MafA基因片段扩增的PCR引物

引物名称	引物序列
		PBX1-F	tgaaccgtcagatccgctagagatctGCCACCATGGACGAGCAGCCCAGACTGA(SEQ ID NO：1)
PBX1-PDX1-R	cgtagaactgttcctcgctgttcatGGGCCCAGGGTTGGACTCAACG(SEQ ID NO：2)
		P1-PDX1-F	agacgttgagtccaaccctgggcccGCCACCATGAACAGCGAGGAACAGTTCT(SEQ ID NO：3)
PDX1-NGN3-R	gagcaccagaaggatgaggggccatAGGTCCGGGGTTAGATTCCACG(SEQ ID NO：4)
		P1-NGN3-F	cgacgtggaatctaaccccggacctGCCACCATGGCCCCTCATCCTTCTGGTG(SEQ ID NO：5)
NGN3-PAX4-R	cctcgccccatccgacttgaggcatAGGCCCGGGGTTTTCTTCAACA(SEQ ID NO：6)
		N3-PAX4-F	agatgttgaagaaaaccccgggcctGCCACCATGCCTCAAGTCGGATGGGGCG(SEQ ID NO：7)
PAX4-Z-R	ggatcggatatcttatctagaagcttTCAGCCGATTTCTTTGCCGGCC(SEQ ID NO：8)
		RFX3-F	gatatcttatctagaagcttGCCACCATGCAGACCAGCGAAACCGGCT(SEQ ID NO：9)
RFX3-MAFA-R	cagttcggcagccatTCAAGGCCCGGGGTTTTCTTCA(SEQ ID NO：10)
		R3-MAFA-F	aaccccgggccttgaGCCACCATGGCTGCCGAACTGGCCATGG(SEQ ID NO：11)
MAFA-Z-R	gtcagatccgctagagatctTCAAGGTCCAGGGTTGCTTTCC(SEQ ID NO：12)

(2)使用内切酶BglⅡ和HindⅢ酶切pAdTrack-CMV和RedTrack-CMV获得相应的线性化表达载体，通过Easy Geno重组克隆试剂盒将扩增后的Pbx1基因、Pdx1基因、Ngn3基因、Pax4基因的片段和线性pAdTrack-CMV载体进行连接，将Rfx3基因和MafA基因的片段和线性RedTrack-CMV载体进行连接，各个基因以2A序列连接。

(3)使用内切酶PmeⅠ酶切步骤(2)中构建成功的携带有目的基因的表达载体获得其相应的线性化表达载体，转入BJ5183-AD-1化学感受态细胞中与pAdEasy-1进行重组。

(4)使用内切酶PacⅠ酶切步骤(3)中重组后的表达载体，获得线性化的重组表达载体，转入AAV-293细胞中进行包毒，获得pAdEasy-Pbx1-Pdx1-Ngn3-Pax4腺病毒颗粒和pAdEasy-Rfx3-MafA腺病毒颗粒。

(5)将步骤(4)获得的腺病毒颗粒以MOI＝100感染犬MSCs、进行重编程，获得重编程的胰岛β-细胞(简称RM-βCs)，其中，感染后的犬间充质干细胞中目的基因的mRNA和蛋白的表达水平如图1所示，可以看出以犬MSCs和空白载体(pAdEasy-0)为对照，载体上携带的基因mRNA表达量极显著高于对照组；再通过蛋白质印记表示重组后的载体也能表达其相应携带的目的基因，目的基因在细胞内高表达。其中，从犬脂肪组织中经犬全骨髓培养法和酶消化法分离获得犬MSCs，分别经形态观察、生长曲线测定、三系分化和表面抗原的流式细胞术鉴定，确定为犬脂肪MSCs。pAdEasy-Pbx1-Pdx1-Ngn3-Pax4腺病毒颗粒(绿)和pAdEasy-Rfx3-MafA腺病毒颗粒(红)感染犬MSCs细胞的荧光变化如图2所示，可以看出感染后的细胞的荧光颜色为黄绿色，说明这两个携带目的基因的腺病毒颗粒成功感染犬MSCs。对感染后的犬MSCs进行倒置荧光显微镜观察，确定其细胞形态逐渐发生变化、并增殖分化形成RM-βCs。

RM-βCs的基因表达：通过RT-qPCR，在如表2所示序列的正向和反向引物的存在下，以未诱导的犬MSCs和胰岛细胞(通过酶消化法从犬尸体胰腺分离获得)作为对照，Gadph作为内参基因，对β-细胞成熟标志基因Pdx1、MafA、Nkx6.1、Nkx2.2、Pax4、Pcsk1和Ins的表达进行检测，结果如图3所示，可以看出，犬的MSCs正常情况下基本不表达这些基因，RM-βCs中这些基因的表达量至少可达胰岛细胞表达量的35％-80％。图中，####表示P＜0.0001；****表示P＜0.0001；**表示P＜0.01。相应的引物序列如下表所示：

表2.Pdx1、MafA、Nkx6.1、Nkx2.2、Pax4、Pcsk1和Ins基因表达检测引物

胰岛素和C-肽分泌量：通过葡萄糖刺激、Human/Canine/Porcine InsulinQuantikine ELISA Kit和C-肽测定试剂盒测得，胰岛细胞和RM-βCs的胰岛素分泌量结果如图4所示，可以看出在三种不同糖浓度的刺激情况下，RM-βCs的胰岛素分泌量均可达到胰岛细胞胰岛素分泌量的50％及以上，高糖(25mM)刺激下，RM-βCs的胰岛素分泌量高达225.80±10.82μIU/10⁵细胞。此外，在6基因的基础上再分别增加2个基因(Nkx2.2和Nkx6.1、Nkx2.2和Gata4、Gata4和Nkx6.1)，胰岛素的分泌量无提高，即使用8个基因重编程的RM-βCs的胰岛素分泌效率与使用本发明特定的6个基因重编程的RM-βCs的胰岛素分泌效率相当，其中，####表示P＜0.0001。MSCs、胰岛细胞和RM-βCs的C-肽分泌量如图5所示，可以看出在三种不同糖浓度的刺激状态下，MSCs本身的C-肽分泌量极少，RM-βCs的C-肽分泌量可达到胰岛细胞C-肽分泌量的50％左右，高糖(25mM)刺激下，RM-βCs的C-肽分泌量高达3.61±0.19ng/10⁵细胞。图中，####表示P＜0.0001；****表示P＜0.0001。

RM-βCs的免疫荧光染色：使用Hoechst 33258对细胞核进行免疫荧光染色后，进一步加入胰岛素一抗(小鼠单克隆抗体)以及DyLight488标记山羊抗小鼠IgG二抗染色胰岛素和C-肽一抗(兔多克隆抗体)以及DyLight594标记山羊抗兔IgG二抗染色C-肽，结果如图6所示，可以看出RM-βCs中胰岛素和C-肽免疫荧光染色阳性，荧光颜色为彩色。其中，RM-βCs未染色前呈灰色，经Hoechst33258染色后的细胞核呈蓝色；胰岛素经胰岛素一抗(小鼠单克隆抗体)以及DyLight488标记山羊抗小鼠IgG二抗染色后发出绿色荧光、C-肽经C-肽一抗(兔多克隆抗体)以及DyLight594标记山羊抗兔IgG二抗染色后发出红色荧光。

RM-βCs的免疫原性检测：

1、通过流式细胞术分别检测犬MSCs和RM-βCs表面免疫表型DLA Class I，DLAClassⅡ，CD4和CD80的变化，结果如图7所示，可以看出，和犬MSCs相比，RM-βCs表面也缺乏DLA ClassⅡ分子和共刺激分子CD40、CD80。其中，****表示P＜0.0001。

2、单向混合淋巴细胞实验：以犬MSCs和RM-βCs分别与PBMCs共培养，刺激使其增殖，增殖能力如图8所示，可以看出，当犬MSCs和RM-βCs与PBMCs共培养时，无论何种比例对PBMCs的刺激指数均变小，说明两种细胞均可抑制PBMCs的增殖。其中，！！！！表示P＜0.0001；！！表示P＜0.01；####表示P＜0.0001；**表示P＜0.01。

3、淋巴细胞毒性试验：通过腹腔注射犬MSCs和RM-βCs预致敏犬脾细胞，将犬MSCs和RM-βCs分别与预致敏犬脾细胞共培养，再通过共培养检测预致敏犬脾细胞对RM-βCs的细胞毒性，结果如图9所示，可以看出随着预致敏的脾细胞的含量越多，相比于犬MSCs，只是稍容易引起RM-βCs的凋亡。其中，###表示P＜0.001；##表示P＜0.01；****表示P＜0.0001。

4、免疫荧光检测GADA和ICA的结合位点，其中，GADA染色为绿色荧光，ICA染色为红色荧光，结果如图10所示，可以看出和胰岛细胞相比，RM-βCs中无GADA和ICA的结合位点。

5、体内腹膜炎性浸润实验：腹腔注射RM-βCs检测CD45⁺细胞、CD3e⁺细胞和总白细胞数量，MSCs作为对照，PBS作为空白对照，结果如图11所示，可以看出移植RM-βCs到腹腔后，相比于对照组和空白对照组，CD45阳性和CD3e阳性的细胞明显增多，说明RM-βCs的加入引起炎性细胞浸润等免疫反应。其中，^^^^表示P＜0.0001；****表示P＜0.0001；####表示P＜0.0001；！！！！表示P＜0.0001。

测试例1：RM-βCs移植治疗模型犬糖尿病

模型的建立：将5-10公斤的中华田园犬的85％胰腺切除，并配合5mg/kg链脲佐菌素溶液约9mL腹腔注射，构建犬Ⅰ型糖尿病模型。模型犬的空腹血糖值要求超过15mmol/L(15.5-18mmol/L)。设置RM-βCs和MSCs(组1)和RM-βCs(组2)为试验组，MSCs(组3)和PBS(组4)为对照组，分别进行细胞移植(或PBS注射)治疗。治疗后各组犬的血糖变化如图12所示，体重变化如图13所示，糖耐受变化如图14所示。

组1：将制备例所获得的RM-βCs和MSCs细胞按1：1配制，每公斤体重1mL的剂量注射于模型犬的残余胰腺组织中，其中，RM-βCs的细胞数量为5×10⁶个/公斤体重。用四只模型犬做平行试验，取其平均值。治疗前后血糖和体重变化如表3所示，移植细胞后第9天，血糖开始下降；移植后第15天，空腹血糖下降至15mmol/L以下；移植后第21天，空腹血糖下降至10mmol/L以下；移植后第24天，空腹血糖下降至8mmol/L以下，模型犬随着血糖的降低，多饮多尿症状逐渐减轻，直至消失，体重基本恢复到制模前的水平，可维持88天。

组2：将制备例获得的RM-βCs按5×10⁶个/mL/公斤体重的剂量注射于模型犬的残余胰腺组织中。用四只模型犬做平行试验，取其平均值。移植细胞后第15天，血糖开始下降；移植后第27天，空腹血糖下降至15mmol/L以下；移植后第42天，空腹血糖下降至10mmol/L以下；移植后的第54天，空腹血糖下降至8mmol/L以下。模型犬随着空腹血糖的降低，多饮多尿症状逐渐减轻，直至消失，体重基本恢复到制模前的水平，可维持37天。

组3：将犬脂肪MSCs按照5×10⁶个/mL/公斤体重的剂量注射于模型犬的残余胰腺组织中。用四只模型犬做平行试验，取其平均值。治疗前后血糖和体重变化如表3所示，移植细胞后第36天，空腹血糖开始轻微下降，但未降至15mmol/L以下；移植后第93天开始，空腹血糖水平出现持续升高；所有犬多饮、多尿症状未出现减轻，体重持续降低。

组4：将PBS溶液按1mL/公斤体重的剂量注射于模型犬的残余胰腺组织中。用三只模型犬做平行试验，取其平均值。治疗前后血糖和体重变化如表3所示，犬的空腹血糖持续升高，多饮多尿症状日益严重，体重出现持续下降，精神状态差。

通过图12-14及表3中测试例1的结果可以看出，采用本发明获得的RM-βCs能够定植于犬体内，对高血糖刺激做出反应，在一定时间段内逆转机体的高血糖；MSCs与RM-βCs共移植，能够为RM-βCs创造更好的环境，延长RM-βCs发挥作用的时间。

测试例2：一只雌性法斗犬(病例1)，9岁，体重7.5kg，已绝育，患Ⅰ型糖尿病已超过5年，无外源胰岛素情况下空腹血糖超过41mmol/L，三多一少症状明显，前后肢溃烂，双眼出现严重白内障。发病后一直用诺和平中效胰岛素12IU(早6IU，晚6IU)治疗，已无法维持血糖(15.15-25.35mmol/L)平稳。将制备例所获得的RM-βCs和MSCs按1：1混合形成细胞制剂，按每公斤体重1mL的剂量注射于病犬的腹股沟皮下，其中RM-βCs的细胞数量为5×10⁶个/公斤体重。细胞移植治疗后，空腹血糖出现下降的趋势，在第34天，血糖下降至17.5mmol/L，并可维持在此水平；在第38d，进行了第二次细胞移植，随后血糖继续下降，虽有起伏，但均维持在7-14mmol/L之间。在使用细胞制剂后，胰岛素的用量从12IU(早6IU，晚6IU)减至3IU(早1.5IU，晚1.5IU)。在治疗过程中，随着空腹血糖的下降，犬的体重出现回升。治疗后血糖和体重的连续变化如图15和表3测试例2所示。

测试例3：一只雄性中华田园犬(病例2)，5岁，体重8.20kg，患Ⅰ型糖尿病已超过1年，无外源胰岛素情况下空腹血糖超过25mmol/L，三多一少症状明显，未见明显的并发症。发病后一直用诺和平中效胰岛素7IU(早4IU，晚3IU)治疗，空腹血糖在9.05-13.28mmol/L之间波动。将制备例所获得的RM-βCs和MSCs按1：1混合形成细胞制剂，按每公斤体重1mL的剂量注射于病犬的腹股沟皮下，其中，RM-βCs的细胞数量为5×10⁶个/公斤体重。细胞移植治疗后，空腹血糖出现下降的趋势；在移植后第20天时，血糖降至17.60mmol/L，随后可维持在此水平。在第一次移植后第26d，进行了第二次细胞移植，在移植后第40d，血糖下降至10mmol/L以下，此后血糖起伏范围较小，基本上位于7-9mmol/L之间。在使用细胞制剂后，胰岛素用量从7IU(早4IU，晚3IU)减至1IU(早0.5IU，晚0.5IU)。随着血糖水平的降低及平稳，犬的体重逐渐回升。治疗后血糖和体重的连续变化如图16和表3测试例3所示。

通过图15-16及表3测试例2和测试例3的结果所示，将本发明获得的RM-βCs与MSCs共移植于临床Ⅰ型糖尿病犬体内，在一定时间段内可降低血糖，使体重恢复且保持稳定；另外，还可以发现测试例2和测试例3的犬的外源胰岛素用量分别减少了75％和85.71％，本发明特制的细胞制剂能够通过多次移植，逐渐替代外源胰岛素的使用，而且不会引起犬自身抗体GADA和ICA水平升高。说明RM-βCs和MSCs共移植治疗犬临床Ⅰ型糖尿病的疗效显著，有望经过多次移植而治愈。

表3细胞移植治疗后犬的血糖和体重变化

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种用于将间充质干细胞重编程为胰岛β-细胞的基因组合，其特征在于，该基因组合包括来源于犬科动物的Pbx1基因、Pdx1基因、Ngn3基因、Pax4基因、Rfx3基因和MafA基因。

2.权利要求1所述的基因组合在将犬科动物的间充质干细胞重编程为胰岛β-细胞中的应用。

3.一种用于将间充质干细胞重编程为胰岛β-细胞的表达载体，其特征在于，该表达载体包括连接于至少两个表达载体上的来源于犬科动物的Pbx1基因、Pdx1基因、Ngn3基因、Pax4基因、Rfx3基因和MafA基因。

4.根据权利要求3所述的表达载体，其中，所述表达载体包括携带有Pbx1基因、Pdx1基因、Ngn3基因和Pax4基因的第一表达载体以及携带有Rfx3基因和MafA基因的第二表达载体。

5.根据权利要求3所述的表达载体，其中，所述表达载体为携带有所述基因的腺病毒载体；

优选的，所述腺病毒载体为pAdTrack-CMV和/或RedTrack-CMV中的至少一种。

6.一种将间充质干细胞重编程为胰岛β-细胞的方法，其特征在于，该方法包括：使用权利要求3、4或5所述的表达载体感染犬科动物的间充质干细胞，使其重编程为胰岛β-细胞。

7.根据权利要求6所述的方法重编程获得的胰岛β-细胞。

8.一种用于降低血糖及恢复体重的干细胞制剂，其特征在于，所述干细胞制剂含有权利要求7所述的胰岛β-细胞和犬科动物的间充质干细胞。

9.根据权利要求8所述的干细胞制剂，其中，所述胰岛β-细胞和间充质干细胞的细胞数量比例为1：1-3；

优选地，所述干细胞制剂为液体制剂，所述干细胞制剂中胰岛β-细胞的浓度为1×10⁶-6×10⁶个细胞/mL。

10.权利要求7所述的胰岛β-细胞和/或权利要求8或9所述的干细胞制剂在制备用于治疗犬科动物的I型糖尿病的药物中的应用。

Images