CN108624562B - 一种制备肿瘤干细胞的方法及其专用试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种制备肿瘤干细胞的方法及其专用试剂盒。该方法依次包括如下步骤：取肿瘤细胞，接种至诱导培养基，贴壁培养3d～5d；接种至肿瘤细胞球培养基，贴壁培养1d～3d；接种至肿瘤细胞球培养基，悬浮培养，得到肿瘤干细胞；诱导培养基中含有MEK抑制剂、GSK3抑制剂和HDAC抑制剂；肿瘤细胞球培养基为含有青霉素、链霉素和B27培养基添加剂的mTeSR培养基。实验证明，采用本发明提供的方法制备的肿瘤干细胞高表达Oct4、Nanog和CD133，生长缓慢，且具有外排Hoechst、耐受化疗药物等生物学特性，完全获得了肿瘤干细胞的特征。本发明具有重大的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物医学领域，具体涉及一种制备肿瘤干细胞的方法及其专用试剂盒。
背景技术
胰腺癌是一种高度致命性消化道恶性肿瘤，恶性程度高，转移和复发率高，预后差。由于胰腺癌早期缺乏典型的临床表现，确诊时往往已经进入晚期，再加上胰腺癌对化疗药物不敏感，广泛耐药，尽管近几年在胰腺癌的医疗诊断和手术治疗方面都取得了一定进展，但胰腺癌仍然是癌症相关死亡的主要原因。
研究证实，在血液恶性肿瘤和包括胰腺癌在内的实体瘤中存在肿瘤干细胞(CSCs)，肿瘤干细胞在肿瘤复发中起着至关重要的作用。肿瘤干细胞理论认为，肿瘤存在异质性，肿瘤内存在一小部分能够自我更新，多效分化，高致瘤性以及对放疗化疗具有抵抗能力的癌细胞，其余大部分细胞失去生长分化潜能，没有或者只有有限的增殖分化能力，经过短暂的分化后最终死亡。肿瘤干细胞学说为胰腺癌发病机制和治疗策略的研究提供了新的依据，只有清除肿瘤干细胞才能根治恶性肿瘤，否则残存的肿瘤干细胞依然会导致肿瘤的复发，以前对于胰腺癌的研究忽略了肿瘤干细胞的存在，目前采取的治疗方法不能有效的清除胰腺癌中的肿瘤干细胞，这或许是导致胰腺癌治疗失败，肿瘤转移复发的根本原因。目前认为消除肿瘤干细胞是获得癌症永久性治愈的重要策略。肿瘤干细胞的发现和研究为癌症的研究和治疗带来了新的方向。
2007年，Li等将人原发胰腺癌标本种植于非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠皮下，对第一代及传代后的肿瘤细胞进行标记，通过流式分选技术分选出0.2％-0.8％CD24+CD44+ESA+细胞，该亚群细胞在NOD/SCID小鼠体内具有高致瘤性，其致瘤能力是CD24-CD44-ESA-细胞的100倍。此外，将分离出的CD44+CD24+ESA+细胞进行连续传代成瘤实验发现，其肿瘤组织中CD44+CD24+ESA+细胞比例与其来源的人胰腺癌组织相似，说明CD24+CD44+ESA+细胞具有自我更新能力，证实了胰腺癌干细胞的存在。2007年，Hermann等发现，在胰腺癌细胞中有1％-3％表达CD133+细胞亚群，其同样具有肿瘤干细胞的特性。之后，研究者发现通过细胞表面标志物c-Met和/或ALDH也可以分离得到胰腺癌干细胞。除了通过肿瘤干细胞的表面标志物的方法分离胰腺癌干细胞外，也有研究者根据胰腺癌干细胞的生物学特性分离胰腺癌干细胞。Hoechst33342是一种核酸荧光染料，在肿瘤干细胞中有一部分细胞可以外排这种染料，从而使细胞核不着色或着色程度很低，研究者将这类细胞称为侧群(side population，SP)细胞。Zhou等用流式细胞仪从人胰腺癌细胞系Panc1中分离出对Hoechst33342拒染的SP细胞，约占细胞总数的2.1-8.7％。也有研究者将人胰腺癌细胞系在含有表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、白血病抑制因子(LIF)、神经细胞存活因子-1(NSF-1)和N-乙酰半胱氨酸的CSC诱导培养基中培养，获得球形细胞后转移到层粘连蛋白包被的培养皿中,在含有B27培养基添加剂、BSA、EGF、bFGF的DMEM-F12基础培养基中培养约两个月，诱导细胞中CD24+CD44+ESA+的比例增加，诱导的细胞具有高致瘤性，细胞循环检测显示诱导细胞处于G0/G1期。2016年，Ning等将胰腺癌细胞在含有BFGF、EGF、B27培养基添加剂和胰岛素的DMEM-F12基础培养基中培养，发现胰腺癌细胞可聚集成球并表达胰腺癌干细胞的表面标志物，表明胰腺癌细胞在一定条件下可以转变为胰腺癌干细胞。由于肿瘤干细胞的表面标志物缺少特异性，而Hoechst33342具有毒性，因此现有方法分离获得的肿瘤干细胞含量少，限制了肿瘤干细胞的研究。由此可见，建立一种快速高效获得大量肿瘤干细胞的方法，对于肿瘤干细胞的深入研究以及开发针对肿瘤干细胞的靶向治疗具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种制备肿瘤干细胞的方法。
本发明首先提供了用于制备肿瘤干细胞的试剂盒；所述试剂盒可含有诱导培养基；所述诱导培养基中可含有MEK抑制剂、GSK3抑制剂和HDAC抑制剂。
所述诱导培养基中可含有0.3～0.7μM MEK抑制剂(如0.3～0.5μM MEK抑制剂、0.5～0.7μM MEK抑制剂、0.3μM MEK抑制剂、0.5μM MEK抑制剂或0.7μM MEK抑制剂)、1～5μMGSK3抑制剂(如1～3μM GSK3抑制剂、3～5μM GSK3抑制剂、1μM GSK3抑制剂、3μM GSK3抑制剂或5μM GSK3抑制剂)和0.8～1.2μM HDAC抑制剂(如0.8～1.0μM HDAC抑制剂、1.0～1.2μMHDAC抑制剂、0.8μM HDAC抑制剂、1.0μM HDAC抑制剂或1.2μM HDAC抑制剂)。
所述诱导培养基中具体可含有0.5μM MEK抑制剂、3μM GSK3抑制剂和1.0μM HDAC抑制剂。
上述任一所述MEK抑制剂具体可为PD0325901。
上述任一所述GSK3抑制剂具体可为a1)或a2)或a3)或a4)：a1)CHIR99021；a2)B216763；a3)BIO；a4)TWS119。
上述任一所述HDAC抑制剂具体可为VPA。
上述任一所述诱导培养基可为含有8mL/100mL～12mL/100mL FBS(如8mL/100mL～10mL/100mL FBS、10mL/100mL～12mL/100mL FBS、8mL/100mLFBS、10mL/100mL FBS或12mL/100mL FBS)、1340U/100mL～2000U/100mL青霉素(如1340U/100mL～1670U/100mL青霉素、1670U/100mL～2000U/100mL青霉素、1340U/100mL青霉素、1670U/100mL青霉素或2000U/100mL青霉素)、800U/100mL～1200U/100mL链霉素(如800U/100mL～1000U/100mL链霉素、1000U/100mL～1200U/100mL链霉素、800U/100mL链霉素、1000U/100mL链霉素或1200U/100mL链霉素)、15μL/mL～25μL/mL B27培养基添加剂(如15μL/mL～20μL/mL B27培养基添加剂、20μL/mL～25μL/mL B27培养基添加剂、15μL/mL B27培养基添加剂、20μL/mL B27培养基添加剂或25μL/mL B27培养基添加剂)、0.3～0.7μM PD0325901(如0.3～0.5μMPD0325901、0.5～0.7μM PD0325901、0.3μM PD0325901、0.5μM PD0325901或0.7μMPD0325901)、1～5μM CHIR99021(如1～3μM CHIR99021、3～5μM CHIR99021、1μMCHIR99021、3μM CHIR99021或5μM CHIR99021)和0.8～1.2μM VPA(如0.8～1.0μM VPA、1.0～1.2μM VPA、0.8μM VPA、1.0μM VPA或1.2μM VPA)的干细胞无血清完全培养基。
上述任一所述诱导培养基具体可为含有10mL/100mL FBS、1670U/100mL青霉素、1000U/100mL链霉素、20μL/mL B27培养基添加剂、0.5μM PD0325901、3μM CHIR99021和1μMVPA的干细胞无血清完全培养基。
所述试剂盒还可含有肿瘤细胞球培养基；所述肿瘤细胞球培养基可为含有1340U/100mL～2000U/100mL青霉素(如1340U/100mL～1670U/100mL青霉素、1670U/100mL～2000U/100mL青霉素、1340U/100mL青霉素、1670U/100mL青霉素或2000U/100mL青霉素)、800U/100mL～1200U/100mL链霉素(如800U/100mL～1000U/100mL链霉素、1000U/100mL～1200U/100mL链霉素、800U/100mL链霉素、1000U/100mL链霉素或1200U/100mL链霉素)和15μL/mL～25μL/mL B27培养基添加剂(如15μL/mL～20μL/mL B27培养基添加剂、20μL/mL～25μL/mLB27培养基添加剂、15μL/mL B27培养基添加剂、20μL/mL B27培养基添加剂或25μL/mL B27培养基添加剂)的干细胞无血清完全培养基。
所述肿瘤细胞球培养基具体可为含有1670U/100mL青霉素、1000U/100mL链霉素和20μL/mL B27培养基添加剂的干细胞无血清完全培养基。
上述任一所述干细胞无血清完全培养基可为mTeSR培养基。
上文中，在50mL肉汤培养基中完全抑制金黄色葡萄球菌标准菌株发育的最小青霉素剂量为1U。在1mL肉汤培养基中完全抑制大肠杆菌标准菌株发育的最小链霉素剂量为1U。
所述试剂盒中，所述肿瘤干细胞可为c1)或c2)或c3)或c4)：c1)人胰腺癌干细胞；c2)肺癌干细胞；c3)人小细胞肺癌干细胞；c4)人食管癌干细胞。
本发明还保护一种制备肿瘤干细胞的方法，依次可包括如下步骤：
(1)取肿瘤细胞，接种至上述任一所述诱导培养基，贴壁培养3d～5d；
(2)接种至上述任一所述肿瘤细胞球培养基，贴壁培养1d～3d；
(3)接种至上述任一所述肿瘤细胞球培养基，悬浮培养，得到肿瘤干细胞。
上述方法还可包括如下步骤：在进行所述步骤(2)后、所述步骤(3)前，进行步骤(A)；所述步骤(A)可为：将完成步骤(2)后的细胞消化为单细胞。所述消化具体可为加入Accutase进行消化。
所述步骤(1)中，所述肿瘤细胞可为肿瘤单细胞。所述肿瘤单细胞具体可为向肿瘤细胞中加入0.25％胰蛋白酶，充分消化获得。
上述方法中，所述贴壁培养或所述悬浮培养的温度可为36℃-38℃。
上述方法中，所述肿瘤细胞可为b1)至b8)中任意一种：b1)胰腺癌细胞；b2)人胰腺癌细胞系Panc1；b3)人胰腺癌细胞系BXPC3；b4)肺癌细胞；b5)小细胞肺癌细胞；b6)人小细胞肺癌细胞系H446；b7)食管癌细胞；b8)人食管癌细胞系Eca9706。
上述方法中，所述肿瘤干细胞可为c1)或c2)或c3)或c4)：c1)人胰腺癌干细胞；c2)肺癌干细胞；c3)人小细胞肺癌干细胞；c4)人食管癌干细胞。
MEK抑制剂和/或GSK3抑制剂和/或HDAC抑制剂在制备肿瘤干细胞的应用也属于本发明的保护范围。
上述应用中，所述MEK抑制剂可为PD0325901。所述GSK3抑制剂可为a1)或a2)或a3)或a4)：a1)CHIR99021；a2)B216763；a3)BIO；a4)TWS119。所述HDAC抑制剂可为VPA。
实验证明，采用本发明提供的方法制备的肿瘤干细胞高表达Oct4、Nanog和CD133，生长缓慢，且具有外排Hoechst、耐受化疗药物等生物学特性，完全获得了肿瘤干细胞的特征。本发明具有重大的应用价值。
附图说明
图1为制备肿瘤干细胞的流程示意图。
图2为肿瘤干细胞的形成情况和胰腺癌干细胞的分化能力检测。
图3为采用免疫荧光法检测Panc1细胞和胰腺癌干细胞中Oct4蛋白和Nanog蛋白的表达水平。
图4为RT-PCR检测Panc1细胞和胰腺癌干细胞中Oct4蛋白和Nanog蛋白的mRNA水平。
图5为流式细胞仪检测Panc1细胞和胰腺癌干细胞上CD133、CD24、CD44和ESA的表达情况。
图6为RT-PCR检测Panc1细胞和胰腺癌干细胞中Twist、ZEB1、ZEB2和Vim的mRNA水平。
图7为Panc1细胞和胰腺癌干细胞的细胞体外增殖曲线。
图8为Panc1细胞和胰腺癌干细胞的耐药性分析。
图9为Panc1细胞和胰腺癌干细胞的Hoechst 33342外排能力检测。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
人胰腺癌细胞系Panc1、人胰腺癌细胞系BXPC3和人小细胞肺癌细胞系H446均由首都医科大学附属北京朝阳医院医学研究中心肿瘤科实验室提供；人胰腺癌细胞系Panc1以下简称Panc1细胞；人胰腺癌细胞系BXPC3以下简称BXPC3细胞；小细胞肺癌细胞系H446以下简称H446细胞。人食管癌细胞系Eca9706为上海复祥科技有限公司的产品；人食管癌细胞系Eca9706以下简称Eca9706细胞。NOD/SCID小鼠(即非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷小鼠)为北京维通利华实验动物技术有限公司的产品。培养皿的直径为60mm。
下述实施例中的统计方法：数据采用均数加减标准差的形式表示，两组数据的比较采用t检验，应用SPSS21.0统计软件进行统计学处理，P＜0.05表示具有统计学意义。
下述实施例中的试剂来源见表1。
表1
诱导培养基：含10％(v/v)FBS、1％(m/v)青霉素、1％(m/v)链霉素、20μL/mL B27培养基添加剂、0.5μM PD0325901、3μM CHIR99021和1μM VPA的mTeSR培养基。
肿瘤细胞球培养基：含1％(m/v)青霉素、1％(m/v)链霉素和20μL/mL B27培养基添加剂的mTeSR培养基。
每1.0mg青霉素的效价为1670U。在50mL肉汤培养基中完全抑制金黄色葡萄球菌标准菌株发育的最小青霉素剂量为1U。
每1.0mg链霉素的效价为1000U。在1mL肉汤培养基中完全抑制大肠杆菌标准菌株发育的最小链霉素剂量为1U。
Random primer、2×TS Reaction Mix和
RT/RI Enzyme Mix均为逆转录试剂盒中的组件。
实施例1、诱导肿瘤细胞转化为肿瘤干细胞
诱导肿瘤细胞转化为肿瘤干细胞的流程示意图见图1(IM为诱导培养基，SM为肿瘤细胞球培养基)。
一、诱导Panc1细胞转化为胰腺癌干细胞
1、取装有含10％(v/v)FBS、1％(m/v)青霉素和1％(m/v)链霉素的DMEM培养基的培养皿，加入Panc1细胞，37℃、5％CO2培养至生长对数期。
2、完成步骤1后，取所述培养皿，先加入0.25％胰蛋白酶充分消化(消化成单细胞)，然后加入含10％(v/v)FBS的DMEM培养基终止消化。
3、完成步骤2后，取所述培养皿中的细胞液，1000rpm离心5min，收集沉淀。
4、完成步骤3后，取沉淀，加入1mL诱导培养基重悬，得到细胞悬液并细胞计数。
5、取六孔板，每孔加入步骤4得到的细胞悬液(约5×105个细胞)和2mL诱导培养基，37℃、5％CO2培养96h(培养第50h，需更换新的诱导培养基)。
6、完成步骤5后，取所述六孔板，弃培养基，加入肿瘤细胞球培养基，37℃、5％CO2培养48h。
7、完成步骤6后，取所述六孔板，先吸出培养基1(即液相)备用，然后每孔加入1mLAccutase静置2min，最后加入培养基1终止消化。
8、完成步骤7后，取所述六孔板中的细胞液，1000rpm离心5min，收集沉淀。
9、取低粘附培养皿，加入步骤8收集的沉淀和肿瘤细胞球培养基，37℃、5％CO2悬浮培养(培养期间，每2d更换一次肿瘤细胞球培养基)，形成肿瘤细胞球。该肿瘤细胞球即为Panc1细胞转化的胰腺癌干细胞。
悬浮培养1d，肿瘤细胞球开始形成，之后逐渐变大。培养期间，每天在显微镜下观察肿瘤细胞球的形成情况(见图2中a，比例尺为100μm)。
二、诱导BXPC3细胞转化为胰腺癌干细胞
将上述步骤一中1的Panc1细胞替换为BXPC3细胞，“含10％(v/v)FBS、1％(m/v)青霉素和1％(m/v)链霉素的DMEM培养基”替换为含10％(v/v)FBS、1％(m/v)青霉素和1％(m/v)链霉素的RPMI-1640培养基，其它步骤均不变，形成肿瘤细胞球。该肿瘤细胞球即为BXPC3细胞转化的胰腺癌干细胞(见图2中b，比例尺为100μm)。
三、诱导H446细胞转化为小细胞肺癌干细胞
将上述步骤一中1的Panc1细胞替换为H446细胞，其它步骤均不变，形成肿瘤细胞球。该肿瘤细胞球即为H446细胞转化的小细胞肺癌干细胞(见图2中c，比例尺为100μm)。
四、诱导Eca9706细胞转化为食管癌干细胞
将上述步骤一中1的Panc1细胞替换为Eca9706细胞，“含10％(v/v)FBS、1％(m/v)青霉素和1％(m/v)链霉素的DMEM培养基”替换为含10％(v/v)FBS、1％(m/v)青霉素和1％(m/v)链霉素的RPMI-1640培养基，其它步骤均不变，形成肿瘤细胞球。该肿瘤细胞球即为Eca9706细胞转化的食管癌干细胞(见图2中d，比例尺为100μm)。
实施例2、实施例1中Panc1细胞转化的胰腺癌干细胞的干性鉴定
一、胰腺癌干细胞的分化能力检测
1、同实施例1步骤一中1-8。
2、取低粘附培养皿，加入收集的沉淀和肿瘤细胞球培养基，37℃、5％CO2悬浮培养5d(培养期间，每2d更换一次肿瘤细胞球培养基)，形成胰腺癌干细胞。
3、完成步骤2后，将所述胰腺癌干细胞，吸入离心管，800rpm离心5min，收集沉淀。
4、完成步骤3后，取所述沉淀，加入1mL Accutase静置3-4min(消化至肉眼看不到细胞团块)，然后用手指轻弹离心管，向离心管加入PBS缓冲液终止消化。
5、完成步骤4后，1000rpm离心5min，收集沉淀。
6、完成步骤5后，取沉淀，加入1mL含10％(v/v)FBS、1％(m/v)青霉素和1％(m/v)链霉素的DMEM高糖培养基，轻轻吹打混匀，然后置于培养皿内，再加入含10％(v/v)FBS、1％(m/v)青霉素和1％(m/v)链霉素的DMEM高糖培养基补足至4mL。
7、完成步骤6后，取所述培养皿，37℃、5％CO2培养(培养期间，每2-3d更换一次含10％(v/v)FBS、1％(m/v)青霉素和1％(m/v)链霉素的DMEM高糖培养基)。
培养期间，每天在相差显微镜下动态观察形态学变化。
胰腺癌干细胞培养3d的形态见图2中e(比例尺为100μm)。结果表明，胰腺癌干细胞消化后，培养6-8h开始贴壁；培养24h，完全贴壁并开始伸出突起，细胞形态不规则，呈现多边形；培养3d，细胞形态与Panc1细胞贴壁生长的形态(见图2中f，比例尺为100μm)基本一致。由此可见，胰腺癌干细胞具有一定的分化能力。
二、采用免疫荧光法检测干性相关蛋白OCT4和Nanog的表达
待测细胞为处于生长对数期的Panc1细胞或胰腺癌干细胞。胰腺癌干细胞为在低粘附培养皿中加入实施例1步骤一中8收集的沉淀和肿瘤细胞球培养基，37℃、5％CO2悬浮培养3d得到。
Oct4蛋白和Nanog蛋白对于维持干细胞特性，自我更新及对放化疗的敏感性等方面起着重要作用。
A、采用免疫荧光法检测Oct4蛋白的表达
1、取待测细胞，加入Accutase消化成单细胞悬液，然后转移至离心管，1000rpm离心5min，收集沉淀。
2、完成步骤1后，取所述离心管，加入含10％(v/v)FBS的DMEM培养基重悬，得到细胞悬液。
3、取24孔板，每孔加入0.5mL细胞悬液，37℃、5％CO2培养24h。
4、完成步骤3后，取所述24孔板，弃培养基，用PBS缓冲液洗涤1次(约5min)，然后每孔加入300μL 4％(m/v)多聚甲醛水溶液，4℃固定20min。
5、完成步骤4后，取所述24孔板，弃液相，用PBS缓冲液洗涤3次(每次约5min)，然后每孔加入300μL 0.3％(m/v)Triton-100通透20min。
6、完成步骤5后，取所述24孔板，弃液相，用PBS缓冲液洗涤3次(每次约5min)，然后每孔加入300μL山羊血清工作液(用PBS缓冲液将山羊血清稀释20倍而成；山羊血清为Solarbio公司的产品)封闭30min。
7、完成步骤6后，取所述24孔板，弃液相，每孔加入200μL兔抗人OCT4抗体(工作浓度为1：200)，4℃孵育12h。
8、完成步骤7后，取所述24孔板，室温平衡30min，弃液相，用PBS缓冲液洗涤3次(每次约5min)，然后加入200μL FITC标记的山羊抗兔荧光二抗(FITC)，室温避光孵育1h。
9、完成步骤8后，取所述24孔板，弃液相，用PBS缓冲液洗涤3次(每次约5min)，然后用DAPI染核3min，用PBS缓冲液洗涤3次(每次约5min)，用抗荧光淬灭试剂封片，置于荧光显微镜下观察并拍摄图片。
B、采用免疫荧光法检测Nanog蛋白的表达
将步骤A中7的“兔抗人OCT4抗体(工作浓度为1：200)”替换为“小鼠抗人Nanog抗体(工作浓度为1：100)”，步骤A中8的“山羊抗兔荧光二抗(FITC)”替换为“山羊抗小鼠荧光二抗(TRITC)”，其它步骤均不变，得到Nanog蛋白的表达情况。
实验结果见图3(Adherent cells为Panc1细胞，Sphere cells为胰腺癌干细胞)。结果表明，与处于生长对数期的Panc1细胞相比，胰腺癌干细胞中Oct4蛋白和Nanog蛋白的免疫荧光染色强度明显增强。
三、检测Oct4蛋白和Nanog蛋白的mRNA水平
待测细胞为处于生长对数期的Panc1细胞或胰腺癌干细胞。胰腺癌干细胞为在低粘附培养皿中加入实施例1步骤一中8收集的沉淀和肿瘤细胞球培养基，37℃、5％CO2悬浮培养3d得到。
1、采用Trizol法提取待测细胞的总RNA。
2、配制体系。体系为20μL，由1μL Random primer(浓度为0.1μg/μL)、10μL 2×TSReaction Mix、1μL 
RT/RI Enzyme Mix、1μL待测细胞的总RNA(含1000ng待测细胞的总RNA)和7μL RNase-free Water组成。
3、取步骤2配制的体系，25℃孵育10min，42℃孵育30min，85℃灭活5s，4℃冷藏，得到第一链cDNA。
4、以步骤3得到的第一链cDNA为模板，通过RT-PCR检测Oct4蛋白或Nanog蛋白的mRNA水平(以GADPH基因为内参基因)。
检测Oct4蛋白的mRNA水平的上游引物为5’-GAACCGAGTGAGAGGCAACC-3’，下游引物为5’-ATCCCAAAAACCCTGGCACA-3’。检测Nanog蛋白的mRNA水平的上游引物为5’-TGCCTCACACGGAGACTG-3’，下游引物为5’-GCTATTCTTCGGCCAGTT-3’。检测GADPH基因的上游引物为5’-CAAGGTCATCCATGACAACTTTG-3’，下游引物为5’-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3’。
其中RT-PCR反应体系为20μL，由10μL 2×EasyTaq Mix、1μL上游引物(浓度为10μM)、1μL下游引物(浓度为10μM)、1μL步骤3得到的第一链cDNA(约100ng)和7μL灭菌蒸馏水组成。
反应条件：94℃3min；94℃30sec，X℃30sec，72℃1min，37个循环；72℃5min；4℃保存。检测OCT4蛋白的mRNA水平时，X为60。检测Nanog蛋白的mRNA水平时，X为55。检测GADPH蛋白的mRNA水平时，X为58。
RT-PCR检测结果见图4(a为处于生长对数期的Panc1细胞，b为胰腺癌干细胞)。结果表明，与Panc1细胞相比，胰腺癌干细胞中Oct4蛋白和Nanog蛋白的mRNA水平均上调。
四、体内成瘤实验
A、胰腺癌干细胞体内成瘤实验
1、在低粘附培养皿中加入实施例1步骤一中8收集的沉淀和肿瘤细胞球培养基，37℃、5％CO2悬浮培养3d，得到胰腺癌干细胞。
2、完成步骤1后，取胰腺癌干细胞，800rpm离心5min，收集沉淀。
3、完成步骤2后，取沉淀，加入1mL Accutase，待胰腺癌干细胞为细小颗粒状时(约消化3min)转移至离心管，加入含10％(v/v)FBS的DMEM培养基重悬，1000rpm离心5min，收集沉淀。
4、完成步骤3后，取所述沉淀，加入1mL DMEM培养基，细胞计数。
5、完成步骤4后，分别取102个、103个、104个、105个和106个细胞加入提前标注好的EP管内，补充DMEM培养基至100μL；然后分别向EP管内加入100μL基质胶Matrigel，混匀，得到不同浓度的细胞悬液。取1mL注射器，分别吸取不同浓度的细胞悬液接种至NOD/SCID小鼠背部皮下右侧，每组5只小鼠。每天观察小鼠瘤体形成情况，并测量肿瘤的大小。8周后脱臼法处死小鼠，记录瘤体形成情况。
B、Panc1细胞体内成瘤实验
1、取处于生长对数期的Panc1细胞，弃培养基，PBS缓冲液洗涤2次，加入1mL0.25％胰蛋白酶消化1min，然后加入含10％(v/v)FBS的DMEM培养基终止消化，1000rpm离心5min，收集沉淀。
2、完成步骤1后，取所述沉淀，加入1mL DMEM培养基，细胞计数。
3、完成步骤2后，分别取102个、103个、104个、105个和106个细胞加入提前标注好的EP管内，补充DMEM培养基至100μL；然后分别向EP管内加入100μL基质胶Matrigel，混匀，得到不同浓度的细胞悬液。取1mL注射器，分别吸取不同浓度的细胞悬液接种至NOD/SCID小鼠背部皮下左侧，每组5只小鼠。每天观察小鼠瘤体形成情况，并测量肿瘤的大小。8周后脱臼法处死小鼠，记录瘤体形成情况。
统计结果见表2。结果表明，胰腺癌干细胞的体内成瘤能力强于Panc1细胞。高致瘤性是干细胞重要的特征之一，肿瘤干细胞具有起始肿瘤形成的特征。本实施例中胰腺癌干细胞具有体内高致瘤性，说明该胰腺癌干细胞具有肿瘤干细胞高成瘤性的重要特征。
表2
| 细胞注射数目 | Panc1细胞体内成瘤实验 | 胰腺癌干细胞体内成瘤实验 |
| 10<sup>6</sup>个 | 5/5 | 5/5 |
| 10<sup>5</sup>个 | 4/5 | 4/5 |
| 10<sup>4</sup>个 | 3/5 | 4/5 |
| 10<sup>3</sup>个 | 1/5 | 3/5 |
| 10<sup>2</sup>个 | 0/5 | 3/5 |
按照上述步骤一至四，将Panc1细胞替换为BXPC3细胞，将Panc1细胞转化的胰腺癌干细胞替换为BXPC3细胞转化的胰腺癌干细胞，其它步骤均不变。结果表明，BXPC3细胞转化的胰腺癌干细胞也具有一定的分化能力；与处于生长对数期的BXPC3细胞相比，BXPC3细胞转化的胰腺癌干细胞中Oct4蛋白和Nanog蛋白的免疫荧光染色强度也明显增强，Oct4蛋白和Nanog蛋白的mRNA水平也均上调；BXPC3细胞转化的胰腺癌干细胞的体内成瘤能力强于BXPC3细胞。
按照上述步骤一至四，将Panc1细胞替换为H446细胞，将Panc1细胞转化的胰腺癌干细胞替换为H446细胞转化的小细胞肺癌干细胞，其它步骤均不变。结果表明，H446细胞转化的小细胞肺癌干细胞也具有一定的分化能力；与处于生长对数期的H446细胞相比，H446细胞转化的小细胞肺癌干细胞中Oct4蛋白和Nanog蛋白的免疫荧光染色强度也明显增强，Oct4蛋白和Nanog蛋白的mRNA水平也均上调；H446细胞转化的小细胞肺癌干细胞的体内成瘤能力强于H446细胞。
按照上述步骤一至四，将Panc1细胞替换为Eca9706细胞，将Panc1细胞转化的胰腺癌干细胞替换为Eca9706细胞转化的食管癌干细胞，其它步骤均不变。结果表明，Eca9706细胞转化的食管癌干细胞也具有一定的分化能力；与处于生长对数期的Eca9706细胞相比，Eca9706细胞转化的食管癌干细胞中Oct4蛋白和Nanog蛋白的免疫荧光染色强度也明显增强，Oct4蛋白和Nanog蛋白的mRNA水平也均上调；Eca9706细胞转化的食管癌干细胞的体内成瘤能力强于Eca9706细胞。
实施例3、实施例1中Panc1细胞转化的胰腺癌干细胞的生物学特性
一、胰腺癌干细胞表面标志物的表达水平上调
CD24、CD44、ESA和CD133是分离胰腺癌干细胞常用的表面标志物。
待测细胞为处于生长对数期的Panc1细胞或胰腺癌干细胞。胰腺癌干细胞为在低粘附培养皿中加入实施例1步骤一中8收集的沉淀和肿瘤细胞球培养基，37℃、5％CO2悬浮培养4d得到。
1、取离心管，加入待测细胞，Accutase消化后，加入PBS缓冲液终止消化。
2、完成步骤1后，取所述离心管，1000rpm离心5min，弃上清，用PBS缓冲液洗涤2次，然后加入DMEM培养基，得到细胞密度为2×106/μL的单细胞悬液。
3、完成步骤2后，取所述单细胞悬液，置于细胞流式管，然后加入如下抗体(需1:20稀释)：FITC anti-human CD44、PE anti-human CD326(EpCAM，ESA)、APC anti-human CD24和BV421 Mouse Anti-Human CD133，37℃避光孵育1h。
4、完成步骤3后，取所述细胞流式管，1500rpm离心5min，弃上清，用PBS缓冲液洗涤2次，然后向每个细胞流式管中加入1mL流式固定液，置于流式细胞仪进行分析。
实验结果见图5(Adherent cells为Panc1细胞，Sphere cells为胰腺癌干细胞)。结果表明，与Panc1细胞相比，胰腺癌干细胞上CD133的表达明显增加，CD24、CD44和ESA的表达也有不同程度增加。
二、检测上皮间质转化(EMT)相关基因Twist、ZEB1、ZEB2和Vim的表达
待测细胞为处于生长对数期的Panc1细胞或胰腺癌干细胞。胰腺癌干细胞为在低粘附培养皿中加入实施例1步骤一中8收集的沉淀和肿瘤细胞球培养基，37℃、5％CO2悬浮培养3d得到。
1、采用Trizol法提取待测细胞的总RNA。
2、配制体系。体系为20μL，由1μL Random primer(浓度为0.1μg/μL)、10μL 2×TSReaction Mix、1μL 
RT/RI Enzyme Mix、1μL待测细胞的总RNA(含1000ng待测细胞的总RNA)和7μL RNase-free Water组成。
3、取步骤2配制的体系，25℃孵育10min，42℃孵育30min，85℃灭活5s，4℃冷藏，得到第一链cDNA。
4、以步骤3得到的第一链cDNA为模板，通过RT-PCR检测Twist基因、ZEB1基因、ZEB2基因和Vim基因的表达情况(以GADPH基因为内参基因)。
检测Vim基因的上游引物为5’-AGAACTTTGCCGTTGAAGCTG-3’，下游引物为5’-CCAGAGGGAGTGAATCCAGATTA-3’。检测ZEB1基因的上游引物为5’-GCGGCGCAATAACGTTACAAATTA-3’，下游引物为5’-CCTTCCTTTCCTGTGTCATCCT-3’。检测ZEB2基因的上游引物为5’-GCGATGGTCATGCAGTCAG-3’，下游引物为5’-CAGGTGGCAGGTCATTTTCTT-3’。检测Twist基因的上游引物为5’-CTGAGCAACAGCGAGGAAGA-3’，下游引物为5’-TTGCCATCTTGGAGTCCAGC-3’。检测GADPH基因的上游引物为5’-CAAGGTCATCCATGACAACTTTG-3’，下游引物为5’-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3’。
其中RT-PCR反应体系为20μL，由10μL 2×EasyTaq Mix、1μL上游引物(浓度为10μM)、1μL下游引物(浓度为10μM)、1μL步骤3得到的第一链cDNA(约100ng)和7μL灭菌蒸馏水组成。
反应条件：94℃3min；94℃30sec，X℃30sec，72℃1min，37个循环；72℃5min；4℃保存。检测Twist基因时，X为62。检测ZEB1基因和Vim基因时，X为59。检测ZEB2基因时，X为58。检测GADPH基因时，X为58℃。
RT-PCR检测结果见图6(a为处于生长对数期的Panc1细胞，b为胰腺癌干细胞)。上皮间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT)是指在特定的生理和病理条件下上皮细胞向间充质细胞转化的现象。EMT与肿瘤干细胞密切相关。结果表明，Panc1细胞和胰腺癌干细胞中Twist基因、ZEB1基因、ZEB2基因和Vim基因的表达量无显著差异，说明在诱导过程中Panc1细胞并未经过EMT过程。
三、细胞体外增殖能力的检测
A、胰腺癌干细胞体外增殖能力的检测
1、在低粘附培养皿中加入实施例1步骤一中8收集的沉淀和肿瘤细胞球培养基，37℃、5％CO2悬浮培养4d，得到胰腺癌干细胞。
2、完成步骤1后，取胰腺癌干细胞，800rpm离心5min，收集沉淀。
3、完成步骤2后，取沉淀，加入1mL Accutase，待胰腺癌干细胞为细小颗粒状时(约消化3min)转移至离心管，加入DMEM培养基终止消化，1000rpm离心5min，收集沉淀。
4、完成步骤3后，取所述沉淀，加入含10％(v/v)FBS的DMEM培养基重悬细胞，得到细胞重悬液。
5、取96孔板，每孔接种200μL细胞重悬液(约5000个)，然后分为五组(每组设置4个复孔)，置于37℃、5％CO2培养箱中分别培养24h、48h、72h、96h和120h。
6、完成步骤5后，取所述96孔板，弃液相，每孔加入100μL DMEM培养基和10μL CCK8检测液，37℃孵育1h，终止培养，检测各孔的OD450nm值。
空白本底孔：另取一新的96孔板，每孔加入100μL DMEM培养基和10μL CCK8检测液，37℃孵育1h，终止培养，检测OD450nm值。
将各孔的OD450nm值减去空白本底孔的OD450nm值，各重复孔的OD450nm值取均数±SD，得到各组的OD450nm值。以培养时间为横坐标，各组对应的OD450nm值为纵坐标，绘制生长曲线。
B、Panc1细胞体外增殖能力的检测
将步骤A中1至3替换为步骤K，其它步骤均不变，绘制生长曲线。步骤K：取处于生长对数期的Panc1细胞，弃培养基，PBS缓冲液洗涤2次，加入1mL 0.25％胰蛋白酶消化1min，然后加入DMEM培养基终止消化，1000rpm离心5min，收集沉淀。
生长曲线见图7(Panc1 adherent cells为Panc1细胞，Panc1 sphere cells为胰腺癌干细胞)。结果表明，与Panc1细胞相比，胰腺癌干细胞体外增殖缓慢：Panc1细胞在48h后便进入生长对数期，胰腺癌干细胞在96h后才进入生长对数期。
四、耐药能力的检测
对化疗药的杀伤作用具有耐受性是癌症的恶性特征之一，越来越多的研究也表明，肿瘤干细胞对化疗药具有较强耐受性，gemcitabine和5-FU是临床治疗胰腺癌的常用药物。
A、胰腺癌干细胞对化疗药的耐受能力检测
实验重复三次，每次设置4个复孔。
1、在低粘附培养皿中加入实施例1步骤一中8收集的沉淀和肿瘤细胞球培养基，37℃、5％CO2悬浮培养4d，得到胰腺癌干细胞。
2、完成步骤1后，取胰腺癌干细胞，800rpm离心5min，收集沉淀。
3、完成步骤2后，取沉淀，加入1mL Accutase，待胰腺癌干细胞为细小颗粒状时(约消化3min)转移至离心管，加入DMEM培养基终止消化，1500rpm离心5min，收集沉淀。
4、完成步骤3后，取所述沉淀，加入含10％(v/v)FBS的DMEM培养基重悬细胞，得到细胞重悬液。
5、取96孔板，每孔接种200μL细胞重悬液(约5000个)，置于37℃、5％CO2培养箱中培养24h。
6、完成步骤5后，取所述96孔板，每孔加入5-FU或gemcitabine并使其浓度为20μg/mL或100μg/mL，然后37℃、5％CO2培养72h。
7、完成步骤6后，取所述96孔板，每孔加入100μL DMEM培养基和10μL CCK8检测液，设空白药物孔(200μL DMEM培养基+(5-FU或gemcitabine)+10μL CCK8检测液)，37℃孵育1h，终止培养。
8、完成步骤7后，取所述96孔板，在酶标仪上检测各孔在450nm处的OD值。
将各测试孔的OD450nm值减去空白药物孔OD450nm值，各重复孔的OD450nm值取均数±SD，计算细胞存活率(％)＝(加药细胞OD450nm值/对照细胞OD450nm值)×100％。
B、Panc1细胞对化疗药的耐受能力检测
将步骤A中1至3替换为步骤K，其它步骤均不变，绘制生长曲线。步骤K：取处于生长对数期的Panc1细胞，弃培养基，PBS缓冲液洗涤2次，加入0.25％胰蛋白酶消化，然后加入DMEM培养基终止消化，1000rpm离心5min，收集沉淀。
实验结果见图8(Panc1 adherent cells为Panc1细胞，Panc1 sphere cells为胰腺癌干细胞)。结果表明，无论是gemcitabine还是5-FU，胰腺癌干细胞的细胞存活率都比Panc1细胞高。由此可见，胰腺癌干细胞对化疗药具有更强的耐药性。
五、Hoechst 33342外排能力检测
Hoechst 33342是一种核酸荧光染料，在肿瘤干细胞中有一部分细胞可以外排这种染料，从而使细胞核不着色或着色程度很低，研究者将这类细胞称为侧群细胞，即SP细胞。Zhou等用流式细胞仪从Panc1细胞中分离出对Hoechst 33342拒染的SP细胞，约占细胞总数的2.1-8.7％。SP细胞具有外排Hoechst的能力，故Hoechst染色为弱阳性，在荧光显微镜下观察为浅蓝色，non-SP细胞染色为阳性，荧光显微镜下观察为蓝色。PI染色阳性细胞为凋亡细胞。
A、胰腺癌干细胞对Hoechst 33342外排能力的检测
1、取处于生长对数期的Panc1细胞，弃培养基，PBS缓冲液洗涤2次，加入0.25％胰蛋白酶消化，然后加入DMEM培养基终止消化，用吸管反复吹打数次后移入无菌离心管内，1500rpm离心5min，收集沉淀。
2、完成步骤1后，取所述沉淀，加入lmL 37℃预热的DMEM培养基，细胞计数；另取一个15mL离心管，加入106个/mL Panc1细胞和Hoechst 33342，得到处理体系；该处理体系中，Hoechst 33342的浓度为5μg/mL。
3、完成步骤2后，取所述处理体系，37℃、5％CO2孵育60min(孵育过程中每15min轻轻混匀离心管一次)。
4、完成步骤3后，1000rpm离心5min，用PBS缓冲液洗涤1次；1000rpm离心5min，收集沉淀并加入PI染色20min(PI的浓度为2μg/mL)。
5、完成步骤4后，采用荧光显微镜观察。
B、Panc1细胞对Hoechst 33342外排能力的检测
将步骤A中1替换为步骤M，其它步骤均不变，绘制生长曲线。步骤M：在低粘附培养皿中加入实施例1步骤一中8收集的沉淀和肿瘤细胞球培养基，37℃、5％CO2悬浮培养4d，800rpm离心5min，收集沉淀并加入Accutase消化，然后加入DMEM培养基终止消化，用吸管反复吹打数次后移入无菌离心管内，1500rpm离心5min。
实验结果见图9(Panc1 adherent cells为Panc1细胞，Panc1 sphere cells为胰腺癌干细胞)。结果表明，凋亡细胞的数量不超过细胞总数的5％；胰腺癌干细胞中细胞核染色比Panc1细胞中细胞核着色浅，说明胰腺癌干细胞比Panc1细胞具有更强的外排Hoechst33342的能力。
按照上述步骤二至五，将Panc1细胞替换为BXPC3细胞，将Panc1细胞转化的胰腺癌干细胞替换为BXPC3细胞转化的胰腺癌干细胞，其它步骤均不变。结果表明，BXPC3细胞和BXPC3细胞转化的胰腺癌干细胞中Twist基因、ZEB1基因、ZEB2基因和Vim基因的表达量无显著差异，说明在诱导过程中BXPC3细胞并未经过EMT过程；与BXPC3细胞相比，BXPC3细胞转化的胰腺癌干细胞的体外增殖缓慢，对化疗药(如gemcitabine、5-FU)具有更强的耐药性，外排Hoechst 33342的能力更强。
按照上述步骤二至五，将Panc1细胞替换为H446细胞，将Panc1细胞转化的胰腺癌干细胞替换为H446细胞转化的小细胞肺癌干细胞，其它步骤均不变。结果表明，H446细胞和H446细胞转化的小细胞肺癌干细胞中Twist基因、ZEB1基因、ZEB2基因和Vim基因的表达量无显著差异，说明在诱导过程中H446细胞并未经过EMT过程；与H446细胞相比，H446细胞转化的小细胞肺癌干细胞的体外增殖缓慢，对化疗药(如gemcitabine、5-FU)具有更强的耐药性，外排Hoechst 33342的能力更强。
按照上述步骤二至五，将Panc1细胞替换为Eca9706细胞，将Panc1细胞转化的胰腺癌干细胞替换为Eca9706细胞转化的食管癌干细胞，其它步骤均不变。结果表明，Eca9706细胞和Eca9706细胞转化的食管癌干细胞中Twist基因、ZEB1基因、ZEB2基因和Vim基因的表达量无显著差异，说明在诱导过程中Eca9706细胞并未经过EMT过程；与Eca9706细胞相比，Eca9706细胞转化的食管癌干细胞的体外增殖缓慢，对化疗药(如gemcitabine、5-FU)具有更强的耐药性，外排Hoechst 33342的能力更强。
综上所述，实施例1中制备的肿瘤干细胞高表达Oct4和Nanog以及CD133，生长缓慢，且具有外排Hoechst、耐受化疗药物等生物学特性，说明其已经获得了肿瘤干细胞的特征。
Claims (4)
1.一种制备肿瘤干细胞的方法，依次包括如下步骤：
（1）取肿瘤细胞，接种至诱导培养基，贴壁培养3d～5d；
所述诱导培养基的溶质及其浓度为8mL/100mL～12mL/100mL FBS、1340U/100mL～2000U/100mL青霉素、800U/100mL～1200U/100mL链霉素、15μL/mL～25μL/mL B27培养基添加剂、0.3～0.7μM PD0325901、1～5μM CHIR99021和0.8～1.2μM VPA，所述溶剂为mTeSR培养基；
所述肿瘤细胞为胰腺癌细胞、小细胞肺癌细胞或食管癌细胞；
（2）接种至肿瘤细胞球培养基，贴壁培养1d～3d；
所述肿瘤细胞球培养基的溶质及其浓度为1340U/100mL～2000U/100mL青霉素、800U/100mL～1200U/100mL链霉素和15μL/mL～25μL/mL B27培养基添加剂，所述溶剂为mTeSR培养基；
（3）接种至所述肿瘤细胞球培养基，悬浮培养，得到肿瘤干细胞。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法还包括如下步骤：在进行所述步骤（2）后、所述步骤（3）前，进行步骤（A）；
所述步骤（A）为：将完成步骤（2）后的细胞消化为单细胞。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述肿瘤细胞为肿瘤单细胞。
4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述肿瘤干细胞为人胰腺癌干细胞、人小细胞肺癌干细胞或人食管癌干细胞。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|---|
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Non-Patent Citations (3)
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| 转化生长因子β1诱导胰腺癌细胞获得肿瘤干细胞功能的研究;王晔等;《中华危重症医学杂志(电子版)》;20161201(第06期);全文 * |
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