CN103755801B - 蚯蚓纤溶活性蛋白联合紫杉醇在制备抑制癌细胞的药物中的应用 - Google Patents

蚯蚓纤溶活性蛋白联合紫杉醇在制备抑制癌细胞的药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种蚯蚓纤溶活性蛋白，是通过以下方法制备得到的：取新鲜蚯蚓，加水匀浆，静置，离心得蛋白上清液，盐析，离心，沉淀溶于水中，得蚯蚓纤溶活性蛋白粗提物，该粗提物经透析脱盐、阴离子交换层析、凝胶过滤层析、凝胶柱脱盐除杂操作，冷冻干燥成为固体粉末，并在分离过程中采用细胞实验筛选活性蛋白，最终得到纯化的蚯蚓纤溶活性蛋白。通过实验研发现，蚯蚓纤溶活性蛋白与紫杉醇联合使用，可以在体外抑制肿瘤细胞生长，因此，蚯蚓纤溶活性蛋白联合紫杉醇可以用于制备抑制癌细胞的药物。本发明还提供了一种抑制肿瘤细胞的联合用药物，包括蚯蚓纤溶活性蛋白以及紫杉醇，且任选的可以包括一种或多种可药用载体。

Description

蚯蚓纤溶活性蛋白联合紫杉醇在制备抑制癌细胞的药物中的应用
技术领域
本发明涉及蚯蚓纤溶活性蛋白联合紫杉醇在制备抑制癌细胞增药物中的应用，属于抗癌药物领域。
背景技术
癌症已成为当前三大杀手之一。癌症，又称恶性肿瘤，因其具有局部浸润和远处转移的特点，成为目前难以治愈的顽疾之一。
目前治疗癌症的主要方法有手术、化学疗法以及放射疗法。其中化学疗法是指采用能够杀死或抑制癌细胞生长、迁移、侵袭的药物来治疗癌症。理想的治疗癌症的药物是可以特异性的杀死癌细胞而不影响正常细胞的各项生理功能的，然而，不幸的是，到目前为止，尚未发现这种理想药物。化疗药物主要是通过影响细胞的增殖分裂来杀死癌细胞，但同时它们对于一些可以快速增殖的正常细胞（比如骨髓细胞）也同样具有杀伤作用。而且，治疗癌症的化学药物如紫杉醇、长春新碱等在治疗癌症过程中会引发癌细胞的多药耐药性。因此，寻求一种新型无毒或毒性小的抗肿瘤药物或者寻求一种新的用药方式以便减少化疗药的剂量及毒性并降低细胞产生多药耐药性的可能性成为目前研究的重要方向。
蚯蚓，又名地龙。八十年代初日本学者从蚯蚓体内提取出一种能溶解血栓的酶类物质，此后，研究人员从不同种属蚯蚓体内分离提取了组成成份不完全相同的蚯蚓纤溶酶(earthwormfibrinolyticenzyme，EFE)。蚯蚓纤溶酶是一组丝氨酸蛋白水解酶，既具有直接溶解纤维蛋白的纤溶酶活性，又具有纤溶酶原激活活性；相对分子质量为20～40KD，实验表明该酶具有抗凝、溶纤作用，可降低血小板粘附活性、溶解血栓。
80年代后期，蚯蚓提取物的抗肿瘤作用开始得到我国少数科技工作者的关注。初步研究显示，蚯蚓提取物对胃癌、肺癌、食管癌等多种肿瘤有一定程度的抑制作用。研究者进一步研究发现蚯蚓纤溶酶粗提物有抑制肿瘤细胞生长的作用。对其作用机制研究发现，它可以降低癌细胞的粘附性，抑制癌细胞与血管内皮细胞的粘附从而有效抑制癌细胞的迁移。此外，有研究工作者发现蚯蚓纤溶酶仅对癌细胞有抑制作用而对正常细胞没有或仅有较弱的抑制作用。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供了一种新的抑制癌细胞的联合用药物。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明的发明人通过实验研发现，蚯蚓纤溶活性蛋白与紫杉醇联合使用，可以在体外抑制肿瘤细胞生长，其特点是采用从蚯蚓体内提取分离纯化出的纯品纤溶活性蛋白与紫杉醇联合作用，在体外应用于人乳腺癌细胞（MCF-7），作用结果显示：二者联合作用时的抗肿瘤活性比两种药物单独使用时的抗肿瘤活性之和相同或更强，且二者相互作用系数（CDI）<1，表示二者联合使用可发挥协同作用。因此，蚯蚓纤溶活性蛋白联合紫杉醇可以用于制备抑制癌细胞的药物。
所述蚯蚓纤溶活性蛋白，是从蚯蚓体内分离出的同时具有纤溶活性以及抗肿瘤活性的一种蛋白类物质，其制备方法如下：取新鲜蚯蚓，清洗干净，加入蚯蚓质量1～4倍的水（优选二蒸水），匀浆，静置12小时，以便蚯蚓蛋白较为充分溶解；4000rpm离心20分钟去除蚯蚓废渣，得蛋白上清液；蛋白上清液用0℃硫酸铵盐析（达到40%～60%饱和度），离心，弃上清，得到的沉淀溶于水（优选二蒸水）中，得到蚯蚓纤溶活性蛋白粗提物，该粗提物经透析脱盐、阴离子交换层析、凝胶过滤层析、凝胶柱脱盐除杂操作，冷冻干燥成为固体粉末，并在分离过程中采用细胞实验筛选活性蛋白，最终得到纯化的蚯蚓纤溶活性蛋白（命名为D-5-S-2）。经电泳分析，该蚯蚓纤溶活性蛋白分子量在25kD左右。纤维蛋白平板实验显示，该蛋白具有很好的纤溶活性。
所述透析脱盐截留分子量大于3500道尔顿，具体为：把透析袋（截留分子量>3500）一端用夹子夹紧，将粗提物溶液过0.45μm滤器后置于夹好的透析袋中，蛋白液量不超过透析袋容积的2/3,将袋开口处用夹子密封，用二蒸水作透析介质，每隔2～4小时更换一次二蒸水，至使用氯化钡溶液检测透析介质时无法形成硫酸钡沉淀即可。
所述阴离子交换层析具体为：将透析完全的蛋白粗提物溶液利用考马斯亮蓝法测蛋白浓度，过DEAE阴离子交换柱，上样体积与柱体积相当，流动相A液为50MmpH8.0Tris-HCl溶液，B液为1MNaCl50MmpH8.0Tris-HCl溶液,流速为2ml/min，梯度洗脱，收集5%～20%B液阶段洗脱出的各个蛋白峰，以聚乙二醇20000溶液为透析介质进行浓缩脱盐。考马斯亮蓝法测定蛋白浓度，计算各蛋白峰得率（即最终得到的蛋白峰的质量与最初上样总蛋白质量的比值）。细胞实验筛选活性，选择活性和得率最高的蛋白（选择原则为：得率相差不大时，选择活性高的进一步分析，活性相差不大时，选择得率高的进行实验）进行下一步分析。结果见附图1。
所述细胞实验筛选活性具体为：MCF-7细胞在细胞瓶内铺满（即达到瓶底面积的90%）时，倾去培养基，加入1mL0.25%胰酶消化，待细胞从瓶壁上脱落后，加入1mL培养基终止消化，1000rpm，离心5min，然后加入2mL培养基重悬，取10μL细胞悬液，稀释至100μL，然后进行细胞计数，调整细胞密度为8*104/mL,以每孔100μL的比例将细胞悬液铺至96孔板内，置于37℃，5%CO2的培养箱内培养，12h后，将各个蛋白峰用培养基配制成适当浓度（50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL），吸净96孔板内培养基，将蛋白药液以每孔100微升的比例加入到各个孔中，每个浓度设立5个复孔，并设立空白对照组（即设5个孔，其内各加入100μL不含蛋白峰的培养基），重新置于37℃，5%CO2的培养箱内培养，48小时后，对加药组、对照组各孔内加入10微升CCK-8试剂，1h后，以450nm为测定波长，670nm为参比波长，利用酶标仪测定吸光度值，根据公式：抑制率%=（A对照组-A加药组）*100/A对照组，计算抑制率百分比，抑制率%越高说明蛋白峰活性越好。结果见附图2，各个蛋白峰抑制率比较图，抑制活性最高的为DEAE-5号峰（简称D-5）。培养基为1640培养基，为现有技术中已有的常规培养基。
所述凝胶过滤层析具体为：浓缩脱盐的D-5蛋白峰进行S200凝胶过滤层析，上样体积2ml，流动相为0.15M氯化钠溶液，流速为1ml/min，收集蛋白峰，冻干浓缩，细胞实验筛选活性（方法同阴离子交换柱细胞实验活性筛选部分），选择活性和得率最高的蛋白（原则同上）进行下一步分析。结果见附图3、4。
所述凝胶柱脱盐除杂具体为：采用G10凝胶柱对上述筛选得到的具有活性的蛋白进行脱盐操作，上样量2ml，流动相为水（优选二蒸水），流速为1ml/min，收集蛋白峰，冻干得固体粉末，即为蚯蚓纤溶活性蛋白（简称D-5-S-2）。
所述电泳分析采用SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳，具体为：将蚯蚓活性纤溶蛋白溶于二蒸水内，浓度为1mg/mL,按照5:1的比例加入6×上样缓冲液使之最终变为1×。95℃，变性15min。配制浓缩胶以及12%的分离胶，在上样孔内分别加入10微升（1mg/mL、0.5mg/mL）的蛋白样品、4微升的Marker。以甘氨酸-TRIS溶液为电泳缓冲液，以电压为110V为条件，时间为1.5h。结束后将胶取出，采用考马斯亮蓝R-250染色液常温染色1h,然后采用脱色液（乙醇：乙酸：水=1:1:8）进行脱色，蛋白条带清晰可见。拍照成像。结果见附图5。
所述纤维蛋白平板实验测定纤溶活性，具体方法见2010版药典第三部附录Ⅻ重组链激酶生物活性测定法。结果见附图6。
上述所用实验术语均为所属领域的常规术语，比如蛋白峰，其实际上表示的是蛋白峰所对应的洗脱液。
本发明还提供了一种抑制肿瘤细胞的联合用药物，包括蚯蚓纤溶活性蛋白以及紫杉醇，且任选的可以包括一种或多种可药用载体。
所述蚯蚓纤溶活性蛋白以及紫杉醇的重量配比为80:1为佳。
所述可药用载体为本领域技术人员所公知和常用的，如丸剂、片剂、胶囊剂等中的填充剂或载体物质，这些物质通常被保健专家认可用于这一目的且作为药剂的非活性成分。
所述联合用药物可以制成任意剂型。
应当理解，本发明所述的联合使用包括以下两种方式：
一是将蚯蚓纤溶活性蛋白及紫杉醇分别制成单独的制剂，两种制剂的剂型可以不同，并且紫杉醇可以采用其现有剂型。在使用时可以将这两种药物先后使用，也可以同时使用。将两种药物先后使用时，蚯蚓纤溶活性蛋白的单独制剂可以首先使用。依次给药时，给予第二种组分时第一种组分应该还未丧失其在体内的有效作用。
二是将蚯蚓纤溶蛋白及紫杉醇制成单一的复方制剂，使用时同时使用。
配制药物组合物及使用时，需要产生作用的蚯蚓纤溶蛋白及紫杉醇的剂量可以改变，且最终由医务人员决定，所考虑的因素包括患者年龄及疾病性质和严重程度。
就目前而言，紫杉醇的用药方式多以静脉注射为主（如力朴素、紫杉醇注射液等），而类似于本发明中纤溶活性蛋白的蚯蚓纤溶酶给药方式多为口服且多用于抗栓治疗。本发明提到的纤溶活性蛋白目前在临床上尚无用于治疗肿瘤的例子。因而，在二者被制成单一的复方制剂时仍需要进行更多的分析研究。
本发明主要公开了一种新型联合用药方法，即蚯蚓纤溶活性蛋白与紫杉醇联合使用在体外抑制肿瘤细胞生长。其特点是采用从蚯蚓体内提取分离纯化出的纯品纤溶活性蛋白与紫杉醇联合作用，在体外应用于人乳腺癌细胞（MCF-7）。作用结果显示：二者联合作用时的抗肿瘤活性比两种药物单独使用时的抗肿瘤活性之和相同或更强，且二者相互作用系数（CDI）<1，表示二者联合使用可发挥协同作用。这一联合用药的方法可以减少紫杉醇对正常细胞的损伤，取得了所属领域技术人员预料不到的技术效果。
附图说明
图1：过阴离子交换柱（DEAE）后分离出的各个蛋白峰结果图
图2：过DEAE后各个蛋白峰抑制MCF-7细胞生长的活性比较
图3：DEAE-5号峰过S200凝胶柱后的结果图
图4：DEAE-5号峰过S200凝胶柱后各个蛋白峰抑制MCF-7细胞生长的活性比较图
图5：纯化的蚯蚓纤溶活性蛋白（D-5-S-2）电泳结果图
图6：纯化的蚯蚓纤溶活性蛋白纤维蛋白平板实验结果图
图7：蚯蚓纤溶活性蛋白粗提物与紫杉醇单独及联合使用48h后对人乳腺癌细胞（MCF-7）的抑制作用。
图8：蚯蚓纤溶活性蛋白与紫杉醇单独以及联合使用24h后对人乳腺癌细胞（MCF-7）抑制作用。
图9：蚯蚓纤溶活性蛋白与紫杉醇单独以及联合使用48h后对人乳腺癌细胞（MCF-7）抑制作用。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
实施例蚯蚓纤溶活性蛋白与紫杉醇联合作用于人乳腺癌细胞（MCF-7）
1、蚯蚓纤溶活性蛋白粗提物联合紫杉醇对MCF-7的作用
（1）MCF-7细胞传代，0.25%胰酶消化后，加入培养基（1640培养基）终止消化，1000rpm，离心5分钟，弃上清，将细胞用2mL培养基吹散，稀释到一定浓度，按每孔6000个细胞铺至96孔板内，待细胞贴壁完全后，准备加药。
（2）取新鲜蚯蚓50g，清洗干净，加入蚯蚓质量2倍的二蒸水，匀浆，静置12小时，以便蚯蚓蛋白较为充分溶解；4000rpm离心20分钟去除蚯蚓废渣，得蛋白上清液；蛋白上清液用0℃硫酸铵盐析（达到40%～60%饱和度），离心，弃上清，得到的沉淀溶于二蒸水中，透析脱盐后，冻干，得到蚯蚓纤溶活性蛋白粗提物。
（3）将蚯蚓纤溶活性蛋白粗提物溶于适量超纯水，考马斯亮蓝法测蛋白浓度，过0.22滤器除菌，备用。
（4）将蚯蚓纤溶活性蛋白以及紫杉醇按一定浓度梯度稀释好（如表1所示），每孔100μL。每个浓度设四个复孔。
表1：蚯蚓纤溶活性蛋白粗提物以及紫杉醇加药浓度
（5）48小时后采用CCK-8法测定细胞存活率。结果见图7。
结果显示，蚯蚓纤溶活性蛋白粗提物有抑制MCF-7细胞生长的作用，而且与紫杉醇联合使用时发挥协同作用，二者相互作用系数<1。
2纯化的蚯蚓纤溶活性蛋白联合紫杉醇对MCF-7的作用
所述纯化的蚯蚓纤溶活性蛋白是对上述蚯蚓纤溶活性蛋白粗提物进一步纯化得到的：粗提物经透析脱盐、阴离子交换层析、凝胶过滤层析、凝胶柱脱盐除杂操作，并冷冻干燥成为固体粉末，即为蚯蚓纤溶活性蛋白。经电泳分析，该蚯蚓纤溶活性蛋白分子量在25kD左右。纤维蛋白平板实验显示，该蛋白具有很好的纤溶活性。
所述透析脱盐截留分子量大于3500道尔顿，具体为：把透析袋（截留分子量>3500）一端用夹子夹紧，将粗提物溶液过0.45μm滤器后置于夹好的透析袋中，蛋白液量不超过透析袋容积的2/3,将袋开口处用夹子密封，用二蒸水作透析介质，每隔2～4小时更换一次二蒸水，至使用氯化钡溶液检测透析介质时无法形成硫酸钡沉淀即可。
所述阴离子交换层析具体为：将透析完全的蛋白粗提物溶液利用考马斯亮蓝法测蛋白浓度，过DEAE阴离子交换柱，上样体积与柱体积相当，流动相A液为50MmpH8.0Tris-HCl溶液，B液为1MNaCl50MmpH8.0Tris-HCl溶液,流速为2ml/min，梯度洗脱，收集5%～20%B液阶段洗脱出的各个蛋白峰，以聚乙二醇20000溶液为透析介质进行浓缩脱盐。考马斯亮蓝法测定蛋白浓度，计算各蛋白峰得率（即最终得到的蛋白峰的质量与最初上样总蛋白质量的比值）。细胞实验筛选活性，选择活性和得率最高的蛋白（选择原则为：得率相差不大时，选择活性高的进一步分析，活性相差不大时，选择得率高的进行实验）进行下一步分析。结果见附图1。
所述细胞实验筛选活性具体为：MCF-7细胞在细胞瓶内铺满（达到瓶底面积的90%）时，倾去培养基，加入1mL0.25%胰酶消化，待细胞从瓶壁上脱落后，加入1mL培养基终止消化，1000rpm，离心5min，然后加入2mL培养基重悬，取10μL细胞悬液，稀释至100μL，然后进行细胞计数，调整细胞密度为8*104/mL,以每孔100μL的比例将细胞悬液铺至96孔板内，置于37℃，5%CO2的培养箱内培养，12h后，将各个蛋白峰用培养基配制成适当浓度（50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL），吸净96孔板内培养基，将蛋白药液以每孔100微升的比例加入到各个孔中，每个浓度设立5个复孔，并设立空白对照组（即设5个孔，其内各加入100μL不含蛋白峰的培养基），重新置于37℃，5%CO2的培养箱内培养，48小时后，对加药组、对照组各孔内加入10微升CCK-8试剂，1h后，以450nm为测定波长，670nm为参比波长，利用酶标仪测定吸光度值，根据公式：抑制率%=（A对照组-A加药组）*100/A对照组，计算抑制率百分比，抑制率%越高说明蛋白峰活性越好。结果见附图2，各个蛋白峰抑制率比较图，抑制活性最高的为DEAE-5号峰（简称D-5）。
所述凝胶过滤层析具体为：浓缩脱盐的D-5蛋白峰进行S200凝胶过滤层析，上样体积2ml，流动相为0.15M氯化钠溶液，流速为1ml/min，收集蛋白峰，冻干浓缩，细胞实验筛选活性（方法同阴离子交换柱细胞实验活性筛选部分），选择活性和得率最高的蛋白进行下一步分析。结果见附图3、4。
所述凝胶柱脱盐除杂具体为：采用G10凝胶柱对上述筛选得到的具有活性的蛋白进行脱盐操作，上样量2ml，流动相为二蒸水，流速为1ml/min，收集蛋白峰，冻干得固体粉末，即为蚯蚓纤溶活性蛋白（简称D-5-S-2）。
所述电泳分析采用SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳，具体为：将蚯蚓活性纤溶蛋白溶于二蒸水内，浓度为1mg/mL,按照5:1的比例加入6×上样缓冲液使之最终变为1×。95℃，变性15min。配制浓缩胶以及12%的分离胶，在上样孔内分别加入10微升（1mg/mL、0.5mg/mL）的蛋白样品、4微升的Marker。以甘氨酸-TRIS溶液为电泳缓冲液，以电压为110V为条件，时间为1.5h。结束后将胶取出，采用考马斯亮蓝R-250染色液常温染色1h,然后采用脱色液（乙醇：乙酸：水=1:1:8）进行脱色，蛋白条带清晰可见。拍照成像。结果见附图5。
所述纤维蛋白平板实验测定纤溶活性，具体方法见2010版药典第三部附录Ⅻ重组链激酶生物活性测定法。结果见附图6。
其它操作同上述1各步骤。铺两块96孔板。蚯蚓纤溶活性蛋白以及紫杉醇的浓度配比关系如表2所示。
表2：蚯蚓纤溶活性蛋白以及紫杉醇加药浓度
24h、48h后分别测定细胞存活率，结果见图8、图9。
结果显示，与粗提物相比，纯化了的蚯蚓纤溶活性蛋白的抗肿瘤活性有了显著提高，且随着时间的递进，抗肿瘤活性依次增强。在与紫杉醇联合使用时，与粗提物相比，虽然降低了蚯蚓纤溶活性蛋白以及紫杉醇的给药浓度，但抗肿瘤作用仍达到了与之相同或更高水平。

Claims (4)

1.蚯蚓纤溶活性蛋白，其特征在于：是通过以下方法制备得到的：取新鲜蚯蚓，清洗干净，加入蚯蚓质量1～4倍的水，匀浆，静置12小时；4000rpm离心20分钟得蛋白上清液；蛋白上清液用0℃硫酸铵盐析，离心，弃上清，得到的沉淀溶于水中，得到蚯蚓纤溶活性蛋白粗提物，该粗提物经透析脱盐、阴离子交换层析、凝胶过滤层析、凝胶柱脱盐除杂操作，冷冻干燥成为固体粉末，并在分离过程中采用细胞实验筛选活性蛋白，最终得到纯化的蚯蚓纤溶活性蛋白；
所述透析脱盐截留分子量大于3500道尔顿；
所述阴离子交换层析具体为：将透析完全的蛋白粗提物溶液过DEAE阴离子交换柱，上样体积与柱体积相当，流动相A液为50MmpH8.0Tris-HCl溶液，B液为1MNaCl50MmpH8.0Tris-HCl溶液,梯度洗脱，收集5%～20%B液阶段洗脱出的各个蛋白峰，以聚乙二醇20000溶液为透析介质进行浓缩脱盐；考马斯亮蓝法测定蛋白浓度，计算各蛋白峰得率，并进行细胞实验筛选活性，选择活性和得率最高的蛋白，选择原则为：得率相差不大时，选择活性高的，活性相差不大时，选择得率高的；选择后，进行下一步凝胶过滤层析；
所述凝胶过滤层析具体为：上述选择的活性和得率最高的蛋白进行S200凝胶过滤层析，流动相为0.15M氯化钠溶液，收集蛋白峰，冻干浓缩，细胞实验筛选活性，选择活性和得率最高的蛋白，进行下一步凝胶柱脱盐；
所述凝胶柱脱盐除杂具体为：采用G10凝胶柱对上述筛选得到的蛋白进行脱盐操作，流动相为水，收集蛋白峰，冻干得固体粉末，即为蚯蚓纤溶活性蛋白；
所述细胞实验筛选活性的方法具体为：MCF-7细胞在细胞瓶内铺满时，倾去培养基，加入1mL0.25%胰酶消化，待细胞从瓶壁上脱落后，加入1mL培养基终止消化，1000rpm，离心5min，然后加入2mL培养基重悬，取10μL细胞悬液，稀释至100μL，然后进行细胞计数，调整细胞密度为8*104/mL,以每孔100μL的比例将细胞悬液铺至96孔板内，置于37℃，5%CO2的培养箱内培养，12h后，将各个蛋白峰用培养基配制成适当浓度，吸净96孔板内培养基，将蛋白药液以每孔100微升的比例加入到各个孔中，重新置于37℃，5%CO2的培养箱内培养，48小时后，各孔内加入10微升CCK-8试剂，1h后，以450nm为测定波长，670nm为参比波长，利用酶标仪测定吸光度值，计算各蛋白峰的抑制率百分比。
2.权利要求1所述的蚯蚓纤溶活性蛋白联合紫杉醇在制备治疗抑制癌细胞的药物中的应用。
3.一种抑制肿瘤细胞的联合用药物，其特征在于：包括权利要求1所述的蚯蚓纤溶活性蛋白以及紫杉醇，且任选的可以包括一种或多种可药用载体。
4.根据权利要求3所述的抑制肿瘤细胞的联合用药物，其特征在于：所述蚯蚓纤溶活性蛋白与紫杉醇的重量配比为80:1。
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