JP2022064275A - 上皮細胞がんを治療する医薬組成物を調製するための小胞子霊芝の免疫調節タンパク質及びキーホールリンペットヘモシアニン及びその用途 - Google Patents

Abstract

【課題】免疫細胞が腫瘍細胞に対して特異能動免疫反応を起こさせることができ、免疫原性及び治療効果を高めることができる医薬組成物及びその調製への用途を提供する。【解決手段】本発明は、小胞子霊芝の免疫調節タンパク質（ＧＭＩ，ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ）及びキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ，Ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）を含む医薬組成物を開示する。本発明にはさらに、上皮細胞がんを治療する医薬組成物を調製するための小胞子霊芝の免疫調節タンパク質及びキーホールリンペットヘモシアニンの用途を開示する。【選択図】図２Ｆ

Description

本発明は、上皮細胞がんを治療する医薬組成物を調製するための小胞子霊芝の免疫調節タンパク質、キーホールリンペットヘモシアニン及びその用途に関する。

がんは人類の健康にとって大きな脅威であり、台湾衛生署が発表した資料によれば、がんは台湾で３６年連続して死亡原因の第１位となっている。このことから分かるように、がんは人体の健康に及ぼす脅威は無視できないほどに大きい。全てのがんの種類において、約８０％以上が上皮細胞がんであり、過剰な細胞分裂により上皮組織に異常な腫瘍ができるのが特徴である。がん細胞は正常な細胞の成長の限界を持たず、その他の細胞にまで異常に侵入する。基本的には、上皮組織を持つ体内のあらゆる器官は上皮細胞がんが発生する可能性があり、 一般的なものとしては、肺がん、乳がん、口腔がん、食道がん、胃がん、大腸がん、肝臓がん、子宮頸がん、膀胱がん、すい臓がん、皮膚がんなどがある。

従来のがん治療の種類には、化学療法、外科手術、放射線療法、ホルモン療法、生物学的療法、標的療法、これらを組み合わせた治療法などが含まれる。しかし、多くの腫瘍は従来の方法に抵抗を有する。近年ではすでにがん治療のための免疫療法の研究が行われているが、この方法では、腫瘍から離れた部位にワクチン化合物を投与して、患者の全身性の腫瘍に特異能動免疫反応を起こさせている。現在、孤立した腫瘍関連抗原を含むいくつかのタイプのワクチンがすでに提案されている。

現在では多くの腫瘍関連抗原が同定され、それらの多くはがんの治療や予防のためのタンパク質ベース又はＤＮＡベースのワクチンとして研究されているものの、ほとんどはまだ臨床試験段階であって、治療製品は作られていない。また、がんワクチン開発の課題の一つとして、がん抗原は通常自己由来のものであることから、免疫系が変異した自分の細胞タンパク質を区別できないため、免疫原性が劣ることが挙げられる。そのため、がんワクチンの免疫原性や治療効果を高める方法の開発が急務となっている。

そこで、免疫細胞が腫瘍細胞に対して特異能動免疫反応を生じさせ、且つ医薬組成物の免疫原性や治療効果を高めることができる医薬組成物及びその調製への用途を提供することが重要な課題となっている。

上記課題に鑑み、本発明は、免疫細胞が腫瘍細胞に対して特異能動免疫反応を起こさせることができ、免疫原性及び治療効果を高めることができる医薬組成物及びその調製への用途を提供することを目的とする。

上記目的を達成するために、本発明の医薬組成物は、小胞子霊芝の免疫調節タンパク質（ＧＭＩ，ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ）と、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ，Ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）とを含む。

上記目的を達成するために、本発明ではまた、上皮細胞がんを治療する医薬組成物を調製するための小胞子霊芝の免疫調節タンパク質（ＧＭＩ）及びキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）の用途を提供するものであり、このうち医薬組成物は小胞子霊芝の免疫調節タンパク質とキーホールリンペットヘモシアニンとを含む。

一つの実施例において、小胞子霊芝の免疫調整タンパク質の用量は、５μｇ/ｍＬから２００μｇ/ｍＬの範囲である。

一つの実施例において、キーホールリンペットヘモシアニンの用量は１０μｇ/ｍＬから２００μｇ/ｍＬの範囲である。

一つの実施例において、小胞子霊芝の免疫調節タンパク質とキーホールリンペットヘモシアニンとの重量比は２０：１から１：４０の範囲である。

一つの実施例において、医薬組成物は、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ，ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）を更に含む。

一つの実施例において、フィトヘマグルチニンの用量は１μｇ/ｍＬから２０μｇ/ｍＬの範囲である。

一つの実施例において、小胞子霊芝の免疫調節タンパク質とフィトヘマグルチニンとの重量比は２００：１から１：４の範囲である。

一つの実施例において、キーホールリンペットヘモシアニンとフィトヘマグルチニンとの重量比は２００：１から１：２の範囲である。

一つの実施例において、医薬組成物は、錠剤、カプセル、乳剤、分散剤、懸濁剤、溶液、シロップ、顆粒、経皮パッチ、ゲル、粉末、クリーム、ペースト、坐剤又はエアゾールの形態である。

一つの実施例において、上皮細胞がんは、肺がん、乳がん、口腔がん、食道がん、胃がん、大腸がん、肝がん、子宮頸がん、膀胱がん、すい臓がん又は皮膚がんである。

一つの実施例において、上皮細胞がんは、肺がん、乳がん、すい臓がん又は膀胱がんである。

上記によれば、本発明の医薬組成物及びその調製の用途にて、その医薬組成物は小胞子霊芝の免疫調節タンパク質（ＧＭＩ）とキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）とを含むことから、免疫細胞が腫瘍細胞に対して特異能動免疫反応を生じさせ、且つ医薬組成物の免疫原性や治療効果を高めることができる。

本発明の医薬組成物、ＰＨＡ、ＫＬＨ及びＧＭＩで処置したヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を光学顕微鏡で観察した研究結果を示す写真である。 本発明の医薬組成物、ＰＨＡ、ＫＬＨ及びＧＭＩで処置したヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のフローサイトメーター分析の結果を示している。フローサイトメーターで分析した７-ＡＡＤ、ＣＦＳＥの蛍光強度の細胞分布を示す図であり、この分布図から各グループの細胞毒殺率を算出することができる。 本発明の医薬組成物、ＰＨＡ、ＫＬＨ及びＧＭＩで処置したヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のフローサイトメーター分析の結果を示している。図１Ｂに基づいてフローサイトメーターによる繰り返し３回の実験から得られた細胞毒殺率を示している。 本発明の医薬組成物、ＰＨＡ、ＫＬＨ及びＧＭＩで処置したヒト肺がん細胞（Ａ５４９細胞）を光学顕微鏡で観察した研究結果を示す写真である。 本発明の医薬組成物、ＰＨＡ、ＫＬＨ及びＧＭＩで処置したヒト肺がん細胞（Ａ５４９細胞）を光学顕微鏡で観察した研究結果を示す写真である。 本発明の医薬組成物、ＰＨＡ、ＫＬＨ及びＧＭＩで処置した肺がん細胞株（Ａ５４９細胞）のフローサイトメーター分析の結果である。フローサイトメーターで分析した７-ＡＡＤ、ＣＦＳＥの蛍光強度の細胞分布を示す図であり、この分布図から各グループの細胞毒殺率を算出することができる。 本発明の医薬組成物、ＰＨＡ、ＫＬＨ及びＧＭＩで処置した肺がん細胞株（Ａ５４９細胞）のフローサイトメーター分析の結果である。フローサイトメーターで分析した７-ＡＡＤ、ＣＦＳＥの蛍光強度の細胞分布を示す図であり、この分布図から各グループの細胞毒殺率を算出することができる。 本発明の医薬組成物、ＰＨＡ、ＫＬＨ及びＧＭＩで処置した肺がん細胞株（Ａ５４９細胞）のフローサイトメーター分析の結果である。図２Ｃに基づいてフローサイトメーターによる繰り返し３回の実験から得られた細胞毒殺率を示している。 本発明の医薬組成物、ＰＨＡ、ＫＬＨ及びＧＭＩで処置した肺がん細胞株（Ａ５４９細胞）のフローサイトメーター分析の結果である。図２Ｄに基づいてフローサイトメーターによる繰り返し３回の実験から得られた細胞毒殺率を示している。 本発明の医薬組成物、ＰＨＡ、ＫＬＨ及びＧＭＩで処置したヒト乳腺がん細胞株（ＭＤＡ-ＭＢ-２３１細胞）を光学顕微鏡で観察した研究結果を示す写真である。 本発明の医薬組成物、ＰＨＡ、ＫＬＨ及びＧＭＩで処置したヒト乳腺がん細胞株（ＭＤＡ-ＭＢ-２３１細胞）を光学顕微鏡で観察した研究結果を示す写真である。 本発明の医薬組成物、ＰＨＡ、ＫＬＨ及びＧＭＩで処置したヒト乳腺がん細胞株（ＭＤＡ-ＭＢ-２３１細胞）のフローサイトメーター分析の結果である。フローサイトメーターで分析した７-ＡＡＤ、ＣＦＳＥの蛍光強度の細胞分布図を示しており、この分布図から各グループの細胞毒殺率を算出することができる。 本発明の医薬組成物、ＰＨＡ、ＫＬＨ及びＧＭＩで処置したヒト乳腺がん細胞株（ＭＤＡ-ＭＢ-２３１細胞）のフローサイトメーター分析の結果である。フローサイトメーターで分析した７-ＡＡＤ、ＣＦＳＥの蛍光強度の細胞分布図を示しており、この分布図から各グループの細胞毒殺率を算出することができる。 本発明の医薬組成物、ＰＨＡ、ＫＬＨ及びＧＭＩで処置したヒト乳腺がん細胞株（ＭＤＡ-ＭＢ-２３１細胞）のフローサイトメーター分析の結果である。図３Ｃに基づいてフローサイトメーターによる繰り返し３回の実験から得られた細胞毒殺率を示している。 本発明の医薬組成物、ＰＨＡ、ＫＬＨ及びＧＭＩで処置したヒト乳腺がん細胞株（ＭＤＡ-ＭＢ-２３１細胞）のフローサイトメーター分析の結果である。図３Ｄに基づいてフローサイトメーターによる繰り返し３回の実験から得られた細胞毒殺率を示している。 本発明の医薬組成物、ＰＨＡ、ＫＬＨ及びＧＭＩで処置したヒト膀胱がん細胞株（Ｔ２４細胞）を光学顕微鏡で観察した研究結果を示す写真である。 本発明の医薬組成物、ＰＨＡ、ＫＬＨ及びＧＭＩで処置したヒト膀胱がん細胞株（Ｔ２４細胞）を光学顕微鏡で観察した研究結果を示す写真である。 本発明の医薬組成物、ＰＨＡ、ＫＬＨ及びＧＭＩで処置したヒト膀胱がん細胞株（Ｔ２４細胞）のフローサイトメーター分析の結果である。フローサイトメーターで分析した７-ＡＡＤ、ＣＦＳＥの蛍光強度の細胞分布図を示しており、この分布図から各グループの細胞毒殺率を算出することができる。 本発明の医薬組成物、ＰＨＡ、ＫＬＨ及びＧＭＩで処置したヒト膀胱がん細胞株（Ｔ２４細胞）のフローサイトメーター分析の結果である。フローサイトメーターで分析した７-ＡＡＤ、ＣＦＳＥの蛍光強度の細胞分布図を示しており、この分布図から各グループの細胞毒殺率を算出することができる。 本発明の医薬組成物、ＰＨＡ、ＫＬＨ及びＧＭＩで処置したヒト膀胱がん細胞株（Ｔ２４細胞）のフローサイトメーター分析の結果である。図４Ｃに基づいてフローサイトメーターによる繰り返し３回の実験から得られた細胞毒殺率を示している。 本発明の医薬組成物、ＰＨＡ、ＫＬＨ及びＧＭＩで処置したヒト膀胱がん細胞株（Ｔ２４細胞）のフローサイトメーター分析の結果である。図４Ｄに基づいてフローサイトメーターによる繰り返し３回の実験から得られた細胞毒殺率を示している。 本発明の医薬組成物、ＰＨＡ、ＫＬＨ及びＧＭＩで処置したヒトすい臓がん細胞株（ＢｘＰＣ-３細胞）を光学顕微鏡で観察した研究結果を示す写真である。 本発明の医薬組成物、ＰＨＡ、ＫＬＨ及びＧＭＩで処置したヒトすい臓がん細胞株（ＢｘＰＣ-３細胞）を光学顕微鏡で観察した研究結果を示す写真である。 本発明の医薬組成物、ＰＨＡ、ＫＬＨ及びＧＭＩで処置したヒトすい臓がん細胞株（ＢｘＰＣ-３細胞）のフローサイトメーター分析の結果である。フローサイトメーターで分析した７-ＡＡＤ、ＣＦＳＥの蛍光強度の細胞分布図を示しており、この分布図から各グループの細胞毒殺率を算出することができる。 本発明の医薬組成物、ＰＨＡ、ＫＬＨ及びＧＭＩで処置したヒトすい臓がん細胞株（ＢｘＰＣ-３細胞）のフローサイトメーター分析の結果である。フローサイトメーターで分析した７-ＡＡＤ、ＣＦＳＥの蛍光強度の細胞分布図を示しており、この分布図から各グループの細胞毒殺率を算出することができる。 本発明の医薬組成物、ＰＨＡ、ＫＬＨ及びＧＭＩで処置したヒトすい臓がん細胞株（ＢｘＰＣ-３細胞）のフローサイトメーター分析の結果である。図５Ｃに基づいてフローサイトメーターによる繰り返し３回の実験から得られた細胞毒殺率を示している。 本発明の医薬組成物、ＰＨＡ、ＫＬＨ及びＧＭＩで処置したヒトすい臓がん細胞株（ＢｘＰＣ-３細胞）のフローサイトメーター分析の結果である。図５Ｄに基づいてフローサイトメーターによる繰り返し３回の実験から得られた細胞毒殺率を示している。

以下にて関連する図面を参照して、本発明が提供する各種の実施例を説明する。このうち同じ構成要素は同じ参考記号で説明する。

まず、本発明の複数の実施例を以下にて提供しているものの、各々の実施例はいずれも可能な状況で本発明で開示する構成要素の一種の組合せを表すものであるが、本発明ではその開示する構成要素の全ての可能な組合せを含むべきである。したがって、もし一つの実施例が構成要素Ａ、Ｂ及びＣを含み、そして第２の実施例がＢ及びＤを含むとして、明確に開示されていなくても、本発明はＡ、Ｂ、Ｃ及び/又はＤのその他種類の任意の組合せを含むものであると理解されるべきである。

下記のいくつかの実施例において、成分の量、特性（例えば濃度、反応条件など）を示すための数値を記述してあるが、これはいくつかの状況において「約」用語を用いて修正されていると理解されるべきである。よって、いくつかの実施例において、本明細書及び別紙の実用新案登録請求の範囲に記載する数値パラメータは、特定の実施例で試みられる所望の特性に応じて変化する近似値である。いくつかの実施例において、記載される有効桁数の数字及び一般的な数値簡素化技術の適用に基づいて、数値パラメータは解釈すべきである。しかしながら、いくつかの実施例において、その数値範囲及び数値パラメータは近似値であるが、具体的な実験例にて提示された数値は可能な限り正確に記載してある。本明細書中に記載してある数値は、個々の数値を統計的に測定して生じた標準偏差による一部の誤差が含まれる可能性がある。

本明細書に別途規定しない限り、本明細書で提示する全ての数値範囲はこれらの端点を含むものと解釈すべきであり、開放式の範囲は商業的に実施可能な数値を含むものと解釈すべきである。同様に、本明細書に別途規定がない限り、全ての数値リストはその中間の数値を含むと認識されるべきである。つまり、本明細書で言及する数値範囲は、該範囲内に収まる各々の単独数値を一つずつ指すものとしての簡易な記載方法を意図するものに過ぎない。別途説明がある場合を除き、範囲内における各々の単独数値のいずれもが本明細書に開示する一部に組み込まれるものであり、同じく本明細書中で一つずつ指している。

本明細書で開示する代替要素又は実施例のグループは本発明での限定と解釈すべきではない。各々のグループの構成要素は単独で提案及び保護を求めることができるか、又は、このグループのその他構成要素又は本明細書中におけるその他要素との任意の組合せの方式で提案及び保護を求めることができる。利便性及び/又は排他性の理由から、グループの一つ又は複数の構成要素をグループに組み込んだり、グループから削除することができる。このような組み込み又は削除が発生した場合、明細書には補正後のグループが含まれているとみなされ、それにより、添付されている特許請求の範囲内で使用されるすべてのマーカッシュタイプのグループの記述要件が満たされることになる。また、明細書に記載されている用語は、たとえ特許請求の範囲に見られないものであっても、発明を実施するために必要な要素として解釈されるべきではない。

本明細書で使用される、「小胞子霊芝の免疫調節タンパク質」、「ＧＭＩ（ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ）」という用語は、例えば台湾特許ＴＷ Ｉ４１４３０７明細書中に開示されている小胞子霊芝の免疫調節タンパク質のことを意味しており、これは小胞子霊芝から選ばれた免疫調整作用のあるタンパク質又はその組換えタンパク質であって、このタンパク質は免疫調整剤としての機能を備えている。

本明細書で使用される、「キーホールリンペットヘモシアニン」、「ＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）」という用語はジャイアントキーホールリンペット（Ｍｅｇａｔｈｕｒａ ｃｒｅｎｕｌａｔａ）のヘモリンパ中に見られる大型で複数のユニットの酸素運搬性金属タンパク質である。ＫＬＨは、分子量約４００ｋＤａ（例：ＫＬＨモノマー）～約８０００ｋＤａ（例：ＫＬＨ二十量体）の縮合体にて分子量約３５０,０００～約３９０,０００のサブユニットからなる不均一なグリコシル化タンパク質である。ＫＬＨサブユニットの各領域には、１つの酸素分子と共に結合している２つの銅原子を含む。ヘモシアニンに酸素が結合すると、分子は独特の透明感のある乳白青色となる。ＫＬＨは強い免疫原性を持っているが、ヒトには有害な免疫反応を起こさない。ＫＬＨは、一連の工程によりジャイアントキーホールリンペットのヘモリンパ中から純化され、前記工程は硫酸アンモニウム沈殿や透析を含み、さらに最高純度を得るためにクロマトグラフィーを含む。いくつかの実施例では、ＫＬＨの純化にはエンドトキシンの除去も含まれるが、エンドトキシンは抗体を作るために注射される際にアジュバントとして作用することがあるため、このステップは必須ではない。いくつかの実施例では、ＫＬＨモノマーユニットが凝集して、約４,０００ｋＤａ～８,０００ｋＤａの総分子量を持つ巨大な多量体（十量体又は二十量体）になる。いくつかの実施例では、高次ＫＬＨ多量体は、約８００万から１０００万の分子量を有し、約９２から１０７Ｓの沈降係数を有する。

本明細書で使用される、「フィトヘマグルチニン」、「ＰＨＡ（ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）」という用語は、細胞を凝集させ、単糖又は多糖の複合体を沈殿させる植物由来の非免疫原性の非酵素性タンパク質である。単糖又は多糖の複合体に特異的に結合する能力を持つことから、例えばメッセージ伝達、免疫反応、植物防御など多くのメッセージ伝達プロセスにおいて重要な役割を果たしている。また、フィトアグルチニンは、細胞凝集、抗ウイルス、抗真菌、アポトーシスやオートファジーの誘導など様々な能力を持っている。

本明細書で使用される、「医薬組成物」という用語は、本発明の小胞子霊芝の免疫調節タンパク質（ＧＭＩ）、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）及び／又は他の化学成分（例えば、薬学的に許容される担体、安定剤、希釈剤、分散剤、懸濁剤、増粘剤及び／又は賦形剤）との混合物を意味する。該医薬組成物は、小胞子霊芝の免疫調節タンパク質、キーホールリンペットヘモシアニンを生体に投与するのに役立つ。

本発明の方法で使用される医薬組成物は、以下の投与経路に適している可能性がある：鼻腔、吸入、経口、直腸、膣、胸膜、腹膜、非消化管、局所、経皮、肺、鼻内、口腔、眼、硬膜外、髄腔内、静脈内、その他の投与経路。本発明の方法にて有用な組成物は、哺乳類に直接投与することができる。本発明のその他薬剤には、投影型ナノ粒子（ｐｒｏｊｅｃｔｅｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）、ミクロスフェア（ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ）、リボソーム製剤（ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）、被覆粒子（ｃｏａｔｅｄ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）、ポリマー複合体（ｐｏｌｙｍｅｒ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）及び免疫学に基づく製剤が含まれる。

投与経路は当業者にとっては明らかであり、しかも、治療する疾病のタイプや重症度、治療する家畜又はヒトの患者のタイプ及び年齢などの数多くの要因に依存する。

本明細書に記載されている医薬組成物の製剤は、薬理学及び薬学の分野で知られている方法、又は今後開発される何らかの方法によって調製することができる。一般的に、このような製剤方法は、活性成分を担体、又は１種類或いは多種類の他の補助成分と組み合わせた後、必要に応じて、又は実行可能な場合には、製品を目的の単回投与又は複数回投与のユニットに形成又は包装するという工程を含む。

本明細書で使用される、「単位用量」とは、あらかじめ定量された活性成分を含む医薬組成物の離散的な量（ｄｉｓｃｒｅｔｅ ａｍｏｕｎｔ）を意味する。活性成分の用量は通常、個体に投与される活性成分の用量に等しいか、又は該用量の便宜的な分数（ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ ｆｒａｃｔｉｏｎ）、例えば用量の半分又は１/３である。単位用量の剤形は、１日１回の投与に用いられる剤形であるか、又は１日複数回（例えば、１日あたり約１～４回、又はそれ以上）のうちの一回の投与に用いられる剤形にすることができる。１日に複数回投与する場合、単位用量の剤形は各投与量で同じでも異なっていてもよい。

本明細書で使用される、「薬学的に許容される」という用語は、本発明の医薬組成物に使用することができ、且つ該医薬組成物がその生物学的活性又は特性を保持することができ、かつ比較的非毒性である担体又は希釈剤などの材料を意味する。すなわち該材料は、望ましくない生物学的効果を引き起こすことなく、また、医薬組成物に含まれる成分と有害な方法で相互作用することなく、個人に投与することができる。

本明細書中で使用される「薬学的に許容される担体」は塩類、材料、組成物又は担体を含み、例えば、充填剤、希釈剤、賦形剤又はカプセル化材料など、本発明の医薬組成物が意図された機能を果たすように、個々の身体に運ばれ、又は輸送されることができる。典型的には、該医薬組成物は、ある器官や体の一部から別の器官や体の別の部分に運ばれる。各塩類や担体は、配合物の他の成分（本発明で使用可能な医薬組成物を含む）と互換性があり、且つ治験者に無害でなければならない。担体として使用可能な材料の例としては、以下のものが含まれる：糖類（ラクトース、グルコース及びショ糖）、デンプン（コーンスターチ及びポテトスターチ）、セルロース及びその誘導体（カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、酢酸セルロース）、粉末トラガカントゴム、麦芽、ゼラチン、タルク、賦形剤（ココアバター及び坐薬ワックス）、油類（ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油、大豆油など）、ジオール類（プロピレングリコール）、ポリオール類（グリセロール、ソルビトール、マンニトール、ポリエチレングリコール）、エステル類（オレイン酸エチル、ラウリン酸エチル）、寒天、緩衝剤（水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウムなど）、界面活性剤、アルギン酸、パイロジェンフリー水（ｐｙｒｏｇｅｎ-ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ）、等張塩水、リンゲル液（Ｒｉｎｇｅｒ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、エタノール、リン酸緩衝液、及び医薬調合物に使用されるその他の無毒性の互換性物質。

いくつかの実施例では、１つ又は複数の薬学的に許容される賦形剤又は担体を使用して、本発明の医薬組成物を調合することができる。いくつかの実施例では、本発明の医薬組成物は、治療上有効な用量のＧＭＩ、ＫＬＨ、及び／又はＰＨＡ、及び／又は薬学的に許容される担体を含む。医薬的に許容される担体は有用であり、グリセリン、水、塩水、エタノール、組換えヒトアルブミン（例：ＲＥＣＯＭＢＵＭＩＮ（登録商標））、溶解ゼラチン（例：ＧＥＬＯＦＵＳＩＮＥ（登録商標））、リン酸塩や有機酸塩などの薬学的に許容される塩類溶液などが含まれるが、これらに限定されるものではない。

製剤は、従来の賦形剤（すなわち、当技術分野で知られている経口、非消化管、経鼻、吸入、静脈内、皮下、経腸管（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ ｅｎｔｅｒａｌ）又は他の適切な投与様式に適したもの）の医薬的に許容される有機又は無機の担体物質と混合してもよい。医薬製剤は滅菌処理するとともに、必要であれば、例えば潤滑剤、防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧緩衝液に影響を与える塩類、着色剤、調味料、及び／又は香りを付与する物質などの補助剤と混合することができる。また、必要であれば、その他の活性剤（他の鎮痛剤、抗不安剤又は睡眠剤）と併用することもできる。本明細書で使用される「追加成分」には、医薬用担体として使用できる１種類又は多種類の成分が含まれるが、これらに限定されるものではない。

本発明の医薬組成物は、組成物の総重量に対して約０.００５％～２.０％の防腐剤を含んでいてもよく、防腐剤は、環境汚染物質にさらされた場合の腐敗を防ぐために使用される。本発明によれば、有用な防腐剤の例としては、ベンジルアルコール、ソルビン酸、パラベン、イミダゾリジニル尿素（ｉｍｉｄｕｒｅａ）及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるものが含まれるが、これらに限定されるものではない。

本発明の医薬組成物は、錠剤、カプセル、乳剤、分散液、懸濁液、溶液、シロップ、顆粒、経皮パッチ、ゲル、粉末、クリーム、ペースト、坐剤又はエアゾールの形態であるが、これらに限定されるものではない。

本発明の医薬製剤の粉末及び顆粒は、公知の方法で調製することができる。この製剤は、例えば、錠剤やカプセルにしたり、水性又は油性の担体を加えて水性又は油性の懸濁液や溶液にしたりして、個体に直接適用することができる。これらの製剤の全ては、さらに１種類又は多種類の分散剤又は湿潤剤、懸濁剤、イオン性及び非イオン性の界面活性剤、及び防腐剤を含むことができる。また、これらの製剤は、充填剤や甘味料、調味料又は着色剤などの追加の賦形剤を含んでいてもよい。

懸濁剤は、通常の方法で調製でき、活性成分を水性又は油性の担体に懸濁させる。水性担体としては、例えば、水や等張食塩水などが含まれる。油性担体としては、例えば、アーモンド油、油性エステル、エタノール、植物油（ピーナッツ油、オリーブ油、ゴマ油、ヤシ油）、分留した植物油、鉱物油（流動パラフィン）などが含まれる。液体懸濁液は、１種類又は多種類の追加成分を含んでもよく、懸濁剤、分散剤又は湿潤剤、乳化剤、調整剤、防腐剤、緩衝剤、塩類、調味料、着色剤及び甘味料などが含まれるが、これらに限定されるものではない。油性懸濁液は、さらに増粘剤を含むことができる。既知の懸濁剤としては、ソルビトールシロップ、食用油脂の水素添加、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴム、アラビアゴム、セルロース誘導体（カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース）が含まれるが、これらに限定されるものではない。既知の分散剤又は湿潤剤としては、レシチンなどの天然由来のリン脂質の縮合物、アルキレンオキシド、脂肪酸、長鎖脂肪アルコール、脂肪酸とヘキシトールから誘導される部分エステル、又は脂肪酸とヘキシトール無水物（ｈｅｘｉｔｏｌ ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）から誘導される部分エステル（例えば、ステアリン酸ポリオキシエチレン、ヘプタデカエチレンオキシセタノール（ｈｅｐｔａｄｅｃａｅｔｈｙｌｅｎｅｏｘｙｃｅｔａｎｏｌ）、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン、及びモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン）が含まれるが、これらに限定されるものではない。既知の乳化剤としては、レシチン、アラビアゴム、イオン性又は非イオン性の界面活性剤などが含まれるが、これらに限定されるものではない。既知の防腐剤としては、メチル、エチル、又はｎ-プロピル４－ヒドロキシ安息香酸、アスコルビン酸、ソルビン酸などが含まれるが、これらに限定されるものではない。既知の甘味料としては、例えば、グリセリン、プロピレングリコール、ソルビトール、ショ糖、サッカリンなどが含まれる。

水性又は油性溶媒中の活性成分の液体溶液は、液体懸濁液と基本的に同じ方法で調製できるが、主な違いは、活性成分が溶媒中に懸濁するのではなく溶解することである。本明細書にて使用する、「油性」の液体とは、炭素を含む液体分子を含み、しかも水よりも極性の低い液体のことである。本発明の医薬組成物の液剤は、液剤の懸濁液の説明に関連する各成分を含んでいてもよい。懸濁剤は、必ずしも活性成分の溶媒への溶解に寄与するものではないことを理解すべきである。水性担体としては、例えば、水や等張食塩水などが含まれる。油性溶剤としては、例えば、アーモンド油、油性エステル、エタノール、植物油（ピーナッツ油、オリーブ油、ゴマ油、ヤシ油）、分留した植物油、鉱物油（流動パラフィン）などが含まれる。

本発明の医薬組成物は、水中油型エマルション又は油中水型エマルションとして調製、包装又は販売することができる。油相は、植物油（オリーブ油、ピーナッツ油）、鉱物油（流動パラフィン）、又はそれらの組み合わせである。組成物は、天然由来のゴム（アラビアゴムやトラガカントゴム）、天然由来のリン脂質（大豆やレシチン）、脂肪酸とヘキシトール無水物を組み合わせて得られるエステル又は部分エステル（ソルビタンモノオレエートなど）、及びそのような部分エステルとエチレンオキシドとの縮合物（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート）などの１種類又は１種類以上の乳化剤をさらに含んでいてもよい。これらのエマルションは、例えば甘味料や調味料の追加成分を含んでいてもよい。

化学化合物を材料に含浸又はコーティングする方法は本技術分野で知られており、しかも化学化合物沈殿させ、又は表面に結合させる方法、合成時に化学化合物を材料構造に組み込む方法（例えば、生理学的に分解可能な材料を使用する方法）、水性又は油性の溶液又は懸濁液を吸収材に吸収させる方法、その後の乾燥の有無）などが含まれるが、これらに限定されるものではない。成分を混合する方法としては、物理的な粉砕、固体及び懸濁液製剤での顆粒の使用、経皮吸収パッチでの混合などが当業者には知られている。

本明細書で用いられる、「治療/処置」、「治療」 及び「治療法」という用語は、薬物又は医薬組成物を個体に投与することにより、個体が経験する疾患又は状態の症状の頻度又は重症度を減少させることを意味する。

本説明書で用いられる、「個体」、「被験個体」、「被験者」、及び「患者」という用語は、ヒト又はヒト以外の哺乳類のことである。ヒト以外の哺乳類としては、例えば、ヒツジ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、げっ歯類の哺乳類などの家畜やペットなどが含まれる。好ましくは、個体はヒトである

本明細書にて使用する、「がん」という用語には、全ての悪性腫瘍を含み、がん腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、肉腫（ｓａｒｃｏｍａ）が含まれるが、これらに限定されるものではない。がんは、細胞が制御不能又は異常に分裂し、周囲の組織に侵入して破壊することに起因する。本明細書にて使用する、「増生」及び「増殖」は、有糸分裂を行う細胞を指す。本明細書にて使用する、「転移」とは、悪性腫瘍が発生部位から離れていることを指す。がん細胞は、血流、リンパ系、体腔内、又はそれらの組み合わせによって転移する。

「がん」という用語とは、細胞が悪性化し、周囲の組織の上皮細胞に浸潤し、転移を起こすことを指す。

「がんワクチン」という用語とは、免疫系を刺激してがんと対抗したり、又はがんの発生を助ける媒介物質と対抗させるワクチンのことである。がんワクチンには大きく分けて２種類があり、健康な被験者ががんになるのを防ぐための「予防型がんワクチン」と、がんに対する体の防御力を高めて既存のがんを治療するための「治療型がんワクチン」がある（Ｌｏｌｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ, Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ, ２００６； ６（３）：２０４～２１６）。本明細書にて使用する、「がんワクチン」という用語は、予防的ながんワクチンと治療的ながんワクチンの両方を含むと解釈されるべきである。

範囲：本発明の全文において、各々の実施例は範囲の形式で表すことができる。理解すべきは、範囲形式の記述は単に利便性と簡素化のために過ぎず、本発明の範囲に対する制限として解釈されるべきではない、ということである。よって、範囲の記述は、全ての可能なサブ範囲及びこの範囲内の単一の数値を具体的に開示しているものであると見なされるべきである。例えば、１から５までの範囲の記述は特定に開示するサブ範囲、例えば１から３まで、１から４まで、１から５まで、２から４まで、２から５まで、３から５まで、そしてこの範囲内の単一及び一部数字、例えば１、２、２．５、３、４及び５を有するものと見なされるべきである。どのような大きさの範囲であっても適用される。

本実施例で使用する小胞子霊芝の免疫調節タンパク質（ＧＭＩ）（台湾特許ＴＷ Ｉ４１４３０７明細書中に開示されている小胞子霊芝の免疫調節タンパク質）は、腫瘍細胞の増殖を抑制する効果を有する。主に上皮細胞成長因子受容体（ＥＧＦＲ）信号伝達経路を介して、上皮細胞成長因子受容体によって誘発される腫瘍細胞の増殖を阻止し、がんの転移（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）や浸潤（ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を阻止することができる。

本発明に係る医薬組成物は、小胞子霊芝の免疫調節タンパク質（ＧＭＩ）と、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）とを含む。

本実施例において、小胞子霊芝の免疫調整タンパク質の用量は、５μｇ/ｍＬから２００μｇ/ｍＬの範囲である。好ましくは、小胞子霊芝の免疫調節タンパク質の用量は、５μｇ/ｍＬ、１０μｇ/ｍＬ、１５μｇ/ｍＬ、２０μｇ/ｍＬ、２５μｇ/ｍＬ、３０μｇ/ｍＬ、３５μｇ/ｍＬ、４０μｇ/ｍＬ、４５μｇ/ｍＬ、５０μｇ/ｍＬ、５５μｇ/ｍＬ、６０μｇ/ｍＬ、６５μｇ/ｍＬ、７０μｇ/ｍＬ、７５μｇ/ｍＬ、８０μｇ/ｍＬ、８５μｇ/ｍＬ、９０μｇ/ｍＬ、９５μｇ/ｍＬ、１００μｇ/ｍＬ、１０５μｇ/ｍＬ、１１０μｇ/ｍＬ、１１５μｇ/ｍＬ、１２０μｇ/ｍＬ、１２５μｇ/ｍＬ、１３０μｇ/ｍＬ、１３５μｇ/ｍＬ、１４０μｇ/ｍＬ、１４５μｇ/ｍＬ、１５０μｇ/ｍＬ、１５５μｇ/ｍＬ、１６０μｇ/ｍＬ、１６５μｇ/ｍＬ、１７０μｇ/ｍＬ、１７５μｇ/ｍＬ、１８０μｇ/ｍＬ、１８５μｇ/ｍＬ、１９０μｇ/ｍＬ、１９５μｇ/ｍＬ、２００μｇ/ｍＬ又は前記いずれか２つの値の間に含まれる任意の値及び範囲とすることができる。もちろん、小胞子霊芝の免疫調節タンパク質の用量は、組み合わされる処置における担体、投与経路又は必要としている個体及びその生理的状態によって変わる可能性がある。

本実施例において、キーホールリンペットヘモシアニンの用量は１０μｇ/ｍＬから２００μｇ/ｍＬの範囲である。好ましくは、キーホールリンペットヘモシアニンの用量は、１０μｇ/ｍＬ、１５μｇ/ｍＬ、２０μｇ/ｍＬ、２５μｇ/ｍＬ、３０μｇ/ｍＬ、３５μｇ/ｍＬ、４０μｇ/ｍＬ、４５μｇ/ｍＬ、５０μｇ/ｍＬ、５５μｇ/ｍＬ、６０μｇ/ｍＬ、６５μｇ/ｍＬ、７０μｇ/ｍＬ、７５μｇ/ｍＬ、８０μｇ/ｍＬ、８５μｇ/ｍＬ、９０μｇ/ｍＬ、９５μｇ/ｍＬ、１００μｇ/ｍＬ、１０５μｇ/ｍＬ、１１０μｇ/ｍＬ、１１５μｇ/ｍＬ、１２０μｇ/ｍＬ、１２５μｇ/ｍＬ、１３０μｇ/ｍＬ、１３５μｇ/ｍＬ、１４０μｇ/ｍＬ、１４５μｇ/ｍＬ、１５０μｇ/ｍＬ、１５５μｇ/ｍＬ、１６０μｇ/ｍＬ、１６５μｇ/ｍＬ、１７０μｇ/ｍＬ、１７５μｇ/ｍＬ、１８０μｇ/ｍＬ、１８５μｇ/ｍＬ、１９０μｇ/ｍＬ、１９５μｇ/ｍＬ、２００μｇ/ｍＬ又は前記いずれか２つの値の間に含まれる任意の値及び範囲とすることができる。もちろん、キーホールリンペットヘモシアニンの用量は、組み合わされる処置における小胞子霊芝の免疫調節タンパク質、担体、投与経路又は必要としている個体及びその生理的状態によって変わる可能性がある。

本実施例において、小胞子霊芝の免疫調節タンパク質とキーホールリンペットヘモシアニンとの重量比は２０：１から１：４０の範囲である。好ましくは、小胞子霊芝の免疫調節タンパク質とキーホールリンペットヘモシアニンとの重量比は、２０：１、１９：１、１８：１、１７：１、１６：１、１５：１、１４：１、１３：１、１２：１、１１：１、１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１１、１：１２、１：１３、１：１４、１：１５、１：１６、１：１７、１：１８、１：１９、１：２０、１：２１、１：２２、１：２３、１：２４、１：２５、１：２６、１：２７、１：２８、１：２９、１：３０、１：３１、１：３２、１：３３、１：３４、１：３５、１：３６、１：３７、１：３８、１：３９、１：４０又は前記いずれか２つの値の間に含まれる任意の値及び範囲とすることができる。もちろん、小胞子霊芝の免疫調節タンパク質とキーホールリンペットヘモシアニンとの重量比は、組み合わされる処置における担体、投与経路又は必要としている個体及びその生理的状態によって変わる可能性がある。

本実施例において、医薬組成物は、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ，ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）を更に含むことができる。

本実施例において、フィトヘマグルチニンの用量は１μｇ/ｍＬから２０μｇ/ｍＬの範囲である。好ましくは、フィトヘマグルチニンの用量可以是１μｇ/ｍＬ、２μｇ/ｍＬ、３μｇ/ｍＬ、４μｇ/ｍＬ、５μｇ/ｍＬ、６μｇ/ｍＬ、７μｇ/ｍＬ、８μｇ/ｍＬ、９μｇ/ｍＬ、１０μｇ/ｍＬ、１１μｇ/ｍＬ、１２μｇ/ｍＬ、１３μｇ/ｍＬ、１４μｇ/ｍＬ、１５μｇ/ｍＬ、１６μｇ/ｍＬ、１７μｇ/ｍＬ、１８μｇ/ｍＬ、１９μｇ/ｍＬ、２０μｇ/ｍＬ又は前記いずれか２つの値の間に含まれる任意の値及び範囲とすることができる。もちろん、フィトヘマグルチニンの用量は、組み合わされる処置における小胞子霊芝の免疫調節タンパク質、担体、投与経路又は必要としている個体及びその生理的状態によって変わる可能性がある。

本実施例において、小胞子霊芝の免疫調節タンパク質とフィトヘマグルチニンとの重量比は２００：１から１：４の範囲である。好ましくは、小胞子霊芝の免疫調節タンパク質とフィトヘマグルチニンとの重量比は、２００：１、１９５：１、１９０：１、１８５：１、１８０：１、１７５：１、１７０：１、１６５：１、１６０：１、１５５：１、１５０：１、１４５：１、１４０：１、１３５：１、１３０：１、１２５：１、１２０：１、１１５：１、１１０：１、１０５：１、１００：１、９５：１、９０：１、８５：１、８０：１、７５：１、７０：１、６５：１、６０：１、５５：１、５０：１、４５：１、４０：１、３５：１、３０：１、２５：１、２０：１、１５：１、１０：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、１：４又は前記いずれか２つの値の間に含まれる任意の値及び範囲とすることができる。もちろん、小胞子霊芝の免疫調節タンパク質とフィトヘマグルチニンとの重量比は、組み合わされる処置における担体、投与経路又は必要としている個体及びその生理的状態によって変わる可能性がある。

本実施例において、キーホールリンペットヘモシアニンとフィトヘマグルチニンとの重量比は２００：１から１：２の範囲である。好ましくは、小胞子霊芝の免疫調節タンパク質とフィトヘマグルチニンとの重量比は、２００：１、１９５：１、１９０：１、１８５：１、１８０：１、１７５：１、１７０：１、１６５：１、１６０：１、１５５：１、１５０：１、１４５：１、１４０：１、１３５：１、１３０：１、１２５：１、１２０：１、１１５：１、１１０：１、１０５：１、１００：１、９５：１、９０：１、８５：１、８０：１、７５：１、７０：１、６５：１、６０：１、５５：１、５０：１、４５：１、４０：１、３５：１、３０：１、２５：１、２０：１、１５：１、１０：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、１：２又は前記いずれか２つの値の間に含まれる任意の値及び範囲とすることができる。もちろん、キーホールリンペットヘモシアニンとフィトヘマグルチニンとの重量比は、組み合わされる処置における担体、投与経路又は必要としている個体及びその生理的状態によって変わる可能性がある。

本実施例において、医薬組成物は、錠剤、カプセル、乳剤、分散剤、懸濁剤、溶液、シロップ、顆粒、経皮パッチ、ゲル、粉末、クリーム、ペースト、坐剤又はエアゾールの形態であるが、これらに限定されるものではない。好ましくは、医薬組成物は、分散剤、懸濁剤又は溶液であってもよい。

本発明ではまた、上皮細胞がんの治療のための医薬組成物の調製及び用途のための小胞子霊芝の免疫調節タンパク質（ＧＭＩ）及びキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）を提供するものであり、このうち医薬組成物は小胞子霊芝の免疫調節タンパク質とキーホールリンペットヘモシアニンとを含む。また、本発明では更に、小胞子霊芝の免疫調節タンパク質と、キーホールリンペットヘモシアニンとを含む医薬組成物を提供することを含む、上皮細胞がんを罹患した患者を治療するのに用いられる方法を提供する。医薬組成物の用量、担体の種類、形態、その他の特性は、上述した医薬組成物と実質的に同じであり、上記を参考できることから、ここでは別途説明しない。

本実施例において、上皮細胞がんは、例えば肺がん、乳がん、口腔がん、食道がん、胃がん、大腸がん、肝がん、子宮頸がん、膀胱がん、すい臓がん又は皮膚がんであるが、これらに限定されるものではない。好ましくは、上皮細胞がんは、肺がん、乳がん、すい臓がん又は膀胱がんとすることができる。

以上のことから、本発明による医薬組成物及びその製剤の用途は、上皮性細胞がんの治療に有効性を発揮することができる。

以下の実験例は、上皮性細胞がんの治療効果に対して、顕著な効果を提供する、本発明の用途及び医薬組成物を説明するのに用いられる。

材料及び方法

細胞株：肺がん細胞株Ａ５４９（ＡＴＣＣより購入）、Ｃｏｏｐｅｒ ＪＲ.らの、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ. ２０１６ Ｏｃｔ ２８；１１（１０）：ｅ０１６４４３８中に記載する培養方法を参考として、３７℃/５％ ＣＯ_２インキュベータ中にて、細胞培地（１０％ ＦＢＳが添加されているＲＰＭＩ-１６４０培地）で培養を行う。ヒト乳腺がん細胞株ＭＤＡ-ＭＢ-２３１（生物資源保存及び研究センター，ＢＣＲＣより購入）、Ｋｉｍ ＳＷ.らの、Ｉｎｔ Ｊ Ｏｎｃｏｌ. ２０１５ Ｍａｙ；４６（５）：２０６７-７５中に記載する培養方法を参考として、３７℃/５％ ＣＯ_２インキュベータ中にて、細胞培地（１０％ ＦＢＳが添加されているＲＰＭＩ-１６４０培地）で培養を行う。膀胱がん細胞株Ｔ２４（ＢＣＲＣから購入）、Ｚｈａｏ ＺＦ.らの、Ｍｅｄ Ｓｃｉ Ｍｏｎｉｔ. ２０１７ Ｍａｒ ６；２３：１１５６-１１６４中に記載する培養方法を参考として、３７℃/５％ ＣＯ_２インキュベータ中にて、細胞培地（１０％ ＦＢＳが添加されているＲＰＭＩ-１６４０培地）で培養を行う。すい臓がん細胞株ＢｘＰＣ-３（ＢＣＲＣから購入）、Ｃｈｅｎ ＲＹ.らの、Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ. ２０１４ Ｏｃｔ ２８； ２０（４０）：１４８９５-１４９０３中に記載する培養方法を参考として、３７℃/５％ ＣＯ_２インキュベータ中にて、細胞培地（１０％ ＦＢＳが添加されているＲＰＭＩ-１６４０培地）で培養を行う。このうち、ＦＢＳ（牛胎児血清）はＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社から購入した。

ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）：ドナーから全血試料を採取し、Ｆｉｃｏｌｌで遠心分離してＰＢＭＣ細胞を分離した後、凍結保存用の培地に加えて凍結保存しており、その後の実験時には解凍して使用する。ＦｉｃｏｌｌによるＰＢＭＣの分離と凍結保存の方法は、この分野の一般的な知識であり、既知の実験方法に従って行うことができるため、ここでは別途説明しない。このうち、ＦｉｃｏｌｌはＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社から購入した。

フローサイトメーター試薬の構成：７-ＡＡＤ/ＣＦＳＥ Ｃｅｌｌ-Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＬＬＣ.，Ｃａｔ：#９６９から購入）を使用して、まず１０Ｘ Ａｓｓａｙ Ｂｕｆｆｅｒを１Ｘ Ａｓｓａｙ Ｂｕｆｆｅｒに希釈して（４ｍＬの１０Ｘ Ａｓｓａｙ Ｂｕｆｆｅｒを３６ｍＬの滅菌水中に加える）準備しておく。続いて、ＣＦＳＥ（原管）を２００μｌのＤＭＳＯで逆溶解した後、１Ｘ Ａｓｓａｙ Ｂｕｆｆｅｒで１：１２５で希釈することで、２０×ＣＦＳＥ染色剤（８μＬ ＣＦＳＥ + ９９２μＬ １Ｘ Ａｓｓａｙ Ｂｕｆｆｅｒ）を調製する。７-ＡＡＤ（原管）を２６０μｌのＤＭＳＯで逆溶解した後、１Ｘ Ａｓｓａｙ Ｂｕｆｆｅｒで１：１０で希釈することで２１Ｘ ７-ＡＡＤ染色剤（４０μＬ ７-ＡＡＤ + ３６０μＬ １Ｘ Ａｓｓａｙ Ｂｕｆｆｅｒ）を調製する。

処置群の構成：（１）１ｍＬ細胞培地（対照群）、（２）１ｍＬ細胞培地には１０μｇ又は２０μｇのＰＨＡが混合されることで、ＰＨＡ濃度が１０μｇ/ｍＬ（低用量ＰＨＡ群）又は２０μｇ/ｍＬである群（高用量ＰＨＡ群）を調製する、（３）１ｍＬ細胞培地には１００μｇ又は２００μｇのＫＬＨが混合されることで、ＫＬＨ濃度が１００μｇ/ｍＬ（低用量ＫＬＨ群）又は２００μｇ/ｍＬである群（高用量ＫＬＨ群）を調製する、（４）１ｍＬ細胞培地には２０μｇ又は２００μのＧＭＩが混合されることで、ＧＭＩ濃度が２０μｇ/ｍＬ（低用量ＧＭＩ群）又は２００μｇ/ｍＬである群（高用量ＧＭＩ群）を調製する、（５）１ｍＬ細胞培地には１０μｇ又は２０μｇのＰＨＡ、１００μｇ又は２００μｇのＫＬＨ及び２０μｇ又は２００μｇのＧＭＩが混合されることで、ＰＨＡ濃度が１０μｇ/ｍＬ、ＫＬＨ濃度が１００μｇ/ｍＬであり、且つＧＭＩ濃度が２０μｇ/ｍＬである群（低用量医薬組成物群）又はＰＨＡ濃度が２０μｇ/ｍＬ、ＫＬＨ濃度が２００μｇ/ｍＬであり且つＧＭＩ濃度が２００μｇ/ｍＬである群（高用量医薬組成物群）を調製する。これらのうち、ＰＨＡはＳＩＧＭＡ-ＡＬＤＲＩＣＨ, Ｃａｔ：Ｌ８９０２から、ＫＬＨ （Ｉｍｍｕｃｏｔｈｅｌ（登録商標））はＢｉｏｓｙｎから購入した。

実験例１：ＰＢＭＣ細胞に対するＧＭＩ、ＫＬＨ、ＰＨＡ及び医薬組成物の影響

ＰＢＭＣを１Ｘ １０^６個細胞/ウェルの濃度でそれぞれ以下の条件に懸濁させ、（１）１ｍＬ細胞培地（対照群）（２）１ｍＬ細胞培地には１０μｇ/ｍＬ、２０μｇ/ｍＬのＰＨＡ（それぞれＰＨＡ群-１、ＰＨＡ群-２）が混合されており、（３）１ｍＬ細胞培地には１００μｇ/ｍＬ、２００μｇ/ｍＬのＫＬＨ（それぞれＫＬＨ群-１、ＫＬＨ群-２）が混合されており、（４）１ｍＬ細胞培地には２０μｇ/ｍＬ、２００μｇ/ｍＬのＧＭＩ（それぞれＧＭＩ群-１、ＧＭＩ群-２）、（５）１ｍＬ細胞培地には１０μｇ/ｍＬのＰＨＡ、１００μｇ/ｍＬのＫＬＨ及び２０μｇ/ｍＬのＧＭＩ（医薬組成物群-１）又は２０μｇ/ｍＬのＰＨＡ、２００μｇ/ｍＬのＫＬＨ及び２００μｇ/ｍＬのＧＭＩ（医薬組成物群-２）が混合されるとともに、２４ウェルプレート中に接種し、３７℃/５％ ＣＯ_２インキュベータ中で２４時間培養した後、顕微鏡で観察するとともに撮影したところ、結果は図１Ａに示すように、高用量又は低用量のＧＭＩ群、ＰＨＡ群及び医薬組成物群のいずれに関わらず、対照群と比べても、ＰＢＭＣの凝集反応を引き起こしており、ＧＭＩ、ＰＨＡ及び医薬組成物の処置ではＰＢＭＣの免疫反応が増加することを意味している。

撮影後、細胞をマイクロチューブに回収して、４^ｏＣにて１０分間７-ＡＡＤ染色を行った後、フローサイトメーターで分析を行って（ＢＤ Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６）、細胞内にＣＦＳＥの蛍光の存在を検出するために、ＦＬ-１ ｃｈａｎｎｅｌ（緑色蛍光）を設定した。細胞内に７-ＡＡＤの蛍光の存在を検出するためにＦＬ-３ ｃｈａｎｎｅｌ（赤色蛍光）を設定した。フローサイトメーター分析の結果は図１Ｂに示すように、横軸はＣＦＳＥの蛍光強度、縱軸は７-ＡＡＤの蛍光強度であり、ＰＢＭＣ細胞は７-ＡＡＤ染色のみであることから、ＣＦＳＥ蛍光は検出されなかった。ＡＡＤ^-象限で表す細胞は生きている細胞であり、ＡＡＤ⁺象限で表す細胞は死滅した細胞であることから、よって、細胞毒殺率の計算方式は（ＡＡＤ⁺） / （ＡＡＤ^- + ＡＡＤ⁺）Ｘ１００％となる。図１Ｂの分析結果を、上記の細胞毒殺率の計算式に従って細胞毒殺率に変換し、フローサイトメーターを用いて３回実験を繰り返して行い統計して得られた細胞毒殺率の結果を図１Ｃに示す。

図１Ｃを参照すると、対照群と比較したところ、低用量及び高用量ＰＨＡ群（図中、ＰＨＡ群-１、ＰＨＡ群-２と表記）、低用量ＧＭＩ群（図中、ＧＭＩ群-１と表記）及び低用量医薬組成物群（図中、医薬組成物群-１と表記）にて、一部のＰＢＭＣを毒殺するのみで、その他のグループはＰＢＭＣに対しての毒殺はほとんど影響なかった。図１Ａ～図１Ｃの結果から分かるように、ＰＨＡ、ＫＬＨ、ＧＭＩ、医薬組成物の処置は、ＰＢＭＣの生存率にはほとんど影響がなく、しかもＰＢＭＣの免疫反応を高めることができた。

実験例２：Ａ５４９細胞（肺がん細胞）に対するＰＨＡ、ＫＬＨ、ＧＭＩ及び医薬組成物の影響

Ａ５４９細胞を１Ｘ１０^７個細胞/ｍＬの濃度で１９ ｍＬの１Ｘ Ａｓｓａｙ Ｂｕｆｆｅｒ中に懸濁させて、２０Ｘ ＣＦＳＥ １ｍＬを加えて３７℃で１５分間培養した後、細胞培地２０ｍＬを加えることで、ＣＦＳＥの結合反応を終了させて、次に１２００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清液を除去した。４ｍＬの細胞培地で細胞を再懸濁させた後、０.２ｍＬを２４ウェルプレート中に接種した。

次に、そのＡ５４９細胞を２つの処置群に分け、１つ目はＡ５４９細胞処置群（ＰＢＭＣと共培養しない）であり、２つ目はＡ５４９＋ＰＢＭＣ処置群（Ａ５４９をＰＢＭＣと共培養し、生体内の腫瘍の環境をシミュレートする）である。

Ａ５４９細胞処置群に関して：

（１）細胞培地（対照群）０.３ｍＬ、（２）ＰＨＡが混合されている細胞培地（ＰＨＡ群）０.３ｍＬ、（３）ＫＬＨが混合されている細胞培地（ＫＬＨ群）０.３ｍＬ、（４）ＧＭＩが混合されている細胞培地（ＧＭＩ群）０.３ｍＬ、（５）ＰＨＡ、ＫＬＨ及びＧＭＩが混合されている細胞培地（医薬組成物群）０.３ｍＬ、異なった群を順に加えて、３７℃/５％ ＣＯ_２インキュベータ中で２４時間培養した後、上清液をマイクロチューブに収集して、各ウェル中にＤＰＢＳ ０.４ ｍＬを加えて細胞を洗浄した後、洗浄後の上清液をマイクロチューブに回収して、ＤＰＢＳ ０.３ｍＬを再び加えて、顕微鏡で観察するとともに撮影した。図２Ａ及び図２Ｂを参照されたい。図２Ａ及び図２Ｂは、本発明の医薬組成物、ＰＨＡ、ＫＬＨ、ＧＭＩで処置したヒト肺がん細胞株（Ａ５４９細胞）を光学顕微鏡で観察した研究結果を示す写真である。図２Ａは低用量処置の群、図２Ｂは高用量処置の群を示す。図２Ａでは、ＰＨＡ群は１０μｇ/ｍＬのＰＨＡ、ＫＬＨ群は１００μｇ/ｍＬのＫＬＨ、ＧＭＩ群は２０μｇ/ｍＬのＧＭＩ、そして医薬組成物群は１０μｇ/ｍＬのＰＨＡ＋１００μｇ/ｍＬのＫＬＨ＋２０μｇ/ｍＬのＧＭＩである。図２Ｂでは、ＰＨＡ群は２０μｇ/ｍＬのＰＨＡ、ＫＬＨ群は２００μｇ/ｍＬのＫＬＨ、ＧＭＩ群は２００μｇ/ｍＬのＧＭＩ、そして医薬組成物群は２０μｇ/ｍＬのＰＨＡ＋２００μｇ/ｍＬのＫＬＨ＋２００μｇ/ｍＬのＧＭＩである。顕微鏡で観察した結果は、ＰＨＡ群とＫＬＨ群とでは、高用量でも低用量でも、対照群に比べて付着細胞数はあまり変化しておらず、つまりこの２つの処置はＡ５４９細胞に対する毒殺効果は大きくないことを示している。一方では、対照群に比べてＧＭＩ群と医薬組成物群では、付着細胞数は明らかに減少していることから、この２つの処置はＡ５４９細胞に対して毒殺効果を持つことが示されたことになる。

撮影後、ＤＰＢＳ ０.３ｍＬをマイクロチューブに回収し、各ウェルにＡｃｃｕｔａｓｅ^ＴＭ細胞分離液２００μＬを細胞が隠れるように加え 、３７℃で２分間処置して２４ウェルプレートから細胞を剥離させ、前に回収した上清液で洗浄し、細胞をマイクロチューブに収集し、最後に７-ＡＡＤを４℃で１０分間染色した。その後、フローサイトメーターで分析を行って（ＢＤ Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６）、細胞内にＣＦＳＥの蛍光の存在を検出するために、ＦＬ-１ ｃｈａｎｎｅｌ（緑色蛍光）を設定した。細胞内に７-ＡＡＤの蛍光の存在を検出するためにＦＬ-３ ｃｈａｎｎｅｌ（赤色蛍光）を設定した。フローサイトメーター分析の結果は図２Ｃ、図２Ｄに示すように、横軸はＣＦＳＥの蛍光強度、縱軸は７-ＡＡＤの蛍光強度であり、ＣＦＳＥ⁺ＡＡＤ^-象限で示す細胞は生きている細胞であり、ＣＦＳＥ⁺ＡＡＤ⁺象限で示す細胞は死滅した細胞であることから、よって、細胞毒殺率の計算方式は（ＣＦＳＥ⁺ＡＡＤ⁺） / （ＣＦＳＥ⁺ＡＡＤ^- + ＣＦＳＥ⁺ＡＡＤ⁺）×１００％となる。図２Ｃ及び図２Ｄの分析結果を、上記の細胞毒殺率の計算式に従って細胞毒殺率を算出した後、フローサイトメーターを用いて３回実験を繰り返して行い統計して得られた細胞毒殺率の結果を図２Ｅ及び図２Ｆに示す。

図２Ｃから図２Ｆを参照されたい。図２Ｃ及び図２Ｅでは、ＰＨＡ群は１０μｇ/ｍＬのＰＨＡ、ＫＬＨ群は１００μｇ/ｍＬのＫＬＨ、ＧＭＩ群は２０μｇ/ｍＬのＧＭＩ、医薬組成物群は、１０μｇ/ｍＬのＰＨＡ＋１００μｇ/ｍＬのＫＬＨ＋２０μｇ/ｍＬのＧＭＩである。図２Ｄ及び図２Ｆでは、ＰＨＡ群は２０μｇ/ｍＬのＰＨＡ、ＫＬＨ群は２００μｇ/ｍＬのＫＬＨ、ＧＭＩ群は２００μｇ/ｍＬのＧＭＩ、医薬組成物群は２０μｇ/ｍＬのＰＨＡ＋２００μｇ/ｍＬのＫＬＨ＋２００μｇ/ｍＬのＧＭＩとなっている。図２Ｃでは、対照群、ＰＨＡ群、ＫＬＨ群、ＧＭＩ群、医薬組成物群のフローサイトメーターによる１回実験で得られた細胞毒殺率は、それぞれ０.９％、４.６％、１.０％、８.１％、１７.４％であった。図２Ｅに示すように、低用量の処置でのフローサイトメーターを用いて３回実験を繰り返して行い統計して得られた細胞毒殺率の結果では、ＰＨＡ群は肺がん細胞に対して部分的に毒殺作用を示し、ＫＬＨ群は肺がん細胞に対する毒殺効果は大きくなかった。ＧＭＩ群は肺がん細胞に対する毒殺効果が優れており、そして医薬組成物群は肺がん細胞に対する毒殺効果はＧＭＩ群よりも顕著であることから、医薬組成物群（ＰＨＡ+ＫＬＨ+ＧＭＩ）はＰＨＡ、ＫＬＨ、ＧＭＩを単独で投与した群よりもＡ５４９細胞に対する毒殺現象はより顕著で且つ明らかに異なっており、肺がんの細胞を死滅させる現象がより顕著となり、肺がんの治療においてより効果的であったことを示している。また、図２Ｄの高用量群において、フローサイトメーターによる１回実験で得られた対照群、ＰＨＡ群、ＫＬＨ群、ＧＭＩ群、医薬組成物群の細胞毒殺率はそれぞれ０.９％、１３.８％、１.４％、２９.３％、３９.５％であった。図２Ｆの結果が示すように、高用量の処置にて、フローサイトメーターを用いて３回実験を繰り返して行い統計して得られた細胞毒殺率の結果では、ＰＨＡ群は肺がん細胞に対して部分的に毒殺作用を示し、ＫＬＨ群は肺がん細胞に対する毒殺効果は大きくなかった。ＧＭＩ群は肺がん細胞に対する毒殺効果が優れており、そして医薬組成物群は肺がん細胞に対する毒殺効果はＧＭＩ群よりも顕著であることから、医薬組成物群（ＰＨＡ+ＫＬＨ+ＧＭＩ）はＰＨＡ、ＫＬＨ、ＧＭＩを単独で投与した群よりもＡ５４９細胞に対する毒殺現象はより顕著で且つ明らかに異なっており、肺がんの細胞を死滅させる現象がより顕著となり、肺がんの治療においてより効果的であったことを示している。図２Ｅの低用量群処置の結果と比較して、図２Ｆの高用量群の結果では、医薬組成物群の用量を増やした時、肺がん細胞が死滅する現象はより顕著になったことを示している。図２Ｅ及び図２Ｆにおいて、*は２群間の比較、Ｐ<０.０５、**は２群間の比較、Ｐ<０.０１、***は２群間の比較、Ｐ<０.００１を示し、各実験では３回の独立した実験が行われ、エラーバーは平均の標準誤差（ｓｔａｎｄａｒｄ ｅｒｒｏｒ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅａｎ，ＳＥＭ）を示す。

Ａ５４９+ＰＢＭＣ処置群に関して：

ＰＢＭＣを１Ｘ １０^７個の細胞で１ｍＬの細胞培地に懸濁させて、０.１ｍＬを２４ウェルプレートに加える。また、異なる群毎にそれぞれ（１）ＰＨＡが混合されている細胞培地（ＰＨＡ群）０.２ｍＬ、（２）ＫＬＨが混合されている細胞培地（ＫＬＨ群）０.２ｍＬ、（３）ＧＭＩが混合されている細胞培地（ＧＭＩ群）０.２ｍＬ、（４）ＰＨＡ、ＫＬＨ及びＧＭＩが混合されている細胞培地（医薬組成物群）０.２ｍＬを２４ウェルプレート中に加える（ウェル内には５ｘ１０^５個のＡ５４９細胞が注入済みである）。ここでは、ヒトの末梢血細胞と腫瘍細胞の比率を２：１にすることで、ヒトの体内での腫瘍の状態を再現している。２４ウェルプレートを３７℃/５％ ＣＯ_２インキュベータ中で２４時間培養した後、上清液をマイクロチューブ中に収集し、各ウェル中にＤＰＢＳ ０.４ ｍＬを加えて細胞を洗浄した後、洗浄後の上清液をマイクロチューブに回収して、ＤＰＢＳ ０.３ ｍＬを再び加えて、顕微鏡で観察するとともに撮影した。図２Ａ及び図２ＢのＰＢＭＣが加えられている群（図中はＰＢＭＣ+ＰＨＡ群、ＰＢＭＣ+ＫＬＨ群、ＰＢＭＣ+ＧＭＩ群、ＰＢＭＣ+医薬組成物群を示す）を再度参照されたい。顕微鏡で観察した結果は、ＰＢＭＣ+ＰＨＡ群及びＰＢＭＣ+ＫＬＨ群では、高用量でも低用量でも、対照群に比べて付着細胞数はあまり変化しておらず、つまりこの２つの処置はＡ５４９細胞に対する毒殺効果は大きくないことを示している。一方では、対照群に比べてＰＢＭＣ+ＧＭＩ群及びＰＢＭＣ+医薬組成物群では、付着細胞数は明らかに減少していることから、この２つの処置はＡ５４９細胞に対して毒殺効果を持つことが示されたことになる。

撮影後、ＤＰＢＳ ０.３ｍＬをマイクロチューブに収集し、各ウェルにＡｃｃｕｔａｓｅ^ＴＭ細胞分離液２００μＬを細胞が隠れるように加え 、３７℃で２分間処置して２４ウェルプレートから細胞を剥離させ、前に回収した上清液で洗浄し、細胞をマイクロチューブに収集し、最後に７-ＡＡＤを４℃で１０分間染色した。その後、フローサイトメーターで分析を行うが、フローサイトメーターの設定方式、分析方法、細胞毒殺率の計算方式についてはすでに詳細に説明しているので、ここでは別途説明しない。

図２Ｃから図２Ｆを再度参照されたい。図２Ｃ中（図中は、ＰＢＭＣ+ＰＨＡ群、ＰＢＭＣ+ＫＬＨ群、ＰＢＭＣ+ＧＭＩ群、ＰＢＭＣ+医薬組成物群を示している）では、ＰＢＭＣがある処置状況にて、同時に低用量で投与する処置を行うことで、フローサイトメーターで１回実験で得られた対照群、ＰＢＭＣ+ＰＨＡ群、ＰＢＭＣ+ＫＬＨ群、ＰＢＭＣ+ＧＭＩ群、ＰＢＭＣ+医薬組成物群の細胞毒殺率はそれぞれ０.９％、４.７％、２.７％、１８.６％、２２.５％であった。図２Ｅに示すように、ＰＢＭＣがある処置状況で、同時に低用量で投与する処置にて、フローサイトメーターを用いて３回実験を繰り返して行い統計して得られた細胞毒殺率の結果では、ＰＨＡ群は肺がん細胞に対して部分的に毒殺作用を示し、ＫＬＨ群は肺がん細胞に対する毒殺効果は大きくなかった。ＧＭＩ群は肺がん細胞に対する毒殺効果が優れており、そして医薬組成物群は肺がん細胞に対する毒殺効果はＧＭＩ群よりも顕著であることから、ＰＢＭＣがある状況で、医薬組成物群（ＰＨＡ+ＫＬＨ+ＧＭＩ）はＰＨＡ、ＫＬＨ、ＧＭＩを単独で投与した群よりもＡ５４９細胞に対する毒殺現象はより顕著で且つ明らかに異なっており、肺がんの細胞を死滅させる現象がより顕著となり、肺がんの治療により効果的であったことを示している。また、図２Ｄ中（図中、ＰＢＭＣ+ＰＨＡ群、ＰＢＭＣ+ＫＬＨ群、ＰＢＭＣ+ＧＭＩ群、ＰＢＭＣ+医薬組成物群を示している）では、ＰＢＭＣがある処置状況にて、同時に高用量の処置を行うことで、フローサイトメーターで１回実験で得られた対照群、ＰＢＭＣ+ＰＨＡ群、ＰＢＭＣ+ＫＬＨ群、ＰＢＭＣ+ＧＭＩ群及びＰＢＭＣ+医薬組成物群の細胞毒殺率はそれぞれ０.９％、１３.９％、４.７％、４８.６％及び５５％であった。図２Ｆの結果が示すように、ＰＢＭＣがある処置状況で、同時に高用量で投与する処置にて、フローサイトメーターを用いて３回実験を繰り返して行い統計して得られた細胞毒殺率の結果では、ＰＨＡ群は肺がん細胞に対して部分的に毒殺作用を示し、ＫＬＨ群は肺がん細胞に対する毒殺効果は大きくなかった。ＧＭＩ群は肺がん細胞に対する毒殺効果が優れており、そして医薬組成物群は肺がん細胞にもたらす毒殺現象はＧＭＩ群よりも顕著であることから、医薬組成物群（ＰＨＡ+ＫＬＨ+ＧＭＩ）はＰＨＡ、ＫＬＨ、ＧＭＩを単独で投与した群よりもＡ５４９細胞に対する毒殺現象はより顕著で且つ明らかに異なっており、肺がんの細胞を死滅させる現象がより顕著となり、肺がんの治療においてより効果的であったことを示している。ＰＢＭＣがある状況では、図２Ｅの低用量群処置の結果と比較して、図２Ｆの高用量群の結果では、医薬組成物群の用量を増やした時、肺がん細胞が死滅する現象はより顕著になったことを示している。

本発明の医薬組成物は、Ａ５４９細胞を毒殺することに共働作用を有する：

２種類以上の薬剤が生物活性に対する作用は、（１）共働作用（ｓｙｎｅｒｇｉｓｍ）、（２）相加作用（ａｄｄｉｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔ）、（３）拮抗作用（ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ）の３種類がある。Ｃｈｏｕ ＴＣらの、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｄｏｓｅ-ｅｆｆｅｃｔ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ： ｔｈｅ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｄｒｕｇｓ ｏｒ ｅｎｚｙｍｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ, Ａｄｖ Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇｕｌ, Ｖｏｌ. ２２, １９８４, ｐｐ.２７～５５の文献及びＬｉａｎｇ Ｚｈａｏらの、ＡｕＥｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ： Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ, Ｃｕｒｖｅ Ｓｈｉｆｔ, Ｉｓｏｂｏｌｏｇｒａｍ, ａｎｄ Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ Ｉｎｄｅｘ Ａｎａｌｙｓｉｓ, Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ, Ｖｏｌ. １０, ２００４, ｐｐ.７９９４～８００４の文献で提案されている薬物併用効果指数（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｉｎｄｅｘ，ＣＩ）は、２つの薬剤の相互作用を分析・評価するために用いることができ、その評価の計算公式は以下の通りである：ＣＩ＝Ｃ_Ａ,ｘ / ＩＣ_ｘ,Ａ + Ｃ_Ｂ,ｘ / ＩＣ_ｘ,Ｂ、式中Ｃ_Ａ,ｘ及びＣ_Ｂ,ｘは２つの薬剤Ａ、Ｂを併用してｘ％の効果が得られた時の個別の薬剤濃度であり、ＩＣ_ｘ,Ａ及びＩＣ_ｘ,Ｂは１つの薬物を単独で使用してｘ％の効果が得られた時の薬剤濃度である。計算結果によると、２つの薬剤の組み合わせは、ＣＩ値が＜１の場合は共働作用、ＣＩ値＝１の場合は相加作用、ＣＩ値が＞１の場合は拮抗作用があった。

本実験例では、フローサイトメーターを用いて３回実験を繰り返して行い統計して得られた細胞毒殺率の結果は図２Ｅ及び図２Ｆに示すように、対照群Ａ５４９の細胞毒殺率は０.９７％であるが、もし１０μｇ/ｍＬのＰＨＡ、１００μｇ/ｍＬのＫＬＨ又は２０μｇ/ｍＬのＧＭＩのみを単独で使用した場合、Ａ５４９細胞に対する毒殺率はそれぞれ５.２３％、２.３％及び９.２３％であった。医薬組成物群（１０μｇ/ｍＬのＰＨＡ+１００μｇ/ｍＬのＫＬＨ+２０μｇ/ｍＬのＧＭＩ）の一部では、Ａ５４９細胞に対する毒殺率は１７.２８％であった。また、２０μｇ/ｍＬのＰＨＡ、２００μｇ/ｍＬのＫＬＨ或は２００μｇ/ｍＬのＧＭＩのみを単独で使用した場合、Ａ５４９細胞に対する毒殺率はそれぞれ１１.８３％、１.７％及び２３.８３％であった。医薬組成物群（２０μｇ/ｍＬのＰＨＡ+２００μｇ/ｍＬのＫＬＨ+２００μｇ/ｍＬのＧＭＩ）の一部分では、Ａ５４９細胞に対する毒殺率は４０.５３％であった。これら数値を用いて、ＰＨＡ、ＫＬＨ及びＧＭＩの細胞毒殺をそれぞれ算出する一次方程式を用いて、低用量医薬組成物群（１０μｇ/ｍＬのＰＨＡ+１００μｇ/ｍＬのＫＬＨ+２０μｇ/ｍＬのＧＭＩ）でのＡ５４９細胞に対する毒殺率が１７.２８％であることを例として、１７.２８％をそれぞれＰＨＡ、ＫＬＨ及びＧＭＩの一次方程式のｙ値中に代入すると、それぞれＩＣｘ,ＰＨＡ=２７.６２、ＩＣｘ,ＫＬＨ=１５５７.４２及びＩＣｘ,ＧＭＩ=１１７.０５が得られて、更に３つの薬物併用効果指数（ＣＩ）を計算すると、ＣＩ=（１０/２７.６２）+（１００/１５５７.４２）+（２０/１１７.０５）=０.６で、結果は<１となることから、低用量時には、医薬組成物群はＡ５４９細胞を毒殺することに共働作用を有するということを示している。同様の方式で高用量を算出した時、ＣＩ値＝０.８８で、結果は<１となり、高用量の医薬組成物群はＡ５４９細胞を毒殺することにも同様に共働作用を有するということを示している。一方、ＰＢＭＣがある状況で、低用量医薬組成物群ＣＩ値＝０.４１、高用量医薬組成物群ＣＩ値＝０.９６、結果はいずれも<１となり、ＰＢＭＣがある状況で、ＰＨＡ、ＫＬＨ又はＧＭＩを単独で使用するものと比べて、低用量又は高用量の医薬組成物群に関わらず、共働作用を有する。

実験例３：ＭＤＡ-ＭＢ-２３１細胞（ヒト乳腺がん細胞）に対するＰＨＡ、ＫＬＨ、ＧＭＩ及び医薬組成物の影響

本実験例のＭＤＡ-ＭＢ-２３１細胞の実験方法は実験例２と同じであって、相違点がＡ５４９細胞の代わりにＭＤＡ-ＭＢ-２３１細胞に変えたのみで、同じ実験を行ったことから、実験の詳細な手順はここでは別途説明しない。

ＭＤＡ-ＭＢ-２３１細胞処置群の実験結果に関して：

図３Ａ及び図３Ｂを参照されたい。図３Ａ及び図３Ｂは、本発明の医薬組成物、ＰＨＡ、ＫＬＨ及びＧＭＩで処置したヒト乳腺がん細胞（ＭＤＡ-ＭＢ-２３１細胞）を光学顕微鏡で観察した研究結果を示す写真である。図３Ａは低用量処置の群、図３Ｂは高用量処置の群を示す。図３Ａでは、ＰＨＡ群は１０μｇ/ｍＬのＰＨＡ、ＫＬＨ群は１００μｇ/ｍＬのＫＬＨ、ＧＭＩ群は２０μｇ/ｍＬのＧＭＩ、そして医薬組成物群は１０μｇ/ｍＬのＰＨＡ＋１００μｇ/ｍＬのＫＬＨ＋２０μｇ/ｍＬのＧＭＩである。図３Ｂでは、ＰＨＡ群は２０μｇ/ｍＬのＰＨＡ、ＫＬＨ群は２００μｇ/ｍＬのＫＬＨ、ＧＭＩ群は２００μｇ/ｍＬのＧＭＩ、そして医薬組成物群は２０μｇ/ｍＬのＰＨＡ＋２００μｇ/ｍＬのＫＬＨ＋２００μｇ/ｍＬのＧＭＩである。顕微鏡で観察した結果は、ＰＨＡ群とＫＬＨ群とでは、高用量でも低用量でも、対照群に比べて付着細胞数はあまり変化しておらず、つまりこの２つの処置はＭＤＡ-ＭＢ-２３１細胞に対する毒殺効果は大きくないことを示している。一方では、対照群に比べてＧＭＩ群と医薬組成物群では、付着細胞数は明らかに減少していることから、この２つの処置はＭＤＡ-ＭＢ-２３１細胞に対して毒殺効果を持つことが示されたことになる。

図３Ｃから図３Ｆを参照されたい。図３Ｃ及び図３Ｅでは、ＰＨＡ群は１０μｇ/ｍＬのＰＨＡ、ＫＬＨ群は１００μｇ/ｍＬのＫＬＨ、ＧＭＩ群は２０μｇ/ｍＬのＧＭＩ、医薬組成物群は１０μｇ/ｍＬのＰＨＡ＋１００μｇ/ｍＬのＫＬＨ＋２０μｇ/ｍＬのＧＭＩである。図３Ｄ及び図３Ｆでは、ＰＨＡ群は２０μｇ/ｍＬのＰＨＡ、ＫＬＨ群は２００μｇ/ｍＬのＫＬＨ、ＧＭＩ群は２００μｇ/ｍＬのＧＭＩ、医薬組成物群は２０μｇ/ｍＬのＰＨＡ＋２００μｇ/ｍＬのＫＬＨ＋２００μｇ/ｍＬのＧＭＩとなっている。図３Ｃに示すように、対照群、ＰＨＡ群、ＫＬＨ群、ＧＭＩ群、医薬組成物群のフローサイトメーターによる１回の反復実験で得られた細胞毒殺率は、それぞれ１.８%、５.４%、２.８%、４４.７%及び５４.５%であった。図３Ｅに示すように、低用量の処置でのフローサイトメーターを用いて３回実験を繰り返して行い統計して得られた細胞毒殺率の結果では、ＰＨＡ群及びＫＬＨ群は乳腺がん細胞に対する毒殺効果は大きくなかった。ＧＭＩ群は乳腺がん細胞に対する毒殺効果が優れており、そして医薬組成物群は乳腺がん細胞に対する毒殺効果はＧＭＩ群よりも顕著であることから、医薬組成物群（ＰＨＡ+ＫＬＨ+ＧＭＩ）はＰＨＡ、ＫＬＨ、ＧＭＩを単独で投与した群よりもＭＤＡ-ＭＢ-２３１細胞に対する毒殺現象はより顕著で且つ明らかに異なっており、乳腺がんの細胞を死滅させる現象がより顕著となり、乳腺がんの治療においてより効果的であったことを示している。また、図３Ｄの高用量群において、フローサイトメーターによる１回実験で得られた対照群、ＰＨＡ群、ＫＬＨ群、ＧＭＩ群、医薬組成物群の細胞毒殺率はそれぞれ１.８%、１４.７%、３.０%、４０.８%及び５５.７%であった。図３Ｆの結果が示すように、高用量の処置にて、フローサイトメーターを用いて３回実験を繰り返して行い統計して得られた細胞毒殺率の結果では、ＰＨＡ群は乳腺がん細胞に対して部分的に毒殺作用を示し、ＫＬＨ群は乳腺がん細胞に対する毒殺効果は大きくなかった。ＧＭＩ群は乳腺がん細胞に対する毒殺効果が優れており、そして医薬化合物群は乳腺がん細胞に対する毒殺効果はＧＭＩ群よりも顕著であることから、医薬組成物群（ＰＨＡ+ＫＬＨ+ＧＭＩ）はＰＨＡ、ＫＬＨ、ＧＭＩを単独で投与した群よりもＭＤＡ-ＭＢ-２３１細胞に対する毒殺現象はより顕著で且つ明らかに異なっており、乳腺がんの細胞を死滅させる現象がより顕著となり、乳腺がんの治療においてより効果的であったことを示している。図３Ｅの低用量群処置の結果と比較して、図３Ｆの高用量群の結果では、医薬組成物群の用量を増やした時、乳腺がん細胞が死滅する現象はより顕著になったことを示している。図３Ｅ及び図３Ｆにおいて、*は２群間の比較、Ｐ<０.０５、***は２群間の比較、Ｐ<０.００１を示し、各実験では３回の独立した実験が行われ、エラーバーは平均の標準誤差を示す。

ＭＤＡ-ＭＢ-２３１+ＰＢＭＣ処置群の実験結果に関して：

図３Ａ及び図３ＢのＰＢＭＣが加えられている群（ＰＢＭＣ+ＰＨＡ群、ＰＢＭＣ+ＫＬＨ群、ＰＢＭＣ+ＧＭＩ群、ＰＢＭＣ+医薬組成物群を示す）を再度参照されたい。顕微鏡で観察した結果は、ＰＢＭＣ+ＰＨＡ群及びＰＢＭＣ+ＫＬＨ群では、高用量でも低用量でも、対照群に比べて付着細胞数はあまり変化しておらず、つまりこの２つの処置はＭＤＡ-ＭＢ-２３１細胞に対する毒殺効果は大きくないことを示している。一方では、対照群に比べてＰＢＭＣ+ＧＭＩ群及びＰＢＭＣ+医薬組成物群では、付着細胞数は明らかに減少していることから、この２つの処置はＭＤＡ-ＭＢ-２３１細胞に対して毒殺効果を持つことが示されたことになる。

図３Ｃから図３Ｆを再度参照されたい。図３Ｃ中（図中、ＰＢＭＣ+ＰＨＡ群、ＰＢＭＣ+ＫＬＨ群、ＰＢＭＣ+ＧＭＩ群、ＰＢＭＣ+医薬組成物群を示している）では、ＰＢＭＣがある処置状況にて、同時に低用量で投与する処置を行うことで、フローサイトメーターで１回実験で得られた対照群、ＰＢＭＣ+ＰＨＡ群、ＰＢＭＣ+ＫＬＨ群、ＰＢＭＣ+ＧＭＩ群及びＰＢＭＣ+医薬組成物群の細胞毒殺率はそれぞれ１.８%、３２.４%、４.４%、６４.４%及び７３.０%であった。図３Ｅに示すように、ＰＢＭＣがある処置状況で、同時に低用量で投与する処置にて、フローサイトメーターを用いて３回実験を繰り返して行い統計して得られた細胞毒殺率の結果では、ＰＨＡ群は乳腺がん細胞に対して部分的に毒殺作用を示し、ＫＬＨ群は乳腺がん細胞に対する毒殺効果は大きくなかった。ＧＭＩ群は乳腺がん細胞に対する毒殺効果が優れており、そして医薬組成物群は乳腺がん細胞に対する毒殺効果はＧＭＩ群よりも顕著であることから、ＰＢＭＣがある状況で、医薬組成物群（ＰＨＡ+ＫＬＨ+ＧＭＩ）はＰＨＡ、ＫＬＨ、ＧＭＩを単独で投与した群よりもＭＤＡ-ＭＢ-２３１細胞に対する毒殺現象はより顕著で且つ明らかに異なっており、乳腺がんの細胞を死滅させる現象がより顕著となり、乳腺がんの治療においてより効果的であったことを示している。また、図３Ｄ中（図中、ＰＢＭＣ+ＰＨＡ群、ＰＢＭＣ+ＫＬＨ群、ＰＢＭＣ+ＧＭＩ群、ＰＢＭＣ+医薬組成物群を示している）では、ＰＢＭＣがある処置状況にて、同時に高用量の処置を行うことで、フローサイトメーターによる１回実験で得られた対照群、ＰＢＭＣ+ＰＨＡ群、ＰＢＭＣ+ＫＬＨ群、ＰＢＭＣ+ＧＭＩ群及びＰＢＭＣ+医薬組成物群の細胞毒殺率はそれぞれ１.８%、４８.５%、４.３%、５９.０%及び６４.７%であった。図３Ｆの結果が示すように、ＰＢＭＣがある処置状況で、同時に高用量で投与する処置にて、フローサイトメーターを用いて３回実験を繰り返して行い統計して得られた細胞毒殺率の結果では、ＰＨＡ群は乳腺がん細胞に対して部分的に毒殺作用を示し、ＫＬＨ群は乳腺がん細胞に対する毒殺効果は大きくなかった。ＧＭＩ群は乳腺がん細胞に対する毒殺効果が優れており、そして医薬組成物群は乳腺がん細胞にもたらす毒殺現象はＧＭＩ群よりも顕著であることから、医薬組成物群（ＰＨＡ+ＫＬＨ+ＧＭＩ）はＰＨＡ、ＫＬＨ、ＧＭＩを単独で投与した群よりもＭＤＡ-ＭＢ-２３１細胞に対する毒殺現象はより顕著で且つ明らかに異なっており、乳腺がんの細胞を死滅させる現象がより顕著となり、乳腺がんの治療においてより効果的であったことを示している。

本発明の医薬組成物は、ＭＤＡ-ＭＢ-２３１細胞を毒殺することに共働作用を有する：

本実験例にて、ＰＢＭＣがない状況では、低用量医薬組成物群ＣＩ値＝０.２１であって、ＰＢＭＣがある状況では、低用量医薬組成物群ＣＩ値＝０.４５であって、結果はいずれも<１となり、ＰＢＭＣがある又はない状況に関わらず、ＰＨＡ、ＫＬＨ又はＧＭＩを単独で使用するものと比べて、低用量の医薬組成物群はＭＤＡ-ＭＢ-２３１細胞を毒殺することに共働作用を有する。

実験例４：Ｔ２４細胞（ヒト膀胱がん細胞）に対するＰＨＡ、ＫＬＨ、ＧＭＩ及び医薬組成物の影響

本実験例のＴ２４細胞の実験方法は実験例２と同じであって、相違点がＡ５４９細胞の代わりにＴ２４細胞に変えたのみで、同じ実験を行ったことから、実験の詳細な手順はここでは別途説明しない。

Ｔ２４細胞処置群の実験結果に関して：

図４Ａ及び図４Ｂを参照されたい。図４Ａ及び図４Ｂは、本発明の医薬組成物、ＰＨＡ、ＫＬＨ及びＧＭＩで処置したヒト膀胱がん細胞（Ｔ２４細胞）を光学顕微鏡で観察した研究結果を示す写真である。図４Ａは低用量処置の群、図４Ｂは高用量処置の群を示す。図４Ａでは、ＰＨＡ群は１０μｇ/ｍＬのＰＨＡ、ＫＬＨ群は１００μｇ/ｍＬのＫＬＨ、ＧＭＩ群は２０μｇ/ｍＬのＧＭＩ、そして医薬組成物群は１０μｇ/ｍＬのＰＨＡ＋１００μｇ/ｍＬのＫＬＨ＋２０μｇ/ｍＬのＧＭＩである。図４Ｂでは、ＰＨＡ群は２０μｇ/ｍＬのＰＨＡ、ＫＬＨ群は２００μｇ/ｍＬのＫＬＨ、ＧＭＩ群は２００μｇ/ｍＬのＧＭＩ、そして医薬組成物群は２０μｇ/ｍＬのＰＨＡ＋２００μｇ/ｍＬのＫＬＨ＋２００μｇ/ｍＬのＧＭＩである。顕微鏡で観察した結果は、ＰＨＡ群とＫＬＨ群とでは、高用量でも低用量でも、対照群に比べて付着細胞数はあまり変化しておらず、つまりこの２つの処置はＴ２４細胞に対する毒殺効果は大きくないことを示している。一方では、対照群に比べてＧＭＩ群と医薬組成物群では、付着細胞数は明らかに減少していることから、この２つの処置はＴ２４細胞に対して毒殺効果を持つことが示されたことになる。

図４Ｃから図４Ｆを参照されたい。図４Ｃ及び図４Ｅでは、ＰＨＡ群は１０μｇ/ｍＬのＰＨＡ、ＫＬＨ群は１００μｇ/ｍＬのＫＬＨ、ＧＭＩ群は２０μｇ/ｍＬのＧＭＩ、医薬組成物群は１０μｇ/ｍＬのＰＨＡ＋１００μｇ/ｍＬのＫＬＨ＋２０μｇ/ｍＬのＧＭＩである。図４Ｄ及び図４Ｆでは、ＰＨＡ群は２０μｇ/ｍＬのＰＨＡ、ＫＬＨ群は２００μｇ/ｍＬのＫＬＨ、ＧＭＩ群は２００μｇ/ｍＬのＧＭＩ、医薬組成物群は２０μｇ/ｍＬのＰＨＡ＋２００μｇ/ｍＬのＫＬＨ＋２００μｇ/ｍＬのＧＭＩとなっている。図４Ｃに示すように、対照群、ＰＨＡ群、ＫＬＨ群、ＧＭＩ群、医薬組成物群のフローサイトメーターによる１回実験で得られた細胞毒殺率は、それぞれ３.１%、２２.１%、２.８%、５０.２%及び６６.９%であった。図４Ｅに示すように、低用量の処置にて、フローサイトメーターを用いて３回実験を繰り返して行い統計して得られた細胞毒殺率の結果では、ＰＨＡ群は膀胱がん細胞に対して部分的に毒殺作用を示し、ＫＬＨ群は膀胱がん細胞に対する毒殺効果は大きくなかった。ＧＭＩ群は膀胱がん細胞に対する毒殺効果が優れており、そして医薬組成物群は膀胱がん細胞に対する毒殺効果はＧＭＩ群よりも顕著であることから、医薬組成物群（ＰＨＡ+ＫＬＨ+ＧＭＩ）はＰＨＡ、ＫＬＨ、ＧＭＩを単独で投与した群よりもＴ２４細胞に対する毒殺現象はより顕著で且つ明らかに異なっており、膀胱がんの細胞を死滅させる現象がより顕著となり、膀胱がんの治療においてより効果的であったことを示している。また、図４Ｄの高用量群において、フローサイトメーターによる１回実験で得られた対照群、ＰＨＡ群、ＫＬＨ群、ＧＭＩ群及び医薬組成物群の細胞毒殺率はそれぞれ３.１％、３９.４%、５.９%、６１.９%及び７５.５%であった。図４Ｆの結果が示すように、高用量の処置にて、フローサイトメーターを用いて３回実験を繰り返して行い統計して得られた細胞毒殺率の結果では、ＰＨＡ群は膀胱がん細胞に対して部分的に毒殺作用を示し、ＫＬＨ群は膀胱がん細胞に対する毒殺効果は大きくなかった。ＧＭＩ群は膀胱がん細胞に対する毒殺効果が優れており、そして医薬組成物群は膀胱がん細胞に対する毒殺効果はＧＭＩ群よりも顕著であることから、医薬組成物群（ＰＨＡ+ＫＬＨ+ＧＭＩ）はＰＨＡ、ＫＬＨ、ＧＭＩを単独で投与した群よりもＴ２４細胞に対する毒殺現象はより顕著で且つ明らかに異なっており、膀胱がんの細胞を死滅させる現象がより顕著となり、膀胱がんの治療においてより効果的であったことを示している。図４Ｅの低用量群処置の結果と比較して、図４Ｆの高用量群の結果では、医薬組成物群の用量を増やした時、膀胱がん細胞が死滅する現象はより顕著になったことを示している。図４Ｅ及び図４Ｆにおいて、*は２群間の比較、Ｐ<０.０５、**は２群間の比較、Ｐ<０.０１、***は２群間の比較、Ｐ<０.００１を示し、各実験では３回の独立した実験が行われ、エラーバーは平均の標準誤差を示す。

Ｔ２４+ＰＢＭＣ処置群の実験結果に関して：

図４Ａ及び図４ＢのＰＢＭＣが加えられている群（ＰＢＭＣ+ＰＨＡ群、ＰＢＭＣ+ＫＬＨ群、ＰＢＭＣ+ＧＭＩ群、ＰＢＭＣ+医薬組成物群を示す）を再度参照されたい。顕微鏡で観察した結果は、ＰＢＭＣ+ＰＨＡ群及びＰＢＭＣ+ＫＬＨ群では、高用量でも低用量でも、対照群に比べて付着細胞数はあまり変化しておらず、つまりこの２つの処置はＴ２４細胞に対する毒殺効果は大きくないことを示している。一方では、対照群に比べてＰＢＭＣ+ＧＭＩ群及びＰＢＭＣ+医薬組成物群では、付着細胞数は明らかに減少していることから、この２つの処置はＴ２４細胞に対して毒殺効果を持つことが示されたことになる。

図４Ｃから図４Ｆを再度参照されたい。図４Ｃ中（図中、ＰＢＭＣ+ＰＨＡ群、ＰＢＭＣ+ＫＬＨ群、ＰＢＭＣ+ＧＭＩ群、ＰＢＭＣ+医薬組成物群を示している）では、ＰＢＭＣがある処置状況にて、同時に低用量で投与する処置を行うことで、フローサイトメーターによる１回実験で得られた対照群、ＰＢＭＣ+ＰＨＡ群、ＰＢＭＣ+ＫＬＨ群、ＰＢＭＣ+ＧＭＩ群、ＰＢＭＣ+医薬組成物群の細胞毒殺率はそれぞれ３.１%、２８%、５.０%、６２.３%及び６８.５%であった。図４Ｅに示すように、ＰＢＭＣがある処置状況で、同時に低用量で投与する処置にて、フローサイトメーターを用いて３回実験を繰り返して行い統計して得られた細胞毒殺率の結果では、ＰＨＡ群は膀胱がん細胞に対して部分的に毒殺作用を示し、ＫＬＨ群は膀胱がん細胞に対する毒殺効果は大きくなかった。ＧＭＩ群は膀胱がん細胞に対する毒殺効果が優れており、そして医薬組成物群は膀胱がん細胞に対する毒殺効果はＧＭＩ群よりも顕著であることから、ＰＢＭＣがある状況で、医薬組成物群（ＰＨＡ+ＫＬＨ+ＧＭＩ）はＰＨＡ、ＫＬＨ、ＧＭＩを単独で投与した群よりもＴ２４細胞に対する毒殺現象はより顕著で且つ明らかに異なっており、膀胱がんの細胞を死滅させる現象がより顕著となり、膀胱がんの治療においてより効果的であったことを示している。また、図４Ｄ中（図中、ＰＢＭＣ+ＰＨＡ群、ＰＢＭＣ+ＫＬＨ群、ＰＢＭＣ+ＧＭＩ群、ＰＢＭＣ+医薬組成物群を示している）では、ＰＢＭＣがある処置状況にて、同時に高用量の処置を行うことで、フローサイトメーターによる１回実験で得られた対照群、ＰＢＭＣ+ＰＨＡ群、ＰＢＭＣ+ＫＬＨ群、ＰＢＭＣ+ＧＭＩ群及びＰＢＭＣ+医薬組成物群の細胞毒殺率はそれぞれ３.１%、４０.９%、６.９%、８０.８%及び８４.０%であった。図４Ｆの結果が示すように、ＰＢＭＣがある処置状況で、同時に高用量で投与する処置にて、フローサイトメーターを用いて３回実験を繰り返して行い統計して得られた細胞毒殺率の結果では、ＰＨＡ群は膀胱がん細胞に対して部分的に毒殺作用を示し、ＫＬＨ群は膀胱がん細胞に対する毒殺効果は大きくなかった。ＧＭＩ群は膀胱がん細胞に対する毒殺効果が優れており、そして医薬組成物群は膀胱がん細胞にもたらす毒殺現象はＧＭＩ群よりも顕著であることから、医薬組成物群（ＰＨＡ+ＫＬＨ+ＧＭＩ）はＰＨＡ、ＫＬＨ、ＧＭＩを単独で投与した群よりもＴ２４細胞に対する毒殺現象はより顕著で且つ明らかに異なっており、膀胱がんの細胞を死滅させる現象がより顕著となり、膀胱がんの治療においてより効果的であったことを示している。ＰＢＭＣがある状況では、図４Ｅの低用量群処置の結果と比較して、図４Ｆの高用量群の結果では、医薬組成物群の用量を増やした時、膀胱がん細胞が死滅する現象はより顕著になったことを示している。

本発明の医薬組成物は、Ｔ２４細胞を毒殺することに共働作用を有する：

本実験例にて、ＰＢＭＣがない状況では、低用量医薬組成物群ＣＩ値＝０.５３であって、ＰＢＭＣがある状況では、低用量医薬組成物群ＣＩ値＝０.５６であって、結果はいずれも<１となり、ＰＢＭＣがある又はない状況に関わらず、ＰＨＡ、ＫＬＨ又はＧＭＩを単独で使用するものと比べて、低用量の医薬組成物群はＴ２４細胞を毒殺することに共働作用を有する。

実験例５：ＢｘＰＣ-３細胞（ヒトすい臓がん細胞）に対するＰＨＡ、ＫＬＨ、ＧＭＩ及び医薬組成物の影響

本実験例のＢｘＰＣ-３細胞の実験方法は実験例２と同じであって、相違点がＡ５４９細胞の代わりにＢｘＰＣ-３細胞に変えたのみで、同じ実験を行ったことから、実験の詳細な手順はここでは別途説明しない。

ＢｘＰＣ-３細胞処置群の実験結果に関して：

図５Ａ及び図５Ｂを参照されたい。図５Ａ及び図５Ｂは、本発明の医薬組成物、ＰＨＡ、ＫＬＨ、ＧＭＩで処置したヒトすい臓がん細胞（ＢｘＰＣ-３細胞）を光学顕微鏡で観察した研究結果を示す写真である。図５Ａは低用量処置の群、図５Ｂは高用量処置の群を示す。図５Ａでは、ＰＨＡ群は１０μｇ/ｍＬのＰＨＡ、ＫＬＨ群は１００μｇ/ｍＬのＫＬＨ、ＧＭＩ群は２０μｇ/ｍＬのＧＭＩ、そして医薬組成物群は１０μｇ/ｍＬのＰＨＡ＋１００μｇ/ｍＬのＫＬＨ＋２０μｇ/ｍＬのＧＭＩである。図５Ｂでは、ＰＨＡ群は２０μｇ/ｍＬのＰＨＡ、ＫＬＨ群は２００μｇ/ｍＬのＫＬＨ、ＧＭＩ群は２００μｇ/ｍＬのＧＭＩ、そして医薬組成物群は２０μｇ/ｍＬのＰＨＡ＋２００μｇ/ｍＬのＫＬＨ＋２００μｇ/ｍＬのＧＭＩである。顕微鏡で観察した結果は、ＰＨＡ群とＫＬＨ群とでは、高用量でも低用量でも、対照群に比べて付着細胞数はあまり変化しておらず、つまりこの２つの処置はＢｘＰＣ-３細胞に対する毒殺効果は大きくないことを示している。一方では、対照群に比べてＧＭＩ群と医薬組成物群では、付着細胞数は明らかに減少していることから、この２つの処置はＢｘＰＣ-３細胞に対して毒殺効果を持つことが示されたことになる。

図５Ｃから図５Ｆを参照されたい。図５Ｃ及び図５Ｅでは、ＰＨＡ群は１０μｇ/ｍＬのＰＨＡ、ＫＬＨ群は１００μｇ/ｍＬのＫＬＨ、ＧＭＩ群は２０μｇ/ｍＬのＧＭＩ、医薬組成物群は、１０μｇ/ｍＬのＰＨＡ＋１００μｇ/ｍＬのＫＬＨ＋２０μｇ/ｍＬのＧＭＩである。図５Ｄ及び図５Ｆでは、ＰＨＡ群は２０μｇ/ｍＬのＰＨＡ、ＫＬＨ群は２００μｇ/ｍＬのＫＬＨ、ＧＭＩ群は２００μｇ/ｍＬのＧＭＩ、医薬組成物群は２０μｇ/ｍＬのＰＨＡ＋２００μｇ/ｍＬのＫＬＨ＋２００μｇ/ｍＬのＧＭＩとなっている。図５Ｃに示すように、対照群、ＰＨＡ群、ＫＬＨ群、ＧＭＩ群、医薬組成物群のフローサイトメーターによる１回実験で得られた細胞毒殺率は、それぞれ７.０%、７.９%、５.２%、１４.３%及び２５%であった。図５Ｅに示すように、低用量の処置でのフローサイトメーターを用いて３回実験を繰り返して行い統計して得られた細胞毒殺率の結果では、ＰＨＡ群及びＫＬＨ群はすい臓がん細胞に対する毒殺効果は大きくなかった。ＧＭＩ群はすい臓がん細胞に対する毒殺効果が優れており、そして医薬組成物群はすい臓がん細胞に対する毒殺効果はＧＭＩ群よりも顕著であることから、医薬組成物群（ＰＨＡ+ＫＬＨ+ＧＭＩ）はＰＨＡ、ＫＬＨ、ＧＭＩを単独で投与した群よりもＢｘＰＣ-３細胞に対する毒殺現象はより顕著で且つ明らかに異なっており、すい臓がんの細胞を死滅させる現象がより顕著となり、すい臓がんの治療においてより効果的であったことを示している。また、図５Ｄの高用量群において、フローサイトメーターによる１回実験で得られた対照群、ＰＨＡ群、ＫＬＨ群、ＧＭＩ群及び医薬組成物群の細胞毒殺率はそれぞれ７．０％、１２.５%、６.３%、４７.２%及び６０.９%であった。図５Ｆの結果が示すように、高用量の処置にて、フローサイトメーターを用いて３回実験を繰り返して行い統計して得られた細胞毒殺率の結果では、ＰＨＡ群はすい臓がん細胞に対して部分的に毒殺作用を示し、ＫＬＨ群はすい臓がん細胞に対する毒殺効果は大きくなかった。ＧＭＩ群はすい臓がん細胞に対する毒殺効果が優れており、そして医薬組成物群はすい臓がん細胞に対する毒殺効果はＧＭＩ群よりも顕著であることから、医薬組成物群（ＰＨＡ+ＫＬＨ+ＧＭＩ）はＰＨＡ、ＫＬＨ、ＧＭＩを単独で投与した群よりもＢｘＰＣ-３細胞に対する毒殺現象はより顕著で且つ明らかに異なっており、すい臓がんの細胞を死滅させる現象がより顕著となり、すい臓がんの治療により効果的であったことを示している。図５Ｅの低用量群処置の結果と比較して、図５Ｆの高用量群の結果では、医薬組成物群の用量を増やした時、すい臓がん細胞が死滅する現象はより顕著になったことを示している。図５Ｅ及び図５Ｆにおいて、*は２群間の比較、Ｐ<０.０５、**は２群間の比較、Ｐ<０.０１、***は２群間の比較、Ｐ<０.００１を示し、各実験では３回の独立した実験が行われ、エラーバーは平均の標準誤差を示す。

ＢｘＰＣ-３+ＰＢＭＣ処置群の実験結果に関して：

図５Ａ及び図５ＢのＰＢＭＣが加えられている群（ＰＢＭＣ+ＰＨＡ群、ＰＢＭＣ+ＫＬＨ群、ＰＢＭＣ+ＧＭＩ群、ＰＢＭＣ+医薬組成物群を示す）を再度参照されたい。顕微鏡で観察した結果は、ＰＢＭＣ+ＰＨＡ群及びＰＢＭＣ+ＫＬＨ群では、高用量でも低用量でも、対照群に比べて付着細胞数はあまり変化しておらず、つまりこの２つの処置はＢｘＰＣ-３細胞に対する毒殺効果は大きくないことを示している。一方では、対照群に比べてＰＢＭＣ+ＧＭＩ群及びＰＢＭＣ+医薬組成物群では、付着細胞数は明らかに減少していることから、この２つの処置はＢｘＰＣ-３細胞に対して毒殺効果を持つことが示されたことになる。

図５Ｃから図５Ｆを再度参照されたい。図５Ｃ中（図中、ＰＢＭＣ+ＰＨＡ群、ＰＢＭＣ+ＫＬＨ群、ＰＢＭＣ+ＧＭＩ群、ＰＢＭＣ+医薬組成物群を示している）では、ＰＢＭＣがある処置状況にて、同時に低用量で投与する処置を行うことで、フローサイトメーターによる１回実験で得られた対照群、ＰＢＭＣ+ＰＨＡ群、ＰＢＭＣ+ＫＬＨ群、ＰＢＭＣ+ＧＭＩ群、ＰＢＭＣ+医薬組成物群の細胞毒殺率はそれぞれ７.０%、２９.４%、７.５%、５０.４%及び５６.７%であった。図５Ｅに示すように、ＰＢＭＣがある処置状況で、同時に低用量で投与する処置にて、フローサイトメーターを用いて３回実験を繰り返して行い統計して得られた細胞毒殺率の結果では、ＰＨＡ群はすい臓がん細胞に対して部分的に毒殺作用を示し、ＫＬＨ群はすい臓がん細胞に対する毒殺効果は大きくなかった。ＧＭＩ群はすい臓がん細胞に対する毒殺効果が優れており、そして医薬組成物群はすい臓がん細胞に対する毒殺効果はＧＭＩ群よりも顕著であることから、ＰＢＭＣがある状況で、医薬組成物群（ＰＨＡ+ＫＬＨ+ＧＭＩ）はＰＨＡ、ＫＬＨ、ＧＭＩを単独で投与した群よりもＢｘＰＣ-３細胞に対する毒殺現象はより顕著で且つ明らかに異なっており、すい臓がんの細胞を死滅させる現象がより顕著となり、すい臓がんの治療により効果的であったことを示している。また、図５Ｄ中（図中、ＰＢＭＣ+ＰＨＡ群、ＰＢＭＣ+ＫＬＨ群、ＰＢＭＣ+ＧＭＩ群、ＰＢＭＣ+医薬組成物群を示している）では、ＰＢＭＣがある処置状況にて、同時に高用量の処置を行うことで、フローサイトメーターによる１回実験で得られた対照群、ＰＢＭＣ+ＰＨＡ群、ＰＢＭＣ+ＫＬＨ群、ＰＢＭＣ+ＧＭＩ群及びＰＢＭＣ+医薬組成物群の細胞毒殺率はそれぞれ７.０%、５０%、１９.５%、５１.４%及び５９.５%であった。図５Ｆの結果が示すように、ＰＢＭＣがある処置状況で、同時に高用量で投与する処置にて、フローサイトメーターを用いて３回実験を繰り返して行い統計して得られた細胞毒殺率の結果では、ＰＨＡ群はすい臓がん細胞に対して部分的に毒殺作用を示し、ＫＬＨ群はすい臓がん細胞に対する毒殺効果は大きくなかった。ＧＭＩ群はすい臓がん細胞に対する毒殺効果が優れており、そして医薬組成物群はすい臓がん細胞にもたらす毒殺現象はＧＭＩ群よりも顕著であることから、医薬組成物群（ＰＨＡ+ＫＬＨ+ＧＭＩ）はＰＨＡ、ＫＬＨ、ＧＭＩを単独で投与した群よりもＢｘＰＣ-３細胞に対する毒殺現象はより顕著で且つ明らかに異なっており、すい臓がんの細胞を死滅させる現象がより顕著となり、すい臓がんの治療においてより効果的であったことを示している。ＰＢＭＣがある状況では、図５Ｅの低用量群処置の結果と比較して、図５Ｆの高用量群の結果では、医薬組成物群の用量を増やした時、すい臓がん細胞が死滅する現象はより顕著になったことを示している。

本発明の医薬組成物は、ＢｘＰＣ-３細胞を毒殺することに共働作用を有する：

本実験例にて、ＰＢＭＣがない状況では、低用量医薬組成物群ＣＩ値＝０.４５であり、高用量医薬組成物群ＣＩ値＝０.９であって、ＰＢＭＣがある状況では、低用量医薬組成物群ＣＩ値＝０.５２であって、結果はいずれも<１となり、ＰＢＭＣがない状況では、ＰＨＡ、ＫＬＨ又はＧＭＩを単独で使用するものと比べて、低用量及び高容量の医薬組成物群はＢｘＰＣ-３細胞を毒殺することに共働作用を有しており、そしてＰＢＭＣがある状況では、ＰＨＡ、ＫＬＨ又はＧＭＩを単独で使用するものと比べて、低用量の医薬組成物群はＢｘＰＣ-３細胞を毒殺することに共働作用を有する。

実験例１の結果によれば、本発明の医薬組成物中のＧＭＩとＰＨＡは、免疫細胞（ＰＢＭＣ）の細胞生存率に影響を与えることなく、免疫反応を高めることができることを示している。実験例２の結果によれば、本発明の実施例の医薬組成物は、ヒト肺がん細胞（Ａ５４９）において顕著な細胞死滅をもたらしており、細胞が死滅する現象はＰＨＡ、ＫＬＨ、ＧＭＩを単独で投与した群よりも顕著であって、しかも共働作用があったことを示している。また、医薬組成物の濃度が高くなるにつれて、肺がん細胞死滅をもたらす現象はより顕著になった。さらに、医薬組成物は、免疫細胞の免疫反応を増進して、腫瘍細胞への毒殺効果を高めることができる。実験例３の結果によれば、本発明の実施例の医薬組成物は、乳腺がん細胞（ＭＤＡ-ＭＢ-２３１）において顕著な細胞死滅をもたらしており、細胞が死滅する現象はＰＨＡ、ＫＬＨ、ＧＭＩを単独で投与した群よりも顕著であって、しかも共働作用があったことを示している。また、医薬組成物の濃度が高くなるにつれて、乳腺がん細胞死滅をもたらす現象はより顕著になった。さらに、医薬組成物は、免疫細胞の免疫反応を増進して、腫瘍細胞への毒殺効果を高めることができる。実験例４の結果によれば、本発明の実施例の医薬組成物は、膀胱がん細胞（Ｔ２４）において顕著な細胞死滅をもたらしており、細胞が死滅する現象はＰＨＡ、ＫＬＨ、ＧＭＩを単独で投与した群よりも顕著であって、しかも共働作用があったことを示している。また、医薬組成物の濃度が高くなるにつれて、膀胱がん細胞死滅をもたらす現象はより顕著になった。さらに、医薬組成物は、免疫細胞の免疫反応を増進して、腫瘍細胞への毒殺効果を高めることができる。実験例５の結果によれば、本発明の実施例の医薬組成物は、すい臓がん細胞（ＢｘＰＣ-３）において顕著な細胞死滅をもたらしており、細胞が死滅する現象はＰＨＡ、ＫＬＨ、ＧＭＩを単独で投与した群よりも顕著であって、しかも共働作用があったことを示している。また、医薬組成物の濃度が高くなるにつれて、すい臓がん細胞死滅をもたらす現象はより顕著になった。さらに、医薬組成物は、免疫細胞の免疫反応を増進して、腫瘍細胞への毒殺効果を高めることができる。特に、上記の実験例は説明のためのものであり、本発明を限定するものではない。

上記の細胞培養試験からのデータは、ヒトが使用するための用量の範囲として調合でき、好ましくは、ＥＤ５０を含み且つ毒性が極めて低いか、又は無毒性で医薬組成物の循環濃度の範囲で処方するために使用することができ、その範囲内では、ヒトに対する治療有効量は、使用する剤形及び使用する投薬経路に応じて変化することができる。本発明の方法で使用される医薬組成物の場合、治療有効量は、細胞培養試験から推定することができる。

以上のことから、本発明の医薬組成物及びその製剤の用途は、腫瘍細胞に対して免疫細胞の特異能動免疫反応を効果的に促進でき、ひいては、腫瘍細胞に対する医薬組成物の毒殺率が高まり、腫瘍細胞の生存率を低下させて、腫瘍の治療効果を得ることができる。

上記は単に例示に過ぎず、限定するものではない。本発明の技術思想及び範囲を超えることなく、これに対して行う等価の修正又は変更のいずれも、別紙の特許請求の範囲に含まれるものである。

本発明の医薬組成物及びその製剤の用途は、腫瘍細胞に対して免疫細胞の特異能動免疫反応を効果的に促進でき、ひいては、腫瘍細胞に対する医薬組成物の毒殺率が高まり、腫瘍細胞の生存率を低下させて、腫瘍の治療効果を得ることができる。そのため、腫瘍の治療には重要かつ実質的な利用性を備える。

Claims (15)

1. 小胞子霊芝の免疫調節タンパク質（ＧＭＩ，ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ）と、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ，Ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）とを含む、ことを特徴とする医薬組成物。
2. 前記小胞子霊芝の免疫調整タンパク質の用量は５μｇ/ｍＬから２００μｇ/ｍＬの範囲である、請求項１に記載の医薬組成物。
3. 前記キーホールリンペットヘモシアニンの用量は１０μｇ/ｍＬから２００μｇ/ｍＬの範囲である、請求項１に記載の医薬組成物。
4. 前記小胞子霊芝の免疫調節タンパク質と前記キーホールリンペットヘモシアニンとの重量比は２０：１から１：４０の範囲である、請求項１に記載の医薬組成物。
5. フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ，ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）を更に含む、請求項１に記載の医薬組成物。
6. 前記フィトヘマグルチニンの用量は１μｇ/ｍＬから２０μｇ/ｍＬの範囲である、請求項５に記載の医薬組成物。
7. 前記小胞子霊芝の免疫調節タンパク質と前記フィトヘマグルチニンとの重量比は２００：１から１：４の間であり、前記キーホールリンペットヘモシアニンと前記フィトヘマグルチニンとの重量比は２００：１から１：２の範囲である、請求項５に記載の医薬組成物。
8. 前記医薬組成物は、錠剤、カプセル、乳剤、分散剤、懸濁液、溶液、シロップ、顆粒、経皮パッチ、ゲル、粉末、クリーム、ペースト、坐剤又はエアゾールの形態である、請求項１に記載の医薬組成物。
9. 上皮細胞がんを治療する医薬組成物を調製するための小胞子霊芝の免疫調節タンパク質（ＧＭＩ）及びキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）の用途であって、該医薬組成物は小胞子霊芝の免疫調節タンパク質とキーホールリンペットヘモシアニンとを含む、ことを特徴とする用途。
10. 前記小胞子霊芝の免疫調整タンパク質の用量は５μｇ/ｍＬから２００μｇ/ｍＬの範囲である、請求項９に記載の用途。
11. 前記キーホールリンペットヘモシアニンの用量は１０μｇ/ｍＬから２００μｇ/ｍＬの範囲である、請求項９に記載の用途。
12. 前記小胞子霊芝の免疫調節タンパク質と前記キーホールリンペットヘモシアニンとの重量比は２０：１から１：４０の範囲である、請求項９に記載の用途。
13. 前記医薬組成物はフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）を更に含み、該フィトヘマグルチニンの用量は１μｇ/ｍＬから２０μｇ/ｍＬの範囲である、請求項９に記載の用途。
14. 前記小胞子霊芝の免疫調節タンパク質と前記フィトヘマグルチニンとの重量比は２００：１から１：４の間であり、前記キーホールリンペットヘモシアニンと前記フィトヘマグルチニンとの重量比は２００：１から１：２の範囲である、請求項１３に記載の用途。
15. 前記上皮細胞がんは、肺がん、乳がん、口腔がん、食道がん、胃がん、大腸がん、肝がん、子宮頸がん、膀胱がん、すい臓がん又は皮膚がんである、請求項９に記載の用途。

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