CN114040751A - 针对微卫星稳定型结直肠癌通过协同性免疫原性细胞死亡促进抗肿瘤响应的槲皮素和土木香内酯的纳米共递送 - Google Patents

Abstract

公开了包含槲皮素和土木香内酯的协同组合的胶束制剂及其用于治疗癌症的用途，所述癌症包括微卫星稳定型结直肠癌(CRC)，其在其他方面对免疫治疗具有抗性。发现槲皮素和土木香内酯的组合在协同比例胶束负载下诱导协同性免疫原性细胞死亡(ICD)。

Description

针对微卫星稳定型结直肠癌通过协同性免疫原性细胞死亡促 进抗肿瘤响应的槲皮素和土木香内酯的纳米共递送

联邦政府资助的研究或开发

本发明是在由国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的基金号CA198999的政府支持下完成的。政府对本发明具有一定的权利。

背景技术

结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是全世界癌症死亡的主要原因之一，其影响女性和男性二者。其是美国的第三大死亡原因。手术切除、化学治疗(例如，CapeOX、FOLFOX或FOLFIRI)和放射治疗是标准的临床治疗。然而，这些方案对疾病晚期无效，因为在手术之后的高复发率仍是麻烦的。在2017年，仅在美国就报道了超过95,520例结肠癌新病例和约40,000例直肠癌新病例。尽管结肠镜检查以及其他筛查和预防措施改善了存活率，但少于40％的CRC可在局部阶段被诊断。五年生存率从局部阶段的90％显著下降至发生癌症转移时的仅14％，例如在肝中。

近年来，基于调节免疫系统的治疗方法已在治疗多种癌症方面成功。这些方法包括干扰程序性死亡1/程序性死亡配体1(PD-1/PD-L1)来克服免疫抑制的免疫阻断抑制剂或通过改造患者T细胞来识别和攻击癌细胞的嵌合抗原受体T细胞治疗。在CRC中，具有有缺陷的DNA错配修复系统(mismatch repair system，MMR)或微卫星不稳定性(MSI-H)的患者对免疫治疗更响应。仅5％至15％的患者表现出MMR缺陷/MSI-H。检查点阻断免疫治疗对于肿瘤被T细胞预浸润的患者可以是非常有效的。对于结直肠癌患者不幸的是，患者群体中约95％对PD-1/PD-L1阻断治疗无响应。

发明内容

在一些方面中，本发明公开的主题提供了用于治疗癌症的胶束制剂，其包含协同有效量的槲皮素和土木香内酯(alantolactone)、或其衍生物。在一些具体的方面中，槲皮素和土木香内酯以选自约1:13槲皮素:土木香内酯(mol/mol)、约1:7槲皮素:土木香内酯(mol/mol)和约1:4槲皮素:土木香内酯(mol/mol)的摩尔比存在于胶束制剂中。在一些更具体的方面中，槲皮素和土木香内酯以约1:4槲皮素:土木香内酯(mol/mol)的摩尔比存在于胶束制剂中。在某些方面中，所述胶束制剂包含1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-甲氧基-聚(乙二醇2000)(DSPE-PEG2000)和D-α-生育酚聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS)的组合。

在另一些方面中，本发明公开的主题提供了用于在有此治疗需要的对象中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗有效量的包含协同有效量的槲皮素和土木香内酯的胶束制剂以治疗所述癌症。在一些具体的方面中，所述癌症选自结直肠癌、乳腺癌、胰腺癌、宫颈癌、前列腺癌和淋巴瘤。在一些更具体的方面中，所述结直肠癌是微卫星稳定型结直肠癌。

在某些方面中，协同有效量的槲皮素和土木香内酯的施用诱导免疫原性细胞死亡(immunogenic cell death，ICD)和/或诱导癌细胞凋亡。在另外某些方面中，协同有效量的槲皮素和土木香内酯的施用抑制肿瘤生长和/或进展。在另外某些方面中，协同有效量的槲皮素和土木香内酯的施用降低了癌症的肿瘤微环境中免疫细胞的百分比。在一些具体的方面中，癌症的肿瘤微环境中的免疫细胞选自髓样来源抑制细胞(myeloid-derivedsuppressor cell，MDSC)和T调节细胞(T regulatory cell，Treg)。

本发明公开的主题的某些方面已在上文中阐明，其全部或部分通过本发明公开的主题解决，当结合所附的如下文进行最佳描述的实施例和附图时，另一些方面将随着描述的进行变得明显。

附图说明

本专利或申请文件包含至少一幅彩色附图。在请求并支付必要的费用之后，官方将提供带有彩色附图的该专利或专利申请公开的副本。

在已概括性地对本发明公开的主题如此描述之后，现将参照附图进行，所述附图不一定按比例绘制，并且在附图中：

图1A、图1B和图1C示出了：(图1A)槲皮素(Q)和土木香内酯(A)的化学结构；(图1B)由Q或A单独以及Q和A的组合诱导的免疫原性细胞死亡(ICD)。由箭头指示的高迁移率族框蛋白1(High-mobility group box 1，HMGB1)％阳性细胞作为与红色荧光重叠的阳性绿色荧光计数；以及(图1C)Q和A对CT26-FL3细胞的组合指数(CI)和IC₅₀。**p<0.005，*p<0.05，ns：不显著；

图2A和图2B示出了：(图2A)由Q或A单独以及Q和A的组合诱导的ICD。由箭头指示的HMGB1％阳性细胞作为与红色荧光重叠的阳性绿色荧光计数；以及(图2B)QA-M的形态；

图3A、图3B、图3C、图3D、图3E、图3F和图3G示出了：(图3A)QA-M的形态及其尺寸和ζ电位。柱指示50nm；(图3B)QA-M的临界胶束浓度测量；(图3C)在孵育24小时之后用PBS缓冲液稀释12倍至60倍的QA-M胶束的颗粒尺寸和包封效率(EE％)(pH 7.4)(n＝3)；(图3D)100mg/mL蛋黄卵磷脂混悬剂中在37℃下在72小时中Q从QA-M的累积释放(n＝3)；(图3E)在i.v.注射之后在不同时间点的QA-F和QA-M的药代动力学曲线(n＝6)；(图3F)在用负载DiD的胶束(150μg/kg)注射之后24小时时并通过IVIS成像观察到的CT26-FL3荷瘤小鼠中的胶束分布。肿瘤和主要器官的目的区域(region-of-interest，ROI)荧光强度(n＝3)；以及(图3G)在静脉内注射之后在不同时间点通过UHPLC/MS检测的肿瘤中来自QA-F和QA-M的Q和A的生物分布(n＝3)；**p<0.005，*p<0.05；

图4A、图4B、图4C、图4D和图4E示出了：(图4A)在不同组中在3mg/kg的Q和9mg/kg的A的情况下肿瘤生长的抑制(n＝4)。在实验结束时收集肿瘤并称重。箭头指示注射天数；(图4B)不同处理之间的存活率，n＝5；(图4C)PBS、Q-M、A-M和QA-M组中的ALT、AST、BUN和CREAT水平，n＝3；(图4D)各组中主要器官和肿瘤的H&E染色；(图4E)各组肿瘤中的TUNEL阳性细胞(％)(n＝4)。****p<0.0001，***p<0.0005，**p<0.005，*p<0.05；

图5A和图5B是：(图5A)在用3mg/kg的Q和9mg/kg的A进行的实验结束时收集CT26-FL3肿瘤并成像(n＝4)；以及(图5B)CT26-FL3肿瘤抑制研究中小鼠的体重变化(n＝4)；

图6.各组肿瘤中的TUNEL阳性细胞(％)(n＝4)。****p<0.0001，*p<0.05；

图7A、图7B、图7C和图7D示出了：(图7A)通过流式细胞术和RT-PCR的各组肿瘤中的免疫抑制性细胞群和细胞因子的相对mRNA表达(n＝4)；(图7B)分别通过流式细胞术和RT-PCR的各组肿瘤中的细胞毒性T淋巴细胞和细胞因子的相对mRNA表达(n＝4)；(图1C)各组肿瘤中CD3⁺细胞的免疫荧光染色和定量(n＝4)。柱等于100μm；以及(图7D)各组肿瘤中生物标志物的Western印迹分析和定量(n＝3)。****p<0.0001，***p<0.0005，**p<0.005，*p<0.05，ns：不显著；##：与QA-M相比，p<0.005；#：与QA-M相比，p<0.05；ΦΦΦΦ：与PBS相比，p<0.0001；ΦΦ：与PBS相比，p<0.005；Φ：与PBS相比，p<0.05；

图8示出了通过流式细胞术测量的各组肿瘤中的Treg细胞和MDSC(n＝4)。****p<0.0001，**p<0.005，*p<0.05，ns：不显著；

图9示出了通过流式细胞术测量的各组肿瘤中的TLR4⁺和PD-L1⁺CD11c⁺细胞群(n＝4)。***p<0.0005，**p<0.005，*p<0.05，ns：不显著；

图10示出了通过流式细胞术的各组肿瘤中的细胞毒性T淋巴细胞(n＝4)。****p<0.0001，***p<0.0005，**p<0.005，*p<0.05，ns：不显著；

图11示出了各组肿瘤中CD3⁺细胞的免疫荧光染色和定量(n＝4)。柱指示100μm。****p<0.0001，**p<0.005，ns：不显著；

图12示出了各组肿瘤中生物标志物的Western印迹分析和定量，n＝3。##：与QA-M相比，p<0.005，#：与QA-M相比，p<0.05；ΦΦΦΦ：与PBS相比，p<0.0001；ΦΦ：与PBS相比，p<0.005；Φ：与PBS相比，p<0.05；

图13A、图13B和图13C示出了：(图13A)在CD4⁺和CD8⁺细胞消耗之后CT26-FL3肿瘤的处理方案和肿瘤生长曲线。**：与PBS组相比，p<0.005(n＝5)；(图13B)在肿瘤抑制实验结束时通过流式细胞术分析的淋巴结(lymph node，LN)中的记忆免疫T细胞。****p<0.0001，**p<0.005，*p<0.05，ns：不显著，(n＝4)；以及(图13C)在总共四次QA-M注射之后向荷瘤小鼠的身体的每侧皮下接种4T1和CT26-FL3细胞。在所列的接种之后天数时测量皮下肿瘤(n＝5)；**p<0.005，ns：不显著；

图14示出了在肿瘤抑制实验结束时通过流式细胞术分析的LN中的记忆免疫T细胞(n＝3)。****p<0.0001，***p<0.0005，**p<0.005，*p<0.05，ns：不显著；以及

图15A、图15B和图15C示出了：通过PBS、QA-F和QA-M每隔一天处理进行总共四次注射的4T1乳腺肿瘤(n＝4)的(图15A)肿瘤生长曲线、(图15B)肿瘤图像以及(图15C)重量。****p<0.0001，***p<0.0005，**p<0.005，*p<0.05。

具体实施方式

现在将在下文中参照附图更全面地描述本发明公开的主题，在附图中示出了本发明的一些但不是全部实施方案。贯穿全文，相同的数字表示相同的要素。本发明公开的主题可以以许多不同的形式来体现，并且不应被解释为限于本文阐述的实施方案；相反，提供这些实施方案是为了使本公开内容满足适用的法律要求。实际上，在受益于前述描述和相关附图中呈现的教导之后本发明公开主题所属领域的技术人员将会想到本文所阐述的本发明公开主题的许多修改方案和其他实施方案。因此，应当理解，本发明公开的主题不限于所公开的特定实施方案并且修改方案和其他实施方案也旨在包括在所附权利要求书的范围内。

I.槲皮素和土木香内酯的纳米共递送针对微卫星稳定型结直肠癌通过协同性免疫原性细胞死亡促进抗肿瘤响应

A.包含协同有效量的槲皮素和土木香内酯的胶束制剂

在一些实施方案中，本发明公开的主题提供了用于治疗癌症的胶束制剂，其包含协同有效量的槲皮素和土木香内酯、或其衍生物。槲皮素是一种来自多酚类中的类黄酮组的植物黄酮醇。槲皮素具有以下化学结构：

土木香内酯是一种存在于许多植物物种中的倍半萜内酯，并且其具有以下化学结构：

本文中使用的术语“协同”、“协同的”、“协同地”及其派生词，例如“协同作用”或“协同组合”或“协同组合物”是指槲皮素(Q)和土木香内酯(A)的组合的生物活性大于各种药剂当单独施用时的生物活性的总和的情况。

协同可以以组合指数来表示，所述组合指数(combination index，CI，其可例如通过使用Chou和Talalay方法来确定。Zhang等,2014；Chou等.,1984。CI可通过使用下式(1)来计算：

CI＝(D)₁/(D_x)₁+(D)₂/(D_x)₂ (1)

其中(D)₁和(D)₂是单一药物在组合之后抑制x％细胞生长的浓度，并且(D_x)₁和(D_x)₂是单一药物单独地抑制x％细胞生长的浓度。CI值大于1表明拮抗作用，并且CI值小于1表明药物组合的协同作用。

一般而言，CI越低，通过该特定组合显示的协同作用越大。因此，“协同组合”的活性高于基于单独组分当单独使用时观察到的活性所能够预期的活性。此外，组分的“协同有效量”是指该组分在组合物中存在的例如另一种治疗剂中引起协同作用所需的量。

在某些实施方案中，槲皮素和土木香内酯以选自约1:13槲皮素:土木香内酯(mol/mol)、约1:7槲皮素:土木香内酯(mol/mol)和约1:4槲皮素:土木香内酯(mol/mol)的摩尔比存在于胶束制剂中。在一些具体实施方案中，槲皮素和土木香内酯以约1:4槲皮素:土木香内酯(mol/mol)的摩尔比存在于胶束制剂中。

在某些实施方案中，胶束制剂包含1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-甲氧基-聚(乙二醇2000)(DSPE-PEG2000)和D-α-生育酚聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS)的组合。

在某些实施方案中，胶束制剂包含球形颗粒。球形颗粒的直径可为小于约150nm，包括但不限于约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145和150nm。在一些具体实施方案中，颗粒的直径为约15至约25nm。在一些更具体的实施方案中，颗粒的直径为约20nm。

在某些实施方案中，胶束制剂的ζ电位为约-1至约-0.1mV。在一些具体实施方案中，胶束制剂的ζ电位为约-0.3±0.1mV。

在某些实施方案中，胶束制剂针对槲皮素和土木香内酯中每一种的包封效率为约80％至约95％，包括80％、85％、90％和95％。在某些实施方案中，胶束制剂针对槲皮素和土木香内酯的包封效率为大于约90％。

在某些实施方案中，胶束制剂的临界胶束浓度(critical micelleconcentration，CMC)为约0.003mg/mL。

B.用包含协同有效量的槲皮素和土木香内酯的胶束制剂治疗癌症的方法

在另一些实施方案中，本发明公开的主题提供了用于在有此治疗需要的对象中治疗癌症的方法，所述方法包括向对象施用治疗有效量的包含协同有效量的槲皮素和土木香内酯的胶束制剂以治疗癌症。本文中使用的术语“癌症”是指或描述哺乳动物中通常特征在于不受调节的细胞生长的生理状况。本文中使用的“癌细胞”或“肿瘤细胞”是指特征在于这种不受调节的细胞生长的细胞。

本文中使用的术语“治疗”可包括逆转、减轻、抑制这样的术语适用的疾病、障碍或病症或者这样的疾病、障碍或病症的一种或更多种症状或表现的进展，防止或降低这样的术语适用的疾病、障碍或病症或者这样的疾病、障碍或病症的一种或更多种症状或表现的可能性。预防是指使疾病、障碍、病症、或者其症状或表现不发生、或者这些的严重程度的恶化不发生。因此，可预防性地施用本发明公开的化合物以防止或降低疾病、障碍或病症的发生或复发。

本文中使用的术语“抑制”及其语法派生词是指本发明公开的化合物，例如本发明公开的式(I)化合物阻断、部分阻断、干扰、减少、或降低细菌生长或细菌感染的能力。因此，本领域普通技术人员将理解，术语“抑制”涵盖细菌生长或细菌感染的完全和/或部分降低，例如降低至少10％，在一些实施方案中，降低至少20％、30％、50％、75％、95％、98％以及最多且包括100％。

一般而言，活性剂或药物递送装置的“有效量”是指引发所期望的生物响应所需的量。如本领域普通技术人员将理解的，药剂或装置的有效量可根据例如以下因素而变化：所期望的生物学终点、待递送的药剂、药物组合物的构成、靶组织等。

通过本发明公开的方法治疗的“对象”在其许多实施方案中期望地是人对象，但是应理解本文所述的方法对于旨在包括在术语“对象”中的所有脊椎动物物种均是有效的。因此，“对象”可包括人对象，出于医学目的，例如用于现有病症或疾病的治疗或用于防止病症或疾病发作的预防性治疗；或动物对象，出于医学、兽医目的、或发展目的。合适的动物对象包括哺乳动物，其包括但不限于：灵长类，例如人、猴、猿等；牛类(bovine)，例如牛(cattle)、公牛(oxen)等；羊类，例如绵羊等；山羊类(caprine)，例如山羊(goat)等；猪类(porcine)，例如猪(pig)、肉猪(hog)等；马类(equine)，例如马、驴、斑马等；猫科(feline)，包括野猫和家猫；犬科(canine)，包括狗(dog)；兔类(lagomorph)，包括家兔、野兔等；和啮齿类，包括小鼠、大鼠等。动物可以是转基因动物。在一些实施方案中，对象是人，其包括但不限于胎儿、新生儿、婴幼儿、青少年和成人对象。此外，“对象”可包括患有或怀疑患有病症或疾病的患者。因此，术语“对象”和“患者”在本文中是可互换使用的。术语“对象”还指来自对象的生物体、组织、细胞或细胞集合。

在一些具体实施方案中，癌症选自结直肠癌、乳腺癌、胰腺癌、宫颈癌、前列腺癌和淋巴瘤。在一些更具体的实施方案中，结直肠癌是微卫星稳定型结直肠癌。本领域普通技术人员将理解，其他癌症也可通过本发明公开的方法治疗，包括但不限于所有形式的癌、黑素瘤、肉瘤、淋巴瘤和白血病，包括但不限于膀胱癌、脑瘤、乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌、食管癌、子宫内膜癌、肝细胞癌、喉癌、肺癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌和甲状腺癌。在一些实施方案中，待治疗的癌症是转移性癌症。特别地，癌症可对已知治疗具有抗性。

在某些实施方案中，协同有效量的槲皮素和土木香内酯的施用诱导免疫原性细胞死亡(ICD)和/或诱导癌细胞凋亡。在另一些实施方案中，协同有效量的槲皮素和土木香内酯的施用抑制肿瘤生长和/或进展。在又一些实施方案中，协同有效量的槲皮素和土木香内酯的施用降低了癌症的肿瘤微环境中免疫细胞的百分比。在某些实施方案中，癌症的肿瘤微环境中的免疫细胞选自髓样来源抑制细胞(MDSC)和T调节细胞(Treg)。

在某些实施方案中，协同有效量的槲皮素和土木香内酯的施用抑制一种或更多种细胞中的促肿瘤炎症。在另一些实施方案中，协同有效量的槲皮素和土木香内酯的施用降低一种或更多种癌细胞中的Toll样受体4阳性(TLR4⁺)表达。在又一些实施方案中，协同有效量的槲皮素和土木香内酯的施用降低一种或更多种癌细胞上的PD-L1表达。

在某些实施方案中，协同有效量的槲皮素和土木香内酯的施用降低一种或更多种癌细胞中免疫抑制性细胞因子的分泌。在一些具体实施方案中，免疫抑制性细胞因子选自IL-10、TGF-β、IL-Iβ和CCL2。

在某些实施方案中，协同有效量的槲皮素和土木香内酯的施用激活癌症肿瘤中的一种或更多种肿瘤浸润性免疫细胞。在一些具体实施方案中，一种或更多种肿瘤浸润性免疫细胞包含一种或更多种CRT⁺细胞。在又一些更具体的实施方案中，一种或更多种CRT⁺细胞选自CD3⁺T细胞、CD8⁺T细胞和CD4⁺T细胞。

在某些实施方案中，协同有效量的槲皮素和土木香内酯的施用提高了一种或更多种树突细胞上共刺激信号(MHC II类和CD86)水平的表达。在另一些实施方案中，协同有效量的槲皮素和土木香内酯的施用提高了自然杀伤(NK)细胞的存在。在又一些实施方案中，协同有效量的槲皮素和土木香内酯的施用提高了肿瘤中来自CD4⁺和CD8⁺T细胞的IFN-γ产生，所述肿瘤包括癌症。

在某些实施方案中，协同有效量的槲皮素和土木香内酯的施用激活T细胞。在另一些实施方案中，协同有效量的槲皮素和土木香内酯的施用在肿瘤中诱导较高水平的IL-12和IFN-γ，所述肿瘤包括癌症。在又一些实施方案中，协同有效量的槲皮素和土木香内酯的施用提高了一种或更多种癌细胞中CXCL9的表达。

在某些实施方案中，协同有效量的槲皮素和土木香内酯的施用提高了一种或更多种癌细胞中肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor alpha，TFN-α)的分泌。在另一些实施方案中，协同有效量的槲皮素和土木香内酯的施用下调抑制性免疫细胞和细胞因子。在又一些实施方案中，协同有效量的槲皮素和土木香内酯的施用上调免疫活性细胞和细胞因子。

在某些实施方案中，协同有效量的槲皮素和土木香内酯的施用提高了一种或更多种癌细胞中磷酸-AMP活化蛋白激酶α(p-AMPKα)蛋白的表达。在另一些实施方案中，协同有效量的槲皮素和土木香内酯的施用降低一种或更多种癌细胞中哺乳动物雷帕霉素靶标(mammalian target of rapamycin，mTOR)和磷酸-mTOR(p-mTOR)的表达。在又一些实施方案中，协同有效量的槲皮素和土木香内酯的施用抑制Bcl-2以诱导细胞凋亡，从而促进自噬。在又一些实施方案中，协同有效量的槲皮素和土木香内酯的施用产生p-AMPK并且抑制mTOR和p-mTOR，从而促进自噬。

在某些实施方案中，协同有效量的槲皮素和土木香内酯的施用激活肿瘤中的先天免疫应答，从而诱导适应性免疫应答的激活并抑制肿瘤生长。在另一些实施方案中，协同有效量的槲皮素和土木香内酯的施用募集肿瘤特异性记忆T细胞。在一些具体实施方案中，记忆T细胞包括CD8⁺和CD4⁺。

根据长期的专利法惯例，没有数量词修饰的名词当在本申请(包括权利要求书)中使用时是指“一个/种或更多个/种”。因此，例如，提及“对象”包括复数个对象，除非上下文明显相反(例如，复数个对象)，等等。

贯穿本说明书和权利要求书，除非上下文另有要求，否则术语“包含”、和“含有”以非排他性的意义使用。同样，术语“包括”及其语法变体旨在为非限制性的，使得列表中项目的列举不排除可替代或添加至所列项目的其他类似项目。

出于本说明书和所附权利要求书的目的，除非另有指示，否则在本说明书和权利要求书中使用的所有表示量、大小、尺寸、比例、形状、公式、参数、百分比、数量、特征和其他数值的数字均应理解为在所有情况下均被术语“约/大约”修饰，即使术语“约/大约”可不明确地与值、量或范围一起出现。因此，除非有相反的指示，在以下说明书和所附权利要求书中所示的数值参数不是也无需是精确的，而是可以是近似的和/或根据期望更大或更小，反映了公差、转换因子、四舍五入、测量误差等，以及本领域技术人员已知的其他因素，这取决于通过本发明公开的主题想要获得的所期望特性。例如，术语“约/大约”在提及值时可意指涵盖与特定量的以下变化：在一些实施方案中，±100％；在一些实施方案中，±50％；在一些实施方案中，±20％；在一些实施方案中，±10％；在一些实施方案中，±5％；在一些实施方案中，±1％；在一些实施方案中，±0.5％；以及在一些实施方案中，±0.1％，因为这样的变化适合于进行所公开的方法或使用所公开的组合物。

此外，当与一个或更多个数字或数值范围结合使用时，术语“约/大约”应理解为是指所有这样的数字，其包括在范围内的所有数字以及通过在所提及数值上下扩展边界来修改该范围。通过端点对数值范围的记载包括纳入在该范围内的所有数字，例如整数，包括其分数(例如，1至5的记载包括1、2、3、4和5，以及其分数，例如1.5、2.25、3.75、4.1等)和在该范围内的任何范围。

实施例

已包括以下实施例以向为了实践本发明公开的主题的代表性实施方案的本领域普通技术人员提供指导。根据本公开内容和本领域的一般技术水平，技术人员可理解以下实施例旨在仅是示例性的，并且在不脱离本发明公开的主题的范围的情况下可采用多种改变、修改和变化。以下的综合描述和具体实例仅用于举例说明的目的，并且不应被解释为以任何方式对通过其他方法制备本公开内容的化合物进行限制。

实施例1

针对微卫星稳定型结直肠癌通过协同性免疫原性细胞死亡促进抗肿瘤响应的槲皮素和土木香内酯的纳米共递送

1.1综述

已知微卫星稳定型结直肠癌(CRC)对免疫治疗具有抗性。发现槲皮素(Q)和土木香内酯(A)的组合在1:4(Q:A)的摩尔比下诱导协同性免疫原性细胞死亡(ICD)。为了实现比例负载和递送，开发了具有高包封效率和最佳比例的载药量的Q和A的胶束递送(QA-M)。QA-M实现了针对两种药物延长血液循环和提高肿瘤积累。更重要的是，QA-M在协同性免疫治疗的静脉内注射之后2小时和4小时保留了肿瘤中所期望的药物比(Q与A的摩尔比＝1:4)。当与PBS和游离药物的组合相比时，通过QA-M的处理显著抑制了鼠原位CRC中的肿瘤生长(p<0.005)。组合纳米治疗刺激宿主免疫应答以实现长寿命肿瘤破坏和诱导性记忆性肿瘤监视，当与PBS(p<0.0001)和游离药物的组合(p<0.0005)相比时，存活中位时间提高1.3倍。本发明公开的主题的结果证明了由Q和A共递送诱导的协同性治疗作用，其能够通过诱导ICD、引起细胞毒性和调节免疫抑制性肿瘤微环境来再激活抗肿瘤免疫。这样的捕获在简单且安全的纳米递送系统中具有协同作用的Q和A的组合可提供了作为CRC的免疫治疗剂进行大规模制造和新临床应用的潜力。

1.2引言

1.2.1.背景

结直肠癌(CRC)是全世界癌症死亡的主要原因之一，其影响女性和男性二者。其是美国的第三大死亡原因。美国癌症协会(American Cancer Society)，2017。手术切除、化学治疗(CapeOX、FOLFOX或FOLFIRI)和放射治疗是标准的临床治疗。然而，这些方案对疾病晚期无效。在手术之后的高复发率仍是麻烦的。Weitz等，2005；McKeown等，2014；以及Birendra等，2017。在2017年，仅在美国就报道了超过95,520例结肠癌新病例和约40,000例直肠癌新病例。尽管结肠镜检查以及其他筛查和预防措施改善了存活率，但少于40％的CRC可在局部阶段被诊断。五年生存率从局部阶段的90％显著下降至发生癌症转移时的仅14％，例如在肝中。美国癌症协会，2017；Goodwin和Huang，2017。

最近，有效的免疫治疗已成为临床实际和癌症治疗方案的前沿。癌症免疫治疗被认为通过刺激免疫细胞的活化或阻断由癌性细胞产生的抑制免疫应答的信号来增强免疫应答。Alev等，2018。已经证实，在肿瘤微环境中，免疫细胞可调节肿瘤进展并且是有吸引力的治疗靶点。Gajewski等，2013；Wellenstein和de Visser，2018；以及Duan 2018。近年来，基于调节免疫系统的治疗方法已在治疗多种癌症方面成功。这些方法包括干扰程序性死亡1/程序性死亡配体1(PD-1/PD-L1)以克服免疫抑制的免疫阻断抑制剂或通过改造患者T细胞来识别和攻击癌细胞的嵌合抗原受体T细胞治疗。Marin-Acevedo等，2018；Showalter等，2017。在CRC中，具有有缺陷的DNA错配修复系统(MMR)或微卫星不稳定性(MSI-H)的患者对免疫治疗更响应。不幸的是，仅5％至15％的患者表现出MMR缺陷/MSI-H，并且检查点阻断免疫治疗对于肿瘤被T细胞预浸润的患者可以是非常有效的。Goodwin和Huang，2017；Pfirschke等，2016。对于结直肠癌患者不幸的是，患者群体中约95％对PD-1/PD-L1阻断治疗无响应。Song等，2018；Gilabert-Oriol等，2018。

据报道，一些化学治疗药物(例如，米托蒽醌(mitoxantrone)、多柔比星(doxorubicin)、硼替佐米(bortezomib)、奥沙利铂(oxaliplatin)、紫杉醇(paclitaxel)和吉西他滨(gemcitabine))表现出免疫调节作用。这些药物可潜在地用于临床增强肿瘤特异性免疫和调节恶性疾病的结局。Hodge等，2013；Suryadevara等，2017；Kono等，2013；以及Zhang等，2018。这些药剂可诱导免疫原性细胞死亡(ICD)，像将肿瘤细胞转移到“治疗性疫苗”中一样发挥作用，或者通过促进免疫细胞的成熟和活化、或抑制免疫细胞例如髓样来源抑制细胞(MDSC)和T调节细胞(Treg)的免疫抑制来直接刺激免疫应答。Gubin和Schreiber，2015；Tesniere等，2016；以及Obeid等，2007。ICD的特征在于垂死的肿瘤细胞的膜上表达钙网蛋白(CRT)，为树突细胞(dendritic cell，DC)摄取提供“吃我”信号。Obeid等，2007；Martins等，2014。随后从肿瘤细胞释放三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)和高迁移率族框1(HMGB1)蛋白像对抗原呈递DC的佐剂刺激一样发挥作用。Kroemer等，2013；Lu等，2017。因此，ICD的诱导已成为控制侵袭性、转移性或复发性癌症的新免疫原性治疗。Gubin和Schreiber，2015。然而，常规细胞毒性化学药物的临床优势和局限性是显而易见的，尤其是在破坏免疫系统方面。Crawford等，2004。先前已报道了米托蒽醌和来源于经典中草药的根的南蛇藤醇(celastrol)的组合触发ICD并引起全身性免疫。Liu等，2018。然而，南蛇藤醇的临床使用由于其狭窄的治疗剂量窗口和不利作用(例如不孕和心脏毒性)而受到限制。Wang等，2011；

等，2017。

1.2.1.工作范围

在本发明公开的主题中，对其他中药进行了筛选，并且出乎意料地发现槲皮素(Q)可与土木香内酯(A)协同作用以诱导ICD。槲皮素(Q)和土木香内酯(A)的化学结构示于图1A中。

Q作为生物类黄酮家族的成员，并表现出广谱的有益效果，例如抗炎、抗氧化剂、抗增殖以及抗癌活性和转移。Ward等，2018a；Feng等，2018；Rockenbach等，2013。它因为其治疗特性以及其安全性(GRAS-通常被认为是安全报告)和天然来源(其广泛分布在日常饮食，包括绿色蔬菜、洋葱、浆果等中)而引起了广泛的兴趣。Egert等，2008。报道了Q在数种癌症，例如胰腺癌、乳腺癌、宫颈癌和前列腺癌中的抗癌作用。Ward等，2018a；Rockenbach等，2013；Ward等，2018b。

A是总状土木香(Inula racemosa Hook.f.)的主要生物活性倍半萜内酯组分，并且其通过凋亡机制具有数种有益活性，包括抗菌、抗炎和抗肿瘤活性。Chun等，2012；Rasul等，2013。其靶向凋亡起因于抑制活化的信号转导及转录激活蛋白3(signal transducerand activator of transcription 3，STAT3)以及诱导超载活性氧类(reactive oxygenspecies，ROS)，引起大量氧化性脱氧核糖核酸损伤、谷胱甘肽耗竭和线粒体功能障碍，这最终导致凋亡。Chun等，2015；Khan等，2012。

然而，存在很少关于Q和A在抗肿瘤免疫和免疫抑制性肿瘤环境中的肿瘤进展方面的作用的信息。制备了Q和A的组合并在微卫星稳定型CRC的鼠模型CT26-FL3上确定了其在触发ICD和诱导细胞凋亡方面的协同作用，所述模型已作为原位模型接种在结肠壁中。为了不仅在载药过程中而且在注射之后在肿瘤组织中维持Q和A的最佳摩尔比，考虑到这两种药物的疏水特性而采用长循环胶束颗粒来共递送Q和A(QA-M)。这种在胶束中共递送Q和A被认为引发了稳健的先天性和适应性免疫应答、诱导癌细胞凋亡并控制癌症进展，这可引起延长的宿主存活。

1.3结果和讨论

1.3.1对Q和A对诱导ICD和细胞凋亡的协同作用的评价

目前，越来越多的努力集中在某些可在癌细胞中诱导ICD的应激剂的应用上。Kawano等，2016。ICD的免疫原性特征主要通过损伤相关分子模式来介导，其包括细胞表面暴露的CRT和释放HMGB1。报道了Q通过上调作为ER应激标志物的葡萄糖调节蛋白78和C/-EBP同源蛋白并导致半胱天冬酶-4的切割来引起ER应激，半胱天冬酶-4是ER驻留型半胱天冬酶。Liu等，2017。已报道的关于Q或A的ICD效应的研究很少。

在本发明公开的主题中，通过使用免疫荧光来研究ICD效应。如图1B所示(各组的放大图可见于图2A中)，在用0.07和0.33μM浓度的不同浓度的游离Q孵育之后，确定了Q表现出对CRT易位和HMGB1释放的影响分别极小或不可检测。另一方面，A单独在CRT易位和HMGB1释放两方面均诱导浓度依赖性ICD效应。这两种作用可通过与Q组合来增强(0.07和0.33μM分别用于CRT易位和HMGB1释放)。关于CRT易位，在0.04或0.13μM的较低A浓度下，当与对照组(DMSO处理组)相比时，A和QA二者表现出很小的差异。然而，当将0.26μM的A与0.07μM的Q一起在CT26-FL3细胞上孵育4小时时，当与单独的A相比时，观察到％CRT阳性细胞增加了2.1倍(p<0.0005)。随着A浓度的提高，QA组合显示出更明显的CRT易位。在HMGB1的释放行为中观察到相同的趋势。与对照组相比，分别在0.33μM和1.3μM浓度下的Q和A二者均显示不可检出的HMGB1释放。然而，这两种药物在这些浓度下的组合提高了HMGB1阳性细胞。因此，这些结果表明Q和A在低浓度下协同工作以诱导ICD。

除了由在CT26-FL3细胞上施加QA引起的ICD效应外，还研究了由QA组合引起的细胞毒性。Q在不影响正常上皮细胞的情况下诱导恶性细胞的凋亡性和坏死性细胞死亡，这与其对调节ROS产生以及干扰Akt和NF-κB信号通路的作用有关。Ward等，2018b。研究了QA组合在孵育24小时之后在CT26-FL3细胞上的体外细胞毒性分析(图1C)。用Q和A的不同摩尔比绘制组合指数(CI)与受影响细胞的分数(Fa)。CI值低于1指示协同作用。Miao等，2014。当Q和A以所示药物比组合时，发现在摩尔比为1:13、1:7和1:4(Q:A mol/mol)时CI值低于1。在QA组合中发现Q的IC50(IC₅₀＝8.0μM)显著更低，其比单独的Q的IC50(IC₅₀＝148μM)低94.8％。这指示A在孵育期间提高了CT26-FL3细胞对Q的敏感性。考虑到QA在ICD和细胞毒性方面的协同作用，选择1:4的Q:A摩尔比用于进一步的体内实验。接下来，制备了载有Q和A的胶束(QA-M)，并研究了其体内协同作用。

1.2.2QA-M的制备和表征

QA-M是用1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-甲氧基-聚(乙二醇2000)(DSPE-PEG2000)和D-α-生育酚聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS)通过乙醇注射方法来制备的。QA-M的形态在图3A(QA-M的放大TEM照片可见于图2B中)中显示。颗粒是具有为20±0.6nm的窄的尺寸分布和为-0.3±0.1mV的ζ电位的球形。QA-M的包封效率分别为针对Q的90.5±0.6％和针对A的94.6±0.8％(包封的Q与A的摩尔比为1:4)。QA-M的载药量计算为Q的0.90±0.01％和A的2.80±0.02％。因此，在这些胶束中实现了Q和A的比例负载。

临界胶束浓度(CMC)值指示胶束的稳定性。胶束在低于CMC的浓度下分解，而聚合物在高于CMC的浓度下聚集并形成胶束。制备中聚合物的CMC值越低，胶束颗粒的预测稳定性越好。Jin等，2018。报道了DSPE-PEG2000和TPGS的CMC分别为0.0336mg/mL和0.2mg/mL。Sezgin等，2006；Mi等，2011。在图3B中，通过乙醇注射方法制备的混合胶束的CMC比单独的DSPE-PEG2000或TPGS的CMC低得多。QA-M的0.0031mg/mL的相当低的CMC表明其在全身血液循环中具有预测的抗稀释稳定性。该观察结果可能是DSPE-PEG2000和TPGS的疏水嵌段之间的疏水相互作用增强的结果。Jin等，2018。

为了进一步证明QA-M的稳定性，研究了稀释稳定性。将胶束系统在PBS缓冲液(pH＝7.4)中稀释12、30和60倍。尺寸分布和药物包封效率在37℃下记录24小时(图3C)。当稀释至60倍时，QA-M的浓度仍高于CMC，因此胶束不会解离，并且未发现在稀释之前和之后尺寸分布和包封效率显著变化。

Q和A从QA-M中的释放行为在图2D中显示。即使在72小时之后，Q与来自QA-M的总Q的释放百分比仅为(7.6±0.3)％。关于A从QA-M中的释放，其在整个实验中均未检出(Q的最低检测限：100ng/mL，等于QA-M中Q的0.3％；A的最低检测限：100ng/mL，等于QA-M中A的0.1％)，这指示在由高浓度软脂质体(卵磷脂浓度100mg/mL)形成的漏槽条件下释放了少量A。Q和A从QA-M中的控制释放表明：(1)释放介质不会破坏QA-M的结构，这不像表面活性剂。为了分配到软脂质体中，负载药物需要在一开始就以分子形式溶解在水中。由于A的疏水性比Q的疏水性高，A转移至卵磷脂囊泡的趋势较小(释放介质中A的浓度低于最低检测限)，而Q在72小时时从胶束中释放约7.6％；(2)Q和A二者的持续释放使胶束在体内维持最佳药物比成为可能。事实上，连同稀释稳定性和体外释放结果，认为QA-M一旦注射在静脉中将在血液稀释下保持稳定，并在血液循环时间期间保持药物以几乎不变的比率捕获。进行了以下药代动力学和组织分布研究以确定该认为。

由于血流内的稳定性和聚乙二醇的颗粒膜修饰，可预测QA-M在体内延长的循环，并且QA-M将通过高通透性与滞留(enhanced permeability and retention，EPR)效应来有效地将载物递送至肿瘤。Jin等，2018；Sezgin等，2006。因此，研究了QA-M的药代动力学和生物分布。如图3E所示，与Q和A的游离组合(QA-F)相比，胶束药物表现出延长Q和A二者在血流中的循环，其通过使用非房室模型和PKsolver来计算(表1)。QA-M中的Q和A特别地表现出从零至最终时间点的浓度-时间曲线下面积(AUC_0→t))分别比QA-F中的Q和A高15.7倍和16.3倍。

在QA-M中Q和A的末期(V_z)期间的表观分布容积显著降低，其分别为QA-F中Q和A的13.3％和14.2％。结果显示，胶束纳米药物可延长循环时间并减缓药物分布。接近零的ζ电位和QA-M中聚乙二醇的存在可能是胶束长循环效应的原因。Mi等，2011；Parveen等，2011。

表1QA-F和QA-M的药代动力学参数(n＝6)

¹从零时至最终时间点的体内驻留时间；²从零至最终时间点的浓度-时间曲线下面积；³表观分布容积；⁴总血浆清除率。*：与来自QA-F的Q相比，p<0.05；§；与来自QA-F的A相比，p<0.05。

DiD(1,1’-双十八烷基-3,3,3’,3’-四甲基吲哚二羰花青,4-氯苯磺酸盐)被用作CT26-FL3荷瘤小鼠中胶束分布的探针。在注射之后24小时，主要在肿瘤中检测到负载DiD的胶束(DiD-M)(图3F)。即使在肝或肺中积累了一定量的胶束，但在聚乙二醇化胶束的帮助下，大部分胶束在肿瘤中积累。当与其他主要器官相比时，在DiD-M组中发现相对荧光强度增加了至少1.7倍。此外，在将QA-M或QA-F分别以3mg/kg的Q和9mg/kg的A的剂量进行i.v.注射之后检测Q和A的生物分布(图3G)。在被包封在胶束中之后，Q和A二者在4小时中与来自QA-F的Q和A相比时可分别表现出肿瘤中积累的至少约2倍和5倍提高。从体外ICD效应中获得的Q和A的最佳比例是用在早期时间点肿瘤中药物的浓度来实现的。在注射之后2小时和4小时，通过胶束递送之后Q和A的比例分别为1.0:3.8和1.0:4.1，这与从体外ICD效应获得的最佳摩尔比1:4大致相同。在另外两个测量时间点：12和24小时，由于体内代谢，肿瘤中Q和A二者的含量急剧降低而无法保持最佳比例。然而，QA-F未能递送Q和A达到这样的比率(在2、4、12和24小时分别为1.0:1.6、1.0:2.3、1.0:3.0和1.0:1.6)。根据QA-M的药代动力学和生物分布特性，认为使用胶束药物递送系统的好处不仅是延长血液循环和提高肿瘤积累，而且还针对协同性ICD和细胞毒性将Q和A以最佳摩尔比共递送至肿瘤。因此，胶束能够进行比例负载，以及Q和A的比例递送。因此，协同性药物作用是预期到的。

1.3.3在原位结直肠癌模型中的治疗效力

为了证明QA-M用于在体内针对结直肠癌的免疫治疗的效用，研究了其对原位CT26-FL3肿瘤的生长的抑制。这些肿瘤缺乏T细胞浸润，Gilabert-Oriol，等，2018，并且因此对常规免疫治疗具有抗性。对CT26-FL3荷瘤小鼠施用游离或胶束Q和A组合，每隔一天，四次(图4A，其他组的详细数据可见于图5A中)。QA-M组合治疗显著延迟肿瘤生长(p<0.0005)，该组的肿瘤体积增加为用PBS处理的组的约10％，而QA-F对肿瘤进展无影响。Q-M或A-M单独地也可显示出一定程度的肿瘤生长抑制。但在终止处理后，肿瘤生长恢复。重要的是，与在肿瘤进展的晚期显示出一定体重下降的PBS组和游离药物处理组相比，QA-M没有引起任何体重变化(图5B)。当与PBS组和QA-F组相比时，QA-M也显示出显著延长的中位存活时间(p<0.0001)(图4B)。Q-M、A-M和QA-M组中丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、血尿素氮(BUN)和肌酐的水平也在正常范围内，表明没有肝和肾毒性(图4C)。Zhang等，2013。分别在PBS和A-F处理的组的H&E染色中观察到肝和脾中的转移。然而，Q-M、A-M和QA-M组未显示明显的肾损伤、肺毒性、心脏损伤或脾中炎性浸润(图4D)。

在实验结束时收集肿瘤并分析有效的细胞凋亡、免疫监视和其他抗肿瘤免疫刺激介质。由于Q-F和A-F的活性与QA-F的活性非常类似(图4A)，因此仅选择QA-F进行详细分析。首先，TUNEL测定(图4E，其他组的详细数据可见于图6中)揭示，QA-M表现出最有效的杀伤效果，并且与对照组和QA-F处理组相比，分别诱导6.6倍和2.0倍高的凋亡细胞数量。癌细胞的显著特征是丧失对细胞周期的调控，这允许持续增殖。Q使细胞周期阻滞于G2/M期，而A诱导细胞周期G1/G0期阻滞。Lee等，2006；Zhao等，2015。因此，这两种药物除了诱导细胞凋亡外还表现出对癌细胞的抗增殖作用。如也可在图7D中所见的，QA-M引起B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)和B细胞淋巴瘤-特大(Bcl-xL)蛋白的表达显著降低，这与QA-F组和对照组相比引起表达分别降低57.2％和70％。这一发现与在肿瘤生长抑制中的数据一致，表明QA-M比游离药物组合发挥更大的抗肿瘤作用。

1.3.4不同处理之后的肿瘤免疫微环境变化

已知肿瘤还利用几种免疫抑制机制来防止抗肿瘤免疫应答。Wu等，2018；Fridman等，2012。QA-M可显著减少免疫抑制性细胞群(图7A，其他组的详细数据可见于图8中)。观察到强免疫抑制性Treg和MDSC显著减少。与未经处理对照相比，QA-M组中与癌症患者的不良预后相关的Treg(CD4⁺Foxp3⁺T细胞)的肿瘤含量(Sakaguchi等，2010)降低了91.1％(p<0.0001)。QA-M还将MDSC的百分比从未经处理组中的8.4±2.4％和QA-F组中的7.6±2.6％降低到QA-M组中的2.6±0.6％，达到统计学显著(p<0.05)。MDSC在肿瘤微环境中的积聚促进了肿瘤细胞的存活，并且抑制了T细胞的增殖和功能活性。Xu等，2013。

该处理还可抑制促肿瘤炎症(图7A，其他组的详细数据可见于图9中)。分析了Toll样受体4阳性(TLR4⁺)细胞，并且QA-F和QA-M两者使百分比从PBS组中的13.4±1.1％下降到QA-F组中的6.3±0.8％和QA-M组中的3.4±0.1％。CRC中TLR4过表达与免疫抑制和对治疗的抗性有关。Li等，2014；Yesudhas等，2014。炎症是癌症发生的核心。抗炎药物可提高治疗CRC的效力。Wang和DuBois，2013。Q的抗炎作用主要源于其对促炎细胞因子肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素6(IL-6)和白介素-1β(IL-1β)以及炎性介质例如过氧化氢酶和一氧化氮的抑制作用。Li等，2016。如中国药典和欧洲药典中所述，A在临床上用作抗炎剂，其通过抑制环氧合酶2的表达和减弱环氧合酶2与NF-κB细胞之间的结合进行。Wang等，2013。观察到QA-M中CD11c阳性细胞上的PD-L1表达也显著降低，其为PBS组中的27.5％。PD-L1表达于活化的抗原呈递细胞的细胞表面上并选择肿瘤细胞，这抑制了免疫应答。已证明树突细胞(DC)上表达的PD-L1抑制初始和效应T细胞。Sage等，2018。QA-M组中DC上PD-L1表达降低可改善抗肿瘤T细胞响应的活性。还发现QA-M组中免疫抑制性细胞因子IL-10、TGF-β、IL-1β和CCL2的分泌降低。因此，QA-M在经处理的肿瘤中发挥了强抗炎作用。

原位结直肠肿瘤中具有严格的免疫抑制性环境。研究了肿瘤中的肿瘤浸润性免疫细胞是否可被适当活化。重要的是，在QA-M处理组中观察到CRT⁺细胞显著增加，这与图7B中的ICD效应一致。在原位CRC肿瘤内由Q和A共递送诱导的协同ICD效应强烈地重新激活抗肿瘤免疫。ICD释放HMGB-1和CRT，这转而激活DC。QA-M对肿瘤中的CD3⁺T细胞、CD8⁺和CD4⁺T细胞表现出最大的作用，其与对照组相比分别提高7.4倍、4.4倍和6.8倍(图7B和图7C，其他组的详细数据可见于图10和图11中)。已知DC的成熟与细胞表面上MHC II类和共刺激分子(例如CD40、CD80和CD86)的表达提高有关。Palucka等，2012。本发明公开的结果显示，QA-M处理大大提高了树突细胞上共刺激信号(MHC II类和CD86)的水平，表明这些DC成熟并被激活而促进抗肿瘤T细胞响应并诱导分泌细胞因子，例如白介素12(IL-12)。流式细胞术分析显示，QA-M对自然杀伤(NK)细胞的淋巴细胞群有显著且积极的影响。在QA-M处理之后，肿瘤中CD4⁺和CD8⁺T细胞的IFN-γ产生显著提高。这表明T细胞被激活，这可能是宿主存活时间延长的主要原因。干扰素-γ(IFN-γ)是Th1细胞因子，并且对细胞介导的抗肿瘤免疫应答的发生至关重要。与未经处理组相比，QA-F没有提高IL-12和IFN-γ，而QA-M处理诱导肿瘤中IL-12和IFN-γ的显著更高的水平。C-X-C基序趋化因子9(CXCL9)是对干扰素-γ(IFN-γ)响应而产生的细胞因子之一，并伴随活化的淋巴细胞的积聚而触发炎症。Han等，2017。QA-M显著提高CXCL9的表达。干扰素不仅表现出重要的抗病毒作用，而且对细胞免疫应答的质量发挥关键影响并且放大针对特定T细胞的抗原呈递。Le等，2000。与对照组和QA-F相比，QA-M也可显著提高肿瘤坏死因子α(TFN-α)的分泌。因此，通过将Q和A经胶束共递送至肿瘤，抑制性免疫细胞和细胞因子显著下调，并且同时免疫活性细胞和细胞因子上调。

肿瘤裂解物的western印迹分析在图7D中显示(其他组的详细数据可见于图12中)。当与PBS组和QA-F组相比时，QA-M表现出磷酸-AMP活化蛋白激酶α(p-AMPKα)蛋白的表达显著提高。对于哺乳动物雷帕霉素靶标(mTOR)和磷酸-mTOR(p-mTOR)，QA-M降低了这两种蛋白质的表达。自噬被定义为使细胞成分递送到溶酶体并降解以维持基本活性和生存力的过程。Wang等，2018。结果表明，QA-M可抑制Bcl-2来诱导细胞凋亡，然后促进自噬的发生。QA-M触发自噬的另一条路线是通过产生p-AMPK并抑制mTOR和p-mTOR。蛋白激酶B(Akt)/腺苷单磷酸蛋白激酶(AMPK)/mTOR途径是代谢途径协调和因此营养供应平衡的关键信号传导联系。Kim等，2011；Kim等，2016。报道了Q通过通过靶向和失活线粒体FIFO-ATP酶/ATP合酶以及提高AMP水平来抑制线粒体ATP产生来激活内源性mTOR抑制剂AMPK。Rivera等，2016；Ahn等，2008；Zheng和Ramirez，2000。与通过流式细胞术检测观察到的类似，也观察到CRT水平比PBS组显著性高2.4倍。

1.3.5QA-M的长期抗肿瘤免疫记忆效应

当将荷瘤小鼠中的CD4⁺或CD8⁺T细胞在QA-M处理前耗竭时，Song等，2018，通过抗CD4或抗CD8a抗体处理，停止的肿瘤生长消失，而同种型匹配的IgG没有作用(图13A)。结果表明免疫监视T细胞对QA-M的效力起重要作用。QA-M组的肿瘤中先天性免疫应答的激活诱导适应性免疫应答的激活，从而抑制肿瘤生长。

免疫记忆响应的一个重要特征是它诱导针对抗原攻击的长期记忆响应的能力。除了局部细胞毒性T淋巴细胞(CTL)受到QA-M处理影响外，免疫监测细胞的另一组分，肿瘤特异性记忆T细胞，也显著募集(图13B，其他组的详细数据可见于图14中)。QA-M引起淋巴结(LN)中记忆CD8⁺和CD4⁺细胞增加表明了ICD在体内的有效性。在小鼠中接种CT26-FL3原位结直肠肿瘤之后19天，未经处理组和经处理组(每隔一天的四次QA-M注射)同时皮下接受CT26-FL3细胞和4T1细胞的再次攻击。11天之后，测量肿瘤(图13C)。经处理组和未经处理组中4T1细胞的肿瘤生长均显示无显著差异。然而，经处理组中CT26-FL3的肿瘤生长相对减慢至为未经处理组的约50％。结果表明，QA-M诱导免疫系统的长期记忆响应，其对CT26-FL3细胞具有特异性，但对4T1细胞则没有。

1.3.6在原位乳腺癌模型中的治疗效力

还检查了在Balb/c小鼠的乳腺脂肪垫中生长的三阴性乳腺癌细胞对QA-M的响应。在PBS和QA-F处理组中，观察到肿瘤的持续生长。用QA-M处理的组显示肿瘤生长速率显著降低(图15)。QA-M组的肿瘤重量分别为PBS和QA-F处理组的26.1％和34.2％。这些发现表明QA-M在抑制4T1乳腺癌的肿瘤生长方面是有效的。

1.3.7总结

癌细胞已经设计出控制细胞死亡和限制濒死细胞发出危险信号从而逃避免疫监视的策略。报道了约95％的CRC患者中的肿瘤是微卫星稳定型的，这通常与较少的新抗原和弱全身性免疫刺激有关。Goodwin和Huang，2017。在此，低浓度的Q(在该浓度下其本身未观察到ICD效应)可帮助A诱导以CRT易位和HMGB 1释放为特征的ICD效应。此外，当与A以一定比例组合时，Q可诱导对于CT26-FL3细胞的更多细胞死亡，而组合的药物的IC50远低于单独使用的Q的IC50。因此，制备QA-M的目的是展示在体内在最佳摩尔比下的协同ICD效应。利用由纳米药物递送系统产生的长循环和EPR效应的优势，胶束混悬剂提升了Q和A在肿瘤中的积聚，并在静脉内注射之后的早期时间点保持最佳比例。

除了比例药物负载外，由于比例生物分布，通过QA-M对原位CRC肿瘤的处理和4T1乳腺肿瘤中的显著抗肿瘤生长作用，观察到了强的抗肿瘤免疫。ICD释放的HMGB 1和CRT可激活DC用于肿瘤抗原摄取和加工。活化的DC是针对肿瘤的初级T淋巴细胞响应的高效抗原呈递细胞，因此，上调的DC上共刺激信号(MHCII和CD86)可成功引发抗肿瘤T淋巴细胞增殖和细胞因子分泌。

肿瘤微环境中的免疫有效细胞(例如T细胞、NK细胞和免疫抑制性细胞(包括Treg细胞、M2肿瘤相关巨噬细胞、MDSC))之间的平衡可校正针对恶性细胞的免疫应答。该治疗之后的主要变化包括显著减少强免疫抑制性Treg细胞和MDSC，抑制促肿瘤炎症，大大提升肿瘤浸润性淋巴细胞和趋化因子的表达，和降低自噬。改变了肿瘤抑制性微环境，同时促进了抗肿瘤响应和肿瘤监视。在细胞水平上，表明了适应性免疫系统有助于这些全身性反应，并且NK细胞也增加。此外，因为检测到来自荷瘤小鼠的淋巴结中T细胞增加，危险信号或细胞因子(例如TNF-α和IFN-γ)的释放促进了DC的成熟和交叉呈递，这导致通过活化肿瘤特异性T细胞使较远端肿瘤团块消退。用单克隆抗体中和CD4⁺和CD8⁺T细胞之后，治疗作用被阻断。所有这些结果表明QA-M不仅改变了抑制性肿瘤微环境，而且还成功地促进了全身性记忆抗肿瘤响应。

此外，QA-M制剂简单地由两种聚合物TPGS和DSPE-PEG2000构成。TPGS被美国食品与药品管理局批准用作Tocosol(紫杉醇纳米乳剂，Sonus PharmaceuticalsIncorporation)中的安全佐剂，并且DSPE-PEG2000也被美国食品与药品管理局批准作为抗肿瘤产品Doxil(多柔比星HCl脂质体注射剂，ALZA公司)的组分。对于QA-M安全且方便的方案使其具有作为免疫治疗剂进行大规模生产和临床应用的潜力。

1.4材料和方法

1.4.1材料

Q(纯度>95％)、D-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯(TPGS)、葛根素和乙酸1-萘酯和芘购自Sigma-Aldrich(Sigma-Aldrich，MO，USA)。A(纯度>98％)购自上海同田生物技术股份有限公司(Shanghai Tauto Biotech Co.,Ltd.)。N-(甲氧基聚乙烯氧基羰基)-1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DSPE-PEG)购自NOF公司(

DSPE-020CN)。DeadEnd^TM荧光TUNEL测定试剂盒从Promega(Madison，WI，USA)获得。含有DAPI(4’,6-二脒基-2-苯基吲哚)的抗淬灭封固剂来自Vector实验室(Burlingame，CA，USA)。DiD’固体(l,1’-双十八烷基-3,3,3’,3’-四甲基吲哚二羰花青,4-氯苯磺酸盐)来自Invitrogen(Carlsbad，CA，USA)。蛋黄卵磷脂(PC-98T，PC>98％)来自Kewpie公司(Shibuya，Tokyo，Japan)。所有其他化学品均为分析级，并在收到时使用。

1.4.2.细胞系

原始鼠CT26-FL3细胞由University of South Carolina Murine的Maria Pena博士惠赠，并用携带RFP/Luc和嘌呤霉素抗性基因的载体转染以表达红色荧光蛋白(RFP)/Luc。CT26-FL3细胞在37℃和5％CO₂下在含有10％FBS和1％青霉素/链霉素(PS)(Invitrogen，Carlsbad，CA)达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco’s Modified Eagle’sMedium)(DMEM，高糖，Gibco)中培养。鼠乳腺癌4T1细胞购自UNC Lineberger综合癌症中心的组织培养机构，并在37℃和5％CO₂下在含有10％FBS和1％青霉素/链霉素(PS)(Invitrogen，Carlsbad，CA)的Roswell Park Memorial Institute(RPMI)-1640培养基中培养。

1.4.3动物

从Charles River实验室获得6周龄雌性Balb/c小鼠(20±2g)。所有动物处理程序均获北卡罗来纳大学(University of North Carolina)的教堂山机构动物护理和使用委员会(Chapel Hill’s Institutional Animal Care and Use Committee)批准。雌性Sprague-Dawley大鼠(200±20g)由湖南斯莱克景达实验动物有限公司(Hunan SJALaboratory Animals)(中国湖南)提供。这些动物在江西中医药大学(Jiangxi Universityof Traditional Chinese Medicine)的动物实验中心饲养。动物室在整个实验期间通风良好并具有有规律的12小时光-暗循环。

1.4.4抗体

InVivoMAb抗小鼠CD8α(Lyt 2.1)、抗小鼠CD4(克隆GK1.5)、大鼠IgG2b同种型购自BioXcell(West Lebanon，NH)。

1.4.5对CRT易位和细胞释放HMGB1的协同效应

将CT26-FL3细胞以2×10⁵/皿的密度接种于35-mm的具有玻璃底部的细胞培养皿中，并在处理前孵育24小时。去除细胞培养基，并以指定的浓度用含有不同Q与A组合的培养基补充4小时用于CRT检测，和8小时用于HMGB1检测。将细胞固定并洗涤3次。加入在冷封闭缓冲液(PBS中10％山羊血清)中稀释的一抗抗CRT抗体(ab2907，1:500，Abcam)60分钟。在冷PBS中洗涤三次后，然后将细胞与在冷封闭缓冲液中稀释的Alexa

488山羊抗兔(IgG)(ab150077，1:500，Abcam)孵育60分钟。将细胞用4％PFA固定20分钟，并添加DAPI封固剂用于核染色。对于细胞内HMGB1染色，将细胞固定并洗涤3次。随后，用含有0.1％TritonX-100的封闭缓冲液使细胞透化10分钟，并用PBS冲洗三次，非特异性结合位点封闭30分钟。添加HMGB1的一抗(ab79823，1:500，Abcam)60分钟。然后用在冷封闭缓冲液中稀释的Alexa

488山羊抗兔(IgG)(ab150077，1:500，Abcam)孵育细胞60分钟。将细胞用4％PFA固定20分钟，并添加DAPI封固剂用于核染色。在40×物镜下在Olympus IX81倒置显微镜下使载片可视化。

1.4.6药物组合的协同性细胞毒性作用

使用MTT(3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四唑溴化物)方法评估了游离Q、游离A和药物组合针对CT26-FL3细胞的细胞毒性。Zhang等，2017。将细胞接种在96孔板(每孔5×10³个细胞)中，并在处理之前孵育24小时。然后取出培养基，向每个孔加入含有游离药物和药物组合(具有一系列浓度)的新鲜培养基。孵育24小时之后，通过MTT测定确定细胞生存力。通过使用Chou和Talalay方法计算组合指数(CI)评价Q和A的协同作用。Zhang等，2014；Chou等，1984。通过使用下式(1)计算CI：

CI＝(D)₁/(D_x)₁+(D)₂/(D_x)₂ (1)

其中(D)₁和(D)₂是单一药物在组合之后抑制x％细胞生长的浓度，(D_x)₁和(D_x)₂是单一药物单独地抑制x％细胞生长的浓度。CI值大于1或小于1分别表示药物组合的拮抗或协同。

1.4.7QA-M的制备和表征

QA-M由DSPE-PEG2000和TPGS通过乙醇注射法制备。简单地说，首先将Q和A(1:4，摩尔比)与载体材料(1:6.5，摩尔比)(包括DSPE-PEG2000和TPGS(1:4.8，摩尔比))一起溶解在乙醇中，乙醇用作可混溶性溶剂。然后在60℃下在搅拌30分钟的情况下，将透明有机溶液逐滴添加到2mL水中。然后在室温下将混悬物在蒸馏水中透析另外2小时，以去除残余乙醇。

负载Q和负载A的胶束(Q-M和A-M)的制备方法与QA-M相同，不同之处在于：Q或A单独使用。负载DiD的胶束(DiD-M，47.5μM)的制备也采用所述的相同方案，不同之处在于：使用DiD代替混合物中的Q和A。

使用Malvern Zetasizer Nano-ZS90(Malvern Instruments，Malvern，UK)通过动态光散射法测量胶束的平均尺寸和ζ电位。所有结果均为三次测试运行的平均值。在JEM-1230透射电子显微镜(TEM)(JEOL，Japan)下观察QA-M的形态。用蒸馏水稀释胶束，并用磷钨酸在硝化纤维素覆盖的铜网上负染。将样品在环境温度下干燥，然后观察。

Q和A在胶束中的包封效率(EE)作为胶束中负载的药物量占原始加料量的百分比计算。胶束的载药量(DL)作为负载的药物量相对于用于负载的聚合物总量的百分比计算。简言之，将5mg游离经干燥QA-M溶解于0.6mL甲醇中，然后通过高效液相色谱(HPLC)在ZORBAX SB-C18柱(250mm×4.6mm²，5μm；Agilent Technologies，Santa Clara，CA，USA)上在268nm下分析溶液中Q或A的量。流动相为0.06M乙酸铵溶液(pH 5.7，使用冰乙酸调节)-乙腈。使用梯度洗脱，流速为1.0mL/分钟，其中最初保持7分钟5％的有机溶剂(含乙腈的乙酸铵溶液)，然后在10分钟内线性提高至70％，在此将其保持另外8分钟，最后在10分钟内线性降低至5％，在此将其保持直到5分钟运行结束。柱温保持在25℃，进样体积为10μL。

1.4.8CMC确定

采用标准芘作为荧光探针技术来确定QA-M的临界胶束浓度(CMC)。Hou等，2011。简言之，将1mL在丙酮中的1mg/mL芘溶液转移到空容器中，随后允许丙酮在暗处通过气流蒸发。向每个烧瓶中添加一系列具有不同聚合物浓度的QA-M，以实现2.5×10^-5至3×10^-2mg/mL的最终浓度。在声处理30分钟之后，将胶束和芘的组合在60℃下孵育1小时。在室温下在暗处平衡过夜之后，使用Cary Eclipse荧光分光光度计(Agilent，CA，USA)测量样品。将发射波长调整为390nm，并选择芘的激发波长330nm和340nm作为检测波长。将强度比(I₃₄₀/I₃₃₀)作为聚合物浓度对数的函数绘制。QA-M的CMC值由最佳拟合线的交点确定，这指示在水性介质中形成稳定胶束所需的最小聚合物浓度。

1.4.9稀释稳定性

如先前所报道的，通过将QA-M胶束在PBS(pH＝7.4)中以12至60倍稀释度在37℃下孵育24小时来研究其稀释稳定性。Valera-Garcia等，2018；Zhang等，2017。用上述方法确定了尺寸分布和药物包封效率。

1.4.10体外释放

通过透析法研究了来自QA-M的Q和A的释放行为。将QA-M(2mL)置于预溶胀透析袋(截留Mw 8000)中，然后在以100rpm的速度搅拌下将其在37℃下浸没在空卵磷脂混悬物(PC-98T，100mg/mL，100mL)中72小时。卵磷脂混悬物是通过膜水合法且随后声处理形成的，该卵磷脂混悬物的尺寸为约100nm。通过确定卵磷脂混悬物中游离Q和A的最大浓度(其分别为0.5mg/mL和0.8mg/mL)，确认了漏槽条件。在不同时间点，从释放培养基中提取1.0mL样品，与甲醇混合，并使用上述HPLC法测量Q和A。在37℃下向释放培养基补充等体积的新鲜培养基。在整个实验过程中保持漏槽条件。所有测量均一式三份进行，并计算平均值和标准偏差。

1.4.11胶束分布

为了观察胶束的分布，如上所述制备了负载DiD的胶束(DiD-M，150μg/kg)，并将其注射到荷瘤小鼠中。24小时之后处死DiD-M和PBS处理组的小鼠。收集主要器官和肿瘤，并通过IVIS成像进行观察。检测肿瘤和主要器官的目的区域(ROI)荧光强度(n＝3)。

1.4.12药代动力学和组织分布

将12只健康Sprague-Dawley大鼠(200+20g)随机分为两组，并在实验前禁食过夜。以Q为3mg/kg和A为9mg/kg向这两组中大鼠的尾静脉内注射(i.v.)Q和A的混合溶液(QA-F)以及QA-M。在指定时间(0.0083、0.0167、0.033、0.117、0.25、0.5、1、2、4、8、12和24小时)注射之后，从眶后丛取出血液样品(500μL)。将血液样品在室温下以6,000rpm离心5分钟，并将200μL分离的血浆保持在-80℃下用于分析。

将50μL内标-葛根素(1.0μg/mL)和乙酸1-萘酯(0.5μg/mL)各自的甲醇溶液添加到100μL血清样品中以分别确定Q和A。将混合物涡旋5分钟。然后向混合物中添加2mL乙酸乙酯并涡旋另外10分钟，然后在室温下以10,000rpm离心10分钟，以将药物溶解在有机溶剂中。获得的上清液在N₂下干燥并在乙醇中溶解，然后使其经受超高效液相色谱(UHPLC)/质谱(MS)，用于使用配备有电喷雾离子源的TRIPLE QUDA 4500液相色谱三重四极杆质谱仪(ABSCIEX，Framingham，MA，USA)在正离子模式下检测Q和A。

色谱分离在XB-C18 Ultimate UHPLC柱(21mm×50mm，1.8μm，Welch Materials，TX，USA)上确定。使用溶剂A(0.1％甲酸溶液)和溶剂B(乙腈)完成梯度洗脱。以0.28mL/分钟的流速完成梯度洗脱。最初，从0.01分钟至1分钟使用10％有机溶剂(含乙腈的甲酸溶液)，在1分钟中线性提高至90％，在此将其保持另外2.7分钟，然后在另外3.3分钟中降至10％，最后在8分钟时降至10％，在此将其保持至8分钟运行结束。

在多离子反应监测模式中质谱仪在正离子模式下运行。定量分析Q和内标葛根素的离子反应比分别为m/z 303.1→m/z 229.2和m/z 416.8→m/z 297.2。Q和内标的碰撞能分别为42V和43V。A和内标乙酸1-萘酯的定量分析的离子反应比分别为m/z 233.1→m/z117.1和m/z 187.2→m/z 145.0。A和内标的碰撞能分别为24V和10V。离子化条件包括使用电喷雾离子源，其中进样电压为5.5kV，离子源温度为600℃，GS1压力为50psi，GS2压力为45psi，碰撞气体压力为9psi。

如之前所报道的，在雌性BALB/c小鼠中建立了原位Ct-26-FL3结直肠肿瘤模型。Song等，2018。将24只荷瘤Balb/c小鼠随机分为两组，并在实验前禁食过夜。以Q为3mg/kg和A为9mg/kg向这两组中小鼠的尾静脉内注射(i.v.)QA-F和QA-M。在不进行处理的情况下处死另外三只动物，并将其组织用作空白对照和用于制备对照加标样品。

在2、4、12和24小时时将动物分为三组处死。组织样品用盐水匀浆化至0.2g/mL。将葛根素1μg/mL和乙酸1-萘酯500ng/mL的50微升溶液分别作为Q和A的内标添加到组织匀浆中。将组织样品涡旋5分钟，然后添加2mL乙酸乙酯。然后将混合物涡旋10分钟，然后以10,000rpm离心10分钟，以获得上清液用于检测。获得的上清液在N₂下干燥，并在乙醇中溶解，然后对其进行药代动力学研究中提到的UHPLC/MS。

1.4.13原位结肠肿瘤生长抑制测定

如之前所报道的，在雌性Balb/c小鼠中建立了原位CT26-FL3结直肠肿瘤模型。Song等，2018。将28只荷瘤小鼠分为七个随机组：PBS、游离Q(Q-F)、游离A(A-F)、游离Q和A的组合(QA-F)、Q-M、A-M和QA-M。以3mg/kg的Q剂量和9mg/kg的A剂量通过总共四次注射(i.v.)向小鼠静脉内注射制剂，每2天一次。PBS组中小鼠注射PBS作为对照。通过腹膜内(i.p.)注射100μL D-萤光素(Pierce^TM，20mg/mL)并随后使用

动力学光学系统(PerkinElmer，CA)进行生物发光分析检测肿瘤负荷。每2天记录小鼠的肿瘤生长和体重。肿瘤体积的增量作为发光强度计算，并相对于测量第一天的原始值归一化(V_t/V₀)。记录各组小鼠的体重。最后一次注射之后9天，处死小鼠，取出肿瘤、心脏、肝、脾、肺和肾组织，用于本研究。从眶丛收集血液样品，放入肝素化管中，然后以5,000rpm离心5分钟以分离血浆。收集一份肿瘤、脾和淋巴结用于流式细胞术分析。将一份肿瘤固定在4％福尔马林中，石蜡包埋并切片用于末端脱氧核苷酸转移酶介导的缺口末端标记(TUNEL)测定、免疫荧光染色以及苏木精和伊红(H&E)染色。将一份肿瘤储存在-80℃下用于western印迹和RT-PCR测定。

1.4.14H&E染色

将肿瘤固定于4％福尔马林中，石蜡包埋并切片进行苏木精和伊红(H&E)染色。通过H&E染色确定细胞凋亡、转移和毒性，并通过光学显微术拍照。

1.4.15TUNEL测定

按照制造商(Promega，Madison，WI，USA)的建议进行TUNEL测定。用DAPI封固剂对细胞核进行染色。用Olympus IX81倒置显微镜分析样品，并用Image J软件进行定量。

1.4.16流式细胞术分析

如之前所述，对肿瘤和脾的单细胞混悬物进行加工和收集。Song等，2018。在免疫荧光染色之后，通过流式细胞术分析脾细胞、淋巴细胞和肿瘤浸润性白细胞(TIL)。使用与荧光团缀合的抗体对细胞进行染色(表2)。所有抗体均从Biolegend(San Diego，CA)或Abcam(Cambridge，MA)购买。所有样品均通过使用18色流式细胞仪(LSR II，BDBiosciences，CA)进行分析，数据使用FlowJo 8.6软件(TreeStar)进行分析。

IF：免疫荧光。Flow：流式细胞术。WB：western印迹。

1.4.17定量实时聚合酶链反应(RT-PCR)

使用RNeasy微阵列组织微型试剂盒(Qiagen)从肿瘤组织中提取总RNA。使用iScript^TM cDNA合成试剂盒(BIO-RAD)反向转录cDNA。通过使用用于RT-qPCR的TaqMan^TM基因表达主混合物(ThermoFisher)扩增cDNA(150ng)。GAPDH用作内源性对照。表3列出了具有特定目录号的RT-PCR引物。使用7500实时PCR系统进行反应，并通过7500软件分析数据。

表3实时PCR的引物列表

引物	应用的生物系统
		小鼠IFN-γ	Mm01168134_m1
小鼠TNF-α	Mm00443260_g1
		小鼠TGF-β	Mm01178820_m1
小鼠IL10	Mm01288386_m1
		小鼠CXCL9	Mm00434946_m1
小鼠CCL2	Mm00441242_m1
		小鼠IL-1β	Mm00434228_m1
小鼠GAPDH	Mm99999915_g1

1.4.18免疫荧光染色

在脱蜡、抗原修复和透化之后，将样品在室温下在5％BSA中封闭1小时。将与AlexaFluor 647(Biolegend，San Diego，US)缀合的抗CD3添加到载片在4℃下过夜。然后用含有DAPI的抗淬灭封固剂对细胞核进行复染。在Olympus IX81倒置显微镜下观察样品，并通过Image J软件进行定量。

1.4.19Western印迹分析

通过Pierce BCA蛋白质测定试剂盒(Thermo Scientific，USA)提取和定量蛋白质。使用NuPAGE 4-12％双-Tris SDS-PAGE凝胶电泳分离40微克蛋白质，并转移至聚偏氟乙烯膜(PVDF；Thermo Scientific)。在PBS吐温20溶液(Fisher Scientific，Faith Lawn，NJ，USA)中用5％BSA封闭含有蛋白质的PVDF膜1小时。然后用一抗(1:1000稀释，Bcl-2、Bcl-xL、p-AMPKα、mTOR、p-mTOR、CRT和GAPDH)在4℃下孵育膜过夜，然后用辣根过氧化物酶(HRP)缀合的二抗抗兔IgG(Cell Signal Technology，Danvers，MA，USA)在室温下孵育1小时。洗涤并使用ChemiDoc XRS+成像系统(Bio-Rad，CA，USA)捕获膜。GAPDH用作负载对照。Image J软件(国立卫生研究院)用于半定量平均灰度值，并相对于GAPDH的平均灰度值归一化。

1.4.20长期抗肿瘤免疫记忆效应

将总共l×l0⁶个CT26-FL3细胞原位接种到25只6周龄雌性Balb/C小鼠(Janvier，Charles River)中，并如上所述i.v.注射PBS和QA-M(Q为3mg/kg，A为9mg/kg)。抗小鼠CD8α、抗小鼠CD4和抗大鼠IgG(200μg/小鼠，i.p.)在QA-M注射之前一天给予，每三天，共注射3次。Song等，2018。每隔一天使用IVIS系统监测和记录肿瘤体积。

向10只小鼠接种l×l0⁶个CT26-FL3细胞以建立原位结直肠鼠模型。最后一次注射之后4天，将l×l0⁶个4T1细胞接种于右下肋，而在同一天将l×l0⁶个CT26-FL3细胞接种于对侧肋。记录小鼠两侧的肿瘤体积。

1.4.20在原位乳腺癌模型中的治疗效力

向12只Balb/c雌性小鼠在乳腺处接种4T1细胞(每只小鼠1×10⁶个)以建立原位乳腺肿瘤模型。当肿瘤体积达到100mm³时，将小鼠分为三组：PBS、QA-F和QA-M。通过四次注射(i.v.)以3mg/kg的Q剂量和9mg/kg的A剂量将制剂施用于小鼠，每隔一天一次。对照组小鼠仅施用PBS。每隔一天测量小鼠的肿瘤体积，并使用式(2)计算：

V＝(W²×L)/2 (2)

其中V为肿瘤体积，W为较小的垂直直径，L为较大的垂直直径。实验结束时测量肿瘤重量并成像。

1.4.20统计学测定

所有结果均以平均值±标准差(SD)呈现。使用Student t检验和单因素方差分析来评价显著性，p<0.05被认为是显著的。

参考文献

说明书中提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献表示本发明公开主题所属领域的技术人员的水平。所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献均在此通过引用并入，程度如同每个单独的出版物、专利申请、专利和其他参考文献被具体地和单独地指明通过引用并入一样。将理解，尽管本文引用了许多专利申请、专利和其他参考文献，但是这样的引用并非承认这些文件中的任一个构成本领域公知常识的一部分。

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尽管为了清楚理解的目的已经通过举例说明和实例的方式在一些细节方面对前述主题进行了描述，但是本领域技术人员将理解，可以在所附权利要求书的范围内实施某些改变和修改。

Claims (40)

1.用于治疗癌症的胶束制剂，其包含协同有效量的槲皮素和土木香内酯、或其衍生物。

2.权利要求1所述的胶束制剂，其中所述槲皮素和土木香内酯以选自约1:13槲皮素:土木香内酯(mol/mol)、约1:7槲皮素:土木香内酯(mol/mol)和约1:4槲皮素:土木香内酯(mol/mol)的摩尔比存在于所述胶束制剂中。

3.权利要求1所述的胶束制剂，其中所述槲皮素和土木香内酯以约1:4槲皮素:土木香内酯(mol/mol)的摩尔比存在于所述胶束制剂中。

4.权利要求1所述的胶束制剂，其中所述胶束制剂包含1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-甲氧基-聚(乙二醇2000)(DSPE-PEG2000)和D-α-生育酚聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS)的组合。

5.权利要求1所述的胶束制剂，其中所述胶束制剂包含球形颗粒。

6.权利要求5所述的胶束制剂，其中所述球形颗粒的直径为约20nm。

7.权利要求5所述的胶束制剂，其中所述胶束制剂的ζ电位为约-0.3±0.1mV。

8.权利要求1所述的胶束制剂，其中所述胶束制剂针对槲皮素和土木香内酯的包封效率为大于约90％。

9.权利要求1所述的胶束制剂，其中所述胶束制剂的临界胶束浓度(CMC)为约0.003mg/mL。

10.用于在有此治疗需要的对象中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗有效量的权利要求1至9中任一项所述的胶束制剂以治疗所述癌症。

11.权利要求10所述的方法，其中所述癌症选自结直肠癌、乳腺癌、胰腺癌、宫颈癌、前列腺癌和淋巴瘤。

12.权利要求11所述的方法，其中所述结直肠癌是微卫星稳定型结直肠癌。

13.权利要求10所述的方法，其中协同有效量的槲皮素和土木香内酯的施用诱导免疫原性细胞死亡(ICD)和/或诱导癌细胞凋亡。

14.权利要求10所述的方法，其中协同有效量的槲皮素和土木香内酯的施用抑制肿瘤生长和/或进展。

15.权利要求10所述的方法，其中协同有效量的槲皮素和土木香内酯的所述施用降低所述癌症的肿瘤微环境中免疫细胞的百分比。

16.权利要求15所述的方法，其中在所述癌症的肿瘤微环境中的所述免疫细胞选自髓样来源抑制细胞(MDSC)和T调节细胞(Treg)。

17.权利要求10所述的方法，其中协同有效量的槲皮素和土木香内酯的所述施用抑制一种或更多种细胞中的促肿瘤炎症。

18.权利要求10所述的方法，其中协同有效量的槲皮素和土木香内酯的所述施用降低一种或更多种癌细胞中的Toll样受体4阳性(TLR4⁺)表达。

19.权利要求10所述的方法，其中协同有效量的槲皮素和土木香内酯的所述施用降低一种或更多种癌细胞上的PD-L1表达。

20.权利要求10所述的方法，其中协同有效量的槲皮素和土木香内酯的所述施用降低一种或更多种癌细胞中免疫抑制性细胞因子的分泌。

21.权利要求20所述的方法，其中所述免疫抑制性细胞因子选自IL-10、TGF-β、IL-1β和CCL2。

22.权利要求10所述的方法，其中协同有效量的槲皮素和土木香内酯的所述施用激活癌症肿瘤中的一种或更多种肿瘤浸润性免疫细胞。

23.权利要求22所述的方法，其中所述一种或更多种肿瘤浸润性免疫细胞包含一种或更多种CRT⁺细胞。

24.权利要求23所述的方法，其中所述一种或更多种CRT⁺细胞选自CD3⁺T细胞、CD8⁺T细胞和CD4⁺T细胞。

25.权利要求10所述的方法，其中协同有效量的槲皮素和土木香内酯的所述施用提高一种或更多种树突细胞上共刺激信号(MHC II类和CD86)水平的表达。

26.权利要求10所述的方法，其中协同有效量的槲皮素和土木香内酯的所述施用提高自然杀伤(NK)细胞的存在。

27.权利要求10所述的方法，其中协同有效量的槲皮素和土木香内酯的所述施用提高肿瘤中来自CD4⁺和CD8⁺T细胞的IFN-γ产生，所述肿瘤包括所述癌症。

28.权利要求10所述的方法，其中协同有效量的槲皮素和土木香内酯的所述施用激活T细胞。

29.权利要求10所述的方法，其中协同有效量的槲皮素和土木香内酯的所述施用在肿瘤中诱导较高水平的IL-12和IFN-γ，所述肿瘤包括所述癌症。

30.权利要求10所述的方法，其中协同有效量的槲皮素和土木香内酯的所述施用提高一种或更多种癌细胞中CXCL9的表达。

31.权利要求10所述的方法，其中协同有效量的槲皮素和土木香内酯的所述施用提高一种或更多种癌细胞中肿瘤坏死因子α(TFN-α)的分泌。

32.权利要求10所述的方法，其中协同有效量的槲皮素和土木香内酯的所述施用下调抑制性免疫细胞和细胞因子。

33.权利要求10所述的方法，其中协同有效量的槲皮素和土木香内酯的所述施用上调免疫活性细胞和细胞因子。

34.权利要求10所述的方法，其中协同有效量的槲皮素和土木香内酯的所述施用提高一种或更多种癌细胞中磷酸-AMP活化蛋白激酶α(p-AMPKα)蛋白的表达。

35.权利要求10所述的方法，其中协同有效量的槲皮素和土木香内酯的所述施用降低一种或更多种癌细胞中哺乳动物雷帕霉素靶标(mTOR)和磷酸-mTOR(p-mTOR)的表达。

36.权利要求10所述的方法，其中协同有效量的槲皮素和土木香内酯的所述施用抑制Bcl-2以诱导细胞凋亡，从而促进自噬。

37.权利要求10所述的方法，其中协同有效量的槲皮素和土木香内酯的所述施用产生p-AMPK并且抑制mTOR和p-mTOR，从而促进自噬。

38.权利要求10所述的方法，其中协同有效量的槲皮素和土木香内酯的所述施用激活肿瘤中的先天免疫应答，从而诱导适应性免疫应答的激活并且抑制肿瘤生长。

39.权利要求10所述的方法，其中协同有效量的槲皮素和土木香内酯的所述施用募集肿瘤特异性记忆T细胞。

40.权利要求39所述的方法，其中所述记忆T细胞包括CD8⁺和CD4⁺。

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