TWI775177B - 小孢子靈芝免疫調節蛋白與鑰孔蟲戚血藍蛋白用於製備治療上皮細胞癌的醫藥組合物及用途 - Google Patents
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Abstract
本發明揭露一種醫藥組合物,其包括小孢子靈芝免疫調節蛋白(GMI,ganoderma microsporum immunomodulatory protein)以及鑰孔蟲戚血藍蛋白(KLH,Keyhole limpet hemocyanin)。本發明另揭露一種小孢子靈芝免疫調節蛋白及鑰孔蟲戚血藍蛋白用於製備治療上皮細胞癌的醫藥組合物的用途。
Description
本發明是關於一種小孢子靈芝免疫調節蛋白與鑰孔蟲戚血藍蛋白用於製備治療上皮細胞癌的醫藥組合物及用途。
癌症是人類健康的一大威脅,根據衛生署公布的資料,癌症已連續三十六年蟬聯國人第一大死因。由此可見,癌症對人類健康的威脅已達不容忽視的程度。在所有的癌症種類中,約有80%以上的癌症屬於上皮細胞癌,其特徵為上皮組織的不正常腫塊,起因於過度地細胞分裂。癌症細胞不具有正常細胞生長之限制,會不正常地侵入其他細胞的範圍。基本上,身體任何有上皮組織的器官都可能罹患上皮細胞癌,較常見的有肺癌、乳癌、口腔癌、食道癌、胃癌、大腸癌、肝癌、子宮頸癌、膀胱癌、胰臟癌或皮膚癌。
傳統癌症治療的種類包括化學治療、手術治療、放射線治療、賀爾蒙療法、生物製劑療法、標靶治療以及結合前述治療方法的療法。然而,許多腫瘤對傳統方法具有抗性。近年來已進行治療癌症之免疫療法的研究,該方法藉由在遠離腫瘤之部位投予疫苗組合物來使患者產生全身性腫瘤特異性主動免疫反應。目前已提出多種類型疫苗,包括含有分離之腫瘤相關抗原的疫苗。
雖然目前已鑑別出許多腫瘤相關抗原且已研究許多這些抗原作為基於蛋白質或基於DNA之疫苗用於治療或預防癌症,但迄今大部分尚於臨床試驗階段且尚未產生治療性產品。另外,開發癌症疫苗的挑戰之一在於癌症抗原通常來源於自身且因此具有不良的免疫原性,此係因為免疫系統經自身調節而不識別自身蛋白質。因此,現仍亟需一種可增強癌症疫苗之免疫原性或治療效果的方法。
因此,提供一種醫藥組合物及其製備用途,能夠使免疫細胞產生針對腫瘤細胞的特異性主動免疫反應,且可增強醫藥組合物的免疫原性及治療效果,實為一重要課題。
有鑑於上述課題,本發明的目的為提供一種能夠使免疫細胞產生針對腫瘤細胞的特異性主動免疫反應,且可增強免疫原性及治療效果的醫藥組合物及其製備用途。
為達上述目的,依據本發明的一種醫藥組合物,包括一小孢子靈芝免疫調節蛋白(GMI,ganoderma microsporum immunomodulatory protein)以及一鑰孔蟲戚血藍蛋白(KLH,Keyhole limpet hemocyanin)。
為達上述目的,本發明另提供一種小孢子靈芝免疫調節蛋白(GMI)與鑰孔蟲戚血藍蛋白(KLH)用於製備治療上皮細胞癌的醫藥組合物之用途,其中醫藥組合物包括一小孢子靈芝免疫調節蛋白以及一鑰孔蟲戚血藍蛋白。
在一實施例中,小孢子靈芝免疫調節蛋白的劑量介於5微克/毫升至200微克/毫升之間。
在一實施例中,鑰孔蟲戚血藍蛋白的劑量介於10微克/毫升至200微克/毫升之間。
在一實施例中,小孢子靈芝免疫調節蛋白與鑰孔蟲戚血藍蛋白的重量比例介於20:1至1:40之間。
在一實施例中,醫藥組合物更包括一植物性凝血球素(PHA,phytohemagglutinin)。
在一實施例中,植物性凝血球素的劑量介於1微克/毫升至20微克/毫升之間。
在一實施例中,小孢子靈芝免疫調節蛋白與植物性凝血球素的重量比例介於200:1至1:4之間。
在一實施例中,鑰孔蟲戚血藍蛋白與植物性凝血球素的重量比例介於200:1至1:2之間。
在一實施例中,醫藥組合物的劑型係為錠劑、膠囊、乳劑、分散劑、懸浮劑、溶液劑、糖漿劑、顆粒劑、經皮貼劑、凝膠劑、粉劑、霜劑、膏劑、栓劑或噴霧劑。
在一實施例中,上皮細胞癌係為肺癌、乳癌、口腔癌、食道癌、胃癌、大腸癌、肝癌、子宮頸癌、膀胱癌、胰臟癌或皮膚癌。
在一實施例中,上皮細胞癌係為肺癌、乳癌、胰臟癌或膀胱癌。
承上所述,本發明的一種醫藥組合物及其製備用途,能夠使免疫細胞產生針對腫瘤細胞的特異性主動免疫反應,且可增強醫藥組合物的免疫原性及治療效果。
以下將參照相關圖式,說明依本發明所提供的各種實施例,其中相同的元件將以相同的參照符號加以說明。
需先說明的是,以下提供了本發明的多個實施例,雖然每個實施例都代表在某種可能的情況下本發明所揭露之元件的一種組合,但本發明仍應包括其所揭露之元件的所有可能的組合。因此,如果一個實施例包括元件A、B及C,而第二實施例包括元件B及D,即使未明確揭露,本發明應理解為仍包括A、B、C及/或D的其他種類的任意組合。
而在下述的某些實施例中,其中描述了用於表示成分的量、特性(例如濃度、反應條件等等)的數值,其應理解為在一些情況下被用語「大約」加以修飾。因此,在某些實施例中,本說明書及所附之申請專利範圍中所記載的數值參數是近似值,其可依據特定實施例所試圖獲得之所需特性而改變。在某些實施例中,應根據所記載之有效位數的數字及應用一般的數值簡化技術來解釋數值參數。然而,即便在某些實施例中,其數值範圍及數值參數是近似值,但在具體實驗例中所提出的數值則是盡可能地精確記載。在本文中所記載的數值可能包含某些誤差,其係因於統計各個量測值而產生的標準差所導致。
除非本文另有規定,本文所提出的所有數值範圍應解釋為包含它們的端點,而開放式範圍應解釋為包含商業上可實施的數值。同樣地,除非本文另有規定,所有的數值列表應被認為包含其中間的數值。亦即,本文所提及的數值範圍僅意在作為一一指稱各個落在該範圍內的單獨數值的簡寫方法。除非另有說明,在範圍內的每個單獨數值皆被納為本說明書揭露之一部分,如同其於本文中一一被指稱。
本文所揭露之替代元件或實施例之群組不應解釋為本發明之限制。每個群組成員可被單獨地提及和要求保護,或者係以與該群組內其他成員或本文中其他元件任意結合的方式被提及和要求保護。基於便利性及/或專利性的理由,群組中之一個或多個成員可以納入在群組中或自群組中刪除。當發生任何前述之納入或刪除的情況時,說明書應被視為包括修改後之群組,從而滿足所附之申請專利範圍中使用的所有馬庫西式群組之書面說明要件。而說明書中的任何語詞即便未見於申請專利範圍中,但仍不應解釋為實施本發明的必要元素。
如本文所使用的,術語「小孢子靈芝免疫調節蛋白」、「GMI(ganoderma microsporum immunomodulatory protein)」是指如TW I414307說明書中揭露的小孢子靈芝免疫調節蛋白,其是由小孢子靈芝選殖出的免疫調節蛋白或其重組蛋白,該蛋白具有免疫調節劑之功效。
如本文所使用的,術語「鑰孔蟲戚血藍蛋白」、「KLH(Keyhole limpet hemocyanin)」是在巨型鑰孔蟲戚(Megathura crenulata)的血淋巴中發現的大的、多次單元的、攜氧的金屬蛋白。KLH是在分子量約400 kDa(例如KLH單體)至約8000 kDa(例如KLH二十聚體)的凝聚體中由分子量約350,000至約390,000的次單元組成的異質醣基化蛋白。KLH次單元的每個區域都含有兩個共同結合單個氧分子的銅原子。當氧與血藍蛋白結合時,分子呈現獨特的透明乳白藍色。KLH具有強烈的免疫原性,但不會對人類產生不良的免疫反應。KLH透過一系列步驟從巨型鑰孔蟲戚的血淋巴中純化,前述步驟通常包括硫酸銨沉澱和透析,並且可以涉及層析純化以獲得最高純度。在某些實施例中,KLH純化還可以包括內毒素移除,但此步驟是非必要的,因為當被注射用於產生抗體時,內毒素可以充當佐劑。在某些實施例中,KLH單體單元聚集成總分子量約4,000 kDa至8,000 kDa的巨型多聚體(十聚體或二十聚體)。在某些實施例中,較高的KLH多聚體具有約8~10百萬的分子量,具有約92~107S的沉降係數。
如本文所使用的,術語「植物性凝血球素」、「PHA(phytohemagglutinin)」是指源自植物的一類能凝集細胞和沉澱單糖或多糖複合物的非免疫來源的非酶蛋白質。由於其對於單糖或多糖複合物特異性結合的能力,使得其在如訊息傳遞、免疫反應、植物防禦等諸多訊息傳遞過程中均具有重要作用。同時植物凝集素具有細胞凝集、抗病毒、抗真菌及誘導細胞凋亡或自噬等多種能力。
如本文所使用的,術語「醫藥組合物」是指本發明的小孢子靈芝免疫調節蛋白(GMI)、鑰孔蟲戚血藍蛋白(KLH)及/或與其它化學組分(如醫藥上可接受的載體、穩定劑、稀釋劑、分散劑、懸浮劑、增稠劑及/或賦形劑)的混合物。該醫藥組合物有助於將小孢子靈芝免疫調節蛋白、鑰孔蟲戚血藍蛋白施用於生物體。
用於本發明方法的醫藥組合物可能適合下列施用途徑:鼻腔、吸入、口服、直腸、陰道、胸膜、腹膜、非腸胃道、局部、經皮、肺部、鼻內、口腔、眼部、硬膜外、鞘內、靜脈內或其他施用途徑。在本發明的方法中有用的組合物,可以直接施用於哺乳動物。其他本發明的製劑包括投射的奈米粒子(projected nanoparticles)、微球體(microspheres)、脂質體製劑(liposomal preparations)、披覆粒子(coated particles),聚合物的綴合物(polymer conjugates)及基於免疫學的製劑。
施用途徑對於本領域技術人員而言是顯而易見的,並取決於許多因素,包括所治療疾病的類型及嚴重程度,所治療的家畜或人類患者的類型及年齡等。
本文所述的醫藥組合物的製劑,可以透過藥理學及藥劑學領域所知的或今後所開發的任何方法來製備。一般來說,這樣的製備方法包括以下步驟:使活性成分與載體或一種或多種的其他輔助成分結合,接著—如果需要或可行的話—將產品形成或包裝成預計的單劑量或多劑量的單元。
如本文所使用的,「單位劑量」係包含有預定量活性成分的醫藥組合物的離散量(discrete amount)。活性成分的劑量,通常等於會施用於個體的活性成分的劑量,或為該劑量的適當分數(convenient fraction),例如該劑量的一半或三分之一。單位劑量的劑型,可以是用在每日單次給藥的劑型,或者是用在每日多次給藥(例如,每天約1至4次,或更多次)中一次給藥的劑型。當以每日多次的方式來給藥時,每次給藥的單位劑量劑型可以相同或不同。
如本說明書所使用的,術語「醫藥上可接受的」是指一種材料,例如載體或稀釋劑,該材料可用於本發明的醫藥組合物,且使該醫藥組合物可保有其生物活性或性質且相對無毒。即該材料可以施用於個體,但不會引起不希望的生物效應或與醫藥組合物所含的任何成分以有害的方式相互作用。
在本說明書中所使用之「醫藥上可接受的載體」包括鹽類、材料、組成物或載體,例如填充劑、稀釋劑、賦形劑或包封材料,其可讓本發明的醫藥組合物攜帶或運輸到個體體內,使醫藥組合物發揮其預期的功能。典型地,該醫藥組合物從一個器官或身體的一部分被攜帶或運輸到另一個器官或身體的另一部分。每種鹽類或載體必須是與調配物的其他成分(包括可用於本發明的醫藥組合物)相容且對受試者無害。可用作載體的材料的實例包括:糖(例如乳糖、葡萄糖及蔗糖)、澱粉(例如玉米澱粉及馬鈴薯澱粉)、纖維素及其衍生物(例如鈉羧甲基纖維素、乙基纖維素及醋酸纖維素)、粉狀黃蓍膠、麥芽、明膠、滑石、賦形劑(例如可可脂及栓劑蠟)、油(例如花生油、棉籽油、紅花子油、芝麻油、橄欖油、玉米油及大豆油)、二醇類(例如丙二醇)、多元醇(例如甘油、山梨醇、甘露醇及聚乙二醇)、酯類(例如油酸乙酯及月桂酸乙酯)、瓊脂、緩衝劑(例如氫氧化鎂及氫氧化鋁)、界面活性劑、海藻酸、無熱原水(pyrogen-free water)、等滲鹽水、林格氏溶液(Ringer’s solution)、乙醇、磷酸鹽緩衝溶液,以及其他醫藥調配物中使用的無毒相容物質。
在某些實施例中,可以使用一或多種醫藥上可接受的賦形劑或載體來配製本發明的醫藥組合物。在某些實施例中,本發明的醫藥組合物包含治療有效劑量的GMI、KLH、及/或PHA、及/或醫藥上可接受的載體。醫藥上可接受的載體是有用的,包含但不限於甘油、水、鹽水、乙醇、重組人類白蛋白(如Recombumin®)、溶解的明膠(如Gelofusine®)以及其他醫藥上可接受的鹽類溶液,如磷酸鹽及有機酸鹽類。
製劑可以與常規賦形劑(即,適用於本領域已知的口服、非腸胃道的、鼻內,吸入、靜脈內、皮下,經腸道(transdermal enteral)或任何其他適合的施用模式)的醫藥上可接受的有機或無機載體物質混合使用。醫藥製劑可以經過滅菌處理,並且如果需要的話,可以與輔助劑混合,例如潤滑劑、防腐劑、穩定劑、潤濕劑、乳化劑、影響滲透壓緩衝液的鹽類、著色劑、調味劑,及/或賦予香氣的物質等。如果需要,還可以將其與其它活性劑(例如其他鎮痛劑、抗焦慮劑或安眠劑)進行組合。如本文所使用的,「額外的成分」包括但不限於一或多種可以用作醫藥載體的成分。
本發明的醫藥組合物可以包含佔組合物總重量約0.005%至2.0%的防腐劑,防腐劑在暴露於環境污染物的情況下用於防止腐敗。根據本發明,有用的防腐劑實例包括但不限於選自於苯甲醇、山梨酸、對羥苯甲酸酯類、咪唑烷基脲(imidurea)及其組合所組成的群組。
本發明的醫藥組合物的劑型例如但不限於錠劑、膠囊、乳劑、分散劑、懸浮劑、溶液劑、糖漿劑、顆粒劑、經皮貼劑、凝膠劑、粉劑、霜劑、膏劑、栓劑或噴霧劑。
本發明醫藥製劑的粉劑及顆粒劑,可以使用已知方法製備。該製劑可以直接施用於個體,例如用於形成錠劑、膠囊、或透過向其中加入水性或油性載體來製備水性或油性懸浮液或溶液。這些製劑中的每一種皆可進一步包含一或多種分散劑或潤濕劑、懸浮劑、離子型及非離子型界面活性劑,以及防腐劑。這些製劑中還可以包括額外的賦形劑,例如填充劑及甜味劑、調味劑或著色劑。
懸浮劑可以使用常規方法製備,以使活性成分懸浮在水性或油性載體中。水性載體包括例如水及等滲鹽水。油性載體包括例如杏仁油、油性酯、乙醇,植物油(例如花生油、橄欖油、芝麻油或椰子油)、分餾的植物油,及礦物油(例如液體石蠟)。液體懸浮液可進一步包含一或多種額外的成分,包括但不限於懸浮劑、分散劑或潤濕劑、乳化劑、緩和劑、防腐劑、緩衝劑、鹽類、調味劑、著色劑及甜味劑。油性懸浮液可以進一步包含增稠劑。已知的懸浮劑包括但不限於山梨醇糖漿、氫化食用脂肪、海藻酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮、黃蓍膠、阿拉伯膠,及纖維素衍生物(如羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素)。已知的分散劑或濕潤劑包括但不限於天然存在的磷脂如卵磷脂、烯化氧與下列物質的縮合產物:脂肪酸、長鏈脂肪醇、衍生自脂肪酸及己糖醇的部分酯類、或衍生自脂肪酸及己糖醇酐(hexitol anhydride)的部分酯類(例如聚乙二醇硬脂酸酯、十七烷乙烯氧基鯨蠟醇(heptadecaethyleneoxycetanol)、聚氧乙烯山梨糖醇單油酸酯,及聚氧乙烯山梨糖醇酐單油酸酯)。已知的乳化劑包括但不限於卵磷脂、阿拉伯膠及離子或非離子界面活性劑。已知的防腐劑包括但不限於甲基、乙基或正丙基對羥基苯甲酸鹽、抗壞血酸及山梨酸。已知的甜味劑包括例如甘油、丙二醇,山梨醇、蔗糖及糖精。
活性成分在水性或油性溶劑中的液態溶液,可以用與液態懸浮液基本上相同的方式製備,主要區別在於活性成分是溶解而非懸浮在溶劑中。如本文所使用的,「油性」液體係一種包括含碳液態分子的液體,並且表現出比水小的極性。本發明醫藥組合物的液態溶液,可以包含每種與液態懸浮液描述相關的成分。應該理解的是,懸浮劑不一定有助於活性成分在溶劑中的溶解。水性溶劑包括例如水及等滲鹽水。油性溶劑包括例如杏仁油、油性酯、乙醇,植物油(例如花生油、橄欖油、芝麻油或椰子油)、分餾的植物油,及礦物油(例如液體石蠟)。
本發明的醫藥組合物也可以以水包油乳劑或油包水乳劑的形式來製備、包裝或銷售。油相可以是植物油(如橄欖油或花生油)、礦物油(如液體石蠟),或其組合。組合物可以進一步包含一或多種乳化劑,例如天然存在的樹膠(例如阿拉伯膠或黃蓍膠)、天然存在的磷脂(例如大豆或卵磷脂)、由脂肪酸與己糖醇酐組合得到的酯類或部分酯類,例如山梨糖醇酐單油酸酯及該部分酯類與環氧乙烷的縮合產物(如聚氧乙烯山梨糖醇酐單油酸酯)。這些乳劑還可以包含額外的成分,包括例如甜味劑或調味劑。
以化學組合物來浸漬或塗覆材料的方法是本領域已知的,並且包括但不限於將化學組合物沉積或結合到表面上的方法、在合成中將化學組合物結合到材料結構中的方法(即例如用生理上可降解的材料)、以及將水性或油性溶液或懸浮液吸收到吸收材料中的方法,有或無後續的乾燥。如本領域技術人員已知用於混合組分的方法,包括物理研磨、在固體及懸浮液製劑中使用顆粒、以及在經皮貼片中混合。
如本說明書所使用的,術語「治/處理」、「治療」及「治療方法」是指透過向個體施用藥劑或醫藥組合物,來降低個體所經歷疾病或病症症狀的頻率或嚴重程度。
如本說明書所使用的,術語「個體」、「受試個體」、「受試者」、「患者」可以是人類或非人類哺乳動物。非人類哺乳動物包括例如家畜和寵物,例如羊、牛、豬、犬科動物、貓科動物和鼠類哺乳動物。優選地,個體是人類。
如本文所使用的,術語「癌症」包括任何惡性腫瘤,包括但不限於癌(carcinoma)、肉瘤(sarcoma)。癌症起因於細胞不受控制及/或異常分裂,然後侵入並破壞周圍組織。如本文所使用的,「增生」和「增殖」是指進行有絲分裂的細胞。如本文所使用的,「轉移」是指惡性腫瘤遠離其起源區域。癌細胞可以透過血流、透過淋巴系統、穿過體腔或其任何組合而轉移。
術語「癌」是指惡性新生長,其傾向於滲入周圍組織的上皮細胞並且引起轉移。
術語「癌症疫苗」是指一種疫苗,其會刺激免疫系統以對抗癌症,或對抗有助於癌症發展的介質。有兩種廣泛類型的癌症疫苗:預防性癌症疫苗,其旨在避免癌症在健康受試者中發展;和治療性癌症疫苗,其旨在透過加強身體對抗癌症的天然防禦,來治療現有的癌症(Lollini et al., Nature Reviews Cancer, 2006; 6(3):204–216)。如本文所使用的,術語「癌症疫苗」應被解釋為包括預防性和治療性癌症疫苗。
範圍:在本發明全文中,各個實施例可以以範圍的形式呈現。應該理解的是,範圍形式的描述僅僅是為了方便及簡潔,不應該被解釋為對本發明範圍的限制。因此,範圍的描述應被視為是具體公開了所有可能的子範圍以及該範圍內的單一數值。例如,從1到5的範圍的描述應該被視為具有特定公開的子範圍,例如1到3、1到4、1到5、2到4、2到5、3到5等,以及在該範圍內的單一及部分數字,例如1、2、2.5、3、4及5。無論何種大小的範圍皆適用。
在本實施例中所使用的小孢子靈芝免疫調節蛋白(GMI)(如TW I414307說明書中揭露的小孢子靈芝免疫調節蛋白),其具有抑制腫瘤細胞生長的效果。其主要可以透過上皮細胞生長因子受器(EGFR)訊號傳導途徑,來制止由上皮細胞生長因子所誘發的腫瘤細胞生長,進而制止癌症轉移(metastasis)及浸潤(infiltration)。
依據本發明之一種醫藥組合物,其包括一小孢子靈芝免疫調節蛋白(GMI)以及一鑰孔蟲戚血藍蛋白(KLH)。
在本實施例中,小孢子靈芝免疫調節蛋白的劑量介於5微克/毫升至200微克/毫升之間。較佳的,小孢子靈芝免疫調節蛋白的劑量可以是5微克/毫升、10微克/毫升、15微克/毫升、20微克/毫升、25微克/毫升、30微克/毫升、35微克/毫升、40微克/毫升、45微克/毫升、50微克/毫升、55微克/毫升、60微克/毫升、65微克/毫升、70微克/毫升、75微克/毫升、80微克/毫升、85微克/毫升、90微克/毫升、95微克/毫升、100微克/毫升、105微克/毫升、110微克/毫升、115微克/毫升、120微克/毫升、125微克/毫升、130微克/毫升、135微克/毫升、140微克/毫升、145微克/毫升、150微克/毫升、155微克/毫升、160微克/毫升、165微克/毫升、170微克/毫升、175微克/毫升、180微克/毫升、185微克/毫升、190微克/毫升、195微克/毫升、200微克/毫升或前述任兩個數值之間所涵蓋的任意數值及範圍。當然,小孢子靈芝免疫調節蛋白的劑量可能會隨配合的處理上之載體、投予路徑或有需要之個體及其生理狀況的不同而有所變化。
在本實施例中,鑰孔蟲戚血藍蛋白的劑量介於10微克/毫升至200微克/毫升之間。較佳的,鑰孔蟲戚血藍蛋白的劑量可以是10微克/毫升、15微克/毫升、20微克/毫升、25微克/毫升、30微克/毫升、35微克/毫升、40微克/毫升、45微克/毫升、50微克/毫升、55微克/毫升、60微克/毫升、65微克/毫升、70微克/毫升、75微克/毫升、80微克/毫升、85微克/毫升、90微克/毫升、95微克/毫升、100微克/毫升、105微克/毫升、110微克/毫升、115微克/毫升、120微克/毫升、125微克/毫升、130微克/毫升、135微克/毫升、140微克/毫升、145微克/毫升、150微克/毫升、155微克/毫升、160微克/毫升、165微克/毫升、170微克/毫升、175微克/毫升、180微克/毫升、185微克/毫升、190微克/毫升、195微克/毫升、200微克/毫升或前述任兩個數值之間所涵蓋的任意數值及範圍。當然,鑰孔蟲戚血藍蛋白的劑量可能會隨配合的處理上之小孢子靈芝免疫調節蛋白、載體、投予路徑或有需要之個體及其生理狀況的不同而有所變化。
在本實施例中,小孢子靈芝免疫調節蛋白與鑰孔蟲戚血藍蛋白的重量比例介於20:1至1:40之間。較佳的,小孢子靈芝免疫調節蛋白與鑰孔蟲戚血藍蛋白的重量比例可以是20:1、19:1、18:1、17:1、16:1、15:1、14:1、13:1、12:1、11:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:21、1:22、1:23、1:24、1:25、1:26、1:27、1:28、1:29、1:30、1:31、1:32、1:33、1:34、1:35、1:36、1:37、1:38、1:39、1:40或前述任兩個比例之間所涵蓋的任意數值及範圍。當然,小孢子靈芝免疫調節蛋白與鑰孔蟲戚血藍蛋白的重量比例可能會隨配合的處理上之載體、投予路徑或有需要之個體及其生理狀況的不同而有所變化。
在本實施例中,醫藥組合物可更包括一植物性凝血球素(PHA,phytohemagglutinin)。
在本實施例中,植物性凝血球素的劑量介於1微克/毫升至20微克/毫升之間。較佳的,植物性凝血球素的劑量可以是1微克/毫升、2微克/毫升、3微克/毫升、4微克/毫升、5微克/毫升、6微克/毫升、7微克/毫升、8微克/毫升、9微克/毫升、10微克/毫升、11微克/毫升、12微克/毫升、13微克/毫升、14微克/毫升、15微克/毫升、16微克/毫升、17微克/毫升、18微克/毫升、19微克/毫升、20微克/毫升或前述任兩個數值之間所涵蓋的任意數值及範圍。當然,植物性凝血球素的劑量可能會隨配合的處理上之小孢子靈芝免疫調節蛋白、載體、投予路徑或有需要之個體及其生理狀況的不同而有所變化。
在本實施例中,小孢子靈芝免疫調節蛋白與植物性凝血球素的重量比例介於200:1至1:4之間。較佳的,小孢子靈芝免疫調節蛋白與植物性凝血球素的重量比例可以是200:1、195:1、190:1、185:1、180:1、175:1、170:1、165:1、160:1、155:1、150:1、145:1、140:1、135:1、130:1、125:1、120:1、115:1、110:1、105:1、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、65:1、60:1、55:1、50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4或前述任兩個比例之間所涵蓋的任意數值及範圍。當然,小孢子靈芝免疫調節蛋白與植物性凝血球素的重量比例可能會隨配合的處理上之載體、投予路徑或有需要之個體及其生理狀況的不同而有所變化。
在本實施例中,鑰孔蟲戚血藍蛋白與植物性凝血球素的重量比例介於200:1至1:2之間。較佳的,鑰孔蟲戚血藍蛋白與植物性凝血球素的重量比例可以是200:1、195:1、190:1、185:1、180:1、175:1、170:1、165:1、160:1、155:1、150:1、145:1、140:1、135:1、130:1、125:1、120:1、115:1、110:1、105:1、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、65:1、60:1、55:1、50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2或前述任兩個比例之間所涵蓋的任意數值及範圍。當然,鑰孔蟲戚血藍蛋白與植物性凝血球素的重量比例可能會隨配合的處理上之載體、投予路徑或有需要之個體及其生理狀況的不同而有所變化。
在本實施例中,醫藥組合物的劑型例如但不限於為錠劑、膠囊、乳劑、分散劑、懸浮劑、溶液劑、糖漿劑、顆粒劑、經皮貼劑、凝膠劑、粉劑、霜劑、膏劑、栓劑或噴霧劑。較佳的,醫藥組合物的劑型可以是分散劑、懸浮劑或溶液劑。
本發明另提供一種小孢子靈芝免疫調節蛋白(GMI)與鑰孔蟲戚血藍蛋白(KLH)用於製備治療上皮細胞癌的醫藥組合物之用途,其中醫藥組合物包括一小孢子靈芝免疫調節蛋白以及一鑰孔蟲戚血藍蛋白。另外,本發明再提供一種用於治療罹患上皮細胞癌的患者之方法,包括提供一醫藥組合物,醫藥組合物包括一小孢子靈芝免疫調節蛋白以及一鑰孔蟲戚血藍蛋白。醫藥組合物的劑量、載體的種類、劑型及其他性質與前述說明之醫藥組合物大致相同,可參考前述,於此不再贅述。
在本實施例中,上皮細胞癌例如但不限於為肺癌、乳癌、口腔癌、食道癌、胃癌、大腸癌、肝癌、子宮頸癌、膀胱癌、胰臟癌或皮膚癌。較佳的,上皮細胞癌可以是肺癌、乳癌、胰臟癌或膀胱癌。
承上所述,依據本發明的醫藥組合物及其製備用途,能夠達到治療上皮細胞癌的功效。
以下實驗例用來說明本發明之用途及醫藥組合物,對於上皮細胞癌的治療效果,提供了顯著的功效。
材料與方法
細胞株:肺癌細胞株A549(購自ATCC),參照Cooper JR.等人,於PLoS One. 2016 Oct 28;11(10):e0164438中所述的培養方法,在37℃/5% CO2
培養箱中,以細胞培養基(補充有10% FBS的RPMI-1640培養基)進行培養;人類乳腺癌細胞株MDA-MB-231(購自生物資源保存及研究中心,BCRC),參照Kim SW.等人,於Int J Oncol. 2015 May;46(5):2067-75中所述的培養方法,在37℃/5% CO2
培養箱中,以細胞培養基(補充有10% FBS的RPMI-1640培養基)進行培養;膀胱癌細胞株T24(購自BCRC),參照Zhao ZF.等人,於Med Sci Monit. 2017 Mar 6;23:1156-1164中所述的培養方法,在37℃/5% CO2
培養箱中,以細胞培養基(補充有10% FBS的RPMI-1640培養基)進行培養;胰臟癌細胞株BxPC-3(購自BCRC),參照Chen RY.等人,於World J Gastroenterol. 2014 Oct 28; 20(40):14895-14903中所述的培養方法,在37℃/5% CO2
培養箱中,以細胞培養基(補充有10% FBS的RPMI-1640培養基)進行培養。其中,FBS(胎牛血清)購自Biological Industries。
人類周邊血液單核細胞(PBMC)細胞:取自捐贈者的全血樣品,以Ficoll進行離心來分離出PBMC細胞,並加入冷凍保存培養基進行冷凍保存,於後續實驗時再解凍使用。以Ficoll分離PBMC及冷凍保存的方法為本領域通常知識者依據習知實驗方法可完成,於此不贅述。其中,Ficoll購自GE Healthcare。
流式細胞儀試劑配置:使用7-AAD/CFSE Cell-Mediated Cytotoxicity Assay Kit(購自ImmunoChemistry Technologies LLC.,Cat:#969),先將10X Assay Buffer 稀釋為1X Assay Buffer備用(將4毫升的10X Assay Buffer加入36毫升的滅菌水中)。接著,將CFSE(原管)以200微升的DMSO回溶後,以1X Assay Buffer進行1:125稀釋以配置20X CFSE染劑(8 uL CFSE + 992uL 1X Assay Buffer);將7-AAD(原管)以260微升的DMSO回溶後,以1X Assay Buffer進行1:10稀釋以配置21X 7-AAD染劑(40 uL 7-AAD + 360 uL 1X Assay Buffer)。
處理組別配置:(1)1毫升細胞培養基(控制組)、(2)1毫升細胞培養基混合有10微克或20微克的PHA,以配製PHA濃度為10微克/毫升(低劑量PHA組)或20微克/毫升的組別(高劑量PHA組)、(3)1毫升細胞培養基混合有100微克或200微克的KLH,以配製KLH濃度為100微克/毫升(低劑量KLH組)或200微克/毫升的組別(高劑量KLH組)、(4)1毫升細胞培養基混合有20微克或200微克的GMI,以配製GMI濃度為20微克/毫升(低劑量GMI組)或200微克/毫升的組別(高劑量GMI組)、(5)1毫升細胞培養基混合有10微克或20微克的PHA、100微克或200微克的KLH及20微克或200微克的GMI,以配製PHA濃度為10微克/毫升、KLH濃度為100微克/毫升且GMI濃度為20微克/毫升的組別(低劑量醫藥組合物組)或PHA濃度為20微克/毫升、KLH濃度為200微克/毫升且GMI濃度為200微克/毫升的組別(高劑量醫藥組合物組)。其中,PHA購自SIGMA-ALDRICH,Cat:L8902;KLH(Immucothel®)購自Biosyn。
實驗例一:
GMI
、
KLH
、
PHA
及醫藥組合物對於
PBMC
細胞的影響
將PBMC以1 X 106
個細胞/孔的濃度分別懸浮於(1)1毫升細胞培養基(控制組)、(2)1毫升細胞培養基混合有10微克/毫升、20微克/毫升的PHA(分別為PHA組-1、PHA組-2)、(3)1毫升細胞培養基混合有100微克/毫升、200微克/毫升的KLH(分別為KLH組-1、KLH組-2)、(4)1毫升細胞培養基混合有20微克/毫升、200微克/毫升的GMI(分別為GMI組-1、GMI組-2)、(5)1毫升細胞培養基混合有10微克/毫升PHA、100微克/毫升KLH及20微克/毫升GMI(醫藥組合物組-1)或20微克/毫升PHA、200微克/毫升KLH及200微克/毫升GMI(醫藥組合物組-2),並接種到24孔盤中,在37℃/5% CO2
培養箱中培養24小時後,以顯微鏡進行觀察並拍照,結果如圖1A所示,無論是高劑量或低劑量的GMI組、PHA組及醫藥組合物組相較於控制組,都會造成PBMC的聚集反應,表示GMI、PHA及醫藥組合物的處理會增加PBMC的免疫反應。
拍照後,將細胞收集至微量離心管中,在4o
C下進行7-AAD染色10分鐘。隨後,以流式細胞儀進行分析(BD Accuri C6),設定FL-1 channel(綠色螢光)以檢測細胞內是否有CFSE的螢光;FL-3 channel(紅色螢光)以檢測細胞內是否有7-AAD的螢光。流式細胞儀分析的結果如圖1B所示,橫軸為CFSE的螢光強度、縱軸為7-AAD的螢光強度,因PBMC細胞僅以7-AAD染色,因此未檢測到CFSE螢光。AAD-
象限顯示的細胞為活細胞,AAD+
象限顯示的細胞為被殺死的細胞,因此,細胞毒殺率的計算方式為(AAD+
) / (AAD-
+ AAD+
) X 100%。將圖1B的分析結果,依據上述細胞毒殺率的計算公式,換算出細胞毒殺率後,將以流式細胞儀進行三重複實驗而統計獲得的細胞毒殺率結果顯示在圖1C中。
請參照圖1C,與控制組相比,僅低劑量與高劑量的PHA組(圖中標示為PHA組-1、PHA組-2)、低劑量GMI組(圖中標示為GMI組-1)與低劑量醫藥組合物組(圖中標示為醫藥組合物組-1),會造成少部分PBMC毒殺情形,而其他各組對PBMC的毒殺情況影響不大。依據圖1A至圖1C的結果可得知,PHA、KLH、GMI及醫藥組合物的處理,對於PBMC的存活率影響不大,且會增加PBMC的免疫反應。
實驗例二:
PHA
、
KLH
、
GMI
及醫藥組合物對於
A549
細胞(肺癌細胞)的影響
將A549細胞以1x107
個細胞/mL的濃度懸浮於19 mL的1X Assay Buffer中,加入1 mL的20X CFSE放置於37℃培養15分鐘,隨後加入20 mL的細胞培養基以終止CFSE的結合反應,接著以1200 rpm離心5分鐘後,去除上清液。以4 mL細胞培養基使細胞再懸浮後,取0.2毫升接種到24孔盤中。
接著,將A549細胞分成2種處理組別,其一為A549細胞處理組(不與PBMC共同培養);其二為A549 + PBMC處理組(A549與PBMC共同培養,以模擬腫瘤在生物體內的環境)。
關於
A549
細胞處理組:
依據不同組別依序加入(1)0.3毫升細胞培養基(控制組)、(2)0.3毫升混合有PHA的細胞培養基(PHA組)、(3)0.3毫升混合有KLH的細胞培養基(KLH組)、(4)0.3毫升混合有GMI的細胞培養基(GMI組)、(5)0.3毫升混合有PHA、KLH及GMI的細胞培養基(醫藥組合物組),置於37℃/5% CO2
培養箱中培養24小時後,將上清液收集至微量離心管,在每個孔中加入0.4 mL DPBS清洗細胞後,將清洗後的上清液收集至微量離心管,重新加入0.3 mL DPBS,以顯微鏡觀察並拍照。請參照圖2A及圖2B,圖2A及圖2B為以本發明醫藥組合物、PHA、KLH及GMI處理人類肺癌細胞株(A549細胞)的研究結果,其為以光學顯微鏡進行觀察的細胞照片。圖2A為低劑量處理的組別,圖2B為高劑量處理的組別。在圖2A中,PHA組為10微克/毫升的PHA、KLH組為100微克/毫升的KLH、GMI組為20微克/毫升GMI、醫藥組合物組為10微克/毫升的PHA+100微克/毫升的KLH+20微克/毫升GMI。在圖2B中,PHA組為20微克/毫升的PHA、KLH組為200微克/毫升的KLH、GMI組為200微克/毫升GMI、醫藥組合物組為20微克/毫升的PHA+200微克/毫升的KLH+200微克/毫升GMI。從顯微鏡觀察的結果顯示,無論是高劑量或低劑量,PHA組及KLH組相較於控制組而言,貼附的細胞數量變化不大,也就是說,這2個處理對於A549細胞毒殺效果不大。而GMI組及醫藥組合物組相較於控制組而言,貼附的細胞數量明顯變少,顯示這2個處理對於A549細胞具有毒殺效果。
拍照後,將0.3 mL DPBS收集至微量離心管中,在每個孔中加入200 uL AccutaseTM
細胞分離溶液覆蓋細胞,於37o
C下處理2分鐘以使細胞脫離24孔盤,以先前收集之上清液進行沖洗,並將細胞收集至微量離心管中,最後在4o
C下進行7-AAD染色10分鐘。隨後,以流式細胞儀進行分析(BD Accuri C6),設定FL-1 channel(綠色螢光)以檢測細胞內是否有CFSE的螢光;FL-3 channel(紅色螢光)以檢測細胞內是否有7-AAD的螢光。流式細胞儀分析的結果如圖2C、圖2D所示,橫軸為CFSE的螢光強度、縱軸為7-AAD的螢光強度,CFSE+
AAD-
象限顯示的細胞為活細胞,CFSE+
AAD+
象限顯示的細胞為被殺死的細胞,因此,細胞毒殺率的計算方式為(CFSE+
AAD+
) / (CFSE+
AAD-
+ CFSE+
AAD+
) X 100%。將圖2C及圖2D的分析結果,依據上述細胞毒殺率的計算公式,換算出細胞毒殺率後,將以流式細胞儀進行三重複實驗而統計獲得的細胞毒殺率結果顯示在圖2E及圖2F中。
請參照圖2C至圖2F,在圖2C及圖2E中,PHA組為10微克/毫升的PHA、KLH組為100微克/毫升的KLH、GMI組為20微克/毫升GMI、醫藥組合物組為10微克/毫升的PHA+100微克/毫升的KLH+20微克/毫升GMI。在圖2D及圖2F中,PHA組為20微克/毫升的PHA、KLH組為200微克/毫升的KLH、GMI組為200微克/毫升GMI、醫藥組合物組為20微克/毫升的PHA+200微克/毫升的KLH+200微克/毫升GMI。在圖2C中,以流式細胞儀進行一重複實驗所得到的控制組、PHA組、KLH組、GMI組及醫藥組合物組的細胞毒殺率分別為0.9%、4.6%、1.0%、8.1%及17.4%。如圖2E所示,在低劑量的處理下,以流式細胞儀進行三重複實驗而統計獲得的細胞毒殺率結果顯示,PHA組對肺癌細胞有部分毒殺作用,KLH組對肺癌細胞的毒殺效果不大;GMI組對肺癌細胞的毒殺效果較好,而醫藥組合物組對肺癌細胞的毒殺效果相較於GMI組更為顯著,顯示醫藥組合物組(PHA+KLH+GMI)與單獨以PHA、KLH、GMI處理的組別相比,對於A549細胞的毒殺現象更明顯且具有顯著差異,讓肺癌細胞死亡的現象更顯著,使得治療肺癌的效果更好。另外,在圖2D高劑量組別中,以流式細胞儀進行一重複實驗所得到的控制組、PHA組、KLH組、GMI組及醫藥組合物組的細胞毒殺率分別為0.9%、13.8%、1.4%、29.3%及39.5%。由圖2F的結果所示,在高劑量的處理下,以流式細胞儀進行三重複實驗而統計獲得的細胞毒殺率結果顯示,PHA組對肺癌細胞有部分毒殺作用,KLH組對肺癌細胞毒殺效果不大;GMI組對肺癌細胞的毒殺效果較好,而醫藥組合物組對肺癌細胞的毒殺效果相較於GMI組更為顯著,顯示醫藥組合物組(PHA+KLH+GMI)與單獨以PHA、KLH、GMI處理的組別相比,對於A549細胞的毒殺現象更明顯且具有顯著差異,讓肺癌細胞死亡的現象更顯著,使得治療肺癌的效果更好。與圖2E的低劑量組別處理的結果相比,圖2F高劑量組別的結果顯示,當醫藥組合物組的劑量提高時,其造成肺癌細胞死亡的現象更顯著。在圖2E及圖2F中,*表示兩組之間進行比較,P<0.05;**表示兩組之間進行比較,P<0.01;***表示兩組之間進行比較,P<0.001;每個實驗都進行了三組獨立試驗,誤差槓表示平均值標準誤差(standard error of the mean,SEM)。
關於
A549+PBMC
處理組:
將PBMC以1 X 107
個細胞懸浮於1毫升細胞培養基,取0.1毫升加入24孔盤,另外,依據不同組別分別取(1)0.2毫升混合有PHA的細胞培養基(PHA組)、(2)0.2毫升混合有KLH的細胞培養基(KLH組)、(3)0.2毫升混合有GMI的細胞培養基(GMI組)、(4)0.2毫升混合有PHA、KLH及GMI的細胞培養基(醫藥組合物組)加到24孔盤中(孔內已有5x105
個A549細胞)。於此,人類周邊血球細胞與腫瘤細胞的數量比例為2:1,用以模擬腫瘤在人體中的狀態。將24孔盤置於37℃/5% CO2
培養箱中培養24小時後,將上清液收集至微量離心管中,在每個孔中加入0.4 mL DPBS清洗細胞後,將清洗後的上清液收集至微量離心管,重新加入0.3 mL DPBS,以顯微鏡觀察並拍照。請再參照圖2A及圖2B中,有加入PBMC的組別(圖中顯示為PBMC+PHA組、PBMC+KLH組、PBMC+GMI組、PBMC+醫藥組合物組)。從顯微鏡觀察的結果顯示,無論是高劑量或低劑量,PBMC+PHA組及PBMC+KLH組相較於控制組而言,其貼附的細胞數量變化不大,也就是說,這2個處理對於A549細胞毒殺效果不大。而PBMC+GMI組及PBMC+醫藥組合物組相較於控制組而言,其貼附的細胞數量明顯變少,顯示這2個處理對於A549細胞具有毒殺效果。
拍照後,將0.3 mL DPBS收集至微量離心管中,在每個孔中加入200 uL AccutaseTM
細胞分離溶液覆蓋細胞,於37o
C下處理2分鐘以使細胞脫離24孔盤,以先前收集之上清液進行沖洗,並將細胞收集至微量離心管中,最後在4o
C下進行7-AAD染色10分鐘。隨後,以流式細胞儀進行分析,流式細胞儀的設定方式、分析方法及細胞毒殺率的計算方式已詳述於前,於此不再贅述。
請再參照圖2C至圖2F,在圖2C中(圖中顯示為PBMC+PHA組、PBMC+KLH組、PBMC+GMI組、PBMC+醫藥組合物組),為在有PBMC的處理狀況下,同時給予低劑量的處理,以流式細胞儀進行一重複實驗所得到的控制組、PBMC+PHA組、PBMC+KLH組、PBMC+GMI組及PBMC+醫藥組合物組的細胞毒殺率分別為0.9%、4.7%、2.7%、18.6%及22.5%。如圖2E所示,在有PBMC的處理狀況下,同時給予低劑量的處理,以流式細胞儀進行三重複實驗而統計獲得的細胞毒殺率結果顯示,PHA組對肺癌細胞有部分毒殺作用,KLH組對肺癌細胞的毒殺效果不大;GMI組對肺癌細胞的毒殺效果較好,而醫藥組合物組對肺癌細胞的毒殺效果相較於GMI組更為顯著,顯示在有PBMC的情況下,醫藥組合物組(PHA+KLH+GMI)與單獨以PHA、KLH、GMI處理的組別相比,對於A549細胞的毒殺現象更明顯且具有顯著差異,讓肺癌細胞死亡的現象更顯著,使得治療肺癌的效果更好。另外,在圖2D中(圖中顯示為PBMC+PHA組、PBMC+KLH組、PBMC+GMI組、PBMC+醫藥組合物組),為在有PBMC的處理狀況下,同時給予高劑量的處理,以流式細胞儀進行一重複實驗所得到的控制組、PBMC+PHA組、PBMC+KLH組、PBMC+GMI組及PBMC+醫藥組合物組的細胞毒殺率分別為0.9%、13.9%、4.7%、48.6%及55%。由圖2F的結果所示,在有PBMC的處理狀況下,同時給予高劑量的處理,以流式細胞儀進行三重複實驗而統計獲得的細胞毒殺率結果顯示,PHA組對肺癌細胞有部分毒殺作用,KLH組對肺癌細胞毒殺效果不大;GMI組對肺癌細胞的毒殺效果較好,而醫藥組合物組造成肺癌細胞毒殺現象相較於GMI組更為顯著,顯示醫藥組合物組(PHA+KLH+GMI)與單獨以PHA、KLH、GMI處理的組別相比,對於A549細胞的毒殺現象更明顯且具有顯著差異,讓肺癌細胞死亡的現象更顯著,使得治療肺癌的效果更好。在有PBMC的情況下,與圖2E的低劑量組別處理的結果相比,圖2F高劑量組別的結果顯示,當醫藥組合物組的劑量提高時,其造成肺癌細胞死亡的現象更顯著。
本發明的醫藥組合物對於
A549
的細胞毒殺具有協同作用:
兩種以上藥物對生物活性的效應,具有三種不同作用:(1)協同作用(synergism);(2)加成作用(additive effect)與(3)拮抗作用(antagonism)。根據Chou TC等人於Quantitative analysis of dose-effect relationships: the combined effects of multiple drugs or enzyme inhibitors, Adv Enzyme Regul, Vol. 22, 1984, pp.27-55的文獻及Liang Zhao等人於AuEvaluation of Combination Chemotherapy: Integration of Nonlinear Regression, Curve Shift, Isobologram, and Combination Index Analysis, Clinical Cancer Research, Vol. 10, 2004, pp.7994-8004的文獻所提出之藥物聯用指數(combination index,CI),可用來分析評估兩種藥物間之交互作用,其評估之計算公式為:CI = CA,x
/ ICx,A
+ CB,x
/ ICx,B
,其中CA,x
和CB,x
是指同時合併使用A、B兩種藥物達到x%有效時的個別藥物濃度,ICx,A
及ICx,B
是指單獨用一種藥物達到x%有效時的藥物濃度。依照計算得到的結果,當CI值<1時,兩種藥物聯用具有協同作用;當CI值=1時,兩種藥物聯用具有加成作用;當CI值>1時,兩種藥物聯用具有拮抗作用。
在本實驗例中,以流式細胞儀進行三重複實驗而統計獲得的細胞毒殺率結果如圖2E及圖2F所示,控制組A549細胞毒殺率為0.97%,若單獨使用10微克/毫升PHA、100微克/毫升KLH或20微克/毫升GMI,其對A549細胞毒殺率分別是5.23%、2.3%及9.23%。在醫藥組合物組(10微克/毫升的PHA+100微克/毫升的KLH+20微克/毫升GMI)的部分,其對A549細胞的毒殺率則為17.28%。另外單獨使用20微克/毫升PHA、200微克/毫升KLH或200微克/毫升GMI,其對A549細胞毒殺率分別是11.83%、1.7%及23.83%。在醫藥組合物組(20微克/毫升的PHA+200微克/毫升的KLH+200微克/毫升GMI)的部分,其對A549細胞的毒殺率則為40.53%。利用這些數值分別計算出PHA、KLH及GMI之細胞毒殺線性方程式。以低劑量醫藥組合物組(10微克/毫升的PHA+100微克/毫升的KLH+20微克/毫升GMI)對A549細胞的毒殺率則為17.28%為例,將17.28%分別代入PHA、KLH及GMI之線性方程式y值中,分別得到ICx,PHA
=27.62、ICx,KLH
=1557.42和ICx,GMI
=117.05,進一步計算三種藥物聯用指數值(CI),CI=(10/27.62)+(100/1557.42)+(20/117.05)=0.6,結果<1,表示在低劑量時,醫藥組合物組毒殺A549細胞具有協同作用。利用同樣的方式計算出在高劑量時,CI值 = 0.88,結果<1,表示高劑量之醫藥組合物組毒殺A549細胞同樣具有協同作用。另一方面,在有PBMC的情況下,低劑量醫藥組合物組CI值 = 0.41,高劑量醫藥組合物組CI值 = 0.96,結果都<1,顯示在有PBMC的情況下,相較於單獨使用PHA、KLH或GMI,不管是低劑量或是高劑量之醫藥組合物組,都具有協同作用。
實驗例三:
PHA
、
KLH
、
GMI
及醫藥組合物對於
MDA-MB-231
細胞(人類乳腺癌細胞)的影響
本實驗例之MDA-MB-231細胞的實驗方法,與實驗例二相同,差異僅在於以MDA-MB-231細胞取代A549細胞,進行相同的實驗,故於此不再重複贅述實驗的細節流程。
關於
MDA-MB-231
細胞處理組的實驗結果:
請參照圖3A及圖3B,圖3A及圖3B為以本發明醫藥組合物、PHA、KLH及GMI處理人類乳腺癌細胞株(MDA-MB-231細胞)的研究結果,其為以光學顯微鏡進行觀察的細胞照片。圖3A為低劑量處理的組別,圖3B為高劑量處理的組別。在圖3A中,PHA組為10微克/毫升的PHA、KLH組為100微克/毫升的KLH、GMI組為20微克/毫升GMI、醫藥組合物組為10微克/毫升的PHA+100微克/毫升的KLH+20微克/毫升GMI。在圖3B中,PHA組為20微克/毫升的PHA、KLH組為200微克/毫升的KLH、GMI組為200微克/毫升GMI、醫藥組合物組為20微克/毫升的PHA+200微克/毫升的KLH+200微克/毫升GMI。從顯微鏡觀察的結果顯示,無論是高劑量或低劑量,PHA組及KLH組相較於控制組而言,貼附的細胞數量變化不大,也就是說,這2個處理對於MDA-MB-231細胞毒殺效果不大。而GMI組及醫藥組合物組相較於控制組而言,貼附的細胞數量明顯變少,顯示這2個處理對於MDA-MB-231細胞具有毒殺效果。
請參照圖3C至圖3F,在圖3C及圖3E中,PHA組為10微克/毫升的PHA、KLH組為100微克/毫升的KLH、GMI組為20微克/毫升GMI、醫藥組合物組為10微克/毫升的PHA+100微克/毫升的KLH+20微克/毫升GMI。在圖3D及圖3F中,PHA組為20微克/毫升的PHA、KLH組為200微克/毫升的KLH、GMI組為200微克/毫升GMI、醫藥組合物組為20微克/毫升的PHA+200微克/毫升的KLH+200微克/毫升GMI。如圖3C所示,以流式細胞儀進行一重複實驗所得到的控制組、PHA組、KLH組、GMI組及醫藥組合物組的細胞毒殺率分別為1.8%、5.4%、2.8%、44.7%及54.5%。如圖3E所示,在低劑量的處理下,以流式細胞儀進行三重複實驗而統計獲得的細胞毒殺率結果顯示,PHA組及KLH組對乳腺癌細胞的毒殺效果不大;GMI組對乳腺癌細胞的毒殺效果較好,而醫藥組合物組對乳腺癌細胞的毒殺效果相較於GMI組更為顯著,顯示醫藥組合物組(PHA+KLH+GMI)與單獨以PHA、KLH、GMI處理的組別相比,對於MDA-MB-231細胞的毒殺現象更明顯且具有顯著差異,讓乳腺癌細胞死亡的現象更顯著,使得治療乳腺癌的效果更好。另外,在圖3D高劑量組別中,以流式細胞儀進行一重複實驗所得到的控制組、PHA組、KLH組、GMI組及醫藥組合物組的細胞毒殺率分別為1.8%、14.7%、3.0%、40.8%及55.7%。由圖3F的結果所示,在高劑量的處理下,以流式細胞儀進行三重複實驗而統計獲得的細胞毒殺率結果顯示,PHA組對乳腺癌細胞有部分毒殺作用,KLH組對乳腺癌細胞毒殺效果不大;GMI組對乳腺癌細胞的毒殺效果較好,而醫藥組合物組對乳腺癌細胞的毒殺效果相較於GMI組更為顯著,顯示醫藥組合物組(PHA+KLH+GMI)與單獨以PHA、KLH、GMI處理的組別相比,對於MDA-MB-231細胞的毒殺現象更明顯且具有顯著差異,讓乳腺癌細胞死亡的現象更顯著,使得治療乳腺癌的效果更好。與圖3E的低劑量組別處理的結果相比,圖3F高劑量組別的結果顯示,當醫藥組合物組的劑量提高時,其造成乳腺癌細胞死亡的現象更顯著。在圖3E及圖3F中,*表示兩組之間進行比較,P<0.05;***表示兩組之間進行比較,P<0.001;每個實驗都進行了三組獨立試驗,誤差槓表示平均值標準誤差。
關於
MDA-MB-231+PBMC
處理組的實驗結果:
請再參照圖3A及圖3B中,有加入PBMC的組別(圖中顯示為PBMC+PHA組、PBMC+KLH組、PBMC+GMI組、PBMC+醫藥組合物組)。從顯微鏡觀察的結果顯示,無論是高劑量或低劑量,PBMC+PHA組及PBMC+KLH組相較於控制組而言,其貼附的細胞數量變化不大,也就是說,這2個處理對於MDA-MB-231細胞毒殺效果不大。而PBMC+GMI組及PBMC+醫藥組合物組相較於控制組而言,其貼附的細胞數量明顯變少,顯示這2個處理對於MDA-MB-231細胞具有毒殺效果。
請再參照圖3C至圖3F,在圖3C中(圖中顯示為PBMC+PHA組、PBMC+KLH組、PBMC+GMI組、PBMC+醫藥組合物組),為在有PBMC的處理狀況下,同時給予低劑量的處理,以流式細胞儀進行一重複實驗所得到的控制組、PBMC+PHA組、PBMC+KLH組、PBMC+GMI組及PBMC+醫藥組合物組的細胞毒殺率分別為1.8%、32.4%、4.4%、64.4%及73.0%。如圖3E所示,在有PBMC的處理狀況下,同時給予低劑量的處理,以流式細胞儀進行三重複實驗而統計獲得的細胞毒殺率結果顯示,PHA組對乳腺癌細胞有部分毒殺作用,KLH組對乳腺癌細胞的毒殺效果不大;GMI組對乳腺癌細胞的毒殺效果較好,而醫藥組合物組對乳腺癌細胞的毒殺效果相較於GMI組更為顯著,顯示在有PBMC的情況下,醫藥組合物組(PHA+KLH+GMI)與單獨以PHA、KLH、GMI處理的組別相比,對於MDA-MB-231細胞的毒殺現象更明顯且具有顯著差異,讓乳腺癌細胞死亡的現象更顯著,使得治療乳腺癌的效果更好。另外,在圖3D中(圖中顯示為PBMC+PHA組、PBMC+KLH組、PBMC+GMI組、PBMC+醫藥組合物組),為在有PBMC的處理狀況下,同時給予高劑量的處理,以流式細胞儀進行一重複實驗所得到的控制組、PBMC+PHA組、PBMC+KLH組、PBMC+GMI組及PBMC+醫藥組合物組的細胞毒殺率分別為1.8%、48.5%、4.3%、59.0%及64.7%。由圖3F的結果所示,在有PBMC的處理狀況下,同時給予高劑量的處理,以流式細胞儀進行三重複實驗而統計獲得的細胞毒殺率結果顯示,PHA組對乳腺癌細胞有部分毒殺作用,KLH組對乳腺癌細胞毒殺效果不大;GMI組對乳腺癌細胞的毒殺效果較好,而醫藥組合物組造成乳腺癌細胞毒殺現象相較於GMI組更為顯著,顯示醫藥組合物組(PHA+KLH+GMI)與單獨以PHA、KLH、GMI處理的組別相比,對於MDA-MB-231細胞的毒殺現象更明顯且具有顯著差異,讓乳腺癌細胞死亡的現象更顯著,使得治療乳腺癌的效果更好。
本發明的醫藥組合物對於
MDA-MB-231
的細胞毒殺具有協同作用:
在本實驗例中,在沒有PBMC的情況下,低劑量醫藥組合物組CI值 = 0.21;在有PBMC的情況下,低劑量醫藥組合物組CI值 = 0.45,結果都<1,顯示無論是在無或有PBMC的情況下,相較於單獨使用PHA、KLH或GMI,低劑量之醫藥組合物組毒殺MDA-MB-231細胞都具有協同作用。
實驗例四:
PHA
、
KLH
、
GMI
及醫藥組合物對於
T24
細胞(人類膀胱癌細胞)的影響
本實驗例之T24細胞的實驗方法,與實驗例二相同,差異僅在於以T24細胞取代A549細胞,進行相同的實驗,故於此不再重複贅述實驗的細節流程。
關於
T24
細胞處理組的實驗結果:
請參照圖4A及圖4B,圖4A及圖4B為以本發明醫藥組合物、PHA、KLH及GMI處理人類膀胱癌細胞株(T24細胞)的研究結果,其為以光學顯微鏡進行觀察的細胞照片。圖4A為低劑量處理的組別,圖4B為高劑量處理的組別。在圖4A中,PHA組為10微克/毫升的PHA、KLH組為100微克/毫升的KLH、GMI組為20微克/毫升GMI、醫藥組合物組為10微克/毫升的PHA+100微克/毫升的KLH+20微克/毫升GMI。在圖4B中,PHA組為20微克/毫升的PHA、KLH組為200微克/毫升的KLH、GMI組為200微克/毫升GMI、醫藥組合物組為20微克/毫升的PHA+200微克/毫升的KLH+200微克/毫升GMI。從顯微鏡觀察的結果顯示,無論是高劑量或低劑量,PHA組及KLH組相較於控制組而言,貼附的細胞數量變化不大,也就是說,這2個處理對於T24細胞毒殺效果不大。而GMI組及醫藥組合物組相較於控制組而言,貼附的細胞數量明顯變少,顯示這2個處理對於T24細胞具有毒殺效果。
請參照圖4C至圖4F,在圖4C及圖4E中,PHA組為10微克/毫升的PHA、KLH組為100微克/毫升的KLH、GMI組為20微克/毫升GMI、醫藥組合物組為10微克/毫升的PHA+100微克/毫升的KLH+20微克/毫升GMI。在圖4D及圖4F中,PHA組為20微克/毫升的PHA、KLH組為200微克/毫升的KLH、GMI組為200微克/毫升GMI、醫藥組合物組為20微克/毫升的PHA+200微克/毫升的KLH+200微克/毫升GMI。如圖4C所示,以流式細胞儀進行一重複實驗所得到的控制組、PHA組、KLH組、GMI組及醫藥組合物組的細胞毒殺率分別為3.1%、22.1%、2.8%、50.2%及66.9%。如圖4E所示,在低劑量的處理下,以流式細胞儀進行三重複實驗而統計獲得的細胞毒殺率結果顯示,PHA組對膀胱癌細胞有部分毒殺作用,KLH組對膀胱癌細胞的毒殺效果不大;GMI組對膀胱癌細胞的毒殺效果較好,而醫藥組合物組對膀胱癌細胞的毒殺效果相較於GMI組更為顯著,顯示醫藥組合物組(PHA+KLH+GMI)與單獨以PHA、KLH、GMI處理的組別相比,對於T24細胞的毒殺現象更明顯且具有顯著差異,讓膀胱癌細胞死亡的現象更顯著,使得治療膀胱癌的效果更好。另外,在圖4D高劑量組別中,以流式細胞儀進行一重複實驗所得到的控制組、PHA組、KLH組、GMI組及醫藥組合物組的細胞毒殺率分別為3.1%、39.4%、5.9%、61.9%及75.5%。由圖4F的結果所示,在高劑量的處理下,以流式細胞儀進行三重複實驗而統計獲得的細胞毒殺率結果顯示,PHA組對膀胱癌細胞有部分毒殺作用,KLH組對膀胱癌細胞毒殺效果不大;GMI組對膀胱癌細胞的毒殺效果較好,而醫藥組合物組對膀胱癌細胞的毒殺效果相較於GMI組更為顯著,顯示醫藥組合物組(PHA+KLH+GMI)與單獨以PHA、KLH、GMI處理的組別相比,對於T24細胞的毒殺現象更明顯且具有顯著差異,讓膀胱癌細胞死亡的現象更顯著,使得治療膀胱癌的效果更好。與圖4E的低劑量組別處理的結果相比,圖4F高劑量組別的結果顯示,當醫藥組合物組的劑量提高時,其造成膀胱癌細胞死亡的現象更顯著。在圖4E及圖4F中,*表示兩組之間進行比較,P<0.05;**表示兩組之間進行比較,P<0.01;***表示兩組之間進行比較,P<0.001;每個實驗都進行了三組獨立試驗,誤差槓表示平均值標準誤差。
關於
T24+PBMC
處理組的實驗結果:
請再參照圖4A及圖4B中,有加入PBMC的組別(圖中顯示為PBMC+PHA組、PBMC+KLH組、PBMC+GMI組、PBMC+醫藥組合物組)。從顯微鏡觀察的結果顯示,無論是高劑量或低劑量,PBMC+PHA組及PBMC+KLH組相較於控制組而言,其貼附的細胞數量變化不大,也就是說,這2個處理對於T24細胞毒殺效果不大。而PBMC+GMI組及PBMC+醫藥組合物組相較於控制組而言,其貼附的細胞數量明顯變少,顯示這2個處理對於T24細胞具有毒殺效果。
請再參照圖4C至圖4F,在圖4C中(圖中顯示為PBMC+PHA組、PBMC+KLH組、PBMC+GMI組、PBMC+醫藥組合物組),為在有PBMC的處理狀況下,同時給予低劑量的處理,以流式細胞儀進行一重複實驗所得到的控制組、PBMC+PHA組、PBMC+KLH組、PBMC+GMI組及PBMC+醫藥組合物組的細胞毒殺率分別為3.1%、28%、5.0%、62.3%及68.5%。如圖4E所示,在有PBMC的處理狀況下,同時給予低劑量的處理,以流式細胞儀進行三重複實驗而統計獲得的細胞毒殺率結果顯示,PHA組對膀胱癌細胞有部分毒殺作用,KLH組對膀胱癌細胞的毒殺效果不大;GMI組對膀胱癌細胞的毒殺效果較好,而醫藥組合物組對膀胱癌細胞的毒殺效果相較於GMI組更為顯著,顯示在有PBMC的情況下,醫藥組合物組(PHA+KLH+GMI)與單獨以PHA、KLH、GMI處理的組別相比,對於T24細胞的毒殺現象更明顯且具有顯著差異,讓膀胱癌細胞死亡的現象更顯著,使得治療膀胱癌的效果更好。另外,在圖4D中(圖中顯示為PBMC+PHA組、PBMC+KLH組、PBMC+GMI組、PBMC+醫藥組合物組),為在有PBMC的處理狀況下,同時給予高劑量的處理,以流式細胞儀進行一重複實驗所得到的控制組、PBMC+PHA組、PBMC+KLH組、PBMC+GMI組及PBMC+醫藥組合物組的細胞毒殺率分別為3.1%、40.9%、6.9%、80.8%及84.0%。由圖4F的結果所示,在有PBMC的處理狀況下,同時給予高劑量的處理,以流式細胞儀進行三重複實驗而統計獲得的細胞毒殺率結果顯示,PHA組對膀胱癌細胞有部分毒殺作用,KLH組對膀胱癌細胞毒殺效果不大;GMI組對膀胱癌細胞的毒殺效果較好,而醫藥組合物組造成膀胱癌細胞毒殺現象相較於GMI組更為顯著,顯示醫藥組合物組(PHA+KLH+GMI)與單獨以PHA、KLH、GMI處理的組別相比,對於T24細胞的毒殺現象更明顯且具有顯著差異,讓膀胱癌細胞死亡的現象更顯著,使得治療膀胱癌的效果更好。在有PBMC的情況下,與圖4E的低劑量組別處理的結果相比,圖4F高劑量組別的結果顯示,當醫藥組合物組的劑量提高時,其造成膀胱癌細胞死亡的現象更顯著。
本發明的醫藥組合物對於
T24
的細胞毒殺具有協同作用:
在本實驗例中,在沒有PBMC的情況下,低劑量醫藥組合物組CI值 = 0.53;在有PBMC的情況下,低劑量醫藥組合物組CI值 = 0.56,結果都<1,顯示無論是在無或有PBMC的情況下,相較於單獨使用PHA、KLH或GMI,低劑量之醫藥組合物組毒殺T24細胞都具有協同作用。
實驗例五:
PHA
、
KLH
、
GMI
及醫藥組合物對於
BxPC-3
細胞(人類胰臟癌細胞)的影響
本實驗例之BxPC-3細胞的實驗方法,與實驗例二相同,差異僅在於以BxPC-3細胞取代A549細胞,進行相同的實驗,故於此不再重複贅述實驗的細節流程。
關於
BxPC-3
細胞處理組的實驗結果:
請參照圖5A及圖5B,圖5A及圖5B為以本發明醫藥組合物、PHA、KLH及GMI處理人類胰臟癌細胞株(BxPC-3細胞)的研究結果,其為以光學顯微鏡進行觀察的細胞照片。圖5為低劑量處理的組別,圖5B為高劑量處理的組別。在圖5A中,PHA組為10微克/毫升的PHA、KLH組為100微克/毫升的KLH、GMI組為20微克/毫升GMI、醫藥組合物組為10微克/毫升的PHA+100微克/毫升的KLH+20微克/毫升GMI。在圖5B中,PHA組為20微克/毫升的PHA、KLH組為200微克/毫升的KLH、GMI組為200微克/毫升GMI、醫藥組合物組為20微克/毫升的PHA+200微克/毫升的KLH+200微克/毫升GMI。從顯微鏡觀察的結果顯示,無論是高劑量或低劑量,PHA組及KLH組相較於控制組而言,貼附的細胞數量變化不大,也就是說,這2個處理對於BxPC-3細胞毒殺效果不大。而GMI組及醫藥組合物組相較於控制組而言,貼附的細胞數量明顯變少,顯示這2個處理對於BxPC-3細胞具有毒殺效果。
請參照圖5C至圖5F,在圖5C及圖5E中,PHA組為10微克/毫升的PHA、KLH組為100微克/毫升的KLH、GMI組為20微克/毫升GMI、醫藥組合物組為10微克/毫升的PHA+100微克/毫升的KLH+20微克/毫升GMI。在圖5D及圖5F中,PHA組為20微克/毫升的PHA、KLH組為200微克/毫升的KLH、GMI組為200微克/毫升GMI、醫藥組合物組為20微克/毫升的PHA+200微克/毫升的KLH+200微克/毫升GMI。如圖5C所示,以流式細胞儀進行一重複實驗所得到的控制組、PHA組、KLH組、GMI組及醫藥組合物組的細胞毒殺率分別為7.0%、7.9%、5.2%、14.3%及25%。如圖5E所示,在低劑量的處理下,以流式細胞儀進行三重複實驗而統計獲得的細胞毒殺率結果顯示,PHA組及KLH組對胰臟癌細胞的毒殺效果不大;GMI組對胰臟癌細胞的毒殺效果較好,而醫藥組合物組對胰臟癌細胞的毒殺效果相較於GMI組更為顯著,顯示醫藥組合物組(PHA+KLH+GMI)與單獨以PHA、KLH、GMI處理的組別相比,對於BxPC-3細胞的毒殺現象更明顯且具有顯著差異,讓胰臟癌細胞死亡的現象更顯著,使得治療胰臟癌的效果更好。另外,在圖5D高劑量組別中,以流式細胞儀進行一重複實驗所得到的控制組、PHA組、KLH組、GMI組及醫藥組合物組的細胞毒殺率分別為7.0%、12.5%、6.3%、47.2%及60.9%。由圖5F的結果所示,在高劑量的處理下,以流式細胞儀進行三重複實驗而統計獲得的細胞毒殺率結果顯示,PHA組對胰臟癌細胞有部分毒殺作用,KLH組對胰臟癌細胞毒殺效果不大;GMI組對胰臟癌細胞的毒殺效果較好,而醫藥組合物組對胰臟癌細胞的毒殺效果相較於GMI組更為顯著,顯示醫藥組合物組(PHA+KLH+GMI)與單獨以PHA、KLH、GMI處理的組別相比,對於BxPC-3細胞的毒殺現象更明顯且具有顯著差異,讓胰臟癌細胞死亡的現象更顯著,使得治療胰臟癌的效果更好。與圖5E的低劑量組別處理的結果相比,圖5F高劑量組別的結果顯示,當醫藥組合物組的劑量提高時,其造成胰臟癌細胞死亡的現象更顯著。在圖5E及圖5F中,*表示兩組之間進行比較,P<0.05;**表示兩組之間進行比較,P<0.01;***表示兩組之間進行比較,P<0.001;每個實驗都進行了三組獨立試驗,誤差槓表示平均值標準誤差。
關於
BxPC-3+PBMC
處理組的實驗結果:
請再參照圖5A及圖5B中,有加入PBMC的組別(圖中顯示為PBMC+PHA組、PBMC+KLH組、PBMC+GMI組、PBMC+醫藥組合物組)。從顯微鏡觀察的結果顯示,無論是高劑量或低劑量,PBMC+PHA組及PBMC+KLH組相較於控制組而言,其貼附的細胞數量變化不大,也就是說,這2個處理對於BxPC-3細胞毒殺效果不大。而PBMC+GMI組及PBMC+醫藥組合物組相較於控制組而言,其貼附的細胞數量明顯變少,顯示這2個處理對於BxPC-3細胞具有毒殺效果。
請再參照圖5C至圖5F,在圖5C中(圖中顯示為PBMC+PHA組、PBMC+KLH組、PBMC+GMI組、PBMC+醫藥組合物組),為在有PBMC的處理狀況下,同時給予低劑量的處理,以流式細胞儀進行一重複實驗所得到的控制組、PBMC+PHA組、PBMC+KLH組、PBMC+GMI組及PBMC+醫藥組合物組的細胞毒殺率分別為7.0%、29.4%、7.5%、50.4%及56.7%。如圖5E所示,在有PBMC的處理狀況下,同時給予低劑量的處理,以流式細胞儀進行三重複實驗而統計獲得的細胞毒殺率結果顯示,PHA組對胰臟癌細胞有部分毒殺作用,KLH組對胰臟癌細胞的毒殺效果不大;GMI組對胰臟癌細胞的毒殺效果較好,而醫藥組合物組對胰臟癌細胞的毒殺效果相較於GMI組更為顯著,顯示在有PBMC的情況下,醫藥組合物組(PHA+KLH+GMI)與單獨以PHA、KLH、GMI處理的組別相比,對於BxPC-3細胞的毒殺現象更明顯且具有顯著差異,讓胰臟癌細胞死亡的現象更顯著,使得治療胰臟癌的效果更好。另外,在圖5D中(圖中顯示為PBMC+PHA組、PBMC+KLH組、PBMC+GMI組、PBMC+醫藥組合物組),為在有PBMC的處理狀況下,同時給予高劑量的處理,以流式細胞儀進行一重複實驗所得到的控制組、PBMC+PHA組、PBMC+KLH組、PBMC+GMI組及PBMC+醫藥組合物組的細胞毒殺率分別為7.0%、50%、19.5%、51.4%及59.5%。由圖5F的結果所示,在有PBMC的處理狀況下,同時給予高劑量的處理,以流式細胞儀進行三重複實驗而統計獲得的細胞毒殺率結果顯示,PHA組對胰臟癌細胞有部分毒殺作用,KLH組對胰臟癌細胞毒殺效果不大;GMI組對胰臟癌細胞的毒殺效果較好,而醫藥組合物組造成胰臟癌細胞毒殺現象相較於GMI組更為顯著,顯示醫藥組合物組(PHA+KLH+GMI)與單獨以PHA、KLH、GMI處理的組別相比,對於BxPC-3細胞的毒殺現象更明顯且具有顯著差異,讓胰臟癌細胞死亡的現象更顯著,使得治療胰臟癌的效果更好。在有PBMC的情況下,與圖5E的低劑量組別處理的結果相比,圖5F高劑量組別的結果顯示,當醫藥組合物組的劑量提高時,其造成胰臟癌細胞死亡的現象更顯著。
本發明的醫藥組合物對於
BxPC-3
的細胞毒殺具有協同作用:
在本實驗例中,在沒有PBMC的情況下,低劑量醫藥組合物組CI值 = 0.45、高劑量醫藥組合物組CI值 = 0.9;在有PBMC的情況下,低劑量醫藥組合物組CI值 = 0.52,結果都<1,顯示在無PBMC的情況下,相較於單獨使用PHA、KLH或GMI,低劑量及高劑量之醫藥組合物組毒殺BxPC-3細胞都具有協同作用,而在有PBMC的情況下,相較於單獨使用PHA、KLH或GMI,低劑量之醫藥組合物組毒殺BxPC-3細胞具有協同作用。
依據實驗例一的結果顯示,本發明實施例的醫藥組合物中的GMI及PHA,可以增加免疫細胞(PBMC)的免疫反應且不影響其細胞存活率。依據實驗例二的結果顯示,本發明實施例的醫藥組合物會造成人類肺癌細胞(A549)明顯死亡,細胞死亡的現象相較於單獨以PHA、KLH、GMI處理的組別來說更為顯著,且具有協同作用;另外,隨著醫藥組合物濃度的提高,造成肺癌細胞死亡的現象越顯著;再者,醫藥組合物可增進免疫細胞的免疫反應,以提高其對於腫瘤細胞的毒殺效果。依據實驗例三的結果顯示,本發明實施例的醫藥組合物會造成乳腺癌細胞(MDA-MB-231)明顯死亡,細胞死亡的現象相較於單獨以PHA、KLH、GMI處理的組別來說更為顯著,且具有協同作用;另外,隨著醫藥組合物濃度的提高,造成乳腺癌細胞死亡的現象越顯著;再者,醫藥組合物可增進免疫細胞的免疫反應,以提高其對於腫瘤細胞的毒殺效果。依據實驗例四的結果顯示,本發明實施例的醫藥組合物會造成膀胱癌細胞(T24)明顯死亡,且細胞死亡的現象相較於單獨以PHA、KLH、GMI處理的組別來說更為顯著,且具有協同作用;另外,隨著醫藥組合物濃度的提高,造成膀胱癌細胞死亡的現象越顯著;再者,醫藥組合物可增進免疫細胞的免疫反應,以提高其對於腫瘤細胞的毒殺效果。依據實驗例五的結果顯示,本發明實施例的醫藥組合物會造成胰臟癌細胞(BxPC-3)明顯死亡,且細胞死亡的現象相較於單獨以PHA、KLH、GMI處理的組別來說更為顯著,且具有協同作用;另外,隨著醫藥組合物濃度的提高,造成胰臟癌細胞死亡的現象越顯著;再者,醫藥組合物可增進免疫細胞的免疫反應,以提高其對於腫瘤細胞的毒殺效果。特別地,上述實驗例僅用以說明,而非對本發明的限制。
從上述細胞培養試驗的數據可用於配製一個範圍的劑量用於人體,該醫藥組合物的劑量較佳在一個範圍的循環濃度內,該範圍的循環濃度包括ED50且毒性極低或沒有毒性,對於人體的治療有效劑量可以在該範圍內變化,取決於所用的劑型和使用的投藥途徑。對於本發明的方法中使用的醫藥組合物來說,可以從細胞培養試驗估計治療有效劑量。
綜上所述,本發明的醫藥組合物及其製備用途,能夠有效地促進免疫細胞針對腫瘤細胞的特異性主動免疫反應,進而提高醫藥組合物針對腫瘤細胞的毒殺率,使得腫瘤細胞的存活率下降,達到治療腫瘤的效果。
以上所述僅為舉例性,而非為限制性者。任何未脫離本發明之精神與範疇,而對其進行之等效修改或變更,均應包含於後附之申請專利範圍中。
圖1A為以本發明醫藥組合物、PHA、KLH及GMI處理人類周邊血液單核細胞(PBMC)的研究結果,其為以光學顯微鏡進行觀察的細胞照片。
圖1B及圖1C為以本發明醫藥組合物、PHA、KLH及GMI處理人類周邊血液單核細胞(PBMC)的流式細胞儀分析結果。圖1B為以流式細胞儀分析7-AAD、CFSE螢光強度的細胞分布圖,以此分布圖可計算出各個組別的細胞毒殺率。圖1C為依據圖1B以流式細胞儀進行三重複實驗而統計獲得的細胞毒殺率。
圖2A及圖2B為以本發明醫藥組合物、PHA、KLH及GMI處理人類肺癌細胞株(A549細胞)的研究結果,其為以光學顯微鏡進行觀察的細胞照片。
圖2C至圖2F為以本發明醫藥組合物、PHA、KLH及GMI處理肺癌細胞株(A549細胞)的流式細胞儀分析結果。圖2C、圖2D為以流式細胞儀分析7-AAD、CFSE螢光強度的細胞分布圖,以此分布圖可計算出各個組別的細胞毒殺率。圖2E為依據圖2C以流式細胞儀進行三重複實驗而統計獲得的細胞毒殺率。圖2F為依據圖2D以流式細胞儀進行三重複實驗而統計獲得的細胞毒殺率。
圖3A及圖3B為以本發明醫藥組合物、PHA、KLH及GMI處理人類乳腺癌細胞株(MDA-MB-231細胞)的研究結果,其為以光學顯微鏡進行觀察的細胞照片。
圖3C至圖3F為以本發明醫藥組合物、PHA、KLH及GMI處理人類乳腺癌細胞株(MDA-MB-231細胞)的流式細胞儀分析結果。圖3C、圖3D為以流式細胞儀分析7-AAD、CFSE螢光強度的細胞分布圖,以此分布圖可計算出各個組別的細胞毒殺率。圖3E為依據圖3C以流式細胞儀進行三重複實驗而統計獲得的細胞毒殺率。圖3F為依據圖3D以流式細胞儀進行三重複實驗而統計獲得的細胞毒殺率。
圖4A及圖4B為以本發明醫藥組合物、PHA、KLH及GMI處理人類膀胱癌細胞株(T24細胞)的研究結果,其為以光學顯微鏡進行觀察的細胞照片。
圖4C至圖4F為以本發明醫藥組合物、PHA、KLH及GMI處理人類膀胱癌細胞株(T24細胞)的流式細胞儀分析結果。圖4C、圖4D為以流式細胞儀分析7-AAD、CFSE螢光強度的細胞分布圖,以此分布圖可計算出各個組別的細胞毒殺率。圖4E為依據圖4C以流式細胞儀進行三重複實驗而統計獲得的細胞毒殺率。圖4F為依據圖4D以流式細胞儀進行三重複實驗而統計獲得的細胞毒殺率。
圖5A及圖5B為以本發明醫藥組合物、PHA、KLH及GMI處理人類胰臟癌細胞株(BxPC-3細胞)的研究結果,其為以光學顯微鏡進行觀察的細胞照片。
圖5C至圖5F為以本發明醫藥組合物、PHA、KLH及GMI處理人類胰臟癌細胞株(BxPC-3細胞)的流式細胞儀分析結果。圖5C、圖5D為以流式細胞儀分析7-AAD、CFSE螢光強度的細胞分布圖,以此分布圖可計算出各個組別的細胞毒殺率。圖5E為依據圖5C以流式細胞儀進行三重複實驗而統計獲得的細胞毒殺率。圖5F為依據圖5D以流式細胞儀進行三重複實驗而統計獲得的細胞毒殺率。
Claims (18)
- 一種醫藥組合物,包括一小孢子靈芝免疫調節蛋白(GMI,ganoderma microsporum immunomodulatory protein)、一鑰孔蟲戚血藍蛋白(KLH,Keyhole limpet hemocyanin)以及一植物性凝血球素(PHA,phytohemagglutinin)。
- 如請求項1所述的醫藥組合物,其中該小孢子靈芝免疫調節蛋白的濃度介於5微克/毫升至200微克/毫升之間。
- 如請求項1所述的醫藥組合物,其中該鑰孔蟲戚血藍蛋白的濃度介於10微克/毫升至200微克/毫升間。
- 如請求項1所述的醫藥組合物,其中該小孢子靈芝免疫調節蛋白與該鑰孔蟲戚血藍蛋白的重量比例介於20:1至1:40之間。
- 如請求項1所述的醫藥組合物,其中該植物性凝血球素的濃度介於1微克/毫升至20微克/毫升之間。
- 如請求項1所述的醫藥組合物,其中該小孢子靈芝免疫調節蛋白與該植物性凝血球素的重量比例介於200:1至1:4之間。
- 如請求項1所述的醫藥組合物,其中該鑰孔蟲戚血藍蛋白與該植物性凝血球素的重量比例介於200:1至1:2之間。
- 如請求項1所述的醫藥組合物,其中該醫藥組合物的劑型係為錠劑、膠囊、乳劑、分散劑、懸浮液、溶液劑、糖漿劑、顆粒劑、經皮貼劑、凝膠劑、粉劑、霜劑、膏劑、栓劑或噴霧劑。
- 一種醫藥組合物在製備治療上皮細胞癌的藥物之用途,其中該醫藥組合物包括一小孢子靈芝免疫調節蛋白(GMI)、一鑰孔蟲戚血藍蛋白(KLH)以及一植物性凝血球素(PHA)。
- 如請求項9所述的用途,其中該小孢子靈芝免疫調節蛋白的濃度介於5微克/毫升至200微克/毫升之間。
- 如請求項9所述的用途,其中該鑰孔蟲戚血藍蛋白的濃度介於10微克/毫升至200微克/毫升之間。
- 如請求項9所述的用途,其中該小孢子靈芝免疫調節蛋白與該鑰孔蟲戚血藍蛋白的重量比例介於20:1至1:40之間。
- 如請求項9所述的用途,其中該植物性凝血球素的濃度介於1微克/毫升至20微克/毫升之間。
- 如請求項9所述的用途,其中該小孢子靈芝免疫調節蛋白與該植物性凝血球素的重量比例介於200:1至1:4之間。
- 如請求項9所述的用途,其中該鑰孔蟲戚血藍蛋白與該植物性凝血球素的重量比例介於200:1至1:2之間。
- 如請求項9所述的用途,其中該醫藥組合物的劑型係為錠劑、膠囊、乳劑、分散劑、懸浮液、溶液劑、糖漿劑、顆粒劑、經皮貼劑、凝膠劑、粉劑、霜劑、膏劑、栓劑或噴霧劑。
- 如請求項9所述的用途,其中該上皮細胞癌係為肺癌、乳癌、口腔癌、食道癌、胃癌、大腸癌、肝癌、子宮頸癌、膀胱癌、胰臟癌或皮膚癌。
- 如請求項9所述的用途,其中該上皮細胞癌係為肺癌、乳癌、胰臟癌或膀胱癌。
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