CN103408654A

CN103408654A - 一种rTRAIL突变体-单甲基化聚乙二醇马来酰亚胺偶联物及其应用

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Publication number: CN103408654A
Application number: CN2013103428613A
Authority: CN
Inventors: 陈枢青; 潘利强
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2013-08-07
Filing date: 2013-08-07
Publication date: 2013-11-27
Anticipated expiration: 2033-08-07
Also published as: CN103408654B

Abstract

本发明公开了一种rTRAIL突变体-单甲基化聚乙二醇马来酰亚胺偶联物及其应用。该偶联物由单甲基化聚乙二醇马来酰亚胺偶联rTRAIL突变体三聚体构成，rTRAIL突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，单甲基化聚乙二醇马来酰亚胺的分子量为3000～10000Da。所述应用是指该偶联物在制备抗肿瘤药物中的应用。与现有技术相比，本发明的mPEG_MAL-rTRAIL突变体偶联物质量易于控制，具有更长的半衰期，更好的稳定性、生物利用度，保留了原TRAIL分子对肿瘤细胞约20%的凋亡诱导活性，成药性更高；制备mPEG_MAL-rTRAIL突变体偶联物的反应时间更短，目的产物得率更高；不存在肝毒性隐患。

Description

一种rTRAIL突变体-单甲基化聚乙二醇马来酰亚胺偶联物及其应用

技术领域

本发明属于生物技术和药物领域，具体涉及一种rTRAIL突变体-单甲基化聚乙二醇马来酰亚胺偶联物及其应用。

背景技术

肿瘤坏死因子（TNF）相关的凋亡诱导配体（TNF relatedapoptosis-inducing ligand，TRAIL）是继TNF、FasL之后发现的第三个TNF家族的凋亡因子，为一种抗癌应用前景良好的生物药物。TRAIL由Wiley等从心肌cDNA文库中克隆出来的，因其氨基酸顺序具有TNF超家族的结构特征并能诱导Jurkat细胞和EB病毒转化的人类淋巴细胞凋亡而得名。许多临床前期研究表明TRAIL能有效诱导多种癌细胞系凋亡，并同时保护正常细胞免于细胞毒副反应。目前国外已进行关于TRAIL及其受体激动型抗体的Ⅰ、Ⅱ期临床试验，并取得初步疗效。另外，TRAIL对NF-κB仅有很微弱的激活作用，即使是全身用药，也不会像TNF-α和Fas-L那样产生严重的炎症反应，这些特性使得TRAIL有成为新一代抗肿瘤药物的潜质。

Sarah G.Hymowitz等研究发现TRAIL在形成三聚体时生物活性最强，同时受体激活时也成三聚体形式，三聚体顶部附近的锌结合位点对维持TRAIL的结构与稳定性起到重要作用，TRAIL分子中还存在一些特殊位点，第109位的天冬氨酸（Asp）是一个潜在的N糖基化位点，可被金属蛋白酶从膜上切下而产生一相对分子质量为24000左右的可溶性活性肽段（114-281），称为rTRAIL。该片段可形成分子量分别为48000和66000左右的二聚体和三聚体，TRAIL的药物应用多采用此肽段。离体实验表明，全长或可溶形式的TRAIL形成的三聚体都可以快速诱导多种肿瘤细胞凋亡。与TNF家族其它成员相比，TRAIL最独特的区别在于，其第137-152位氨基酸序列可形成一个由12-16个氨基酸组成的凸出的环（AA loop）,此结构可插入受体的TRAIL结合位点，从而保证受体与TRAIL特异性结合，研究表明，此插入环与TRAIL细胞毒性作用有关。另外，TRAIL序列中Cys230残基在维持TRAIL的结构和生物活性中具有重要作用。若Cys230突变为Ala或Ser，TRAIL蛋白的稳定性下降，而且不能螯合锌原子形成三聚体，与受体结合能力也会下降200倍，严重影响TRAIL的诱导凋亡的活性。然而，TRAIL的半衰期短（10～30分钟）、不稳定和生物利用度低等缺点制约了其在临床研究上的进一步发展。

聚乙二醇（PEG）是一种pH中性、无毒、水溶性较高的亲水聚合物，其重复单元为氧乙烯基，端基为两个羟基，呈线性或支化链状结构，PEG聚合物是迄今为止已知聚合物中蛋白和细胞吸收水平最低的聚合物。由于PEG无毒且具有良好的生物相容性，PEG已被FDA批准可作为体内注射药用聚合物。PEG化是一项用于延长蛋白质半衰期、增加可溶性和稳定性的技术。美国食品与药品监督管理局（FDA）批准上市了许多PEG化蛋白药物，如PEG-asparaginase

，deaminase

等，证明了该项技术的安全性和有效性。因此，研究者们选择用聚乙二醇对TRAIL进行修饰，以克服其上述的缺点。他们选择用单甲基化聚乙二醇乙醛（mPEG-ALD）对TRAIL进行PEG修饰，因为在低pH（pH=5）的条件下，mPEG-ALD可以与TRAIL的N端特异性反应，然后经硼氢化钠还原后形成稳定的PEG-TRAIL偶联物。但是研究者为了稳定TRAIL的三聚体结构，在TRAIL的N端与PEG之间引入了亮氨酸拉链（LZ），形成PEG-HZ-TRAIL。这种偶联物的不足之处在于：首先，LZ-TRAIL据文献报道具有肝毒性，尽管针对PEG-HZ-TRAIL的研究表明其能改善LZ-TRAIL的肝毒性，但这始终是一个隐患；其次，PEG-HZ-TRAIL只保留了原有TRAIL大约7.3%左右的活性，表明这种PEG修饰方式对TRAIL的活性影响较大；最后，PEG-HZ-TRAIL的偶联需要12h的时间。

因此亟需寻找另一种偶联速率快、最大程度保留TRAIL活性和除去了肝毒性隐患的PEG化TRAIL，来解决上述问题。

发明内容

本发明提供了一种rTRAIL突变体-单甲基化聚乙二醇马来酰亚胺偶联物，利用单甲基化聚乙二醇马来酰亚胺（mPEG-MAL）对rTRAIL突变体进行定点修饰，不仅最大程度地保留了rTRAIL的抗肿瘤活性，还大大延长了rTRAIL的半衰期，而且不存在肝毒性隐患。

一种rTRAIL突变体-单甲基化聚乙二醇马来酰亚胺偶联物，由单甲基化聚乙二醇马来酰亚胺偶联rTRAIL突变体三聚体构成，所述rTRAIL突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述单甲基化聚乙二醇马来酰亚胺的分子量为3000～10000Da。

所述rTRAIL突变体是对全长TRAIL蛋白的第95～281位氨基酸肽段（即rTRAIL）进行定点突变获得的，将第109位的天冬酰胺（Asn）突变为半胱氨酸（Cys）。

天然rTRAIL单体分子表面也有半胱氨酸残基，但均用于形成稳定的三聚体，三聚体分子表面因没有游离巯基存在而失去了与mPEG-MAL进行偶联的位点。因此，本发明利用PCR定点突变手段获得了含有一个半胱氨酸突变位点的rTRAIL突变体，步骤为：

（1）提取人组织总RNA，以总RNA为模板进行反转录，获得cDNA文库；

（2）以所述cDNA为模板，利用引物P1和P2进行PCR扩增，得到TRAIL编码序列；

（3）以所述TRAIL编码序列为模板，利用引物P3和P4进行PCR定点突变扩增，获得突变序列；

（4）将突变序列可操作性地连入载体，转化宿主细胞；

（5）诱导经转化的宿主细胞表达融合蛋白，获得所述rTRAIL突变体。

所述引物P1和P2的序列为：

P1：5’-ATGGCTATGATGGAGGTCCAGG-3’；

P2：5’-TTAGCCAACTAAAAAGGCCCCG-3’；

所述引物P3和P4的序列为：

P3：5’-TATACCATGGGCACCTCTGAGGAAACCATT

TCTACAGTTCAAGAAAAGCAACAATGTATTTCT-3’；

P4：5’-TTCTCGAGTTAGCCAACTAAAAAGGCCCC

GAAAAAACTGGCTTCATGGTCCATGTCCATGTC-3’。

用于突变的TRAIL分子可来源于人或动物，但为了对人的肿瘤治疗更有帮助，优选为人的天然TRAIL分子。全长TRAIL蛋白的第114～281位氨基酸肽段已具备TRAIL全部的抗肿瘤活性，因此选择第109位氨基酸作为突变位点，可以尽量避免影响TRAIL原有的活性。

rTRAIL突变体通过第109位半胱氨酸巯基直接与mPEG-MAL的马来酰亚胺基团偶联，由于TRAIL在聚合成三聚体时生物活性最强，因此，本发明的偶联物分子中含有一个rTRAIL突变体三聚体。由于rTRAIL突变体的突变位点位于第109位氨基酸，不在蛋白分子N端，聚合成三聚体后会形成空间位阻，并且，mPEG-MAL分子量较大，导致该rTRAIL突变体三聚体上只能偶联2个单甲基化聚乙二醇马来酰亚胺分子。获得的偶联物保留了原TRAIL分子20%的抗肿瘤活性。

本发明中，mPEG-MAL的分子量优选为3000～10000Da；进一步优选为5000Da。mPEG-MAL的分子量过大，则会显著降低rTRAIL突变体的活性甚至无法与rTRAIL突变体进行偶联；分子量过小，则无法延长rTRAIL突变体的半衰期。

本发明还提供了所述rTRAIL突变体-单甲基化聚乙二醇马来酰亚胺偶联物的制备方法，包括：

（1）将rTRAIL突变体多聚体解聚，重新聚合得到rTRAIL突变体三聚体；具体包括：将rTRAIL突变体溶于含锌离子的缓冲液中，加入磷酸三（β-氯乙基)酯，30～40℃水浴反应1～3h；

rTRAIL突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；由于rTRAIL突变体之间会通过二硫键形成多聚体，加入磷酸三（β-氯乙基）酯（TCEP）使不稳定的多聚体解聚，保持单体状态，反应体系中的锌离子进一步促使rTRAIL突变体单体聚合成稳定的三聚体，而突变位点的半胱氨酸巯基则处于游离状态；

（2）将rTRAIL突变体三聚体与单甲基化聚乙二醇马来酰亚胺混合，进行偶联反应；

所述偶联反应的温度优选为0～4℃，时间优选为30～60min；进一步优选为：温度4℃，时间40min；rTRAIL突变体三聚体上的游离巯基与mPEG-MAL的马来酰亚胺基团偶联，每个rTRAIL突变体三聚体最多可偶联2个mPEG-MAL分子；mPEG-MAL的分子量优选为3000～10000Da；

（3）反应完成后，分离纯化得到所述rTRAIL突变体-单甲基化聚乙二醇马来酰亚胺偶联物；

经mPEG-MAL修饰的rTRAIL突变体单体的分子量为28kDa，而反应体系中存在的其他分子的分子量均小于10kDa，因此，利用超滤除去反应液中分子量低于10kDa的物质，再经离心去沉淀，将所得上清过滤除菌，即可获得本发明所述rTRAIL突变体-单甲基化聚乙二醇马来酰亚胺偶联物。

本发明还提供了所述rTRAIL突变体-单甲基化聚乙二醇马来酰亚胺偶联物在制备抗肿瘤药物中的应用。

所述抗肿瘤药物包括有效量的rTRAIL突变体-单甲基化聚乙二醇马来酰亚胺偶联物（简写为mPEG_MAL-rTRAIL突变体偶联物），以及至少一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。制备时，通常将活性成分与赋形剂混合，或用赋形剂稀释，或包在可以胶囊或药囊形式存在的载体中。当赋形剂起稀释剂作用时，它可采用固体、半固体或液体材料作为赋形剂、载体或活性成分的介质。因此，组合物可以是片剂、丸剂、粉剂、溶液剂、糖浆剂、灭菌注射溶液等。

合适的赋形剂包括：乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水等；制剂还可包括：湿润剂、乳化剂、防腐剂（如羟基苯甲酸甲酯和丙酯）、甜味剂等。所述抗肿瘤药物可制成单元或多元剂型，各剂型包含为了产生所期望的疗效而计算出预定量的mPEG_MAL-rTRAIL突变体偶联物，以及合适的药剂学赋形剂。

所述的抗肿瘤药物可以通过常规途径进行给药，包括（但并不限于）：肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、局部给药等。

使用该药物时，是将安全有效量的mPEG_MAL-rTRAIL突变体偶联物施用于人，其中该安全有效量的范围优选为0.5～50毫克/千克体重，更优选为1～10毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是在熟练医师技能范围之内的。

此外，本发明的偶联物还可与其他治疗药物联用，其中包括（但并不限于）：各种细胞因子，如IFN、TNF、IL-2等；各种肿瘤化疗药物，如5-FU、氨甲喋呤等影响核酸生物合成的药物；氮芥、环磷酰胺等烷化剂类药物；阿霉素、放线菌素D等干扰转录过程阻止RNA合成的药物；长春新碱、喜树碱类等影响蛋白质合成的药物及某些激素类药物，等等。

作为优选，所述抗肿瘤药物为抗肺癌药物。体外试验表明，本发明mPEG_MAL-rTRAIL突变体偶联物对NCI-H460细胞的凋亡诱导活性达66.8%。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

（1）本发明将rTRAIL突变体的非活性位点突变为与mPEG-MAL特异性偶联的半胱氨酸，获得的mPEG_MAL-rTRAIL突变体偶联物质量易于控制，经mPEG-MAL修饰后，rTRAIL具有更长的半衰期，更好的稳定性、生物利用度，保留了原TRAIL分子对肿瘤细胞约20%的凋亡诱导活性，成药性更高；

（2）本发明的制备方法中TRAIL突变体与mPEG-MAL的偶联反应时间更短，目的产物得率更高，只需40min即可得到90%的目标产物；

（3）本发明的制备方法中不需引入亮氨酸拉链即可获得rTRAIL突变体的稳定三聚体，不存在肝毒性隐患。

附图说明

图1为大肠杆菌表达的rTRAIL突变体N109C电泳图；其中，M代表低分子量Marker，1为未诱导的菌液；2、3为诱导的菌液，4为未诱导的菌液破碎后离心取的上清（可溶部分），5、6为诱导的菌液破碎后离心取的上清（可溶部分），7、8、9为诱导和不诱导的沉淀用8M尿素重溶后的样品；

图2为rTRAIL突变体N109C的亲和纯化结果电泳图；其中，M为蛋白分子量marker，1为IPTG诱导后的菌液，2为破菌后的上清，3为Ni柱的流穿液，4为10mM咪唑洗脱液，5为60mM咪唑洗脱液，6为500mM咪唑洗脱液；

图3为rTRAIL突变体N109C的SP强阳离子交换柱纯化结果电泳图；其中，1为10mM咪唑洗脱液脱盐后的蛋白溶液，2和3都是SP柱的洗脱蛋白，即纯化后的N109C，4为N109C非变性电泳的结果；

图4a为rTRAIL突变体与mPEG-MAL反应不同时间的蛋白电泳图；

其中，M代表低分子量蛋白标准；

图4b为不同摩尔比的mPEG-ALD与TRAIL_(114-281)反应获得的偶联物电泳图；其中，M代表低分子量蛋白标准；

图5a为TRAIL_(114-281)的MALDI-TOF测定分子量的结果；

图5b为N109C突变体的MALDI-TOF测定分子量的结果；

图5c为mPEG_ALD-TRAIL_(114-281)的MALDI-TOF测定分子量的结果；

图5d为mPEG_MAL-N109C的MALDI-TOF测定分子量的结果；

图6为反相HPLC分离N09C、mPEG_ALD-TRAIL_(114-281)与mPEG_MAL-N109C的结果；

图7为TRAIL_(114-281)、mPEG_ALD-TRAIL_(114-281)与mPEG_MAL-N109C的二维结构分析结果图；

图8为TRAIL_(114-281)、mPEG_ALD-TRAIL_(114-281)与mPEG_MAL-N109C的稳定性分析

图9a为TRAIL_(114-281)、mPEG_ALD-TRAIL_(114-281)与mPEG_MAL-N109C的体外抗肿瘤活性分析结果图；

图9b为TRAIL_(114-281)、mPEG_ALD-TRAIL_(114-281)与mPEG_MAL-N109C诱导肿瘤细胞凋亡活性分析结果图；

图10为TRAIL_(114-281)、mPEG_ALD-TRAIL_(114-281)与mPEG_MAL-N109C的药代动力学图谱；

图11a为TRAIL_(114-281)、mPEG_ALD-TRAIL_(114-281)与mPEG_MAL-N109C处理裸鼠给药第七天时的活体肿瘤图；

图11b为TRAIL_(114-281)、mPEG_ALD-TRAIL_(114-281)与mPEG_MAL-N109C处理裸鼠的剥离肿瘤图；

图11c为TRAIL_(114-281)、mPEG_ALD-TRAIL_(114-281)与mPEG_MAL-N109C处理裸鼠体内肿瘤大小变化图；

图12a为TRAIL_(114-281)、mPEG_ALD-TRAIL_(114-281)与mPEG_MAL-N109C处理裸鼠的体重变化图；

图12b为TRAIL_(114-281)、mPEG_ALD-TRAIL_(114-281)与mPEG_MAL-N109C处理裸鼠的血清学指标检测结果图；

图13为TRAIL_(114-281)、mPEG_ALD-TRAIL_(114-281)与mPEG_MAL-N109C处理裸鼠的免疫组化检测结果图；其中，肝脏与肾脏切片用H&E染色；肿瘤组织则用原位凋亡检测试剂盒（TUNEL）检测；

图14为mPEG-ALD与mPEG-MAL对TRAIL的修饰原理示意图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。

1、建立人前列腺cDNA文库

（1）提取人前列腺总mRNA

液氮研磨冻存的人前列腺组织小块（100mg左右）成粉末状，加TRIZOL试剂1mL继续反复研磨，转移至1.5 mL无RNA酶EP管中，室温放置5min，加0.2mL氯仿剧烈振荡15s，室温放置3min；4℃12000g离心15min，转移上层水相至另一无RNA酶的EP管中；加入异丙醇0.5mL，室温放置10min，沉淀RNA；4℃12000g离心10min，去上清，75%乙醇洗涤沉淀；4℃下12000g离心5min，去上清，干燥后用50μLDEPC水溶解，-70℃保存。

（2）反转录PCR

以oligodT为引物，人前列腺总RNA为模板，加AMV逆转录酶进行Reverse-PCR，得到cDNA文库。具体步骤为：

1）RNA预变性：5μg人前列腺RNA+25μg OligodT，用0.1%DEPC补足至10μL；70℃水浴5min，冷却至室温，破坏mRNA二级结构。

2）反转录：合成体系为：

PCR程序为：

逆转录过程 42℃ 60min

逆转录酶灭活 70℃ 10min

获得的cDNA存于-20℃，备用。

2、获取TRAIL编码序列

以上述cDNA为模板，P1和P2为上下游引物，Taq DNA聚合酶催化合成和扩增TRAIL编码序列。经序列分析，所得DNA序列与GenBank登记的序列（NM_003842.4）所显示的TRAIL编码序列一致，即得到了TRAIL编码序列。引物的序列为：

P1：5’-ATGGCTATGATGGAGGTCCAGG-3’；

P2：5’-TTAGCCAACTAAAAAGGCCCCG-3’。

PCR反应体系为：

PCR反应程序：

3、获取TRAIL 95～281（rTRAIL）N109C突变序列

以TRAIL编码序列为模板，P3和P4为上下游引物，Taq DNA聚合酶催化合成和扩增rTRAIL N109C突变体编码序列。经测序分析，所得DNA序列如SEQ ID No.2所示，与预想一致。引物的序列为：

P3：5’-TATACCATGGGCACCTCTGAGGAAACCATT

TCTACAGTTCAAGAAAAGCAACAATGTATTTCT-3’；

P4：5’-TTCTCGAGTTAGCCAACTAAAAAGGCCCC

GAAAAAACTGGCTTCATGGTCCATGTCCATGTC-3’。

除引物和模板外，PCR反应体系和反应程序同步骤2。

4、构建含rTRAIL突变序列的表达载体

rTRAIL N109C突变序列和pET28a（+）分别进行Nco I/Xho I双酶切，然后按照3:1的摩尔比连接，连接酶为T4（Takara）；连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，挑取阳性克隆培养；抽提质粒后Nco I/Xho I双酶切验证连接情况，再经测序验证，得到rTRAIL突变体表达载体：pET28a（+）-rTRAIL N109C。

5、表达载体转化大肠杆菌，建立工程菌

将pET28a（+）-rTRAIL N109C表达载体转化大肠杆菌表达宿主BL21（DE3）（购自Novagen），从卡那霉素抗性平板上挑取单克隆于37℃160rpm培养过夜。用菌液PCR的方法确认rTRAIL突变体表达载体已转化表达宿主：以菌液作为模板，P3、P4作为引物进行PCR。经验证为阳性的单克隆即为所需要的工程菌，菌液加10%～15%甘油后-80℃保存。

6、rTRAIL突变体的制备和纯化

将构建好的工程菌接种至200mL LB培养基（含15μg/mL kanamycin）中，37℃160rpm摇床培养至菌液OD₆₀₀=0.8左右；加入终浓度为1mM的IPTG诱导BL21（DE3）表达融合蛋白，诱导时间为12h；7200g离心10min得到BL21菌体。

用上样缓冲液A重悬菌体，法式压力破碎；7200g离心30min后，取上清过0.22μm水膜；然后用GE公司Ni-NTA亲和柱进行金属亲和层析：10mM咪唑洗脱杂蛋白，60mM咪唑洗脱目的蛋白；60mM咪唑洗脱的组分用GE公司脱盐柱将其缓冲液替换为缓冲液B，然后进行进一步的离子交换层析，选用的柱子为GE公司的SP强阳离子交换柱；缓冲液C用于洗脱离子交换柱上的蛋白。

其中，各缓冲液的组分为：

缓冲液A：50mM NaH₂PO₄，300mM NaCl，pH7.4；

缓冲液B：20mM NaH₂PO₄，pH6.0；

缓冲液C：20mM NaH₂PO₄，1M NaCl，pH6.0。

图1、图2和图3所示的为rTRAIL N109C突变体的原核表达及纯化结果电泳图。由图1可见，rTRAIL N109C突变体可在大肠杆菌内成功地可溶性表达。由图2可见，在10mM咪唑浓度下rTRAIL N109C突变体已经开始洗脱，初步纯化后其纯度在85%以上。由图3可见，经SP柱纯化后，能去掉部分杂蛋白，但还有三条细小的杂带。同时，对基本纯化的rTRAIL N109C突变体进行非变性凝胶电泳发现，获得的rTRAIL N109C突变体中存在二聚体、四聚体等，这是突变蛋白分子间二硫键所导致的。

获得的N109C突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

7、PEG修饰的TRAIL

下面以mPEG-MAL修饰N109C突变体、以mPEG-ALD修饰TRAIL_(114-281)分子N端，分别获得两种偶联物，并检测两种偶联物的生物活性。

（1）mPEG_MAL-N109C偶联物

取0.5mg N109C突变体溶解于1mL PBS（pH6.0，含10μM ZnCl₂）中，加入6μL磷酸三（β-氯乙基）酯（TCEP），37℃水浴2h；边搅拌边加入用50μL PBS（pH6.0）的2倍过量mPEG-MAL（5000Da）（2倍过量即反应体系中mPEG-MAL的摩尔量大于等于N109C突变体的2倍），4℃反应40min，加入过量的半胱氨酸终止反应；用Millipore截留分子量为10kDa的超滤管除去反应体系中的小分子；所得到的偶联物过0.22μm孔径的水膜除菌，-20℃保存备用。

图4a为N109C突变体与mPEG-MAL反应不同时间的蛋白电泳结果图。由图4a可见，当两者反应0.75h后，90%的蛋白条带偏移到箭头所示的位置，表明N109C突变体已被PEG修饰上。且两者反应12h后，条带没有明显变化，表明N109C突变体与mPEG-MAL的偶联已在40min内完成。

（2）mPEG_ALD-TRAIL_(114-281)偶联物

取0.5mg TRAIL_(114-281)（购自海正药业）溶解于1mL100mM的醋酸钠（pH5.0）中，加入过量的mPEG-ALD（摩尔量是TRAIL_(114-281)的2.5～10倍），再加入终浓度为20mM的硼氢化钠，在4℃不断搅拌12h；用Millipore截留分子量为10kDa的超滤管除去反应体系中的小分子；所得到的偶联物过0.22μm孔径的水膜除菌，-20℃保存备用。

图4b为TRAIL_(114-281)与不同摩尔量的mPEG-ALD反应后的电泳结果图。由图4b可见，随着mPEG-ALD与TRAIL_(114-281)的摩尔比值增大，目标产物（箭头所示条带）也越多。在摩尔比值为10时，mPEG_ALD-TRAIL_(114-281)的量没有明显的增多，表明7.5为最优的摩尔比值。8、MALDI-TOF测定偶联物的分子量

将TRAIL_(114-281)、mPEG_ALD-TRAIL_(114-281)、N109C与mPEG_MAL-N109C送至AB SCIEX公司（上海）进行MALDI-TOF测定。结果见图5a、5b、5c、5d。

由图5a可见，对于TRAIL_{（114-281）}样品，根据理论分子量判断，1为单体，2为二聚体，3为三聚体。

由图5b可见，对于rTRAIL突变体N109C样品，1为单体，2为二聚体，3为三聚体，4为信号显著的某种杂蛋白。

由图5c可见，对于mPEG_ALD-TRAIL_(114-281)样品，1为未偶联mPEG-ALD的TRAIL_{（114-281）}单体，2为偶联一个mPEG-ALD分子的TRAIL_{（114-281）}单体，3为偶联两个mPEG-ALD分子的TRAIL_{（114-281）}二聚体，4为偶联三个mPEG-ALD分子的TRAIL_{（114-281）}三聚体。

由图5d可见，对于mPEG_MAL-N109C样品，1为未偶联mPEG-MAL的N109C单体，2为偶联一个mPEG-MAL分子的N109C单体，3为偶联两个mPEG-MAL分子的N109C二聚体，4为偶联两个mPEG-MAL分子的N109C三聚体。

图5a、5b、5c、5d表明，TRAIL_(114-281)和N109C突变体均为单体、二聚体和三聚体的混合物，这三者可能形成一个平衡，可相互转化；它们在与mPEG-ALD或mPEG-MAL反应后，产物中存在mPEG_ALD-TRAIL_(114-281)三聚体与mPEG_MAL-N109C三聚体，前者的三聚体偶联了三个mPEG-ALD分子，而后者的三聚体偶联了两个mPEG-MAL分子。

9、反相HPLC分离偶联不同个数PEG分子的mPEG_ALD-TRAIL_(114-281)和mPEG_MAL-N109C

利用反相HPLC对mPEG_ALD-TRAIL_(114-281)混合物和mPEG_MAL-N109C混合物进行分离，分离条件为：

柱子：瓦里安Varian PLRP-S；

流动相A：0.1%三氟乙酸，流动相B：100%CH3CN，流速为1mL/min；

梯度条件：前3分钟0～25%B，4～29分钟25%～50%B，30～32分钟50%～95%B，33～34分钟95%～25%B，最终25%B冲柱2分钟。

分离结果见图6。由图6可见，对于mPEG_ALD-TRAIL_(114-281)样品，1为偶联一个mPEG-ALD分子的TRAIL_{（114-281）}单体，2为偶联三个mPEG-ALD分子的TRAIL_{（114-281）}三聚体，3为偶联两个mPEG-ALD分子的TRAIL_{（114-281）}二聚体；对于mPEG_MAL-N109C样品，1为偶联一个mPEG-MAL分子的N109C单体，2为偶联两个mPEG-MAL分子的N109C三聚体，3为偶联两个mPEG-MAL分子的N109C二聚体。

图6结果表明，偶联不同个数PEG分子的mPEG_ALD-TRAIL_(114-281)和mPEG_MAL-N109C可用反相HPLC分离；两种混合物中，mPEG_MAL-N109C三聚体、mPEG_ALD-TRAIL_(114-281)三聚体的含量均最高，且大部分的mPEG_MAL-N109C三聚体、mPEG_ALD-TRAIL_(114-281)三聚体均可被分离出。

10、偶联物的二级结构分析

将TRAIL、mPEG_ALD-TRAIL_(114-281)与mPEG_MAL-N109C分别用PBS（pH7.4）稀释至终浓度为0.5mg/mL，再用Chirascan Plus CD spectrophotometer（Applied Photophysics Co.,Ltd）在远紫外（200～260nm）处对三种样品进行扫描，模拟后得到二级结构图谱。结果如图7所示。

由图7所示，三个样品都有二级结构为β折叠的特征吸收峰。但与mPEG_MAL-N109C相比，mPEG_ALD-TRAIL_(114-281)的吸收峰偏移220nm处更多，且在200～220nm处与TRAIL_(114-281)的吸收峰有更多的差异。表明mPEG_MAL-N109C的二级结构与TRAIL_(114-281)更为接近，mPEG-MAL修饰对N109C突变体的二级结构影响较小，能更好地保留TARIL的活性。

11、体外稳定性检测

将SD大鼠血浆用生理盐水稀释一倍，作为检测TRAIL_(114-281)、mPEG_ALD-TRAIL_(114-281)与mPEG_MAL-N109C稳定性的缓冲液。

具体检测步骤如下：

（1）将TRAIL_(114-281)、mPEG_ALD-TRAIL_(114-281)与mPEG_MAL-N109C分布用上述稀释后的大鼠血浆（50%）稀释至终浓度为10μg/mL；

（2）将稀释后的样品置于37℃水浴孵育，然后在不同的时间点取样（100μL），如：0.25h，0.5h，1h，3h，6h，12h，24h；

（3）不同时间点取出的样品离心去除细胞碎片，然后加入到铺有NCI-H460细胞的96孔板中（细胞数量为1×10⁵个/mL），37℃继续孵育24h；

（4）培养结束后，每孔加入10μL CCK-8显色液，置于培养箱中孵育显色1h；取出以450nm、630nm双波长检测；

（5）结果计算：以实验组中OD值高于同等稀释度的阴性对照的样品为阳性（t检验P<0.01）；结果如图8所示。

图8结果表明，mPEG_MAL-N109C在孵育0.25h后活性保留了90%，之后一直维持在90%活性左右，表明其在37℃条件下稳定性极佳。相反，TRAIL_(114-281)与mPEG_ALD-TRAIL_(114-281)在前12h也能维持在80%左右的活性，而在24h后，活性分别急剧下降至60%和70%，表明在37℃条件下，TRAIL_(114-281)与mPEG_ALD-TRAIL_(114-281)的稳定性均不如mPEG_MAL-N109C好。

12、体外抗肿瘤活性测定

选择非小细胞肺癌NCI-H460细胞对TRAIL_(114-281)、mPEG_MAL-N109C与mPEG_ALD-TRAIL_(114-281)的体外抗肿瘤活性进行测定。

具体测定步骤如下：

（1）NCI-H460细胞消化成为单个细胞后，稀释为1×10⁵个/mL，铺96孔板（每孔100μL），正常条件下继续培养24小时；

（2）将mPEG_ALD-TRAIL_(114-281)与mPEG_MAL-N109C分别用培养基稀释，加入细胞板作为实验组，使终浓度为：16、32、63、125、250、500、1000ng/mL；以标准品TRAIL_(114-281)为阳性对照，以溶解实验品的缓冲液为阴性对照，并用培养基以同样方式稀释；空白对照为不加任何溶液的培养基。实验中对照组和实验组皆做三个复孔；

（3）将对照组和实验组加入细胞板中，37℃继续培养24h，观察实验组和对照组对目的细胞的杀伤能力；

（5）结果计算：以实验组中OD值高于同等稀释度的阴性对照的样品为阳性（t检验P<0.01）。计算结果如图9a所示。

由图9a可见，mPEG_ALD-TRAIL_(114-281)杀伤肿瘤细胞的效果最差，只保留了TRAIL不到5%的活性。而mPEG_MAL-N109C则保留了20%左右的活性。表明利用mPEG-MAL修饰N109C突变体获得的偶联物比用mPEG-ALD直接修饰TRAIL N端获得的偶联物具有更好的体外抗肿瘤活性。

13.诱导肿瘤细胞凋亡活性测定

利用流式细胞仪检测TRAIL_(114-281)、mPEG_ALD-TRAIL_(114-281)与mPEG_MAL-N109C诱导NCI-H460细胞凋亡的活性，具体步骤如下：

（1）将NCI-H460细胞以一定数量接种于6孔板中，当细胞汇合度达到90%左右时，每孔分别加入100ng的TRAIL_(114-281)，mPEG_ALD-TRAIL_(114-281)与mPEG_MAL-N109C，并继续孵育24h；然后将六孔板中细胞培养液吸出至一合适离心管内，PBS洗涤贴壁细胞一次，加入适量胰酶细胞消化液(可含有EDTA)消化细胞；

（2）在消化过的细胞中加入步骤（1）中收集的细胞培养液，稍混匀，转移到离心管内，1000g离心5分钟，弃上清，收集细胞，用PBS轻轻重悬细胞并计数；

（3）取5-10万重悬的细胞，1000g离心5分钟，弃上清，加入195μLAnnexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞；

（4）加入5μL Annexin V-FITC，轻轻混匀；

（5）室温（20-25℃）避光孵育10分钟，可以使用铝箔进行避光；

（6）1000g离心5分钟，弃上清，加入190μL Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞；

（7）加入10μL碘化丙啶染色液，轻轻混匀，冰浴避光放置；

（8）进行流式细胞仪检测：阳性对照为65℃孵育30s的NCI-H460细胞，用于确定凋亡区域；阴性为加入样品，但不加Annexin V-FITC和PI的细胞，用于消除样品带入的背景吸收。

结果如图9b所示，MAL表示mPEG_MAL-N109C，ALD表示mPEG_ALD-TRAIL_(114-281)。结果表明在1μg/mL的浓度下，mPEG_MAL-N109C诱导肿瘤细胞凋亡的活性（66.8%）强于mPEG_ALD-TRAIL_(114-281)（59.4%）。与上述实验12的实验结果一致。

14.半衰期比较

（1）选择SD大鼠（200g左右）（购自浙江省医学科学研究院）作为动物实验模型：分为对照组、TRAIL_(114-281)组，mPEG_ALD-TRAIL_(114-281)组和mPEG_MAL-N109C组，每组四只SD大鼠；

（2）尾静脉注射1mg样品，然后在不同的时间点眼眶取血；血样在37℃孵育半小时后，置于4℃一个小时；1000g离心20min，取上清即为血清样品；

（3）用针对TRAIL的ELISA（酶联免疫吸附试验）方法检测血清中各样品的浓度，绘制药代动力学曲线（图10），并用DAS2.0软件计算相关药代动力学参数（表1）。

图10的药代动力学的曲线表明，mPEG_MAL-N109C在大鼠体内的暴露时间、生物利用度要优于TRAIL_(114-281)和mPEG_ALD-TRAIL_(114-281)。表1的药代动力学参数进一步表明，mPEG_MAL-N109C在AUC（曲线下面积）、CL（清除速率）、t_1/2（半衰期）等方面全面优于TRAIL_(114-281)和mPEG_ALD-TRAIL_(114-281)。

表1三种样品的药代动力学参数

药代动力学参数	AUC(mg/L*min)	t_1/2(min)	CL(mL/min)
				TRAIL（114-281）	1705.54±230.05	26.68±2.08	0.66±0.21
mPEG_ALD-TRAIL_114-281	13524.60±1626.19	42.34±4.37	0.074±0.0060
				mPEG_MAL-N109C	200447.06±9776.18	276.68±85.51	0.0050±0.0019

15.体内抗肿瘤活性比较

（1）将30只Balb/c裸鼠（20g左右）（购自上海斯莱克）随机分为四组，每组6～8只；每只裸鼠右腋皮下注射10⁷个NCI-H460细胞（悬浮于PBS中）；四组分别为对照组（PBS组）、TRAIL_(114-281)组、mPEG_ALD-TRAIL_(114-281)组和mPEG_MAL-N109C组；

（2）肿瘤后隔一天（第三天）开始腹腔注射200μg样品/只，连续给药9天；每天测裸鼠体重（结果见图12a），测量肿瘤块的纵向（L）、横向（W）长度，计算肿瘤大小（结果见图11c），肿瘤大小（V）的计算公式为V=（L*W²）/3；

（3）第七天时每组随机取一只裸鼠，人道处死后分离出肿瘤组织、肝脏、肾脏并立即浸泡在10%中性福尔马林中，用于各样品的急性肝毒性或肾脏毒性的研究，以及对肿瘤组织的原位凋亡检测（TUNEL）；其中，肝脏和肾脏的检测用常规的免疫组化流程进行操作，最后进行H&E染色，封片；肿瘤组织则在最后用TUNEL试剂盒（购自Roche）检测肿瘤细胞凋亡情况；结果见图13；

（4）等到第十六天后，停止检测各项指标；裸鼠在禁食过夜后，摘眼球取血；所获取的血清用大型生化分析仪器进行血清学检测，检测指标为：谷丙转氨酶（ALT），谷草转氨酶（ALT），总胆红素（TBIL）和白蛋白（ALB）（结果见图12b）。然后剥离肿瘤，收集肿瘤块图像（结果见图11a和图11b）。

图11a，11b和11c的结果一致表明mPEG_MAL-N109C抑制肿瘤生长的效果最好。同时，图12b和图13的结果显示TRAIL_(114-281)，mPEG_ALD-TRAIL_(114-281)和mPEG_MAL-N109C均未对小鼠的肝功能和肾脏细胞产生负面影响。图13的结果进一步从细胞水平表明，与TRAIL_(114-281)和mPEG_ALD-TRAIL_(114-281)相比，穿透进肿瘤的mPEG_MAL-N109C更多（诱导了更多的肿瘤细胞细胞凋亡），另外小鼠肝脏和肾脏的组织切片并未有异于对照组的地方，再次表明几种药物均无肝脏或是肾脏毒性。

Claims

1.一种rTRAIL突变体-单甲基化聚乙二醇马来酰亚胺偶联物，其特征在于，由单甲基化聚乙二醇马来酰亚胺偶联rTRAIL突变体三聚体构成，所述rTRAIL突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述单甲基化聚乙二醇马来酰亚胺的分子量为3000～10000Da。

2.如权利要求1所述的rTRAIL突变体-单甲基化聚乙二醇马来酰亚胺偶联物，其特征在于，所述单甲基化聚乙二醇马来酰亚胺的分子量为5000Da。

3.如权利要求1所述的rTRAIL突变体-单甲基化聚乙二醇马来酰亚胺偶联物，其特征在于，每个rTRAIL突变体三聚体偶联2个单甲基化聚乙二醇马来酰亚胺分子。

4.如权利要求1～3任一所述rTRAIL突变体-单甲基化聚乙二醇马来酰亚胺偶联物的制备方法，包括：

（1）将rTRAIL突变体多聚体解聚，重新聚合得到rTRAIL突变体三聚体；

所述rTRAIL突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；

所述单甲基化聚乙二醇马来酰亚胺的分子量为3000～10000Da。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述rTRAIL突变体三聚体的制备方法为：

将rTRAIL突变体溶于含锌离子的缓冲液中，加入磷酸三（β-氯乙基)酯，30～40℃水浴反应1～3h。

6.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述偶联反应的温度为0～4℃，时间为30～60min。

7.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述分离纯化方法为：利用超滤除去反应液中分子量低于10kDa的物质，再经离心去沉淀，将所得上清过滤除菌，即为所述rTRAIL突变体-单甲基化聚乙二醇马来酰亚胺偶联物。

8.如权利要求1～3任一所述rTRAIL突变体-单甲基化聚乙二醇马来酰亚胺偶联物在制备抗肿瘤药物中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述抗肿瘤药物为抗肺癌药物。