CN103724424A - 一种mPEG-SPA-pGLP-2复合物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种mPEG-SPA-pGLP-2复合物及其制备方法和应用，其由猪胰高血糖素样肽-2（porcineglucagon-likepeptide-2,pGLP-2）与单甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺丙酸酯（methoxy-polyethyleneglycol-succinimidyl-propionicacidester,mPEG-SPA）通过加成反应连接构成，所述pGLP-2第30位的Lys与所述mPEG-SPA的末端双键形成共价键而连接；该复合物是通过用弱酸性阳离子交换树脂层析法从修饰混合物中分离得到的单点修饰产物。本发明mPEG-SPA-pGLP-2复合物修饰产物单一，分离纯化简单。

Description

一种mPEG-SPA-pGLP-2复合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于肽或蛋白质的修饰复合物及其制备的技术领域，具体涉及一种单甲氧基聚乙二醇修饰的猪胰高血糖素样肽-2（porcine glucagon-like peptide-2, pGLP-2），即一种单甲氧基聚乙二醇-猪胰高血糖素样肽-2复合物及其制备方法和应用。
背景技术
胰高血糖素样肽-2（glucagon-like peptide-2, GLP-2）是胰高血糖素原基因转录、翻译后处理加工的33个氨基酸的胰高血糖素衍生肽之一，主要由远端回肠和结肠的L细胞分泌。GLP-2通过特异性促进肠上皮增殖、抑制肠上皮凋亡、增加肠道血供、抑制胃酸分泌、降低肠道通透性等多方面促进损伤肠粘膜的结构恢复和屏障功能改善，且作用强于以往发现的其他非特异的肠生长因子，为治疗仔猪肠道损伤和功能紊乱提供了广阔的研究前景。pGLP-2与hGLP-2具有相似的肠道促生长作用，同源性为82%，通过C端延长，含有35个氨基酸。
但是，在猪体内，pGLP-2易被体内广泛存在的二肽酰肽酶-IV（dipeptidyl peptidase-IV, DPP-IV）快速降解掉N端的前两个氨基酸His1-Ala2，体内半衰期为8.4min，严重制约了其推广应用。
聚乙二醇（PEG）是一种亲水、不带电荷的线性大分子，蛋白质经PEG修饰后，分子量增加，肾小球的滤过减少，PEG的屏障作用保护了蛋白质不易被蛋白酶水解，有助于蛋白质类药物半衰期的延长。但蛋白PEG修饰产物的分离纯化均比较困难。原因如下：（1）蛋白经PEG修饰后，许多理化性质发生了改变，如等电点、分子质量、溶解度、沉降系数等；（2）PEG分子在水溶液中具有伸展的构象，其流体动力学体积远远大于同样分子质量的球状蛋白，使得与PEG的分离非常困难；（3）PEG分子的不均一性，存在一定的分子质量分布，因此即使包含相同PEG个数的同一种蛋白质，其相对分子量也不完全相同；（4）蛋白质表面可修饰的氨基酸位点较多时，PEG分子可结合在多个不同的氨基酸残基上，使PEG修饰蛋白的空间结构进一步复杂化。以上为蛋白PEG修饰及产品开发的核心与难点所在。
目前，通过PEG修饰pGLP-2延长其半衰期治疗仔猪肠道疾病的研究未见报道。
发明内容
针对pGLP-2中仅含有一个Lys残基的优势，本发明的第一个目的是提供一种mPEG-SPA-pGLP-2复合物，该复合物得到单点修饰产物，从而避免了修饰位点的多态性，使后续纯化简便。mPEG-SPA-pGLP-2复合物保留了pGLP-2的生物学活性，与pGLP-2相比，半衰期延长，可更方便地应用于肠道疾病的治疗。本发明的第二个目的是提供上述的一种mPEG-SPA-pGLP-2复合物的制备方法。本发明的本发明的第三个目的是提供上述的一种mPEG-SPA-pGLP-2复合物的制药用途。
为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案：
一种mPEG-SPA-pGLP-2复合物，由猪胰高血糖素样肽-2（porcine glucagon-like peptide-2, pGLP-2）与单甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺丙酸酸酯（methoxy-polyethylene glycol-succinimidyl-propionic acid ester, mPEG-SPA）通过加成反应连接构成，所述pGLP-2第30位的Lys与所述mPEG-SPA的末端双键形成共价键而连接。
作为优选，所述的pGLP-2的氨基酸序列为：His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Val-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Thr-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Leu-His-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-Ser-Leu-NH2。
作为优选，所述单甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺丙酸酸酯的分子量为5~20KD。
为了实现上述的第二个目的，本发明采用了以下的技术方案：
一种制备上述任一技术方案所述的mPEG-SPA-pGLP-2复合物的方法，该方法包括以下的步骤：
1）将pGLP-2制备成pH为7.5~9.0的溶液；
2）将步骤1）制备的pGLP-2溶液与mPEG-SPA反应，所述pGLP-2与mPEG-SPA的摩尔浓度比为1：1~1：8，反应温度为4~37℃，反应时间为0.5~24小时；
3）分离纯化，得到mPEG-SPA-pGLP-2复合物。
作为优选，所述的步骤1）将pGLP-2溶解于50 mmol/L pH 7.5~9.0的Tris-HCl缓冲液中，终浓度为1.2 mg/mL。
作为优选，所述的步骤2）中加入1%的TFA终止反应。
作为优选，所述的步骤3）分离纯化采用弱酸性阳离子交换树脂层析法；再优选，所述的弱酸性阳离子交换树脂采用C M Sepharose Fast Flow层析柱。
作为优选，将步骤2）制备的粗品溶液用20 mmol/L pH 4.0的醋酸缓冲液稀释10倍，上C M Sepharose Fast Flow层析柱，用含1 mol/L NaCl的20 mmol/L pH 4.0的醋酸缓冲液进行0% 到100%的梯度洗脱，流速为1 mL/min，在波长为215 nm处收集3个吸收峰中的第2和第3个吸收峰的洗脱溶液；将收集到的洗脱溶液用截留分子量为3~10KD的Millipore Amicon Ultra超滤管浓缩，并除去NaCl，冷冻干燥。
常见的聚乙二醇修饰蛋白质反应时，由于蛋白质中含有多个带有游离氨基的赖氨酸，在聚乙二醇反应中会形成多点修饰产物，例如，GLP-1中含有2个赖氨酸，能提供的游离氨基有2个，会形成双修饰产物和单修饰产物的混合产物，给后续纯化和质量控制带来了难题。本发明的pGLP-2只有一个Lys，通过反应条件的优化，得到单点修饰产物，分离纯化简单。mPEG-SPA-pGLP-2复合物保留了pGLP-2的生物学活性，与pGLP-2相比，半衰期延长，一次注射可显著DSS引起的小鼠结肠炎性改变，使给药一次成为可能，可更方便地应用于肠道疾病的治疗。
附图说明
图1为mPEG-SPA-pGLP-2复合物的C M Sepharose F F层析分离纯化图。其中，1是穿透峰，2为mPEG-SPA的吸收峰，3是单点修饰产物mPEG-SPA-pGLP-2的吸收峰。
图2 mPEG-SPA-pGLP-2复合物与pGLP-2对DPP-IV酶的体外酶解稳定性（n=5）。pGLP-2 (◆)和mPEG-SPA-pGLP-2 (■) 与DPP-IV 在 37°C反应，在预设的时间点用RP-HPLC检测，用t = 0时的峰面积含量作为100%。
图3为小鼠结肠炎性变化的HE染色图。
图4为小鼠结肠炎炎性评分（n=6）。数据采用非参数的Wilcoxon秩和检验，没有相同字母表示差异显著(P < 0.05)。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。以下实施中所用mPEG-SPA、化学试剂等，以及未注明具体条件的实验方法，按常规或按商品供货商所建议的条件进行。
实施例1 mPEG-SPA-pGLP-2复合物的制备
在本实施例中，pGLP-2复合物的结构式为：pGLP-2（1-35），序列如下： His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Val-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Thr-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Leu-His-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-Ser-Leu-NH2。mPEG-SPA的分子量为5KD。
第一步，将1.2mg pGLP-2溶解于1mL 50 mmol/L pH 7.5~9.0的Tris-HCl缓冲液中。
第二步，向第一步所得的溶液中加入6.0mg，分子量为5KD的mPEG-SPA，混合均匀。
第三步，将第二步所得的溶液置于4~30℃下进行mPEG修饰反应0.5~24h。
第四步，将经第三步处理的溶液加入1%的TFA终止反应，得到mPEG-SPA-pGLP-2复合物粗品溶液。
第五步，取第四步制得的粗品溶液用20 mmol/L pH 4.0的醋酸缓冲液稀释10倍，上C M Sepharose Fast Flow层析柱，用含1 mol/L NaCl的20 mmol/L pH 4.0的醋酸缓冲液进行0%到100%的梯度洗脱，流速为1 mL/min，在波长为215 nm处收集3个吸收峰中的第2和第3个吸收峰的洗脱溶液。
说明，参见图1，图中，1是3个吸收峰中的第一个吸收峰，即穿透峰，2和3分别是3个吸收峰中的第2和第3个吸收峰，2是mPEG-SPA，3是单点修饰产物mPEG-SPA-pGLP-2。
第六步，将第五步收集到的洗脱溶液用截留分子量为3KD的Millipore Amicon Ultra超滤管浓缩，并除去NaCl，冷冻干燥。得到0.4mg的分子量为8873Da的mPEG-SPA-pGLP-2复合物纯品。
说明，将第六步制得的mPEG-SPA-pGLP-2复合物纯品用蒸馏水复溶，制备成1mg/mL的溶液。取1μL使用UltrafleXtreme MALDI-TOF-MS仪进行分子量测定，结果示于图1，图1中峰3是单点修饰的mPEG-SPA-pGLP-2。
实施例2 mPEG-SPA-pGLP-2复合物的体外酶解稳定性
第一步，将25 nmol/L 的mPEG-SPA-pGLP-2或pGLP-2溶解在10 mmol/L, pH 7.4的三乙胺-HCl缓冲液。
第二步，向第一步的溶液中加入100 mU/mL的 DPP-IV 酶（美国Sigma-Aldrich公司），37℃孵育，在预设的时间点用10% TFA终止反应，RP-HPLC检测mPEG-SPA-pGLP-2或pGLP-2的剩余量。
说明，RP-HPLC检测条件为：使用美国安捷伦公司1200液相色谱仪，ZORBAX SB-C18柱子(4.6 mm × 250 mm, 5 μm)，自动进样器进样量为20 μL，流速1 mL/min，流动相A为含0.1% TFA的去离子水，流动相B为含0.1% TFA的乙腈，流动相B 38%到50%洗脱15 min，215 nm监测。
说明，结果参见图2，图中，mPEG-SPA-pGLP-2的半衰期为296.3min，pGLP-2的半衰期为18.3min，说明mPEG-SPA-pGLP-2复合物可延长pGLP-2的半衰期。
实施例3 mPEG-SPA-pGLP-2复合物的肠道修复作用
实验材料与方法：
雄性健康BALB/C小鼠（清洁级，浙江省医学科学院动物实验中心提供）；
石蜡切片机（德国Leica公司），荧光显微镜摄像机（日本OLYMPUS公司 BX20型），自动脱水机（英国Thermo shandon公司）；
雄性健康BALB/C小鼠，分为4组。第1组，DSS（分子量36000–50000，购自上海MP公司）对照组；第2组，DSS+pGLP-2组；第3组，DSS+mPEG-SPA-pGLP-2组；第4组，饮水组，所有复合物mPEG-SPA-pGLP-2为实施例1中制备得到的目的产物。本实施例中各组的给药量见表1。
表1  各组的给药量
Figure 618110DEST_PATH_IMAGE001
第1~3组小鼠第1~9天每天饮用3% DSS，第10天饮用蒸馏水，第4组小鼠第1~10天自由饮用蒸馏水，第10天第1、4组腹腔注射300μL 0.9%的NaCl溶液组；第2组腹腔注射300μL 0.9%的NaCl溶液和30μg pGLP-2；第3组腹腔注射300μL 0.9%的NaCl溶液和30μg mPEG-SPA-pGLP-2。第11天，空腹12h后称重，颈椎脱臼法处死小鼠，沿腹中线打开腹腔，取出肠道组织，测量从幽门部至回盲端的小肠总长度及盲肠端至肛门的结肠长度，取结肠组织，放入10%中性甲醛液中，进行常规石蜡切片，HE染色后，显微镜50倍视野下选择确定完整绒毛的肠组织区域并拍照，进行结肠炎性评分。
结果如图3所示，DSS组小鼠结肠的HE染色图，其病变最重，结肠肠壁明显水肿增厚，粘膜层粘膜上皮细胞破坏，杯状细胞明显减少，隐窝大面积破坏，形成溃疡面，粘膜固有层，粘膜下层甚至肌层内大量炎症细胞浸润。DSS+pGLP-2组小鼠结肠的HE染色图，其病变次之，粘膜层粘膜上皮细胞破坏，杯状细胞明显减少，隐窝破坏严重，粘膜固有层，粘膜下层甚至肌层内大量炎症细胞浸润。DSS+mPEG-SPA-pGLP-2组小鼠结肠肠壁轻度水肿，粘膜上皮细胞完整，杯状细胞减少，隐窝少量破坏，固有层内少量炎症细胞浸润。饮水组小鼠结肠的HE染色图，为正常结肠组织结构清楚，未见增厚，粘膜上皮细胞完整，固有层内炎症细胞偶见，杯状细胞未见减少和隐窝未见破坏。如图4柱状图所示数值为6只小鼠的结肠炎性评分的平均值，与饮水组相比，DSS处理显著增加了结肠炎性评分(P < 0.001)，而注射mPEG-SPA-pGLP-2组能够显著（P < 0.001）抑制炎症的发生，基本达到正常结肠水平。注射pGLP-2对DSS引起的炎性病变也产生显著影响（P < 0.001），但抑制炎性的效果与结肠正常结构仍有显著差异。说明一次注射mPEG-SPA-pGLP-2可有效抑制DSS引起的小鼠结肠炎性病变，作用效果明显优于注射pGLP-2。
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。

Claims (10)

1.一种mPEG-SPA-pGLP-2复合物，其特征在于：由猪胰高血糖素样肽-2（pGLP-2）与单甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺丙酸酸酯（mPEG-SPA）通过加成反应连接构成，所述pGLP-2第30位的Lys与所述mPEG-SPA的末端双键形成共价键而连接。
2.根据权利要求1所述的一种mPEG-SPA-pGLP-2复合物，其特征在于：所述pGLP-2的氨基酸序列为：His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Val-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Thr-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Leu-His-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-Ser-Leu-NH2。
3.根据权利要求1或2所述的一种mPEG-SPA-pGLP-2复合物，其特征在于：单甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺丙酸酸酯的分子量为5~20KD。
4.一种制备权利要求1~3任意一项权利要求所述的mPEG-SPA-pGLP-2复合物的方法，其特征在于该方法包括以下的步骤：
1）将pGLP-2制备成pH为7.5-9.0的溶液；
2）将步骤1）制备的pGLP-2溶液与mPEG-SPA反应，所述pGLP-2与mPEG-SPA的摩尔比为1：1~1：8，反应温度为4~37℃，反应时间为0.5~24小时；
3）分离纯化，得到mPEG-SPA-pGLP-2复合物。
5.根据权利要求4所述的mPEG-SPA-pGLP-2复合物的制备方法，其特征在于：步骤1）将pGLP-2溶解于50 mmol/L pH 7.5~9.0的Tris-HCl缓冲液中，终浓度为1.2 mg/mL。
6.根据权利要求4所述的mPEG-SPA-pGLP-2复合物的制备方法，其特征在于：步骤2）中加入1%的TFA终止反应。
7.根据权利要求4所述的mPEG-SPA-pGLP-2复合物的制备方法，其特征在于：步骤3）分离纯化采用弱酸性阳离子交换树脂层析法；优选，所述的弱酸性阳离子交换树脂采用C M Sepharose Fast Flow层析柱。
8.根据权利要求7所述的mPEG-SPA-pGLP-2复合物的制备方法，其特征在于：将步骤2）制备的粗品溶液用20 mmol/L pH 4.0的醋酸缓冲液稀释10倍，上C M Sepharose Fast Flow层析柱，用含1 mol/L NaCl的20 mmol/L pH 4.0的醋酸缓冲液进行0% 到100%的梯度洗脱，流速为1 mL/min，在波长为215 nm处收集3个吸收峰中的第2和第3个吸收峰的洗脱溶液；将收集到的洗脱溶液用截留分子量为3~10KD的Millipore Amicon Ultra超滤管浓缩，并除去NaCl，冷冻干燥，第3个吸收峰即为mPEG-SPA-pGLP-2复合物。
9.权利要求1-3中任意一项所述的mPEG-SPA-pGLP-2复合物用于制备治疗和预防仔猪肠道功能紊乱药物中的应用。
10.权利要求1-3中任意一项所述的mPEG-SPA-pGLP-2复合物用于制备治疗猪肠道疾病药物中的应用。
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