CN105085644A - 一种蝎毒素蛋白包涵体的纯化与复性方法与应用 - Google Patents

一种蝎毒素蛋白包涵体的纯化与复性方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种蝎毒蛋白包涵体的纯化与复性方法，主要是利用重组大肠杆菌表达蝎毒蛋白，且在蝎毒蛋白的C端含有His-tag，然后利用变性缓冲液使蝎毒蛋白中的二硫键打开，用组氨酸亲和层析柱纯化变性的蝎毒蛋白，再利用复性缓冲液对蝎毒蛋白进行复性，所述的复性缓冲液，其组成如下：50～200mmol/L？Na2HPO4，10～100mmol/L？Tris，0.1～1mol/L？L～Arg，1～5mmol/L？EDTA，0.1～5mmol/L？GSH，0.05～0.5mmol/L？GSSG，5～20％(v/v)甘油，0.01～5％(v/v)tritonX～100，pH？7～9。利用本发明制备蝎毒蛋白，具有操作简单、复性效果好的优点。

Description

一种蝎毒素蛋白包涵体的纯化与复性方法与应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种蝎毒素蛋白包涵体的纯化、复性方法与应用。
背景技术
在中国，全竭是传统的中药材，具有极高的药用价值。在《本草纲目》即有记载治疗“诸风掉眩，搐掣，疟疾寒热，耳聋无闻”，在《本草图经》中记载“治小儿惊搐”，在《开宝本草》中记载“疗诸风瘾疹，及中风半身不遂，口眼喎斜，语涩，手足抽掣”等。
随着现代医学发展，人们已经认识到全蝎最主要的药用成分来源于竭子的毒液，特别是其中的蛋白组分，以神经毒素的含量最高。这些神经毒素的作用位点为各种离子通道，包括钾离子通道，钠离子通道，氯离子通道和钙离子通道等。
离子通道是许多生命活动的直接参与者，比如心肌、骨骼肌和平滑肌等肌肉收缩过程，防御T细胞的激活、释放胰岛素的β细胞激活，以及很多神经细胞突触的递质传递等。因此，离子通道与多种疾病息息相关，包括心血管疾病、癫痫、神经病、肿瘤、类风湿性关节炎和糖尿病等。蝎毒素通过选择性作用于离子通道，改变其传导性、动力学特性等发挥生物学功能，在上述疾病的治疗中具有重要的应用价值。
基于以上特性，蝎毒素可以作为研究细胞膜上离子通道的分子探针，有利于深入了解离子通道的调控机制，大力推进对离子通道结构和功能以及相关疾病的研究；同时为生理学、药理学和神经生物学等研究领域提供重要材料。
蝎毒素主要是一类20～98个氨基酸构成的具有生物活性的小分子多肽，具有重要的开发应用价值，但是由于蝎子来源匮乏，天然蝎毒素提取率极低，根本无法满足临床及研究需要。分子生物学和基因工程技术的发展使蝎毒素在其他体系中的重组表达成为可能。大肠杆菌表达系统由于其生长迅速，表达量高，成本低廉，操作简单等优点，成为目前最广泛使用的表达系统。但是由于多数蝎毒素富含二硫键，在大肠杆菌中表达量极低，很难折叠成正确构象，常形成包涵体，导致获得的重组蛋白生物活性大大低于天然蝎毒素。所以许多措施被应用于增加蝎毒素的可溶性表达。例如分泌信号肽的使用，融合表达技术及一些高拷贝表达载体的选择和强启动子的使用等。近年来，SUMO融合技术的发展大大改善了蝎毒素的可溶表达情况，但是由于这种方法收率低以及得到的毒素活性不高等因素，为蝎毒素的进一步研究和新药开发造成了不便。
为提高收率、改善毒素活性，体外氧化复性使毒素结构重折叠是个不错的选择。通常，将包涵体蛋白复性变为活性蛋白需要做如下三步处理：第一，收获并洗涤包涵体；第二，溶解包涵体，得到变性蛋白；第三，复性。经洗涤和溶解得到的变性蛋白是不具备生物活性的，需要复性。复性的原理是通过缓慢去除变性剂使目标蛋白从完全伸展的变性状态恢复到正确折叠的结构，去除还原剂效应，使二硫键正确配对形成正确的空间构象，而产生生物活性。前两步收率相对较高，第三步收率较低。影响复性成功的关键因素较多，包括确定复性初始的蛋白浓度、复性缓冲液、pH、温度、复性时间间隔等。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，提供一种高效分离纯化重组蝎毒蛋白包涵体的方法，以及蝎毒蛋白包涵体的复性方法。
本发明还要解决的技术问题是，提供利用上述方法制备得到的蝎毒蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种蝎毒蛋白的纯化与复性方法，该方法包括如下步骤：
(1)将蝎毒蛋白包涵体投入变性缓冲液，搅拌处理，离心，过滤，收集滤液，得到变性的蝎毒蛋白，所述的搅拌处理，其搅拌转速为50～300rpm，搅拌时间为1～10h。；
所述的变性缓冲液，其组成如下：50～200mmol/LTris，1～10mol/LGdn-HCl，20～100mmol/LDTT，pH7～9，溶剂为水；所述的变性缓冲液的组成优选为：80～120mmol/LTris，4～8mol/LGdn-HCl，40～60mmol/LDTT，pH7.5～8.5；最优选为：100mmol/LTris，6mol/LGdn-HCl，50mmol/LDTT，pH8.0。
其中，Tris为缓冲试剂，维持缓冲液pH值；Gdn-HCl为变性剂，能够通过离子间的相互作用破坏包涵体蛋白间的氢键而增溶蛋白；DTT为还原剂，具有抗氧化作用，能保护蛋白上的还原性基团。
(2)纯化变性的蝎毒蛋白；
(3)用复性缓冲液溶解变性的蝎毒蛋白，复性处理，得到复性的蝎毒蛋白，
所述的复性缓冲液，其组成如下：50～200mmol/LNa2HPO4，10～100mmol/LTris，0.1～1mol/LL-Arg，1～5mmol/LEDTA，0.1～5mmol/LGSH，0.05～0.5mmol/LGSSG，5～20％v/v甘油，0.01～5％v/vtritonX-100，pH7～9，溶剂为水，复性缓冲液的组成优选为：80～120mmol/LNa2HPO4，40～60mmol/LTris，pH7.5～8.5，0.4～0.6mol/LL-Arg，1～3mmol/LEDTA，0.5～1.5mmol/LGSH，0.05～0.2mmol/LGSSG，5～10％v/v甘油，0.1～0.3％v/vtritonX-100；最优选为：100mmol/LNa2HPO4，50mmol/LTris，pH8.5，0.5mol/LL-Arg，2mmol/LEDTA，1mmol/LGSH，0.1mmol/LGSSG，5％v/v甘油，0.2％v/vtritonX-100。
其中，Na2HPO4和Tris为缓冲试剂，维持缓冲液pH值；L-Arg为助溶剂；EDTA为金属离子螯合剂；GSH和GSSG能够提供氧化还原电子对，为二硫键的形成提供条件；tritonX-100是温和去垢剂，能够洗涤去除膜碎片和膜蛋白；甘油为蛋白稳定剂。
步骤(1)中，所述的蝎毒蛋白包涵体，是利用重组大肠杆菌发酵得到。
其中，所述的重组大肠杆菌是将克隆有蝎毒蛋白基因的表达质粒转化大肠杆菌得到的。
其中，所述的大肠杆菌为E.coliBL21(DE3)。
其中，所述的表达质粒为pET29a。
其中，所述的克隆有蝎毒蛋白基因的表达质粒，在蝎毒蛋白基因的5’端或3’端含有His-tag，即表达得到的蝎毒蛋白的C端或N端含有His-tag。
作为优选，所述的克隆有蝎毒蛋白基因的表达质粒，在蝎毒蛋白基因的5’端含有His-tag，即表达得到的蝎毒蛋白的C端含有His-tag。
本发明中所述的His-tag，是指由多个组氨酸组成的标签，优选用6个组氨酸组成的标签。
分别在蝎毒蛋白基因的5’端或3’端增加6个组氨酸组成的标签(His-Tag)，表达得到的蝎毒蛋白分别命名为CHis6-rAGAP、NHis6-rAGAP，所述的CHis6-rAGAP和NHis6-rAGAP对肿瘤细胞生长的抑制活性有明显差别，其中，CHis6-rAGAP对HepG2细胞的抑制率达到90％，而NHis6-rAGAP在体外几乎没有抗肿瘤活性。分子动力学模拟表明，N端His-tag浮于融合蛋白的表面，改变了rAGAP的表面电荷，使得表面静电势发生变化，而C端His-tag对AGAP的三维结构及表面电荷影响不大。
步骤(2)是利用组氨酸亲和层析柱纯化得到变性的蝎毒蛋白。
步骤(3)中，所述的复性处理，是将溶解有变性的蝎毒蛋白的复性缓冲液在4～25℃条件下保温12～72h，优选在15～25℃条件下保温18～48h，最优选在20℃条件下保温24h。
上述的蝎毒蛋白的纯化与复性方法制备得到的蝎毒蛋白也在本发明的保护范围之内。
上述蝎毒蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用也在本发明的保护范围之内。
有益效果：本发明提供了一种高效分离纯化重组蝎毒蛋白包涵体的方法，以及蝎毒蛋白包涵体的复性方法。本发明解决了重组蝎毒素在大肠杆菌表达系统中收率低、蛋白不能正确折叠以及生物学活性低等问题，通过本方法得到的重组蝎毒素比SUMO融合技术表达的蝎毒素在小鼠体内的生物学活性要高。采用本发明方法，以1L细菌培养物计算，最终可以获得可溶性蝎毒素约16mg，要远远高于其他大肠杆菌表达系统获得的蛋白。应用本发明方法制备重组蝎毒素蛋白，提高了产率，节省成本，操作简便，为蝎毒素的进一步研究和新药开发提供了便利。
通过该包涵体复性技术获得的重组蝎毒素AGAP比之前文献中报道的低温诱导可溶表达技术以及SUMO融合表达技术获得的重组AGAP抗肿瘤效果更高，接近天然蝎毒素的活性水平。
附图说明
图1为构建的pET29a-AGAP重组质粒图。
图2为CHis6-rAGAP的表达、纯化以及复性结果分析。A图为CHis6-rAGAP表达的SDS-PAGE图；泳道1：未经IPTG诱导的全菌蛋白，泳道2：37℃下1mmol/L的IPTG诱导4h的全菌蛋白，泳道3：超声上清蛋白，泳道4、5：超声沉淀蛋白，泳道M：蛋白marker；B图为CHis6-rAGAP的纯化及复性的SDS-PAGE图；泳道1：用镍柱吸附层析纯化得到的变性CHis6-rAGAP蛋白(用复性缓冲液稀释了20倍)，泳道2：经过复性、浓缩和离心之后的可溶性CHis6-rAGAP蛋白，泳道M：蛋白marker；C图为RP-HPLC(C4柱)分析复性CHis6-rAGAP蛋白的纯度。
图3为本发明方法获得的CHis6-rAGAP和NHis6-rAGAP与SUMO融合技术表达的rAGAP对HepG2肿瘤细胞生长的抑制作用比较图。
图4为不同剂量的CHis6-rAGAP对HepG2小鼠模型中肿瘤大小的抑制作用以及对小鼠体重的影响。A为从裸鼠中取出的肿瘤拍照；B为给药期间每隔两天测定裸鼠肿瘤体积的变化，以5-FU做阳性对照；C为给药期间每隔两天测定裸鼠体重的变化。统计学差异用t检验进行分析，*表示rAGAP或者5-FU给药组与模型组有明显差异(p<0.05)，**表示rAGAP或者5-FU给药组均与模型组有明显差异(p<0.01)
图5为CHis6-rAGAP(A)和NHis6-rAGAP(B)对DRG神经元细胞中电压敏感的钠电流的抑制作用。
图6为AGAP、CHis6-rAGAP和NHis6-rAGAP的分子模拟。A为分子动力学模拟过程中CHis6-rAGAP和NHis6-rAGAP的Cα原子的RMSD变化(参比模型为初始模型)；B、C为动力学模拟之后CHis6-rAGAP和NHis6-rAGAP的三维结构；D、E为AGAP、CHis6-rAGAP和NHis6-rAGAP的三维静电势表面。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：重组质粒及菌株的构建。
(1)pET29a/CHis6-rAGAP质粒的构建：
委托吉尔生化(上海)有限公司合成AGAP的成熟多肽序列(该多肽序列为本领域的技术人员所公知的)，使用P1，P2引物扩增目的基因。引物中含有NdeI和XhoI限制性内切酶识别位点，将目的基因克隆到pET29a质粒中，获得pET29a/CHis6-rAGAP重组质粒(图1)。将重组质粒转入E.coliDH5α中，经过含有50μg/ml卡那霉素的LB培养基中筛选后进行DNA测序，鉴定目的基因是否正确导入菌株。对含有重组质粒的菌株扩大培养，抽提重组质粒，转入E.coliBL21(DE3)表达菌株。
P1(5’-GGAATTCCATATGGTACGCGATGGTTATATTGC-3’)
P2(5’-CCGCTCGAGACCGCCATTGCATTTTCCTG-3’)
(2)pET43.1/NHis6-rAGAP质粒的构建：
使用P3，P4引物扩增蝎毒素目的基因，引物中含有NdeI和BamHI限制性内切酶识别位点(斜体下划线标出)，P3引物中含有His-tag(黑体标出)，将His-tag引入到AGAP的N端，得到NHis6-AGAP基因。将NHis6-AGAP基因克隆到pET43.1质粒中，获得pET43.1/NHis6-rAGAP重组质粒。将重组质粒转入E.coliDH5α中，经过含有50μg/ml卡那霉素的LB培养基中筛选后进行DNA测序，鉴定目的基因是否正确导入菌株。对含有重组质粒的菌株扩大培养，抽提重组质粒，转入E.coliBL21(DE3)表达菌株。
P3(5’-GGAATTCCATATGCATCATCATCATCATCACGTACGCGATGGTTATATTGC-3’)
P4(5’-CGCGGATCCTTAACCGCCATTGCATTTTCCTG-3’)
实施例2：rAGAP的表达和纯化。
将含有以上重组质粒的E.coliBL21(DE3)菌株分别挑单克隆于50mLLB培养基中(含50mg/mL卡那霉素)37℃、220rpm过夜培养，第二天取25mL过夜培养基至1L新鲜LB培养基中培养至对数增长期。当吸光度OD600达到0.6～0.7时，加入1mmol/LIPTG37℃下诱导目的蛋白表达4h。将菌液离心，用100mL裂解液(100mmol/LNaCl,50mmol/LTris,2mmol/LEDTA,1％v/vtritonX-100,pH8.0)重悬，冰浴下400w超声30min。细胞裂解液12000rpm离心10min。SDS-PAGE发现几乎90％的rAGAP以包涵体的形式表达(图2A)。将不溶物用50mL洗脱液(100mmol/LNaCl,50mmol/LTris,2mmol/LEDTA,2mol/LUrea,pH8.0)重悬，然后再超声5min。离心之后，沉淀用去离子水洗两次，然后用10mL缓冲液(100mmol/LTris,6mol/LGdn-HCl,50mmol/LDTT,pH8.0)重悬，温和搅拌4h，12000rpm离心10min，之后用0.45μm滤膜过滤，去除不溶物，上清用Hi～PrepTM脱盐柱去除DTT，脱盐柱先用缓冲液A(50mmol/LTris,500mmol/LNaCl,8mol/Lurea,pH8.0)平衡。洗脱蛋白再上缓冲液A平衡过的组氨酸亲和层析柱，依次使用40、60、80、100、150、300以及500mmol/L的咪唑洗脱液(洗脱液中50mmol/LTris,500mmol/LNaCl,8mol/Lurea,pH8.0不变)进行梯度洗脱。洗脱的rAGAP再用Hi～PrepTM脱盐柱脱去NaCl和咪唑，脱盐缓冲液为50mmol/LTris,8mol/Lurea,pH8.0。经过变性及纯化，1L培养基可以获得75mg可溶性蝎毒素。
实施例3：rAGAP的复性。
将实施例2中获得变性的rAGAP，用复性缓冲液(100mmol/LNa2HPO4,50mmol/LTris,pH8.5,0.5mol/LL-Arg,2mmol/LEDTA,1mmol/LGSH,0.1mmol/LGSSG,5％v/v甘油,0.2％v/vtriton-100)溶解至蛋白终浓度0.1mg/ml，然后在20℃孵育24h。离心过滤之后，上清液经LabscaleTFF超滤系统浓缩20倍，用1×PBS,pH7.4缓冲液透析36h，中间每隔12h换一次缓冲液。经过复性，1L培养基可以获得16mg可溶性蝎毒素。rAGAP的纯度用反相HPLC分析鉴定，纯度可达95％(图2B,C)。CHis6-rAGAP纯化过程中每一步的收率和纯度见表1。该实施例中关键试剂为L-Arg浓度及GSH～GSSG浓度比例。
NHis6-rAGAP的纯化与复性方法与CHis6-rAGAP相同。
表1CHis6-rAGAP纯化过程中每一步的收率和纯度
#从4升大肠杆菌培养基中纯化出AGAP的重量(细胞总湿重为13.41g)
*AGAP的纯度用QuantityOne(Bio-Rad)软件分析
复性缓冲液中的关键试剂为提供氧化还原电子对的GSH和GSSG试剂，其浓度优化过程如下：
保持GSH浓度为1mmol/L不变，
1)调整pH为9.0和GSSG终浓度为0.05mmol/L，20℃恒温复性24h；
2)调整pH为9.0和GSSG终浓度为0.1mmol/L，20℃恒温复性24h；
3)调整pH为9.0和GSSG终浓度为0.2mmol/L，20℃恒温复性24h；
4)调整pH为9.0和GSSG终浓度为0.3mmol/L，20℃恒温复性24h；
5)调整pH为9.0和GSSG终浓度为0.4mmol/L，20℃恒温复性24h；
6)调整pH为8.5和GSSG终浓度为0.05mmol/L，20℃恒温复性24h；
7)调整pH为8.5和GSSG终浓度为0.1mmol/L，20℃恒温复性24h；
8)调整pH为8.5和GSSG终浓度为0.2mmol/L，20℃恒温复性24h；
9)调整pH为8.5和GSSG终浓度为0.3mmol/L，20℃恒温复性24h；
10)调整pH为8.5和GSSG终浓度为0.4mmol/L，20℃恒温复性24h；
11)调整pH为8.0和GSSG终浓度为0.05mmol/L，20℃恒温复性24h；
12)调整pH为8.0和GSSG终浓度为0.1mmol/L，20℃恒温复性24h；
13)调整pH为8.0和GSSG终浓度为0.2mmol/L，20℃恒温复性24h；
14)调整pH为8.0和GSSG终浓度为0.3mmol/L，20℃恒温复性24h；
15)调整pH为8.0和GSSG终浓度为0.4mmol/L，20℃恒温复性24h；
16)调整pH为7.5和GSSG终浓度为0.05mmol/L，20℃恒温复性24h；
17)调整pH为7.5和GSSG终浓度为0.1mmol/L，20℃恒温复性24h；
18)调整pH为7.5和GSSG终浓度为0.2mmol/L，20℃恒温复性24h；
19)调整pH为7.5和GSSG终浓度为0.3mmol/L，20℃恒温复性24h；
20)调整pH为7.5和GSSG终浓度为0.4mmol/L，20℃恒温复性24h；
21)调整pH为7.0和GSSG终浓度为0.05mmol/L，20℃恒温复性24h；
22)调整pH为7.0和GSSG终浓度为0.1mmol/L，20℃恒温复性24h；
23)调整pH为7.0和GSSG终浓度为0.2mmol/L，20℃恒温复性24h；
24)调整pH为7.0和GSSG终浓度为0.3mmol/L，20℃恒温复性24h；
25)调整pH为7.0和GSSG终浓度为0.4mmol/L，20℃恒温复性24h；
以上pH及GSSG浓度摸索发现，当pH为7.5～8.5，GSSG浓度为0.05～0.2mmol/L时，rAGAP的复性效率较高；其中，pH为8.5，GSSG浓度为0.1mmol/L时，rAGAP的复性效率最高。
实施例4：rAGAP对HepG2细胞生长的抑制作用。
将对数生长期的HepG2转接到96孔板中(每孔2×104个细胞)，培养24h，然后加入无血清培养基再培养12h，用1×PBS,pH7.4缓冲液洗细胞，之后加入不同浓度的rAGAP孵育8h。MTT法测定rAGAP对HepG2细胞生长的抑制作用：每孔加入10μlMTT(5mg/ml)，孵育4h，去除媒介，每孔加入100μlDMSO，室温下震摇15min，在570nm下用酶标仪检测吸光度，计算CHis6-rAGAP、NHis6-rAGAP和SUMO～rAGAP对HepG2细胞的抑制率(图3)。当rAGAP的浓度为4μg/ml时，用本发明方法获得的CHis6-rAGAP对HepG2细胞的抑制率达到90％，而SUMO-rAGAP的抑制率只有20％，NHis6-rAGAP在体外几乎没有抗肿瘤活性。经计算，CHis6-rAGAP对HepG2细胞的IC50为2.5μg/ml，比SUMO～rAGAP高6倍(15μg/ml)。
实施例5：CHis6-rAGAP的体内抗肿瘤活性。
从中国科学院上海实验动物中心购买去除胸腺的CD～1nu/nu小鼠，体重16～18g，雌雄各半。给小鼠皮下注射5×106HepG2细胞造模，待肿瘤体积长到约100mm3时，将小鼠随机分为4组，每组10只，实验组分别注射1mg/kg和2mg/kg的CHis6-rAGAP，阳性对照组注射25mg/kg的5～FU，阴性对照组注射生理盐水，体积均为200μl/2天。每隔2天测定小鼠肿瘤体积及体重的变化，18天之后处死小鼠，取出肿瘤。结果发现，2mg/kg/2d剂量的CHis6～rAGAP对小鼠肿瘤具有明显的抑制作用，剂量为1mg/kg/2d时，抑制效果降低(图4A,B)。为了评估CHis6-rAGAP和5～FU对小鼠生活质量的影响，实验过程中还测定了小鼠体重的变化情况，结果发现，两组不同剂量的CHis6-rAGAP对小鼠的体重几乎无影响，而5～FU组小鼠体重明显下降(图4C)。而且，经过18天给药之后，CHis6-rAGAP给药组小鼠无死亡例出现，而5～FU组有40％的小鼠死亡。
实施例6：CHis6-rAGAP的电生理活性。
CO2处死成年雄性C57小鼠，取腰椎(L4、5和6)DRG神经元，依次用胰蛋白酶Ⅰ和胶原酶Ⅱ在37℃下处理30min。温和吸取细胞到添加10％FBS的DMEM培养基中培养。用Axon700A膜片钳放大器记录膜电流的变化。为了选择性记录TTX-R钠电流，使用外液的组成为35mmol/LNaCl,85mmol/Lcholine～Cl,20mmol/LTEA～Cl,3mmol/LKCl,1mmol/LCaCl2,1mmol/LMgCl2,10mmol/LHEPES,10mmol/LD～glucose，用Tris调节pH为7.4。使用内液组成为140mmol/LCsF,10mmol/LNaCl,10mmol/LHEPES,1mmol/LEGTA，用CsOH调节pH为7.3。将DRG神经元细胞在含有300nmol/LTTX的外液中与500nmol/LCHis6-rAGAP共孵育2min，TTX-R钠电流记录如图5所示，CHis6-rAGAP能够抑制约70％的钠电流。
实施例7：rAGAP三维结构的分子模拟。
以Lqh-alpha-IT的晶体结构(PDBID:2ATB)为模板，使用Modeller软件构建AGAP、CHis6-rAGAP和NHis6-rAGAP的三维结构，然后应用OPLS-AA力场在Desmond中对CHis6-rAGAP和NHis6-rAGAP进行80ns的分子动力学模拟，探讨CHis6-rAGAP活性保留，而NHis6-rAGAP抗肿瘤活性丧失的原因。RMSD分析表明，在80ns的分子动力学模拟过程中，C端His-tag经历了较大的结构重排，与AGAP表面靠近，而N端His-tag的构象变化不大，浮于AGAP的表面(图6，A、B、C)。蛋白表面静电势分析表明，与AGAP相比，C端His-tag对CHis6-rAGAP的表面静电势影响不大，而N端His-tag对蛋白表面静电势影响较明显(图6，D、E)。因此我们推测，NHis6-rAGAP活性的丧失可能跟AGAP表面的电荷分布发生变化密切相关，电荷分布变化导致NHis6-rAGAP表面静电势改变。

Claims (11)

1.一种蝎毒蛋白的纯化与复性方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
(1)将蝎毒蛋白包涵体投入变性缓冲液，搅拌处理，离心，收集沉淀，得到变性的蝎毒蛋白；
所述的变性缓冲液，其组成如下：50～200mmol/LTris，1～10mol/LGdn-HCl，20～100mmol/LDTT，pH7～9，溶剂为水；
(2)纯化变性的蝎毒蛋白；
(3)用复性缓冲液溶解变性的蝎毒蛋白，复性处理，得到复性的蝎毒蛋白，
所述的复性缓冲液，其组成如下：50～200mmol/LNa2HPO4，10～100mmol/LTris，0.1～1mol/LL-Arg，1～5mmol/LEDTA，0.1～5mmol/LGSH，0.05～0.5mmol/LGSSG，5～20％v/v甘油，0.01～5％v/vtritonX～100，pH7～9，溶剂为水。
2.根据权利要求1所述的蝎毒蛋白的纯化与复性方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的蝎毒蛋白包涵体，是利用重组大肠杆菌发酵得到。
3.根据权利要求2所述的蝎毒蛋白的纯化与复性方法，其特征在于，所述的重组大肠杆菌是将克隆有蝎毒蛋白基因的表达质粒转化大肠杆菌得到的。
4.根据权利要求3所述的蝎毒蛋白的纯化与复性方法，其特征在于，所述的大肠杆菌为E.coliBL21(DE3)。
5.根据权利要求3所述的蝎毒蛋白的纯化与复性方法，其特征在于，所述的表达质粒为pET29a。
6.根据权利要求3所述的蝎毒蛋白的纯化与复性方法，其特征在于，所述的克隆有蝎毒蛋白基因的表达质粒，在蝎毒蛋白基因的5’端或3’端含有His-tag。
7.根据权利要求6所述的蝎毒蛋白的纯化与复性方法，其特征在于，所述的克隆有蝎毒蛋白基因的表达质粒，在蝎毒蛋白基因的5’端含有His-tag。
8.根据权利要求1所述的蝎毒蛋白的纯化与复性方法，其特征在于，步骤(2)是利用组氨酸亲和层析柱纯化得到变性的蝎毒蛋白。
9.根据权利要求1所述的蝎毒蛋白的纯化与复性方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的复性处理，是将溶解有变性的蝎毒蛋白的复性缓冲液在4～25℃条件下保温12～72h。
10.权利要求1～9任一项所述的蝎毒蛋白的纯化与复性方法制备得到的蝎毒蛋白。
11.权利要求10所述的蝎毒蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105543234A (zh) * 2016-01-19 2016-05-04 中国科学技术大学先进技术研究院 一种制备拥有类似天然状态生理功能的蜈蚣多肽毒素ssd609的方法
CN112341517A (zh) * 2019-08-09 2021-02-09 无锡傲锐东源生物科技有限公司 一种重组蛋白的复性方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1373219A (zh) * 2002-01-18 2002-10-09 中国科学院上海有机化学研究所 重组东亚马氏钳蝎毒rBmKaIT1的基因工程
CN101591668A (zh) * 2009-07-01 2009-12-02 江苏省中医药研究院 东亚钳蝎蝎毒素agap的生产方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1373219A (zh) * 2002-01-18 2002-10-09 中国科学院上海有机化学研究所 重组东亚马氏钳蝎毒rBmKaIT1的基因工程
CN101591668A (zh) * 2009-07-01 2009-12-02 江苏省中医药研究院 东亚钳蝎蝎毒素agap的生产方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LIU,YF 等: "Expression of an antitumor-analgesic peptide from the venom of Chinese scorpion Buthus martensii karsch in Escherichia coli", 《PROTEIN EXPRESSION & PURIFICATION》 *
M.A.TEKOOK 等: "Gene construction, expression and functional testing of an isotropic peptide from the venom of the black scorpion Hottentotta judaicus", 《TOXICON》 *
刘息芳 等: "重组蝎毒活性多肽AGAP的镇痛作用及钠离子通道机制", 《中国药理学与毒理学杂志》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105543234A (zh) * 2016-01-19 2016-05-04 中国科学技术大学先进技术研究院 一种制备拥有类似天然状态生理功能的蜈蚣多肽毒素ssd609的方法
CN105543234B (zh) * 2016-01-19 2019-02-12 合肥科生景肽生物科技有限公司 一种制备拥有类似天然状态生理功能的蜈蚣多肽毒素ssd609的方法
CN112341517A (zh) * 2019-08-09 2021-02-09 无锡傲锐东源生物科技有限公司 一种重组蛋白的复性方法

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