CN102395379B - 重组人白蛋白-人粒细胞集落刺激因子融合蛋白的新稳定制剂 - Google Patents

Abstract

本文描述了用于治疗、预防和减轻以低于正常白细胞计数为特征的症状和疾病如白细胞减少症和嗜中性白细胞减少症的组合物和方法。所述组合物和方法包括重组人白蛋白-人粒细胞集落刺激因子。也描述了包括重组融合蛋白的药物制剂和制备所述制剂的方法。

Description

重组人白蛋白-人粒细胞集落刺激因子融合蛋白的新稳定制剂

本申请要求2009年1月16日提交的美国临时申请第61/145,440号以及2009年1月16日提交的美国临时专利申请第61/145,436号的权益。美国临时申请第61/145,440号以及美国临时专利申请第61/145,436号的全文通过引用纳入本文。

背景技术

白细胞减少症是指循环白细胞(WBC)的减少，通常定义为WBC计数＜4000/mL。白细胞减少症中涉及的主要细胞是嗜中性粒细胞。但是，淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞或嗜碱性粒细胞数量减少可能对总细胞计数减少也有影响(Merck Manual(默克手册)，第17版)。

嗜中性白细胞减少症的特征为血液嗜中性粒细胞计数的减少，通常引起对细菌和真菌感染易感性的提高。根据嗜中性粒细胞计数和感染的相对风险将嗜中性白细胞减少症分类：轻度(1000-1500/mL)、中度(3级，500-1000/mL)或重度(4级，＜500/mL)。急性和重度嗜中性白细胞减少症由于使患者易患迅速致死感染而是一种危及生命的病症(默克手册，第17版)。

嗜中性白细胞减少症可由骨髓中嗜中性粒细胞生成受损或嗜中性粒细胞加速破坏引起。当嗜中性粒细胞快速使用而其生成严重受损时，急性嗜中性白细胞减少症可能在数天内发作。慢性嗜中性白细胞减少症可能持续数月，并通常由脾脏中嗜中性粒细胞的生成减少或隔离引起。嗜中性白细胞减少症可以根据其是骨髓细胞外源因子的次生结果还是存在于骨髓祖细胞的内源性缺损进行分类(默克手册，第17版)。

嗜中性白细胞减少症及其感染性并发症是细胞毒性化疗和其它肿瘤治疗如放疗、生物治疗和骨髓移植中最为常见和严重的副作用之一。细胞毒性化疗通过找出并破坏快速生长的细胞来发挥作用，由于嗜中性粒细胞前体的高增殖率和血液嗜中性粒细胞的快速代谢回转而引发嗜中性白细胞减少症(默克手册，第17版)。化疗患者中，嗜中性白细胞减少症的最常见症状包括发热、口疮和耳感染。显著嗜中性白细胞减少症的患者常发生化脓性感染，例如败血症、皮肤蜂窝组织炎、肝脓肿、疔疮、肺炎、口腔炎、牙龈炎、围直肠炎、结肠炎、鼻窦炎和中耳炎。化疗可能被迫延迟直至身体能产生更多的嗜中性粒细胞，可能必须采用较低的剂量，导致治疗效果较低。

发明概述

本发明涉及用于治疗、预防或减轻以白细胞计数低于正常为特征的疾病或病症，如白细胞减少症和嗜中性白细胞减少症的组合物及方法。在一些实施方式中，所述组合物和方法包括图9所示的重组人白蛋白-人粒细胞集落刺激因子，或其变体或片段。在一些实施方式中，所述组合物和方法用于治疗、预防或减轻嗜中性白细胞减少症和/或白细胞减少症，例如，可用本发明的组合物治疗因给予药物如为治疗癌症所给化疗药物引起的嗜中性白细胞减少症。

在一些实施方式中，所述组合物是药物制剂，包括图9所示的重组人白蛋白-人粒细胞集落刺激因子，或其变体或片段。在一些实施方式中，所述药物制剂包括至少一种药学上可接受的载体，且pH在约5-8.0之间、约5-7.5之间、约5-7.2之间、约5-7.0之间、约5-6.8之间、约5-6.6之间、约5-6.4之间、约5-6.2之间、约5-6之间、约6-7.5之间、约6-7.2之间、约6-7之间。在其它实施方式中，所述pH为约4、约4.2、约4.4、约4.5、约4.6、约4.8、约5、约5.2、约5.4、约5.5、约5.6、约5.8、约6.0、约6.2、约6.4、约6.5、约6.6、约6.8、约7.0、约7.2、约7.4、约7.5、约7.6、约7.8或约8.0。

在一些实施方式中，所述药物制剂包括重组人白蛋白-人粒细胞集落刺激因子，其浓度为约2.5-240mg/ml、约30-120mg/ml、约60-120mg/ml、约5mg/ml、约10mg/ml、约15mg/ml、约20mg/ml、约25mg/ml、约30mg/ml、约35mg/ml、约40mg/ml、约45mg/ml、约50mg/ml、约55mg/ml、约60mg/ml、约70mg/ml、约80mg/ml、约90mg/ml、约100mg/ml、约120mg/ml、约150mg/ml、约100mg/ml、约150mg/ml、约200mg/ml、约240mg/ml或约250mg/ml。

在一些实施方式中，所述药物组合物包括至少一种药学上可接受的盐。在一些实施方式中，所述组合物中盐的浓度为约5-50mM、约10-40mM、约15-30mM、约20-25mM。在一些实施方式中，所述组合物中盐的浓度为约5mM、约10mM、约15mM、约20mM、约25mM、约30mM、约35mM、约40mM、约45mM和约50mM。

在一些实施方式中，所述药物组合物包括至少一种药学上可接受的缓冲剂。在一些实施方式中，所述组合物中缓冲剂存在的浓度为约5-50mM、约10-50mM、约15-50mM、约5-10mM、约10-20mM、约20-30mM、约15-25mM或约20mM。在一些实施方式中，所述组合物中缓冲剂存在的浓度为约5mM、约10mM、约15mM、约20mM、约25mM、约30mM、约35mM、约40mM、约45mM、约50mM、约55mM或约60mM。在一些实施方式中，所述缓冲剂是磷酸盐、柠檬酸盐、或其组合。在一些实施方式中，所述缓冲剂包括磷酸钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、或其组合。

在一些实施方式中，所述药物组合物包括冻干稳定剂。在一些实施方式中，所述冻干稳定剂是二水海藻糖。在一些实施方式中，所述二水海藻糖的浓度约20-100mM、约40-80mM、约50-70mM、或约60mM。在一些实施方式中，所述稳定剂的浓度为约20mM、约30mM、约40mM、约50mM、约60mM、约70mM、约80mM、约90mM、约100mM、约110mM或约120mM。

在一些实施方式中，所述药物组合物包括膨胀剂。在一些实施方式中，所述膨胀剂是多醇。在一些实施方式中，所述多醇是甘露醇。在进一步的实施方式中，所述药物组合物包括药学上可接受的载体。在一些实施方式中，所述载体是聚山梨酯。

本文所述药物组合物可配制用于以多种形式给药。例如，在一些实施方式中，所述药物组合物制备用于经口、肺、静脉内、肌肉内、皮下、经直肠、眼部、结肠、胃肠外、脑池内、阴道内、腹膜内、眼部、耳部、局部、颊、鼻、或局部给药。组合物还可以配制用于特定剂型。例如，在一些实施方式中，所述药物组合物可以配制成液体、凝胶、气溶胶、油膏、乳膏、冻干制剂、粉末、块、片或胶囊。在其它实施方式中，所述药物组合物配制成控释制剂、速融制剂、延迟释放制剂、缓释制剂、脉冲释放制剂、和混合的立即释放制剂。在一些实施方式中，所述药物组合物以液体提供。在其它实施方式中，所述药物组合物以冻干粉末提供。在其它实施方式中，所述药物组合物以冻干块提供。

本文所述药物组合物可以多种方式储存。在一些实施方式中，所述药物组合物储存在小瓶中，在其它实施方式中，所述药物组合物储存在注射器中。

在一些实施方式中，所述药物组合物包含重组人白蛋白-人粒细胞集落刺激因子，至少一种缓冲剂和/或pH调节剂，和可选地至少一种额外药学上可接受载体，其中重组人白蛋白-人粒细胞集落刺激因子溶液的单体纯度在25℃孵育24小时后减少低于10％。在一些实施方式中，所述缓冲剂与pH调节剂相同。在一些实施方式中，在25℃孵育24小时后所述溶液中的单体纯度减少低于约1％、低于约5％、低于约15％、低于约20％或低于约25％。

在其它实施方式中，所述药物组合物包含重组人白蛋白-人粒细胞集落刺激因子、约20mM磷酸钠、约180mM甘露醇、约60mM二水海藻糖、约0.01％(w/v)聚山梨酯80，pH约为6.0，其中所述重组人白蛋白-人粒细胞集落刺激因子的浓度为约2.5-120mg/ml、或约30-60mg/ml。在一些实施方式中，重组人白蛋白-人粒细胞集落刺激因子的浓度为约5mg/ml、约10mg/ml、约15mg/ml、约20mg/ml、约25mg/ml、约30mg/ml、约35mg/ml、约40mg/ml、约45mg/ml、约50mg/ml、约55mg/ml、约60mg/ml、约70mg/ml、约80mg/ml、约90mg/ml、约100mg/ml、约120mg/ml、约150mg/ml、约100mg/ml、约150mg/ml、约200mg/ml、约240mg/ml或约250mg/ml.

在其它实施方式中，所述药物组合物包含重组人白蛋白-人粒细胞集落刺激因子和PMTT20/6.0，其中重组人白蛋白-人粒细胞集落刺激因子的浓度为约2.5-120mg/ml或约30-60mg/ml。在一些实施方式中，重组人白蛋白-人粒细胞集落刺激因子的浓度为约5mg/ml、约10mg/ml、约15mg/ml、约20mg/ml、约25mg/ml、约30mg/ml、约35mg/ml、约40mg/ml、约45mg/ml、约50mg/ml、约55mg/ml、约60mg/ml、约70mg/ml、约80mg/ml、约90mg/ml、约100mg/ml、约120mg/ml、约150mg/ml、约100mg/ml、约150mg/ml、约200mg/ml、约240mg/ml或约250mg/ml。

上述总体说明和以下的附图简要说明与详细说明都是示范性和说明性的，并旨在为本发明要求保护的范围提供进一步说明。通过本发明的以下详细描述，本发明的其它目的、优势和新特征对于本领域技术人员将是显而易见的。

附图简要说明

图1显示rHSA-G-CSF浓度升高降低了单体纯度。2.5-240mg/ml浓度范围内的rHSA-G-CSF样品在PMTT10/7.2中25℃孵育24小时后，通过体积排阻高效液相色谱(“SE-HPLC”)测定单体纯度。

图2显示pH升高增强了rHSA-G-CSF聚集。15mg/ml或60mg/ml浓度的rHSA-G-CSF在25℃下在pH 6.0、6.8、7.2或8.0的PMTT10中孵育7天后，通过SE-HPLC测定聚集。

图3显示温度升高增强了rHSA-G-CSF聚集。15mg/ml或60mg/ml浓度的rHSA-G-CSF在4℃、25℃或40℃下在PMTT10/7.2中孵育24小时后，通过SE-HPLC测定聚集。

图4显示pH升高增强了rHSA-G-CSF聚集。浓度为48mg/ml的rHSA-G-CSF在25℃下在pH 5.8、6.3、6.4或7.0的PMTT10或pH为6.2的CMMT10中孵育最多3天后，通过SE-HPLC测定聚集。顶部线条是10mMPMTT pH 7.0；顶部数起第二条线是10mM PMTT pH 6.4；顶部数起第三条线是10mm PMTT pH 6.3；最底部较暗的线条是10mM PMTT pH 5.8，最底部较亮的线条是10mM CMTT pH 6.2。

图5显示盐浓度增加降低了rHSA-G-CSF聚集。60mg/ml浓度的rHSA-G-CSF在25℃/60％相对湿度下在PMTT10/7.2和5mM、10mM、20mM或50mM氯化钠浓度中孵育1天后，通过SE-HPLC测定聚集。

图6显示磷酸盐浓度增加降低了rHSA-G-CSF聚集。60mg/ml浓度的rHSA-G-CSF在25℃/60％相对湿度(“RH”)下在PMTT/7.2及15mM、20mM、25mM、30mM、40mM或50mM磷酸盐浓度中孵育1天后，通过SE-HPLC测定聚集。

图7显示浓度高至120mg/ml的rHSA-G-CSF在PMTT20/6.0制剂缓冲液中保持的纯度。浓度范围在2.5-120mg/ml的rHSA-G-CSF样品在PMTT10/7.2(旧缓冲液)或PMTT20/6.0(新缓冲液)中25℃孵育24小时后，通过SE-HPLC测定单体纯度。

图8显示pH和磷酸盐浓度如何影响rHSA-G-CSF聚集。浓度为60mg/ml的rHSA-G-CSF在4℃或25℃/60％相对湿度下在PMTT10/7.2(旧缓冲液)或PMTT20/6.0(新缓冲液)中孵育最多14天后，通过SE-HPLC测定聚集。

图9A-C。图9A显示称为Neugranin^TM(“NEUG”)的rHSA-G-CSF融合多肽的核酸和氨基酸序列；图9B显示人G-CSF的氨基酸序列；图9C显示人血清白蛋白的氨基酸序列。

图10列表显示浓度为48mg/ml的rHSA-G-CSF在不同pH中25℃孵育最多3天后通过SE-HPLC测得的聚集。

图11列表显示rHSA-G-CSF在不同pH、蛋白浓度和温度下通过SE-HPLC测得的聚集。表格顶部(头3条)为15mg/ml rHSA-G-CSF。表格底部(最后3条)为60mg/ml rHSA-G-CSF。

图12列表显示rHSA-G-CSF在不同pH、温度和浓度下孵育后的活性。

图13显示生产NEUG的示范性概况的流程图。

图14A和14B分别显示SEC-HPLC和RP-HPLC比较NEUG-1(“1P”)和NEUG-2(“2P”)的结果。

图15A和15B分别显示NEUG-1(“1P”)和NEUG-2(“2P”)之间由IEC-HPLC得到的电荷异质性可比性和由肽作图得到的身份可比性。

图16显示NEUG-1与NEUG-2在SDS-PAGE凝胶上用考马斯蓝染色的可比纯度。

图17A和17B列表小结了为人体临床应用所制备的3个不同批号NEUG-1和5个不同批号NEUG-2的测试结果。

图18显示批号为2378-R的NEUG-1参比标准品的考马斯染色SDS-PAGE分析(还原)。

图19A和19B显示批号为2378-R的NEUG-1参比标准品的SE-HPLC和RP-HPLC色谱图。

图20小结了对代表性开发批号的NEUG-2最终药物产品进行分析的结果。

图21显示经过氧化氢和TBO或TBP处理的NEUG的反相(“RP”)、离子交换(“IE”)和体积排阻(“SEC”)色谱的色谱图；进行研究以监控NEUG的氧化。NEUG对照＝中灰色；经过氧化氢处理的NEUG＝浅灰色；经TBP处理的NEUG＝黑色

图22列表显示经过氧化氢和TBO或TPB处理NEUG的结果。进行研究以监控NEUG的氧化。

图23显示在化疗前(疗程0)接受NEUG-1的对象从治疗到第14天的嗜中性粒细胞绝对计数(ANC)的中位数。在第4天，图中线条由高到低分别是：300μg/kg NEUG、450μg/kg NEUG、150μg/kg和50μg/kg NEUG。

图24A和24B显示了在化疗疗程前以及化疗24小时后接受NEUG-1的对象的ANC和白细胞(“WBC”)计数。NEUG剂量如下：50μg/kg；150μg/kg；300μg/kg或450μg/kg。3级和4级嗜中性白细胞减少症的嗜中性粒细胞临界值在图24A中显示为虚线；图24A和24B还显示了正常嗜中性粒细胞范围。

图25显示在第1疗程化疗后约24小时接受300μg/kg NEUG、450μg/kgNEUG或6mg聚乙二醇化非格司亭(Neulasta)的对象的嗜中性粒细胞绝对计数(ANC)。

图26为I期研究化疗疗程的示意图。

图27显示了I期研究中人对象内NEUG的药代动力学。在患有乳腺癌没有化疗的对象中，侧链指定剂量NEUG(450μg/kg、300μg/kg或150μg/kg)皮下给药的血清NEUG浓度。方形：450μg/kg疗程0；三角形：300μg/kg疗程0；圆形：150μg/kg疗程0。

图28显示I期对象的嗜中性粒细胞绝对计数(“ANC”)图。对象在研究化疗后的疗程1中接受300μg/kg NEUG(n＝19)，450μg/kg NEUG(n＝20)或6mg聚乙二醇非格司亭(Neulasta)(n＝9)。

图29显示NEUG在化疗疗程1中的药代动力学/药效学(“PK/PD”)(I期研究)。患者在疗程1给药多柔比星/多西他赛后1天接受450μg/kg NEUG。ANC显示为空心菱形；NEUG浓度显示为实心方形。3级和4级嗜中性白细胞减少症的临界值用虚线显示。NEUG的定量下限(“LLOQ”)显示为6ng/ml处的点线。

图30A和30B显示I期B部分治疗的各对象的曲线下面积(AUC)，基于第0-15天获得的ANC数值。图30A为图表；图23A中的数据总结在表30B中。

发明详述

本文公开了用于治疗、预防和减轻以白细胞计数减低为特征的症状和疾病的组合物和方法。本文所述的组合物和方法包括由人血清白蛋白(“HSA”)和人粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”)形成的融合多肽。在本发明的一种实施方式中，所述融合多肽长度为759个氨基酸；融合体中的1-585位氨基酸对应于成熟形式HSA的氨基酸，而融合体的586-759位氨基酸对应于成熟形式人G-CSF的氨基酸。图9A-9C显示了融合蛋白的氨基酸序列。

本文所述的组合物和方法还包括含重组HSA-G-CSF多肽的治疗制剂和药物组合物。在一些实施方式中，这些制剂和组合物设置为施用较低剂量的多肽，而在其它实施方式中，所述制剂设置为施用较高剂量的多肽。

本发明还包括含G-CSF变体或片段的融合蛋白，和含白蛋白或其片段或变体的融合蛋白。本发明还包括编码本发明治疗性白蛋白融合蛋白的多核苷酸、治疗性白蛋白融合蛋白、组合物、药物组合物、制剂和试剂盒。本发明也包括用治疗性白蛋白融合蛋白的编码多核苷酸转化的宿主细胞，和采用这些多核苷酸和/或宿主细胞制备本发明的白蛋白融合蛋白的方法。

在一个实施方式中，本发明所述的白蛋白融合蛋白具有延长的保存期限。

在第二个实施方式中，本发明所述的白蛋白融合蛋白比未融合的G-CSF分子更稳定。

本发明还包括经修饰以包含本发明所述核酸分子的转基因生物，优选修饰成表达本发明的白蛋白融合蛋白。

本发明一般涉及编码白蛋白融合蛋白的多核苷酸；白蛋白融合蛋白；和采用白蛋白融合蛋白或白蛋白融合蛋白的编码多核苷酸治疗、预防或改善疾病或紊乱。如本文所用，“白蛋白融合蛋白”是指通过将至少一分子白蛋白(或其片段或变体)与至少一分子G-CSF(或其片段或变体)融合形成的蛋白质。本发明的白蛋白融合蛋白包含G-CSF的至少一个片段或变体和人血清白蛋白的至少一个片段或变体，两者通过基因融合(即，所述白蛋白融合蛋白通过核酸的翻译产生，该核酸中编码全部或部分G-CSF的多核苷酸与编码全部或部分白蛋白的多核苷酸在读框内连接)彼此结合。G-CSF和白蛋白一旦成为白蛋白融合蛋白的部分，就可各自称作白蛋白融合蛋白的“部分”、“区段”或“组成”(例如，“G-CSF蛋白部分”或“白蛋白蛋白部分”)。在一个高度优选的实施方式中，本发明的白蛋白融合蛋白包含至少一分子的G-CSF或其片段或变体(包括但不限于，G-CSF蛋白质的成熟形式)和至少一分子的白蛋白或其片段或变体(包括但不限于白蛋白的成熟形式)。

在进一步优选的实施方式中，本发明的白蛋白融合蛋白通过宿主细胞加工并分泌到周围的培养基中。在表达用宿主的分泌途径中发生的初生白蛋白融合蛋白的加工可包括但不限于，信号肽切割；二硫键形成；适当折叠；碳水化合物的添加和加工(例如，N-和O-连接糖基化)；特异性蛋白水解切割；和装配成多聚体蛋白。本发明的白蛋白融合蛋白优选为已加工形式的。在一个最优选的实施方式中，所述“白蛋白融合蛋白的已加工形式”是指经过N末端信号肽切割的白蛋白融合蛋白产物，本文中也称为“成熟的白蛋白融合蛋白”。

在一个实施方式中，本发明提供了包含G-CSF和血清白蛋白或由其组成的白蛋白融合蛋白的编码多核苷酸。在进一步实施方式中，本发明提供了包含G-CSF和血清白蛋白，或由其组成的白蛋白融合蛋白。在其它实施方式中，本发明提供了包含G-CSF蛋白的生物活性和/或治疗活性片段和血清白蛋白，或由其组成的白蛋白融合蛋白。在其它实施方式中，本发明提供了包含G-CSF蛋白的生物活性和/或治疗活性变体和血清白蛋白，或由其组成的白蛋白融合蛋白。在优选的实施方式中，所述白蛋白融合蛋白的血清白蛋白组成是血清白蛋白的成熟部分。本发明还包括编码这些白蛋白融合蛋白的多核苷酸。

在进一步的实施方式中，本发明提供的白蛋白融合蛋白包含G-CSF蛋白和血清白蛋白的生物活性和/或治疗活性片段，或由其组成。在进一步的实施方式中，本发明提供的白蛋白融合蛋白包含G-CSF蛋白和血清白蛋白的生物活性和/或治疗活性变体，或由其组成。在优选的实施方式中，所述白蛋白融合蛋白的G-CSF蛋白部分是G-CSF蛋白的成熟部分。在进一步的优选实施方式中，所述白蛋白融合蛋白的G-CSF蛋白部分是G-CSF蛋白的胞外可溶结构域。在替代的实施方式中，所述白蛋白融合蛋白的G-CSF蛋白部分是G-CSF蛋白的活性形式。本发明还包括编码这些白蛋白融合蛋白的多核苷酸。

在进一步的实施方式中，本发明提供的白蛋白融合蛋白包含G-CSF蛋白的生物活性和/或治疗活性片段或变体和血清白蛋白的生物活性和/或治疗活性片段或变体，或由其组成。在优选的实施方式中，本发明提供的白蛋白融合蛋白包含G-CSF蛋白的成熟形式和血清白蛋白的成熟形式，或由其组成。本发明还包括编码这些白蛋白融合蛋白的多核苷酸。

I.定义

本文所述发明使用许多定义，如下文和说明书通篇所述。

如本文所用，“多核苷酸”是具有编码融合蛋白的核苷酸序列的核酸分子，包含在读框内连接的至少一分子白蛋白(或其片段或变体)与至少一分子粒细胞集落刺激因子(G-CSF)(或其片段或变体)、或由其组成。

如本文所用，“白蛋白融合构建物”是指包含在读框内连接的编码至少一分子白蛋白(或其片段或变体)的多核苷酸与编码至少一分子G-CSF(或其片段或变体)的至少一个多核苷酸、或由其组成的核酸分子；以及还包含，例如一种或多种下列元件：(1)功能性自我复制载体(包括但不限于，穿梭载体、表达载体、整合载体和/或复制系统)，(2)转录起始区(例如，启动子区如可调节或可诱导的启动子、组成型启动子)，(3)转录终止区，(4)前导序列，和(5)选择性标记。编码G-CSF和白蛋白的多核苷酸一旦成为白蛋白融合构建物的部分，就可各自称作白蛋白融合构建物的“部分”、“区段”或“组成”。

所述显示“治疗活性”的G-CSF多肽或具有“治疗活性”的G-CSF蛋白是指具有一种或多种已知的G-CSF蛋白相关生物学和/或治疗活性的G-CSF多肽。作为非限制性示例，“G-CSF治疗蛋白”是可用于治疗、预防或改善疾病、症状或紊乱的G-CSF蛋白。作为非限制性示例，“G-CSF治疗蛋白”可以与特定细胞类型(正常(如淋巴细胞)或非正常(如癌细胞))特异性结合并因此可用于将化合物(药物或细胞毒剂)特异性靶向到该细胞类型。

如本文所用，术语“对象”是指动物，优选哺乳动物，更优选人。术语“对象”和“患者”可以互换使用。

术语“药学上可接受的载体”是指给予个体时基本没有长期或永久性不良作用的任何载体。药学上可接受的载体包括稀释剂、填料、盐、分散介质、包衣、乳化剂、润湿剂、甜味剂或风味剂、张力调节剂、吸收延迟剂、防腐剂、抗菌和抗真菌剂、缓冲剂、pH调节剂、抗氧化剂、稳定剂、膨胀剂、冷冻保护剂、聚集抑制剂或任何类型的制剂佐剂。Remington′s Pharmaceutical Sciences(《雷明顿药物科学》，2000，第20版，Lippincott，Williams&Wilkins)中描述了合适的载体，其通过引用纳入本文。这些载体或稀释剂的优选示例包括但不限于，水、氯化钠、甘露醇、无水海藻糖、聚山梨酯如聚山梨酯80、各种调节pH的药学上可接受的缓冲剂(例如，磷酸盐缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂、乙酸盐缓冲剂和硼酸盐缓冲剂)。

术语“药学上可接受的盐”包括与阴离子形成的盐，例如衍生自氢氯酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的盐，以及与阳离子形成的盐，例如衍生自钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的盐。

术语“冻干稳定剂”是指保护冻干材料并降低其化学和/或物理不稳定性的分子。冻干稳定剂的优选示例包括但不限于，蔗糖、海藻糖、谷氨酸单钠、组氨酸、甜菜碱、硫酸镁、甘油、赤藓糖醇、丙三醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇、甘露醇丙二醇、聚乙二醇、普流罗尼及其组合。优选的冻干稳定剂是非还原糖，如二水海藻糖或蔗糖。

术语“膨胀剂”是指给冻干混合物添加质量并对冻干块的物理结构有作用的化合物。示范性膨胀剂包括山梨糖醇、甘氨酸、甘露醇和聚乙二醇。

术语“PMTT20/6.0”是指含有磷酸二氢钠(2.42mg/mL，17.4mM)、磷酸氢二钠(0.35mg/mL，2.5mM)、甘露醇(32.79mg/mL，180mM)、无水海藻糖(22.70mg/mL、60mM)、聚山梨酯80(0.1mg/mL，0.01％)的组合物，组合物的最终pH是6.0。它也称为“新缓冲液”、“新PMTT”或“新制剂缓冲液”，并描述为包括20mM磷酸盐、180mM甘露醇、60mM无水海藻糖、0.01％(w/v)聚山梨酯80，pH 6.0。

术语“PMTT10/7.2”是指含有10mM磷酸盐、190mM甘露醇、60mM二水海藻糖、0.01％(W/V)聚山梨酯80的组合物，所述组合物的最终pH为7.2。它也称为“旧缓冲液”、“旧PMTT”或“旧制剂缓冲液”。

术语“PMTT”是指含有磷酸盐、甘露醇、无水海藻糖和聚山梨酯的组合物。

术语“CPMTT10”是指含有10mM柠檬酸盐、190mM甘露醇、60mM无水海藻糖、0.01％(W/V)聚山梨酯80的组合物，缓冲液的pH为6.2。

II.粒细胞集落刺激因子

粒细胞集落刺激因子(G-CSF)是刺激嗜中性粒细胞生成的造血生长因子。给予G-CSF可快速诱导嗜中性粒细胞性白细胞增多。G-CSF的另一重要体内活性是移动造血祖细胞进入外周血液(Duhrsen等，1988，Molineux等，1999；Roberts等，1994)。该效应不但包括嗜中性粒细胞谱系，还扩展到其它单谱系与多谱系祖细胞和多能造血干细胞(Molineux等，1999)。G-CSF通过激发嗜中性粒细胞来增强作为抗感染的防御机制部分的细胞事件，从而增强其针对经调理金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的吞噬和抗菌活性。G-CSF还引起嗜中性粒细胞与单核细胞的趋化性和嗜中性粒细胞的附着(You等，1989；Wang等，1988)。

目前已批准重组G-CSF产品用于多种临床症状以刺激嗜中性粒细胞的增殖和分化。在临床试验中，非格司亭(重组甲硫氨酰基人G-CSF；NeupogenAmgen，Thousand Oaks，CA)提高了外周嗜中性粒细胞数量，从而缩短了骨髓抑制化疗后的嗜中性白细胞减少症的持续时间。非格司亭通过每日皮下(SC)注射给药。聚乙二醇化非格司亭是一种聚乙二醇偶联的rG-CSF(Neulasta)，用其每疗程一次替代每日一次rG-CSF疗法来降低接受骨髓抑制性抗癌药患者的发热性嗜中性白细胞减少症发病率已被证明是安全有效的(Holmes，O’Shaughnessy等，2002；Green等，2003；NeulastaSmPC 2007)。

III.人血清白蛋白

人血清白蛋白(HSA)是人循环系统中自然产生的最常见血液蛋白，测得为约40克白蛋白/升并在循环中保持逾20天。HSA缺乏酶或免疫功能，在体内分布广泛，且已知是血液中治疗性物质的载体。白蛋白是载体蛋白，在生理浓度下具有最小活性。HSA和重组人白蛋白(rHSA)在人体中都具有同样的长循环半衰期。研究显示，与人白蛋白遗传融合的治疗蛋白能获得白蛋白的循环半衰期特征(Syed等，1997)。例如，在兔中的研究显示，与白蛋白融合的CD4半衰期是未融合CD4的140倍(Yeh等，1992)。

人血清白蛋白负责血清渗透压的显著部分以及作为内源和外源配体载体起作用，其成熟形式是有585个氨基酸的蛋白质(如美国专利第7,592,010号的图1所示)。目前，临床应用的HA通过从人血中提取制得。在EP 330 451和EP 361 991中公开了微生物中重组HSA(rHSA)的生成。

IV.用G-CSF治疗

在基于年龄、医疗记录、疾病特征和化疗方案的骨髓毒性确定的高风险患者中，为预防发热性嗜中性白细胞减少症推荐用粒细胞集落刺激因子(G-CSF)进行初步预防。美国临床肿瘤学会(ASCO)和欧洲癌症研究和治疗组织(EORTC)推荐当发热性嗜中性白细胞减少症风险达约20％时采用G-CSF。美国国家综合性癌症中心网络(NCCN)推荐的G-CSF预防的可选指标为发热性嗜中性白细胞减少症风险是10-20％，G-CSF预防的确定性指标为发热性嗜中性白细胞减少症风险至少是20％(Smith等，2006、Vogel等2005，Timmer-Bonte等2006，NCCN指南)。

推荐用集落刺激因子(CSF)预防以减轻某些化疗方案的毒性。但是，这些治疗的附加成本在美国和特别是欧洲部分地区是重要考虑因素，可能引起预防性G-CSF治疗的应用不足，也可能限制患者进行强剂量化疗方案的资格(Timmer-Bonte等，2006；Adams等，2006，NCCN指南)。

V.多肽和多核苷酸的片段和变体

A.片段

本发明还涉及本发明中G-CSF蛋白、白蛋白和/或白蛋白融合蛋白的片段。本发明还涉及本发明中编码G-CSF蛋白、白蛋白和/或白蛋白融合蛋白片段的多核苷酸。尽管从蛋白的N末端删除一个或多个氨基酸会引起本发明中G-CSF蛋白、白蛋白和/或白蛋白融合蛋白的一种或多种生物学功能的改变或丧失，其它治疗活性和/或功能活性(例如，生物活性、多聚体化的能力、结合配体的能力)仍可以保持。例如，当从N末端去除的残基少于完整多肽的主要残基时，N末端缺失多肽对识别所述多肽完整或成熟形式的抗体的诱导和/或结合能力一般仍被保留。通过本文所述的以及本领域已知的常规方法，可容易确定缺少完整多肽的N末端残基的特定多肽是否保留该免疫活性。缺失大量N末端氨基酸残基的突变蛋白保留某些生物或免疫活性并非不可能。事实上，由少至6个氨基酸残基组成的肽常能引起免疫反应。

因此，对应于本发明白蛋白融合蛋白中G-CSF蛋白部分的G-CSF片段包括全长蛋白和从参比多肽(即，G-CSF蛋白、或由多核苷酸或白蛋白融合构建物编码的白蛋白融合蛋白的G-CSF蛋白部分)氨基酸序列的氨基末端缺失一个或多个残基的多肽。具体地，可以用通式m至q描述N末端缺失，其中q是表示参比多肽(例如，G-CSF蛋白、或本发明的白蛋白融合蛋白的G-CSF蛋白部分)的氨基酸残基总数的整数，m限定为从2到q减6范围内的任何整数。本发明也包括编码这些多肽的多核苷酸。

此外，对应于本发明白蛋白融合蛋白中自蛋白部分的血清白蛋白多肽片段包括全长蛋白和从参比多肽(即，血清白蛋白、或白蛋白融合蛋白的血清白蛋白部分)氨基酸序列的氨基末端缺失一个或多个残基的多肽。在优选的实施方式中，可以用通式m至585描述N末端缺失，其中585是成熟人血清白蛋白的氨基酸残基总数，m限定为2到579范围内的任意整数。本发明也包括编码这些多肽的多核苷酸。在补充实施方式中，可以用通式m至609描述N末端缺失，其中609是表示全长人血清白蛋白的氨基酸残基总数的整数，m限定为2到603范围内的任意整数。本发明也包括编码这些多肽的多核苷酸。

此外，本发明的白蛋白融合蛋白片段包括全长白蛋白融合蛋白和在所述白蛋白融合蛋白的氨基末端有一个或多个残基缺失的多肽。具体地，可以用通式m至q描述N末端缺失，其中q是表示白蛋白融合蛋白氨基酸残基总数的整数，m限定为2到q减6范围内的任意整数。本发明也包括编码这些多肽的多核苷酸。

如上所述，尽管从参比多肽(例如，G-CSF蛋白；血清白蛋白；或本发明的白蛋白融合蛋白)的N末端或C末端删除一个或多个氨基酸会引起该蛋白的一种或多种生物学功能的改变或丧失，但其它功能活性(例如，生物活性、多聚体化的能力、结合配体的能力)和/或治疗活性仍可以保持。例如，当从C末端去除的残基少于完整或成熟多肽的主要残基时，C末端缺失多肽对识别所述多肽完整或成熟形式的抗体的诱导和/或结合能力一般仍被保留。通过本文所述的和/或本领域已知的常规方法，可容易确定缺少参比多肽的N末端残基和/或C末端残基的特定多肽是否保留治疗活性。

本发明还提供了在对应于本发明白蛋白融合蛋白中G-CSF蛋白部分的G-CSF蛋白氨基酸序列的羧基末端有一个或多个残基缺失的多肽。具体地，可以用通式1至n描述C末端缺失，其中n是从6到q减1范围内的任何整数，而其中q是表示参比多肽(例如，G-CSF蛋白、或由多核苷酸或白蛋白融合构建物编码的白蛋白融合蛋白的G-CSF蛋白部分)的氨基酸残基总数的整数。本发明也包括编码这些多肽的多核苷酸。

此外，本发明提供了在对应于本发明白蛋白融合蛋白中白蛋白部分的白蛋白氨基酸序列的羧基末端有一个或多个残基缺失的多肽。具体地，可用通式1至n描述C末端缺失，其中n是从6到584范围内的任意整数，其中584表示成熟人血清白蛋白的氨基酸残基总数减1的整数。本发明也包括编码这些多肽的多核苷酸。具体地，可用通式1至n描述C末端缺失，其中n是从6到608范围内的任意整数，其中608是表示血清白蛋白的氨基酸残基总数减1的整数。本发明也包括编码这些多肽的多核苷酸。

此外，本发明提供了在本发明的白蛋白融合蛋白羧基端缺失一个或一个以上残基的多肽。具体地，可用通式1至n描述C末端缺失，其中n是从6到q减1范围内的任意整数，其中q是表示本发明白蛋白融合蛋白的氨基酸残基总数的整数。本发明也包括编码这些多肽的多核苷酸。

此外，上述的任何N或C末端缺失可以组合产生N和C末端缺失的参比多肽。本发明还提供了在氨基和羧基末端都缺失有一个或一个以上氨基酸的多肽，可通常表示为具有参比多肽(例如，G-CSF蛋白、或本发明白蛋白融合蛋白的G-CSF蛋白部分、或血清白蛋白、或本发明白蛋白融合蛋白的白蛋白部分、或白蛋白融合蛋白、或由本发明的多核苷酸或白蛋白融合构建物编码的白蛋白融合蛋白)的m至n残基，其中n和m为如上所述的整数。本发明也包括编码这些多肽的多核苷酸。

本申请还涉及所含多肽与本文提出的参比G-CSF多肽或参比白蛋白多肽或其片段有至少约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％相同的蛋白质。在优选的实施方式中，本申请涉及的蛋白质所含多肽与上述缺失氨基酸序列N和C末端的参比多肽至少有约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％相同。本发明也包括编码这些多肽的多核苷酸。

本发明优选的多肽片段包含显示G-CSF蛋白或血清白蛋白多肽序列的治疗活性和/或功能活性(例如生物活性)的氨基酸序列，或者由其组成，该氨基酸序列是片段。

其它优选的多肽片段是生物活性片段。生物活性片段是那些展示的活性与本发明多肽的活性相似，但不必需相同的片段。片段的生物活性可包括所需活性的改善或不良活性的减弱。

B.变体

“变体”是指与参比核酸或多肽不同但保留其基本性质的多核苷酸或核酸。通常，变体总体上与参比核酸或多肽密切相似并在很多区段与之相同。

本文所用“变体”是指在序列上分别与G-CSF蛋白、白蛋白和/或白蛋白融合蛋白不同，但仍保留其如本文另述或本领域已知的至少一种功能和/或治疗性质的本发明的白蛋白融合蛋白的G-CSF蛋白部分、本发明的白蛋白融合蛋白的白蛋白部分、或本发明的白蛋白融合蛋白。通常，变体与白蛋白融合蛋白的G-CSF蛋白部分所对应的G-CSF蛋白、白蛋白融合蛋白的白蛋白部分所对应的白蛋白、和/或白蛋白融合蛋白的氨基酸序列在整体上非常相似，并在很多区段相同。本发明也包括编码这些变体的核酸。

本发明还涉及包含，与例如本发明的白蛋白融合蛋白的G-CSF蛋白部分所对应的G-CSF蛋白、本发明的白蛋白融合蛋白的白蛋白部分所对应的白蛋白和/或白蛋白融合蛋白至少约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％相同的氨基酸序列，或由其组成的蛋白质。还提供了这些多肽的片段。本发明进一步包括的多肽是由在严谨杂交条件(例如，在6x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中以约45℃杂交从而过滤结合的DNA，然后在0.2x SSC，0.1％SDS中以约50-65℃清洗一次或多次)、在高度严谨条件(例如，在6x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中以约45℃杂交从而过滤结合的DNA，然后在0.1xSSC，0.2％SDS中以约68℃清洗一次或多次)或者在本领域技术人员已知的其它严谨杂交条件(参见，例如，Ausubel，F.M.等编著，1989，Currentprotocol in Molecular Biology(最新分子生物学实验手册)，Green publishingassociates，Inc.和John Wiley&Sons Inc.，New York，见6.3.1-6.3.6和2.10.3各页)下与本发明白蛋白融合蛋白的编码核酸分子的补体杂交的多核苷酸编码的多肽。本发明也包括编码这些多肽的多核苷酸。

所述多肽的氨基酸序列与查询氨基酸序列至少，例如95％“相同”，意在表示查询氨基酸序列的每100个氨基酸中对象多肽的序列中可包括最多5个氨基酸变化，除此之外对象多肽的氨基酸序列与查询序列相同。换而言之，为得到氨基酸序列与查询氨基酸序列至少95％相同的多肽，对象序列中最多有5％的氨基酸残基可被插入、缺失或用其它氨基酸取代。参比序列的这些变化可以发生在参比氨基酸序列的氨基或羧基末端或这些末端位置之间的任何地方，可以散布于参比序列上各残基间，或者在参比序列内的一个或一个以上相邻基团中。

作为实践问题，可以采用已知的计算机程序来常规确定任何特定多肽是否与例如本发明的白蛋白融合蛋白的氨基酸序列或其片段(例如所述白蛋白融合蛋白的G-CSF蛋白部分或所述白蛋白融合蛋白的白蛋白部分)具有至少约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％相同。确定查询序列(本发明的某序列)与对象序列之间的最佳总体匹配的优选方法可以采用基于Brutlag等(Comp.App.Biosci.6：237-245(1990))的算法的FASTDB计算机程序，该方法也称为整体序列比对。在序列比对中，查询和对象序列或者都是核苷酸序列，或者都是氨基酸序列。整体序列比对的结果表示为相同百分数。FASTDB氨基酸比对中所用的优选参数为：矩阵(Matrix)＝PAM 0，k-元组(k-tuple)＝2，错配罚分(Mismatch Penalty)＝1，连接罚分(Joining Penalty)＝20，随机分组长度(Randomization Group Length)＝0，临界分值(CutoffScore)＝1，窗口尺寸(Window Size)＝序列长度，缺口罚分(Gap Penalty)＝5，缺口尺寸罚分(Gap Size Penalty)＝0.05，窗口尺寸＝取500或对象氨基酸序列长度中较短者。

若对象序列比查询序列短是由于N或C末端缺失而非内部缺失，必须对结果进行人工校正。这是因为FASTDB程序在计算整体相同百分数时并不考虑对象序列的N和C末端截断。对于相对查询序列在N和C末端有截断的对象序列，通过计算查询序列中是对象序列N和C末端而不与相应的对象残基匹配/对齐的残基数占查询序列总碱基数的百分比来校正相同百分数。通过FASTDB序列比对的结果确定残基是否匹配/对齐。然后从上述FASTDB程序采用特定参数计算所得相同百分数中减去该百分值，获得最终的相同百分数得分。该最终相同百分数得分用于本发明目的。为了人工调整相同百分数得分，仅考虑对象序列N和C末端与查询序列不匹配/对齐的残基。即，只查询对象序列N和C末端残基最远端外侧的残基位置。

例如，将90个氨基酸残基的对象序列与100个残基的查询序列比对以确定相同百分数。缺失发生在对象序列的N末端，因此FASTDB比对并不显示N末端最初10个残基的匹配/对齐。这10个未配对残基代表序列的10％(N和C末端未匹配残基数/查询序列的总残基数)，因此从FASTDB程序计算得到的相同百分数得分中减去10％。若其余90个残基为理想匹配，则最终的相同百分数将是90％。在另一个例子中，比较90个残基的对象序列与100个残基的查询序列。这次缺失为内部缺失，因此对象序列的N或C末端没有与查询不匹配/对齐的残基。该情况下，FASTDB计算所得相同百分数不用人工校正。再次，只对在FASTDB比对中显示为对象序列N和C末端外侧，未与查询序列匹配/对齐的残基位置进行人工校正。没有为本发明目的进行其它人工校正。

变体通常和与变体具有相同长度的正常HA或G-CSF蛋白长度具有至少约75％(在其它实施方式中，至少约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％)的序列相同性。通过BLAST(Basic Local Alignment Search Tool(基础本地比对搜索工具))分析，采用为序列相似性搜索调整过的blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx程序所用算法(Karlin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA87：2264-2268(1990)和Altschul，J.Mol.Evol.36：290-300(1993)，通过引用全文纳入)确定核苷酸或氨基酸序列水平的同源性或相同性。

BLAST程序所用方法首先考虑查询序列和数据库序列之间的相似区段，然后评估所有一致匹配的统计学显著性，最后仅总结出那些满足预选的显著性阈值的匹配者。关于序列数据库相似性搜索的基本问题的讨论，参见Altschul等(Nature Genetics 6：119-129(1994))，其全文通过引用纳入本文。直方图、描述、对齐、预期(即，针对数据库序列报告匹配者的统计学显著性)、临界值、矩阵和筛选的搜索参数采用默认设置。Blastp、blastx、tblastn和tblastx采用的默认计分矩阵是BLOSUM62矩阵(Henikoff等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915-10919(1992)，通过引用全文纳入)。对于blastn，计分矩阵用M(即，匹配残基配对的奖励计分)与N(即，错配残基的罚分)的比值设定，其中M和N的默认值分别为5和-4。四项blastn参数可作如下调整：Q-10(缺口产生罚分)；R＝10(缺口延伸罚分)；wink＝1(在沿查询序列的各wink.sup.th位置产生字命中)；以及gapw＝16(设定产生带缺口对齐的窗口宽度)。Blastp的相应参数设定为Q＝9；R＝2；wink＝1和gapw＝32。在GCG包1.0版中可在序列间进行Bestfit比较，采用DNA参数GAP＝50(缺口产生罚分)和LEN＝3(缺口延伸罚分)，蛋白质比较中的相应设定为GAP＝8和LEN＝2。

本发明的多核苷酸变体可含有在编码区、非编码区或两者内的变化。特别优选的多核苷酸变体包含产生沉默取代、添加或缺失的变化，但不改变所编码多肽的性质或活性。优选因遗传密码简并性导致的沉默取代所产生的核苷酸变体。此外，也优选多肽变体中低于50个、低于40个、低于30个、低于20个、低于10个、或5-50个、5-25个、5-10个、1-5个或1-2个氨基酸被以任意组合取代、缺失或添加。可以为多种原因产生多核苷酸变体，例如为优化特定宿主中密码子的表达(将人mRNA中的密码子变成细菌宿主如酵母或大肠杆菌中优选的密码子)。

在一个优选的实施方式中，本发明中编码白蛋白融合蛋白的白蛋白部分的多核苷酸优化以在酵母或哺乳动物细胞中表达。在进一步优选的实施方式中，本发明编码白蛋白融合蛋白的G-CSF蛋白部分的多核苷酸优化以在酵母或哺乳动物细胞中表达。在更进一步优选的实施方式中，本发明中编码白蛋白融合蛋白的多核苷酸优化以在酵母或哺乳动物细胞中表达。

在另一实施方式中，在本文所述严谨杂交条件下，编码白蛋白融合蛋白G-CSF蛋白部分的密码子优化多核苷酸不和编码G-CSF蛋白的野生型多核苷酸杂交。在进一步的实施方式中，在本文所述严谨杂交条件下，编码白蛋白融合蛋白的白蛋白部分的密码子优化多核苷酸不和编码白蛋白的野生型多核苷酸杂交。在另一个实施方式中，在本文所述严谨杂交条件下，编码白蛋白融合蛋白的密码子优化多核苷酸不和编码G-CSF蛋白部分或白蛋白部分的野生型多核苷酸杂交。

在另外的实施方式中，编码白蛋白融合蛋白的G-CSF蛋白部分的多核苷酸不包含该G-CSF蛋白的天然产生序列，或不由其组成。在进一步实施方式中，编码白蛋白融合蛋白的白蛋白部分的多核苷酸不包含该白蛋白的天然产生序列，或不由其组成。在另外的实施方式中，编码白蛋白融合蛋白的多核苷酸不包含G-CSF蛋白部分或白蛋白部分的天然产生序列，或不由其组成。

采用已知的蛋白质工程和重组DNA技术的方法，可以产生变体以改善或改变本发明多肽的特性。例如，可以从本发明多肽的N或C末端删除一个或多个氨基酸而不显著损失生物学功能。

在优选的实施方式中，本发明的变体具有保守取代。“保守取代”是指在组内交换，例如脂族或疏水氨基酸Ala、Val、Leu和Ile的取代；羟基残基Ser和Tar的取代；酸性残基Asp和Glu的取代；酰胺残基Asn和Gln的取代；碱性残基Lys、Arg和His的取代；芳香族残基Phe、Tyr和Trp的取代；以及小尺寸氨基酸Ala、Ser、Thr、Met和Gly的取代。

提供了关于如何制备表型沉默的氨基酸取代的指南，例如，Bowie等，“Deciphering the Message in Protein Sequences：Tolerance to Amino AcidSubstitutions(解码蛋白质序列的信息：对氨基酸取代的容差)”，Science247：1306-1310(1990)，其中作者表明有两种主要策略研究氨基酸序列对变化的容差。

第一种策略通过进化过程中的自然选择探索氨基酸取代的容差。通过比较不同物种间的氨基酸序列鉴别保守氨基酸。这些保守氨基酸可能对于蛋白质功能很重要。相反，其取代为自然选择容忍的氨基酸位置表明这些位置对于蛋白质功能并非关键。因此，容忍氨基酸取代的位置可被改变而仍保持所述蛋白质的生物活性。

第二种策略采用遗传工程在克隆基因的特定位置引入氨基酸变化以鉴别蛋白质功能的关键性区域。例如，可采用定点突变或丙氨酸扫描突变(在分子的各残基处引入单个丙氨酸突变)。参见Cunningham和Wells，Science244：1081-1085(1989)。然后，可测试所得突变分子的生物学活性。

如作者所指出，这两种策略揭示了蛋白质对氨基酸取代的惊人容差。作者进一步指出，在蛋白质的某些氨基酸位置哪些氨基酸变化是可能允许的。例如，大多数被包埋(在蛋白质三级结构中)的氨基酸残基要求非极性侧链，而通常表面侧链的特性极少是保守的。此外，可容忍的保守氨基酸取代涉及脂族或疏水氨基酸Ala、Val、Leu和Ile的取代；羟基残基Ser和Thr的取代；酸性残基Asp和Glu的取代；酰胺残基Asn和Gln的取代；碱性残基Lys、Arg和His的取代；芳香族残基Phe、Tyr和Trp的取代；以及小尺寸氨基酸Ala、Ser、Thr、Met和Gly的取代。除了保守氨基酸取代，本发明的变体包括(i)含一个或一个以上非保守氨基酸残基取代的多肽，其中被取代的氨基酸残基可以由或不由该遗传密码编码，或者(ii)含有一个或一个以上具取代基团的氨基酸残基取代的多肽，或(iii)与另一化合物例如提高多肽稳定性和/或溶解度的化合物(如聚乙二醇)融合或化学偶联的多肽，(iv)包含补充氨基酸，例如IgG Fc融合区肽的多肽。本领域技术人员在本文教导下认为这些多肽变体是在本文范围内的。

例如，包含带电氨基酸被其它带电或中性氨基酸取代的多肽变体可产生特性改善的蛋白质，例如较少聚集。药物制剂的聚集减低活性并因聚集体的免疫原活性提高了清除。参见Pinckard等，Clin.Exp.Immunol.2：331-340(1967)；Robbins等，Diabetes 36：838-845(1987)；Cleland等，Crit.Rev.Therapeutic Drug Carrier Systems 10：307-377(1993)。

在特定的实施方式中，本发明的多肽包含白蛋白融合蛋白氨基酸序列、G-CSF蛋白和/或人血清白蛋白的氨基酸序列的片段或变体，或由其组成，其中所述片段或变体与参比氨基酸序列相比，具有1-5、5-10、5-25、5-50、10-50或50-150个氨基酸残基的添加、取代和/或缺失。在优选的实施方式中，所述氨基酸取代是保守的。本发明也包括编码这些多肽的核酸。

本发明的多肽可以由通过肽键或修饰的肽键，即肽等排物彼此连接的氨基酸组成，并可包含20种基因编码的氨基酸以外的氨基酸。所述多肽可以通过天然过程修饰，例如翻译后加工，或者通过本领域熟知的化学修饰技术修饰。这些修饰在基础文章和更具体的专著以及大量研究文献中已详尽描述。修饰可发生在多肽的任何地方，包括肽主链、氨基酸侧链和氨基或羧基末端。应当了解相同类型的修饰可以在给定多肽的多个位置以相同或不同程度出现。并且，给定多肽也可包含许多类型的修饰。多肽可以是分支的，例如因泛素化造成，它们可以是含有或不含分支的环状。环状、分支和分支环状多肽可以由翻译后的天然过程造成也可通过合成方法产生。修饰包括乙酰化、酰基化、ADP-核糖基化、酰胺化、共价结合黄素、共价结合血红素部分、共价结合核苷酸或核苷酸衍生物、共价结合脂质或脂质衍生物、共价结合磷脂酰肌醇、交联、环化、二硫键形成、去甲基化、形成共价交联、形成半胱氨酸、形成焦谷氨酸、甲酰化、γ-羧化、糖基化、GPI锚体形成、羟基化、碘化、甲基化、十四烷基化、氧化、聚乙二醇化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊二烯化、外消旋化、硒化、硫化、转移RNA介导的蛋白质氨基酸加成如精氨酰化、以及泛素化。(参见，例如PROTEINS--STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES(蛋白质结合和分子性质)，第2版，T.E.Creighton，W.H.Freeman and Company，NewYork(1993)；POST-TRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OFPROTEINS(蛋白质翻译后的共价修饰)，B.C.Johnson编著，AcademicPress，New York，第1-12页(1983)；Seifter等，Meth.Enzymol.182：626-646(1990)；Rattan等，Ann.N.Y.Acad.Sci.663：4862(1992))。

C.功能活性

“具功能活性的多肽”是指能显示与G-CSF蛋白的全长、前蛋白、和/或成熟形式相关的一种或一种以上已知功能活性的多肽。这些功能活性包括但不限于，生物学活性、抗原性[与抗多肽抗体结合(或与多肽竞争结合)的能力]、免疫原性(产生结合本发明特定多肽的抗体的能力)、与本发明的多肽形成多聚体的能力、和与多肽的受体或配体结合的能力。

“具生物学活性的多肽”是指如特定生物学实验所检测，剂量依赖或不依赖性地，显示与本发明的G-CSF蛋白包括其成熟形式相似，但未必相同活性的多肽。

在优选的实施方式中，本发明的白蛋白融合蛋白具有未与白蛋白融合的G-CSF蛋白部分(或其片段或变体)相关的至少一种生物学和/或治疗活性。

可以采用本领域已知试验和本文所述试验或对它们作常规改良以试验其本发明的白蛋白融合蛋白的功能活性(例如，生物学活性)。另外，本领域技术人员可以对白蛋白融合蛋白的G-CSF蛋白部分所对应的G-CSF蛋白片段进行常规试验。此外，本领域技术人员可以采用本领域已知试验和/或下文实施例部分所述试验对白蛋白融合蛋白的白蛋白部分所对应的白蛋白片段进行常规试验分析活性。

例如，在一个实施方式中，试验白蛋白融合蛋白结合或与G-CSF蛋白竞争结合抗G-CSF多肽抗体和/或抗白蛋白抗体的能力，可以采用本领域已知的各种免疫试验，包括但不限于，使用例如放射免疫试验、ELISA(酶联免疫吸附测定)、“夹心”免疫试验、免疫放射试验、凝胶扩散沉淀反应、免疫扩散试验、原位免疫试验(例如，采用胶体金、酶或放射性同位素标记)、Western印迹、沉淀反应、聚集试验(例如凝胶聚集试验、血凝试验)、补体固定试验、免疫荧光试验、蛋白质A试验和免疫电泳试验等技术的竞争性和非竞争性试验系统。在一个实施方式中，通过检测初次抗体上的标记测得抗体的结合。在另一实施方式中，通过检测二次抗体或试剂与初次抗体的结合测得初次抗体。在另一实施方式中，标记所述二次抗体。本领域已知并在本发明范围内有多种方法用于在免疫试验中检测结合。

在一个优选实施方式中，识别了G-CSF蛋白质的结合伴侣(例如，受体或配体)，例如，可以通过本领域熟知的方法如还原和非还原性凝胶层析、蛋白亲和层析及亲和印迹法，分析白蛋白融合蛋白与该结合伴侣的结合，所述融合蛋白包含G-CSF蛋白作为对融合体的G-CSF蛋白部分。一般参见Phizicky等，Microbiol.Rev.59：94-123(1995)。在另一实施方式中，可采用本领域已知技术常规分析白蛋白融合蛋白与融合体G-CSF蛋白部分所对应G-CSF多肽的受体结合的生理关联能力。

在另一实施方式中，评估白蛋白融合蛋白形成多聚体的能力，可以通过本领域熟知的方法，例如还原和非还原性凝胶层析、蛋白亲和层析及亲和印迹分析多聚体与其它组分的结合。通常参见Phizicky等，同上。

可用于分析结合和交叉反应性及确认HSA-G-CSF融合体特性的免疫学测定包括但不限于：使用诸如Western印迹、放射性免疫实验、ELISA(酶联免疫吸附测定)、“夹心”免疫实验、免疫沉淀实验、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散实验、凝集实验、补体结合实验、免疫放射分析、荧光免疫分析、蛋白A免疫实验等技术的竞争性和非竞争性测定系统。这类实验是本领域熟知的常规实验(参见例如，Ausubel等编，1994，CurrentProtocols in Molecular Biology(《新编分子生物学实验》)，第1卷，纽约约翰韦利父子公司(John Wiley&Sons，Inc.，New York)，通过引用全文纳入本文)。

与白蛋白融合蛋白的G-CSF蛋白部分所对应的G-CSF蛋白结合的抗体也可就其对给定蛋白或抗原的结合亲和性加以描述或限定，优选其特异性结合的抗原。优选的结合亲和力包括解离常数或Kd低于5x10^-2M、10^-2M、5x10^-3M、10^-3M、5x10^-4M、10^-4M。更优选的结合亲和力包括解离常数或Kd低于5x10^-5M、10^-5M、5x10^-6M、10^-6M、5x10^-7M、10^-7M，5x10^-8M或10^-8M。更优选的结合亲和力包括解离常数或Kd低于5x10^-9M、10^-9M、5x10^-10M、10^-10M、5x10^-11M、10^-11M、5x10^-12M、10^-12M、5x10^-13M、10^-13M、5x10^-14M、10^-14M、5x10^-15M、或10^-15M。此外，本文所述和本领域已知的试验可以常规应用于检测白蛋白融合蛋白及其片段、变体、衍生物引起所述白蛋白融合蛋白的G-CSF蛋白部分和/或白蛋白部分相关的生物学活性和/或G-CSF活性(体内或体外)的能力。其它方法会是本领域技术人员已知的，并在本发明范围内。

VI.HSA-G-CSF融合蛋白

重组人白蛋白-人粒细胞集落刺激因子(rHSA-G-CSF)是G-CSF类似物。rHSA-G-CSF的例子描述于美国专利第5,665,863号以及美国专利第7,041,478号，两者都通过引用纳入本文。

rHSA-G-CSF的另一例子是美国特华生物药物有限公司(TevaBiopharmaceuticals USA LTD.)开发的Neugranin^TM(“NEUG”)。Neugranin^TM(“NEUG”)是单链连接759个氨基酸的融合多肽，分子量约85kDa。残基1-585对应成熟形式HSA，残基586-759对应成熟形式的人G-CSF。Neugranin^TM融合蛋白如图9所示。

VII：产生融合蛋白

生产rHSA-G-CSF的合成过程的示例见美国专利申请第11/929,828号的描述，其全文通过引用纳入本文。在一些实施方式中，采用遗传工程改造的表达NEUG融合蛋白的酵母(例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))宿主系统生产NEUG。采用本领域熟知的方法(例如通过一系列层析和过滤步骤，例如亲和层析及离子交换层析)从酵母培养的发酵培养基中收集并纯化NEUG。

在一个非限制性的例子中，如下开发NEUG融合构建物。从英国牛津大学F.E.Baralle博士实验室的人cDNA文库中分离出全长白蛋白cDNA。该克隆作为质粒pAT153ALB送往英国诺丁汉的Delta Biotechnology Limited。此外，修饰6氨基酸的HSA前肽(RGVFRR)以促进酵母中的更有效加工(RSLDKR)。

Neugranin生产质粒是基于野生型酿酒酵母中发现的2-μ质粒。基于pSAC35的表达载体(专利EP 286 424 B、US 5,637,504)含有来自酿酒酵母的LEU2基因作为选择标记，该基因补充所述生产宿主中的亮氨酸缺陷。该生产质粒还包含强酵母启动子PRB1，和来自质粒pUC9的可在大肠杆菌中克隆和增殖的序列。此外，所述质粒显示的独特属性在于，它一旦转化到酵母中就会去除在大肠杆菌中增殖所需的pUC9衍生序列。这通过侧接FLP识别靶标和进入酵母后质粒表达酵母FLP重组酶而实现。因此，用于生成NEUG的生物体中没有细菌DNA存在。这通过在产生主细胞库后从酵母中取出2μm质粒并测序得到证实。

如上所述，名为CID1643(pSAC35：HSA.GCSF(T31-P204))的NEUG生产质粒是从基于pSAC35的表达载体衍生得到。通过PCR扩增与人G-CSFT31-P204对应的区段，添加适当的5’和3’限制性位点以允许与HSA开放读框3’末端的无缝融合。

在马里兰州罗克维尔(Rockville，MD)的Human Genome Sciences(HGS)公司用NEUG种子瓶制备cGMP主细胞库(MCB)。NEUG MCB的测试和鉴定在美国宾夕法尼亚州马尔文的Charles River Laboratories(Malvern，PA，USA)和美国得克萨斯州休斯敦的Lark Technologies(Houston，TX，USA)，遵照ICH指南Q5D(Derivation and Characterization of Cell Substrates Used for Productionof Biotechnological/Biologicals Products(用于生产生物技术/生物产品的细胞基质的产生和鉴定))进行。

随后在美国宾夕法尼亚州马尔文的Charles River Laboratories产生并检测从该MCB衍生的cGMP工作细胞库(WCB)。

生产NEUG细胞系库的所有培养基成分都是合成、生物合成或植物来源。在细胞系或细胞库制备过程中没有使用动物来源或人源的成分。

所述细胞库在＜-135℃下保存在预灭菌的1.8mL带内螺口封盖Nunc聚丙烯管内的冻存培养基中。

下文的实验实施例中提供了分离、纯化和制备药用rHSA-G-CSF融合蛋白的非限制性示范方法。

VIII.制备治疗蛋白

天然状态或重组生成的治疗蛋白，例如干扰素和生长激素，通常是保质期短的不稳定分子，特别是当配制成水性溶液时。这些分子在配制用于给药时的不稳定性使许多所述分子必需冻干并在保存期间的所有时间均冷藏，因此致使所述分子难以运输和/或保存。当药物制剂必需在医院环境外保存并分配时，保存问题尤为迫切。包含治疗蛋白的白蛋白融合蛋白已显示比未融合白蛋白的相同治疗蛋白有延长的保存期。保存期一般指溶液或在其它保存制剂中的治疗蛋白的治疗活性稳定而没有治疗活性不当损失的时间段。

即便如此，聚集和化学不稳定性还是含治疗蛋白的白蛋白融合蛋白的开发中的主要障碍。药物制剂的聚集可以是非常有害的，因为它降低了活性并因聚集体的免疫原活性而提高了药物清除(Pinckard等，1967；Robbins等，1987；Cleland等，1993)。

下文给出了说明本文所述方法和组合物不同方面的一些非限制性实施例。

IX.实验实施例

给出以下实施例以阐述本发明。然而应当了解，本发明不限于这些实施例所述的特定条件和细节。本文参考的所有公开可得的文献，包括但不限于美国专利，都通过引用纳入本文。

在实施例1、2和6中，介绍了药用Neugranin^TM(“NEUG”)组合物的3种不同的非限制性制剂。各制剂包含图9所示的NEUG融合多肽。A部分所述的方法和所得组合物统称为“NEUG-0”。B部分所述的方法和所得组合物统称为“NEUG-1”，而E部分所述的方法和所得组合物统称为“NEUG-2”。

NEUG是分子量约85kDa、单链连接的融合多肽，包含对应于HSA成熟形式的1-585位残基和对应于人G-CSF成熟形式586-759位残基。图9显示了NEUG融合蛋白的氨基酸序列。

实施例1：制备治疗用NEUG-0

生产NEUG-0用于毒理学实验。所述制剂包括在10mM柠檬酸盐、75mM氯化钠、100mM蔗糖、0.01％聚山梨酯80中的4.0mg/ml NEUG并缓冲至pH6.5。

安全性/毒理学

在猴中评估NEUG的非临床安全性。100、500、1000μg/kg NEUG的重复接触(每周1次共4周)耐受良好，没有发病和死亡或者体重或食物消耗的改变。没有可认为是不良毒性的总体或微观变化。治疗相关观察限于预期的G-CSF给药药理学(例如，嗜中性粒细胞增多，脾脏重量稍有增加，髓质增生)，不认为是毒性。在猴中的NOAEL为＞1毫克/公斤/周，比下列观察的人体中0.45mg/kg的剂量高约12倍。经治疗动物也显示了ANC和WBC的提高。(数据未显示)。

实施例2：制备治疗用NEUG-1

生产NEUG-1用于人体临床研究。所述制剂在PMMT10/7.2(10mM磷酸钠、200mM甘露醇、60mM无水海藻糖、0.01％(W/V)聚山梨酯-80，pH 7.2的溶液中含15.0mg/ml NEUG。

下表1提供了NEUG-1的组成。

^a各管包括0.16mL的过量以确保1.0mL的可递送体积。

图13的非限制性过程步骤显示了生产NEUG-1的批量药物物质(“BDS”)的一种示范性方法。然后，所述BDS在约-80℃(标称值，保存温度的可接受范围为约-65℃)下保存。

为改善制剂在运输和临床地点存放的稳健性，并提供具有预期的长保存期的稳定产品，开发了NEUG-1的冻干形式。冻干的方法是本领域熟知的，按下列步骤所述进行一种形成极好的冻干块的示范性方法。

步骤1：解冻和稀释批量药物物质

在15-30℃下解冻NEUG批量药物物质的容器。汇集(若需要)所述批量药物物质、混合，通过280nm的吸收测定蛋白质浓度。所述批量药物物质的浓度用于计算稀释缓冲液所需的量。还测定了密度和pH。用制剂缓冲液稀释批量药物物质到所需的终浓度。

步骤2：无菌过滤

通过无菌过滤器将稀释溶液从制剂区转移到无菌接收容器，过滤器已通过完整性测试。过滤通道由两个串联的0.2μm PVDF过滤器组成。所有过滤器此前未使用过并已通过完整性测试，在生产后即丢弃。

步骤3：装填和部分塞住

将Neugranin装入去热原的3mL USP I型玻璃小瓶中，部分塞住，并放到无底的冻干托盘上。在装填操作中进行重量检查以核实装填体积。

步骤4：冻干

通过室压力和架温控制冻干循环。通过遍布于冻干室的产品热电偶监控产品温度。部分塞住的小瓶装载在预冷的搁架上并以受控速率冷冻。进行退火步骤以促进甘露醇(膨胀剂)结晶。然后进行初始干燥并通过热电偶监控核实。进行二次干燥以达到所需的含水量。在二次干燥结束时，通过向冻干室排入0.2μm无菌过滤的氮气释放冻干室内的真空。

步骤5：密封和封盖

在部分真空(约11-12psi)下将塞子安置在小瓶中。卸下产品托盘，将小瓶封盖。

已证实初始的冻干临床材料(NEUG-1)非常稳定，现有保存期为2年(当2-8℃下保存时)，保存期可能由于连续稳定性研究数据的检查而得以进一步延长。

实施例3：NEUG-1参比标准品，批号2378-R的总体性质

已开发了多种方法检查NEUG的生理化学和生物学特征。名为参比标准品批号2378-R的NEUG批号含21.3mg/mL NEUG，配制在10mM磷酸钠、200mM甘露醇、60mM无水海藻糖和0.01％(w/v)聚山梨酯80中，pH为7.2(PMTT10/7.2)。对参比标准品批号进行生理化学鉴定，以下表2提供了测试属性、分析方法和结果小结。

NEUG-1批号2378-R的考马斯蓝染色SDS-PAGE分析得到单一条带(图19)。图19A和19B中还分别显示了NEUG-1批号2378-R的代表性SEC-HPLC和RP-HPLC色谱图。

实施例4：测试NEUG-0和NEUG-1制剂

1.蛋白浓度对rHSA-G-CSF单体纯度的影响

将2.5-240mg/ml浓度范围内的重组人白蛋白-人粒细胞集落刺激因子(rHSA-G-CSF)在PMTT10/7.2(10mM磷酸盐、190mM甘露醇、60mM二水海藻糖、0.01％(W/V)聚山梨酯80，pH 7.2)中以25℃孵育24小时。孵育后，通过SE-HPLC测定单体纯度。

结果(图1)显示，聚集随rHSA-G-CSF浓度的升高而增加。

2.pH对rHSA-G-CSF聚集的影响

浓度为15mg/ml和60mg/ml的重组人白蛋白-人粒细胞集落刺激因子在PMTT10(10mM磷酸盐、190mM甘露醇、60mM二水海藻糖、0.01％(W/V)聚山梨酯80)中25℃孵育7天，pH为6.0、6.8、7.2和8.0。孵育后，通过SE-HPLC测定rHA-G-CSF单体纯度。

结果(图2)表明，聚集随pH的升高而增加，且随蛋白质浓度的升高而加快。

3.温度对rHSA-G-CSF聚集的影响

浓度为60mg/ml的重组人白蛋白-人粒细胞集落刺激因子在PMTT10/7.2缓冲液中在4℃、25℃或40℃孵育24小时。孵育后，通过SE-HPLC测定rHSA-G-CSF单体纯度。

结果(图3)表明，聚集随温度的升高而加速。

4.pH对rHSA-G-CSF聚集的影响

浓度为48mg/ml的重组人白蛋白-人粒细胞集落刺激因子在25℃下孵育最多3天，缓冲液为pH 5.8、6.3、6.4或7.0的PMTT10(10mM磷酸盐、190mM甘露醇、60mM二水海藻糖、0.01％(W/V)聚山梨酯80)、或者是缓冲为pH 6.2的CMTT10(10mM柠檬酸盐、190mM甘露醇、60mM二水海藻糖、0.01％(W/V)聚山梨酯80)。在孵育后0、1、2和3天，通过SE-HPLC测定重组人白蛋白-人粒细胞集落刺激因子单体纯度。

结果(图4和图10)表明，大多数聚集发生在孵育的第一天，聚集速率因pH升高而提高。

5.pH对rHSA-G-CSF聚集的影响

浓度为15mg/ml或60mg/ml的重组人白蛋白-人粒细胞集落刺激因子在4℃、25℃或40℃下在pH 6.0、6.8、7.2或8.0的PMTT10中孵育最多10天。在孵育0、1、7和10天后，通过SE-HPLC测定单体纯度。

结果(图11)表明，聚集随pH的升高而增加，且随温度和蛋白质浓度的升高而加快。

6.pH对rHSA-G-CSF生物活性的影响

浓度为15mg/ml或60mg/ml的重组人白蛋白-人粒细胞集落刺激因子在4℃、25℃或40℃下在pH 6.0、6.8、7.2或8.0的PMTT10中孵育最多10天。在孵育0和7或10天后，通过生物试验测定生物活性。

简要地，NFS-60细胞对G-CSF和NEUG都有增殖响应。本试验中，在96孔的微孔板中接入10,000细胞/孔，在37℃下用NEUG蛋白处理20小时。孵育20小时后，NFS-60细胞用0.5μCi/孔的[³H]-胸苷脉冲4小时，然后通过[³H]-胸苷掺入测定DNA合成水平。为了统计分析，采用四参数逻辑模型拟合所测得[³H]-胸苷掺入作为NEUG浓度的函数，并测定EC50值(pg/mL)。以相对效力(RP％)值报道测试蛋白的结果，该数值通过比较相同试验中参比标准品EC50值与所分析测试样品EC50值而得到[RP％＝(EC50参比/EC50样品)*100]。

结果(图12)表明，在低pH中孵育时rHSA-G-CSF的活性保留地更好。

7.盐浓度对rHSA-G-CSF聚集的影响

通过改变溶液中的氯化钠量来控制rHA-G-CSF的60mg/ml溶液的离子强度。制剂缓冲液为PMTT10/7.2。样品在25℃/60％相对湿度下孵育1天，氯化钠浓度为5mM、10mM、20mM或50mM，随后通过SE-HPLC测试。

结果显示盐浓度增加降低了rHSA-G-CSF聚集(图5)。

8.磷酸盐浓度对rHSA-G-CSF聚集的影响

通过改变溶液中的磷酸盐量来控制rHA-60mg/ml G-CSF溶液的离子强度。制剂缓冲液为PMTT pH 7.2。样品在25℃/60％相对湿度下孵育1天，磷酸盐浓度为15mM、20mM、25mM、30mM、40mM或50mM，随后通过SE-HPLC测试。

结果显示磷酸盐浓度增加降低了rHSA-G-CSF聚集(图6)。

实施例5：制备治疗用NEUG-2

生产NEUG-2用于以较高浓度使用和给药的临床研究。所述制剂在PMMT20/6.0(20mM磷酸钠、180mM甘露醇、60mM海藻糖、0.01％(W/V)聚山梨酯-80)中含50.0mg/ml NEUG。

基本上，遵循NEUG-1所示的相同发酵和纯化过程(参见例如，图13)。

NEUG-2制备为液体和冻干形式。制备了冻干形式以改善制剂在运输和临床地点存放的稳健性，并提供具有预期长保存期的稳定产品。NEUG-2采用与NEUG-1所述相同的冷冻-干燥循环进行冻干。所述NEUG-2制剂也产生成型良好、药学极佳的块。

实施例6：比较NEUG-0、NEUG-1和NEUG-2制剂

表3显示了NEUG-0、标准批号NEUG-1(参比标准品2378-R)和3个不同批号NEUG-2的生理化学可比性。表中，“CP”表示澄清、浅黄色。“ND”表示未确定。

随着从NEUG-0到NEUG-2的生产过程开发，过程相关的杂质(例如，酵母宿主蛋白)和产品相关变体(SEC、RP和IEC-HPLC)不断降低。

表4和5提供NEUG-0、NEUG-1和NEUG-2的制剂历史和制剂比较的小结。

实施例7：测试NEUG-1和NEUG-2

1.pH和磷酸盐浓度对rHSA-G-CSF单体纯度的影响

图7中的结果显示了SE-HPLC测得的NEUG分别在PMTT10/7.2和PMTT20/6.0(20mM磷酸盐、180mM甘露醇、60mM二水海藻糖、0.01％(W/V)聚山梨酯80，pH 6.0)中的单体纯度。样品含2.5-120mg/ml范围的不同蛋白质浓度，分析纯度前在25℃下孵育24小时。

结果显示，根据SE-HPLC检测，rHA-G-CSF在PMTT20/6.0制剂缓冲液中在最高达120mg/ml的浓度下均未观察到显著的纯度降低，而在PMTT10/7.2中有10％聚集增加。

2.pH和磷酸盐浓度对rHSA-G-CSF聚集的影响

图8的结果显示了SE-HPLC测得的聚集，60mg/ml rHA-G-CSF在PMTT20/6.0或PMTT10/7.2中在4℃或25℃/60％相对湿度下孵育最长14天。

结果显示在PMTT20/6.0制剂缓冲液中孵育的样品在25℃14天后未见显著的聚集，而相同条件下在PMTT10/7.2制剂缓冲液中孵育的样品显示聚集提高了6％。

3.NEUG-1相对NEUG-2的HPLC比较

图14A和14B显示了NEUG-1和NEUG-2的SEC-HPLC分析和RP-HPLC分析。

4.NEUG-1和NEUG-2电荷可比性、肽作图和纯度

通过IEC-HPLC比较了NEUG-1(图中称为“1P”)和NEUG-2(图中称为“2P”)的电荷异质性。结果见图15A所示。如图15B所示，还通过肽作图比较了两种肽的身份(NEUG-1，“1P”和NEUG-2，“2P”)。

如图16所示，还通过SDS-PAGE和考马斯蓝染色比较了NEUG-1和NEUG-2的纯度。下表6显示了各泳道的样品。

5.冷冻-解冻

用15、60、120mg/ml的NEUG-2(在PMTT20/6.0中)缓冲溶液评估了冷冻-解冻的影响。样品被冷冻和解冻0-10次，然后通过视觉检查和SEC、RP、IEC进行分析。

结果表明，对于旧(PMTT10/7.2)和新(PMTT20/6.0)制剂缓冲液，Neugranin似乎都对冷冻-解冻引起的降解不敏感(数据未显示)。

6.短期稳定性

在旧缓冲液(PMTT10/7.2)和新缓冲液(PMTT20/6.0)中的NEUG(60mg/ml)样品在4和25℃/60％湿度下保存1个月，然后通过视觉检查、SEC、RP、IEC和生物试验进行分析。通过SE-HPLC评估单体纯度。

在第14天，旧缓冲液中的NEUG显示聚集增加6％，而在新缓冲液中的NEUG未见变化。1个月时，视觉、RP、IEC和生物试验没有显著改变。

7.振荡

用旧制剂缓冲液(PMTT10/7.2)新制剂缓冲液(MPTT20/6.0)中的NEUG在3种条件(15、60、120mg/ml)，pH 6.0下评估了振荡引起聚集的影响。各样品在25℃下以120rpm水平振荡0-30分钟。进行视觉检查和SE-HPLC。

SE-HPLC、RP-HPLC、IE-HPLC的结果显示单体没有显著损失。(数据未显示)。此外，视觉检查的结果表明振荡未引起外观的变化。这提示在旧和新制剂缓冲液中Neugranin可能对振荡引起的聚集都不敏感。

8.氧化

离子交换高效液相色谱(“IEC”)和反相高效液相色谱(“RPLC”)可用来监测Neugranin的氧化。过氧化氢研究的实验条件如下。使8mg/mL Neugranin接触0.03％过氧化氢和TBO。在25℃下孵育0、1、3、5、8、20和24小时后，用体积排阻色谱法(“SEC”)、反相(“RP”)和IEC分析样品。采用RPLC、IEC评估过氧化氢和TPB引起的氧化。图21和22显示了色谱图和表格形式的数据。

HSA显示在过氧化氢存在下氧化。鉴定出的氧化位点包括Cys-34、Met-123、Met-298、Met-446和Met-548。

色谱图(图21)显示了室温下对照(灰色)、接触过氧化氢(浅灰色)、和接触TPB(黑色)1小时后的NEUG覆盖图。RP和IEC显示H₂O₂处理的样品在主峰后3分钟洗脱的峰出现显著增加；RP显示TPB处理的样品在主峰后3分钟有洗脱峰，该峰稍有增加，在IEC中比主峰晚2、3分钟洗脱。

总之，结果提示，RP和IEC能检测不同的氧化形式，H₂O₂和TBP都能引起NEUG在甲硫氨酸和半胱氨酸残基处氧化。NEUG的氧化在应激条件下发生，但没有迹象表明它是NEUG在储存中的主要降解途径，且其活性没有显著改变。

实施例8：药用NEUG的示范性特征鉴定

用NEUG-1工艺生产了3个批号的cGMP药物物质，并用NEUG-2工艺生产了5个批号。NEUG-2制剂所得蛋白质的品质通常与NEUG-0和NEUG-1相当或者更好。表17A-B中提供了所有cGMP批号的测试结果。NEUG-1批号为060615001、060628001和060707001。NEUG-2批号为071008005、071025001、071026004、071106001和07116001。如下进行批号测试。

1.视觉检查外观

采用正向辐照荧光灯对黑色和白色背景进行视觉检查来评估Neugranin^TM(“NEUG”)的外观。

2.pH

pH计用pH 4.0、7.0和10.0的缓冲液标准化。标准化以后，测定并记录NEUG样品的pH。

3.由凝固点测定渗透压

通过凝固点下降测定渗透压。测量前用290mOsm/kg的标定标准品标准化。

4.通过280nm的吸收测定浓度

通过测量280nm下的吸收确定NEUG的浓度。采用经验确定的消光系数0.54mg^-1*mL*AU计算蛋白质浓度。

5.通过ELISA鉴定身份

采用标准的夹心ELISA形式用本领域熟知的方法进行身份鉴定试验。所述试验是基于抗体对G-CSF和NEUG分子的白蛋白部分的特异性。该抗体对能一起区分NEUG与G-CSF、HSA或其它白蛋白连接蛋白质。

6.通过考马斯蓝染色SDS-PAGE分析纯度

采用考马斯蓝染色的SDS-PAGE评估NEUG在变性条件下的纯度。在分析前，用有或没有还原剂的样品缓冲液稀释样品。每块凝胶上还加载了分子质量标记和NEUG参比标准品。电泳后，凝胶用考马斯蓝染色并用密度分析确定纯度。该方法主要用于检测产品相关杂质如二聚体。

7.通过银染SDS-PAGE分析纯度

采用过量加样的银染SDS-PAGE评估NEUG在变性条件下的纯度。在分析前，用有或没有还原剂的样品缓冲液稀释样品。样品最多加载10微克/泳道。每块凝胶上还加载了分子质量标记和NEUG参比标准品。电泳后，凝胶用银染。用迁移距离和条带模式间的比较来确定NEUG样品和参比标准品之间的可比性。该方法用于检测低水平的产物和工艺相关杂质。

8.体积排阻HPLC分析纯度

采用体积排阻HPLC评估NEUG在天然条件下的纯度。采用TosoHaasG3000SWXL柱(7.8mm x 30cm)用由磷酸盐和硫酸盐组成的等度流动相分析样品。通过计算280nm时主峰下的面积和全部峰面积的比例确定NEUG的纯度。该试验检测产物相关的筛分杂质，包括二聚体和聚集体。

9.反相HPLC分析纯度

采用反相HPLC检测NEUG的纯度。采用安捷伦(Agilent)Zorbax反相柱(StableBond C8、5μm、250x4.6mm)以乙腈浓度升高的梯度洗脱分析样品。通过计算215nm检测波长下主峰面积和全部相关峰面积的比例确定NEUG的纯度。

在RP-HPLC试验中主峰前的峰的质量与在G-CSF的Thr-133处含二己糖修饰的Neugranin变体一致。该修饰不影响效力，且在迄今生产的所有开发、毒理学和cGMP批次中恒定存在。Thr-133是已知的G-CSF修饰位点。

10.生物试验(NFS-60细胞增殖)分析效力

NEUG效力试验是基于细胞的增殖试验，以NSF-60细胞的增殖诱导为基础。NFS-60细胞对G-CSF和NEUG都有增殖响应。本试验中，在96孔的微孔板中接入10,000细胞/孔，在37℃下用NEUG蛋白处理20小时。孵育20小时后，NFS-60细胞用0.5μCi/孔的[³H]-胸苷脉冲4小时，然后通过[³H]-胸苷掺入测定DNA合成水平。为了统计分析，采用四参数逻辑模型拟合所测得[³H]-胸苷掺入作为NEUG浓度的函数，并测定EC50值(pg/mL)。以相对效力(RP％)值报道测试蛋白的结果，该数值通过比较相同试验中参比标准品EC50值和所分析测试样品EC50值而得到[RP％＝(EC50参比/EC50样品)*100]。

11.通过阈值方法分析残余DNA

测量样品中残余DNA的方法是基于市售的试剂盒(分子装置公司(Molecular Devices)总DNA阈值(Total DNA Threshold).DNA定量分析试剂盒)。样品先进行稀释、蛋白消化，提取DNA。然后采用阈值试剂盒定量分析DNA的浓度。该试剂盒进行免疫标记、固定化和电化学测量，相对于牛胸腺DNA标准曲线测得DNA浓度。所得结果通过可接受范围内的DNA标准品加标回收率得以内部定性。

12.动态比浊法分析内毒素

采用标准的自动化动态比浊法分析系统测定NEUG溶液中的内毒素浓度。所述动态比浊法系统是对凝胶-结块方法的改进，测量凝胶-结块形成前的浊度增加。向标准品和测试品中添加鲎变形细胞裂解物(LAL)并在37℃孵育。在孵育过程中，用分光光度法监测反应混合物的浊度。浊度与内毒素浓度成比例。将测试品中浊度形成的速率与已知标准浓度的标准曲线中浊度形成的速率相比较。

13.膜过滤分析生物负载

膜过滤方法与美国药典(USP<61>)中评估样品中活生物体存在数的微生物限制测试相似。在膜过滤法中，测试溶液中的生物体被捕捉到膜过滤器上，该过滤器随后被接种到合适的生长培养基上。在测试前，将样品体积为10mL的测试品用90mL无菌磷酸缓冲盐水(PBS)稀释。过滤全部100mL的稀释测试品。过滤步骤后，滤膜转移到异养平板计数(HPC)琼脂上，在30-35℃孵育2-3天。HPC琼脂与USP<61>中引用的大豆-酪蛋白消化物琼脂(SCD，也称为TSA)不同。HPC琼脂和TSA一样，设计成恢复广泛范围的好氧、异养细菌。但是，HPC琼脂还设计成最大化恢复应激生物。

14.钨研究

已知某些注射器品牌含有钨作为赋形剂。在多种形式钨(无水钨酸钠、多钨酸钠、钨酸铵和氧化钨WO3与WO2)的存在下检测液体NEUG样品，所述钨在2-8℃和25℃下以不同浓度(500ppb、1000ppb和2500ppb)存在最长达3个月。用SE-HPLC、RP-HPLC和生物试验分析样品。在3个月的稳定性研究后未发现钨对NEUG样品有显著影响。

15.鉴定试验

下列分析也用于鉴定信息。

N末端序列

采用PE Applied Biosystems Procise 494 cLC蛋白质测序仪鉴定NeugraninN末端的氨基酸序列。该法整合了埃得曼降解(Edman degradation)化学并利用气相印迹循环、在线PTH氨基酸HPLC分析仪和SequencePro数据分析软件。

IE-HPLC分析电荷异质性

用IEC-HPLC测量NEUG中存在的电荷异质性的相对丰度。用DionexPro-Pac Wax 10-离子交换柱(250x4.6mm)和由Bis-Tris与NaCl组成的流动相分析样品。本方法证明样品独立可变性，在目前的开发阶段用作定性试验而非定量试验。

肽作图

采用肽作图确定NEUG的结构完整性。进行肽作图，采用Lys-C用于消化和反相HPLC，梯度洗脱用于分离肽。所述蛋白样品先被还原和变性，然后烷基化。进行缓冲液交换，接着Lys-C消化1小时，然后过夜。通过反相HPLC分离消化所得Lys-C肽混合物，使用YMC Pack ODS-A C18柱(4.6mm x 250mm)用安捷伦1100HPLC系统给出肽分布概况。用二极管阵列UV检测器和带电喷雾电离的Finigan LCQ DUO-离子阱质谱监测HPLC洗脱。用Xcalibur软件2.3版处理质谱数据。该方法的质量精确度低于20ppm。通过LC-MS确定各HPLC峰的身份。

电喷雾电离质谱

用Applied Biosystems公司装有PicoView纳米电喷雾源的QStar ESI-四极飞行时间(QTOF)Pulsar-i质谱仪进行质量分析。用Hamiliton注射器和Harvard注射泵将样品引入QStar。电喷雾离子源在2500V下运行，气幕值为25。仪器用肌红蛋白校准。通过质量分析仪在整个规定分析时间内每秒钟进行全质量范围(500-3000m/z)扫描记录下荷质比。用Analyst软件1.4版分析所得的总离子电流。该仪器的质量精确度低于10ppm。

残余酿酒酵母(酵母)宿主细胞蛋白

采用ELISA测定块料中存在的酵母宿主细胞蛋白(yHCP)含量，该ELISA基于定制抗体，从用来表达NEUG的酵母宿主相同的空菌株中得到宿主细胞蛋白，用该蛋白进行免疫产生所述定制抗体。

埃尔曼试验(Ellman’s Assay)分析游离巯基

用埃尔曼试剂，5，5’-二硫代-双-(2-苯甲酸)(DTNB)测定NEUG样品中的游离巯基含量。DTNB与游离的巯基反应生成混合的二硫化物和2-硝基-5-巯基苯甲酸(TNB)。TNB在412nm强烈吸收，可通过与N-乙酰半胱氨酸(NAC)标准曲线比较而容易定量分析该反应。为提高所述方法的精确性，反应在部分变性条件下进行。这使得DTNB能与天然条件下可能不完全暴露的游离巯基接触。

16.稳定性

批量药物物质(“BDS”)在-80℃(标称值，可接受的温度为≤-65℃)保存和运输。通过在-80℃和加速储存条件下保存产品来研究BDS的稳定性。首先进行参比标准品(NEUG-1，批号2378-R)的稳定性分析以提供GMP BDS的前导稳定性和对参比标准品本身稳定性的理解。通常对各工艺(NEUG-1、NEUG-2)的至少一个开发和一个cGMP批号进行稳定性分析，各研究具体采用符合ICH指南的研究特定方案。采用标准加速条件来定义试验的适用性和可能的降解途径，并帮助预测失效。通过外观、pH、蛋白质浓度、渗透压、SEC-HPLC、RP-HPLC、SDS-PAGE和生物试验监控稳定性。

下表7-9总结了NEUG 1参比标准品批号2378的代表性稳定性结果。

CPF＝澄清，浅黄色，基本无外源微粒物质

在推荐保存条件下36个月、在-20℃下18个月或在2-8℃下12个月，未见任何参数的显著变化。

对NEUG-2显示了1个月的数据。在推荐的保存条件、-20℃或2-8℃下，未注意到任何显著变化。表10。

下表10.1和10.2显示了两个批号液体形式NEUG-2在2-8℃下的稳定性数据。

如上文所述，从NEUG-1工艺到NEUG-2工艺，对制剂做了改变。作这些改变以确保在更高NEUG浓度下的产品品质，不包括任何新的赋形剂。主要变化是离子强度的提高(从10到20mM)和pH降低(从7.2到6.0)。BDS制剂从NEUG-1到NEUG-2工艺的改善降低浓度依赖性聚集。因此预期NEUG-2制剂将显示与已经稳健的NEUG-1相比改善的稳定性。

此外，在3个月的稳定性研究后，在推荐保存条件、2-8℃下钨对NEUG-2冻干形式或液体形式没有显著影响(通过SE-HPLC、RP-HPLC和效力分析，数据未显示)。

实施例9：示范性药物产品的说明和组成：NEUG-2

1.剂型说明

在一个实施方式中，在单次使用的1型玻璃小瓶中以无菌冻干制剂提供Neugranin^TM(“NEUG”)，小瓶用带涂层橡胶塞和翻开式封口密封。NEUG可在2-8℃下保存。用1.0ml注射用无菌水(WFI)复溶后，各小瓶含pH 6.0的20mM磷酸钠、180mM甘露醇、60mM二水海藻糖、0.01％(w/v)聚山梨酯80中的50mg/mL(可递送50mg/小瓶)NEUG。复溶后的小瓶可室温放置，应在8小时内使用。

2.定量组成

下表11提供了一个示范性NEUG药物产品(NEUG-2)的定量组成。应当注意，液体形式的NEUG-2具有与冻干形式相同的定量组成。所述液体形式可以在预装的注射器中提供(见下文第9部分)。

^a各瓶中装入0.11ml过量以确保1.0ml的可递送体积。

3.复溶缓冲液

无菌注射用水(WFI)可用于冻干形式NEUG的复溶。

4.赋形剂

该示范性NEUG制剂的组成为2.77mg/mL磷酸钠、33.79mg/mL甘露醇、22.7mg/mL二水海藻糖和0.1mg/mL聚山梨酯80，pH 6.0(见上文表5)。磷酸钠为缓冲剂，甘露醇用作膨胀剂以提供良好的块结构并调节张力，海藻糖用作冷冻保护剂，聚山梨酯80用来降低聚集和吸附的可能。在50mg/mL NEUG-2的活性药物成分(“API”)浓度下，蛋白本身作为有力的缓冲剂发挥作用。制剂所用多药典级赋形剂符合多药典(MC)的要求。二水海藻糖是例外，因为目前没有药典规定；但是它符合非药典规格的严格规定。海藻糖被美国FDA列为GRAS，并用于配制大量胃肠外药物(例如，贝伐珠单抗(Avastin)和曲妥珠单抗(Herceptin))。

5.制剂开发

毒理学研究所用初始制剂设计为支持在-20℃下以冷冻液体保存(NEUG-0)。为改善制剂在运输和临床地点存放的稳健性，并提供具有预期长保存期的稳定产品，迄今的所有临床用材料均采用冻干形式。初始临床用材料(NEUG-1)被证明是相当稳定的，现有保存期为2年，可能得以进一步延长。随后的制剂开发表明，更高离子强度和更低pH进一步稳定更高浓度(＞25mg/mL)的API。为此，一种制剂(NEUG-2)具有较低pH(6.0相对7.2)和较高磷酸盐浓度(20相对10mM)。受迫降解研究表明，该制剂保护液体状态下的所述药物免于剧烈振荡、重复冻融和浓度引起的聚集。NEUG-2制剂采用NEUG-1所述的相同冷冻干燥循环，两者都产生了成型良好的块。

6.生产工艺开发

在一些实施方式中，通过用制剂缓冲液将批量药物物质稀释到所需浓度(50mg/mL)、装填然后冷冻干燥所述产品，产生NEUG最终药物产品。

为支持毒理学和临床材料之间的可比性，对两种工艺(NEUG-1和NEUG-2)的1个批号最终药物产品(“FDP”)进行了生理化学鉴定。

生理化学可比性研究的结果见下表12，该结果表明NEUG-2产品的品质和NEUG-1产品相比，至少一样良好，如果不是更好的话。冷冻-干燥过程没有任何不良产品影响。

初始临床研究所用NEUG(NEUG-1)与目前配制的NEUG(NEUG-2)在生理化学上相当。生产工艺和剂型所作改变对临床效率和安全性没有影响(数据未显示)。

7.批次分析

图20概括了对NEUG-2最终药物产品的代表性开发批次进行分析的结果。表中，“ND”表示对开发批次“未完成”所述测试。

8.最终药物产品的稳定性

对NEUG-2的1个批号最终药物产品启动了稳定性研究。在1个月的时间点，任何样品都未观察到显著变化。(数据未显示)。稳定性条件如下：NEUG-2开发批次在PMTT10/6.0中的50.0mg/ml NEUG；3ml玻璃小瓶中的1.2ml液体；2-8℃、25℃/60％相对湿度或者40℃/75％相对湿度保存。

9.预装在注射器中NEUG-2液体的研究

为评估在预装注射器中提供NEUG-2(PMTT，pH 6.0)液体作为市售产品的可行性，进行了下列研究。

已知一些注射器(例如出自Becton Dickinson公司)含有两种主要赋形剂钨和硅胶，它们可能与产品和/或缓冲剂相互作用。为评估注射器赋形剂和产品之间的相互作用，进行了几项研究，包括硅油迁移研究、硅胶掺入和钨掺入研究，以及预装注射器的长期稳定性研究。液体状态CG10639(NEUG-2)稳定性评估所用方法包括视觉检查、SE-HPLC、RP-HPLC、IE-HPLC、生物试验等。

结果总结为，在用5种形式钨(无水钨酸钠、多钨酸钠、钨酸铵、WO3和WO2)以不同剂量(500、1000和2500ppb)掺入并在2-8℃或25℃保存超过3个月的样品中未见显著变化。通过SE-HPLC、RP-HPLC和生物试验分析样品(数据未显示)。

在硅胶相容性研究中，当样品在涂有两种不同剂量(0.4mg或0.8mg)硅胶的注射器中在2-8℃保存4周、或样品中掺入两种不同剂量硅胶并在2-8℃保存3个月时，未观察到硅胶对产品品质的影响(数据未显示)。硅油在制剂缓冲液和药物产品溶液中的分布都相容，并基本保持均衡(数据未显示)。在保存2个月后预装注射器的滑动力没有改变(数据未显示)。此外，CG10639似乎对搅拌和针头剪切不敏感(数据未显示)。

至少长达9个月的长期稳定性研究表明，预装在注射器内的液体NEUG-2在2-8℃稳定，在4℃至少稳定18个月，并且与和产品接触的材料相容。预装注射器中的NEUG-2液体的长期稳定性数据见下表13所示。

CPF＝澄清，浅黄色，基本无外源微粒物质

基于这些研究，钨或硅胶与含PMTT制剂(20mM磷酸盐、180mM甘露醇、60mM二水海藻糖、0.01％(W/V)聚山梨酯80，pH 6.0)的NEUG产品之间没有显著的相互作用。

NEUG在人患者中的临床评估

在题为“I期”和“II期”的两个主要部分中提供下列实施例。每期包括两个部分，A部分和B部分。下表14总结了I期和II期的实施例。应当注意，I期中测试NEUG-1，II期中测试NEUG-2。

每期分成5个部分：1)研究目的，2)患者特征，3)研究药剂，4)研究特点，以及5)A和B部分的结果。

实施例10：I期

1.研究目的

进行I期A/B、II期A/B的研究以评估接受骨髓抑制化疗(多柔比星/多西他赛)的对象中，皮下给予Neugranin^TM(“NEUG”)(重组人白蛋白-人粒细胞集落刺激因子)的安全性、耐受性、免疫原性、药代动力学和药效学

I期的主要研究目的是，通过测定治疗中出现的不良事件的频率、严重程度和持续时间，并将它们与NEUG给药的时间和剂量关联，从而评估与聚乙二醇化非格司亭相比，在可能的治疗剂量范围内皮下给予NEUG的安全性情况。

次要研究目的是评估NEUG的药代动力学和免疫原性，并在接受多柔比星/多西他赛的患者中，比较NEUG和聚乙二醇化非格司亭给药对嗜中性白细胞减少症的发病率、严重程度和持续时间的影响。

如上表2所述，I期按两个部分A部分和B部分进行。

2.患者特征

对于I期，根据下列特征或参数筛选患者：

包括：

1.有组织学确认的乳腺癌，已安排接受多柔比星和多西他赛的患者。

2.年龄为18岁或18岁以上。

3.血液功能合格。

4.ANC＞1500/mm³

5.血小板＞100,000/mm³

6.肝、肾功能合格：

7.血清肌酸酐＜2.0x正常的上限

8.当地实验室测得总胆红素在正常限度内(WNL)

9.血清转氨酶(SGOT/SGPT)＜1.5x正常的上限

10.碱性磷酸酶＜2.5x正常的上限

11.ECOG性能状况0或1。

12.基于左心室射血分数(LVEF)在正常限度内，可以接受多柔比星。

13.能理解本研究的要求，提供已签署的知情同意书(包括同意使用并公开研究相关健康信息)并遵守研究方案步骤。

排除：

1.曾有多于1次的前期化疗方案(包括12个月内的辅助治疗)；进入研究前4周内有任何化疗/免疫治疗；喜树碱累积剂量将妨碍本研究中两个完全剂量的多柔比星疗程。

2.在研究化疗的6周内曾使用任何亚硝基脲(BCNU、CCNU)或丝裂霉素-C。

3.研究者的观点中，心脏记录、迹象或症状妨碍使用基于喜树碱的化疗方案。

4.在化疗研究前2周内曾有手术或放射治疗。

5.骨盆或大于20％的骨髓携带面积曾受宽场辐射、或有骨髓病变。

6.曾与造血干细胞移植进行高剂量化疗。

7.在研究化疗前4周内曾使用骨髓(G-CSF或GM-CSF)生长因子。

8.在研究化疗前4周内曾使用红细胞生成素。

9.有骨髓恶性肿瘤或脊髓发育不良历史。

10.已知脑部转移，除非经充分治疗(手术或化疗)，在至少3周的观察中没有发展的迹象且不用抗惊厥药和甾体能保持神经稳定。

11.已知镰状细胞疾病。

12.诊断有成人呼吸窘迫综合征(ARDS)。

13.在当前感染中需要静脉或口服抗生素。

14.已知对酵母衍生产品的过敏历史。

15.已知对大肠杆菌衍生蛋白质，聚乙二醇化非格司亭、非格司亭或聚乙二醇化非格司亭的任何其它组分有过敏性(仅针对2期)。

16.怀孕妇女或哺乳期妇女(本研究全过程中，所有女性必须采取某种可靠性大于90％的避孕方法，或者是不育或是绝经后)

17.已知HIV阳性或活动性肝炎(状态未知的患者不做测试)

18.不同意在研究全过程中和研究药剂最后给药后30天内采用有效避孕方法的男性。

对象因下列原因从后续治疗中排除：

1.疾病发展

2.尽管治疗最优，但毒性不可接受

3.研究者自由裁量的并发疾病

4.多柔比星方案-达到寿命许可累计剂量的最大值(见资格标准)

5.撤回同意

6.不合规/随访丢失

7.妊娠

若停止NEUG治疗，为了预定的安全性和PK评估，继续研究对象，在任何研究药物的最终剂量后随访至少30天。

3.研究药剂

NEUG(重组人白蛋白-人粒细胞集落刺激因子，rHSA-G-CSF)是分子量约85kDa、单链连接的融合蛋白，其包含HSA成熟形式所对应的1-585位残基和人G-CSF所对应的586-759位残基。NEUG的治疗性部分是重组人DNA衍生的G-CSF。

在单次使用1型玻璃小瓶中以无菌、冻干制剂提供NEUG，并在2-8℃保存。用1.1ml注射用无菌水复溶后，各小瓶包含pH 7.2的10mM磷酸钠、200mM甘露醇、60mM无水海藻糖、0.01％(w/v)聚山梨酯80中的15mg/ml(可递送15mg/小瓶)NEUG。

表1显示了I期所用的NEUG药物产品的组成。

市售的Neulasta(聚乙二醇化非格司亭)在用于皮下注射的0.6ml预装注射器中提供。各注射器包含无菌、透明、无色、无防腐剂溶液中的6mg聚乙二醇化非格司亭(基于蛋白质重量)，所述溶液(pH 4.0)为含乙酸(0.35mg)、山梨糖醇(30.0mg)，聚山梨酯20(0.02mg)，钠(0.102毫克)的注射用水。美国药典。

通过皮下给药施用NEUG(50、150、300或450μg)或Neulasta(聚乙二醇化非格司亭)(6mg)。

4.研究特点

a.研究方案及持续时间

本研究是首次人体、多中心、开放标签、无对照依序剂量递增研究，继以有对照、随机临床试验，在62例患有乳腺癌计划接受多柔比星/多西他赛的对象中进行。本研究由两部分组成：为了在B部分的随机试验前评估安全性，A部分是13个对象中的剂量依序递增研究，4个剂量组(50、150、300或450μg/kg)，50、150和450μg/kg为每组3个对象，在300μg/kg组有4个对象。

A部分中，对象在化疗开始前至少2周(疗程0)接受第一剂NEUG，在没有细胞毒性化疗的情况下初始评估安全性和对嗜中性粒细胞绝对计数(“ANC”)的效果。在最少2周的随访后，若未出现被认为与疗程0的NEUG有关的剂量限制不良事件，且对象继续满足所有资格标准，则对象在疗程1和2的化疗后接受相同剂量的NEUG。

A部分中，剂量限制毒性(DLT)定义为被认为可能、很可能或肯定与所述研究试剂2级或2级以上的临床意义不良事件，2级骨痛除外。A部分各组内，各进入试验对象的初始研究药物给药相隔至少24小时，以监控急性不良事件。

递增到下一剂量水平的决定是基于给定组所有对象的NEUG首剂给药后至少7天的安全性数据审查。若3个对象无一出现DLT，则征募3个对象的继续递增剂量到下一剂量水平。若给定组3个对象中有1个出现DLT迹象，则在该剂量水平征募另3个对象，达到每组共6个对象。若6个对象中仅1个发生DLT则继续剂量递增。若6个对象中2个发生DLT，则停止剂量递增，不再给予进一步的NEUG治疗。

其余对象完成其排定的安全性、药代动力学和药效学评估。

A部分初始组证明了安全性后，进行B部分。B部分中，对象以平行方式随机分至3个治疗组之一：在研究化疗约24小时后给予NEUG 300μg/kg(n＝20)、NEUG 450μg/kg(n＝21)、或批准剂量的6mg聚乙二醇化非格司亭(n＝10)。

下表15和16小结了I期中A和B部分的对象设置。图26显示了I期研究A和B部分的化疗疗程。

b.I期A和B部分化疗的附随治疗

化疗

本试验的化疗方案由治疗第1天通过静脉输液依次给予多柔比星50mg/m²和多西他赛75mg/m²组成，最多为2个21天的疗程。

接受每个疗程的治疗前，对象的嗜中性粒细胞绝对计数(ANC)必须＞1.5x 10⁹/L且血小板数必须＞100x 10⁹/L。为了血液学恢复，治疗最多可以延迟2周。

据报道，联用多柔比星和多西他赛在乳腺癌患者中具有显著的临床活性。但是，所述联用是高度骨髓抑制性的，3级或4级嗜中性粒细胞减少症比率比其它标准方案高。

尽管添加CSF，多柔比星和多西他赛的联用仍引起79％的患者出现4级嗜中性粒细胞减少症，以及9-18％的发热性嗜中性粒细胞减少症比率。这一多柔比星/多西他赛方案用于预防嗜中性粒细胞减少症及其并发症的新药的研究。因此，多柔比星和多西他赛的联用是研究NEUG这类新试剂效力的合适化疗方案。

多柔比星

药理学数据

盐酸多柔比星是从波塞链霉菌表灰变种(streptomyces peucetius varcaesius)中获得的大环抗生素，其抑制DNA和DNA依赖性RNA合成，以及蛋白质合成。多柔比星在细胞周期各阶段都有活性，但在S期细胞毒性最大。该药物主要通过肝排除，肾脏清除是次要的。

药学数据

该药物以10、20、50、100或200mg的小瓶市售。冻干制剂可以用无菌注射用水、注射用5％葡萄糖溶液或0.9％盐水复溶。

副作用和毒性

多柔比星的剂量限制毒性在于骨髓抑制，主要是白细胞减少症，其最低点约在10-14天，以及心脏毒性，包括罕见的急性心包炎-心肌炎综合症和迟延的与累积剂量相关的心肌病。预期毒性有标志性脱发和中度恶心/呕吐。有报道在不慎外渗部位产生局部皮肤和组织损伤的外渗反应，口腔炎，皮肤(特别是指甲床)的色素沉着以及此前放射部位的“回忆”现象。

多西他赛

药理学数据

多西他赛是半合成的紫杉类，与游离微管蛋白结合并促进稳定微管的组装，干扰有丝分裂和细胞复制(M期细胞周期特异性)。多西他赛广泛结合蛋白，在肝中广泛代谢，在给药后7天内约有75％通过粪便排出。

药学数据

多西他赛(Taxotere^TM，赛诺菲安万特公司)以80mg/2mL或20mg/0.5ml的单剂量小瓶提供，附带稀释剂(注射用水中的13％乙醇)小瓶。每毫升Taxotere含40mg多西他赛(无水)和1080mg聚山梨酯80。

副作用和毒性

多西他赛不可用于对多西他赛或其它用聚山梨酯80配制的药物如依托泊苷和维生素E有严重过敏性反应史的患者。

不得再次刺激经历严重过敏性反应的患者。接受多西他赛的患者应当如下所述用皮质类固醇作前驱用药。

轻度到中度的肝损伤导致代谢延迟27％且系统性接触(AUC)提高了38％。多西他赛不得用于SGOT和/或SGPT＞1.5倍正常限度以及碱性磷酸酶＞2.5倍正常限度的患者。在III期研究中，尽管有皮质类固醇前驱用药，仍有17％(中度)和6％(重度潴留)患者出现液体潴留。观察到严重的感觉神经症状(感觉异常、感觉失常、疼痛)。

预期的副作用包括骨髓抑制，主要是白细胞减少症，其最低点约在第9天，到第15-21天恢复。有报道脱发、指甲和皮肤变化、口腔炎、肌痛/关节痛、恶心/呕吐和低血压。

化疗剂量、给药以及剂量调整

各治疗疗程的第1天，给予化疗剂(多柔比星，然后多西他赛)。

通过IV推注给予50mg/m²剂量的多柔比星，经侧支注入静脉或中央静脉导管给药以免渗出损伤。

将75mg/m²多西他赛稀释于250mL 0.9％盐水或5％葡萄糖溶液中，用聚乙烯管输液套件静脉给药，用时约1小时。在多西他赛注射临给药前和刚结束给药后，获得生命体征。

接受每个疗程的化疗前，对象的嗜中性粒细胞绝对计数(ANC)必须＞1500/mm³且血小板数必须＞100,000/mm³。为了血液学恢复，治疗最多可以延迟2周。对于3-4级非血液学毒性，2项3-4级感染事件或4级血小板减少症，允许化疗剂量降低25％。

将经历重度过敏性反应或非血液学毒性妨碍进一步化疗疗程的患者从研究治疗中除去，但完成随访.

化疗前驱用药

从多西他赛给药前一天开始连续3天口服(需要时IV)皮质类固醇(例如地塞米松8mg BID)，以减少液体潴留和过敏性反应的发生率和严重程度。

由主治医生自由裁量止吐剂或其它前驱用药(例如H₂拮抗剂)的使用和选择。

药物禁忌

在研究过程中以及下面指明的补充时间内对象不得接受任何下列药物或方法：

1.在启动研究试剂的30天内以及试验期间的其它在研药剂。

2.在NEUG用药后14天内不应进行后续的化疗疗程。

3.在试验期间，除非发生持续或发热性嗜中性粒细胞减少症，不得接受细胞因子、其它造血生长因子和预防性抗生素。若对象在筛选阶段到试验第0天之间的任何时间接受了G-CSF治疗，则没有资格接受NEUG并终止其研究。

允许的药物

对象可以继续他们的基础药物。若可能，整个研究过程中各药物的每日剂量应保持一致。若出于研究者认为必须的任何理由，对象需要其它药物或改变剂量，应在CRF的适当页面记录所用药物、给药途径、及其给予所针对的适应症。

抗生素

所有对象在每次化疗过程后接受预防性口服抗生素(例如，环丙沙星)以降低感染的可能性。若发生发热性嗜中性粒细胞减少症或持续的重度嗜中性粒细胞减少症(持续＞5天ANC＜0.5x10⁹/L)，则对象视为治疗失败，从研究中除去，完成随访并接受所有标准支持治疗，包括研究者自由裁量下的生长因子支持。

也将经历重度过敏性反应或非血液学毒性妨碍进一步化疗疗程的患者从研究治疗中除去，但完成随访.

c.安全性评估

通过随时间推移评价不良事件(AE)的类型、频率和严重程度，临床实验室测试(血液学和临床化学)的变化，免疫原性，身体检查，以及监控生命体征，来评估NEUG的安全性。根据国家癌症研究所常见的不良事件术语标准(2003年12月12日的NCI-CTCAE 3.0版)对所有AE和实验毒性作评级。从开始研究药物给药直至任何研究药物的最终用药后的30天内，采集所有不良事件(包括严重不良事件，“SAE”)。按评估规划(Schedule of Assessments)中所列获得实验室评估。若有4级嗜中性粒细胞减少症，每天获取实验室结果直至ANC＞500。若对象的下一疗程治疗被延迟(以及治疗的最后疗程后)，每周至少两次获取分类的全血细胞计数(CBC)直至ANC＞1500。

5.I期A和B部分的结果

a.概述

统计方法：

采用说明性统计学方法分析与安全性、药代动力学(PK)、药效学(PD)和免疫原性参数相关的数据。

对于不良事件的频率和严重程度和实验室毒性评级，给出了计数和分级。

功效分析包括4级与3-4级嗜中性粒细胞减少症的发生率和持续时间、ANC最低值、到ANC最低值的时间、恢复的时间(到ANC＞0.5x10⁹/L和ANC＞1.0x10⁹/L)以及发热性嗜中性粒细胞减少症的发生率。

选择本研究样本大小时未使用严格的统计功效。统计功效为80％的研究表明，为在5％的显著水平上证明NEUG不弱于聚乙二醇化非格司亭，计算出每个测试分支需要约37个对象。由于主要是为安全性而进行的1/2a期研究，确定效力的统计功效所要求的样本大小大于适当的样本大小。因此，评估了疗效的趋势。

设置/人口统计学：

A部分为试验的依序剂量递增部分，共招募了13个对象。B部分共招募了51个对象，随机分为NEUG 300μg/kg(n＝20)、NEUG 450μg/kg(N＝21)或聚乙二醇化非格司亭6mg(n＝10)。

b.研究结果

在初始的剂量调查中，没有化疗的情况下，NEUG耐受良好且引起预期的ANC升高，ANC在第2-4天之间达到峰值并到第14天回复正常(图23)。

A部分中，50μg/kg NEUG剂量组的所有3个对象和450μg/kg Neugranin剂量组的1个对象经历了持续超过5天的发热性嗜中性粒细胞减少症或重度嗜中性粒细胞减少症。在B部分中，300μg/kg NEUG剂量组的1个对象和450μg/kg NEUG剂量组的2个对象经历持续超过5天的发热性嗜中性粒细胞减少症或重度嗜中性粒细胞减少症。聚乙二醇化非格司亭组中1个对象经历了持续超过5天的发热性嗜中性粒细胞减少症或重度嗜中性粒细胞减少症。

c.免疫原性

在各NEUG疗程的第1天用药前和治疗检查的最后(最后用药后至少15天)，获取接受NEUG对象的血清样品用于针对NEUG的抗体。若在研究中的任何时间，有对象发生阳性抗NEUG抗体响应，在最终的NEUG剂量约6个月后，获取重复样品。

直到A和B部分的治疗都结束，完成所有对象的测试。所有样品都为NEUG抗体阴性。

d.不良事件

在A部分过程中，剂量限制毒性(DLT)定义为认为可能、很可能或肯定与研究药剂有关的2级或2级以上临床意义的不良事件，2级髓质骨痛除外。

A部分任何组中，在疗程0中未有DLT。仅报道了2例NEUG给药相关的不良事件：骨痛和先前存在高血压的发作，后者发生在NEUG给药后7天。两例事件都得到解决，没有后遗症。

41个NEUG治疗对象中31个经历至少1项不良事件。NEUG和聚乙二醇化非格司亭治疗对象中的AE发生率是相当的(分别为75.6％和70％)。

表17提供了B部分常见不良事件(所有对象中AE发生大于等于5％)的小结。

¹相关＝认为可能、很可能或肯定相关

²无关＝认为可能不相关或者不相关

最常报道的被认为NEUG相关的不良事件是骨痛，一种与所有G-CSF产品相关的典型不良反应，有5位患者报道有骨痛，其中4位列入上表，还有一位是A部分接受450μg/kg的对象。在所有病例中，骨痛为NCI-CTCAE强度1-2级，持续时间短且解决后没有后遗症。在疗程0 NEUG给药后发生了碱性磷酸酶和尿酸的1级升高；研究者认为这些事件不具临床意义，无需干预即被解决。这些是在接受G-CSF(例如，Neulasta)的患者中所预期的效应。

化疗疗程中其它常报道的不良事件(恶心、呕吐、脱发、口腔炎)与接受多柔比星/多西他赛方案的患者中所预期的不良事件一致。

所报道的AE主要是NCI CTC严重程度1或2级。有4项AE报道为严重不良事件。有2个对象，其一接受150μg/kg，另一个接受450μg/kg，经历了导致住院的呕吐，其中一个在后续化疗疗程中经历了第二次SAE；呕吐强度为轻度但引起住院或使住院延长。第3个接受450μg/kg的对象因发热性嗜中性粒细胞减少症住院。该事件被认为与NEUG无关。

e.药代动力学

整个研究过程中，对所有接受NEUG的对象取样分析血清NEUG浓度。采用NEUG特异性的夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)检测该药物。用WinNonlin企业版4.1版或更高版本对血清药物浓度-时间数据作PK分析，使用非房室模型分析或基于模型的分析。

获得下列PK参数：曲线下面积(AUC_0-∞)、清除(CL/F)、分布容积(Vz/F)、最大浓度(Cmax)、吸收半衰期(t1/2，abs)消除半衰期(t1/2，elim)和平均停留时间(MRT)。在方案所用剂量范围内评估药代动力学数据的线性关系。

表18小结了疗程0(预化疗)的药代动力学参数，图27显示了疗程0的PK概况。

用最大血清NEUG浓度和时间-浓度曲线下面积的剂量依赖性增加来测定药物接触。初始50μg/kg剂量组对象的血清浓度始终低于定量分析的下限(6.3ng/mL)。从150到450μg/kg的所有剂量的Tmax都在6-24小时范围内。Cmax的范围从150μg/kg剂量的72.7±59.7(均值±SD)ng/mL到450μg/kg剂量的294±351ng/mL。相应地，AUC_0-∞的范围从150mcg/kg剂量的1758±1675ng/mL*hr到450μg/kg剂量的10131±9563ng/mL*hr。第1疗程的范围相似。NEUG的平均消除半衰期范围为14-30小时。

如“研究特点”(上文第4部分)中所述，A部分的对象在开始化疗前至少2周(疗程0)接受NEUG的初始剂量，在没有细胞毒性化疗时初步评估安全性和对嗜中性粒细胞绝对计数(“ANC”)的效应。在最少2周的随访后，若未出现被认为与疗程0的NEUG有关的剂量限制不良事件，且对象继续满足所有资格标准，则对象在疗程1和2的化疗后接受相同剂量的NEUG。在化疗施用后24小时给予NEUG。图24A和24B显示了在第1和第2疗程接受NEUG的对象的ANC和WBC计数。

f.药效学以及B部分剂量的确定

对研究的I期A部分数据分析得到下列观察：

1.NEUG在疗程0(化疗前)引起剂量依赖性的WBC和ANC升高(见图24A和B的疗程0数据)。

2.在疗程0的ANC升高与等摩尔剂量聚乙二醇化非格司亭的历史数据相当

3.如所预期，化疗后WBC和ANC降低

4.从最低ANC的恢复看来与剂量相关

5.ANC和WBC到第15天回到正常值

基于这些观察以及A部分所有剂量水平表明的安全性，B部分评估选择的剂量为300和450μg/kg。如上所述，对象随机分到NEUG 300μg/kg、NEUG 450μg/kg或聚乙二醇化非格司亭的批准固定剂量6mg。对象在多柔比星/多西他赛(用药2个疗程，相隔21天)用药后1天，接受NEUG或聚乙二醇化非格司亭。B部分的数据包括群体的第1疗程ANC情况。图28和表18中总结了结果。

如表19所示，测定了51个治疗对象中48个的3级和4级嗜中性白细胞减少症的发生率，和第1疗程中的ANC情况。应注意，在没有G-CSF治疗时，多柔比星/多西他赛治疗的患者中的70-80％有平均持续时间为5天的4级嗜中性白细胞减少症。

图28给出了治疗组的平均ANC曲线。

NEUG有效治疗3级、4级和发热性嗜中性白细胞减少症。该化疗方案没有G-CSF治疗时，发热性嗜中性白细胞减少症的发生率约40％。在NEUG给药后观察到ANC的剂量相关升高和低于多柔比星/多西他赛所预期的嗜中性白细胞减少症比率。NEUG未导致超出预期的或严重的不良事件。

在接受300μg/kg NEUG的患者中，3级和4级嗜中性白细胞减少症的发生率高于接受聚乙二醇化非格司亭(Neulasta)的患者，且在接受300μg/kgNEUG的患者中恢复到正常ANC的速度看来也比接受聚乙二醇化非格司亭的患者慢。接受450μg/kg NEUG患者中的ANC情况与接受聚乙二醇化非格司亭的患者相似，尽管接受NEUG患者在从嗜中性白细胞减少症恢复期间的ANC一般低于接受聚乙二醇化非格司亭的患者。总之，这些剂量的NEUG看来提供了与聚乙二醇化非格司亭相似的效果。

f.I期B部分的PK/PD情况

图29显示了在乳腺癌治疗第1疗程多柔比星/多西他赛给药1天后接受450μg/kg NEUG的患者的PK/PD情况。NEUG在给药后1天内达到Cmax，并逐渐降低，到第10天降至不可检测水平。NEUG给药后，ANC到第4天升至峰值，然后如接受多柔比星/多西他赛和G-CSF治疗的患者中所预期，ANC在第8天降至最低然后在第10天恢复正常。到第12天，ANC值在正常范围内，NEUG不可检测。应注意，在未接受预防性G-CSF治疗的患者中，最低ANC的持续时间和达到ANC恢复的时间长得多(例如，5-7天)。一剂450μg/kg后，与标准剂量聚乙二醇化非格司亭报道的15-80小时相比，NEUG的中位清除半衰期约为30小时。

g.NEUG和聚乙二醇化非格司亭之间的其它差异

在治疗第1疗程个体ANC情况的比较中，测试剂量的NEUG和聚乙二醇化非格司亭在加快嗜中性白细胞减少症恢复效果之间的更多具体差异是显著的。所有组的ANC峰值非常相似，接受300μg/kg NEUG的对象中的ANC最低值低于接受450μg/kg NEUG的对象，而接受聚乙二醇化非格司亭对象的ANC最低值的平均值是最高的。在所有治疗组中，第14天ANC都从最低值恢复到了基线，但接受300μg/kg NEUG的组比450μg/kg NEUG的组慢，接受聚乙二醇化非格司亭的对象最快。

将完成I期排定的疗程0(化疗前)的患者的NEUG PK/PD数据与相似化疗前给药的聚乙二醇化非格司亭试验的已公开数据进行比较。比较结果如下：

1.在疗程0，150μg/kg剂量NEUG的Emax(最大观测ANC)与30μg/kg剂量聚乙二醇化非格司亭匹配，该剂量此后被证明功效劣于已证实有效的100μg/kg聚乙二醇化非格司亭剂量。

2.300和450μg/kg剂量Neugranin的Emax与100μg/kg剂量聚乙二醇化非格司亭的疗程0水平更为一致。

3.300和450μg/kg NEUG的中位Cmax和中位Emax几乎相同，因此Cmax继续预测Emax。

4.ANC提高与等摩尔剂量聚乙二醇化非格司亭的公开数据相当。

如上所述，当按等摩尔用药时，在动物和人中的PK/PD评估与估算的NEUG和聚乙二醇化非格司亭等效剂量一致。在小鼠中，聚乙二醇化非格司亭的7.7倍剂量获得相等的AUC_ANC。由于白蛋白对NEUG的分子量有显著贡献，而Neulasta(聚乙二醇化非格司亭)是按rhG-CSF的重量用药(不包括聚乙二醇化非格司亭中聚乙二醇的贡献)，预期4.5倍剂量的NEUG(按重量计)与等剂量的Neulasta(聚乙二醇化非格司亭)效果相当。动物中的功效数据与聚乙二醇化非格司亭的4.5-7.7倍等效(1mg聚乙二醇化非格司亭＝4.5-7.7NEUG)相符。非临床安全性和功效数据与这一剂量估算相符，当与已有的临床数据一起考虑时，构成临床评估选择剂量的基础。

h.I期结果

I期药代动力学评估的结果如下。

在疗程0和第1疗程用150μg/kg、300μg/kg和450μg/kg剂量的NEUG治疗的所有对象的血清样品中都测得NEUG。

在第1疗程，150μg/kg、300μg/kg和450μg/kg剂量组的大多数对象(50个取样对象中的45个)中，直至144小时还可测得NEUG。几乎未观察到疗程至疗程的药物积累。

各剂量组第1疗程的药物接触高于疗程0(化疗前)。第1疗程NEUG接触提高可能是由于嗜中性粒细胞数量减少，该细胞在受体介导G-CSF清除中起作用。

第1疗程中NEUG的中位清除半衰期，300μg/kg剂量组为约36小时，450μg/kg剂量组为约30小时。据报道，非格司亭的清除半衰期为3-4小时，聚乙二醇化非格司亭视不同剂量为42-67.5小时。

观察到剂量之间达到最大血清浓度的时间(t_max)和吸收半衰期(t_1/2，abs)有统计学显著差异。这两项参数都随NEUG剂量的增加而提高。未见其它剂量标准化PK参数显示剂量间的统计学显著差异。

实施例11：II期

研究的II期为对照的随机试验，在334位最多接受4个剂量多柔比星/多西他赛的乳腺癌对象中进行。所述研究在约50个临床地点进行，由两个阶段组成，双向随机先导试验阶段评估皮下给予NEUG相对聚乙二醇化非格司亭的安全性和效果，后续的主试验阶段将对象随机分到聚乙二醇化非格司亭和两个耐受良好的NEUG剂量(1∶1∶1)，NEUG剂量根据先导试验选定。主试验阶段样本大小足以就主要终点，化疗第1疗程中重度(4级)嗜中性白细胞减少症(DSN)的持续时间而言，确立NEUG不劣于聚乙二醇化非格司亭。该研究设计的示意图如下。

1.研究目的

II期的主要目的是选择能表现与聚乙二醇化非格司亭相当效果的NEUG剂量，并评估用NEUG治疗后化疗第1疗程重度嗜中性白细胞减少症(DSN)的持续时间。次要目的是评估2-4疗程中的DSN，评估1-4疗程中嗜中性粒细胞绝对计数恢复的时间和发热性嗜中性白细胞减少症的比率；并评估NEUG的安全性、耐受性、药代动力学(第1疗程中)和免疫原性。

2.患者特征

对于II期，根据下列特征或参数筛选患者：

包括：

1.具有组织学确认的乳腺癌，已安排接受多柔比星60mg/m2和多西他赛75mg/m2的患者。

2.年龄为18岁或18岁以上。

3.血液功能合格：

4.ANC＞1500/mm3

5.血小板＞100,000/mm3

6.肝、肾功能合格：

7.血清肌酸酐＜1.5x正常的上限

8.当地实验室测得总胆红素在正常限度内(WNL)

9.血清转氨酶(SGOT/SGPT)＜1.5x正常的上限

10.碱性磷酸酶＜2.5x正常的上限

11.美国东部肿瘤协作组(“ECOG”)性能状况0-2

12.基于左心室射血分数(LVEF)在正常限度内，可以接受多柔比星

13.能理解本研究的要求，提供已签署的知情同意书(包括同意使用并公开研究相关健康信息)并遵守研究方案步骤。

排除：

1.此前多于1次的化疗方案(包括过去12月内给予的辅助治疗)

2.累积喜树碱剂量将阻止本研究中的4次多柔比星完全剂量疗程。

3.在研究化疗前30内有在先化疗/免疫治疗(对于亚硝基脲(BCNU，CCNU)或丝裂霉素-C，为研究化疗前6周内)

4.伴随曲妥珠单抗(Herceptin)

5.在过去30天内接受过任何在研药剂

6.在研究者的观点中，心脏记录、迹象或症状阻止使用基于喜树碱的化疗方案

7.在化疗研究前2周内曾有手术

8.在化疗研究前4周内曾有辐射治疗(针对骨髓转移瘤的定点放射除外)

9.曾与造血干细胞移植进行高剂量化疗

10.在研究化疗前4周内曾使用G-CSF、GM-CSF或红细胞生成素

11.在研究化疗72小时内接受了全身性抗生素

12.有骨髓恶性肿瘤或脊髓发育不良历史。

13.已知脑部转移，除非经充分治疗(手术或化疗)，在至少3周的观察中没有发展的迹象且不用抗惊厥药和甾体能保持神经稳定。

14.已知镰状细胞疾病

15.诊断有成人呼吸窘迫综合征(ARDS)

16.已知对酵母衍生产品的过敏历史

17.已知对大肠杆菌衍生的蛋白质、聚乙二醇化非格司亭、非格司亭或聚乙二醇化非格司亭的任何其它组分有过敏性

18.妊娠妇女或哺乳期妇女。(在筛选时，具有完整子宫的所有女性必须是血清妊娠测试阴性。所有非不育或非绝经后女性必须在整个研究过程中和研究药剂最后用药后30天内采取医学上接受的避孕方法。)

19.不同意在研究全过程中和研究药剂最后给药后30天内采用有效避孕方法的男性。

20.已知HIV阳性或活动性肝炎(状态未知的患者不做测试)对象因下列原因从后续治疗中排除：

1.疾病发展

2.尽管治疗最优，但毒性不可接受

3.研究者自由裁量的并发疾病

4.多柔比星方案-达到寿命许可累计剂量的最大值(见资格标准)

5.撤回同意

6.不合规/随访丢失

7.妊娠

若停止研究药物治疗，为了预定的安全性和PK评估，继续研究对象，并在任何研究药物的最终剂量后随访至少30天。

3.研究药剂

NEUG(重组人白蛋白-人粒细胞集落刺激因子，rHSA-GCSF)是分子量约85kDa、单链连接的融合蛋白，其包含HSA成熟形式所对应的1-585位残基和人G-CSF所对应的586-759位残基。NEUG的治疗性部分是重组人DNA衍生的G-CSF。

在单次使用1型玻璃小瓶中以无菌、冻干制剂提供NEUG，并在2-8℃保存。用1.0ml注射用无菌水复溶后，各小瓶包含pH 6.0的20mM磷酸钠、180mM甘露醇、60mM无水海藻糖、0.01％(w/v)聚山梨酯80中的50mg/ml(可递送50mg/小瓶)NEUG。

表11显示了II期所用的NEUG药物产品的组成。下表20显示了I期和II期所用NEUG制剂间的区别。

I期所用制剂相当稳定，保存期至少2年。研究表明，更高离子强度和更低pH进一步稳定更高浓度(＞25mg/mL)下的API(数据未显示)。为此，II期的制剂pH较低(6.0相对7.2)和磷酸浓度较高(20相对10mM)。受迫降解研究表明，该制剂保护液体状态下的所述药物免于剧烈振荡、重复冻融和浓度引起的聚集。II期制剂的冻干也产生了成型良好的块。

市售的Neulasta(聚乙二醇化非格司亭)在用于皮下注射的0.6ml预装注射器中提供。各注射器中包含无菌、透明、无色、无防腐剂溶液中的6mg聚乙二醇化非格司亭(基于蛋白质重量)，所述溶液(pH 4.0)为含乙酸(0.35mg)、山梨糖醇(30.0mg)、聚山梨酯20(0.02mg)、钠(0.102mg)的注射用水。美国药典。

通过皮下给药给予NEUG(30、40、50或60mg)或Neulasta(聚乙二醇化非格司亭)(6mg)。

剂量原理

I期的数据表明，300和450μg/kg的NEUG剂量是安全且耐受良好的。此外，和已批准的聚乙二醇化非格司亭固定剂量相比，NEUG的两个剂量在接受细胞毒性化疗的乳腺癌患者中产生相似的ANC情况。ANC曲线的AUC作为效果的单点度量。在这些治疗组中，就AUC_ANC而言没有统计学显著差异，然而，450μg/kg组的AUC略高于300μg/kg组所观察到的，并与聚乙二醇化非格司亭组所观察到的几乎一致(图30)。基于现有数据，估计300μg/kg NEUG不如聚乙二醇化非格司亭有效，450μg/kg大致是提供与聚乙二醇化非格司亭相当效果的最小必需剂量。

固定剂量意在确定无论患者体重如何都足以为患者提供功效和安全性的剂量。基于I期结果，估计450μg/kg NEUG可能是提供与聚乙二醇化非格司亭相似功效的最小必需剂量，而＞300μg/kg设为II期中进一步评估的最小剂量。为选择NEUG的固定剂量，模拟II期的所述患者群体(乳腺癌)。采用40-100kg的重量范围，30mg固定剂量为最重患者提供了最小剂量(300μg/kg或0.3mg/kg)，而40mg的固定剂量下约75％的患者至少接受目标剂量450mg/kg。因此，II期评估所选剂量为30mg、40mg和50mg。这些剂量为平均70kg的患者分别提供0.42、0.57和0.71mg/kg剂量。

表21中提供了基于本试验所评估固定剂量的每公斤等效剂量。

NEUG的非临床安全性为这些剂量下的预期安全性提供了补充支持。在这些固定剂量下，患者的接触(AUC和Cmax)预期低于猴中的耐受良好剂量的接触。例如，猴中1mg/kg耐受良好剂量下的Cmax和AUC比0.45mg/kg下患者的接触高12倍，提示对患者中更高剂量的评估存在进一步的安全性限度，而且在猴中的重复剂量毒性研究中，高达且包括10mg/kg的剂量耐受良好。已证明，高达0.3mg/kg的聚乙二醇化非格司亭剂量在患者中是安全的。

4.研究特点

a.研究方案及持续时间

本研究是对照的随机试验，在约330位排定最多接受4个剂量多柔比星/多西他赛的乳腺癌对象中进行。本研究在约45个临床地点进行，由先导试验阶段和主试验阶段两个阶段组成。

先导试验阶段，A部分，由双向随机研究组成，以评估NEUG与聚乙二醇化非格司亭相比的安全性和效果，依序使用下列剂量：NEUG 30mg(N＝10)相对聚乙二醇化非格司亭(N＝5)；NEUG 40mg(N＝20)相对聚乙二醇化非格司亭(N＝10)和NEUG 50mg(N＝20)比聚乙二醇化非格司亭(N＝10)。在进一步的研究中，还可测试NEUG 60mg(N＝20)相对聚乙二醇化非格司亭(N＝10)。在A部分先导试验阶段，对象以NEUG比聚乙二醇化非格司亭2∶1的比例随机分组，30mg剂量组中共有10个对象，其它各剂量组中共有20个对象。在各疗程中，化疗治疗24小时后将NEUG或聚乙二醇化非格司亭给予对象。在化疗接触和整体定位前，为平衡治疗组间的重量，采用分层随机化将对象分入治疗组(＜50kg、≥50kg且＜80kg、或≥80kg)。

先导试验阶段后，255个对象随机(1∶1∶1)分到聚乙二醇化非格司亭和NEUG的两个剂量组，这两个剂量在先导试验阶段(3分支、平衡的平行随机化阶段)耐受良好且效果与聚乙二醇化非格司亭更为相当。在各疗程中，化疗治疗24小时后给予NEUG或聚乙二醇化非格司亭。为平衡治疗组间的重量，采用分层随机化将对象分入治疗组(＜50kg、≥50kg且＜80kg、或≥80kg)。

在先导试验阶段，在研究进行的基础上审查不良事件。除非进行的数据审查提示有安全性问题，进行剂量从30直至50mg的递增。若第1疗程Neugranin40mg的ANC曲线看来劣于聚乙二醇化非格司亭患者中所观察到的曲线，且Neugranin 50mg是安全的，那么，可在总共30个对象的剂量组中按2∶1的比例将Neugranin 60mg与聚乙二醇化非格司亭随机化补充分支。

与聚乙二醇化非格司亭比较了NEUG各剂量水平的安全性和功效。表22小结了II期A和B部分的患者分配。

安全性评估：

通过随时间推移评价AE的类型、频率和严重程度，临床实验测试(血液学和临床化学)的变化，免疫原性，身体检查，以及监控生命体征，来评估NEUG的安全性。根据国家癌症研究所常见的不良事件术语标准(2003年12月12日的NCI-CTCAE 3.0版)对所有AE和实验毒性作评级。

从开始研究药物给药直至任何研究药物的最终用药后的30天内，采集所有不良事件。从知情同意直至任何研究药物的最终用药后的30天内，采集严重不良事件(SAE)。按评估规划(Schedule ofAssessments)中所列获得实验室评估。

c.附随治疗

化疗

本试验的化疗方案由治疗第1天通过静脉输液依次给予多柔比星60mg/m²和多西他赛75mg/m²组成，最多为4个21天的疗程。

接受每个疗程的治疗前，要求对象的嗜中性粒细胞绝对计数(ANC)＞1000/mm³且血小板数＞100,000/mm³。为了血液学恢复，治疗最多可以延迟2周。对于3-4级非血液学毒性，2项3-4级感染事件或4级血小板减少症，允许化疗剂量降低25％。在参与试验期间，禁止使用预防性抗生素或其它造血生长因子。

据报道，联用多柔比星和多西他赛在乳腺癌患者中具有显著的临床活性。但是，所述联用是高度骨髓抑制性的，3级或4级嗜中性粒细胞减少症比率比其它标准方案高。

尽管添加CSF，多柔比星和多西他赛的联用仍引起79％的患者出现4级嗜中性粒细胞减少症，以及9-18％的发热性嗜中性粒细胞减少症比率。这一多柔比星/多西他赛方案用于预防嗜中性粒细胞减少症及其并发症的新药的研究。因此，多柔比星和多西他赛的联用是研究NEUG这类新试剂效力的合适化疗方案。

多柔比星

药理学数据

盐酸多柔比星是从波塞链霉菌表灰变种(streptomyces peucetius varcaesius)中获得的大环抗生素，与DNA碱基对直接结合(插入)并抑制DNA和DNA依赖性RNA合成以及蛋白质合成。多柔比星在细胞周期各阶段都有活性，但在S期细胞毒性最大。该药物主要通过肝排除，肾脏清除是次要的。

药学数据

该药物以10、20、50、100或200mg的小瓶市售。冻干制剂可以用无菌注射用水、注射用5％葡萄糖溶液或0.9％盐水复溶。

副作用和毒性

多柔比星的剂量限制毒性在于骨髓抑制，主要是白细胞减少症，其最低点约在10-14天，以及心脏毒性，包括罕见的急性心包炎-心肌炎综合症和迟延的与累积剂量相关的心肌病。

预期毒性有标志性脱发和中度恶心/呕吐。有报道在不慎外渗部位产生局部皮肤和组织损伤的外渗反应，口腔炎，皮肤(特别是指甲床)的色素沉着以及此前放射部位的“回忆”现象。

多西他赛

药理学数据

多西他赛是半合成的紫杉类，与游离微管蛋白结合并促进稳定微管的组装，干扰有丝分裂和细胞复制(M期细胞周期特异性)。多西他赛广泛结合蛋白，在肝中广泛代谢，在给药后7天内约有75％通过粪便排出。

药学数据

多西他赛(Taxotere^TM，赛诺菲安万特公司)在80mg/2mL或20mg/0.5ml的单剂量小瓶中提供，附带稀释剂(注射用水中的13％乙醇)小瓶。每毫升Taxotere含40mg多西他赛(无水)和1080mg聚山梨酯80。

副作用和毒性

多西他赛不可用于对多西他赛或其它用聚山梨酯80配制的药物如依托泊苷和维生素E有严重过敏性反应史的患者。

不得再次刺激经历严重过敏性反应的患者。接受多西他赛的所有患者应当如下所述用皮质类固醇作前驱用药。

轻度到中度的肝损伤导致代谢延迟27％和系统性接触(AUC)提高了38％。多西他赛不得用于SGOT和/或SGPT＞1.5倍正常限度以及碱性磷酸酶＞2.5倍正常限度的患者。在III期研究中，尽管有皮质类固醇前驱用药，仍有17％(中度)和6％(重度潴留)患者出现液体潴留。观察到严重的感觉神经症状(感觉异常、感觉失常、疼痛)。

预期的副作用包括骨髓抑制，主要是白细胞减少症，其最低点约在第9天，到第15-21天恢复。有报道脱发、指甲和皮肤变化、口腔炎、肌痛/关节痛、恶心/呕吐和低血压。

化疗剂量、给药以及剂量调整

各治疗疗程的第1天，给予化疗剂(多柔比星，然后多西他赛)。

通过IV推注给予60mg/m²剂量的多柔比星，经侧支注入静脉或中央静脉导管给药以免渗出损伤。

将75mg/m²多西他赛稀释于250mL 0.9％盐水或5％葡萄糖溶液中，用聚乙烯管输液套件静脉给药，用时约1小时。在多西他赛注射临给药前和刚结束给药后，获得生命体征。

将经历重度过敏性反应或非血液学毒性阻止进一步化疗疗程的患者从研究治疗中除去，但完成随访。

化疗前驱用药

从多西他赛给药前一天开始连续3天口服(需要时IV)皮质类固醇(例如地塞米松8mg BID)，以减少液体潴留和过敏性反应的发生率和严重程度。

由主治医生自由裁量止吐剂或其它前驱用药(例如H₂拮抗剂)的使用和选择。

药物禁忌

在研究过程中以及下面指明的补充时间内对象不得接受任何下列药物或方法：

1.在第1疗程化疗72小时内的全身性抗生素。

2.在启动研究试剂的30天内以及试验期间的其它在研药剂。

3.在NEUG用药后14天内不应进行后续的化疗疗程。

4.在试验期间，除非发生持续或发热性嗜中性粒细胞减少症，不得接受细胞因子、其它造血生长因子和预防性抗生素。若对象在筛选期间到试验第0天之间任何时间进行了G-CSF治疗，则没有资格接受NEUG并终止其研究。

允许的药物

对象可以继续他们的基础药物。若可能，整个研究过程中各药物的每日剂量应保持一致。若出于研究者认为必须的任何理由，对象需要其它药物或改变剂量，应记录所用药物、给药途径、及其给予所针对的适应症。

将经历重度过敏性反应或非血液学毒性妨碍进一步化疗疗程的患者从研究治疗中除去，但完成随访。

d.药代动力学

在第1疗程中，对所有接受NEUG的对象取样分析血清NEUG浓度。采用NEUG特异性的夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)检测该药物。用WinNonlin企业版5.0版或更高版本对血清药物浓度-时间数据作PK分析，使用非房室模型分析或基于模型的分析。测得下列PK参数：曲线下面积(AUC_0-∞)、清除(CL/F)、分布容积(Vz/F)、最大浓度(Cmax)、吸收半衰期(t1/2，abs)消除半衰期(t1/2，elim)和平均停留时间(MRT)。

e.免疫原性

在各NEUG疗程的第1天用药前和治疗检查的最后(最后用药后约30天)，获取接受NEUG对象的血清样品用于针对NEUG的抗体。若在研究中的任何时间，有对象发生阳性抗NEUG抗体响应，在最终NEUG剂量约6个月后，获取重复样品；若该样品为阳性，在12个月时获取样品。该方案后面修改为要求所有对象的6和12月免疫原性样品。

5.结果

a.概述

统计方法

选定本试验中主试验阶段(B部分)每个分支的样本大小约85个对象，以提供91％的强度确立NEUG在第1疗程的重度嗜中性白细胞减少症(DSN)平均持续时间主要终点方面不劣于聚乙二醇化非格司亭，不劣于的限度为1天，对多测试调整(通过Hochberg方法)的总体单边显著水平为0.025。根据两独立组的正态近似计数样本大小，估计第1疗程DSN的处理组内标准差为1.6天，以及第1疗程DSN主要终点不可评估的最大比例为20％。

根据3分支随机化阶段(A部分)的对象，在两个选定NEUG剂量(40mg和50mg)和聚乙二醇化非格司亭间比较功效。

次要功效分析包括2-4各化疗疗程中的DSN、1-4各疗程ANC最低值的深度、按疗程或跨疗程的FN(定义为ANC＜0.5x10⁹/L伴有偶发性口腔相等温度＞38.2℃)的比例、以及所有疗程中ANC恢复到＞1.5x10⁹/L的时间。

用适当的统计方法解析次要功效分析相关数据。通过描述的统计方法分析安全性、PK和免疫原性参数。

对于不良事件的频率和严重程度和实验室毒性评级，给出了计数和分级。

功效度量

在第1、3天和从第5天起每天获取全血细胞计数(“CBC”)直至在最低点后ANC＞2.0x10⁹/L，然后每周计数2次直至治疗结束。

b.II期A部分的功效

本研究的先导试验阶段征募的78个对象中，13个对象未完成本研究，3个用NEUG 30mg治疗(27.3％)，3个用NEUG 40mg治疗(14.3％)，3个用NEUG 50mg治疗(15.0％)，还有4个用聚乙二醇化非格司亭治疗(15.4％)。提前终止的最常见原因是撤回同意(7个对象)和研究者的决定(3个对象)。一个NEUG 30mg对象因为不良事件(糖尿病足)而退出。

在各化疗疗程中，治疗组之间重度嗜中性白细胞减少症的发生率和重度嗜中性白细胞减少症的平均持续时间(DSN)相似；但是，ANC恢复的时间和发热性嗜中性白细胞减少症的发生率提示，NEUG 30mg不如NEUG 40mg、NEUG 50mg或聚乙二醇化非格司亭有效。

在第1疗程，NEUG 30mg、40mg、50mg和聚乙二醇化非格司亭组中对象经历发热性嗜中性白细胞减少症的比例分别为20.0％、9.5％、10.0％和8.0％。仅在2-4疗程中观察到3个补充对象的发热性嗜中性白细胞减少症，NEUG 30mg、NEUG 40mg和聚乙二醇化非格司亭组中各1个。图5显示了接受NEUG30或聚乙二醇化非格司亭、此后出现4级嗜中性白细胞减少症的患者亚组的ANC曲线。

在第1疗程，NEUG 30mg(0.9天)、NEUG 50mg(1.1天)和聚乙二醇化非格司亭(0.9天)的平均DSN相似。尽管NEUG 40mg(1.6天)的平均DSN稍长于其它3组治疗，治疗间的差异低于1天，这是主试验阶段中认为治疗等效的标准。所有4个治疗组的DSN中位数都是0或1。

3级或4级嗜中性白细胞减少症的发生率和持续时间的总结统计得出相似模式，即NEUG 30mg、NEUG 50mg和聚乙二醇化非格司亭组有相似结果，而NEUG 40组的3级或4级嗜中性白细胞减少症的发生率和持续时间稍高于其它治疗组。先导试验阶段对象的数量(A部分)相当小，所观察到的差异不具统计学意义。在本研究的B部分、3分支随机阶段中，选择NEUG 40mg和NEUG 50mg进行进一步评估。

c.II期B部分的功效

本研究的主试验阶段征募的256个对象中，18个对象未完成本研究；10个用NEUG 40mg治疗(11.6％)，5个用NEUG 50mg治疗(6.0％)，3个用聚乙二醇化非格司亭治疗(3.5％)。提前终止的最常见原因是撤回同意(7个对象)和AE(4个对象)，包括2例死亡。研究者认为所有这些AE都与研究药物或化疗无关。在主试验阶段，1个(1.2％)NEUG 40mg对象在用研究药物治疗前退出。

表23小结了第1疗程中重度嗜中性白细胞减少症的发生率和持续时间。

重度嗜中性白细胞减少症的发生率从聚乙二醇化非格司亭组的58.1％到NEUG 50mg组的65.5％。治疗效果没有统计学显著性(p＝0.559)。治疗组第1疗程的DSN相当，NEUG 40mg、NEUG 50mg和聚乙二醇化非格司亭组的平均值分别为1.0、1.3和1.2天。NEUG和聚乙二醇化非格司亭之间差异的95％和97.5％双侧置信区间对两个NEUG剂量都严格低于1天。这一分析确立了NEUG不劣于聚乙二醇化非格司亭。在各治疗疗程中，第2-4疗程的重度嗜中性白细胞减少症和3级或4级嗜中性白细胞减少症的发生率低于第1疗程。第2-4疗程的3级或4级嗜中性白细胞减少症的平均DSN和平均持续时间低于第1疗程。在治疗疗程内，所述治疗相似，对于任何化疗疗程内任何这些参数，治疗效果没有显著差异。

在分成4个重量组的患者中比较DSN以确定NEUG固定剂量是否为所有体重的患者提供了充分的支持。这些结果显示，所有体重组都得到充分支持，在体重亚组间，平均DSN没有显著差异(表24)。

表25总结了所有疗程的发热性嗜中性白细胞减少症。在第1疗程中，NEUG40mg、50mg和聚乙二醇化非格司亭组中对象经历发热性嗜中性白细胞减少症的比例分别为2个对象(3.5％)、5个对象(6.0％)和2个对象(2.3％)。在第2-4疗程中，仅有3个补充对象观察到发热性嗜中性白细胞减少症，2个是NEUG 40mg组的对象且1个是聚乙二醇化非格司亭组的对象。在任何化疗疗程中，治疗效果没有统计学显著性。

第2-4疗程重度嗜中性白细胞减少症的持续时间在各治疗间没有显著差异(表26)。

Neugranin 40mg、NEUG 50mg和聚乙二醇化非格司亭组的ANC恢复(＞1.5x109/L)平均时间分别为2.0、2.1和2.6天(表27)。ANC最低值的深度或到达最低值的时间在治疗组间没有显著差异。

d.II期B部分的药代动力学

采用量化下限(LLQ)为6.312ng/mL的已验证夹心ELISA测定血清Neugranin浓度。除用一级吸附、一级消除的一室模型确定吸收半衰期外，采用非房室模型技术计算药代动力学参数。用WinNonlin专业版(5.0.1版)进行模拟。测定II期NEUG治疗的所有对象在化疗第1疗程中的血清NEUG浓度。在II期A部分，NEUG消除半衰期的中位数在30mg剂量组为33小时，在40mg剂量组为46小时，在50mg剂量组为18小时(表28)。在B部分，NEUG消除半衰期的中位数在40mg剂量组为40小时，在50mg剂量组为39小时(表29)。A部分过程中的PK取样(给药前、3h、6h、12h、24h、第3天、第5-9天、第11天)比B部分(给药前、第3天、第5-8天)更频繁。

采用已验证的夹心ELISA测定II期聚乙二醇化非格司亭治疗的所有对象在化疗第1疗程中的血清聚乙二醇化非格司亭浓度。在A部分，聚乙二醇化非格司亭消除半衰期的中位数为约40小时。在B部分，聚乙二醇化非格司亭消除半衰期的中位数为约50小时。据报道，非格司亭的清除半衰期为3-4小时，聚乙二醇化非格司亭(取决于剂量)为42-67.5小时。

e.免疫原性

在研究参与者中，在Neugranin治疗对象中有1例证实有抗G-CSF/新表位抗体应答，在聚乙二醇化非格司亭治疗组中有1例抗G-CSF应答，或分别为0.5％和0.9％(表30)。两个案例中，所述对象都在给药前样品中有升高的非特异性结合。

NEUG治疗后，在患者中见到证实阳性抗体的水平极低，在重复剂量后应答幅度未有明显提高(数据未显示)。在聚乙二醇化非格司亭治疗的患者中，观察到异常的高非特异性背景；但是，只在第2疗程治疗后见到短暂的确定抗体应答(数据未显示)。没有中和性抗体应答。

在该人群中，抗HSA抗体以低水平天然产生，对象中6.9％在给药前评估中测得HSA抗体阳性。在4个NEUG治疗对象(1.8％)中观察到治疗引起的HSA抗体(表31)。所有应答都是短暂且微弱的。三个应答在第一治疗疗程后出现，在第2、3和4疗程后不可测得。在第三次治疗后发生一个应答，但在第四次治疗后的30天随访时不可测得(数据未显示)。

f.II期B部分中治疗引起的不良事件

在II期B部分中，各治疗组中≥90％的对象经历至少一种治疗引起的不良事件(TEAE)，有至少一种研究药物相关TEAE的对象百分比从聚乙二醇化非格司亭组的23.1％到Neugranin 50mg组的35.0％。在NEUG 30mg组中有至少一项SAE的对象百分比最高(30％)，但在其它三个治疗组中约为15％。SAE中无一与研究药物相关。一个患者(NEUG 30mg)因糖尿病足从研究中退出，认为该糖尿病足与研究药物无关。在B部分，除8个对象(2个NEUG40mg、3个NEUG 50mg、3个聚乙二醇化非格司亭)外的所有对象都有至少一项TEAE。有至少一项研究药物相关TEAE的对象百分比在NEUG 50mg组为20.2％，在NEUG 40mg组为22.4％，在接受聚乙二醇化非格司亭的对象中为22.1％。两个对象(1个NEUG 40mg、1个聚乙二醇化非格司亭)在研究过程中死亡，每个治疗组中有6-8个对象经历至少一项SAE。认为没有死亡或SAE与研究药物相关。

当考虑到NEUG 30mg剂量的样本大小时，A部分以及B部分中治疗组间的TEAE总数相似。在A和B部分中，NEUG和聚乙二醇化非格司亭的CTC3级或3级以上TEAE的百分数和与研究药物相关TEAE的百分数都相似。

g.剂量反应

II期的结果表明，40和50mg的NEUG固定剂量在用骨髓毒性化疗治疗的乳腺癌对象中提供了与6mg聚乙二醇化非格司亭相当的安全性和功效。尽管40mg治疗组的平均DSN稍低于50mg组的平均DSN，这些差异在统计上不显著。考虑体重调整剂量和固定剂量组群时，都观察到AUC_ANC(第1疗程0-15天)的剂量反应(图24)。30mg组群的AUC_ANC稍低于聚乙二醇化非格司亭组群，表明本研究中30mg固定剂量效力较低，而40和50mg组群的AUC_ANC是剂量相关的，且大于(尽管不显著)聚乙二醇化非格司亭治疗对象的AUC_ANC。根据上述分析，当NEUG基于体重调整(mg/kg)给药时有明显的剂量反应。但是，与II期B部分第1疗程的DSN的比较显示，所有4个重量组的患者都得到充分支持，DSN在治疗分支(40和50mg NEUG以及聚乙二醇化非格司亭)间或在重量调整剂量(mg/kg)间都没有显著改变。此外，没有迹象表明固定剂量可能引起较轻患者中安全性情况的改变，相关不良事件(特别是骨痛，数据未显示)的发生率和严重程度与每公斤体重接受的剂量没有关联，与聚乙二醇化非格司亭的情况也没有差异。

实施例12：补充的示范性NEUG制剂

进行其它NEUG制剂的开发以分析并确定pH(4-7)、缓冲剂种类(L-组氨酸、柠檬酸盐、乙酸盐)、张度调节剂(山梨糖醇相比NaCl)和蛋白质浓度(浓缩至最多70-90mg/ml)的影响。通过SEC(单体％)、RH-HPLC(纯度％)、埃尔曼试验(-SH含量)、A280(蛋白质)和IE-HPLC(电荷同种型)分析/检测样品。下表32显示了所检查的制剂。

测试后，制剂A40S、A45S、C55N和C55S看来是最稳定的(在所研究的各方面中)。

对本领域的技术人员显而易见的是，可以对本发明的方法和组合物进行各种修改和变动而不偏离本发明的精神或范围。因此，本发明旨在覆盖本发明的修改和变动，只要这些修改和变动在所附权利要求及其等同方案的范围之内。

Claims (21)

1.一种用于给予人的药物组合物，包含重组人白蛋白-人粒细胞集落刺激因子和至少一种药学上可接受的载体，其中所述组合物的pH为4-6.4，具有15-50mM的磷酸缓冲剂浓度和15-30mM的盐浓度，其中所述重组人白蛋白-人粒细胞集落刺激因子的浓度为30-120mg/ml并且25℃孵育24小时后溶液中重组人白蛋白-人粒细胞集落刺激因子的单体纯度降低小于5％。

2.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述组合物的pH为6.0。

3.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述重组人白蛋白-人粒细胞集落刺激因子的浓度为50mg/ml。

4.如权利要求1、2或3所述的药物组合物，其特征在于，所述组合物包含15-30mM的至少一种药学上可接受的盐、180mM的甘露醇、60mM的二水海藻糖和聚山梨酯80。

5.如权利要求1、2或3所述的药物组合物，其特征在于，所述盐的浓度为20mM。

6.如权利要求1、2或3所述的药物组合物，其特征在于，所述磷酸缓冲剂的浓度为20mM。

7.如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述缓冲剂是磷酸钠。

8.如权利要求1、2或3所述的药物组合物，其特征在于，所述组合物包含冻干稳定剂。

9.如权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述冻干稳定剂包含二水海藻糖。

10.如权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述二水海藻糖的浓度为60mM。

11.如权利要求1、2或3所述的药物组合物，其特征在于，所述组合物包含膨胀剂。

12.如权利要求11所述的药物组合物，其特征在于，所述膨胀剂包含多醇。

13.如权利要求12所述的药物组合物，其特征在于，所述多醇包含甘露醇。

14.如权利要求1、2或3所述的药物组合物，其特征在于，所述组合物为冻干粉末形式。

15.如权利要求14所述的药物组合物，其特征在于，所述粉末保存在小瓶中。

16.如权利要求1、2或3所述的药物组合物，其特征在于，所述组合物是液体形式。

17.如权利要求16所述的药物组合物，其特征在于，所述液体保存在注射器中。

18.一种药物组合物，其包含：

(a)50mg/ml重组人白蛋白-人粒细胞集落刺激因子，

(b)20mM磷酸钠，

(c)180mM甘露醇，

(d)60mM二水海藻糖,和

(e)聚山梨酯80，

其中所述组合物的pH为6.0。

19.一种药物组合物，其包含：

(a)50mg/ml重组人白蛋白-人粒细胞集落刺激因子，

(b)17.4mM磷酸二氢钠，

(c)2.5mM磷酸氢二钠，

(d)180mM甘露醇，

(e)60mM无水海藻糖，

(f)聚山梨酯80，

其中，所述组合物的pH为6.0。

20.一种药物组合物，其由以下组分组成：

(a)50mg/ml重组人白蛋白-人粒细胞集落刺激因子，

(b)20mM磷酸钠，

(c)180mM甘露醇，

(d)60mM二水海藻糖,和

(e)聚山梨酯80，

其中所述组合物的pH为6.0。

21.一种药物组合物，其由以下组分组成：

(a)50mg/ml重组人白蛋白-人粒细胞集落刺激因子，

(b)17.4mM磷酸二氢钠，

(c)2.5mM磷酸氢二钠，

(d)180mM甘露醇，

(e)60mM无水海藻糖，和

(f)聚山梨酯80，

其中，所述组合物的pH为6.0。