CN101664378B - 一种重组人血清白蛋白与干扰素α融合蛋白的药物组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种稳定化的含有重组人血清白蛋白与干扰素α融合蛋白的液体药物组合物，它是由治疗有效量的重组人血清白蛋白与干扰素α融合蛋白、pH值为5.5～8.5的缓冲液、溶液渗透压维持剂、非离子表面活性剂、以及药用防腐剂组成的。本发明还公开了一种无菌密封的容器，它装有所述稳定化的含有重组人血清白蛋白与干扰素α融合蛋白的液体药物组合物。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域。具体涉及一种稳定化的含有重组人血清白蛋白与干扰素α融合蛋白的液体药物组合物，及其一种装有该稳定化的液体药物组合物的无菌密封的容器。
背景技术
干扰素(IFN)是一组具有多种功能的活性蛋白质(主要是糖蛋白)，是一种由单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子。它们在同种细胞上具有广谱的抗病毒、影响细胞生长和分化、调节免疫功能等多种生物活性。根据干扰素蛋白质的氨基酸结构、抗原性和细胞来源，可将其分为：IFNα(白细胞型)、IFNβ(成纤维细胞型)、IFNγ(免疫型)。IFNω属于IFNα家族，其结构和大小与其它IFNα稍有差异，但抗原性有较大的不同。现在公认IFNβ和IFNγ只有一个亚型，而IFNα有约二十余个亚型。自80年代以来，许多研究显示，干扰素(尤其是IFNα及IFNγ)除具有抗病毒、免疫调节的作用外，还具有明显的抗细胞增殖作用。因此，目前干扰素已被用于治疗多种人类疾病。
人重组干扰素在临床上都已被广泛的运用于抗病毒及抗肿瘤。多年来，干扰素一直被用于治疗丙型，乙型肝炎的首选用药。但是干扰素的疗效不太理想，只有较小比例的患者在停止用药之后仍能维持对病毒的抑制作用。主要的问题在于干扰素的血液半衰期只有仅仅3-6个小时，一般肝炎病人需要每周至少接受三次注射来到达治疗效果，给病人带来巨大的痛苦。
针对上述干扰素在人体内半衰期短的缺点，美国的罗氏制药(Roche)和先灵葆雅(Schering-Plough)将干扰素聚乙二醇化，以保障一个稳定的血浆浓度，聚乙二醇化的干扰素展示出较好的临床治疗效果。目前，聚乙二醇化的干扰素在临床上已经在很大程度上替代了普通干扰素单体。此外，采用重组人血清白蛋白与干扰素的融合蛋白也可以克服干扰素在人体内半衰期较短的缺点，研究表明，在克鲁维氏酵母中表达的HSA-IFNα融合蛋白(Albuferon)在猕猴体内的半衰期比普通IFNα延长了大约18倍(Osbom B，Olsen H，Nardelli B，et al.Pharmacokinetic andPharmacodynamic Studies of a Human Serum Albumin-Interferon-a Fusion Protein inCynomolgus Monkeys.J Pharmacol Exp Ther 2002 Nov；303：540-548.)。
然而，无论是聚乙二醇化的干扰素，还是重组人血清白蛋白与干扰素的融合蛋白，它们都是属于蛋白药物。由于蛋白质的分子量大，结构复杂，蛋白质分子很不稳定，易受物理或化学因素的影响而变性，丧失其生物活性。尤其当蛋白类药物制剂中所含生物活性蛋白浓度较低时，易出现蛋白降解或蛋白被管壁吸附等现象，从而影响蛋白质制剂的药效。
因此，本领域迫切需要提供一种稳定化的含有重组人血清白蛋白与干扰素融合蛋白的液体药物组合物，这将十分有利于该种新型药物制剂在临床上的应用推广。
发明内容
本发明的目的是提供一种稳定化的含有重组人血清白蛋白与干扰素α融合蛋白的液体药物组合物。
为了实现上述目的，本发明首先提供了一种稳定化的液体药物组合物，它是由治疗有效量的重组人血清白蛋白与干扰素α融合蛋白、(较佳5.0mM～50mM，更佳10mM～40mM，还要佳20mM～30mM)pH值为5.5～8.5(更佳pH6.5～7.5，还要佳pH7.0～7.5)的缓冲液、溶液渗透压维持剂、非离子表面活性剂、以及药用防腐剂组成的。
在一个优选的实施方案中，所述重组人血清白蛋白与干扰素α融合蛋白中的干扰素α选自干扰素α-2a、干扰素α-1b、或干扰素α-2b，即重组人血清白蛋白与干扰素α-2a融合蛋白、重组人血清白蛋白与干扰素α-1b融合蛋白、或重组人血清白蛋白与干扰素α-2b融合蛋白。更优选，在所述整个液体药物组合物中，所述重组人血清白蛋白与干扰素α(较佳干扰素α-2b)融合蛋白的浓度为0.1mg/ml～2.5mg/ml(较佳0.5mg/ml～1.8mg/ml，更佳0.8mg/ml～1.5mg/ml)。
在另一个优选的实施方案中，所述缓冲液是pH5.5～8.5(更佳pH6.5～7.5，还要佳pH7.0～7.5)的磷酸缓冲液(磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液)。更优选，其浓度为5.0mM～50mM(较佳10mM～40mM，更佳20mM～30mM)。
在还有一个优选的实施方案中，所述药用防腐剂是苯甲醇。更优选，在所述整个液体药物组合物中，其浓度为1.0mg/ml～10mg/ml；还要优选，其浓度为3.0mg/ml～7.0mg/ml，最优选，其浓度为4.0mg/ml～6.0mg/ml。
在本发明液体药物组合物中的，所述溶液渗透压维持剂优选蔗糖或葡萄糖。
在一个较佳的实施方案中，所述溶液渗透压维持剂是蔗糖。更佳地，在所述整个液体药物组合物中，其浓度为5.0mg/ml～50mg/ml(优选10mg/ml～30mg/ml)。在另一个较佳的实施方案中，所述溶液渗透压维持剂是葡萄糖。更佳地，在所述整个液体药物组合物中，其浓度为5.0mg/ml～50mg/ml(优选10mg/ml～30mg/ml)。
在本发明液体药物组合物中的，所述非离子表面活性剂优选聚山梨酯80或泊洛沙姆188。
在一个较佳的实施方案中，所述非离子表面活性剂是聚山梨酯80。更佳地，在所述整个液体药物组合物中，其浓度为0.1mg/ml～0.5mg/ml(优选0.1mg/ml～0.3mg/ml)。在另一个较佳的实施方案中，所述非离子表面活性剂是泊洛沙姆188。更佳地，在所述整个液体药物组合物中，其浓度为1.0mg/ml～5.0mg/ml(优选1.0mg/ml～3.0mg/ml)。
本发明另一方面还提供了一种无菌密封的容器，它装有所述稳定化的含有重组人血清白蛋白与干扰素α融合蛋白的液体药物组合物。
在一个优选的实施方案中，所述容器是一种预先注入的单剂量给药或者多剂量给药的注射器。在一个更优选的实施方案中，所述容器是一种预先注入的单剂量给药的注射器。
本发明所述液体药物组合物中的重组人血清白蛋白与干扰素α融合蛋白(即药物活性成分)能够稳定保存，并且本发明将所述液体药物组合物注入预装式注射器中，能使药物在生产、运输、储藏过程中更加稳定，医疗使用时更加安全和便利。
附图说明
图1显示了配方1～4成品在0天(25℃±2℃)时的SDS-PAGE电泳图与Western-blot的检测图(实施例4)。A表示不同配方的SDS-PAGE电泳图；B表示不同配方使用抗人血白蛋白一抗的Western-blot检测图；C表示不同配方使用抗干扰素α-2b一抗的Western-blot检测图。图中，M：Marker，1：配方1，2：配方2，3：配方4，4：配方3，5：人血白蛋白，6：干扰素α-2b。
图2显示了配方1～4成品在6个月(25℃±2℃)时的SDS-PAGE电泳图与Western-blot的检测图(实施例4)。A表示不同配方的SDS-PAGE电泳图；B表示不同配方使用抗人血白蛋白一抗的Western-blot检测图；C表示不同配方使用抗干扰素α-2b一抗的Western-blot检测图。图中，M：Marker，1：配方1，2：配方2，3：配方4，4：配方3，5：人血白蛋白，6：干扰素α-2b。
图3显示了配方7～9成品分别在0天、1个月、6个月、12个月、24个月(2℃～8℃)时的SDS-PAGE电泳图(实施例6)。A表示配方7成品的SDS-PAGE电泳图；B表示配方8成品的SDS-PAGE电泳图；C表示配方9成品的SDS-PAGE电泳图。图中，M：Marker(从上至下依次分别为116、66.2、45、35、25、18.4、14.4kDa)，1：0天，2：1个月，3：6个月，4：12个月，5：24个月。
图4显示了配方10～12成品分别在0天、1个月、6个月、12个月、24个月(2℃～8℃)时的SDS-PAGE电泳图(实施例6)。A表示配方10成品的SDS-PAGE电泳图；B表示配方11成品的SDS-PAGE电泳图；C表示配方12成品的SDS-PAGE电泳图。图中，M：Marker(从上至下依次分别为116、66.2、45、35、25、18.4、14.4kDa)，1：0天，2：1个月，3：6个月，4：12个月，5：24个月。
具体实施方案
具体而言，本发明提供了一种稳定化的液体药物组合物，它是由治疗有效量的重组人血清白蛋白与干扰素α融合蛋白、(较佳5.0mM～50mM，更佳10mM～40mM，还要佳20mM～30mM)pH值为5.5～8.5(更佳pH值为6.5～7.5、还要佳pH7.0～7.5)的缓冲液、溶液渗透压维持剂、非离子表面活性剂、以及药用防腐剂组成的。
需要说明的是，本发明液体药物组合物中所述的缓冲液、溶液渗透压维持剂、非离子表面活性剂、药用防腐剂都是药学上或者人体能够接受的药用辅料，并且都可以通过市售获得。
本发明液体药物组合物中的活性成分是重组人血清白蛋白与干扰素α融合蛋白，是指使用基因工程手段获得的一种重组融合蛋白。一般包括但不限于，重组人血清白蛋白与干扰素α-2a融合蛋白、重组人血清白蛋白与干扰素α-1b融合蛋白、或重组人血清白蛋白与干扰素α-2b融合蛋白。在本发明的一个实施方案中，使用了重组人血清白蛋白与干扰素α-2b融合蛋白作为本发明液体药物组合物的活性成分。
所述干扰素α可直接连接在人血清白蛋白的N末端或C末端形成重组融合蛋白(IFNα-HSA、或HSA-IFNα)；也可以通过一个连接肽(例如(G4S)n，n宜为3或4)连接两种蛋白，形成干扰素α-连接肽-人血清白蛋白融合蛋白(IFNα-L-HSA)、或人血清白蛋白-连接肽-干扰素α融合蛋白(HSA-L-IFNα)。考虑到连接肽毒理评价问题(如在体内增加新的免疫原性的可能性)尚存争议，本发明液体药物组合物中优选干扰素α(较佳干扰素α-2b)直接连接在人血清白蛋白的N末端或C末端形成的重组融合蛋白作为药物活性成分。
干扰素α(如干扰素α-2a、干扰素α-1b、或干扰素α-2b等)或者人血清白蛋白的氨基酸序列是本领域技术人员所熟知的，或者也可以通过搜索网上数据库(例如GenBank)获得。如无特别说明，本发明所述的各种“干扰素”或“IFN”都是指“人干扰素”。
本发明所述“干扰素α”或者“人血清白蛋白”多肽包括与其相同(同源)或基本相同(同源)的多肽，例如，有至少60％、较佳70％、更佳80％、还要佳90％、最佳95％以上的同源性或相同性的多肽，当然，其相同(同源)或基本相同(同源)的多肽与所述蛋白多肽应具有相同或相似的生物活性或功能。当然，所述“干扰素”或者“人血清白蛋白”多肽还包括与所述蛋白多肽具有相同或相似生物活性或功能的突变形式。这些突变形式包括但并不限于，相对于天然蛋白的氨基酸序列有若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代。
因此，所述重组人血清白蛋白与干扰素α融合蛋白也包括了上述相同(同源)或基本相同(同源)多肽的重组融合蛋白，以及上述突变形式多肽的重组融合蛋白。
此外，所述重组人血清白蛋白与干扰素α(较佳干扰素α-2b)融合蛋白的制备方法可以参考中国专利CN1405181、CN1583795或CN1896104，或者也可以通过市售直接获得。
在本发明液体药物组合物中，所述治疗有效量的重组人血清白蛋白与干扰素α融合蛋白的具体浓度(及剂量)可根据干扰素α、及其应用治疗疾病的种类等因素所决定，本领域技术人员可以很方便地通过有限次的实验确定。在所述整个液体药物组合物中，所述重组人血清白蛋白与干扰素α(较佳干扰素α-2b)融合蛋白的浓度一般为0.1mg/ml～2.5mg/ml，优选0.5mg/ml～1.8mg/ml，更优选0.8mg/ml～1.5mg/ml(即每毫升液体药物组合物中含有多少毫克的所述重组融合蛋白)；其中，所述重组融合蛋白的干扰素生物活性(比活性)优选2.5～7.5×105IU/mg，更优选3.0～7.0×105IU/mg，还要优选3.25～6.75×105IU/mg(即每毫克所述重组融合蛋白具有多少单位的干扰素生物活性)。
发明人考察了在不同pH值条件下重组人血清白蛋白与干扰素α(较佳干扰素α-2b)融合蛋白的稳定性(是否发生降解或者聚合)，经过25℃±2℃存放3个月，通过SDS-PAGE电泳方法检测发现，在pH5.5～8.5(更佳pH6.5～7.5，还要佳pH7.0～7.5)条件下重组人血清白蛋白与干扰素α(较佳干扰素α-2b)融合蛋白最为稳定。
因此，在本发明液体药物组合物中选用了pH值为5.5～8.5(更佳pH6.5～7.5，还要佳pH7.0～7.5)的缓冲液作为药用辅料之一。所述pH值为5.5～8.5(更佳pH6.5～7.5，还要佳pH7.0～7.5)的缓冲液是药学上或者人生理上可接受的，包括但不限于，磷酸缓冲液(磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液)、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、Tris-盐酸缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲液等。所述pH值为5.5～8.5(更佳pH6.5～7.5，还要佳pH7.0～7.5)的缓冲液的浓度应满足两个条件：①所述缓冲液的浓度足以使整个液体药物组合物的pH值维持在一个特定pH值(pH5.5～8.5，更佳pH6.5～7.5，还要佳pH7.0～7.5)±0.5(更佳±0.3，还要佳±0.2，最佳±0.1)个pH单位内；②所述缓冲液的浓度是人体可以接受的。一般，所述缓冲液的浓度优选5.0mM～50mM，更优选10mM～40mM，还要优选20mM～30mM。
在本发明一个优选的实施方案中，所述缓冲液是pH5.5～8.5(更佳pH6.5～7.5，还要佳pH7.0～7.5)的磷酸缓冲液(磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液)，其浓度为5.0mM～50mM(更佳10mM～40mM，还要佳20mM～30mM)。
术语“溶液渗透压维持剂”是指人生理上可耐受的，并且可以赋予所述液体药物组合物适宜的渗透压，使药物更容易吸收。一般所述溶液渗透压维持剂包括但不限于，多元醇(如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇、聚乙二醇)、糖类(如葡萄糖、蔗糖、乳糖、海藻糖)、盐类(如氯化钠)等，或其组合。其中，优选蔗糖、葡萄糖、氯化钠、或其组合。
在本发明一个较佳的实施方案中，所述溶液渗透压维持剂是蔗糖。更佳地，在所述整个液体药物组合物中，其浓度为5.0mg/ml～50mg/ml(还要佳10mg/ml～30mg/ml)。
在本发明另一个较佳的实施方案中，所述溶液渗透压维持剂是葡萄糖。更佳地，在所述整个液体药物组合物中，其浓度为5.0mg/ml～50mg/ml(还要佳10mg/ml～30mg/ml)。
在本发明一个更佳的实施方案中，所述溶液渗透压维持剂是蔗糖与氯化钠的组合。还要佳地，在所述整个液体药物组合物中，氯化钠的浓度为5.0mg/ml～10.0mg/ml(最佳6.0mg/ml～8.0mg/ml)，蔗糖的浓度为5.0mg/ml～50mg/ml(最佳10mg/ml～30mg/ml)。
在本发明另一个更佳的实施方案中，所述溶液渗透压维持剂是葡萄糖与氯化钠的组合。还要佳地，在所述整个液体药物组合物中，氯化钠的浓度为5.0mg/ml～10.0mg/ml(最佳6.0mg/ml～8.0mg/ml)，葡萄糖的浓度为5.0mg/ml～50mg/ml(最佳10mg/ml～30mg/ml)。
术语“药用防腐剂”是本领域技术人员所熟知的，它的作用是防止或抑制病原微生物的生长。药用防腐剂包括，但不限于，苯酚、硫柳汞、苯甲酸、山梨酸、对羟基苯甲酸酯类(尼泊金类)、苯甲醇、苯乙醇等，或其组合。药用防腐剂的用量一般与防腐剂的种类，药物的种类、剂型、pH值等多种因素有关。一般优选药用防腐剂的浓度为0.01％～3.0％(w/v)，即0.1mg/ml～30mg/ml。
在本发明一个优选的实施方案中，所述药用防腐剂是苯甲醇。更优选，在所述整个液体药物组合物中，其浓度为0.1％～1.0％(w/v)；还要优选，其浓度为0.3％～0.7％(w/v)，最优选，其浓度为0.4％～0.6％(w/v)。
术语“非离子表面活性剂”能降低液体表面张力，增加液体溶解度，改进药物的吸收与利用。常用的非离子表面活性剂包括但不限于，聚山梨酯(如聚山梨酯20、聚山梨酯40、聚山梨酯60、聚山梨酯80)、泊洛沙姆(如泊洛沙姆124、泊洛沙姆188、泊洛沙姆237、泊洛沙姆338、泊洛沙姆407)等，或其组合。
在本发明一个优选的实施方案中，所述非离子表面活性剂是聚山梨酯80。更优选，在所述整个液体药物组合物中，其浓度为0.01％～0.05％(w/v)(还要优选0.01％～0.03％(w/v))。
在本发明另一个优选的实施方案中，所述非离子表面活性剂是泊洛沙姆188。更优选，在所述整个液体药物组合物中，其浓度为1.0mg/ml～5.0mg/ml(还要优选1.0mg/ml～3.0mg/ml)。
优选地，本发明液体药物组合物是由治疗有效量(较佳0.1mg/ml～2.5mg/ml，更佳0.5mg/ml～1.8mg/ml，还要佳0.8mg/ml～1.5mg/ml)的重组人血清白蛋白与干扰素α(较佳干扰素α-2b)融合蛋白、(较佳5.0mM～50mM，更佳10mM～40mM，还要佳20mM～30mM)pH值为5.5～8.5(更佳pH6.5～7.5，还要佳pH7.0～7.5)的缓冲液、(较佳5mg/ml～50mg/ml，更佳10mg/ml～30mg/ml)葡萄糖或(较佳5mg/ml～50mg/ml，更佳10mg/ml～30mg/ml)蔗糖、(较佳0.01％～0.05％(w/v)，更佳0.01％～0.03％(w/v))聚山梨酯80或(较佳1.0mg/ml～5.0mg/ml，更佳1.0mg/ml～3.0mg/ml)泊洛沙姆188、以及(较佳0.1％～1.0％(w/v)，更佳0.3％～0.7％(w/v)，还要佳0.4％～0.6％(w/v))苯甲醇组成的。
更优选地，本发明液体药物组合物是由治疗有效量(较佳0.1mg/ml～2.5mg/ml，更佳0.5mg/ml～1.8mg/ml，还要佳0.8mg/ml～1.5mg/ml)的重组人血清白蛋白与干扰素α(较佳干扰素α-2b)融合蛋白、(较佳5.0mM～50mM，更佳10mM～40mM，还要佳20mM～30mM)pH值为5.5～8.5(更佳pH6.5～7.5，还要佳pH7.0～7.5)的缓冲液、(较佳5mg/ml～50mg/ml，更佳10mg/ml～30mg/ml)葡萄糖或(较佳5mg/ml～50mg/ml，更佳10mg/ml～30mg/ml)蔗糖、(较佳5.0mg/ml～10.0mg/ml，更佳6.0mg/ml～8.0mg/ml)氯化纳、(较佳0.01％～0.05％(w/v)，更佳0.01％～0.03％(w/v))聚山梨酯80或(较佳1.0mg/ml～5.0mg/ml，更佳1.0mg/ml～3.0mg/ml)泊洛沙姆188、以及(较佳0.1％～1.0％(w/v)，更佳0.3％～0.7％(w/v)，还要佳0.4％～0.6％(w/v))苯甲醇组成的。
本发明液体药物组合物中所述各组分所使用的浓度单位可以相互换算，例如1.0％(w/v)＝1.0g/100ml＝10mg/ml。因此，所附权利要求的范围也覆盖了其浓度单位的任何转换方式。
术语“稳定化”是指所述液体药物组合物中的重组人血清白蛋白与干扰素α融合蛋白的降解、聚合、修饰(包括去糖基化、糖基化、氧化等)、生物活性等的变化处在可控制(或者可接受)的范围之内，一般即所述液体药物制剂还可以安全用于人体，并且相应的疗效还能得到保证。在无菌密封的容器(优选预装式注射器)中，本发明液体药物组合物在2～8℃条件下较佳的储存期为至少36个月，更佳至少30个月，还要佳至少24个月，最佳至少18个月。
特别应该指出的是，发明人在进行所述液体药物组合物的稳定性考察时发现，重组人血清白蛋白与干扰素α(较佳干扰素α-2b)融合蛋白和普通干扰素的稳定性考察有很大的不同，不能简单地根据生物活性的测定结果来判断该药物组合物是否稳定。如发明人在进行6个月的加速试验(25℃±2℃)时(实施例4)，配方4成品的生物活性在6个月时并没有降低，反而比起始时增加10倍以上(超出了正常检测范围)。经对该样品进行SDS-PAGE与Western-blot分析后发现，重组人血清白蛋白与干扰素α-2b融合蛋白已有明显降解，并产生了与普通干扰素分子量一致的分解片段，说明使用该配方的成品并不稳定。如在人体使用时，将会因这种降解产物(非融合干扰素分解片段)的高度生物活性而产生严重的副作用，并由于其分子量小而被机体迅速清除，这同时就意味着也失去了重组人血清白蛋白与干扰素α-2b融合蛋白“长效”的优势。因此发明人设计了如表1的多个检测项目来判断所述重组人血清白蛋白与干扰素α融合蛋白的稳定性。
表1 重组人血清白蛋白与干扰素α融合蛋白稳定性实验测定项目与方法
| 检测项目 | 测定方法 | 方法来源 |
| 外观 | 可见异物检查法 | 《中华人民共和国药典》2005年版三部，附录VB。 |
| pH值 | 电位法(pH计) | 《中华人民共和国药典》2005年版三部，附录VA。 |
| 活性测定 | 细胞病变抑制法(WISH/VSV系统) | 《中华人民共和国药典》2005年版三部，附录XC。 |
| 电泳 | SDS-PAGE电泳 | 《中华人民共和国药典》2005年版三部，附录IVC。 |
| 无菌检测 | 无菌检查法 | 《中华人民共和国药典》2005年版三部，附录XIIA。 |
| 鉴别 | Western-blot | 《分子克隆实验指南》(第三版) |
为了进一步验证本发明液体药物组合物“长效”的优势，发明人将本发明实施例中配方1～3、配方7～12成品(注入预装式注射器中)于2～8℃条件下保存24～30个月，通过猕猴分别注射(SC或IV)不同剂量的上述药物成品，在0、0.5、1、3、6、10、24、48、96、144、192、240、288、336小时分别取1ml的加入抗凝剂(EDTA)的血(用于ELISA检测)。血样置冰浴上1小时，离心后取上清液，-20℃保存待测定。用ELISA试剂盒(美国PBL Biomedical Laboratories公司生产)测定血浆中融合蛋白含量，获得单次用药在猕猴体内的药代动力学资料。
本发明实施例中配方1～3、配方7～12成品的实验结果类似，一次单剂量50～300μg/kg给药，其血清浓度呈缓慢下降，半衰期为70-90小时，而文献报道的普通干扰素的半衰期为3-8小时。由此显示，本发明液体药物组合物在2～8℃条件下保存24～30个月后，其生物活性与“长效”优势都是稳定可靠的。
本发明所述液体药物组合物的剂型选自注射用水剂、喷雾剂、眼用液体制剂、鼻用液体制剂、外用溶液剂、口服液等，其中，优选注射用水剂。当所述液体药物组合物为一种注射用水剂时，其具体给药途径选自皮下注射、皮内注射、肌肉注射、静脉注射、静脉滴注等，其中，优选皮下注射。由于干扰素(特别是重组人血清白蛋白与干扰素融合蛋白)的疗效受到多种因素的影响，所以治疗要个性化，包括剂型、剂量、疗程的个性化，以达到良好的治疗效果。在本发明的一个实施方案中，所述液体药物组合物的活性成分为重组人血清白蛋白与干扰素α-2b融合蛋白，其剂型为注射用水剂，给药途径为皮下注射，治疗慢性乙型肝炎或者慢性丙型肝炎时，一般推荐剂量为1.0～1.2mg/次(比活性优选2.5～7.5×105IU/mg，更优选3.0～7.0×105IU/mg，还要优选3.25～6.75×105IU/mg)，每14天一次，治疗时间(疗程)至少一年。
本发明还提供了一种无菌密封的容器，它装有所述稳定化的含有重组人血清白蛋白与干扰素α融合蛋白的液体药物组合物。
在一个较佳的实施方案中，所述容器选自玻璃安瓿瓶、玻璃瓶、塑料瓶、预装式注射器等。考虑到使用时的安全、方便，在一个更佳的实施方案中，所述容器是一种预先注入的单剂量给药或者多剂量给药的注射器(预装式注射器)。在一个还要佳的实施方案中，所述容器是一种预先注入的单剂量给药的注射器(预装式注射器)。
下面将结合实施例进一步详细地描述本发明。然而应当理解，列举这些实施例只是为了起说明作用，而并不是用来限制本发明的范围。
实施例1重组人血清白蛋白与干扰素α-2b融合蛋白的制备
具体方法参考中国专利CN1405181、CN1583795或CN1896104。本发明配制液体药物组合物时，所使用的重组人血清白蛋白与干扰素α-2b融合蛋白(HSA-IFNα-2b)由浙江德清安平生物制药有限公司提供。质检报告：分子量85.7kDa±8.5kDa，总蛋白浓度不低于1.5mg/ml，比活性不低于3.25×105IU/mg蛋白，纯度不低于95.0％。
实施例2含有重组人血清白蛋白与干扰素α-2b融合蛋白注射用水剂的配方
实施例1的重组人血清白蛋白与干扰素α-2b融合蛋白(HSA-IFNα-2b)与若干药用辅料的配方如下：
配方1：HSA-IFNα-2b 1.2mg，蔗糖20mg，泊洛沙姆188 2.0mg，苯甲醇4.0mg，用20mM pH7.5的磷酸缓冲液加至1ml。
配方2：HSA-IFNα-2b 1.2mg，葡萄糖20mg，聚山梨酯80 0.2mg，苯甲醇6.0mg，用30mM pH6.5的磷酸缓冲液加至1ml。
配方3：HSA-IFNα-2b 1.2mg，氯化钠7.0mg，蔗糖20mg，聚山梨酯80 0.2mg，苯甲醇5.0mg，用25mM pH7.2的磷酸缓冲液加至1ml。
配方4：HSA-IFNα-2b 1.0mg，氯化钠7.0mg，蔗糖20mg，苯甲醇5.0mg，用25mM pH7.2的磷酸缓冲液加至1ml。
配方5：HSA-IFNα-2b 1.0mg，泊洛沙姆188 2.0mg，苯甲醇5.0mg，用25mMpH7.0的磷酸缓冲液加至1ml。
配方6：HSA-IFNα-2b 1.0mg，葡萄糖20mg，苯甲醇5.0mg，用25mM pH7.0的磷酸缓冲液加至1ml。
上述磷酸缓冲液(磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液)是用注射用水配制而成的。
实施例3含有重组人血清白蛋白与干扰素α-2b融合蛋白注射用水剂的配制
分别根据实施例2的配方1～6，先用较小体积的磷酸缓冲液溶解药用辅料，再加入实施例1的重组人血清白蛋白与干扰素α-2b融合蛋白(HSA-IFN α-2b)，最后用相同浓度及pH值的磷酸缓冲液定容。过滤除菌后以1ml/支的规格分别注入预装式注射器(美国BD Pharmaceutical systems的预灌封注射器)中(过滤和分装在局部100级的环境中进行)，装上注射器的推杆，贴标签，制得含有重组人血清白蛋白与干扰素α-2b融合蛋白注射用水剂成品，用于实施例4的加速稳定性实验。
实施例4含有重组人血清白蛋白与干扰素α-2b融合蛋白注射用水剂的加速稳定性实验(25℃±2℃)
将配方1～6含有重组人血清白蛋白与干扰素α-2b融合蛋白注射用水剂(实施例3)在25℃±2℃条件下(SPX-250C型恒温恒湿培养箱，上海博讯医疗设备有限公司医疗设备厂)存放6个月，分别于0天、1个月、2个月、3个月、6个月取样检测，考察项目包括外观、pH值、生物活性(比活性)、无菌检测(表2、表3)。
表2 分别按照配方1～3制得的注射用水剂成品的稳定性实验(25℃±2℃)
表3 分别按照配方4～6制得的注射用水剂成品的稳定性实验(25℃±2℃)
注：----表示干扰素生物活性太高超出了正常检测范围。
从实验结果见表2与表3可知，配方5、配方6成品的干扰素生物活性(比活性)在3个月、6个月(25℃±2℃)时都有明显下降；而配方1～3成品的干扰素生物活性(比活性)一直都较稳定；配方4成品在6个月(25℃±2℃)时干扰素生物活性(比活性)太高超出了正常检测范围，这一点很出乎发明人的意料。为了更好地考察配方4成品中重组融合蛋白的稳定性，发明人对于配方1～4成品在0天、6个月(25℃±2℃)时分别进行SDS-PAGE电泳与Western-blot的检测(图1、图2)。
从实验结果图1与图2可知，配方1～3成品中的重组融合蛋白在6个月(25℃±2℃)时都很稳定，没有出现条带异常。而对配方4成品进行Western-blot分析后发现，重组融合蛋白已有明显降解，并产生了与普通干扰素α-2b分子量一致的分解片段，说明在该配方条件下产品并不稳定。如在人体使用时，将会因这种降解产物(非融合干扰素α-2b分解片段)的高生物活性而产生严重的副作用，并由于其分子量小而被机体迅速清除，这同时就意味着也失去了重组人血清白蛋白与干扰素α-2b融合蛋白“长效”的优势。
因此，综合以上实验结果，发明人确定了本发明液体药物组合物是由治疗有效量的重组人血清白蛋白与干扰素α(较佳干扰素α-2b)融合蛋白、pH值为5.5～8.5(更佳pH6.5～7.5、还要佳pH7.0～7.5)的缓冲液(优选磷酸缓冲液)、溶液渗透压维持剂(优选蔗糖、或葡萄糖，更优选蔗糖与氯化钠组合、或葡萄糖与氯化钠组合)、非离子表面活性剂(优选聚山梨酯80、或泊洛沙姆188)、以及药用防腐剂(优选苯甲醇)组成的。
实施例5含有重组人血清白蛋白与干扰素α-2b融合蛋白注射用水剂的配方及其配制
实施例1的重组人血清白蛋白与干扰素α-2b融合蛋白(HSA-IFNα-2b)与若干药用辅料的配方如下：
配方7：HSA-IFNα-2b 1.0mg，蔗糖10mg，聚山梨酯80 0.1mg，苯甲醇6.0mg，用10mM pH7.2的磷酸缓冲液加至1ml。
配方8：HSA-IFNα-2b 1.0mg，蔗糖40mg，聚山梨酯80 0.4mg，苯甲醇6.0mg，用20mM pH7.2的磷酸缓冲液加至1ml。
配方9：HSA-IFNα-2b 1.0mg，葡萄糖10mg，泊洛沙姆188 4.0mg，苯甲醇5.0mg，用30mM pH7.2的磷酸缓冲液加至1ml。
配方10：HSA-IFNα-2b 1.2mg，葡萄糖40mg，泊洛沙姆188 1.0mg，苯甲醇5.0mg，用40mM pH7.2的磷酸缓冲液加至1ml。
配方11：HSA-IFNα-2b 1.2mg，氯化钠6.0mg，葡萄糖30mg，聚山梨酯80 0.3mg，苯甲醇4.0mg，用25mM pH7.0的磷酸缓冲液加至1ml。
配方12：HSA-IFNα-2b 1.2mg，氯化钠8.0mg，蔗糖30mg，，泊洛沙姆188 3.0mg，苯甲醇4.0mg，用15mM pH7.0的磷酸缓冲液加至1ml。
上述磷酸缓冲液(磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液)是用注射用水配制而成的。
分别根据上述配方7～12，先用较小体积的磷酸缓冲液溶解药用辅料，再加入实施例1的重组人血清白蛋白与干扰素α-2b融合蛋白(HSA-IFN α-2b)，最后用相同浓度及pH值的磷酸缓冲液定容。过滤除菌后以1ml/支的规格分别注入预装式注射器(美国BD Pharmaceutical systems的预灌封注射器)中(过滤和分装在局部100级的环境中进行)，装上注射器的推杆，贴标签，制得含有重组人血清白蛋白与干扰素α-2b融合蛋白注射用水剂成品，用于实施例6的长期稳定性实验。
实施例6含有重组人血清白蛋白与干扰素α-2b融合蛋白注射用水剂的长期稳定性实验(2℃～8℃)
将配方7～12含有重组人血清白蛋白与干扰素α-2b融合蛋白注射用水剂(实施例5)在2℃～8℃条件下(BC/B-518A型海尔冷柜，海尔电器有限公司)存放24个月，分别于0天、1个月、6个月、12个月、24个月取样检测，考察项目包括外观、pH值、生物活性(比活性)、无菌检测(表4、表5)，SDS-PAGE电泳(图3、图4)。
表4 分别按照配方7～9制得的注射用水剂成品的稳定性实验(2℃～8℃)
表5 分别按照配方10～12制得的注射用水剂成品的稳定性实验(2℃～8℃)
从实验结果表4与表5、图3与图4可知，在2℃～8℃条件下经过24个月，配方7～12成品的各项检测指标都很稳定。该实验结果表明在2℃～8℃条件下配方7～12成品(液体药物组合物)至少在24个月内，其稳定性是可以得到保证的，可以安全有效地运用到临床医疗中。
尽管本发明描述了具体的例子，但是有一点对于本领域技术人员来说是明显的，即在不脱离本发明的精神和范围的前提下可对本发明作各种变化和改动。因此，所附权利要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。
Claims (25)
1.一种稳定化的液体药物组合物，其特征在于，它是由治疗有效量的重组人血清白蛋白与干扰素α融合蛋白、pH值为5.5～8.5的缓冲液、溶液渗透压维持剂、非离子表面活性剂、以及药用防腐剂组成的；
所述的溶液渗透压维持剂选自：5.0mg/ml～50mg/ml蔗糖、5.mg/ml～50mg/ml葡萄糖、5.0mg/ml～50mg/ml蔗糖与5.0mg/ml～10mg/ml氯化钠的组合、或5.0mg/ml～50mg/ml葡萄糖与5.0mg/ml～10mg/ml氯化钠的组合；
所述的非离子表面活性剂选自：0.1mg/ml～0.5mg/ml聚山梨酯80、或1.0mg/ml～5.0mg/ml泊洛沙姆188。
2.根据权利要求1所述的液体药物组合物，其特征在于，所述缓冲液是pH值为6.5～7.5的缓冲液。
3.根据权利要求2所述的液体药物组合物，其特征在于，所述缓冲液是pH值为7.0～7.5的缓冲液。
4.根据权利要求1所述的液体药物组合物，其特征在于，所述缓冲液是pH值为5.5～8.5的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液。
5.根据权利要求4所述的液体药物组合物，其特征在于，所述缓冲液是pH值为6.5～7.5的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液。
6.根据权利要求5所述的液体药物组合物，其特征在于，所述缓冲液是pH值为7.0～7.5的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液。
7.根据权利要求1-6任一项所述的液体药物组合物，其特征在于，所述缓冲液的浓度为5.0mM～50mM。
8.根据权利要求7所述的液体药物组合物，其特征在于，所述缓冲液的浓度为10mM～40mM。
9.根据权利要求8所述的液体药物组合物，其特征在于，所述缓冲液的浓度为20mM～30mM。
10.根据权利要求1所述的液体药物组合物，其特征在于，所述重组人血清白蛋白与干扰素α融合蛋白中的干扰素α选自干扰素α-2a、干扰素α-1b、或干扰素α-2b。
11.根据权利要求1或10所述的液体药物组合物，其特征在于，所述重组人血清白蛋白与干扰素α融合蛋白的浓度为0.1mg/ml～2.5mg/ml。
12.根据权利要求11所述的液体药物组合物，其特征在于，所述重组人血清白蛋白与干扰素α融合蛋白的浓度为0.5mg/ml～1.8mg/ml。
13.根据权利要求12所述的液体药物组合物，其特征在于，所述重组人血清白蛋白与干扰素α融合蛋白的浓度为0.8mg/ml～1.5mg/ml。
14.根据权利要求1所述的液体药物组合物，其特征在于，所述药用防腐剂是苯甲醇，在所述整个液体药物组合物中，所述苯甲醇的浓度为1.0mg/ml～10mg/ml。
15.根据权利要求14所述的液体药物组合物，其特征在于，所述苯甲醇的浓度为3.0mg/ml～7.0mg/ml。
16.根据权利要求15所述的液体药物组合物，其特征在于，所述苯甲醇的浓度为4.0mg/ml～6.0mg/ml。
17.根据权利要求1所述的液体药物组合物，其特征在于，所述氯化钠的浓度为6.0mg/ml～8.0mg/ml。
18.根据权利要求1所述的液体药物组合物，其特征在于，所述蔗糖的浓度为10mg/ml～30mg/ml。
19.根据权利要求1所述的液体药物组合物，其特征在于，所述葡萄糖的浓度为10mg/ml～30mg/ml。
20.根据权利要求1所述的液体药物组合物，其特征在于，所述聚山梨酯80的浓度为0.1mg/ml～0.3mg/ml。
21.根据权利要求1所述的液体药物组合物，其特征在于，所述泊洛沙姆188的浓度为1.0mg/ml～3.0mg/ml。
22.根据权利要求1所述的液体药物组合物，其特征在于，所述液体药物组合物的剂型选自注射用水剂、喷雾剂、眼用液体制剂、鼻用液体制剂、外用溶液剂、或口服液。
23.一种无菌密封的容器，其特征在于，它含有权利要求1-22任一项所述稳定化的液体药物组合物。
24.根据权利要求23所述的无菌密封容器，其特征在于，所述容器选自玻璃安瓿瓶、玻璃瓶、塑料瓶、或预装式注射器。
25.根据权利要求23所述的无菌密封容器，其特征在于，所述容器是一种预先注入的单剂量给药或者多剂量给药的注射器。
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