CN101099722A

CN101099722A - 含有重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白的注射用水剂

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Publication number: CN101099722A
Application number: CNA2006100523654A
Authority: CN
Inventors: 黄岩山; 马国昌; 杨志愉; 王同映; 徐飞虎
Original assignee: JIUYUAN GENE ENGINEERING Co Ltd HANGZHOU
Current assignee: JIUYUAN GENE ENGINEERING Co Ltd HANGZHOU
Priority date: 2006-07-07
Filing date: 2006-07-07
Publication date: 2008-01-09
Anticipated expiration: 2026-07-07
Also published as: CN100542611C

Abstract

本发明提供了一种含有重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白的注射用水剂，所述注射用水剂由重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白与药学上可接受的稳定性辅料溶于pH5～8的药学上可接收的缓冲液中得到，所述重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白浓度为0.1～5mg/mL，所述的稳定性辅料为甘氨酸或甲硫氨酸。本发明所述的含有重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白的注射用水剂的有益效果主要体现在：提供了一种能稳定保存rHSA-IFNα蛋白注射用水剂，并适合于实际临床使用。

Description

含有重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白的注射用水剂

(一)技术领域

本发明涉及一种含有重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白(rHSA-IFNα)的注射用水剂，适用于皮下或静脉等途径给药，作为免疫调节剂用于治疗病毒感染性疾病，肿瘤及相关疾病。

(二)背景技术

IFN是临床上应用于抗病毒最为广泛的药物，可应用于治疗人的丙型肝炎、乙型肝炎、恶性肿瘤以及与艾滋病相关的Kaposi′s肉瘤等临床病症。IFNα能有效抑制乙型和丙型肝炎病毒的复制和降低患者血浆转氨酶。然而，作为一个小分子蛋白，IFNα从血浆中清除的速度较快，其清除相半衰期为注射后的3～8h，24h后在血浆中就已检测不到IFNα的存在，这对治疗是极为不利的。

IFN用于肝炎治疗时，通常为每天一次或每周二次注射，但是在大部分治疗时间内，患者体内IFN浓度是低于有效浓度的，而另一方面，在给药后，血药浓度达到峰值时，其药物浓度又是远高于有效浓度，这就会产生明显的副反应。为了增加IFNα在体内的半衰期，现在广泛采用的是PEG修饰法，目前已有40kD左右PEG修饰的IFNα2a(

，Roche)和12kD左右PEG修饰的IFNα2b(PEG-Intron，Schering-Plough)应用于临床。这两类产品均可明显延长IFNα(在体内的半衰期。众所周知PEG修饰在蛋白分子的赖氨酸残基上，IFNα含有10～11个赖氨酸，因此PEG修饰可以形成不同的异构体。这种众多异构体混合物造成不同的生理反应。虽然，利用定点基因突变的方法引入一个半胱氨酸(Q5C)，并在此半胱氨酸上进行PEG修饰，从而可以实现单价定位修饰。但是，这种突变的IFNα的免疫原性需要进一步进行人体评价。

人血清白蛋白(Human serum albumin，HSA)是人体血清中的主要成分，对维持体内渗透压和血浆体积起着至关重要的作用。人血清白蛋白是分子量为6615kD的非糖基化蛋白，肾清除率非常低，体内半衰期为14～20d。它也是体内因子和药物转运的天然载体。研究表明将治疗性蛋白基因与人血清白蛋白基因融合所表达的融合蛋白可明显降低体内药物的清除速率，延长生物半衰期。Yeh等发现，克鲁维氏酵母表达的HSA-CD4融合蛋白在以家兔为动物模型的实验中半衰期比单独的CD4延长了140倍。而克鲁维氏酵母表达的HSA-IFNα的融合蛋白(albuferon)在猕猴体内的半衰期比单独的IFNα延长了大约18倍。

rHSA-IFNα的制备方法有许多文献报道(吴军等：中国专利01124110.1；BLAIRE L.等，THE JOURNAL OF PHARMACOLOGY ANDEXPERIMENTAL THERAPEUTICS.2002，303：540-548)，通过将人血清白蛋白的基因与人干扰素α基因融合在一起，选择合适重组表达方法即可获得相应的融合蛋白。该融合蛋白结构中，人血清白蛋白位于N端，C末端可以直接与人干扰素α的N端相连，也可以通过柔性的连接肽序列使两个蛋白相连。

融合后形成的重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白克服了传统的干扰素治疗过程中多次给药的缺点；并具有以下几个优点：1)能刺激机体对病毒感染的免疫应答；2)延长干扰素在体内的存留时间；3)起最大的治疗作用、减小传统干扰素的潜在副作用或毒性、还可提高疗效。

但是，作为蛋白药物，rHSA-IFNα其稳定性还是无法与常规化学药物相比(Panayotatos；Nikos，1998，US 5846935)，其活性在长期贮存时还是会受到多种环境因素的影响。例如对温度，氧和紫外线高度敏感。由于这些因子的作用，可能发生多种物理或化学变化，例如结合，聚合，和氧化从而大大丧失活性。因此如果贮存期间rHSA-IFNα的稳定性不能保证的话，会导致给药剂量的变化从而影响疗效。

因此，研究出一种能稳定保存rHSA-IFNα蛋白，并适合于实际临床使用的药物制剂是极其有意义的。但是，到目前为止，尚未有这方面的研究报道。

(三)发明内容

本发明既是为了提供一种能稳定保存rHSA-IFNα蛋白，并适合于实际临床使用的含有重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白的注射用水剂。

为达到发明目的本发明采用的技术方案是：

一种含有重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白的注射用水剂，所述注射用水剂由重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白与药学上可接受的稳定性辅料溶于pH5～8的药学上可接收的缓冲液中得到，所述重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白浓度为0.1～5mg/mL。

重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白的制备方法可参考相关的文献(吴军等：中国专利01124110.1；BLAIRE L.等，THE JOURNAL OFPHARMACOLOGY AND EXPERIMENTAL THERAPEUTICS.2002，303：540-548)。其中，所述的干扰素α为干扰素α2a、干扰素α1b、干扰素α2b或干扰素αcon，优选干扰素α2b。

所述稳定性辅料可根据需要酌情添加，如氨基酸类和糖类等。本发明中优选稳定性辅料为甘氨酸或甲硫氨酸，优选甘氨酸质量浓度为1～4％，更优选甘氨酸质量浓度为2.3％。

所述重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白浓度为0.5～2mg/mL。

所述缓冲液为磷酸盐缓冲液、或Tris-HCl缓冲液、或醋酸-醋酸钠缓冲液。所述缓冲液优选为磷酸盐缓冲液，浓度为5～100mmol/L。

优选的，所述注射用水剂由重组人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白与甘氨酸溶于pH5～8的浓度为5～100mmol/L磷酸盐缓冲液中得到，所述重组人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白浓度为0.5～2mg/mL，所述甘氨酸质量浓度为1～4％。

更优选的，所述注射用水剂由重组人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白与甘氨酸溶于pH6.5、浓度10mmol/L的磷酸盐缓冲液中得到，所述重组人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白浓度为0.5mg/mL，所述甘氨酸质量浓度为2.3％。

本发明还公开了含有重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白的注射用水剂在制备用于治疗乙型肝炎、丙型肝炎等病毒性肝炎的药物中的应用。鸭乙肝模型实验证明重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白的注射用水剂具有良好的抗乙肝病毒疗效。

本发明所述的含有重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白的注射用水剂的有益效果主要体现在：提供了一种能稳定保存rHSA-IFNα蛋白注射用水剂，并适合于实际临床使用。

(四)附图说明

图1为样品在不同pH缓冲液中，在40℃条件下，存放二周(a)、四周(b)时取样进行SDS-PAGE检测而得到的电泳图；

图2为不同浓度的样品，在40℃条件下，存放二周(a)、四周(b)时取样进行SDS-PAGE检测而得到的电泳图；

图3为不同浓度的样品，在4℃条件下，存放一年后取样进行SDS-PAGE检测而得到的电泳图。

(五)具体实施方式

为了提高含有rHSA-IFNα药剂的稳定性，进行了深入的研究并且发现如果从合适的辅料(如糖类，氨基酸及其衍生物、表面活性剂等)和无机盐类中挑选至少一种加入制剂中，并通过选择合适的pH及rHSA-IFNα蛋白浓度，则可以有效达到这个目的。

在rHSA-IFNα药剂稳定性研究过程中，选取了澄清度检测，SDS-PAGE电泳检测，蛋白浓度，反相高效液相色谱分析，生物活性检测等作为考察指标，来观察rHSA-IFNα药剂的变化情况。这些方法均可从《中国药典，2005年版》获得。

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：pH对rHSA-IFNα2b稳定性的影响

可注射药物制剂中pH是影响蛋白制品稳定性的一个重要因素。通过加入合适的缓冲盐类，来维持制剂pH。如加入磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐、巴比妥盐、三羟甲基氨基甲烷、硼酸盐、琥珀酸盐等。为了考察不同pH条件下制剂的稳定性，按如下条件进行了不同pH条件对制剂稳定性的影响实验：

实验条件：1ml/瓶(蛋白浓度为1mg/ml)各组中含有不同pH的缓冲液

①pH＝4.0(醋酸-醋酸钠缓冲液)，10mmol/L

②pH＝5.0(醋酸-醋酸钠缓冲液)，10mmol/L

③pH＝6.5(磷酸缓冲液)，5mmol/L

④pH＝6.5(磷酸缓冲液)，10mmol/L

⑤pH＝6.5(磷酸缓冲液)，100mmol/L

⑥pH＝7.5(磷酸缓冲液)，10mmol/L

⑦pH＝8.0(Tris-HCl缓冲液)，10mmol/L

避光放置于40℃的恒温箱中，共进行四周，每隔两周取样分析。

检测方法：SDS-PAGE非还原电泳方法

结果见图1。

40℃的加速试验表明，低pH可以抑制聚体的形成，但会加速降解的产生；高pH会加速聚体的形成，也不能减少降解蛋白的生成；在pH为5.0和6.5时，样品相对比较稳定，产生的聚体和降解条带都较少。考虑到人体环境的pH值为7.0左右，为了与人体条件相近，最终选择6.5为样品制剂的pH条件。而且，在5-100mmol/L浓度范围内的磷酸缓冲液，其结果基本一致，但为了使制剂总体渗透压适于人体应用，并且又能保持一定的缓冲能力，最终控制其在制剂中的浓度为10mmol/L。

实施例2：添加不同制剂辅料对rHSA-IFNα2b稳定性的影响

一般适合蛋白制剂应用的辅料有白蛋白、糖类、氨基酸类、表面活性剂、金属螯合剂等。本发明选择了一些适合于人体应用的辅料进行了筛选。人血清白蛋白因为存在潜在的血源性污染问题，而且我们的制剂本来就包含了白蛋白，因此就不予以考虑。

适用于本发明的糖类可选择多种单糖，寡糖和多糖及磷脂和核苷酸衍生物。例如甘油，甘露糖醇，蔗糖等。这些糖类，可以单独添加，也可以联合使用。

适用于本发明的多肽、氨基酸及衍生物可以从下述一组物质中选择而来的：甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苏氨酸、色氨酸、赖氨酸、羟赖氨酸、组氨酸、精氨酸、胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸等以及它们的衍生物。

为了考察不同辅料对制剂的稳定性的影响，按如下条件对不同辅料进行了筛选。本发明所筛选的辅料配方见表1(表中百分比浓度为质量百分比浓度)。称取所需量的辅料，或量取配制好的浓的辅料储备溶液。将辅料固体或辅料储备溶液加入到合适的缓冲液(pH6.5的磷酸缓冲液)中，然后加入用适当缓冲液(pH6.5的磷酸缓冲液)配的高浓度rHSA-IFNα2b蛋白溶液，再用1mol/l HCL或10％NaOH调节至所需pH值，以获得一定体积含10mmol/L pH6.5的磷酸缓冲液、蛋白浓度为0.5mg/ml的样品溶液。将配好的样品溶液分成两批，每批有12种样品，每种样品各5瓶，0.5ml/瓶。一批用作初始T＝0分析，然后于4℃保存。另一批40℃保存，考察4个月，每个月做分析检测。

表1：辅料组成表

组别	辅料	处方浓度
组别	辅料	处方浓度	1	葡萄糖	5％
2	蔗糖	5％	1	葡萄糖	5％
2	蔗糖	5％	3	甘露醇	5％
4	甘氨酸-1	1％	3	甘露醇	5％
4	甘氨酸-1	1％	5	甘氨酸-2	2.3％
6	甘氨酸-3	4％	5	甘氨酸-2	2.3％
6	甘氨酸-3	4％	7	甲硫氨酸	2.3％
8	EDTA	5mmol/L	7	甲硫氨酸	2.3％
8	EDTA	5mmol/L	9	吐温-80	0.005％
10	蔗糖+吐温-80	5％，0.005％	9	吐温-80	0.005％
10	蔗糖+吐温-80	5％，0.005％	11	甘露醇+EDTA	5％，5mmol/L
12	NaCl	0.8％	11	甘露醇+EDTA	5％，5mmol/L

以下为不同配方稳定性实验结果：

(1)样品的澄明度

表2、3均显示样品在4℃和40℃条件下存放4个月后，没有浑浊现象产生。

表2：样品在4℃条件下存放4个月，每隔一个月检测样品的澄明度

组别	T-0月	T-1月	T-2月	T-3月	T-4月
组别	T-0月	T-1月	T-2月	T-3月	T-4月	1	无色澄清	无色澄清	无色澄清	无色澄清	无色澄清
2	无色澄清	无色澄清	无色澄清	无色澄清	无色澄清	1	无色澄清	无色澄清	无色澄清	无色澄清	无色澄清
2	无色澄清	无色澄清	无色澄清	无色澄清	无色澄清	3	无色澄清	无色澄清	无色澄清	无色澄清	无色澄清
4	无色澄清	无色澄清	无色澄清	无色澄清	无色澄清	3	无色澄清	无色澄清	无色澄清	无色澄清	无色澄清
4	无色澄清	无色澄清	无色澄清	无色澄清	无色澄清	5	无色澄清	无色澄清	无色澄清	无色澄清	无色澄清
6	无色澄清	无色澄清	无色澄清	无色澄清	无色澄清	5	无色澄清	无色澄清	无色澄清	无色澄清	无色澄清
6	无色澄清	无色澄清	无色澄清	无色澄清	无色澄清	7	无色澄清	无色澄清	无色澄清	无色澄清	无色澄清
8	无色澄清	无色澄清	无色澄清	无色澄清	无色澄清	7	无色澄清	无色澄清	无色澄清	无色澄清	无色澄清
8	无色澄清	无色澄清	无色澄清	无色澄清	无色澄清	9	无色澄清	无色澄清	无色澄清	无色澄清	无色澄清
10	无色澄清	无色澄清	无色澄清	无色澄清	无色澄清	9	无色澄清	无色澄清	无色澄清	无色澄清	无色澄清
10	无色澄清	无色澄清	无色澄清	无色澄清	无色澄清	11	无色澄清	无色澄清	无色澄清	无色澄清	无色澄清
12	无色澄清	无色澄清	无色澄清	无色澄清	无色澄清	11	无色澄清	无色澄清	无色澄清	无色澄清	无色澄清

表3：样品在40℃条件下存放4个月，每隔一个月检测样品的澄明度

(2)电泳杂质检测

利用SDS-PAGE的方法，每隔一个月取样检测。表4显示样品在4℃条件下存放4个月内没有降解和聚体产生；表5显示样品在40℃加速条件下，只有含甘氨酸和甲硫氨酸的样品相对较稳定，一直到4个月时才有降解和聚体发生。

表4：样品在4℃条件下存放4个月，每隔一个月用SDS-PAGE检测

组别	T-0月	T-1月	T-2月	T-3月	T-4月
组别	T-0月	T-1月	T-2月	T-3月	T-4月	1	无	无	无	无	无
2	无	无	无	无	无	1	无	无	无	无	无
2	无	无	无	无	无	3	无	无	无	无	无
4	无	无	无	无	无	3	无	无	无	无	无
4	无	无	无	无	无	5	无	无	无	无	无
6	无	无	无	无	无	5	无	无	无	无	无
6	无	无	无	无	无	7	无	无	无	无	无
8	无	无	无	无	无	7	无	无	无	无	无
8	无	无	无	无	无	9	无	无	无	无	无
10	无	无	无	无	无	9	无	无	无	无	无
10	无	无	无	无	无	11	无	无	无	无	无
12	无	无	无	无	无	11	无	无	无	无	无

表5：样品在40℃条件下存放4个月，每隔一个月用SDS-PAGE检测

组别	T-0月	T-1月	T-2月	Y-3月	T-4月
组别	T-0月	T-1月	T-2月	Y-3月	T-4月	1	无	无	有	有	有
2	无	无	有	有	有	1	无	无	有	有	有
2	无	无	有	有	有	3	无	无	无	有	有
4	无	无	无	无	有	3	无	无	无	有	有
4	无	无	无	无	有	5	无	无	无	无	有
6	无	无	无	无	有	5	无	无	无	无	有
6	无	无	无	无	有	7	无	无	无	有	有
8	无	无	有	有	有	7	无	无	无	有	有
8	无	无	有	有	有	9	无	有	有	有	有
10	无	无	有	有	有	9	无	有	有	有	有
10	无	无	有	有	有	11	无	无	有	有	有
12	无	无	有	有	有	11	无	无	有	有	有

(3)RP-HPLC检测

利用RP-HPLC的方法，每隔一个月取样检测。表5显示样品在4℃条件下存放4个月内稳定性较好，样品纯度没有发生大的变化；而在40℃加速条件下，只有含有甘氨酸的样品纯度没有发生大的变化，其它样品的纯度都有较大的降低。

表6：样品在40℃条件下存放4个月，每隔一个月用RP-HPLC检测

组别	T-0月4℃(％)	T-1月4℃(％)	T-2月4℃(％)	T-3月4℃(％)	T-4月4℃(％)	T-1月40℃(％)	T-2月40℃(％)	T-3月40℃(％)	T-4月40℃(％)
组别	T-0月4℃(％)	T-1月4℃(％)	T-2月4℃(％)	T-3月4℃(％)	T-4月4℃(％)	T-1月40℃(％)	T-2月40℃(％)	T-3月40℃(％)	T-4月40℃(％)	1	98.3	98.1	98.1	98.2	97.1	93.6	88.6	82.2	76.8
2	98.1	98.2	97.2	96.3	97.1	95.8	87.5	81.3	70.6	1	98.3	98.1	98.1	98.2	97.1	93.6	88.6	82.2	76.8
2	98.1	98.2	97.2	96.3	97.1	95.8	87.5	81.3	70.6	3	98.5	98.1	98.2	96.4	96.7	97.3	92.5	85.6	78.7
4	98.3	98.2	97.8	98.3	98.0	95.9	94.1	93.2	89.3	3	98.5	98.1	98.2	96.4	96.7	97.3	92.5	85.6	78.7
4	98.3	98.2	97.8	98.3	98.0	95.9	94.1	93.2	89.3	5	98.5	98.9	98.2	98.0	98.1	96.1	94.8	94.1	91.2
6	98.3	98.6	97.6	98.3	98.5	95.4	93.8	92.6	90.3	5	98.5	98.9	98.2	98.0	98.1	96.1	94.8	94.1	91.2
6	98.3	98.6	97.6	98.3	98.5	95.4	93.8	92.6	90.3	7	98.2	97.9	98.2	98.0	97.1	96.1	92.8	89.1	85.2
8	98.3	98.4	97.7	97.3	96.2	96.3	89.5	81.2	73.6	7	98.2	97.9	98.2	98.0	97.1	96.1	92.8	89.1	85.2
8	98.3	98.4	97.7	97.3	96.2	96.3	89.5	81.2	73.6	9	98.1	97.6	96.1	95.1	93.2	94.6	90.1	85.2	75.2
10	98.5	98.1	97.2	97.3	96.5	97.3	89.2	81.1	75.8	9	98.1	97.6	96.1	95.1	93.2	94.6	90.1	85.2	75.2
10	98.5	98.1	97.2	97.3	96.5	97.3	89.2	81.1	75.8	11	98.3	97.8	97.1	96.6	95.8	96.8	88.9	79.8	73.6
12	98.2	98.0	97.5	96.9	96.4	97.2	86.3	82.5	75.6	11	98.3	97.8	97.1	96.6	95.8	96.8	88.9	79.8	73.6

(4)生物学活性(效价)

根据以上各项研究结果显示，含有甘氨酸或甲硫氨酸的样品最稳定，因此只对含有甘氨酸或甲硫氨酸的样品进行效价评估。样品在4℃与40℃条件下存放4个月后分别取样进行生物学活性检测。结果(表7)显示所有制剂的效价都在规定范围内，表明发生的化学和物理降解过程没有显著改变该蛋白质的效价活性，其中又以甘氨酸的效果较佳，并且不同浓度的甘氨酸在制剂中对蛋白的生物学活性的影响作用几乎是一样的。

表7：不同处方样品在4℃与40℃条件存放4个月后进行生物学活性检测

组别	存放温度	％效价
组别	存放温度	％效价	4	4℃	102.2
4	40℃	85.3	4	4℃	102.2
4	40℃	85.3	5	4℃	105.2
5	40℃	89.5	5	4℃	105.2
5	40℃	89.5	6	4℃	103.4
6	40℃	86.7	6	4℃	103.4
6	40℃	86.7	7	4℃	101.5
7	40℃	82.3	7	4℃	101.5
7	40℃	82.3	12	4℃	102.2
12	40℃	58.6	12	4℃	102.2

综合以上实验结果可得出以下结论：糖类(包括葡萄糖、蔗糖、甘露醇)的添加，反而不利于rHSA-IFNα2b蛋白的稳定；表面活性剂也不能减少其聚体的形成；EDTA对稳定性也没有什么影响；而氨基酸类(甘氨酸、甲硫氨酸)对制品的稳定性有一定的作用，其中以甘氨酸的效果最好；因此最终选择甘氨酸或甲硫氨酸作为rHSA-IFNα2b药剂的辅料。

从以上实验数据中还可看到，甘氨酸浓度在1-4％(重量比)时对制剂中蛋白的稳定作用几乎差不多，但考虑到注射给药制剂的渗透压应与人体生理渗透压相近，从而选择2.3％(重量比)的浓度作为制剂中甘氨酸最优用量。

实施例3：rHSA-IFNα2b蛋白浓度对其稳定性的影响

可注射药物制剂中蛋白浓度也是影响蛋白制品稳定性的一个重要因素。浓度过低，不仅使给药体积增大，而且容易被器壁吸附；蛋白浓度太高则易形成聚体。为了使制剂的装量适宜便于使用、并使rHSA-IFNα2b蛋白在制剂中保持相对稳定，本发明按如下条件进行了不同蛋白浓度条件对制品稳定性的影响实验：

实验条件：1ml/瓶(10mmol/L磷酸缓冲液pH＝6.5，2.3％甘氨酸)各组中含有不同浓度的rHSA-IFNα2b蛋白

①0.1mg/ml

②0.5mg/ml

③1.0mg/ml

④2.0mg/ml

⑤5.0mg/ml

避光放置于4℃冰箱和40℃的恒温箱中，进行稳定性考察，定时取样分析。

检测方法：SDS-PAGE非还原电泳方法(每个样取10μg电泳分析)

结果见图2、图3。

在0.1-5.0mg/ml的浓度范围内，4℃冰箱放置1年，均比较稳定；40℃的加速试验表明，蛋白浓度较高会容易产生聚体，从而可能影响到其理化性质、生物学活性。从蛋白的稳定性及制剂使用方便性来考虑，rHSA-IFNα2b蛋白的浓度在0.5-2mg/ml之间是最合适的。

综合实施例1～3，如下的药剂组成是理想的：0.1-5mg/ml的rHSA-IFNα2b蛋白，优选的为0.5-2mg/ml；合适浓度的甘氨酸或甲硫氨酸，优选的是1-4％甘氨酸，最优选的浓度为2.3％。所选缓冲液有磷酸缓冲液、Tris-HCl缓冲液、醋酸-醋酸钠缓冲液，优选的是磷酸缓冲液，浓度为5-100mmol/L，最优选的浓度为10mmol/L。最终使得制剂的渗透压在250-500mOsm，pH在5-8之间，最优的是6.5。

实施例4：含有重组人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白的注射用水剂的制备

取500毫升人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白原液，蛋白浓度为2.5毫克/毫升，并含10mmol/L磷酸缓冲液(pH6.5)，称取57.5克甘氨酸加入到原液中完全溶解，再加入40毫升pH为6.5的0.5mol/L的磷酸缓冲液，用10％NaOH调节pH至6.5，最后加入适量的注射用水稀释使制剂最终体积为2500毫升，混合均匀后用0.22微米的滤膜对该制剂进行无菌过滤并分装于安瓿瓶中。最终制剂组成为：重组人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白浓度为0.5毫克/毫升，磷酸缓冲液的浓度为10mmol/L，pH6.5，甘氨酸含量为2.3％(重量比)。

实施例5：含有重组人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白的注射用水剂稳定性的考察

根据实施例4公开的方法，配制如下几种优选处方：

①含0.5mg/ml重组人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白；10mMNa₂HPO₄-NaH₂PO₄ pH6.5缓冲液；2.3％甘氨酸的注射水剂。

②含2.0mg/ml重组人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白；10mMNa₂HPO₄-NaH₂PO₄ pH6.5缓冲液；2.3％甘氨酸的注射水剂。

③含0.5mg/ml重组人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白；10mMNa₂HPO₄-NaH₂PO₄ pH6.5缓冲液；2.3％甲硫氨酸的注射水剂。

④含2.0mg/ml重组人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白；10mMNa₂HPO₄-NaH₂PO₄ pH6.5缓冲液；2.3％甲硫氨酸的注射水剂。

按照上述四种优选处方配制的溶液，分别于4℃和40℃条件下存放4个月，每月取样进行RP-HPLC检测，并与4个月后取样进行生物学活性检测。

表8：样品在4℃和40℃条件下存放用RP-HPLC检测

组别	T-0月4℃(％)	T-1月4℃(％)	T-2月4℃(％)	T-3月4℃(％)	T-4月4℃(％)	T-1月40℃(％)	T-2月40℃(％)	T-3月40℃(％)	T-4月40℃(％)
组别	T-0月4℃(％)	T-1月4℃(％)	T-2月4℃(％)	T-3月4℃(％)	T-4月4℃(％)	T-1月40℃(％)	T-2月40℃(％)	T-3月40℃(％)	T-4月40℃(％)	1	98.6	98.4	98.5	98.2	97.9	96.9	95.1	94.2	92.3
2	98.3	98.1	98.0	98.2	97.1	96.3	94.4	93.1	91.2	1	98.6	98.4	98.5	98.2	97.9	96.9	95.1	94.2	92.3
2	98.3	98.1	98.0	98.2	97.1	96.3	94.4	93.1	91.2	3	98.5	98.3	98.3	98.4	97.2	96.4	94.8	92.5	90.5
4	98.3	98.3	98.1	98.2	98.0	96.1	94.2	91.1	89.2	3	98.5	98.3	98.3	98.4	97.2	96.4	94.8	92.5	90.5

表9：样品在4℃与40℃条件存放4个月后进行生物学活性检测

组别	4℃存放温度	40℃％效价
组别	4℃存放温度	40℃％效价	1	106.1	89.6
2	103.2	87.2	1	106.1	89.6
2	103.2	87.2	3	103.1	88.3
4	105.5	83.4	3	103.1	88.3

从以上实验数据可以看出，本发明公开的rHSA-IFNα2b蛋白药物制剂具有较好的稳定性。

实施例6：含有重组人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白的注射用水剂在治疗乙型肝炎中的应用

6.1、鸭乙肝模型制备

(1)筛选鸭乙肝阳性血清

根据鸭乙肝病毒(DHBV)序列，设计一对引物用于扩增DHBV P序列。上游引物：5’atg ccc caa cca ttg aag ca3’，下游引物：5 ttc caa tttcgg gaa ggg ca3’。取3只绍兴麻鸭，在无菌条件下抽血，分离血清。取5μl血清加50μl裂解液，100℃煮沸10分钟，快速离心后置于冰上，作为模板待用。配制PCR反应混合液：10×PCR buffer 5μl，2.5mM MgCl₂3μl，2mM dNTP 5μl，上、下游引物各20pmol，Taq DNA聚合酶1.25u加水至总体积45μl，与上述预变性模板5μl混匀后，加滴一滴石蜡油，上机。PCR程序为95℃预变性2分钟，以94℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸45秒为一循环。共30个循环，最后72℃延伸10分钟。阴性对照含有RT-PCR所需的所有成分，但不加模板。PCR结果用凝胶电泳验证：将PCR反应产物各取10μl和上样缓冲液2μl混匀，加至浸泡于1×TBE buffer(90mM tris-硼酸；2mM EDTA pH8.0)的1.5％凝胶琼脂糖梳孔中。40V电泳3小时后，在紫外检测仪上观察结果(波长为300nm)，3个绍兴麻鸭PCR扩增结果均为阳性，出现3条阳性条带，阴性对照未出现阳性条带。取条带最浓的1号绍兴麻鸭血清作为阳性血清。

(2)制备鸭乙肝模型：于孵化当日挑选健康樱桃谷鸭雏鸭，每只经腿静脉注射100ul阳性鸭血清。另取10只1日龄雏鸭作为正常对照组。取阳性鸭血清感染1日龄北京鸭樱桃谷鸭。感染后第2周腿静脉采血，每只0.3ml，用PCR法检测，PCR方法及凝胶电泳检测方法同上。筛选阳性樱桃谷鸭为鸭乙肝模型。

6.2、抗乙肝病毒治疗

(1)将阳性樱桃谷鸭按照随机分五组(60只/组)，重组人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白的注射用水剂的制备如实施例4公开的方法，用量分别为小剂量组(3微克/公斤)，中剂量组(10微克/公斤)，大剂量组(40微克/公斤)；拉米夫丁(5mg/天)为阳性对照组，以及生理盐水空白对照组。治疗组每组42只。于感染后第2周开始治疗。重组人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白的注射用水剂和生理盐水空白组为皮下给药，每隔一周一次。拉米夫丁组将药片磨成粉状，用冷水化开，与饲料搅拌均匀，给樱桃谷鸭喂服。每天两次，早晚各一次，各组均连续给药3个月，停药后继续观察3个月。

(2)模型组于感染后于治疗前(感染后第2周)、治疗1个月(即感染后第6周)、治疗3个月结束时(即感染后第14周)、停药后第1个月(即感染后第18周)、停药后第2个月(即感染后第22周)、停药后第3个月(即感染后第26周)，每组各取10只樱桃谷鸭静脉采血并处死。

6.3、半定量PCR法检测鸭乙肝病毒滴度

取5μl樱桃谷鸭血清加50μl裂解液，100℃煮沸10分钟，快速离心后置于冰上，作为模板待用。配制PCR反应混合液：10×PCR buffer 5μl，2.5mM MgCl₂3μl，2mM dNTP 5μl，待测细胞因子上、下游引物各20pmol，Taq DNA聚合酶1.25u加水至总体积45μl，与上述预变性模板5μl混匀后，加滴一滴石蜡油，上机。PCR程序为95℃预变性2分钟，以94℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸45秒为一循环。共30个循环，最后72℃延伸10分钟。以1号绍兴麻鸭阳性血清为阳性对照，每次反应共设5个阳性对照，阴性对照含有RT-PCR所需的所有成分，但不加模板。将PCR

反应产物各取10μl和上样缓冲液2μl混匀，加至浸泡于1×TBE buffer(90mM tris-硼酸；2mM EDTA pH8.0)的1.5％凝胶琼脂糖梳孔中。40V电泳3小时后，经凝胶成像分析系统进行半定量分析，获取每个条带的光密度扫描值，进行统计分析。每张图像之间以5个阳性对照的平均值均衡。

6.4、治疗后鸭血清乙肝病毒滴度变化情况

从表10中可见，治疗3个月刚刚结束时，各治疗组鸭血清中乙肝病毒滴度均有所下降，以拉米夫丁治疗组最为明显；停药1个月后，重组人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白的注射用水剂治疗组病毒滴度继续下降，至停药后3个月，重组人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白的注射用水剂仍具有一定的病毒抑制作用，未见有反弹现象。而拉米夫丁治疗组停药后DHBV DNA滴度反弹明显。

表10重组人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白的注射用水剂治疗后鸭乙肝病毒滴度变化情况

	治疗前	治疗1个月	治疗结束	停药后1月	停药后2月	停药后3月
	治疗前	治疗1个月	治疗结束	停药后1月	停药后2月	停药后3月	大剂量	10542.6±6953.5	13002.8±7495.6*	10301.5±6920.1	3325.4±989.5*△	4345.1±4133.4*	4198.8±4524.8
中剂量	10891.8±8953.1	13124±9678.9	13013.4±10064.2	3701.9±4994.3*	4843.3±978.3*	4380.9±3619.1	大剂量	10542.6±6953.5	13002.8±7495.6*	10301.5±6920.1	3325.4±989.5*△	4345.1±4133.4*	4198.8±4524.8
中剂量	10891.8±8953.1	13124±9678.9	13013.4±10064.2	3701.9±4994.3*	4843.3±978.3*	4380.9±3619.1	小剂量	11023.5±1186.4	176358.1±8704.8*	12654.3±6278.0	4998.3±3965.3*	5873.2±2954.5*	4563.6±1153.4*
拉米夫丁	12541.3±8932.9	13002.9±7995.6*	9103.5±4986.9	7998.5±5114.3	8679.4±7896.0*	6125.4±2257.8	小剂量	11023.5±1186.4	176358.1±8704.8*	12654.3±6278.0	4998.3±3965.3*	5873.2±2954.5*	4563.6±1153.4*
拉米夫丁	12541.3±8932.9	13002.9±7995.6*	9103.5±4986.9	7998.5±5114.3	8679.4±7896.0*	6125.4±2257.8	空白组	11201.3±8021.3	24051.6±9425.2	14053.8±6942.7	8943.5±7968.9	23123.9±14255.7	13053.5±11421.5

与模型组比较：*p＜0.05；与拉米夫丁组比较：△p＜0.05

鸭乙肝模型实验证明重组人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白的注射用水剂具有良好的抗乙肝病毒疗效。

Claims

1.一种含有重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白的注射用水剂，其特征在于：所述注射用水剂由重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白与药学上可接受的稳定性辅料溶于pH5～8的药学上可接收的缓冲液中得到，所述重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白浓度为0.1～5mg/mL。

2.如权利要求1所述的含有重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白的注射用水剂，其特征在于：所述稳定性辅料为甘氨酸或甲硫氨酸，质量浓度为1～4％。

3.如权利要求2所述的含有重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白的注射用水剂，其特征在于：所述重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白浓度为0.5～2mg/mL。

4.如权利要求3所述的含有重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白的注射用水剂，其特征在于：所述重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白中，干扰素α为干扰素α2a、干扰素α1b、干扰素α2b或干扰素αcon。

5.如权利要求4所述的含有重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白的注射用水剂，其特征在于：所述重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白中，干扰素α为干扰素α2b。

6.如权利要求1～5之一所述的含有重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白的注射用水剂，其特征在于：所述缓冲液为磷酸盐缓冲液、或Tris-HCl缓冲液、或醋酸-醋酸钠缓冲液。

7.如权利要求6所述的含有重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白的注射用水剂，其特征在于所述缓冲液为磷酸盐缓冲液，浓度为5～100mmol/L。

8.如权利要求7所述的含有重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白的注射用水剂，其特征在于：所述注射用水剂由重组人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白与甘氨酸溶于pH5～8的浓度为5～100mmol/L磷酸盐缓冲液中得到，所述重组人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白浓度为0.5～2mg/mL，所述甘氨酸质量浓度为1～4％。

9.如权利要求8所述的含有重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白的注射用水剂，其特征在于：所述注射用水剂由重组人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白与甘氨酸溶于pH6.5、浓度10mmol/L的磷酸盐缓冲液中得到，所述重组人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白浓度为0.5mg/mL，所述甘氨酸质量浓度为2.3％。

10.权利要求1～5之一所述的含有重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白的注射用水剂在制备用于治疗乙型肝炎或丙型肝炎的药物中的应用。