CN102670522A

CN102670522A - 含有重组人血清白蛋白-人粒细胞集落刺激因子融合蛋白的药物制剂及其制备

Info

Publication number: CN102670522A
Application number: CN2011100631876A
Authority: CN
Inventors: 王叶飞; 范敏; 吴亦亮; 陆游; 李虎
Original assignee: TAIZHOU BEIJIN BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd; Jiangsu T-Mab Biopharma Co Ltd
Current assignee: Jiangsu T-mab BioPharma Co., Ltd.
Priority date: 2011-03-16
Filing date: 2011-03-16
Publication date: 2012-09-19
Anticipated expiration: 2031-03-16
Also published as: CN102670522B

Abstract

本发明公开了一种含有重组人血清白蛋白-人粒细胞集落刺激因子融合蛋白的药物制剂及其制备。本发明的含rHSA/G-CSF蛋白的药物制剂，为冻干制剂，每支制剂中包括下列组分：rHSA/G-CSF蛋白1-30mg；药学上可接受的水溶性赋形剂10-80mg；药学上可接受的保护剂5-30mg；pH值调节剂5-50μmol。本发明的含rHSA/G-CSF蛋白的药物制剂溶解于注射用水后适用于皮下或静脉等途径给药，通过注射适合剂量的此药物制剂可治疗中性粒细胞减少症。

Description

含有重组人血清白蛋白-人粒细胞集落刺激因子融合蛋白的药物制剂及其制备

技术领域

本发明涉及一种含重组人血清白蛋白-人粒细胞集落刺激因子融合蛋白(以下简称rHSA/G-CSF)的药物制剂及其制备。

背景技术

人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，是一种来源于单核细胞和纤维组织母细胞的长链多肽糖蛋白，可诱导造血干细胞的增值和分化，促进血液中的中性粒细胞数增加；另外还具有刺激成熟中性粒细胞从骨髓中释放出并激活中性粒细胞的功能。

但是，天然或重组的G-CSF由于分子量较小，极易被肾小球过滤，在人体内的循环半衰期很短，只有2-4小时，每个化疗周期需要每天注射1-2次，持续注射5-7天(Welte K等，Proc Nat Acad Sci USA，82：1526-1530，1985；Frampton JE等，Drugs，48：731-760，1994)。延长G-CSF制剂体内半衰期可以减少给药次数。

人血清白蛋白(HSA)是血液循环中的一个非常重要的天然蛋白，在体液循环中可存在20天以上。研究表明将治疗性蛋白基因与人血清白蛋白基因融合所表达的融合蛋白可明显降低体内药物的清除速率，延长生物半衰期。据此，本发明通过基因工程方法将人白蛋白与G-CSF融合表达获得的rHSA/G-CSF，提高G-CSF在体内的半衰期(Wendy Halpern等，PharmRes，19：1720-1729，2002)；该融合蛋白结构中，人血清白蛋白位于N端，C末端可以直接与人粒细胞集落刺激因子的N端相连，也可以通过柔性的连接肽序列使两个蛋白相连。

本发明所涉及的rHSA/G-CSF的制备方法有许多文献报道(Pharm Res.19：1720-1729.2002；Pichia Expression Kit：A Manual of Methods for Expression of RecombinantProteins in Pichia pastoris；Catalog NO：K1710-01，Invitrogen Corporation.；G-CSF融合蛋白突变体及其制备与应用(中国专利申请号200910199337.9)等)，通过将人血清白蛋白的基因与人粒细胞集落刺激因子基因融合在一起，选择合适重组表达方法即可获得相应的融合蛋白。融合后形成的重组人血清白蛋白-人粒细胞集落刺激因子融合蛋白克服了传统的人粒细胞集落刺激因子治疗过程中多次给药的缺点；并具有以下几个优点：1)延长人粒细胞集落刺激因子在体内的存留时间；2)起最大的治疗作用、减小传统人粒细胞集落刺激因子的潜在副作用或毒性、还可提高疗效。

但是，作为蛋白药物，rHSA/G-CSF其稳定性还是无法与常规化学药物相比，其活性在长期贮存时还是会受到多种环境因素的影响。例如对温度和氧高度敏感。由于这些因素的作用，可能发生多种物理或化学变化，例如变性，降解，聚合或氧化等从而影响药物均一性和活性，最终影响药物疗效，并带来副作用。

因此，研究出一种能稳定保存rHSA/G-CSF蛋白，并适合于实际临床使用的药物制剂是极其有意义的。但是，到目前为止，尚未有这方面的研究报道。本发明涉及的就是此方面内容。

发明内容

本发明的目的就是提供一种稳定性良好的含重组人血清白蛋白-人粒细胞集落刺激因子融合蛋白(以下简称rHSA/G-CSF)的药物制剂。

本发明为了提高含有rHSA/G-CSF药剂的稳定性，选择了冻干制品为制剂形式，并进行了深入的研究。从合适的辅料(如糖类，氨基酸及其衍生物、表面活性剂等)和无机盐类中挑选至少一种加入制剂中，并选择合适的pH，可以有效达到这个目的。

在rHSA/G-CSF药剂稳定性研究过程中，选取了外观观察，SDS-PAGE，SEC-HPLC高效液相色谱分析，生物活性检测等作为考察指标，来观察rHSA/G-CSF药剂的变化情况。这些方法均可从《中国药典，2005年版》获得。

本发明提供了一种含rHSA/G-CSF蛋白的药物制剂，为冻干制剂，每支制剂中包括下列组分：

rHSA/G-CSF蛋白 1-30mg

药学上可接受的水溶性赋形剂 10-80mg

药学上可接受的保护剂 5-30mg

pH值调节剂 5-50μmol

冻干制剂在临用前用1.0ml注射用水溶解。

在rHSA/G-CSF蛋白的药物制剂中添加合适的赋形剂和保护剂，可以显著改善制品的稳定性，同时也可使制剂处于合适的渗透压，方便使用。

所述的药学上可接受的赋形剂可选自甘露醇、甘氨酸、PEG、海藻糖、山梨醇、蔗糖、木糖醇、乳糖、葡萄糖和果糖等，可以单独添加，也可以联合使用。优选的为甘露醇，优选的用量为10-80mg/支。

所述的药学上可接受的保护剂是可选自氨基酸、糖、金属螯合剂、表面活性剂、白蛋白等。优选的为氨基酸，氨基酸类保护剂可选自甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苏氨酸、色氨酸、赖氨酸、羟赖氨酸、组氨酸、精氨酸、胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸等以及它们的衍生物。优选的为精氨酸。所述保护剂的使用量是本领域常规的用量，优选的用量为5-30mg/支。

所述pH调节剂可以是至少一种药学上可接受用于调节pH值的常规或已知物质。可以是碱性化合物或缓冲系统。所述的药学上可接受的碱性化学物可以是通常在药学上可接受的用于调节溶液pH值的碱性化合物，如氢氧化钠、氢氧化钾、磷酸三钠、磷酸三钾等。所述的缓冲系统可以是常用或已知的在药学上可接受的用于调节溶液pH值的缓冲系统，优选的为磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐、巴比妥盐、三羟甲基氨基甲烷、硼酸盐、琥珀酸盐等，更优选的为磷酸盐缓冲系统。所述缓冲体系溶液的pH范围优选为6.0-7.0，最优的为6.5。

优选的，本发明的含rHSA/G-CSF蛋白的药物制剂，其每支冻干制剂中包括下列组分：

rHSA/G-CSF蛋白 1-30mg，最优选为5mg

甘露醇 10-80mg，最优选30mg

精氨酸 5-30mg，最优选10mg

磷酸盐 5-50μmol，最优选10μmol

临用前用1.0ml注射用水溶解。

所述精氨酸为L-盐酸精氨酸。

进一步的，前述各冻干制剂用1.0ml注射用水溶解后的渗透压为250-400mOsm，pH为6.0-7.0，最优的pH为6.5。

发明所述rHSA/G-CSF蛋白中，人血清白蛋白位于N端，C末端可以直接与人粒细胞集落刺激因子的N端相连，也可以通过柔性的连接肽序列使两个蛋白相连，rHSA/G-CSF蛋白及其制备方法均为现有技术。

在本发明药物组合的基础上改变其中组分的含量或加入其它物质，但对提高rHSA/G-CSF稳定性没有显著改变，仍被视为本发明的一部分。

本发明的含rHSA/G-CSF蛋白的药物制剂可经过下列方法制备获得：

1)按配比将rHSA/G-CSF蛋白、药学上可接受的水溶性赋形剂、药学上可接受的保护

剂及pH值调节剂与注射用水混匀并调节pH值至6.0-7.0；

2)冻干制得冻干制剂。

所述步骤2)具体为：将步骤1配制好的药液除菌过滤分装于适宜大小的西林瓶中待冻干机板层温度预先冷冻到-10℃以下，待冻干西林瓶样品放入冻干箱，在-35℃以下保温2 小时，开始抽真空，真空度低于80Pa后，升板层温度到-15℃，维持真空度小于80Pa，当可见水线消失后开始升温，最后升制品温度到30℃并保持3～5小时。

所述冻干机板层温度预先冷冻到-10℃以下，使待冻干制品进冻干箱后温度迅速降低，形成细小的无定型状态，易于水分的去除和减少对活性大分子结构的破坏。

所述升板层温度到-15℃，维持真空度小于80Pa，可确保冻干制品外观饱满，颗粒细腻，同时缩短冻干周期，减少生产能耗。

本发明的含rHSA/G-CSF蛋白的药物制剂溶解于注射用水后适用于皮下或静脉等途径给药，通过注射适合剂量的此药物制剂可治疗中性粒细胞减少症。

本发明考察了赋形剂、稳定剂、pH、制备工艺等因素对rHSA/G-CSF蛋白制品稳定性的影响，筛选出了一个能保证制品在保存与运输过程中性质稳定，便于临床使用而又可以被人体所接受的制剂处方和工艺。

附图说明

图1 rHSA/G-CSF于pH4.5-8.0 37℃二周SDS-PAGE检测图

图2rHSA/G-CSF于pH4.5-8.0 37℃四周SDS-PAGE检测图

图3rHSA/G-CSF于pH6.0-7.0 37℃二周SDS-PAGE检测图

图4rHSA/G-CSF于pH6.0-7.0 37℃四周SDS-PAGE检测图

具体实施方式

为了进一步阐明本发明，提供了下列例子，这些例子仅仅是为了进一步说明本发明，并不意味着作为一种限制。

实施例1 pH值对于rHSA/G-CSF制剂稳定性的影响

rHSA/G-CSF参考Halpern W等所述(Pharm Res.19：1720-1729.2002)，将HSA与G-CSF基因融合后，构建于表达质粒pPIC9，并在毕赤氏酵母GS115(INVITROGEN公司)中表达获得。

本发明首先研究了pH对rHSA/G-CSF稳定性的影响。为了考察不同pH条件下制剂的稳定性，按如下条件进行了不同pH对制剂稳定性的影响实验：

试验1，rHSA/G-CSF蛋白含量为5.0mg，各组中含有不同pH的一定浓度的醋酸盐或磷酸盐缓冲液，pH4.5到pH8.0，间隔0.5，共设8个点。于37℃加速考察四周，每隔两周取样分析，检测方法：SDS-PAGE，10％分离胶，非还原。

试验表明，蛋白在酸性(pH4.5-pH5.5)和偏碱性条件(pH7.5-pH8.0)经4周时间会发生降解或结构改变，而在pH6.0-pH7.0范围之间，相对较少，结果参见图1和图2。

试验2，缩小筛选范围，选用磷酸缓冲液，设置pH如下：①pH＝6.0 ②pH＝6.2③pH＝6.4 ④pH＝6.5 ⑤pH＝6.6 ⑥pH＝6.8 ⑦pH＝7.0，取样和检测方法同试验1。

试验表明，在pH6.0-pH7.0范围内，蛋白降解情况差异不大，优选pH6.5，结果参见图3和图4。

实施例2 辅料对稳定性的影响试验

本发明筛选了一些适合于人体应用的辅料如甘露醇、海藻糖、PEG4000、甘油、甘氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸和组氨酸等赋形剂和保护剂，研究其对rHSA/G-CSF稳定性的影响。

将辅料配制成高浓度的储液，与pH6.5的磷酸缓冲液高浓度储液混合，然后加入含pH6.5的磷酸缓冲的高浓度rHSA/G-CSF蛋白溶液，再用1mol/L HCl或1mol/L NaOH调节pH值，以获得一定体积含10mmol/L pH6.5的磷酸缓冲液，蛋白浓度为5.0mg/ml的样品溶液。样品溶液过滤除菌后分装于无菌西林瓶，装量为1.0ml，半加塞，冻干。将冻干的制品进行外观检查，并用SEC-HPLC分析冻干过程蛋白聚体的形成。

结果表明，甘露醇和甘氨酸单独作为赋形剂的制品外观饱满、颗粒细腻、水溶性都好，但经SEC-HPLC检测纯度，发现聚体含量明显增加，且甘氨酸做为辅料表面易结皮；海藻糖做为辅料冻干前后蛋白聚体含量增加不明显，且冻干品颗粒细腻、水溶性好，但外观稍有萎缩；PEG4000做为辅料蛋白的聚体含量增加不明显，但部分产品会结块开裂；组氨酸和精氨酸做为辅料冻干前后蛋白聚体含量增加也不明显，但成型性很差，冻干后制品萎缩；其它如蛋氨酸、苯丙氨酸为辅料的制剂水溶性差。

根据上述结果，最终选择了海藻糖、甘露醇、精氨酸和组氨酸4种辅料进行进一步筛选，并在25℃加速条件下连续观察16周，考察其外观、水溶性，纯度和蛋白活性(效价保存率)。

表1.几种辅料不同组合制剂保存于25℃条件下检测结果

上表表明：精氨酸或组氨酸与海藻糖组合，外观改善不明显，表现为保存过程中易萎缩，成型性差；组氨酸与甘露醇组合，加速条件下保存聚体增加和活性降解较为明显；而精氨酸10mg，甘露醇30mg组合，25℃加速试验条件下保存16周，外观、纯度和活性保持最好。

实施例3

称取适量的精氨酸、甘露醇、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠加注射用水搅拌溶解，再加入适量高浓度rHSA/G-CSF蛋白溶液，得到每毫升含rHSA/G-CSF蛋白5.0mg，甘露醇30mg，精氨酸10mg，磷酸盐10umol的溶液，用1mol/L盐酸和1mol/L氢氧化钠调节pH值至6.5±0.1。

配制好的溶液用0.22um的PVDF或PES亲水性滤膜过滤。

除菌过滤后的溶液在无菌条件下分装和进冻干箱，冻干机板层温度预先冷冻到-10℃以下，半加塞的样品迅速放入冻干箱。制品平均温度在-35℃以下保温2小时，开始冷凝器降温。冷凝器温度降至-45℃后，开始抽真空，真空度低于80Pa后，升板层温度到-15℃，维持真空度。当视窗中样品水印消失并且制品平均温度接近板层温度后，开始升高板层温度，最后设板层温度到40℃，当制品平均温度升到30℃保持3-5小时，整个冻干过程控制在48小时内。

冻干结束后，轧盖密封，即得到本发明的注射用rHSA/G-CSF冻干粉针剂。

实施例4

按照实施例3的方法，对rHSA/G-CSF蛋白、甘露醇、精氨酸，磷酸缓冲液进行不同含量试验，考察指标选用可准确量化的SEC-HPLC纯度分析。

表2.各组分不同含量正交试验

注：K_I/4、K_II/4、K_III/4、K_IV/4代表在I、II、III、IV四个模拟水平条件下的样品纯度平均值。

通过表2可以得出各组分在不同含量下(水平I-IV)其制剂纯度都在98.0％以上，在最优选含量下(水平II)其制剂纯度不低于99.0％。因此发明者认为每支冻干制剂如下的药剂组合是理想的：rHSA/G-CSF蛋白含量1-30mg，甘露醇含量10-80mg、精氨酸含量5-30mg，磷酸缓冲液含量5-50umol；最优选rHSA/G-CSF蛋白含量5.0mg，甘露醇含量30mg、精氨酸含量10mg磷酸缓冲液含量10μmol。复溶后制剂pH在6.0-7.0之间，最优的是6.5。

实施例5 制品稳定性考察

按照实施例3进行连续三批生产规模的制剂生产，产品规格10mg，并对制品进行长期稳定性考察(保存于2-8℃)。考察项目有外观、水分(检测方法参见《中国药典2005版》三部附录VII D)、pH(检测方法参见《中国药典2005版》三部附录V A)、含量(RP-HPLC外标法)、RP-HPLC纯度(检测方法参见《中国药典2005版》三部附录III B)SDS-PAGE非还原电泳纯度(检测方法参见《中国药典2005版》三部附录IV C)和活性(检测方法参见《中国药典2005版》三部附录X E)。检测结果见表3，数据表明冻干制品在2-8℃保存36个月各项指标都合格。

表3 连续三批制剂长期稳定性考察结果

标示活性百分比＝样品实际活性/理论标示活性×100％

Claims

1.一种含rHSA/G-CSF蛋白的药物制剂，为冻干制剂，每支制剂中包括下列组分：

rHSA/G-CSF蛋白 1-30mg

药学上可接受的水溶性赋形剂 10-80mg

药学上可接受的保护剂 5-30mg

pH值调节剂 5-50μmol。

2.如权利要求1所述含rHSA/G-CSF蛋白的药物制剂，其特征在于，所述的药学上可接受的赋形剂选自甘露醇、甘氨酸、PEG、海藻糖、山梨醇、蔗糖、木糖醇、乳糖、葡萄糖和果糖中的一种或多种；所述的药学上可接受的保护剂选自氨基酸、糖、金属螯合剂、表面活性剂和白蛋白；所述pH值调节剂为碱性化合物或缓冲系统。

3.如权利要求2所述含rHSA/G-CSF蛋白的药物制剂，其特征在于，所述氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苏氨酸、色氨酸、赖氨酸、羟赖氨酸、组氨酸、精氨酸、胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸和异亮氨酸以及它们的衍生物。

4.如权利要求2所述含rHSA/G-CSF蛋白的药物制剂，其特征在于，所述碱性化学物选自氢氧化钠、氢氧化钾、磷酸三钠和磷酸三钾，所述缓冲系统选自磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐、巴比妥盐、三羟甲基氨基甲烷、硼酸盐和琥珀酸盐缓冲体系，所述缓冲体系的pH范围为6.0-7.0。

5.如权利要求1所述含rHSA/G-CSF蛋白的药物制剂，其特征在于，每支冻干制剂中包括下列组分：

rHSA/G-CSF蛋白 1-30mg

甘露醇 10-80mg

精氨酸 5-30mg

磷酸盐 5-50μmol。

6.如权利要求5所述含rHSA/G-CSF蛋白的药物制剂，其特征在于，其特征在于，每支冻干制剂中包括下列组分：

rHSA/G-CSF蛋白 5mg

甘露醇 30mg

精氨酸 10mg

磷酸盐 10μmol。

7.如权利要求5所述含rHSA/G-CSF蛋白的药物制剂，其特征在于，所述精氨酸为L-盐酸精氨酸。

8.如权利要求1-7任一所述含rHSA/G-CSF蛋白的药物制剂，其特征在于，所述各冻干制剂用1.0ml注射用水溶解后的渗透压为250-400mOsm，pH为6.0-7.0。

9.如权利要求1-8任一所述含rHSA/G-CSF蛋白的药物制剂的制备方法，包括下列步骤：

1)按配比将rHSA/G-CSF蛋白、药学上可接受的水溶性赋形剂、药学上可接受的保护剂及pH值调节剂与注射用水混匀并调节pH值至6.0-7.0获得药液；

2)药液冻干制得冻干制剂。

10.如权利要求9所述含rHSA/G-CSF蛋白的药物制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤2)具体为：将步骤1)配制好的药液除菌过滤分装于西林瓶中待冻干机板层温度预先冷冻到-10℃以下，将待冻干西林瓶样品放入冻干箱，在-35℃以下保温2小时，开始抽真空，真空度低于80Pa后，升板层温度到-15℃，维持真空度小于80Pa，当可见水线消失后开始升温，最后升制品温度到30℃并保持3～5小时。