CN112206211A - 蛋白制剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本申请提供了蛋白制剂，其包含pH调节剂、结构保护剂和渗透压调节剂，且不含表面活性剂。本申请还提供了制备蛋白制剂的方法，包括以下步骤：(a)提供包含pH调节剂、结构保护剂和渗透压调节剂且不含表面活性剂的水性溶液；以及(b)将蛋白添加至所述水性溶液。
Description
发明领域
本申请大体涉及生物制品领域，具体而言，本申请提供了蛋白制剂及其制备方法。
发明背景
蛋白制剂已被广泛地应用于研究和工艺生产中。重组蛋白由于可操作性强、产量高等特点被用于制造各种生物制品，特别是蛋白类药物。融合蛋白通常需要人为结构设计，故往往需要利用重组表达技术。重组融合蛋白的分子结构和生产工艺较为复杂，因此其异质性普遍存在，例如氧化型、脱酰胺型、二硫键错配、二硫键断裂、赖氨酸残基糖化异构体等。即使经过纯化工艺，但在终产品中仍可能存在多种经不同翻译后修饰或共价、非共价结合形式的变异体与主成分共存。存在的异构体可能会影响到蛋白制剂的质量和稳定性。目前的蛋白制剂成分较为复杂、包含较多种类的辅助成分，例如缓冲液、表面活性剂、结构保护剂等，而种类繁多的辅助成分会给蛋白制剂生产工艺带来明显影响。
因此，本领域需要改进的蛋白制剂和制备方法。
发明概述
第一方面，本申请提供了蛋白制剂，其包含pH调节剂、结构保护剂和渗透压调节剂，且不含表面活性剂。
在一些实施方案中，pH调节剂为酸/盐缓冲剂。在一些具体实施方案中，pH调节剂为磷酸氢二钠和磷酸二氢钠的混合物、柠檬酸和柠檬酸钠的混合物、醋酸和醋酸钠混合物或以上的任意组合。
在一些实施方案中，结构保护剂为氨基酸。在一些具体实施方案中，结构保护剂为精氨酸、甲硫氨酸、组氨酸或以上的任意组合。
在一些实施方案中，渗透压调节剂为糖类和/或醇类。在一些具体实施方案中，渗透压调节剂为蔗糖、海藻糖、甘露醇或以上的任意组合。
在一些实施方案中，蛋白为重组蛋白。在一些具体实施方案中，蛋白为融合蛋白。在一些更具体实施方案中，蛋白为胰高血糖素样肽-1-Fc融合蛋白(GLP-1-Fc)。
在一些实施方案中，蛋白制剂为冻干制剂。
第二方面，本申请提供了制备蛋白制剂的方法，包括以下步骤：
(a)提供包含pH调节剂、结构保护剂和渗透压调节剂且不含表面活性剂的水性溶液；以及
(b)将蛋白添加至所述水性溶液。
在一些实施方案中，pH调节剂为酸/盐缓冲剂。在一些具体实施方案中，pH调节剂为磷酸氢二钠和磷酸二氢钠的混合物、柠檬酸和柠檬酸钠的混合物、醋酸和醋酸钠混合物或以上的任意组合。
在一些实施方案中，结构保护剂为氨基酸。在一些具体实施方案中，结构保护剂为精氨酸、甲硫氨酸、组氨酸或以上的任意组合。
在一些实施方案中，渗透压调节剂为糖类和/或醇类。在一些具体实施方案中，渗透压调节剂为蔗糖、海藻糖、甘露醇或以上的任意组合。
在一些实施方案中，蛋白为重组蛋白。在一些具体实施方案中，蛋白为融合蛋白。在一些更具体实施方案中，蛋白为胰高血糖素样肽-1-Fc融合蛋白(GLP-1-Fc)。
在一些实施方案中，步骤(a)还包括调整所述水性溶液的pH值。
在一些实施方案中，步骤(b)还包括将蛋白添加至所述水性溶液之后，调整所获得的蛋白溶液的pH值。
在一些实施方案中，该方法还包括以下步骤：(c)将步骤(b)获得的蛋白溶液冻干。
第三方面，本申请提供了通过第二方面所述的方法制备的蛋白制剂。
发明详细描述
本申请的发明人通过对于蛋白制剂的制备工艺进行设计、开发和测试，建立了本申请的各项发明。本申请的各项发明的优势可以包括以下中的一种或多种：
1.蛋白制剂的辅助材料种类较少，工艺较为简单。
2.作为液体制剂形式时，稳定性较好。
3.作为冻干制剂时的性质较为优异，例如表现在冻干制剂外观、复溶制剂外观、复溶时间、冻干前后蛋白的纯度或稳定性变化等。
本申请的各项发明的其它优势也体现于说明书其它部分的描述。
除非另外说明，本申请中的术语的含义与本领域技术人员通常理解的含义相同，例如，涉及原料和产物、操作步骤、工艺参数、使用设备和工具以及数值单位中的术语。
第一方面，本申请提供了蛋白制剂，其包含pH调节剂、结构保护剂和渗透压调节剂，且不含表面活性剂。
在一些实施方案中，pH调节剂为酸/盐缓冲剂，包括但不限于，pH调节剂为磷酸氢二钠和磷酸二氢钠的混合物、柠檬酸和柠檬酸钠的混合物、醋酸和醋酸钠混合物或以上的任意组合。
在一些实施方案中，结构保护剂为氨基酸，包括但不限于，精氨酸、甲硫氨酸、组氨酸或以上的任意组合。
在一些实施方案中，渗透压调节剂为糖类和/或醇类，包括但不限于，蔗糖、海藻糖、甘露醇或以上的任意组合。
在一些实施方案中，蛋白为重组蛋白。在一些具体实施方案中，蛋白为融合蛋白。
重组蛋白需要利用重组表达技术来产生，融合蛋白是一类常见的重组蛋白。重组融合蛋白的分子结构和生产工艺决定了易于产生蛋白的异质性在，例如氧化型、脱酰胺型、二硫键错配、二硫键断裂、赖氨酸残基糖化异构体等，而存在的异构体可能会影响到蛋白制剂的质量和稳定性。本申请提供的蛋白制剂特别适合于重组表达技术下产生的重组蛋白，特别是重组融合蛋白，但是本领域技术人员能够理解，其他方式产生的蛋白(例如天然提取蛋白)也能够受益于本申请的各项发明。
在一些更具体实施方案中，蛋白为胰高血糖素样肽-1-Fc融合蛋白(GLP-1-Fc)，其是本申请示例性的测试蛋白之一。
胰高血糖素样肽-1(GLP-1)是由肠道L细胞分泌的由31个氨基酸组成的肽类激素，是Ⅱ型糖尿病治疗药物开发的热门靶点。GLP-1的优势在于依赖于人体血糖浓度升高情况来调控血糖浓度；促进胰岛B细胞增殖分化，抑制胰岛B细胞凋亡，提高机体的胰岛素敏感性；抑制胃肠排空、减少进食，减轻体重。天然GLP-1在体内容易被二肽基肽酶-4(DDP-4)代谢，其体内半衰期只有1-2min，通过多肽修饰开发出了多种相关药物。基于GLP-1进行的探究包括寻找能抵抗DPP-Ⅳ降解的类似物；对DPP-IV易降解的氨基酸序列替换或修饰；与大分子蛋白结合和修饰，延缓肾消除速率。目前已有报道将GLP-1通过柔性多肽与Fc片段连接得到GLP-1-Fc融合蛋白，可有效延长半衰期。已有的产品包括Lily公司生产的度拉鲁肽。GLP-1-Fc融合蛋白的结构复杂性决定了其不稳定性，易在生产和储存过程中产生聚集和降解。本申请将GLP-1-Fc融合蛋白作为示例性测试对象之一，对其制备工艺进行了改进。
在一些实施方案中，蛋白制剂为冻干制剂。冻干制剂是蛋白制品中常见的剂型，其制备方法和工艺也是本领域技术人员知晓的。本申请的蛋白制剂的优势也可以表现在冻干制剂形式的性质的改善。
第二方面，本申请提供了制备蛋白制剂的方法，包括以下步骤：
(a)提供包含pH调节剂、结构保护剂和渗透压调节剂且不含表面活性剂的水性溶液；以及
(b)将蛋白添加至所述水性溶液。
在一些实施方案中，pH调节剂为酸/盐缓冲剂。在一些具体实施方案中，pH调节剂为磷酸氢二钠和磷酸二氢钠的混合物、柠檬酸和柠檬酸钠的混合物、醋酸和醋酸钠混合物或以上的任意组合。
在一些实施方案中，结构保护剂为氨基酸。在一些具体实施方案中，结构保护剂为精氨酸、甲硫氨酸、组氨酸或以上的任意组合。
在一些实施方案中，渗透压调节剂为糖类和/或醇类。在一些具体实施方案中，渗透压调节剂为蔗糖、海藻糖、甘露醇或以上的任意组合。
在一些实施方案中，蛋白为重组蛋白。在一些具体实施方案中，蛋白为融合蛋白。在一些更具体实施方案中，蛋白为胰高血糖素样肽-1-Fc融合蛋白(GLP-1-Fc)。
在一些实施方案中，步骤(a)还包括调整所述水性溶液的pH值。在一些实施方案中，所述pH值按照所述蛋白的等电点设计。
在一些实施方案中，步骤(b)还包括将蛋白添加至所述水性溶液之后，调整所获得的蛋白溶液的pH值。在一些实施方案中，所述pH值按照所述蛋白的等电点设计。
在一些实施方案中，该方法还包括以下步骤：(c)将步骤(b)获得的蛋白溶液冻干。
第三方面，本申请提供了通过第二方面所述的方法制备的蛋白制剂。
实施例
以下结合实施例具体地说明本申请的实施方案，但实施例不对本申请的各项发明产生任何限定意义。
材料与方法
GLP-1-Fc融合蛋白的制备方法：
按照已有的关于GLP-1-Fc融合蛋白的报道，使用CHO细胞作为表达宿主，在生物反应器上通过流加工艺进行培养，之后通过纯化工艺去除聚集体、降解和工艺相关杂质，得到GLP-1-Fc融合蛋白。
下文中的“聚集体(SEC)”和“单体(SEC)”代表通过尺寸排阻色谱法(SEC)测定的蛋白样品聚集体和单体的含量。
下文中的“聚集体(RPC)”和“单体(RPC)”代表通过反相色谱法(RPC)测定的蛋白样品聚集体和单体的含量。反相色谱(RPC)是指利用非极性的反相介质为固定相，极性有机溶剂的水溶液为流动相，根据溶质极性(疏水性)的差别进行溶质分离与纯化的洗脱色谱法。
冻干制剂的制备方法：真空冷冻干燥，利用升华的原理使物料脱水的一种干燥技术。产品分装在西林瓶中后经过预冻、一次升华和解析干燥等工艺步骤得到冻干制剂。
冻干制剂的水分含量测定方式：冻干制剂通过卡尔费休氏法测定样品的水分含量，本法是根据碘和二氧化硫在吡啶和甲醇溶液中与水定了反应的原理来测定水分的，所用仪器应干燥，并能避免空气中水分的浸入，测定应在干燥处进行。
冻干制剂的不溶性微粒测定方式：不溶性微粒检查法利用光阻的方法检测，当液体中的微粒通过一窄细检测通道时，与液体流向垂直的入射光由于被微粒阻挡而减弱，因此由传感器输出的信号降低，这种信号变化与微粒的截面积大小相关。
冻干制剂的复溶时间测定方式：取冻干制剂，向西林瓶中添加规定量注射用水，轻摇使其溶解，记录样品溶解的时间即为复溶时间。
实施例1：GLP-1-Fc融合蛋白液体制剂的制备
1.制剂配制液的制备：
按照以下顺序在容器中进行投料：注射用水→磷酸氢二钠-磷酸二氢钠→精氨酸→甲硫氨酸→蔗糖。
物料添加过程中，液体处于搅拌状态。
物料添加完成并完全溶解后应对溶液进行pH值检测，并使用盐酸调节溶液至pH值＝6.0±1.5(根据蛋白等电点设置)，然后向容器内补充注射用水至预定体积，继续搅拌至均匀，获得制剂配制液。
2.液体制剂的制备：
将一定体积的制剂配制液加入容器内。向容器内加入搅拌子，并将其放置在磁力搅拌器上进行搅拌。根据需要计算需加入的GLP-1-Fc融合蛋白产品的量，计算方式如下：(制剂配制量×制剂蛋白浓度)÷蛋白产品浓度。加入蛋白产品(4±0.4mg/ml)并伴随搅拌，随后将配制液的pH调节至pH值＝6.0±1.5(根据蛋白等电点设置)，获得GLP-1-Fc融合蛋白液体制剂。
实施例2：GLP-1-Fc融合蛋白液体制剂的稳定性测试
本实施例测试了实施例1获得的GLP-1-Fc融合蛋白液体制剂的稳定性性质，包括长期储存条件(2-8℃)、反复冻融条件以及其他条件下的稳定性，具体结果如表1至表3所示。
表1.长期储存条件(2-8℃)的稳定性数据
表2.反复冻融稳定性数据
表3.其他稳定性测试数据
实施例3：GLP-1-Fc融合蛋白液体制剂的与同类制剂的稳定性测试
本实施例比较了实施例1获得的GLP-1-Fc融合蛋白液体制剂与同类商业产品(度拉鲁肽，其制剂配方为：10mM柠檬酸缓冲液，4.6％甘露醇和0.02％的吐温80)的稳定性性质，具体结果如表4所示。
表4.其他稳定性测试数据
实施例4：GLP-1-Fc融合蛋白冻干制剂的性能测试
本实施例测试了从实施例1获得的GLP-1-Fc融合蛋白液体制剂制备得到的冻干制剂的性能，具体结果如表5至表8所示。
表5.GLP-1-Fc融合蛋白冻干制剂的一般参数
表6.GLP-1-Fc融合蛋白冻干制剂的即时稳定性数据
表7.GLP-1-Fc融合蛋白冻干制剂长期储存稳定性数据
表8.GLP-1-Fc融合蛋白冻干制剂的加速条件稳定性数据
Claims (10)
1.蛋白制剂，其包含pH调节剂、结构保护剂和渗透压调节剂，且不含表面活性剂。
2.如权利要求1所述的蛋白制剂，其中
所述pH调节剂为酸/盐缓冲剂，例如，磷酸氢二钠和磷酸二氢钠的混合物、柠檬酸和柠檬酸钠的混合物、醋酸和醋酸钠混合物或以上的任意组合；和/或
所述结构保护剂为氨基酸，例如，精氨酸、甲硫氨酸、组氨酸或以上的任意组合；和/或
所述渗透压调节剂为糖类和/或醇类，例如，蔗糖、海藻糖、甘露醇或以上的任意组合。
3.如权利要求1或2所述的蛋白制剂，其中所述蛋白为重组蛋白，优选为融合蛋白，例如胰高血糖素样肽-1-Fc融合蛋白(GLP-1-Fc)。
4.如权利要求1-3中任一项所述的蛋白制剂，其中所述蛋白制剂为冻干制剂。
5.制备蛋白制剂的方法，包括以下步骤：
(a)提供包含pH调节剂、结构保护剂和渗透压调节剂且不含表面活性剂的水性溶液；以及
(b)将蛋白添加至所述水性溶液。
6.如权利要求5所述的方法，其中
所述pH调节剂为酸/盐缓冲剂，例如，磷酸氢二钠和磷酸二氢钠的混合物、柠檬酸和柠檬酸钠的混合物、醋酸和醋酸钠混合物或以上的任意组合；和/或
所述结构保护剂为氨基酸，例如，精氨酸、甲硫氨酸、组氨酸或以上的任意组合；和/或
所述渗透压调节剂为糖类和/或醇类，例如，蔗糖、海藻糖、甘露醇或以上的任意组合。
7.如权利要求5或6所述的蛋白制剂，其中所述蛋白为重组蛋白，优选为融合蛋白，例如胰高血糖素样肽-1-Fc融合蛋白(GLP-1-Fc)。
8.如权利要求5-7中任一项所述的蛋白制剂，其中步骤(a)还包括调整所述水性溶液的pH值。
9.如权利要求5-8中任一项所述的蛋白制剂，其中步骤(b)还包括将蛋白添加至所述水性溶液之后，调整所获得的蛋白溶液的pH值。
10.如权利要求5-9中任一项所述的蛋白制剂，还包括以下步骤：
(c)将步骤(b)获得的蛋白溶液冻干。
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