KR20200109768A

KR20200109768A - T 세포 면역 반응 활성화를 위한 암 치료용 암항원 발굴 플랫폼

Info

Publication number: KR20200109768A
Application number: KR1020190029370A
Authority: KR
Inventors: 장미희; 이철주; 한기철; 이지은
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2019-03-14
Filing date: 2019-03-14
Publication date: 2020-09-23
Also published as: KR102182555B1

Abstract

암 조직에 공통적으로 발현되는 공통 암 항원 또는 신생항원(Neoantigen)을 스크리닝 하는 방법에 관한 것이다. 일 양상에 따른 암 공통 항원 또는 신생항원(Neoantigen)에 대한 스크리닝 방법은 암 조직에서 발현되는 인간 백혈구 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 펩타이드를 효율적으로 스크리닝할 수 있는 방법에 관한 것이다. 특히 일 양상에 따른 스크리닝 방법은 면역원성을 찾아내기 따라서, 일 양상에 따라 스크리닝 하여 찾아낸 항원, 즉 펩타이드는 면역원성이 높으므로 이를 활용하면 암 치료 백신에 유용하게 활용될 수 있다.

Description

T 세포 면역 반응 활성화를 위한 암 치료용 암항원 발굴 플랫폼{Platform of discovery of cancer therapeutic antigen for activation of T cell-mediated immune response}

암 조직에 공통적으로 발현되는 공통 암 항원 또는 신생항원(Neoantigen)을 스크리닝 하는 방법에 관한 것이다.

암은 정상 세포에 비하여 세포 성장이 조절되지 않고, 근접한 조직으로 침입이 가능하며, 때로는 전이가 되는 특성을 가지고 있다. 암은 기본적으로 조직의 성장 조절에 관련되어 있는 질병으로, 정상 세포가 암 세포로 형질전환이 되면 세포 성장과 분열을 조절하는 유전자의 발현이 변화한다 (Croce., The New England Journal of Medicine, 358(5): 502-511, 2008).

항암 치료는 물리적으로 암 조직을 제거하거나, 또는 방사선 조사나 항암제 투여를 통해 암 유전자 (oncogene)를 비롯하여 항-세포 사멸 분자 (anti-apoptotic molecule), 텔로머라제 (telomerase), 성장인자 수용체 유전자 (growth factor receptor gene), 신호전달 분자 (signaling molecule) 등과 같이 암 세포의 생존에 필요한 유전자의 발현을 저해시키거나 세포 사멸을 유도하는 방식으로 수행된다 (Knudson AG, Nature reviews. Cancer 1(2): 157-162, 2001). 그러나 이와 같은 치료 과정에서 암 세포뿐만 아니라 정상 세포도 영향을 받을 수 있어 부작용이 나타나는 문제점이 있다.

이에, 대안적으로 암을 치료하는 방법으로 암 치료 백신에 대한 필요성이 대두되고 있다. 암 치료 백신접종은 감염원을 예방하는 전통적인 예방접종과는 방법이 다르며, 특히 암 백신은 비자기-항원보다는 자기-항원에 대하여 면역반응을 유도하여야 한다. 또한, 상기 백신은 암이 형성된 후 투여하였을 때 작용하여야 하고 면역억제 효과를 발휘하여야 하며, 환자 사이의 이종 암 항원 발현에 대하여 감수성이 없어야 한다.

많은 암 항원은 자기항원으로서 면역 허용원이므로, 특정한 면역 반응을 유도하는 것은 어려우며 특히 많은 암에서 공통적으로 작용할 수 있는 항원을 찾아내는 것은 용이하지 않다. 다만, 암 세포에 대해 특이적인 면역 반응을 유발하는 항원 펩타이드를 이용하면 상기 항원을 발현하는 암세포를 특이적으로 제거하는 면역치료에 유용하게 사용될 수 있을 것이나, 현재까지 이에 대해 전혀 알려진바 없다.

일 양상은 (a) 암 조직을 파쇄하고 용해액을 첨가하여 암 조직의 용해액을 제조하는 단계; (b) 상기 암 조직의 용해액에 인간 백혈구 항원(human leucocyte antigen: HLA)에 특이적으로 결합하는 항체를 접촉시켜 항원-항체반응의 결과물을 수득하는 단계; (c) 상기 (b) 단계의 결과물에서 결합된 펩타이드를 정제하여 수득하는 단계; (d) 상기 (c)단계에서 수득한 펩타이드를 HLA의 대립유전자(allele)에 대한 친화도가 높은 펩타이드를 선택하는 단계; 및 (e) 상기 (d) 단계의 선별된 펩타이드 중 T세포 특이적인 면역원성이 나타나는 펩타이드를 선별하는 단계를 포함하는, 암 공통 항원을 스크리닝 하는 방법을 제공한다.

다른 양상은 (a) 암 조직을 파쇄하고 용해액을 첨가하여 암 조직의 용해액을 제조하는 단계; (b) 상기 암 조직의 용해액에 인간 백혈구 항원(human leucocyte antigen: HLA)에 특이적으로 결합하는 항체를 접촉시켜 항원-항체반응의 결과물을 수득하는 단계; (c) 상기 (b) 단계의 결과물에서 결합된 펩타이드를 정제하여 수득하는 단계; (d) 상기 (c)단계에서 수득한 펩타이드를 HLA 대립유전자(allele)에 대한 친화도가 높은 펩타이드를 선택하는 단계; 및 (e) 상기 (d) 단계의 선별된 펩타이드 중 T세포 특이적인 면역원성이 나타나는 펩타이드를 선별하는 단계를 포함하는, 신생항원(Neoantigen)을 스크리닝 하는 방법을 제공한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, (a) 암 조직을 파쇄하고 용해액을 첨가하여 암 조직의 용해액을 제조하는 단계; (b) 상기 암 조직의 용해액에 인간 백혈구 항원(human leucocyte antigen: HLA)에 특이적으로 결합하는 항체를 접촉시켜 항원-항체반응의 결과물을 수득하는 단계; (c) 상기 (b) 단계의 결과물에서 결합된 펩타이드를 정제하여 수득하는 단계; (d) 상기 (c)단계에서 수득한 펩타이드를 HLA 대립유전자(allele)에 대한 친화도가 높은 펩타이드를 선택하는 단계; 및 (e) 상기 (d) 단계의 선별된 펩타이드 중 T세포 특이적인 면역원성이 나타나는 펩타이드를 선별하는 단계를 포함하는, 암 공통 항원을 스크리닝 하는 방법을 제공한다.

일 양상에 따른 암 공통 항원 또는 신생항원에 대한 스크리닝 방법은 암 조직에서 발현되는 인간 백혈구 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 펩타이드를 효율적으로 스크리닝할 수 있는 방법에 관한 것이다. 특히 일 양상에 따른 스크리닝 방법은 면역원성을 찾아내기 따라서, 일 양상에 따라 스크리닝 하여 찾아낸 항원, 즉 펩타이드는 면역원성이 높으므로 이를 활용하면 암 치료 백신에 유용하게 활용될 수 있다.

도 1은 암환자의 암 조직으로부터 공통 항원을 찾아내는 일 양상에 따른 스크리닝방법을 간단하게 모식화한 도이다.
도 2는 후보군 펩타이드를 말초혈액 단핵세포에 처리하여 나타난 면역원성을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 PBMC 세포에 선별된 후보군 암 항원 펩타이드 중 2종의 펩타이드에 대한 면역원성을 확인한 결과(도 3A) 및 후보군 펩타이드 20종에 대한 면역원성을 확인한 이미지를 펩타이드 별 면역원성 정도를 정량적 그래프로 나타낸 결과(도 3B)에 나타낸 도이다.
도 4는 4종의 펩타이드로 최종적으로 선별된 CDC5L, ELF4A1, TCP1 및 CTNNB1에 대한 면역원성을 확인한 결과를 나타낸 도이다.

일 양상은 (a) 암 조직을 파쇄하고 용해액을 첨가하여 암 조직의 용해액을 제조하는 단계; (b) 상기 암 조직의 용해액에 인간 백혈구 항원(human leucocyte antigen: HLA)에 특이적으로 결합하는 항체를 접촉시켜 항원-항체반응의 결과물을 수득하는 단계; (c) 상기 (b) 단계의 결과물에서 결합된 펩타이드를 정제하여 수득하는 단계; (d) 상기 (c)단계에서 수득한 펩타이드를 HLA 대립유전자(allele)에 대한 친화도가 높은 펩타이드를 선택하는 단계; 및 (e) 상기 (d) 단계의 선별된 펩타이드 중 T세포 특이적인 면역원성이 나타나는 펩타이드를 선별하는 단계를 포함하는, 암 공통 항원을 스크리닝 하는 방법을 제공한다.

용어 “인간 백혈구 항원(HLA)는 인간의 주요 조직 적합성 복합체 (Major Histocompatibility Complex: MHC) 단백질을 코딩하는 유전자 복합체로, 조직적합성 항원을 지배하는 유전자를 함유한 염색체부위를 의미한다. 인간 백혈구 항원(HLA)라고 하며 MHC 복합체라고 약기한다. 본 명세서 내에서 사용하는 용어 HLA는 주요 조직 적합성 복합체와 동일한 의미로 기재하고 있으며, MHC와 HLA는 본 명세서 내에서 혼용하여 사용이 가능하다.

명세서에서 사용된 용어 "암" 은 포유동물에서 조절되지 않는 세포 성장을 전형적인 특징으로 하는 생리적 상태를 의미하거나 그러한 생리적 상태를 설명하는 것으로 주위 조직에 침윤하면서 빠르게 성장하고 신체 각 부위에 확산되거나 전이되어 생명을 위협하는 악성 종양을 제한 없이 포함할 수 있다. 암의 예로는 암종, 림프종, 모세포종, 육종 및 백혈병 또는 림프성 악성 종양 등이 있으나 이것으로 제한되지 않는다. 이러한 암의 보다 특별한 예로는 폐암, 후두암, 위암, 대장/직장암, 간암, 담낭암, 췌장암, 유방암, 난소암, 자궁암, 자궁경부암, 전립선암, 신장암, 피부암 등의 상피세포 등에서 유래하는 암종(carcinoma), 골암, 근육암, 지방암, 섬유세포암 등의 결합조직세포에서 유래하는 육종(sarcoma), 백혈병, 림프종, 다발성골수종 등의 조혈세포에서 유래하는 혈액암, 신경조직에 발생하는 종양, 및 삼중음성유방암(Triple negative breast cancer) 뿐만이 아니라 두경부암 등이 있다.

일 양상의 구체예에서는 암 조직을 파쇄하고, 이를 용해액으로 용해시켜 암 조직에서 발현하는 HLA-항체-레진과 이와 결합하는 펩티돔을 통한 면역 침강반응(Immunoprecipitation)을 수행하여 tC18 레진을 이용하여, 정제하고 정제된 펩타이드를 효소 특이도(enzyme specificity)를 unspecific으로, false discovery rate를 0.01로, 펩타이드 길이를 8~15로, 최대 펩타이드 질량을 1,500로, 최대 전하를 3으로 하여 1차 암 공통 항원 펩타이드를 선별하였다.

이후 구체예에서는 NetMHC (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/) 프로그램을 이용하여 각 HLA 대립유전자(allele)에 대한 친화도를 분석하고, IEDB Analysis Resource (http://tools.iedb.org/immunogenicity/) 프로그램으로 수득한 1차 암 공통 항원 펩타이드의 면역원성을 분석하여 상위 50개의 펩타이드를 선별하였고, 최종적인 항원 펩타이드를 선별하기 위하여, 세포 내 착색(intracellular staining) 방법을 이용하여 세포 내 INF-γ 마커 검출을 위한 대용량 초고속 이미징화 기반의 실험을 수행하여 손쉽게 CD8+ 세포 매개 면역원성 스크리닝을 수행할 수 있으므로, 암세포 조직 내 HLA에 특이적으로 결합하면서 동시에 면역원성까지 높아 펩타이드를 손쉽게 간편하게 이미징화를 통해 스크리닝 할 수 있음을 확인하였다.

상기 스크리닝 방법은 생체 내 (in vivo) 또는 시험관 내 (in vitro)에서 수행될 수 있으며, 특별히 제한되지 않는다. 일 양상에 따른 암 공통 항원 후보 물질 펩타이드는 공지된 물질 또는 신규 물질일 수 있으며, 예를 들어 펩타이드 라이브러리 (peptide library)를 통하여 대규모로 스크리닝을 수행할 수 있다.

일 양상에 따른 스크리닝 방법에 있어서, 상기 (a) 단계의 용해액은 암 조직을 용해시킬 수 있는 어떤 용액이든 제한 없이 사용할 수 있으며, 비특이적 세포 용해제 또는 특이적 세포 용해제를 포함할 수 있다. 상기 비특이적 세포 용해제에는, 예를 들면, 계면활성제, NaOH 및 카오트로픽 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상이 포함될 수 있으며, 또한 옥틸 글루코시드(octyl glucoside), 소듐 디옥시콜레이트(sodium deoxycholate), 에틸렌다이아민테트라아세트산(EDTA), 페닐메탄슬포릴 플루오리드(PMSF), 요오드아세트아미드 (iodoacetamide), 프로테아제 인히비터 칵테일(protease inhibitor cocktail) 및 인산완충식염수(PBS)를 포함하는 용액이 포함될 수 있다. 또한 상기 특이적 세포 용해제에는, 예를 들면, 리소자임 또는 페니실린 및 베타-락탐계 항생제가 포함될 수 있다. 일 양상의 구체예에서는 옥틸 글루코시드(octyl glucoside), 소듐 디옥시콜레이트(sodium deoxycholate), 에틸렌다이아민테트라아세트산(EDTA), 페닐메탄슬포릴 플루오리드(PMSF), 요오드아세트아미드 (iodoacetamide), 프로테아제 인히비터 칵테일(protease inhibitor cocktail) 및 인산완충식염수(PBS)를 포함하는 용액을 사용하여 암 조직의 용해액을 제조하였다.

상기 스크리닝 방법에 있어서, (b) 단계는 (b-1) 상기 암 조직의 용해액을 원심분리하여 상등액을 수득하는 단계; 및 (b-2) 상기 (b-1)단계의 상등액의 HLA에 특이적으로 결합하는 항체를 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 (b) 단계에서 사용되는 항체는 HLA 클래스 1 또는 클래스 2와 특이적으로 결합되는 것일 수 있다.

또한 상기 스크리닝 방법에 있어서, (c) 단계는 (c-1) 상기 (b) 단계의 항원-항체 반응의 결과물을 세척하는 단계; (c-2) 세척물을 아세트산 용액으로 용출하여 용출물을 수득하는 단계; 및 (c-3) 상기 용출물에서 펩타이드를 정제하는 단계를 포함할 수 있다.

일 양상에 있어서, 상기 (d) 단계의 HLA의 대립유전자는 암 조직에서 보편적으로 발현되는 HLA의 대립유전자라면 제한 없이 포함될 수 있으나, 상기 대립유전자는 예를 들어 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DR 및 HLA-DQ로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 상기 HLA-A 클래스 중 A11:01, A24:02, A02:01 또는 이들의 조합일 수 있다. 본 명세서 내의 구체적인 일실시예에서는 삼중음성 유방암에서 가장 보편적으로 나타나는 A11:01형 HLA에 특이적으로 결합하면서 동시에 면역원성이 높은 펩타이드를 스크리닝하였다.

일 양상에 있어서, 상기 (e) 단계의 면역원성은 말초혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell) 또는 세포독성 림포구 (Tumor infiltrating lymphocyte: TIL)를 이용하여 확인하였으며, 또한 상기 (e) 단계의 면역원성을 말초혈액 단핵세포에서 사이토카인(cytokine)의 분비를 이미징 시스템 장비를 통하여 확인할 수 있으며, 예를 들어 상기 이미징 시스템 장비는 High content screen (HCS) 시스템을 활용할 수 있다.

상기 사이토카인은 예를 들면, 종양괴사인자-α(TNF-α), 인터페론-γ(INF-γ), 대식세포 염증성 단백질-1β(MIP-1β) 인터류킨-6(IL-6), 또는 인터류킨-12(IL-12)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한 상기 (e) 단계는 세포 이미징화 시스템에 의하여 인터페론 감마(IFN-γ)의 분비가 검출되는 경우에 상기 펩타이드를 면역원성이 나타나는 펩타이드로 결정하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 신생항원은 네오항원이라고 불리며, 상기 신생항원은 암조직 체세포 돌연변이에 의해 나타난 돌연변이 기반 펩타이드 서열을 의미한다. 상기 신생항원은 바이러스 단백질, 번역-후변형 또는 점 돌연변이(point mutation), 삽입-결실, 또는 오픈리딩 프레임(open reading frame)의 변화와 같은 체세포 돌연변이에서 발생할 수 있는 것으로 알려져 있다. 상기 신생항원은 공통된 신생항원으로서 정상적인 게놈에서는 발견되지 않으나 특정 암 유형 또는 환자 사이에 공통적으로 나타나는 공통 신생항원(Shared neoantigen) 및 개개인의 암환자에 따라 돌연변이 위치나 정보가 달라져 나타나는 개인화된 신생항원(personalized neoantigen) 2개의 하위 그룹을 가지며, 일 양상에 있어서 상기 신생항원은 상기 공통 신생항원과 개인화된 신생항원을 포함할 수 있다.

중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 고려하여 생락하며, 본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예 기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 암세포 발현 HLA에 특이적으로 결합하는 펩타이드의 정제 및 분석

공통 암 항원을 확인하기 위하여 암 조직에서 발현하는 인간 백혈구 항원(HLA)와 결합하는 펩티돔을 펩티돔-MHC간 면역침강반응 (Immunoprecipitation: IP)을 통하여 수득한 펩타이드를 분석하였다. 동결된 삼중 음성 유방암(Triple negative breast cancer : TNBC) 환자의 조직 41 mg을 파쇄기(CP02 cryoPREP Automated Dry Pulverizer)로 파쇄하고 600 μL의 융해액(1% 옥틸 글루코시드(octyl glucoside), 0.25% 소듐 디옥시콜레이트(sodium deoxycholate), 1 mM 에틸렌다이아민테트라아세트산(EDTA), 1 mM 페닐메탄슬포릴 플루오리드(PMSF), 0.2 mM 요오드아세트아미드 (iodoacetamide), 프로테아제 인히비터 칵테일(protease inhibitor cocktail) 및 인산완충식염수(PBS))을 넣고 1시간 동안 정치한 후, 15,000 rpm으로 4°C에서 20분간 원심분리를 실시하였다. 이후 상등액을 분리하여 50 μL의 HLA-항체-레진(resin)과 4°C에서 2시간 동안 반응시켰다.

이후, 150 mM의 NaCl 및 20 mM의 Tris-HCl로 이루어진 세척용액 A (pH 8.0), 400 mM의 NaCl 및 20 mM의 Tris-HCl로 이루어진 세척용액 B(pH 8.0) 및 20 mM Tris-HCl의 세척용액 C (pH 8.0) 순으로 용액을 300 μL씩 3 회 레진에 처리하여 세척하였다. 이후 100 μL의 0.1 M 아세트산(acetic acid) 용액으로 8회 용출시키고, 용출하여 얻은 용액을 tC18 레진을 이용하여 정제하였다. 이후 최종적으로 정제하여 수득한 펩타이드를 30% 아세토나이트릴(acetonitrile) 및 0.1% 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid, TFA) 용액으로 용출하여 건조한 후, 0.1% 포름산(formic acid) 용액에 녹여 LTQ-Orbitrap 질량분석기로 분석하였으며, 수득한 질량분석 데이터를 MaxQuant 프로그램을 이용하여 분석하여 HLA에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 동정하였다. 펩타이드의 분석조건을 효소 특이도(enzyme specificity)를 unspecific으로, false discovery rate를 0.01로, 펩타이드 길이를 8~15로, 최대 펩타이드 질량을 1,500kDa으로, 최대 전하를 3으로 하였다.

상기 펩티돔-MHC간 면역침강반응이후 수득한 펩티돔 분석을 통하여 총 1000여종의 후보군 펩타이드를 결정하였다.

실시예 2. 공통 암 항원 후보군 펩타이드의 선별

실시예 1에서 수득한 1000여종의 1차 후보군 펩타이드 중 공통 암 항원 후보 펩타이드를 선별하기 위한 실험을 수행하였다. 동정된 펩타이드는 NetMHC (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/) 프로그램을 이용하여 각 HLA 대립유전자(allele)에 대한 친화도를 분석하였다. 또한 각 펩타이드에 대하여 IEDB Analysis Resource (http://tools.iedb.org/immunogenicity/) 프로그램으로 상기 실시예 1에서 수득한 1000여종의 펩타이드의 면역원성을 분석하였다. 상기 분석된 내용을 바탕으로 암 조직 유래된 펩타이드 중 면역원성이 높은 순으로 후보를 선별하였다. 최종적으로 선별한 후보 펩타이드를 바이오인포매틱스 분석을 기반으로 하여, HLA 대립유전자에 대한 친화도가 500 nM 이하인 상위 50개의 펩타이드를 선별하였다.

실시예 3. 최종적인 공통 암 항원 펩타이드의 선별 및 이에 대한 검증

상기 실시예 2에서 선별된 50개의 펩타이드를 면역원성 스크리닝 시스템을 활용하여 공통 암 항원 펩타이드를 결정하기 위한 스크리닝 실험을 수행하였다. 실시예 2에서 선별한 펩타이드의 처리 조건은 다음과 같다: 384 웰을 이용하여, 각 웰당 5 X 10⁴ PBMC 세포를 50 μl 씩 접종 한 후, 5회 반복으로 선별된 20 ug/ml의 펩타이드를 세포에 접촉시켰다. 이후, 세포 배양액에 20 ng/ml의 IL-7를 넣고 배양하였다. 이때, 면역원성에 대한 양성군에는 CD3/CD28 비드(B:C = 1:2) (Stem cell, USA)를 처리하여 T 세포를 활성화 시켰으며, 반면 음성 대조군에는 펩타이드가 포함되지 않은 PBS 버퍼만 처리하였다. 펩타이드를 접촉시킨 PBMC 세포를 100 U 의 IL-2를 포함하는 배지에 배양시켰으며, 3일마다 ½ 씩 새로운 배지로 교체하여 1주일 정도 배양하였다.

이후 CD8+ 세포 매개 면역 원성 스크리닝을 세포 내 착색(intracellular staining) 방법을 이용하여 세포 내 INF-γ 마커 검출을 위한 이미징화 실험을 수행하였다. 양성군에서 세포 내 INF-γ 배출을 증가시키기 위하여 세포 내 착색을 수행하기 직전, 최종 농도 20 ng/ml의 PMA 및 최종 농도 1 μg/ml의 이오노마이신(Ionomycin)를 세포에 처리하였다. INF-γ 이외 세포 밖으로 분비되는 사이토카인을 억제하기 위하여, 1:000 배율로 희석한 BFA(Biolegend)를 8시간 가량 세포에 처리 후, 4% PFA/PERM buffer (BD, USA)로 세포 고정시켰다. 이후, 세포막을 구멍을 낸 후, 세포 내 착색 방법을 진행하였다. 세포 내 착색 마커인 CD8A, INF-γ, 및 CD4을 검출하기 위하여, CD8a-alexa 488 (BD), INF-γ-APC (Biolegend), 및 CD4-alexa549 항체를 1:50 배율로 희석하여 4℃에서 하룻밤 동안 처리한 후, PBS 로 3번 워싱하였다. 워싱 후, 60 nM 의 DAPI가 첨가된 PBS 를 20 μl씩 처리하고, Operetta (Perkin Elmer) 이미징 시스템 장비를 사용하여 이미징화하였으며, 이미징화하여 확인한 INF-γ 검출 결과를 도 2에 나타내었다. CD8+ T 세포를 녹색으로, INF-γ를 분비하는 세포는 적색으로 라벨링하였다.

도 2에서 확인한 바와 같이, 녹색 및 적색으로 염색된 PBMC 세포를 통하여 후보군 펩타이드를 처리한 경우의 세포의 발현 차이에 의하여 공통항원을 효율적으로 선별할 수 있음을 확인하였다. 특히, 양성 군에서는 INF-γ의 검출이 많은 반면, 음성대조군에서는 INF-γ검출이 거의 없는 것을 확인하였다. 따라서, 상기와 같은 발현 차이의 분석을 통하면 후보군 펩타이드가 효과적으로 면역원성을 나타내는 것인지를 효과적으로 확인할 수 있어, 암 조직 내 공통적으로 발현되는 HLA에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 스크리닝 할 수 있음을 확인하였다.

실시예 4. A11:01에 특이적으로 결합하는 공통 암항원 펩타이드에 대한 면역원성 검증

공통 암 항원을 찾아내기 위하여, TNBC 환자의 조직에서 보편적으로 과발현되는 A11:01에 특이적으로 결합하는 펩타이드에 대한 면역 원성을 검증하기 위한 실험을 실시하였다. A11:01을 발현하는 3명의 기증자로부터 유래한 PBMC 세포를 이용하고, 실시예 1 내지 3에서 개시하고 있는 실험방법을 수행하였다. 면역원성에 대한 세포 내 착색에서 CD8+ T 세포를 녹색으로, INF-γ를 분비하는 세포는 적색, CD4를 가진 세포를 보라색으로 라벨링하였다. 3명의 기증자로부터 유래된 PBMC 세포에 선별된 후보군 암항원 펩타이드 중 2종의 펩타이드에 대한 면역원성을 확인한 결과를 도 3A에, 후보군 펩타이드 20종에 대한 면역원성을 확인한 이미지를 펩타이드 별 면역원성 정도를 정량적 그래프로 나타낸 결과를 도 3B에 나타내었다. 총 50종의 펩타이드 후보군 중 최종적으로 A11:01에 특이적으로 결합되는 펩타이드 중 가장 면역원성이 높은 4종의 펩타이드로 최종적으로 선별된 CDC5L, ELF4A1, TCP1 및 CTNNB1에 대한 면역원성을 확인한 결과를 도 4에 나타내었다.

도 3A에서 확인한 바와 같이, 선별된 후보군 펩타이드를 A11:01을 가진 PBMC 세포에 처리한 경우에 처리된 각각의 펩타이드 별 발현되는 INF-γ 을 검출함으로써, 상기 TCP1 및 CTNNB1의 펩타이드가 면역원성을 나타내는 공통 암항원 펩타이드가 될 수 있음을 확인하였다. 도 3B에서 확인한 바와 같이, 20종의 후보군 펩타이드 중 P12가 각기 다른 유래의 PBMC에서 모두에서 높은 정도의 면역원성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 도 3A 및 3B과정으로 확인한 후보군 펩타이드 중 보편적으로 면역원성이 높은 펩타이드에 대한 선별과정을 거쳐서 최종적으로 선별된 CDC5L, ELF4A1, TCP1 및 CTNNB1가 음성대조군 대비 높은 정도의 면역원성을 나타내는 것을 도 4에서 확인하였다. 따라서, 보편적인 암조직에서 과발현되는 HLA에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 간편하게 찾아낼 수 있어 암에 대한 공통항원을 효율적으로 선별할 수 있음을 확인하였다.

Claims

(a) 암 조직을 파쇄하고 용해액을 첨가하여 암 조직의 용해액을 제조하는 단계;
(b) 상기 암 조직의 용해액에 인간 백혈구 항원 (human leucocyte antigen : HLA)에 특이적으로 결합하는 항체를 접촉시켜 항원-항체반응의 결과물을 수득하는 단계;
(c) 상기 (b) 단계의 결과물에서 결합된 펩타이드를 정제하여 수득하는 단계;
(d) 상기 (c)단계에서 수득한 펩타이드를 HLA 대립유전자(allele)에 대한 친화도가 높은 펩타이드를 선택하는 단계; 및
(e) 상기 (d) 단계의 선별된 펩타이드 중 T세포 특이적인 면역원성이 나타나는 펩타이드를 선별하는 단계를 포함하는, 암 공통 항원을 스크리닝 하는 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 (a) 단계의 용해액은 비특이적 세포 용해제 또는 특이적 세포 용해제를 포함하는 것인, 암 공통 항원을 스크리닝 하는 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 (b) 단계는 (b-1) 상기 암 조직의 용해액을 원심분리하여 상등액을 수득하는 단계; 및 (b-2) 상기 (b-1)단계의 상등액의 HLA에 특이적으로 결합하는 항체를 접촉시키는 단계를 포함하는, 암 공통 항원을 스크리닝 하는 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 (b) 단계의 항체는 HLA 클래스 1 또는 클래스 2와 특이적으로 결합되는 것인, 암 공통 항원을 스크리닝 하는 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 (c) 단계는 (c-1) 상기 (b) 단계의 항원-항체 반응의 결과물을 세척하는 단계; (c-2) 세척물을 아세트산 용액으로 용출하여 용출물을 수득하는 단계; 및 (c-3) 상기 용출물에서 펩타이드를 정제하는 단계;를 포함하는, 암 공통 항원을 스크리닝 하는 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 (d) 단계의 HLA 대립유전자는 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DR 및 HLA-DQ로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 암 공통 항원을 스크리닝 하는 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 (d) 단계의 대립유전자는 A11:01, A24:02, A02:01 또는 이들의 조합인 것인, 암 공통 항원을 스크리닝 하는 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 (e) 단계의 면역원성은 말초혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell) 또는 세포독성 림포구 (Tumor infiltrating lymphocyte: TIL)를 이용하여 확인하는 것인, 암 공통 항원을 스크리닝 하는 방법.
청구항 8에 있어서, 상기 (e) 단계의 면역원성은 말초혈액 단핵세포 또는 세포독성 림포구 (Tumor infiltrating lymphocyte: TIL)에서 사이토카인(cytokine)의 분비를 검출하는 것에 의하여 확인되는 것인, 암 공통 항원을 스크리닝 하는 방법.
청구항 8에 있어서, 상기 (e) 단계의 면역원성이 나타나는 펩타이드의 선별은 세포 이미징화 시스템에 의하여 인터페론 감마(IFN-γ)의 분비가 검출되는 경우에 상기 펩타이드를 면역원성이 나타나는 펩타이드로 결정하는 것인, 암 공통 항원을 스크리닝 하는 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 암은 폐암, 후두암, 위암, 대장/직장암, 간암, 담낭암, 췌장암, 유방암, 난소암, 자궁암, 자궁경부암, 전립선암, 신장암, 피부암 등의 상피세포 등에서 유래하는 암종(carcinoma), 골암, 근육암, 지방암, 섬유세포암 등의 결합조직세포에서 유래하는 육종(sarcoma), 백혈병, 림프종, 다발성골수종 등의 조혈세포에서 유래하는 혈액암, 신경조직에 발생하는 종양, 및 삼중음성유방암(Triple negative breast cancer) 으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것인, 암 공통 항원을 스크리닝 하는 방법.
(a) 암 조직을 파쇄하고 용해액을 첨가하여 암 조직의 용해액을 제조하는 단계;
(b) 상기 암 조직의 용해액에 인간 백혈구 항원 (human leucocyte antigen : HLA)에 특이적으로 결합하는 항체를 접촉시켜 항원-항체반응의 결과물을 수득하는 단계;
(c) 상기 (b) 단계의 결과물에서 결합된 펩타이드를 정제하여 수득하는 단계;
(d) 상기 (c)단계에서 수득한 펩타이드를 HLA 대립유전자(allele)에 대한 친화도가 높은 펩타이드를 선택하는 단계; 및
(e) 상기 (d) 단계의 선별된 펩타이드 중 T세포 특이적인 면역원성이 나타나는 펩타이드를 선별하는 단계를 포함하는, 신생항원(Neoantigen)을 스크리닝 하는 방법.