JP2011250787A - 免疫応答の評価方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】免疫調節ペプチドの同定方法、および、より具体的には、免疫応答の多重分析による抗原ペプチドの同定のための新規方法を提供する。
【解決手段】サブセットにおいて目的の免疫反応性を導き出すエピトープが該サブセットのターゲティング剤として同定される、免疫反応性の複数のパラメータについて培養物を同時に分析して最低1個のエピトープを同定することにより、被験体のHLSタイプに依存しないT細胞エピトープを同定するための組成物および方法。
【選択図】なし
【解決手段】サブセットにおいて目的の免疫反応性を導き出すエピトープが該サブセットのターゲティング剤として同定される、免疫反応性の複数のパラメータについて培養物を同時に分析して最低1個のエピトープを同定することにより、被験体のHLSタイプに依存しないT細胞エピトープを同定するための組成物および方法。
【選択図】なし
Description
本出願は、免疫調節ペプチドの同定方法、および、より具体的には、免疫応答の多重分析による抗原ペプチドの同定のための新規方法および系に関する。
免疫系は微生物の傷害に対する保護を提供する。それは、その本当に本質により複雑な系である。それは自己組織に対する付随的な損傷を制限しつつ、絶え間なく変わる脅威を認識しかつそれらに適合することが可能でなければならないからである。免疫機能不全(機能亢進および機能低下の双方)が多くのヒト疾患の根源であることは、この複雑さの結果である。養子免疫系(B細胞およびT細胞から構成される)は、特化された分類の抗原提示分子に結合しかつその情況で提示されるペプチド、糖ペプチド、リンペプチドおよび脂質のような分子パターンの形態の抗原を認識する。T細胞により認識される抗原由来のフラグメント、例えばペプチドはエピトープと称される。その特異的エピトープのT細胞による認識が養子免疫機能の中心事象であることが広く受け入れられている。
これらの特化された抗原提示分子は:i)高度に多形性でありかつ2つの主要なクラスすなわちクラスIおよびクラスIIに分離され得る古典的なヒト白血球抗原(HLA)タンパク質;ii)HLA E、FおよびG下位遺伝子座(sublocus)によりコードされる古典的でない群(非特許文献1)、ならびにiii)抗原提示分子のCD1ファミリー(非特許文献2)を包含する。HLAクラスI分子は、HLA A、BおよびC遺伝子座によりコードされ、そしてCD8+細胞傷害性T細胞に8〜10アミノ酸(AA)のペプチドを提示する(非特許文献3)。HLAクラスII分子は、12〜16AAのペプチドをCD4+ヘルパーT細胞に提示し、そしてHLA DR、DPおよびDQ遺伝子座によりコードされる(非特許文献4)。T細胞は、抗原提示分子の状況でのみ、ならびに適切な抗原のプロセシングおよび提示後にのみ抗原を認識する。HLA依存性の抗原提示については、抗原プロセシングは通常、タンパク質のタンパク質分解性の断片化よりなり、HLA分子の溝にはまるポリペプチドをもたらし、そしてこのペプチド/HLA複合体はその後、抗原提示細胞の細胞表面上でT細胞に提示される(非特許文献5、非特許文献6)。古典的でない群はHLA E、FおよびG下位遺伝子座によりコードされ、そして、低い程度の多形、および免疫エフェクター細胞に結合しかつ拘束された一組のペプチドを提示する能力を特徴とする。非古典的HLA分子により提示されるペプチドの認識は、母体と胎児の界面および/若しくは腫瘍免疫のような領域での免疫寛容の誘導において重要であることが示されている。これらの特化された分子の間での他の重要な群は、免疫系での特化されたエフェクター細胞への細菌の糖脂質のような脂質の提示に関与するCD1ファミリーである。
3つの主要な型のT細胞免疫、すなわちタイプ1(Th1)、タイプ2(Th2)および制御性(制御性T)が抗原認識の後に続くとみられる。タイプ1の免疫は、細胞内病原体の消失および抗腫瘍免疫に重要であり、そして主としてIFNガンマ(IFN−γ)の発現を特徴とする。タイプ2の免疫は細胞外病原体の消失に決定的に重要であり、そして主としてIL−4、IL−5、IL−9およびIL−13のようなサイトカインの発現を特徴とする。IL−10若しくはTGF−βのようなサイトカインにより媒介される制御性T型の免疫は、自己寛容の発生および維持に不可欠である。これら3種の型の応答は、古典的なα/β TCTR+ CD8+ T細胞に制限されず、そしてまた、γ/δ TCR+ CD8+ T細胞、ならびにナチュラルキラー(NK)細胞およびNK T細胞によっても媒介され得る。従って、これらの細胞型のいずれかによる特異的抗原エピトープの認識は、それらの活性化および独特の特化された応答に至る。免疫応答の質は、従って、サイトカインパターン(タイプ1、タイプ2および制御性T)の協調発現を観察することにより記述しうる。
免疫反応の経過の間の適切なT細胞応答の活性化は、しばしば、1種の特化された応答の他を上回る優性性を伴う。適切な特化されたT細胞応答のこの選択的活性化は、疾患の転帰の決定的に重要な決定子である。これの特筆すべき一例は、感染に対するタイプ1応答が保護免疫を特徴としかつタイプ2応答がしばしば致死的な疾患に至る、らいでの患者応答で示される。腫瘍免疫に関する別の劇的な例においては、制御性T細胞応答への不適切な移動に至る免疫寛容誘発性エピトープが、ヒトで後の腫瘍進行をもたらすことが示された一方、腫瘍抗原エピトープによるタイプ1応答の活性化は腫瘍増殖の阻害を伴う。さらに、制御性T細胞応答から離れる不適切な移動は、自己抗原が提示される場合に自己免疫疾患の発症に至ることがある。自己免疫疾患の特定の臨床像は優性な応答、すなわち、1型糖尿病の場合でのようなタイプ1、若しくはアレルギーの場合でのようなタイプ2のいずれかに依存するとみられる。
これらの特化されたT細胞応答の活性化は、それらへの特異的エピトープの提示に依存するため、従って、これらのペプチドエピトープを同定することが有利であると思われる。これらの特化されたT細胞エピトープを疾患状態の早期に同定することにより、適切なT細胞応答を高めるか若しくは不適切なT細胞応答を排除し、そしてそれにより免疫応答の均衡を疾患の転帰を改善するように移動させる機会が生じる。これらの抗原性T細胞エピトープの定量的同定および定性的特徴付けのための方法論は、ワクチンの設計、ならびに感染性、自己免疫性および腫瘍性疾患への診断および治療的アプローチの重要な基礎となる。
Braud VM、Curr Opin Immunol.1999 Feb;11(1):100−8 Bendelac A、Science.1995 Jul 14;269(5221):185−6 Adams EJ、Immunol Rev.2001 Oct;183:41−64 Korman AJ、Immunol Rev.1985 Jul;85:45−86 Rock,K、Adv Immunol.2002;80:1−70 Cresswell P、Curr Biol.1994 Jun 1;4(6):541−3
Braud VM、Curr Opin Immunol.1999 Feb;11(1):100−8 Bendelac A、Science.1995 Jul 14;269(5221):185−6 Adams EJ、Immunol Rev.2001 Oct;183:41−64 Korman AJ、Immunol Rev.1985 Jul;85:45−86 Rock,K、Adv Immunol.2002;80:1−70 Cresswell P、Curr Biol.1994 Jun 1;4(6):541−3
[発明の要約]
本発明は、目的の抗原タンパク質から採取されたオーバーラップペプチドのライブラリーからの1種若しくはそれ以上のペプチドの存在下で、被験体の免疫細胞を培養すること、ならびに該ペプチド上のエピトープに対する特異性およびサイトカイン応答のような免疫反応性の複数のパラメータについて、該培養物を同時に分析することによる、被験体からの1種若しくはそれ以上の免疫調節ペプチドを同定するための組成物および方法を包含し、免疫調節ペプチドは、被験体のHLAタイプに依存しないペプチドに対する免疫反応性の存在により同定される。例えば、反応性エピトープはペプチドのプール中の免疫調節ペプチドから選択されうる。該方法はまた、その特定の個体からのペプチド特異的エフェクター細胞の単離も包含する。
本発明は、目的の抗原タンパク質から採取されたオーバーラップペプチドのライブラリーからの1種若しくはそれ以上のペプチドの存在下で、被験体の免疫細胞を培養すること、ならびに該ペプチド上のエピトープに対する特異性およびサイトカイン応答のような免疫反応性の複数のパラメータについて、該培養物を同時に分析することによる、被験体からの1種若しくはそれ以上の免疫調節ペプチドを同定するための組成物および方法を包含し、免疫調節ペプチドは、被験体のHLAタイプに依存しないペプチドに対する免疫反応性の存在により同定される。例えば、反応性エピトープはペプチドのプール中の免疫調節ペプチドから選択されうる。該方法はまた、その特定の個体からのペプチド特異的エフェクター細胞の単離も包含する。
別の例は:被験体から免疫細胞を単離すること;プロセシングされたペプチドライブラリーからの1種若しくはそれ以上のフラグメントの存在下で該免疫細胞を培養すること;ならびに、該フラグメントに対する免疫特異性およびサイトカイン応答の複数のパラメータについて、該培養物を同時に分析することによる、1種若しくはそれ以上の免疫調節フラグメントの同定方法であり、免疫調節フラグメントは、該フラグメントに対する免疫反応性の存在により同定される。この方法を使用して、複数のペプチドフラグメントに特異的なエフェクター細胞を単離することができ、かつ、例えば混合若しくはクローン集団に精製さえしうる。別の例において、本発明は、被験体から1種若しくはそれ以上の免疫細胞を単離しかつ1種若しくはそれ以上の抗原フラグメントの存在下で培養すること;該免疫細胞により産生されるサイトカインを同定すること;および該抗原性物質に応答しての協調的サイトカイン発現に基づき免疫反応性の型を決定することによる、抗原性物質に対し被験体により発現される免疫反応性の型の同定方法を包含する。抗原性物質は、抗原、ペプチド、微生物、細胞、およびそれらの組合せの混合物を包含しうる。抗原タンパク質は、既知若しくは未知のタンパク質および/若しくはタンパク質フラグメント、または、該方法およびその後の特徴付けでの使用の前に大きさにより分画された既知のタンパク質若しくはペプチドから採取されたオーバーラップペプチドのライブラリーからさえの、既知若しくは未知のアミノ酸配列をもつペプチドを包含しうる。何らかの態様において、抗原性物質は、免疫応答の型を駆動するため異なる比で提供される複数の抗原性物質および/若しくはペプチドを包含しうる(例えばTh1対Th2若しくはTc1対Tc2、またはそれらの混合物および組合せ)。
本発明はまた、被験体から免疫細胞を単離すること、目的の抗原タンパク質から採取されたオーバーラップペプチドのライブラリーからの一連のペプチドの存在下で該免疫細胞を培養すること、および免疫反応性の複数のパラメータについて該培養物を同時に分析して、該被験体について最低1種の免疫調節分子を同定して、産生されるサイトカインの同定に基づき該免疫調節分子に対する免疫反応性の型を決定することによる、被験体の免疫状態の評価のための診断方法も包含し、免疫反応性の型が該被験体の免疫状態を暗示する。例えば、該方法は、被験体の免疫抑制の程度、被験体の免疫系の活性化過剰の程度、被験体のT細胞レパートリー、およびなお免疫反応性の型さえ評価しうる。これらは該被験体の免疫関連疾患の危険性を暗示しうる。本発明を使用してモニターしうる免疫関連疾患の制限しない例は:感染性疾患、自己免疫疾患、自己炎症性疾患、癌、慢性炎症およびアレルギーを包含する。
本発明の別の使用は、免疫細胞を、目的の抗原タンパク質から採取されたオーバーラップペプチドのライブラリーの存在下で被験体から培養し、該培養物を免疫反応性の複数のパラメータについて分析して、該被験体のT細胞およびHLAのレパートリーについて最低1種の免疫調節分子を同定し、そして該培養物をサイトカイン産生について分析して、産生されるサイトカインの同定に基づき免疫調節分子に対する免疫反応性の型を決定して、処置の転帰の指標として処置の前の該被験体の該エピトープ特異的な免疫状態を決定する、治療に対する被験体の応答の予測方法にある。治療は、ワクチン接種、受動免疫療法および養子細胞移入のような免疫療法でありうる。別の例は、目的の抗原タンパク質から採取されたオーバーラップペプチドのライブラリーからの一連のペプチドの存在下で、被験体からの1種若しくはそれ以上の免疫細胞を培養すること、ならびに細胞増殖およびサイトカイン産生プロファイルについて該培養物を分析して、免疫調節分子に対する免疫反応性の型を決定することによる、被験体の疾患の経過および臨床転帰の予測方法であり、サイトカイン産生プロファイルは疾患の重症度および疾患の進行若しくは後退の状態のマーカーである。
別の例は、産生されるサイトカインの同定を包含する免疫反応性の複数のパラメータの分析に基づき、被験体について1種若しくはそれ以上の免疫調節分子を同定すること;および該1種若しくはそれ以上の免疫調節分子を含んでなるエピトープ特異的な免疫ワクチンを製造することによる、被験体の治療的介入の調整方法である。ワクチンは、例えば:被験体における特異的な型の免疫応答を高める若しくは低下させる1種若しくはそれ以上の抗原;被験体におけるエピトープ特異的なサイトカイン産生を高める若しくは低下させる1種若しくはそれ以上の抗原;被験体におけるエピトープ特異的なサイトカイン産生を高める若しくは低下させる1種若しくはそれ以上の抗原;および/あるいは被験体における抗体産生を高める若しくは低下させる、または細胞媒介性免疫を高める1種若しくはそれ以上の抗原を包含しうる。
被験体のなお別の免疫モニタリング方法は、ライブラリーから同定される免疫調節ペプチドの1種若しくはそれ以上で被験体を免疫化すること;1種若しくはそれ以上の免疫調節ペプチドへの曝露後に被験体から免疫細胞を単離することにより、被験体のエピトープ特異的な免疫状態を決定すること;ならびに免疫化の前および後の免疫応答の型を比較して、該被験体のエピトープ特異的な免疫状態の変化を決定することを包含する。
操作において、免疫療法の必要な被験体の処置方法は:被験体からの免疫細胞を、1種若しくはそれ以上の免疫調節ペプチドに曝露して、該1種若しくはそれ以上の免疫調節ペプチドにより誘発される免疫応答の型を決定すること;免疫応答の型に影響を及ぼす免疫調節ペプチドで被験体を処置すること;ならびに1種若しくはそれ以上の免疫調節ペプチドで被験体を処置した後に免疫応答の型を評価すること、および、必要な場合は、該1種若しくはそれ以上の免疫調節ペプチドを改変して免疫応答の型を変えることを包含する。治療的有効性の評価は、ワクチン療法、抗癌治療、抗腫瘍療法、臓器移植、アレルギー、自己免疫疾患の治療および感染性疾患の治療をモニターするのに使用しうる。本発明の別の方法は、免疫調節物質、および目的の抗原タンパク質から採取されたオーバーラップペプチドのライブラリーからの1種若しくはそれ以上のペプチドの存在および非存在下で、単離された免疫細胞を培養すること;該ペプチド上のエピトープに対する特異性およびサイトカイン応答のような免疫反応性の複数のパラメータについて、該培養物を同時に分析すること;ならびに免疫調節物質が存在する場合の免疫反応性を、免疫調節物質が非存在である場合の免疫反応性と比較することにより、免疫療法のための新たな治療薬を同定および特徴付けすることを包含し、免疫反応性の阻害は免疫抑制性の治療薬を暗示し、また、免疫反応性の増強はアジュバントを暗示し、かつ、Th1、Th2、Tc1、Tc2およびそれらの組合せに対する免疫応答の型を駆動さえしうる。
1種若しくはそれ以上の治療薬は、免疫調節物質および目的の抗原からの1種若しくはそれ以上のフラグメントの存在および非存在下で、単離された免疫細胞を培養すること;該フラグメントに対する特異性およびサイトカイン応答のような免疫反応性の複数のパラメータについて、該培養物を同時に分析すること;ならびに免疫反応性の細胞を単離することにより同定されうる。抗原は、感染性疾患、癌、腫瘍、自己免疫疾患、自己炎症性疾患、関節炎、糖尿病、アレルギー、臓器移植および骨髄移植でありうる。ワクチンエピトープもまた、目的の抗原タンパク質から採取されたオーバーラップペプチドのライブラリーからの1種若しくはそれ以上のペプチドの存在下で、単離された免疫細胞を培養すること;免疫反応性の複数のパラメータおよびサイトカイン産生について、該培養物を分析して、産生されるサイトカインの同定に際して該ペプチドに対する免疫反応性の型を決定すること;ならびに同一の同定された配列を有する1種若しくはそれ以上のペプチドを伴うワクチンを製造することによっても同定されうる。該方法は、1種若しくはそれ以上のペプチドの配列が単離後に決定さえされうるのに十分柔軟性である。ワクチンエピトープもまた、抗原から採取されたオーバーラップペプチドのライブラリーからの一連のペプチドの存在下で、単離された免疫細胞を培養すること;ならびに、免疫反応性の複数のパラメータおよびサイトカイン産生について、該培養物を分析して、1種若しくはそれ以上のペプチドに対する免疫反応性の型を決定することによっても同定されることができ、ワクチンエピトープは、それらが該抗原に対して導き出す免疫反応性を特徴とする。抗原の例は、ウイルス、細菌、真菌、原生動物、寄生虫若しくは蠕虫を包含する。抗原は自己抗原でありうる。細胞培養物もまた分析することができ、そして、1種若しくはそれ以上のT細胞、B細胞、樹状細胞、単球、好中球、肥満細胞および赤血球のプロファイルも決定しうる。
本発明の組成物は、Th1およびTh2双方のT細胞についての反応性ペプチドが同定された特定の個体に対して免疫反応性と同定されたペプチドライブラリーから単離された、免疫応答の型を改変するために選択される1種若しくはそれ以上のペプチドを包含する。組成物のなお他の例は、Tc1およびTc2双方のT細胞についての反応性ペプチドが同定された特定の個体に対して免疫反応性と同定されたペプチドライブラリーから単離された、免疫応答の型を改変するために選択される1種若しくはそれ以上のペプチドを包含する。これらの組成物は、ワクチンとして、乾燥若しくは液体の形態などに処方しうる。
[発明の詳細な記述]
本発明の多様な態様の作成および使用は下に詳細に論考される一方、本発明は多様な特定の情況で例示され得る多くの応用可能な発明の概念を提供することが認識されるべきである。本明細書で論考される特定の態様は、本発明を作成および使用するための特定の方法を単に具体的に説明し、そして本発明の範囲の範囲を定めない。
本発明の多様な態様の作成および使用は下に詳細に論考される一方、本発明は多様な特定の情況で例示され得る多くの応用可能な発明の概念を提供することが認識されるべきである。本明細書で論考される特定の態様は、本発明を作成および使用するための特定の方法を単に具体的に説明し、そして本発明の範囲の範囲を定めない。
本発明の理解を容易にするために多数の用語を下で定義する。本明細書で定義される用語は、本発明に関する領域の当業者により共通に理解されるところの意味するところを有する。1つの(「a」「an」)および該(「the」)のような用語は単数の実体のみを指すことを意図しておらず、しかしその特定の例が具体的説明に使用されうる一般的分類を包含する。本明細書の用語法は本発明の特定の態様を記述するために使用されるが、しかし、それらの使用は、請求の範囲に概説されたとおりを除き、本発明の範囲を定めない。
本発明は、誘発される応答の型を考慮せずに抗原特異的な免疫応答を評価することが可能である組成物および方法を包含する。本明細書で使用されるところの「誘発される免疫応答の型」若しくは「免疫応答の型」という用語は、ペプチド若しくは抗原を提示する主要組織適合抗原複合体(MHC)に関係なくTh1、Th2、Tc1、Tc2およびそれらの組合せ、若しくは他のT細胞に基づく養子免疫を介する免疫細胞応答の活性化若しくは調節、それにより、MHCに関係して特定のペプチド若しくは抗原を認識しかつそれに応答するT細胞、および同一の細胞、隣接細胞、若しくはその特定のT細胞と相互作用する細胞に対するその効果、またはペプチド若しくは抗原を提示する細胞に対するその効果を記述するのに使用される。熟練した免疫学者は、用語法が重なることがある、すなわち、抗原提示細胞によりプロセシングされかつそれが特定のMHC糖タンパク質すなわちクラスI若しくはクラスIIの情況で提示されるペプチド、抗原若しくはエピトープに負荷されたタンパク質を指すことが一般的であることを認識するであろう。
「ペプチド」、「抗原」若しくは「エピトープ」という用語は、抗原提示細胞による提示後のT細胞による免疫調節の提示に関して使用されることが、本明細書の文脈で使用されるとおり明らかであろう。本明細書で使用されるところの「ペプチド」という用語はアミノ酸の鎖を記述するのに使用される。
本明細書で使用されるところの「抗原」、「免疫原」、「エピトープ」および「抗原決定基」という用語は、免疫応答を調節するペプチドを記述するのに互換性に使用される。本明細書で使用されるところの「調節する」という用語は、例えば細胞の増殖、サイトカイン若しくはイムノカイン分泌、細胞間の相互作用、アポトーシスなどにより測定されるところの免疫応答の活性化、調節、反応不顕化若しくは抑制さえ記述するのに使用される。例えば、T細胞応答は、ある種のサイトカイン若しくはイムノカインが、ある型の応答、例えば抗体産生を活性化し;かつ同時に別の型の応答、例えば細胞傷害性T細胞若しくはNK細胞の活性化を低下させることが可能であるT細胞により放出される場合は「調節され」うる。
本明細書で使用されるところの「免疫調節性」という用語は、特定の抗原、免疫原、エピトープ若しくは抗原決定基が細胞に影響を及ぼし、すなわちその場で若しくはエフェクターカスケードの下流でさえ活性化される細胞に対する効果を記述するのに使用される。
本発明者は、抗原エピトープの予測および特徴付けのための多くのツールが以前に開発されたことを認識した。例えば、主要組織適合抗原複合体(MHC)とペプチドの複合体のX線結晶構造データに主に基づくペプチドとMHCの相互作用のコンピュータモデル化が、タンパク質内の潜在的エピトープを予測するのにしばしば使用される。この方法論は新たな予測アルゴリズムの導入から大きな恩恵を受けたとは言え、それはしかしながら構造データベースの大きさに依存し、そして従ってそのデータ組に表されないMHC複合体の予測でより少なく効率的でありうる。この方法は、抗原エピトープの同定手段を提供するが、しかしそれらのエピトープにより導き出される特異的応答を特徴づけるのに使用し得ない。(Flower DR、Novartis Found Symp.2003;254:102−20;discussion 120−5、216−22、250−2)。
MHCからのペプチドの溶出、次いで質量分析配列決定が、抗原エピトープを同定するために成功裏に使用されている(Hunt DF、Science.1992 Mar 6;255(5049):1261−3)。同定のための強力な方法論とは言え、ペプチド溶出は高価で遅く、そして大きなサンプルサイズを必要とし、それを臨床の設定での使用に非実用的にしている。この方法は抗原エピトープの同定手段もまた提供するが、しかし、それらのエピトープにより導き出される特異的応答を特徴づけるのに使用し得ない。
オーバーラップペプチドのライブラリーが、病原体関連タンパク質中の抗原エピトープを同定するのに使用されている(Martin R、Methods.2003 Mar;29(3):236−47)。ペプチドライブラリースクリーニングは、反応性の読み出しとして生物学的アッセイを使用し、そして従って該エピトープに対する応答の大きさを評価するのに使用し得る。オーバーラップライブラリーを使用することにより、全部の潜在的なクラスIおよびクラスIIエピトープを同定し得る。今日まで、ペプチドライブラリーを使用して潜在的抗原エピトープを評価するのに使用された生物学的アッセイは、以下の方法論、すなわち、細胞質内サイトカイン、ELISAおよび細胞増殖を包含する(Martin R、Methods.2003 Mar;29(3):236−47)。これらのアッセイのいずれかにおけるライブラリー内の所定のペプチドに対する反応性は、抗原エピトープが存在することの指標であるが;しかしながらこれらの方法のいずれも、そのエピトープに対する応答の質、例えば抗原性、アレルギー誘発性、免疫寛容誘発性若しくはいずれかの他の特異的応答に関する明確な指標を与えない。
抗原エピトープの予測および特徴付けに有用な既知の技術の組合せもまた報告されている。組合せアッセイの例を下に示す。
ペプチドライブラリーおよびELISPOT。ELISPOT技術は、表面結合捕捉抗体を使用して、プレート上で培養した細胞から分泌されるサイトカインを結合する。二次標識抗体を使用して、サイトカイン分泌細胞の数を定量化する。細胞をオーバーラップペプチドのライブラリーとともにインキュベートすること、およびサイトカイン産生をELISPOTにより評価することにより、抗原エピトープが単離された(Geginat G、J Immunol.2001 Feb 1;166(3):1877−84)。この方法論は、しかしながら、いずれかの所定のサンプルについてわずか数種のサイトカインの産生を測定し得るために制限される。エピトープ認識に応答して産生されるサイトカインおよびケモカインの完全な範囲を測定することのこの不能は、免疫応答のいかなる特徴付け(すなわちタイプ1、タイプ2若しくは抑制性T(T−Regulatory))も極めて困難にする。
ペプチドライブラリーおよびELISA。ELISA技術は、表面結合捕捉抗体を使用して、細胞から分泌された可溶性サイトカインを結合する。二次標識抗体を使用して、標準曲線と比較した場合の分泌されたサイトカインの濃度を定量する。細胞をオーバーラップペプチドのライブラリーとともにインキュベートすること、およびサイトカイン産生をELISAにより評価することにより、抗原エピトープが単離された。この方法論は、しかしながら、いずれかの所定のサンプルについてわずか数種のサイトカインの産生を測定し得るために制限される。エピトープ認識に応答して産生されるサイトカインおよびケモカインの完全な範囲を測定することのこの不能は、応答のいかなる特徴付け(すなわちタイプ1、タイプ2若しくは抑制性T)も極めて困難にする。さらに、ELISAによる単一サイトカインの評価は、最低100マイクロリットルの生物学的液体および/若しくは培養物上清という大きな容量を必要とする。
ペプチドライブラリーおよび細胞増殖アッセイ。細胞増殖アッセイは、放射核種の取り込み若しくは蛍光色素の希釈を使用して、刺激に応答しての細胞分裂をモニターする。細胞をオーバーラップペプチドのライブラリーとともにインキュベートすること、および細胞増殖アッセイにより細胞分裂を評価することにより、抗原エピトープが単離された(Mutch D、J Acquir Immune Defic Syndr.1994 Sep;7(9):879−90)。この方法論は、しかしながら、細胞分裂は抗原応答の大きさの指標でありうるとは言え、このアッセイが応答の質(すなわちタイプ1、タイプ2若しくは抑制性T)に関する情報を与えないために制限される。いくつかの抗原特異的応答が、抑制性T細胞応答のような迅速な細胞増殖と関連しないことにもまた注目すべきである。
ペプチドライブラリーおよび細胞傷害性リンパ球アッセイ(CTL)。細胞傷害性リンパ球アッセイは、エピトープ認識および細胞溶解性細胞の機能の尺度として、抗原を負荷した(限定されるものでないが、cDNA、ウイルスおよびファージ発現ライブラリー、全タンパク質、タンパク質フラグメント、ペプチド、改変ペプチドならびに脂質を挙げることができる)標的細胞からの放射核種若しくは蛍光色素の遊離をモニターする。細胞をオーバーラップペプチドのライブラリーとともにインキュベートすること、および細胞傷害性リンパ球アッセイにより細胞の細胞傷害性を評価することにより、抗原エピトープが単離された。細胞の細胞傷害性はタイプ1の抗原応答の大きさの指標でありうるとは言え、この方法論は、タイプ1以外の応答(すなわちタイプ2若しくは抑制性T)を評価する場合に制限された使用のものである。CTLアッセイを使用する抗原特異的細胞傷害性の特徴付けは、標的細胞からのレポーター遊離による低感度にしばしば悩まされる。この方法論は高価な細胞培養操作を必要とし、そして従ってハイスループットとみなされ得ないことにもまた注目すべきである。
ペプチドライブラリーおよび細胞質内サイトカイン染色。細胞質内サイトカイン染色技術は、標準的な蛍光染色手順および抗サイトカイン抗体を使用して、抗原刺激に応答して産生された細胞内サイトカインのレベルを測定する。サイトカイン産生の測定およびサイトカイン産生細胞の定量をその後、標準的なサイトメトリー、顕微鏡若しくは分光測光学的技術により達成し得る。細胞をオーバーラップペプチドのライブラリーとともにインキュベートすること、および細胞質内染色によりサイトカイン産生を評価することにより、抗原エピトープが単離された(Karlsson AC、J Immunol Methods.2003 Dec;283(1−2):141−53)。この方法論は、しかしながら、いずれかの所定のサンプルについてわずか数種のサイトカインの産生を測定し得るために制限される。エピトープ認識に応答して産生されたサイトカインおよびケモカインの完全な範囲を測定することのこの不能は、応答のいかなる特徴付け(すなわちタイプ1、タイプ2、抑制性T)も極めて困難にする。この方法論は、それが分析に多数の細胞を必要とし、また、分析される細胞に対し破壊的であるために、さらに制限される。
ペプチド溶出および質量分析配列決定。MHCからのペプチドの溶出、次いで質量分析配列決定は、抗原エピトープを同定するために成功裏に使用されている(Hunt DF、Science.1992 Mar 6;255(5049):1261−3。)。同定のための強力な方法論とは言え、ペプチド溶出は高価で遅く、そして大きなサンプルサイズを必要とし、臨床の設定での使用にそれを非実用的にしている。この方法は抗原エピトープの同定手段を提供するが、しかしそれらのエピトープにより導き出される特異的応答(すなわちタイプ1、タイプ2、抑制性T)を特徴づけるのに使用し得ない。
ペプチドとMHCの相互作用のコンピュータモデル化。主要組織適合抗原複合体(MHC)とペプチド複合体のX線結晶構造データに主に基づく、ペプチドとMHCの相互作用のコンピュータモデル化は、タンパク質内の潜在的エピトープを予測するのにしばしば使用される。この方法論は新たな予測アルゴリズムの導入から大きな恩恵を受けたとは言え、それは、しかしながら構造データベースの大きさに依存し、そして従ってそのデータ組に表されないMHC複合体の予測ではより少なく効率的でありうる(Kuhara S.Pac Symp Biocomput.1999;:182−9。)。この方法は抗原エピトープの同定手段を提供するが、しかしそれらのエピトープにより導き出される特異的応答を特徴づけるのに使用し得ない。
組換え発現クローニングによる抗原の血清学的同定(SEREX)。SEREX技術は、コンビナトリアル発現ライブラリースクリーニングによる、血清抗体により認識されるエピトープの同定を必要とする。SEREX技術は体液性免疫応答の特異性に関して一指標を与えうるとは言え、いかなるこうした指標も細胞性免疫応答の大きさ若しくは性質いずれに関しても示されない(Tureci O、Mol Med Today.1997 Aug;3(8):342−9。)。この技術は時間および労働双方とも集約的であり、そして従って臨床の設定では非実用的である。
複数のサイトカイン分析のためのリアルタイムPCR。リアルタイムPCRを使用して、複数のサイトカインをコードするRNAの発現を定量的様式で測定し得る(Giulietti A.、Methods.2001 Dec;25(4):386−401)。この技術は、しかしながら時間および労働双方とも集約的であり、分析に十分な量のRNAを単離するために多数の細胞を必要とし、そして細胞に対し破壊的である。最後に、RNAの発現は生物学的に活性のサイトカインの分泌を示さない。
上に示されたとおり、抗原エピトープを予測および特徴付けすることが可能な技術が報告されており、そして、いくつかの場合には、有用な情報の量を最大化するために、蛍光に基づく増殖アッセイおよび細胞内サイトカインアッセイのような多様な技術が組み合わせられた。これらの組合せアッセイのアプローチは、しばしば、上述された細胞内サイトカイン染色に伴う限界のような、その個々の構成要素のアッセイの限界に悩まされる。
自動化の影響を受けやすく、非破壊的で、そしてそれを臨床診断の設定に応用可能にしてヒトでの免疫応答の評価を可能にする小さなサンプルサイズを必要とする、ハイスループットの多パラメータ技術に対する緊急のかつこれまで果たされていない必要性が存在する。この必要性は、出現するおよび再出現する病原体、ならびに、免疫応答の像を提供しかつ/若しくは病原体の性質を同定する迅速なアッセイが必要とされる生体脅威(biothreat)病原体を鑑みればとりわけ重要である。上述された方法論のいずれも、抗原エピトープに対する定性的および定量的免疫応答の明確な特徴付けを提供しない。コンピュータモデル化を除き、これらの方法は高処理量を提供せず、診断若しくは免疫モニタリングの観点からそれらの利用性を制限する。
本発明は免疫調節ペプチドおよびそれらの誘導体の同定を提供し、従って診断、予後および治療的意義をもつ、健康なおよび疾患に罹った個体で誘導される免疫応答の型の評価を可能にする。この方法論はまた、それに対して応答が生成されるエピトープを同時に同定しつつ、その応答の質および大きさの双方の尺度も与える。
一局面において、本発明は、誘導される応答の型に関係しない抗原特異的免疫応答の評価方法であり、従って健康なおよび疾患に罹ったの双方の個体で誘導される免疫応答の型の評価を可能にする。この方法論は、それに対し免疫応答が生成されるエピトープを同時に同定しつつ、その応答の質的および量的双方の尺度を与える。
本発明の方法は3種の技術、すなわちヒト若しくは動物いずれかからの免疫細胞の細胞培養、MHCに制限されない抗原性物質の提示、ならびに免疫応答の全部の多様性を観察する能力を提供するサイトカインおよび/若しくはケモカインの存在についての分析の組合せである。一態様において、該3種の技術は、ヒト若しくは動物いずれかからの免疫細胞の細胞培養、MHCに制限されないオーバーラップペプチドのライブラリー、ならびにサイトカインおよび/若しくはケモカインの存在についての多重分析を必要とする。好ましくは、本発明は、第一の相がハイスループットスクリ―ニングであり(第I相)、および第二の相が特異的抗原エピトープの同定を提供する(第II相)、抗原特異的免疫応答の多相評価方法である。
本発明の方法は、ペプチドおよび非ペプチド(例えば糖脂質)双方のエピトープについて多彩な抗原のプロセシング、提示および認識が可能である、存在する複数の細胞型での細胞培養物分析を使用する。本発明の方法に適する細胞は、限定されるものでないがT細胞、B細胞、樹状細胞、単球、好中球、肥満細胞および赤血球を挙げることができる。T細胞、B細胞、NK細胞およびNK−T細胞を包含する単離された末梢血単核細胞(PBMC)は、本発明での使用のための複数の細胞型の容易に得られる供給源を提供する。さらに、サイトカインの産生もまた支援するヒト若しくは動物細胞を培養するための当該技術分野で既知のいかなる標準化された手順も、本発明での使用に適する。
本発明の方法において、いかなる抗原性物質も免疫応答を導き出すのに使用し得る。本発明に適する抗原性物質の供給源は、抗原、ペプチド、タンパク質、微生物、細胞、組織、腫瘍若しくはそれらのいずれかの組合せを包含する。適する抗原性物質は、限定されるものでないが、ペプチド、糖ペプチド、リンペプチド、脂質、糖脂質およびリン脂質を包含する組成物を挙げることができる。
一態様において、オーバーラップペプチドのライブラリーを、目的のタンパク質上の抗原エピトープを同定しかつ免疫応答を刺激するために本発明で使用する。この技術は、いずれかの所定の抗原についての全部の可能なエピトープクラスIおよびクラスIIの同定を提供し、そしてCD4およびCD8双方のT細胞応答に適する。そして、エピトープの同定はHLAハプロタイプにより制限されない。
目的のタンパク質のアミノ酸配列は、小さなオーバーラップペプチド、例えば、例えば3ないし4アミノ酸のオフセット(offset)を伴う一連の8ないし15−merのオーバーラップペプチドに分割する。本発明によれば、オーバーラップペプチドのライブラリーは、製造し得るか、若しくは商業的に入手可能な供給源から購入し得るかのいずれかである。例えば、296アミノ酸を含有するインフルエンザマトリックスタンパク質から、60種のオーバーラップする15−merペプチド(4アミノ酸のオフセットを伴う)のオーバーラップペプチドのライブラリーを製造し得る。
オーバーラップペプチドのライブラリーから、1種若しくはそれ以上のペプチドを培養容器に付着させた細胞培養物容器を調製する。一多相法において、マルチウェルの第I相培養プレートをスクリーニングの目的上使用し、各ウェルは数種のオーバーラップペプチドの1クラスターを含有する。クラスターあたりのオーバーラップペプチドの数、およびスクリーニングに必要とされるクラスターの数は、タンパク質それ自身の大きさに依存する。好ましくは、各クラスターは約5〜10種のオーバーラップペプチド;より小さいタンパク質については約3〜7種のオーバーラップペプチドを含有する。一多相法において、目的のタンパク質のオーバーラップペプチドのライブラリーを、ウェルあたりのクラスターあたり5〜10種のペプチドによりコード化し(coded)、前馴化した96ウェルの第I相培養プレートにクラスターごとに分配する。第II相のためには、反応性クラスター中のオーバーラップペプチドを、ウェルあたり単一ペプチドとして分配する。第I相培養プレートは、処理量を最大化しかつアッセイごとの変動性を最小化するように事前に調製し得る。事前に調製しかつ−80℃で保存したプレートは最低1年の貯蔵寿命を有する。また、特定の第I相クラスターが反復して抗原性であることが見出される程度まで、第II相培養プレートもまた事前に調製し得る。
本発明の免疫応答アッセイを開始するため、目的の免疫細胞を上述された培養容器に添加し、そして培養容器に付着させた抗原ペプチド(1種若しくは複数)に応答してのサイトカインの産生を支援する時間および条件下でインキュベートする。この方法論を使用して評価し得る免疫細胞は、限定されるものでないが、PBMC、リンパ球、T細胞、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、NK細胞、NKT細胞、TCR □□ T細胞、B細胞、単球、樹状細胞および顆粒球を挙げることができる。一方法において末梢血単核細胞(PBMC)を使用する。多相法において、例えば、ウェルあたりクラスターあたり5〜10種のペプチドを含む目的の抗原のオーバーラップペプチドのライブラリーを含有する、上述された1個若しくはそれ以上の暗号化し前馴化した96ウェルの第I相培養プレートに、PBMCをウェルあたり2×105で接種する。免疫細胞をその後、培地、温度およびインキュベーション条件を特定の細胞型について選択された、サイトカインの産生を支援する条件下でインキュベートする。例えば、PBMCは、好ましくは実施例1に記述されるところの完全培地中37℃で18〜48時間インキュベートする。インキュベーション後に細胞をペレットにし、そして上清を各ウェルから単離しかつ多様なサイトカインおよびケモカインの存在について分析する。本明細書に記述されるところの本発明に関して、「サイトカイン」という用語はサイトカインおよびケモカイン双方を表すのに使用される。
本発明により、同一サンプル中で数種のサイトカイン、好ましくは20種若しくはそれ以上のサイトカインの存在について上清を同時に分析することが可能である、当該技術分野で既知のいずれの方法も、本発明で使用し得る。こうした方法は、質量分析、抗体に基づくアレイ、および多重分析ビーズ技術を包含する。サイトカイン多重分析は、それが:i)複数の免疫パラメータの同時測定を見込む、ii)小容量のサンプルを必要とする、iii)サンプルを破壊しない感受性アッセイを提供する;iv)特化された免疫応答に特徴的な特異的サイトカインの協調的発現を支援する、およびv)免疫エフェクターの直接測定を提供する、ために使用される。適する商業的に入手可能なサイトカイン多重分析機は、Luminex100 Cytokine Multiplexワークステーション(Luminex Corp.、テキサス州オースティン)であり、100個までの被検体を同時に測定することが可能であり、小容量のサンプルを必要とし、そして1ミリリットルあたり1〜32,000ピコグラムのダイナッミックレンジ内でサイトカインの存在を迅速に検出する。サイトカイン多重アレイ技術(Luminex)は、小容量中の複数のサイトカインおよびケモカインの同時定量を可能にする(Earley MC、Cytometry.2002 Oct 15;50(5):239−42)。該アッセイは事実上ハイスループットであり、そして多様な生物学的サンプルの分析に応用され得る。刺激若しくは病原体の傷害に応答しての協調的サイトカイン発現を分析することにより、状態特異的なバイオシグネチャが、特異的免疫応答に対応して記述され得る。
一方法において、50マイクロリットルの上清を、96ウェル形式でLuminex100 Cytokine Multiplexワークステーション(Luminex Corp.、テキサス州オースティン)に移し、そして製造元の説明書に従って分析する。上清を、予め調製かつ検証された多重ビーズおよび試薬のマスターミックスを使用して、多様なサイトカインの存在について、二重で迅速にスクリーニングする。
多相法において、第I相サイトカイン分析により反応性について陽性であることが判明する抗原クラスターを、上述されたところのエピトープフォーカシング(epitope focusing)第II相培養プレートでの抗原ペプチドの同定のため、それらの構成要素ペプチド成分に分解する。一方法において、第II相培養プレートは、二重の各クラスターの個々の成分ペプチドを含有する暗号化し予め馴化したウェルストリップよりなる。目的の免疫細胞をウェルストリップに添加し、そしてウェルストリップに付着した抗原ペプチド(1種若しくは複数)に応答してのサイトカインの産生を支援する時間および条件下でインキュベートする。例えば、融解したPBMCを、ウェルストリップにウェルあたり2×105細胞で添加し、そして37℃で18〜48時間培養する。インキュベーション後に細胞をペレットにし、上清を単離し、そしてサイトカイン産生について分析する。一方法において、50マイクロリットルの上清を分析のためLuminexワークステーションに移す。所定のペプチド鎖についての第II相での多重スクリーニングは、第I相分析の間にその親クラスターに応答して産生されたサイトカイン(1種若しくは複数)よりなる。第II相スクリーニングで同定されたペプチドは、該個体により認識される抗原エピトープを表す。同定されたペプチドに応答して産生されたサイトカインおよびケモカインの特徴的なパターンは、そのエピトープにより導き出される特化された応答の型の指標である。
本発明の方法は、ペプチド特異的T細胞エピトープの迅速な同定および特徴付けのためのハイスループット処置である。本明細書に示されるとおり、アッセイの開発および検証は、選択された一群のサイトカインおよびケモカインの同定につながり、それはタイプ1、タイプ2および抑制性T細胞の細胞表現型の同定を可能にする。
本発明の方法は:a)高感度、すなわち試験した全部のサイトカインについて1ミリリットルあたりピコグラムでの検出;b)ハイスループット、すなわちアッセイは48時間以内に完了し得る;c)小容量の生物学的液体中の複数の被検体の分析、例えば50マイクロリットル容量中の最低30種のサイトカインおよびケモカインの評価;d)非破壊的、すなわち多パラメータ分析のための細胞に基づくアッセイの追加を可能にする;ならびにe)HLAハプロタイプに依存しない様式での抗原エピトープの同定を包含する、既存の技術を上回るいくつかの利点を有する。本発明の方法は、複数の免疫パラメータをモニターするためにサイトカイン多重化(mutiplexing)を使用し、そして従って、限定されるものでないが抗原性、アレルギー誘発性および免疫寛容誘発性の応答を挙げることができる免疫応答の質を特徴づけることが可能である。複数のサイトカインの協調的応答をモニターすることにより、抗原エピトープの同定および特徴付けもまた、現在の従来技術の技術よりも感受性である。現在の当該技術の技術のいずれも、単独若しくは組合せのいずれかで、本発明の方法が提供し得るサイトカインの多パラメータ評価ならびに抗原エピトープの同定および特徴付けを提供することが可能でない。さらに、本発明の方法はハイスループット技術の利点を包含する。現在の従来技術の技術と対照的に、本発明の方法は分析されている細胞に対し破壊的でないこともまた注目されるべきであり;それは、従って、限定されるものでないが増殖、細胞内サイトカインおよび表面受容体染色、CTLアッセイおよびELISPOTを挙げることができる、いずれかの数の標準的若しくは通例のイムノアッセイと組合せ得る。最後に、本発明の方法は、いずれかの他の現在利用可能な技術よりも、分析のためにはるかにより小容量の生物学的液体および/若しくは培養上清、ならびにはるかにより少数の細胞を必要とする。従って、本発明の方法は、ハイスループット、低容量、非破壊的技術であり、自動化の影響を受けやすく、そして従って臨床診断、予後および治療的使用に実際的である。
一局面において、本発明は、診断、予後および治療的応用をもつ、免疫調節ペプチドおよびそれらの誘導体の同定を可能にする方法である。(a)診断的:この技術は、患者の既存の免疫状態を評価するのに使用し得る。多様な抗原中のエピトープを同定かつ特徴付けることにより、その個体の完全なT細胞レパートリーの明確な像を決定し得る。この技術は、ハイスループットで、自動化の影響を受けやすく、非破壊的であり、そして小さなサンプルサイズを必要とし、それを臨床診断の設定に応用可能にする。それは、従って、限定されるものでないが、アレルギー、糖尿病、関節炎、狼瘡および多発性硬化症を挙げることができる、多数の自己反応性疾患および過免疫応答の診断において一ツールとして使用し得る。(b)予後:この技術により評価されるところの処置前の個体のエピトープ特異的な免疫状態は、処置の転帰の予後指標としてはたらき得る。従って、治療的介入の経過を、この免疫状態を高める若しくは排除するように調整し得る。この技術は、抗腫瘍免疫療法、臓器移植、アレルギーおよび自己免疫疾患の処置の予後の評価に使用し得る。(c)治療的:本発明の方法は、処置の経過の間に免疫モニタリングツールとして使用し得る。治療の間のエピトープ特異的免疫応答の特異性、大きさおよび質の明確な像が、進行中の処置の有効性を評価するようにはたらき得る。このアプローチからのデータに基づき、特異的免疫応答を高める、調節する、若しくは阻害するように処置を適合させ得る。この技術は、従って、ワクチン開発、抗腫瘍免疫療法、臓器移植、アレルギーおよび自己免疫疾患の領域での進行中の治療的処置を導くのに使用し得る。
別の局面において、本発明は、限定されるものでないが、ワクチン、生物活性ペプチドおよびターゲッティング試薬を挙げることができる新薬の設計において有用であり得る。(a)ワクチン:本発明の方法は、有効なワクチンの開発を大きく助長し得る。この技術を使用して同定される抗原エピトープは、それら自身が、感染性疾患若しくは癌に対する免疫応答を高めるため、または自己免疫疾患、アレルギー若しくは臓器移植の処置のためタンパク質に対する免疫応答を寛容化するための有効なワクチンとしてはたらき得る。(b)生物活性ペプチド:より大きなタンパク質のタンパク質分解により生成される生物活性ペプチドは、顕著な神経調節性および免疫調節性の機能とともに記述されている。この技術を用いて、これらの特性をもつペプチドを迅速に同定し得る。(c)ターゲッティング試薬:細胞上の特異的受容体と相互作用する、この技術を使用して同定される生物活性ペプチドを、特定の細胞集団に薬物を送達するためのターゲッティング試薬として使用し得る。
本発明の方法は、限定されるものでないが、慢性感染、アレルギー、腫瘍性疾患、自己免疫疾患、アルツハイマー病、急性感染性疾患、臓器移植およびアテローム硬化症を挙げることができるいくつかの医学的応用での使用に適する。これらの応用は代表的であることを意味していること、および当該技術分野で既知のような他の応用を本発明の一部として企図していることが理解されるべきである。
慢性感染。膨大な数のおよび多様なヒト疾患が慢性の病原体感染により引き起こされる。これらの疾患の病因は異なりうるとは言え、それらは全部、該病原体に対するおよびタイプ1若しくはタイプ2いずれかの効果的な応答を開始することの不能を特徴とし得る。応答が一旦開始されれば、病原体関連タンパク質の自己エピトープ模倣は、ライム関節炎およびヘルペス関連脱髄性疾患のような、該感染が消失された後も長く持続する自己免疫応答もまた誘発し得る。病原体の免疫認識後の自己免疫反応の出現は、特異的エピトープの選択を、安全な有効な治療にとって決定的に重要にする。研究は、いくつかの慢性感染における調節的応答の不適切な活性化と関係した。本発明の方法は、慢性感染に関する診断、予後および治療的応用に適する。(a)診断的:HBVについてのPCRに基づく検査のようないくつかの慢性に感染性の病原体の非侵襲的診断検査は、臨床の設定で極端な変動性を示す。本発明の方法は、病原体関連ペプチドに対する特異的応答の迅速な検出および特徴付けによる慢性感染の診断に適用し得る。病原体関連の自己免疫性合併症の診断もまたこの技術の使用により助長され得る。(b)予後:本発明の方法は、特異的な病原体関連エピトープに対するタイプ1、タイプ2若しくは抑制性Tいずれかの反応性を検出かつ特徴付けするのに使用し得、それらは順に、疾患の転帰の予後指標としてはたき得、それにより抗生物質治療を導く。本発明の方法は、感染に関連した自己免疫疾患の発症に関する予後指標としてもまたはたらき得る、特定の病原体に関連したエピトープに対する反応性を検出かつ特徴付けするのに適する。(c)治療的:本発明を用いての病原体に関連したタンパク質に対する抗原エピトープの同定および特徴付けは、安全で有効な予防的および治療ワクチンの開発を助長し得る。これらは、自己エピトープ模倣を回避するワクチンの実現を包含すると思われる。ワクチンはまた、病原体プロテオーム内のインバリアントエピトープを標的とする汎バリアント(pan−variant)エピトープの同定も包含するとみられ、従って、同一病原体の複数の株に対する保護、ならびにHIVおよびマラリアの場合でのような各病原体の共通の変異体バリアントを提供する。この技術の応用による制御性Tエピトープおよび応答細胞の同定および排除は、保護的抗病原体応答の開始においてある役割を演じ得る。
アレルギー。アレルギーは、一般には有害でない物質に対する過免疫応答である。タイプ2応答への不適切な移動が、アレルギー性免疫応答の誘発において決定的に重要な役割を演じていることが報告されている。イエダニ、花粉およびカビのような吸入アレルゲン;卵、小麦、大豆およびナッツのような食物アレルゲン;若しくはペニシリンのような若干の薬物を包含する多くのアレルゲンが同定されている。アナフィラキシーと呼ばれる重症のしばしば生命を脅かす反応が生じ得る。アレルギーの情況での抑制性T細胞応答の活性化が、従って有利であると思われる。(a)診断的:皮膚検査およびアレルゲン特異的IgEレベルのような血液検査が、アレルゲンを同定するのに一般に使用される。しかしながら、皮膚検査はアナフィラキシーを経験しうる若干の患者にとって危険であり得る。本発明の方法は、患者特異的なアレルギー誘発性エピトープを同定するための安全な診断ツールとして適用し得る。(b)予後:本発明の方法は、個々のアレルギー患者についてのアレルゲンエピトープの同定を可能にする。これは、処置若しくは経過観察の間の免疫応答をモニターするのに有用である。免疫寛容誘発性の抑制性T細胞刺激性エピトープもまた処置後に同定し得、そして成功裏の治療の予後指標としてはたらき得る。(c)治療的:抗原エピトープの同定は、免疫応答を抑制性Tに切り替えるか、または不適切なタイプ2細胞を選択的に排除若しくは抑制するために使用し得る、新たなペプチドに基づくワクチンにつながり得る。
腫瘍性疾患。腫瘍性疾患は、正常組織から突然変異した異常な細胞の制御されない増殖と定義される。これらは、癌、充実性腫瘍およびリンパ/造血系の悪性病変を包含し、それらの全部が一般に腫瘍と称される。腫瘍環境が、いくつかの異なる機構により腫瘍抗原に対する免疫寛容を誘発することが報告された。腫瘍細胞に対するタイプ1 T細胞の発生は腫瘍増殖の後退若しくは抑制に関する一方、免疫寛容に移動した免疫応答は、癌特異的タイプ1 T細胞の発生を阻害する。しかしながら、若干の癌において、腫瘍抗原特異的なタイプ1 T応答が、抗原の模倣により自己免疫疾患を誘発する。例えば、乳房および卵巣腫瘍抗原CDR2に特異的な細胞傷害性T細胞が、若干の患者で傍腫瘍性小脳変性症(PCD)を誘発することが報告されている。
抗腫瘍免疫の過程での自己免疫反応の出現は、安全で有効な治療に決定的に重要な特異的エピトープの選択を行う。(a)診断的:腫瘍関連の自己免疫性合併症の診断が本発明の方法の使用により助長され得る。(b)予後:この技術を使用する、特定の腫瘍関連エピトープに対するタイプ1、タイプ2若しくは抑制性Tいずれかの反応性の検出および特徴付けは、疾患の転帰の予後指標としてはたらき得る。本発明の方法は、プレワクチンとポストワクチンの間の腫瘍特異的免疫応答の質および大きさを比較することにより、いかなる種類のワクチン処置の評価も可能にする。この技術を使用する、特定の腫瘍関連エピトープに対する反応性の検出および特徴付けは、腫瘍関連の自己免疫疾患の発症に関する予後指標としてはたらき得る。(c)治療的:本発明を用いての腫瘍関連タンパク質に対する抗原エピトープの同定および特徴付けは、安全で有効な治療ワクチンの開発を助長し得る。これは、自己エピトープ模倣を回避するワクチンの実現を包含するとみられる。
自己免疫性疾患。自己免疫疾患は、身体自身の組織に対する免疫応答により引き起こされる障害と定義し得る。自己抗原提示の情況での制御性T細胞の機能から離れる不適切な移動が、自己免疫疾患の発症および進行における決定的に重要な因子であると考えられている。生じる疾患の特定の性質は支配的応答に依存する。例えば、1型糖尿病の症例において、膵島を認識するタイプ1細胞が患者で単離された。(Arif S、J Clin Invest.2004 113:451)。さらに、多発性硬化症患者では、ミエリン塩基性タンパク質(MBP)反応性タイプ1分極T細胞が、in vivo活性化、および病因において主要な役割を演じていることが報告されているクローン増殖を受けることを示す証拠が存在する。制御性T細胞の機能の復帰が、正常な免疫恒常性の再構成に決定的に重要であるとみられる。(a)診断的:本発明の方法は、所定の型の自己反応性免疫細胞の増殖の原因であるドミナントな自己エピトープの同定を可能にする。(b)予後:本発明の方法は、個々の自己免疫患者についての自己抗原エピトープの同定を可能にする。これは処置若しくは経過観察の間の免疫応答をモニターするのに有用である。免疫寛容誘発性の抑制性T細胞刺激性エピトープもまた処置後に同定され得、そして成功裏の治療の予後指標としてはたらき得る。(c)治療的:抗原エピトープの同定は、免疫応答を抑制性Tに切り替えるか、または不適切なタイプ1若しくはタイプ2細胞を選択的に排除若しくは抑制し得る、新たなペプチドに基づくワクチンにつながり得る。
アルツハイマー病。アルツハイマー病(AD)は、知的機能の進行性の後天的損傷である、ゆっくりと進行する形態の痴呆である。ADは、脳領域中の42残基のアミロイドβタンパク質(Aβ)の進行性沈着を特徴とする。報告は、有意により高比率の健康な高齢被験体およびADを伴う患者が、年齢を一致させた成人に比較した場合に、タイプ1およびタイプ2双方の特徴の強いAβ反応性T細胞応答を有したことを示している。(a)診断的:多くの症例で、アルツハイマー病と老人性痴呆の間の鑑別診断は死後にのみ確定的に決定し得る。本発明の方法を使用してAβ反応性T細胞応答を同定し得、それは従ってADの診断指標としてはたらき得る。(b)予後:本発明を用いての特異的免疫応答の同定は、疾患の臨床経過の予測を可能にし得る。
急性感染症。病原体に対するタイプ1応答の誘導は、細菌およびウイルスのような細胞内微生物の感染からの回復に決定的に重要である。対照的に、蠕虫のような細胞外病原体は、そのサイトカインが病原体のIgEおよび好酸球媒介性の破壊を指図するタイプ2細胞の発生を誘導する。エボラウイルス若しくはデングウイルスのような数種のウイルスは、高死亡率を伴う重篤な疾病を引き起こし、それらの双方について認可されたワクチンは確立されていない。マウスモデルにおいて、エボラウイルスの糖タンパク質(GP)およびマトリックスタンパク質(VP40)由来のウイルス様粒子(VLP)を含むワクチンがT細胞およびB細胞双方を活性化することが判明しており、そしてウイルス攻撃から保護する。(a)診断的:本発明の方法は、出現および再出現する病原体および生体脅威病原体の存在を診断する新規エピトープの同定に適する。(b)治療的:本発明の方法は、これらの疾患から回復した患者をスクリーニングすることにより、ウイルス抗原に対するT細胞エピトープを同定し得る。従って、急性の致死的ウイルス感染症に対して新たなペプチドに基づくワクチンを作成し得る。
臓器移植。臓器移植の拒絶は、移植臓器、若しくは移植片対宿主病(GVHD)の場合でのようにレシピエントに対する支配的なタイプ1応答により一般に駆動される過免疫応答である。調節機能が、免疫寛容および長期の移植片認容性の発生において決定的に重要な役割を演じているとみられる。臓器移植の情況での抑制性Tの活性化若しくは支配的なタイプ1応答の選択的排除が、従って有利であると思われる。(a)診断的:本発明の方法は、急性GVHDおよび最も具体的には慢性GVHDの発生を予測し得る免疫反応のパターンの決定に指摘する。(b)予後:移植の前若しくは出現後、ドナー若しくはレシピエントいずれかのサンプル中の存在のドミナントなタイプ1エピトープは、移植片拒絶の予後指標であり得、そして、本発明は、ドミナントなタイプ1エピトープの存在を決定するのに適する。免疫寛容誘発性の抑制性T細胞刺激性エピトープもまた、本発明を用いて処置後に同定され得、そして移植片免疫寛容の予後指標としてはたらき得る。(c)治療的:本発明を用いての抗原エピトープの同定は、免疫応答を抑制性Tに切り替え得るか、または不適切なタイプ1細胞を選択的に排除若しくは抑制するための新たなペプチドに基づくワクチンにつながり得る。
アテローム硬化症。アテローム硬化症は動脈の一般的障害である。脂肪、コレステロールおよび他の物質が動脈壁に蓄積し、そして「粥腫」すなわち斑を形成する。慢性の炎症細胞媒介性の免疫応答が、アテローム硬化症の病因に関与していることが現在認識されている。アテローム硬化斑中でのT細胞の活性化が、酸化されたLDL(oxLDL)のような斑由来抗原により開始されることが報告されている。他者は、頚動脈のヒトアテローム硬化性斑中でのクラミジア ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)反応性T細胞の検出を報告した。(a)診断的:本発明の方法は、免疫反応の初期のパターンの同定に適する。(b)予後:本発明の方法は、T細胞により認識される、oxLDL若しくは交差反応性クラミジア(Chlamydia)抗原のようなアテローム硬化症の病因に関する抗原のエピトープの定量的測定を見込む。(c)治療的:本発明の方法は、アテローム硬化症の進行を予防するための新たなペプチドに基づくワクチンを開発するのに使用し得る特異的エピトープを決定するのに適する。
下に示される実施例は本発明を代表的し、そして本発明を具体的に説明することを意図しているが、しかし本発明の範囲をいかなる方法でも制限すると解釈されるべきでないことが理解されるべきである。本発明の範囲から離れることなく、本発明の方法の特徴の改変を行いうる。代替の方法もまた、本発明の範囲から離れることなく使用しうることが当業者に容易に明らかであろう。とりわけ、実施例に提示されるサイトカイン産生の測定方法は単に代表的なものであり、そしてサイトカイン濃度を測定するための当該技術分野で既知のいかなる方法も本発明で使用し得る。
[実施例]
[実施例]
正常ドナーのPBMCのウイルスペプチドとの単純なインキュベーションにより約48時間で検出された抗原特異的免疫応答。抗原特異的免疫応答がPBMCおよび単一ペプチドを使用して本発明の方法により検出され得るかどうかを決定するために、HLA−A0201+正常志願者から新たに調製したPBMCを、HLA−A0201拘束性ペプチドとともにインキュベートした。ドナーは、他の方法により、Flu−MP特異的CD8+ T細胞を有するが、しかしMage 3特異的CD8+ T細胞を有しないことが既知であった(データは示されない)。
末梢血単核細胞(PBMC)を、HLA−A0201+健康志願者から新たに採取した血液から、Ficoll−Paque密度勾配遠心分離により単離した。PBMCを、10%熱不活性化ヒトAB血清(Gemini Bio−Products)、L−グルタミン(2mM)、ペニシリン(200UI/ml)、ストレプトマイシン(200μg/ml)、ピルビン酸ナトリウム(1mM)、1%非必須アミノ酸、2−β−メルカプトエタノール(50μM、Sigma)およびHEPES pH7.4(25mM、Gibco)を補充したRPMI培地(完全培地すなわちCM)中1×106細胞/mlの濃度で再懸濁した。2×105細胞/ウェルを三重で丸底96ウェルプレートに接種し、そして1μlのHLA−A0201拘束性ペプチド(ストック濃度1mg/ml、培養物濃度10μg/ml);Flu−MP58−66(GILGFVFTL)若しくはMAGE−3271−279(FLWGPRALV、Multi Peptide Systems、カリフォルニア州サンディエゴ)若しくはペプチド希釈剤(H2O中5%DMSO)のいずれかとともにインキュベートした。培養上清を48時間後に収集し、そしてサイトカインおよびケモカインをLuminexで測定した。
Flu−MPペプチドで刺激したPBMCは、48時間以内に、IFN−γを包含する多数のサイトカインを誘導した(データは示されない)。該結果は、正常ドナーからの新鮮PBMCがFlu−MPペプチドに応答しかつ多数のサイトカインを産生したこと、および、抗原特異的免疫応答がペプチドとのPBMCの単純なインキュベーションにより約48時間で検出され得ることを示す。
腫瘍抗原を包含するPBMC中のペプチド反応性細胞の広範なレパートリーについて約48時間で検出された抗原特異的免疫応答。ウイルス抗原はしばしば、腫瘍抗原より強い想起(recall)応答を誘導することが可能である。腫瘍抗原特異的免疫応答が本発明の方法により検出され得るかどうかを決定するため、DCワクチン(黒色腫関連抗原の4種のHLA−A2ペプチドを負荷した自己CD34+造血前駆細胞由来DC)の最低8注入を受領した2例の黒色腫患者からの液体窒素中の低温保存PBMCを、冷PBS中で融解した。PBSでの第二の洗浄後に、PBMCをCM中37℃で15分間インキュベートし、そして細胞破片をナイロン細胞フィルターで除去した。細胞をCMで再度洗浄しそして1×106/mlでCMに再懸濁した。その後、2×105細胞/ウェルを丸底96ウェルプレートに三重で接種し、そして、1μlのHLA−A0201拘束性ペプチドすなわち(ストック濃度1mg/ml、培養物濃度10μg/ml);Flu−MP 58−66、CMV PP65(NLVPMVATV、Biosynthesis、テキサス州ルイスビル)、MAGE−3 271−279、MART−1 27−35(AAGIGILTV)、gp100g209−2M(IMDQVPFSV)、チロシナーゼ368−376(YMDGTMSQV、NCI)若しくはペプチド希釈剤(H2O中5%DMSO)のそれぞれとともにインキュベートした。培養上清を48時間後に収集し、そして産生されたサイトカインをLuminex技術で測定した。加えて、抗原特異的IFN−γ産生T細胞の検出のため、製造元のプロトコル(Mabtech)に従ってELISPOTアッセイを実施した。簡潔には、PBMC(2×105細胞/ウェル)を、10μg/mlのペプチドの存在若しくは非存在下に10μg/mlの一次抗IFN−γモノクローナル抗体(Mabtech、スウェーデン・ストックホルム)で前被覆したプレートに添加した。
直接IFN−γ ELISPOTにより、Flu−MPおよびCMVに対するCD8+ T細胞を有することが既知であった(データは示されない)患者1は、Flu−MP若しくはCMVペプチドに応答してIL−1α、IFN−γ、TNF−αおよびIP−10の誘導を示したが、しかし4種の黒色腫ペプチドではしなかった(データは示されない)。これは、黒色腫ペプチドが免疫応答を非特異的に調節しないことを示す。MART−1特異的CD8+ T細胞ならびにFlu−MP若しくはCMVを有することが示された(データは示されない)患者2は、MART−1ペプチドに応答してのIL−1αのわずかな増大およびIP−10の顕著な増大を表したが、しかし他の黒色腫ペプチドではしなかった(データは示されない)。結果は、正常ドナーからの新鮮PBMCがFlu−MPペプチドに応答しかつIL−1αおよびIP−10を産生することを示す。サイトカイン/ケモカイン産生プロファイルは2例の異なる正常ドナー間で異なり、同一のFlu−MPペプチドを認識する異なる型のCD8+ T細胞がEPIMAXアッセイで同定され得ることを示唆する。IP−10がIFNに応答してアップレギュレートされ得るという事実を考えれば、DCとTの相互作用はT細胞からのIFN−γ産生を誘導することができ、それはDCからのIP−10産生につながる。従って、IP−10はタイプ1 T細胞応答の有用なマーカーであり得る。
ペプチドを負荷したCD34−DCをワクチン接種した黒色腫患者におけるMart−1ペプチドに応答してのIP−10の誘導はIFN−γに依存する。IP−10産生がIFN−γに依存するかどうかを検査するために、HLA−A2黒色腫ペプチドを負荷した自己CD34−DCをワクチン接種した黒色腫患者から得たPBMCを、ブロッキング抗IFN−γR1 mAbの存在下で、MART−1ペプチド#6(10μM)若しくはFlu−MP HLA−A2ペプチド(10μg/ml)のいずれかで刺激した。IP−10産生はIFN−γR1の遮断により完全に無効にされた(データは示されない)。従って、IP−10産生はIFN−γ産生に依存し、IP−10がIFN−γ産生の代理マーカーとなり得ることを示した。
DCワクチン(黒色腫関連抗原の4種のHLA−A2ペプチドを負荷した自己CD34+造血前駆細胞由来DC)の最低8注入を受容した2例の黒色腫患者からの液体窒素中の融解された低温保存PBMCを、丸底96ウェルプレートに三重で接種し、そして10μg/mlのHLA−A0201拘束性ペプチドすなわちFlu−MP58−66、CMV PP65(NLVPMVATV)、MAGE−3271−279(FLWGPRALV)、MART−127−35(AAGIGILTV)、gp100g209−2 M(IMDQVPFSV)、チロシナーゼ368−376(YMDGTMSQV)若しくはペプチド希釈剤(H2O中5%DMSO)のそれぞれとともにインキュベートし;そして培養上清を48時間後に収集しかつサイトカインおよびケモカインの存在についてLuminex技術を使用して量的に評価した。抗原特異的IFN−γ産生T細胞の検出のためELISPOTアッセイを実施し、ここで、PBMC(2×105細胞/ウェル)を、10μg/mlのペプチドの存在若しくは非存在下に10μg/mlの一次抗IFN−γモノクローナル抗体で前被覆したプレートに添加した。該結果は、PBMC中のペプチド反応性細胞の広範なレパートリーが本発明の方法により同定されたことを示した。
本発明の方法は、T細胞により認識される特異的ペプチド配列の同定を可能にする。T細胞により認識される抗原エピトープ(1種若しくは複数)およびそのエピトープにより誘導される免疫応答が本発明の方法で同定され得るかどうかを決定するため、15−merのMART−1ペプチドライブラリーからの4〜7種のペプチドよりなるペプチドの5クラスターを、CD34−DCワクチンを受領したHLA−A0201+黒色腫患者から得たPBMCとともにインキュベートした。4アミノ酸のオフセットを伴う15−merのオーバーラップペプチドは、MART−1の全アミノ酸配列を包含するよう設計した(Mimotopes、カリフォルニア州サンディエゴ)。各ペプチドは2mMで50%アセトニトリルで再構成し、そして使用まで−80℃に保管した。PMBCはDCワクチンを受領した黒色腫患者から得た。4〜6種のクラスターを形成した(clustered)ペプチド(1ペプチドあたり1μl)若しくは単一のペプチド(1μl)を96ウェルプレートに三重で接種し、そして室温で乾燥した。その後、200μlのCM中の2×105PBMCを各ウェルに添加し、そして加湿5%CO2インキュベーター中37℃で48時間インキュベートした。培養上清中のサイトカイン若しくはケモカイン濃度をLuminexで測定した。
有意により多量のIP−10がクラスター#1培養物中で検出されたことが見出された。次に、MART−1ライブラリーからの単一ペプチドを含むPBMCの第二の培養物を、クラスター#1内の原因であるペプチドを同定するために作成した。ペプチド#6は顕著なIP−10を誘導し、このペプチドが黒色腫患者のT細胞のエピトープであることを示す。興味深いことに、このペプチドはHLA−A0201のドミナントなエピトープ配列(MART−127−35;AAGIGILTV)を含有する。DCワクチンを受領した黒色腫患者からPBMCを得た。この患者はHLA−A*0201posであり、そして、四量体結合アッセイで、HLA−A*0201拘束性のドミナントなエピトープ(MART−126−35)を認識するMART−1特異的CD8+T細胞を有することが示された(データは示されない)。PBMCをこのHLA−A*0201のドミナントなMART−1ペプチドと共に培養した場合、2種のサイトカインIL−1αおよびIP−10が特異的に誘導されたが、しかしIFN−γのアップレギュレーションは示されなかった(データは示されない)。IP−10がタイプI若しくはタイプIIインターフェロンに応答して多くの細胞型により分泌されることを考え、われわれは、IP−10がMART−1特異的T細胞から分泌されるIFN−γに応答して産生されたと推測した。従って、IP−10産生はIFN−γの機能を阻害することにより完全に無効にされた(図4C)。該結果は、ペプチドを負荷したCD34−DCをワクチン接種した黒色腫患者におけるMART−1ペプチドに応答してのIP−10の誘導が、IFN−γに依存することを示す。
この患者のPBMCが、このドミナントなエピトープを認識するCD8+ T細胞を含有するかどうかを確認するために、PBMCを、MART−127−35若しくは他のHLA−0201ペプチド(例えばMage−3、チロシナーゼおよびFlu−MP)を負荷した自己単球由来DCとともに培養し、そして抗原特異的CD8+ T細胞集団の誘導について特異的四量体で検査した。図4B−4Eに示されるとおり、MART−1特異的CD8+ T細胞は7日以内に容易に増殖し、この患者がMART−1に対するメモリー若しくはエフェクターCD8+ T細胞を有すること、およびこのCD8+ T細胞集団が本発明の方法によりMART−1ライブラリーを用いて認識されたことを示した。
本発明の方法は多様な型の免疫応答の同定を可能にする。本発明の方法は、免疫応答のためのエピトープならびに誘導される応答の型の同時の同定を可能にする。実施例4に示される一般的方法により、黒色腫患者からのPBMCプレワクチン若しくはポストワクチンいずれかを、MART−1若しくはNY−ESO1ペプチドライブラリーからの5〜6種のペプチドクラスターとともに48時間インキュベートした(MART−1は5クラスターと;NY−ESO1は8クラスターと)。典型的な結果は、多様な免疫応答に対応するサイトカインプロファイルのシグネチャを表すことが示された(データは示されない)。各免疫応答のパターンを表した該ペプチドクラスターは灰色の棒で示した。タイプ1応答において、IL−10産生は抑制されかつIP−10が誘導される。対照的に、抑制性T応答において、タイプ1応答の阻害により、より多くのIL−10が誘導されかつIP−10産生が無効にされる。IL−13およびエオタキシンは、IP−10のレベルに影響を及ぼすことなくタイプ2応答で検出される。従って、本発明は、いかなる種類の抗原によっても約48時間で誘導される多様な型の免疫応答を同定する。HLA−A0201+ドナーからの2×105の新鮮PBMCを、HLA−A0201拘束性Flu−MP58−66、Mage3271−279若しくは希釈剤で、示された時間、三重で刺激した。培養上清中のサイトカインを多重ビーズに基づくサイトカインアッセイで測定した。三重のデータからの平均±SDを示す。この結果は、IL−1aおよびIP−10のペプチド特異的産生が、48時間のペプチド刺激でプラトーに達したことを示す。
本発明の方法は、非T細胞により誘導される他の型の免疫応答の同定を可能にする。15−merペプチドがB細胞、NK細胞若しくはNK−T細胞のような他の免疫細胞により認識されること、および数種のペプチドは同定されていない受容体に結合して免疫応答の調節に至ることが既知である。本発明の別の例を使用して、MHC非拘束性中で調節シグネチャを表したペプチドで非T細胞により誘導される免疫応答を同定した。黒色腫患者からのPBMCを、スルビビンライブラリーからのペプチドクラスターとともにインキュベートした。図6A−6Hに示されるとおり、スルビビンクラスター#3からのペプチド#15はサイトカイン産生の強い調節パターンを誘導した。すなわち、IL−10およびIL−1βが強く誘導され、そして、タイプ1応答のマーカーであるIL−1αおよびIP−10はひどく無効にされた。
この応答がある型のMHC分子に制限されるかどうかを決定するため、5名の正常健康志願者から採取したPBMC由来新鮮血をスルビビンペプチド#15とともに48時間インキュベートし、そして本発明の方法に従ってサイトカイン濃度を測定した。ペプチド#15は全5名の正常志願者でIP−10産生を阻害し(データは示されない)、このペプチドがあるHLAサブタイプに制限されないことを示した。スルビビンペプチド#15は免疫応答を改変する強い能力を有することが示された。ペプチド#15の存在下に生インフルエンザウイルスで刺激した黒色腫患者からのPBMCは、明らかにIL−10産生によるIP−10誘導の強い廃止を表したからである(データは示されない)。さらに、ペプチド#15はTSST−1誘発性のT細胞増殖を部分的に阻害した(データは示されない)。枯渇研究は、CD56+細胞がIL−10産生およびIP−10阻害の原因であったことを示し(データは示されない)、スルビビンペプチド#15がNK、NK−T細胞若しくはγ/δ T細胞集団に作用することを示した。ペプチド#15はまたCD3−CD56+ NK細胞の生存を維持することも示された(データは示されない)。従って、本発明の方法は、ある型のペプチドにより誘導されるいかなる種類の免疫調節の同定にも有用である。
本発明の方法は、ワクチン接種の間の黒色腫患者の免疫モニタリングを見込む。細胞を、暗号化し予め馴化した96ウェルの第I相培養プレート中にウェルあたり2×105で接種した。第I相培養プレートは、クラスターあたり長さ各15アミノ酸の12種のオーバーラップペプチドとともに四重で腫瘍抗原GP100、MAGE3、NY−ESOおよびMART−1のそれぞれ5ペプチドクラスター、ならびにKLHおよび死Colo細胞対照を含有する。プレートは、処理量を最大化しかつアッセイ間の変動性を最小限にするために事前に準備してもよい。細胞を37℃で5日間インキュベートする。同時に、再刺激に指定された細胞を、30:1のPBMC対DCの比の、完全な範囲の抗原ペプチドクラスターを負荷した自己成熟DCの存在下で7日間培養する。第7日にこれらの細胞を徹底的に洗浄し、そして第I相培養プレートに24時間移す。インキュベーション後に、これらの再刺激した細胞はペレットにされることができ、そして150マイクロリットルの各上清を、TECAN Genesis RPSロボットサンプル処理装置(TECAN)を装備した完全自動化Luminex100 Cytokine Multiplexワークステーションに96ウェル形式で移す。
オペレータに依存しないサンプル処理が可能なワークステーションを、バーコード識別および無作為マイクロプレート分析とともに使用しうる。上清を、予め調製しかつ検証した多重ビーズおよび試薬のマスターミックスを使用して、IFN−γ、TNF−α、IL−13、IL−10およびグランザイムBの存在について二重で迅速にスクリーニングする。残存する上清サンプルは後の分析のため凍結する。共培養物からのDCが、第I相プレートでの24時間インキュベーションの間のバックグラウンドのサイトカイン産生に寄与しうることが予期される。成熟DCからの上清は、従ってサイトカイン多重分析において対照としてはたらく。一次刺激アッセイからの細胞を回転して落とし(spun down)、そしてH3チミジンを含有する培地に再懸濁しかつ37℃をインキュベートする。5日後に、抗原特異的増殖をチミジン取り込みアッセイにより四重で評価する。一次刺激アッセイからの上清は後日での分析のため−80℃で凍結する。再刺激後のサイトカイン産生について陽性であるペプチドクラスターを、一次刺激の間のサイトカイン産生についてスクリーニングする。
第I相サイトカイン多重アレイにより反応性について陽性であると判明している腫瘍抗原クラスターを、第II相培養プレート上で抗原ペプチド同定のためそれらの構成成分に分解する。第II相培養プレートは、各クラスターについて12種の成分ペプチドを含有するウェルストリップを二重で包含する。第II相ペプチドウェルストリップは事前に準備し、そしてバーコードラベルを貼付した枠にセットする。融解したPBMCを、第I相で同定された特異的ペプチドクラスターを負荷した自己の成熟DCと37℃で7日間共培養し、洗浄し、そしてウェルあたり2×105で第II相培養プレートに24時間移す。インキュベーション後に細胞をペレットにし、そして150マイクロリットルの上清を分析のためLuminexワークステーションに移す。所定のペプチドストリップについての第II相での多重スクリーニングは、第I相分析の間にその親クラスターに応答して産生されたサイトカイン(1種若しくは複数)よりなる。成熟DC単独が第II相分析のためのバックグラウンド対照としてはたらく。所定のクラスターの抗原ペプチド(1種若しくは複数)が一旦同定されれば、それらを使用して、抗原特異的エフェクター集団を単離する。
第III相モニタリングはペプチド特異的エフェクター細胞の同定および特徴付けよりなる。この手順において、2×106個のPBMCを融解し、そして、第II相で単離された各抗原ペプチドを負荷した自己の成熟DCとともに37℃で7日間インキュベートする。細胞をその後洗浄しそして24時間の再刺激にかける。再刺激後に、細胞をブレフェルジンA処理し、固定し、浸透化し、そして表面マーカーおよび細胞内サイトカイン発現双方を特徴づけるために一団の抗体で染色する。抗原特異的エフェクター集団の同定は、9色分析および分取が可能なFACSariaフローサイトメーター/ソーター(Becton−Dickinson)を使用する多色サイトメトリー分析により達成される。刺激されたT細胞のCTL機能を、ペプチドを負荷され、EBVで形質転換された自己B−LCLを標的として使用するCr51遊離アッセイによりin vitroで測定する。同定後、抗原特異的エフェクター細胞集団を、IL−2およびIL−6の存在下で自己の成熟した抗原ペプチドを負荷したDCと7日間共培養すること、次いでIL−2およびIL−7の存在下でのペプチドを負荷した成熟DCでの毎週の再刺激により、サブクローニングする。クローンのエフェクター細胞集団が一旦確立されれば、遺伝子発現パターンおよび細胞傷害性機能の広範囲の特徴付けに着手する。
本発明の方法は癌におけるワクチンエピトープの選択を可能にする。この技術を使用する特定の腫瘍関連エピトープに対するタイプ1、タイプ2若しくは抑制性Tのいずれかの反応性の検出および特徴付けは、ワクチン接種に使用される場合に所望の型の免疫応答を導き出す、腫瘍関連タンパク質に対する抗原エピトープの同定および特徴付けのためのツールとしてはたらき得る。
ワクチンエピトープを選択するため、患者のPBMCを、腫瘍関連タンパク質からの抗原エピトープを表す一連のペプチドライブラリーに曝露する。48時間培養後に上清を収集し、そして分泌されたサイトカインを本明細書の教示に従って分析する。タイプ1 T細胞応答、例えばIFN−γの産生を誘導するがしかしIL−10(抑制性T応答)若しくはタイプ2サイトカインの産生を誘導しないペプチドのクラスターを同定する。次の段階で、所定の患者のHLAタイプに対応するペプチドをさらに選択し得、そしてこの特定の患者のワクチン接種に使用し得る。従って、患者において所望の型の免疫応答を生じさせるよう調整されたワクチン接種のための剤を、本発明を用いて決定し得る。
本発明の方法は感染性疾患におけるワクチンエピトープの選択を可能にする。微生物病原体に対する現在利用可能なワクチンの多くは保護免疫を賦与しないことが既知である(例えばデングウイルスワクチン)。保護免疫の欠如は不適切な免疫応答の誘導による可能性があり、例えば、現在のワクチンエピトープのいくつかは、タイプ1 T細胞よりむしろタイプ2若しくは抑制性T細胞を誘導することができ、従って免疫応答を非保護的応答にゆがませかつ/若しくは阻害する。本実施例にて、本発明の技術は、ワクチン接種に使用される場合に所望の型の免疫応答を導き出す微生物関連抗原の抗原エピトープの同定および特徴付けのためのツールとしてはたらき得る。
ワクチンエピトープを選択するため、患者のPBMCを、微生物、例えばデングウイルスからの抗原エピトープを表す一連のペプチドライブラリーに曝露する。48時間培養後に上清を収集し、そして分泌されたサイトカインを本発明の教示に従って分析する。タイプ1 T細胞応答、例えばIFN−γの産生を誘導するがしかしIL−10(抑制性T応答)若しくはタイプ2サイトカインの産生を誘導しないペプチドのクラスターを同定する。次の段階で、ペプチドをさらに選択しかつワクチン接種に使用する。従って、本発明の方法は、ワクチン接種に際して保護的微生物免疫の誘導を可能にするエピトープの選択を見込む。
図1は、本発明により評価される正常ドナーの免疫応答を描くグラフであり、ここで、末梢血単核細胞(PBMC)をHLA−A0201+健康志願者から新たに採取した血液から単離し、2×105細胞/ウェルで丸底96ウェルプレートに三重で接種し、そして1μlのHLA−A0201拘束性ペプチドFlu−MP58−66(GILGFVFTL)若しくはMAGE−3271−279(FLWGPRALV)、またはペプチド希釈剤(H2O中5%DMSO)のいずれかとともにインキュベートし;そして培養上清を48時間後に収集し、そしてLuminex技術を使用してサイトカインおよびケモカインの存在について量的に評価した。結果は、正常ドナーからの新鮮PBMCがFlu−MPペプチドに応答しかつ多数のサイトカインを産生したことを示す。
図2は、本発明による正常ドナー中でのHLA−A0201拘束性ペプチドFlu−MP58−66(GILGFVFTL)に対する免疫応答の別の例を描くグラフである。PBMCを、別のHLA−A0201+健康志願者から新たに採取した血液から単離し、5×105細胞/ウェルで丸底96ウェルプレートに三重で接種し、そして10μg/mlのHLA−A0201拘束性ペプチドFlu−MP58−66(GILGFVFTL)若しくはMART−127−35(AAGIGILTV)、またはペプチド希釈剤(H2O中5%DMSO)のいずれかとともにインキュベートし;そして培養上清を48時間後に収集し、そしてLuminex技術を使用してサイトカインおよびケモカインの存在について量的に評価した。結果は、正常ドナーからの新鮮PBMCがFlu−MPペプチドに応答しかつIL−1αおよびIP−10を産生することを示す。該サイトカイン/ケモカイン産生プロファイルは2名の異なる正常ドナー間で異なり、同一のFlu−MPペプチドを認識する異なる型のCD8+ T細胞がEPIMAXアッセイで同定され得ることを示唆する。
図3A−3Dは、本発明により評価されるところの2例の黒色腫患者の免疫応答を描くグラフである。それぞれ患者1および2についての図3Aおよび3Cにおいて、DCワクチン(黒色腫関連抗原の4種のHLA−A2ペプチドを負荷した、自己のCD34+造血前駆細胞由来DC)の最低8注入を受領した2例の黒色腫患者からの液体窒素中の融解した低温保存PBMCを、丸底96ウェルプレートに三重で接種し、そして10μg/mlのHLA−A0201拘束性ペプチドすなわちFlu−MP58−66、CMV PP65(NLVPMVATV)、MAGE−3271−279(FLWGPRALV)、MART−127−35(AAGIGILTV)、gp100g209−2M(IMDQVPFSV)、チロシナーゼ368−376(YMDGTMSQV)、若しくはペプチド希釈剤(H2O中5%DMSO)のそれぞれとともにインキュベートし;そして培養上清を48時間後に収集しそしてLuminex技術を使用してサイトカインおよびケモカインの存在について量的に評価した。それぞれ患者1および2についての図3Bおよび3Dにおいて、抗原特異的IFN−γ産生T細胞の検出のためELISPOTアッセイを実施し、ここで、PBMC(2×105細胞/ウェル)を、10μg/mlのペプチドの存在若しくは非存在下に10μg/mlの一次抗IFN−γモノクローナル抗体で前被覆したプレートに添加した。該結果は、PBMC中のペプチド反応性細胞の広範なレパートリーが本発明の方法により同定されたことを示す。
図4A−4Cは、本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描くグラフである。図4Aについて、DCワクチンを受領したHLA−A*0201pos黒色腫患者からPBMCを得、そしてHLA−A*0201拘束性のドミナントなMART−1ペプチド(MART−126−35)を負荷した自己DCで刺激した。患者は、四量体結合アッセイで、HLA−A*0201拘束性のドミナントなエピトープ(MART−126−35)を認識するMART−1特異的CD8+ T細胞を有することが示された(図4A)。PBMCをこのHLA−A*0201のドミナントなMART−1ペプチドと直接培養した場合、2種のサイトカインIL−1αおよびIP−10が特異的に誘導されたが、しかしIFN−γのアップレギュレーションは示されなかった(図4B)。IP−10がタイプI若しくはタイプIIのインターフェロンに応答して多くの細胞型により分泌されることを考え、われわれは、IP−10がMART−1特異的T細胞から分泌されるIFN−γに応答して産生されたと推測した。従って、IP−10産生は、IFNγRブロッキングmAbを使用してIFN−γの機能を阻害することにより完全に無効にされた(図4C)。該結果は、ペプチドを負荷したCD34−DCでワクチン接種した黒色腫患者におけるMART−1ペプチドに応答してのIP−10の誘導がIFN−γに依存することを示す。
図5は、本発明により評価した正常ドナーの免疫応答のキネティクスを描くグラフである。HLA−A0201+ドナーからの2×105新鮮PBMCを、HLA−A0201拘束性ペプチドFlu−MP58−66若しくはMage3271−279または希釈剤で、指定された時間、三重で刺激した。培養上清中のサイトカインを多重ビーズに基づくサイトカインアッセイで測定した。三重のデータからの平均±SDを示す。これらの結果は、EPIMAXアッセイでのIL−1aおよびIP−10のペプチド特異的産生が、48時間のペプチド刺激でプラトーに達したことを示す。
図6は本発明のエピトープフォーカシングのスキームを描く。最初に、抗原タンパク質をコードする15−merのオーバーラップペプチドのライブラリーを、ペプチドのクラスター(5〜10種のペプチド/クラスター)に二重で分割する。5×105のPBMCを、ペプチドの各クラスターで最初に刺激する(クラスター分析)。培養上清の複数のサイトカインを多重ビーズに基づくサイトカインアッセイで測定し、そして「ヒット」クラスターを決定した。第二の培養物中、すなわちエピトープフォーカシングで、PBMCを「ヒット」クラスターからの個別のペプチドとともに48時間培養し、そしてその後抗原ペプチドを多サイトカイン分析で測定した。
図7は、特異的T細胞により認識されるエピトープの同定を可能にする、本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描くグラフである。PBMCはDCワクチンを受領した黒色腫患者から得た。この患者はHLA−A*0201posであり、そして四量体結合アッセイで、HLA−A*0201拘束性のドミナントなエピトープ(MART−126−35)を認識するMART−1特異的CD8+ T細胞を有することが示された(図4A)。4〜6種のクラスター形成したペプチド(ペプチドあたり10μM)若しくは単一ペプチド(10μM)のいずれかとしてMART−1の全アミノ酸配列を包括する、4アミノ酸のオフセットを伴う15−merのオーバーラップペプチドを、96ウェルプレートに三重で接種し;そして、200μlのCM中の2×105細胞のPBMCを各ウェルに添加し、そして加湿5%CO2インキュベーター中37℃で48時間インキュベートし;そして培養上清中のサイトカイン若しくはケモカイン濃度をLuminexで測定した。図7に示されるとおり、MART−1の#6ペプチドは、ワクチン接種した黒色腫患者から得たPBMCでのIP−10の強い産生を誘導する。MART−1ペプチド#6は、図4Aに描かれるところの10−merのHLA−A2のドミナントなエピトープを含有する。従って、本発明の方法は、ペプチド特異的T細胞応答の同定を可能にする。
図8は、本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描くグラフである。PBMCはDCワクチンを受領した黒色腫患者から得た。この患者はHLA−A*0201posであり、そして、四量体結合アッセイで、HLA−A*0201拘束性のドミナントなエピトープ(MART−126−35)を認識するMART−1特異的CD8+T細胞を有することが示された(図4A)。PBMCを、ブロッキングIFN γR mAb(20μg/ml)若しくは対照mAbの存在下で、A2−MART−1ペプチド若しくは15−merのMART−1ペプチド#6で48時間刺激した。A2−HIVpolペプチドおよび15−merのMART−1ペプチド#15を対照ペプチドとして使用した。培養上清中のL−1aおよびIP−10の濃度を示す。この結果は、IL−1aおよびIP−10の双方の産生が、ペプチド特異的T細胞からのIFN−γ産生に依存することを示し、IL−1aおよびIP−10がタイプ1 T細胞応答、すなわちTh1およびTc1細胞の代理マーカーであることを示す。
図9は、本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描くグラフである。黒色腫患者から得たPBMCを、黒色腫抗原をコードするオーバーラップペプチドのクラスター若しくは個別のペプチドのいずれかで48時間刺激した。48時間培養物での培養上清中のサイトカイン/ケモカインの濃度をLuminexで測定した。この結果は、エピトープフォーカシングの概念を、本発明の方法においていかなる抗原およびいかなるサイトカインにも応用し得ることを示す。
図10は、本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描く。一連のDCワクチン接種を受領した黒色腫患者から得たPBMCを、黒色腫分化抗原MART−1をコードするオーバーラップペプチドのクラスター若しくは個別のペプチドのいずれかで刺激した。培養48時間での培養上清中のIL−1aおよびIP−10の濃度を示す。クラスター分析(上)で、クラスター#2および#3はIL−1aおよびIP−10のアップレギュレーションを誘導した。エピトープフォーカシング(下)で、クラスター#2からのペプチド#6およびクラスター#3からのペプチド#13が、特異的T細胞のエピトープとして同定された。この結果は、本発明の方法が、IFN−γを作成することが可能な特異的T細胞のエピトープを同定することを可能にすることを示す。
図11は、本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描く。PBMCは、白血球分離(leukopheresis)を用いて図10と同一の患者から得、クライオチューブ(cryotube)中のアリコートを作成し、そして使用まで液体窒素中に保管した。融解したPBMCを、MART−1の15−merペプチド#6、ペプチド#13若しくは希釈剤で刺激した。この実験を別個に3回反復した。培養48時間での培養上清中のIL−1aおよびIP−10の濃度を示す。3回の実験のうち3回が、ペプチド#6若しくはペプチド#13での刺激に際してのIL−1aおよびIP−10のアップレギュレーションを示し、このEPIMAXアッセイの高再現性を示す。
図12Aは、本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描くグラフである。黒色腫患者(図10と同一)からDCワクチン接種前および8回のDCワクチン接種後に得たPBMCを、単一の15−merのMART−1ペプチド若しくは希釈剤で刺激した。培養48時間での培養上清中のIL−1aおよびIP−10の濃度を示す。後PBMCは、同定された2種の15−merペプチドすなわちペプチド#6および#13に応答してのIL−1aおよびIP−10のアップレギュレーションを示した一方、前PBMCはペプチド#13に応答してのIL−1aおよびIP−10のアップレギュレーションに失敗した。ペプチド#6に応答しての前PBMCからのIL−1aおよびIP−10産生は後PBMCからのものより少なかった。これらの結果は、DCワクチン接種がペプチド#13特異的T細胞応答を誘導しかつペプチド#6特異的T細胞応答を高めたことを示唆する。この仮説を検査するため、われわれは異なる十分に確立された方法論、細胞内サイトカイン検出アッセイを使用した。同一のPBMCを、抗DC28/CD49d mAbおよびモネンシンの存在下で、MART−1の15−merの単一ペプチドで8時間刺激した。細胞膜の浸透化後に、細胞を抗IFN−γ mAbで染色し、そしてIFN−γ+集団をフローサイトメーターで分析した(図12B)。約0.15%のCD8+ T細胞が、後PBMC中でペプチド#6若しくは#13いずれかに応答してIFN−gを産生した一方、IFN−g産生は前PBMCで検出されなかった。これらの結果は、癌患者において抗原特異的T細胞応答をモニターするのにEPIMAXを使用し得ることを示し、また、各特異的T細胞応答の大きさが、EPIMAXでのサイトカイン/ケモカイン調節の大きさを見ることにより予測可能であることを示唆する。
図13は本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描く。CFSE(5,6−カルボキシフルオレセイン二酢酸塩スクシンイミジルエステル)は、フローサイトメーターを用いて細胞分裂の数を同定することを可能にするトレーサー色素である。EPIMAXは非破壊的アッセイであるため、われわれは、抗原特異的T細胞の増殖能力を測定するため、EPIMAXおよびCFSE技術と組み合わせた。CFSE染色はEPIMAXでのサイトカイン産生を変えないことが確認された。同一の黒色腫患者(図10と同一)から得たPBMCを最初に1μMのCFSEで染色し、そしてMART−1をコードするオーバーラップペプチドのクラスター若しくは個々のペプチドのいずれかで刺激した。培養第8日に、細胞をCD8−PE、CD3−PerCPおよびCD4−APCで染色し、そしてペプチド刺激に応答してのT細胞増殖を分析した。該図はCD8+ T細胞増殖の分析を示す。MART−1クラスター#2および#3、ならびにペプチド#6および#13は、いくつかのCD8+ T細胞集団においてCFSE強度の希釈を誘導し、ペプチド刺激が抗原特異的CD8+ T細胞の増殖を誘導したことを示す。この結果は、他の方法論との組合せが、抗原特異的T細胞のより表現型的および/若しくは機能的特徴付けを得ることを可能にすることを示す。
図14は、本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描く。同一の黒色腫患者(図10と同一)から得たPBMCを、最初に1μMのCFSEで染色し、そしてMART−1をコードする個々のペプチドで三重で刺激した。培養第8日に、細胞をCD8−PE、CD3−PerCPおよびCD4−APCで染色し、そしてペプチド刺激に応答してのT細胞増殖を分析した。該図は、CD8+ T細胞集団内のCFSEが希釈されたCD8+ T細胞集団の%を示す。MART−1ペプチド#6および#13は、いくつかのCD8+ T細胞集団においてCFSE強度の希釈を誘導し、ペプチド刺激が抗原特異的CD8+ T細胞の増殖を誘導したことを示す。
図15は、本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描く。CD8+ T細胞は、抗原提示細胞上で発現されるMHCクラスI分子の情況で8〜10merのペプチドを認識する。同定されたCD8+T細胞の正確なエピトープを決定するため、オーバーラップする10merのペプチドを、15merのMART−1ペプチド#13内で遅れる(lagging)1アミノ酸を伴い生成し、そして同一患者のPBMCを刺激するのに使用した。48時間での培養上清中のIL−1aおよびIP−10の濃度、ならびに培養第8日のCFSE希釈アッセイを示す。これらの結果は、MART−154−62が、IFN−γの産生および特異的CD8+ T細胞の増殖を可能にするCD8+ T細胞のエピトープであることを示す。従って、EPIMAXはCD8+ T細胞の正確なエピトープを同定することを可能にする。
図16A−Dは、本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描く。HLA−A2neg黒色腫患者から得たPBMCを、黒色腫細胞の大部分で広範に発現されている癌精巣抗原NY−ESO1をコードするオーバーラップペプチドのクラスター若しくは個々のペプチドのいずれかで刺激した。クラスター#5内のNY−ESO1ペプチド#24は48時間にIP−10のアップレギュレーションを誘導した(図16A)。これらの結果は、NY−ESO193−107が特異的T細胞によりエピトープとして認識されることを示す。どのT細胞サブセットがこのエピトープを認識するかを検査するため、該患者のPBMCを、抗MHCクラスIブロッキングmAb(W6/32)若しくはアイソタイプ対照mAbの存在下に、NY−ESO1ペプチド#24で刺激した。図16Bに示されるとおり、ペプチド#24に応答してのIP−10産生はW6/32により完全に無効にされ、IP−10の産生がMHCクラスI分子に依存していること、従ってCD8+ T細胞がペプチド#24を認識することを示す。
CD8+ T細胞の正確なエピトープを同定するため、ペプチド#24内の9merのオーバーラップペプチドを生成し、そして患者のPBMCを刺激するのに使用した。図16Cに示されるとおり、NY−ESO194−102はIP−10の強いアップレギュレーションを誘導し、これがCD8+ T細胞のエピトープであることを示す。HLA拘束要素を同定するため、PBMCを、IL−2(10IU/ml)の存在下に、NY−ESO1ペプチド#24でパルスした自己単球由来DCで刺激した。培養第9日に、細胞を、NY−ESO194−102ペプチドでパルスしたか若しくはパルスしていない各HLAをコードする発現プラスミドでトランスフェクトした、MHCクラスI分子を欠くLCLで再刺激した。8時間の刺激の間のIFN−γ分泌をELISAで測定した。図16Dに示されるとおり、NY−ESO194−102ペプチドでパルスしたHLA−B*3501トランスフェクタントはT細胞からのIFN−γ産生を誘導し、この新規ペプチドがHLA−B*3501分子により提示されることを示す。これらの結果は、EPIMAXが、HLA−A2neg患者においてCD8+ T細胞の新規エピトープを同定することを可能にすることを示し、そして、他の方法論との組合せが、われわれがそれらのHLA拘束要素を同定することを可能にする。
図17は、本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描く。黒色腫患者(図10と同一)から得たPBMCを、MART−1の15−merペプチド#6および#13内の10merのオーバーラップペプチドで48時間刺激した。図17は、48時間での培養上清中のIP−10の濃度を示す。MART−126−35(既知エピトープ)およびMART−153−62(新規エピトープ)がエピトープである。
図18は、本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描く。2例のHLA−A2neg黒色腫患者から得たPBMCを、MART−1の15−merペプチド#6内の10merのオーバーラップペプチドで48時間刺激した。48時間での培養上清中のIP−10の濃度を示す。MART−126−35(既知エピトープ)は双方の患者についてエピトープである。このエピトープはHLA−A2に拘束されるとして既知である。これらの患者はHLA−A2negであり、かつ、HLAクラスIのサブタイプはこれら2例の患者間で完全に異なるため、このエピトープは最低3種の異なるMHCクラスI分子により提示される。これは、EPIMAXを用いるCD8+ T細胞のエピトープの同定の別の例である。
図19は、本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描く。黒色腫患者(図10と同一)から得たPBMCを、#6から#15までの個別のMART−1の15−merペプチドで三重で48時間刺激した。48時間での培養上清中のIL−2の濃度を示す。MART−1ペプチド#10および#11はIL−2のアップレギュレーションを誘導した。この結果は、EPIMAXでのエピトープ同定の別の例を示す。
図20は、図19に示されるところの同定された15−merペプチドでの刺激に際してのCD4+T細胞からのIL−2産生を描く。同一患者のPBMCを、抗CD28/CD49d mAbおよびモネンシンの存在下にMART−1の15−merペプチド#10で8時間刺激した。IL−2の産生を、特異的mAbで染色することにより分析した。該図は、MART−1ペプチド#10に応答してIL−2を産生するCD4+ T細胞集団を示す。これらの結果は、EPIMAXがCD4+ T細胞のエピトープもまた同定し得ることを示す。
図21A−Bは、本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描く。同一の黒色腫患者(図19と同一)から得たPBMCを、最初に1μMのCFSEで染色し、そしてMART−1をコードする個別のペプチドで三重で刺激した。培養第8日に、細胞をCD8−PE、CD3−PerCPおよびCD4−APCで染色し、そしてペプチド刺激に応答してのT細胞増殖を分析した。図21Aは、CD4+T細胞集団内のCFSEが希釈されたCD4+ T細胞集団の%を示す。MART−1ペプチド#10および#11は、ペプチドなしより多いCFSEが希釈されたCD4+T細胞集団を誘導し、これらのペプチドが抗原特異的CD4+ T細胞の増殖を誘導したことを示す。図21Bは、CD4+ T細胞集団内の各MART−1の15−merペプチドに応答してのCFSEが希釈されたCD4+ T細胞集団を描く。MART−1ペプチド#10および#11は、他の15−merペプチドよりもCD4+ T細胞の有意により多い増殖を誘導した。これらの結果は、EPIMAXがCD4+T細胞のエピトープの同定を可能にし、そしてCFSE技術と組み合わせることにより特異的CD4+ T細胞の増殖能力を決定することを可能にすることを強く示す。
図22A−Cは、本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描く。CDワクチン接種を受領したHLA−A2neg黒色腫患者から得たPBMCを、最初に1μMのCFSEで染色し、そしてNY−ESO1をコードするペプチドのクラスターで刺激した。培養第8日に、細胞を、CD8−PE、CD3−PerCPおよびCD4−APCで染色し、そしてペプチド刺激に応答しての分析されたT細胞増殖を、フローサイトメーターを用いてCFSE希釈に基づき分析した。図22Aは、CD4+ T細胞集団内のCFSEが希釈されたCD4+ T細胞のパーセント(%)を示す。NY−ESO1クラスター#8は他のクラスターよりも多くのCFSEが希釈されたCD4+T細胞集団を誘導し、これらのペプチドが抗原特異的CD4+ T細胞の増殖を誘導したことを示す。図22Bは、培養48時間での培養上清中のIL−2濃度を描く。IL−2はNY−ESO1のクラスター#8を含む培養物で産生された。CD4+ T細胞のエピトープを同定するため、CFSEで染色したPBMCを、NY−ESO1クラスター#8内の個別のペプチドで刺激した。増殖するCD4+ T細胞を、フローサイトメーターを用いてCFSE希釈に基づき第8日に分析した。図22Cに示されるとおり、NY−ESO1149−167およびNY−ESO1165−180はCD4+T細胞のより多い増殖を誘導し、これらがエピトープであることを示す。この結果は、黒色腫抗原中のCD4+ T細胞エピトープの同定の別の例を示す。
図23は、本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描く。黒色腫患者(図10と同一)から得たPBMCを、#6から#15までの個別のMART−1 15−merペプチドで三重で48時間刺激した。48時間での培養上清中のIL−5の濃度を示す。MART−1ペプチド#10および#11はIL−5のアップレギュレーションを誘導した。この結果は、EPIMAXでのエピトープ同定の別の例を示す。
図24は、図23に示されるところの同定された15−merペプチドでの刺激に際してのCD4+T細胞からのIL−5産生を描く。同一患者のPBMCを、抗CD28/CD49b mAbおよびモネンシンの存在下でMART−1 15−merペプチド#11で8時間刺激した。IL−5の産生を、特異的mAbで染色することにより分析した。該図は、MART−1ペプチド#11に応答してIL−5を産生するCD4+T細胞集団を示す。この結果は、EPIMAXがエピトープならびに特異的CD4+ T細胞により産生されるサイトカインの型を同定し得ることを示す。
図25は、本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描く。2例の黒色腫患者から得たCFSE染色したPBMCを、TRP−1クラスター#25若しくはgp100クラスター#15いずれかからの個別の15−merペプチドで刺激した。培養上清中のサイトカインを48時間に測定し、そして、T細胞の増殖を、CFSE希釈アッセイに基づき培養第8日に分析した。該結果は、TRP−1ペプチド#124およびgp100ペプチド#152がCD4+T細胞のエピトープであり、それらの双方がCD4+ T細胞の新規エピトープであることを示す。ペプチド刺激は、IL−2、IL−5、IL−13およびIP−10(IFN−γ)のような多様なエフェクターサイトカインの産生、ならびに特異的CD4+ T細胞の増殖を誘導した。これらの結果は、黒色腫抗原中のCD4+T細胞エピトープの同定の別の例を示し、また、EPIMAXを使用して多様な型のT細胞応答を同定し得ることを示唆する。
図26は、本発明により評価されるところの3例の黒色腫患者の免疫応答を描く。EPIMAXは、タイプ1(Th1およびTc1)、タイプ2(Th2およびTc2)細胞のような異なるT細胞サブセットを同定することを可能にする。転移性黒色腫を伴う患者から得たPBMCを、新たに同定された黒色腫ペプチド(15−mer)で48時間刺激し、そして培養上清中のサイトカインを多重ビーズに基づくアッセイで測定した。色を付けた行は示されたペプチドでのサイトカインの濃度を表し(下)、また、白色の行は希釈剤での濃度を表す。3種の異なるT細胞サブセットすなわちタイプ1、2およびタイプIL−10の代表的なサイトカイン産生を示す。タイプ1応答はIL−1aおよびIP−10のアップレギュレーションにより同定される一方、タイプ2応答は、IP−10のアップレギュレーションを伴わない、IL−4、IL−5およびIL−13のようなタイプ2サイトカインのアップレギュレーションにより同定される。EPIMAXを使用して、IL−10のアップレギュレーションを特徴とする新規T細胞応答(タイプIL−10)を同定した。
図27は、EPIMAX方法論で同定される4種の黒色腫抗原すなわちgp100、MART−1、NY−ESO1およびTRP−1内のCD4+およびCD8+T細胞の新たなエピトープの要約を描く。これらの新たなエピトープは、13例の黒色腫患者のPBMCをEPIMAXでスクリーニングすることにより同定された。
表1は、EPIMAXを用いて同定したCD8+ T細胞のエピトープの要約を描く。同定された15−merペプチドおよびそれらのアミノ酸配列番号を示す。数種の15−merペプチドは、9−mer若しくは10−merいずれかのオーバーラップペプチドでフォーカシングされ、そして表中に示される。
表2は、EPIMAXで同定されたTh0、Th1およびTh2細胞のエピトープの要約を描く。同定された15−merペプチドおよびそれらのアミノ酸配列番号を示す。
表3は、EPIMAXで同定されたタイプIL−10のCD4+ T細胞のエピトープの要約を描く。同定された15−merペプチドおよびそれらのアミノ酸配列番号を示す
。
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図28は、本発明により評価されるところの3例の黒色腫患者の免疫応答を描くグラフである。MART−1、gp100、NY−ESO1およびTRP−1のオーバーラップペプチドでの、転移性黒色腫を伴う患者(13例の患者)から得たPBMCのEPIMAX分析は、タイプ1応答を誘導する16種のペプチド、タイプ0/2応答を誘導する15種のペプチド、およびタイプIL−10を誘導する9種のペプチドを生じた。サイトカインは培養第2日に測定した。各T細胞サブセットでのIL−1αおよびIP−10の濃度をそれぞれ示す。各点は、同定された単一ペプチドで刺激したこれらの患者のPBMC培養物からのそれぞれ別個のウェル中のサイトカイン濃度を表す。この結果は、IL−1αおよびIP−10がタイプ1応答で完全に相関することを明確に示す。
図29A−Dは、本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描くグラフである。黒色腫患者から得たPBMCを、NY−ESO1をコードするペプチドのクラスター若しくは個々のペプチドで刺激した。培養48時間での培養上清中のIL−10濃度を示す(図29A)。NY−ESO1ペプチド#39および#40はエピトープである。IL−10産生の起源を探求するため、PBMCを、抗CD28/CD49d mAbおよびモネンシンの存在下でペプチド#39で8時間刺激し、そしてIL−10特異的mAbで染色した。図29Bに示されるとおり、約0.11%のCD4+ T細胞が、NY−ESO1ペプチド#39に応答してIL−10を産生した。この結果は、EPIMAXが黒色腫患者においてIL−10を産生する黒色腫抗原特異的CD4+T細胞を可能にすることを示す。次に、このIL−10産生T細胞が調節特性を有したかどうか評価するため、ペプチド#39若しくは無関係な15−merペプチドで刺激したPBMCをトランスウェル中で「第三者」MLRに添加して、可溶性媒介物質の放出によるT細胞増殖の抑制を試験した。MLRは、ペプチド特異的T細胞応答の影響を回避するため、CFSE標識したCD4+T細胞および同種異系の成熟DC(双方とも健康志願者から)を使用した。NY−ESO1ペプチド#39で刺激したがしかし対照ペプチドでしなかった患者のPBMCは、MLRでの増殖を有意に抑制した(図29C、29D)。これらの結果は、EPIMAXのアプローチが腫瘍抗原特異的抑制性T細胞を同定し得ることを示す。
図30は、本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描くグラフである。図29A−Dでと同一の黒色腫患者から得たPBMCを、2つの異なる時間点、すなわちDCワクチン接種前および8回のワクチン接種後に、NY−ESO1をコードする個別のペプチドで刺激した。培養48時間での培養上清中のサイトカイン/ケモカインの濃度を示す。この結果は、タイプIL−10のシグネチャがワクチン後に消失したことを示し、IL−10産生CD4+T細胞の機能がワクチン後に喪失されたことを示唆する。これらの結果は、EPIMAXアッセイを用いる、DCワクチンによるT細胞応答の調節の別の例を示す。
図31は、本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描くグラフである。われわれは、タイプIL−10応答を誘導する黒色腫抗原中の9種の異なるエピトープを7例の黒色腫患者で同定した。黒色腫を伴う患者から得たPBMCを、各患者に特異的な同定された15−merペプチドとともに48時間インキュベートした。該図は、同定されたタイプIL−10ペプチドとのインキュベーションによる自発的IP−10産生の阻害を示す。これは、EPIMAXで同定されたIL−10産生CD4+T細胞の抑制機能の別の立証である。
図32は、本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描くグラフである。同定されたIL−10を誘導する15−merペプチドを含む各PBMC培養物中のIL−1βおよびIP−10濃度を示す。各点は、同定された独特の単一の15−merペプチドを含むPBMC培養物中の各別個のウェル中のサイトカイン濃度を表す。この結果は、IL−1βおよびIP−10が同定されたタイプIL−10応答で相関し、従って双方のサイトカインがEPIMAXでタイプIL−10細胞を同定するための良好なマーカーであり得ることを示す。
図33は、本発明により評価されるところの正常健康志願者の免疫応答を描くグラフである。3名の正常健康志願者から得た新鮮PBMCを3バッチに分割した。各バッチからのPBMCを、インフルエンザウイルスマトリックスタンパク質(Flu−MP)をコードする15−merのオーバーラップペプチドのクラスターで二重で刺激し(2×105細胞/ウェル、ペプチドあたり10μM)、従って六重のサンプルを創製した。培養48時間でのIP−10の濃度を示す。黒棒および陰は、ペプチドを伴わない培養物中のIP−10の平均±3SD値を表す。IP−10の濃度が、このバックグラウンドの平均+3SDの上で測定されたことは、ペプチドクラスターに応答してのIP−10の陽性の誘導である。正常ドナー#1において、12種のペプチドクラスターのうち9種が六重のサンプルのうち4以上で陽性を記録し、このドナーがFlu−MPに特異的なT細胞の非常に広範なレパートリーを有したことを示した。対照的に、正常ドナー#3では、どのクラスターもIP−10のアップレギュレーションを誘導しなかった。EPIMAXは所定の抗原タンパク質に対するT細胞応答の完全な幅の同定を可能にする。さらに、この研究はEPIMAXが高度に再現可能なアッセイであることを示す。
図34は、本発明により評価されるところの正常健康志願者の免疫応答を描くグラフである。図33に示される同一の試験でのIL−6およびIP−10の濃度を示した。際立って、正常ドナー#3において、いかなるヒットもIP−10産生で同定されなかったが、しかし、ペプチドの多くのクラスターがIL−6産生で陽性を記録した。この結果は、サイトカインの多様な組の測定がEPIMAXにおいてT細胞の多様なサブセットを同定し得ることを示す一例を示す。
図35は、本発明により評価されるところの正常健康志願者の免疫応答を描くグラフである。図33に示される試験でのIL−1aおよびIP−10の濃度を示した。各点は、ペプチドクラスターを含むPBMC培養物中の各別個のウェル中のサイトカイン濃度を表す。全部のドナーにおいて、IL−1aおよびIP−10の濃度はEPIMAXで非常に良好に相関し、これら2種のマーカーがタイプ1応答で完全に相関することを確認する。
図36は、本発明により評価されるところの正常健康志願者の免疫応答を描くグラフである。ドナー#1から得た凍結PBMCを融解し、そしてFlu−MPをコードする15−merペプチドのクラスター若しくは単一ペプチドのいずれかで刺激した。IL−1aおよびIP−10の濃度を示す。各点は、ペプチドクラスター若しくは単一ペプチドを含むPBMC培養物中の各別個のウェル中のサイトカイン濃度を表す。凍結PBMCででさえ、IL−1aおよびIP−10の濃度は非常に良好に相関し(P<0.0001、r=0.9121)、これら2種のマーカーが、PBMCがどんなに新鮮若しくは凍結で得られようと、EPIMAXでタイプ1応答を同定するのに使用し得ることを示す。
図37は、本発明により評価されるところの正常健康志願者の免疫応答を描くグラフである。ドナー#1から得た新鮮若しくは凍結PBMCを、Flu−MPをコードする15−merペプチドのクラスターで刺激した。IL−1aおよびIP−10の濃度を示す。図37に示されるとおり、クラスター#6および#12双方が、新鮮および凍結PBMCでのIL−1aおよびIP−10のアップレギュレーションを誘導した。この試験は、EPIMAXで抗原特異的T細胞応答をモニターするのに凍結PBMCを使用し得ることを示す。
図38A、38Bは、本発明により評価されるところの正常健康志願者の免疫応答を描くグラフである。ドナー#1から得た凍結PBMCを融解し、そしてFlu−MPをコードするペプチドのクラスター若しくは個別のペプチドで六重で刺激した(2×105細胞/ウェル、ペプチドあたり10μM)。培養48時間でのIP−10の濃度を示す(図37A)。別の試験において、より多数のPBMC(2×106細胞/ウェル)を、同一濃度の15−merペプチドで三重で刺激した。図37Bに示されるとおり、ペプチド#58および#59が双方の試験でIP−10産生のスイッチを入れた一方、サンプルと対照培養物の間の対比は、ウェルあたりより多くのPBMCをEPIMAXアッセイで使用した場合により大きい。従って、ウェルあたりより多数のPBMCが、EPIMAXアッセイにおける変動性および感受性を低下させるのに役立つ。PBMC中の抗原特異的T細胞の低頻度(通常105PBMCから1個)を考慮すれば、T細胞応答は、ペプチド刺激に細胞がほとんど応答しなかった場合はEPIMAX(若しくは事実上いかなる種類のアッセイ)で(も)検出されないことがあることがもっともらしい。従って、正規のEPIMAXアッセイにおいて、われわれは5×105PBMC/ウェルを使用している。
図39Aおよび39Bは、EPIMAXアッセイで同定されたペプチドに対する正常健康志願者の免疫応答を描くグラフである。PBMCを1×106細胞/mlでCMに再懸濁し、そして1mlの細胞懸濁液を培養管に入れ、そしてFlu−MPライブラリーからの示された単一ペプチドで7日間刺激した。培養したPBMCを収集し、そしてモネンシンの存在下に示されたペプチドで5時間パルスしたDCで再刺激した。細胞質のサイトカインを、細胞浸透化後に特異的mAbで検査した。CD3+CD4+T細胞集団中のサイトカイン産生細胞の割合を示した(図39A)。ドミナントなペプチドでの刺激は特異的CD4+ T細胞の増殖を誘導した。ドナーのPBMCを1mMのCFSEで最初に染色した。PBMCを1×106細胞/mlでCMに再懸濁し、そして1mlの細胞懸濁液を培養管に入れ、そしてFlu−MPライブラリーからの示された単一ペプチドで6日間刺激した。刺激した細胞を抗CD3およびCD4 mAbで染色し、そして増殖するCD4+ T細胞を、CFSE希釈に基づきフローサイトメーターを用いて分析した。CD3+CD4+T細胞集団中のCFSE細胞の割合を示した(図39B)。これらの結果は、EPIMAXが、機能的なFlu−MP特異的CD4+T細胞のエピトープの同定を可能にしたことの証明を示す。
図40は、本発明により評価されるところの正常健康志願者の免疫応答を描くグラフである。PBMCを図33中のドナー#2から得た。凍結PBMCを融解し、そしてFlu−MPのクラスター#11若しくはクラスター#11内の単一の15−merペプチドのいずれかで刺激した(5×105細胞/ウェル、ペプチドあたり20μM)。培養48時間でのサイトカインの濃度を示す。これらの結果は、ペプチド#52および#53がFlu−MP特異的T細胞のエピトープであることを示し、特異的CD4+T細胞の新規エピトープの同定の別の例を示す。
図41A、41Bは、EPIMAXアッセイで同定されたペプチドに対する正常健康志願者の免疫応答を描くグラフである。図40の試験で使用したPBMCをCFSEで標識し、そしてFlu−Mpクラスター#11内の単一ペプチドで刺激した。CFSEが希釈されたCD4+T細胞を培養第8日に分析した(図41A)。別の試験において、CFSEが希釈されたCD4+ T細胞集団を、培養第6、7、8、および10日に分析した(図41B)。これらの試験は、EPIMAXを用いて同定されたペプチド(Flu−MPペプチド#52および#53)が、ペプチド特異的CD4+T細胞の増殖を誘導し、また、増殖するCD4+ T細胞の集団がペプチド刺激第7若しくは8日にピークに達したことを示す。この試験は、特異的CD4+T細胞の新規エピトープの同定の別の例を示し、そして増殖するCD4+ T細胞集団の分析を培養第8日に実施することを正当化する。
図42は、本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描くグラフである。PBMCはDCワクチン接種を受けた黒色腫患者から得た。該患者は、殺した同種異系黒色腫細胞株を負荷した自己DCワクチンを受領した。DCワクチンが、DCワクチンに使用した同種異系黒色腫細胞株上で発現される同種異系抗原に特異的なこの患者でT細胞を誘導したことが可能である。この可能性を検査するため、患者PBMCを、黒色腫細胞株上で発現されるがしかし該患者細胞上でされない、HLA−B*4001をコードする15−merのオーバーラップペプチドで刺激した。図42に示されるとおり、クラスター#1内のペプチド#5およびペプチド#7はPBMC培養物中でIP−10産生を誘導した。期待されたとおり、これら2種のエピトープは、双方のペプチドがアミノ酸ミスマッチを含有するため、該患者の抗原エピトープであり得る。これらの結果は、EPIMAXが同種異系抗原特異的T細胞応答を同定し得ることを示す。従って、この方法論は、臓器移植の設定で同種異系抗原特異的T細胞を同定するのに有用であり得る。
図43は、本発明により評価されるところの1型糖尿病患者の免疫応答を描くグラフである。PBMCは、セルセプトおよびプレドニゾロンのような免疫抑制薬を服用している1型糖尿病を伴う患者から得た。新鮮PBMC(5×105細胞/ウェル)を、IA−2(膵β島細胞上で特異的に発現される自己抗原の1種)をコードする単一の15−merペプチドで刺激した。培養48時間でのIP−10の濃度を示す。15−merペプチド#47、60、61、62、64および66は、PBMC培養物中でのIP−10産生のアップレギュレーションを誘導した。
この試験は、この患者がIA−2特異的タイプ1細胞の広範なレパートリーを有することを示す。さらに、6種のうち5種(ペプチド#47、60、61、62および66、配列は表4に示す)がT細胞の新規エピトープである。従って、この試験は、EPIMAXが、免疫抑制薬の投薬下でさえ、われわれが自己免疫疾患モデルでエピトープおよびT細胞応答の型を同定することを可能にする。
図44Aおよび44Bは、多様な型の免疫応答の同定を可能にする、本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描くグラフである。前ワクチン黒色腫患者から得たPBMCを、スルビビンペプチドライブラリーの5種のペプチドクラスター(7〜8種のペプチド/クラスター)とともにインキュベートした。スルビビンのクラスター#3はIP−10のダウンレギュレーションおよびIL−10のアップレギュレーションを誘導した。PBMCをその後、クラスター#3からの単一のペプチドとともにインキュベートして、原因となるペプチドすなわちペプチド#15を同定した。IL−10のアップレギュレーションはIL−1bと相関した。データは、IP−10について図44Aおよび44C、IL−10について図44Bおよび44D、IL−1αについて図44Eおよび44G、ならびにIL−1βについて図44Fおよび44Hに示す。
図45は、非T細胞による多様な型の免疫応答の同定を可能にする、本発明により評価されるところの正常健康志願者の免疫応答を描くグラフである。PBMCを5名の健康志願者の新鮮血から単離し、スルビビンペプチド#15とともに48時間インキュベートし、そして本発明の方法により評価した。培養上清中の産生されたIP−10を測定し、そして、図45のデータは、ペプチドが添加されない場合の培養物に対する相対値(%)を示す。スルビビンペプチド#15は、全5名の志願者でのIP−10産生をMHC非拘束性の様式で阻害することが示された。
図46Aおよび46Bは、非T細胞による多様な型の免疫応答の同定を可能にする、本発明により評価されるところの黒色腫患者における免疫応答を描くグラフである。黒色腫患者からのPBMCを、スルビビンペプチド#15および/若しくは生インフルエンザウイルス(Charles River Laboratories、コネチカット州)の存在若しくは非存在下で18時間培養した。IP−10(図46A)およびIL−10(図46B)濃度をLuminexで測定した。スルビビンペプチド#15は、生インフルエンザウイルスで刺激したPBMCからのIP−10産生を阻害することが示された。
図47は、非T細胞による多様な型の免疫応答の同定を可能にする、本発明により評価されるところの黒色腫患者における免疫応答を描くグラフである。黒色腫患者からのPBMCを、スルビビンペプチド#15若しくはペプチド#16(11アミノ酸がペプチド#15に同一である)の存在下で、滴定した濃度のTSST−1で5日間刺激した。5日後にトリチウム化チミジン(1μCi/ウェル)を添加した。プレートを16時間後に収集し、そして取り込まれた放射活性をWallacシンチレーションカウンターにより測定した。スルビビンペプチド#15は、TSST−1で刺激されたT細胞増殖を阻害することが示された。
図48A−48Dは、非T細胞による多様な型の免疫応答の同定を可能にする、本発明により評価されるところの黒色腫患者における免疫応答を描くグラフである。CD4+、CD8+、CD14+、CD56+、BDCA−4+またはBDCA−1若しくは3+細胞を、各mAb(Miltenyi)と複合させたマイクロビーズを使用することにより、黒色腫患者のPBMCから枯渇させた。陰性対照として、PBMCを、いかなるビーズも含まないカラムを通過させた(枯渇なし)。枯渇させた細胞を1M/mlでCMに再懸濁し、そしてスルビビンペプチド#15の存在若しくは非存在下で生インフルエンザウイルスで刺激した。上清を48時間に収集し、そしてIL−10およびIP−10濃度をLuminexで分析した。該データは、CD14+若しくはCD56+細胞が、ペプチド#15がIL−10分泌を誘導するのに必要であることを示す。
図49Aおよび49Bは、非T細胞による多様な型の免疫応答の同定を可能にする、本発明により評価されるところの黒色腫患者における免疫応答を描くグラフである。黒色腫患者からのPBMCを5μM CFSEで染色し、そして10μMのスルビビンペプチド#15(図49B)若しくは対照ペプチド#6(図49A)とともに4日間培養した。NK集団をFACSで分析した。それらのCD56+細胞はCFSEの強度を低下させず、それらが増殖していないことを示す(示されない)。従って、ペプチド#15はCD3−CD56+NK細胞の生存を維持することが示された。
本明細書に記述される特定の態様は本発明の具体的説明として示されかつその制限として示されないことが理解されるであろう。本発明の原則的特徴は、本発明の範囲から離れることなく多様な態様で使用し得る。当業者は、本明細書に記述される特定の手順に対する多数の同等物を認識するであろうか、若しくは、わずかに慣例の実験を使用して確認することが可能であろう。こうした同等物は本発明の範囲内にあると考えられ、そして請求の範囲により包括される。
本明細で挙げられた全部の刊行物および特許出願は、本発明が属する技術分野の当業者の熟練の水準を暗示する。全部の刊行物および特許出願は、各個々の刊行物若しくは特許出願が引用することにより組み込まれることをとりわけかつ個々に示された場合と同一の程度まで、引用することにより本明細書に組み込まれる。
本明細書に開示かつ特許請求される組成物および/若しくは方法の全部は、本開示に照らして過度の実験を伴わずに作成かつ実施し得る。本発明の組成物および方法は好ましい態様に関して記述された一方、本明細書に記述される組成物および/または方法に対し、ならびに該方法の段階若しくは段階の順序において、本発明の概念、技術思想および範囲から離れることなく、変形が適用されうることが、当業者に明らかであろう。より具体的には、化学的および生理学的の双方で関係するある剤を、同一若しくは類似の結果が達成されるとみられる一方で、本明細書に記述される剤の代わりに用いうることが明らかであろう。当業者に明らかな全部のこうした類似の代替および改変は、付随する請求の範囲により定義されるところの本発明の技術思想、範囲および概念内にあると考えられる。
本発明の特徴および利点のより完全な理解のため、付随する図面と一緒に本発明の詳細な記述に今や言及がなされ、そして、ここで:
本発明により評価される正常ドナーの免疫応答を描くグラフであり、ここで、末梢血単核細胞(PBMC)をHLA−A0201+健康志願者から新たに採取した血液から単離し、2×105細胞/ウェルで丸底96ウェルプレートに三重で接種し、そして1μlのHLA−A0201拘束性ペプチドFlu−MP58−66(GILGFVFTL)若しくはMAGE−3271−279(FLWGPRALV)またはペプチド希釈剤(H2O中5%DMSO)のいずれかとともにインキュベートし;そして培養上清を48時間後に収集し、そしてLuminex技術を使用してサイトカインおよびケモカインの存在について量的に評価した。
本発明による正常ドナー中でのHLA−A0201拘束性ペプチドFlu−MP58−66(GILGFVFTL)に対する免疫応答の別の例を描くグラフである。PBMCを、別のHLA−A0201+健康志願者から新たに採取した血液から単離し、5×105細胞/ウェルで丸底96ウェルプレートに三重で接種し、そして10μg/mlのHLA−A0201拘束性ペプチドFlu−MP58−66(GILGFVFTL)若しくはMART−127−35(AAGIGILTV)またはペプチド希釈剤(H2O中5%DMSO)のいずれかとともにインキュベートし;そして培養上清を48時間後に収集し、そしてLuminex技術を使用してサイトカインおよびケモカインの存在について量的に評価した。
本発明により評価されるところの2例の黒色腫患者の免疫応答を描くグラフである。
本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描くグラフである。
本発明により評価されるところの正常ドナーの免疫応答のキネティクスを描くグラフである。
オーバーラップペプチドのライブラリーをペプチドのクラスターに分割し(5〜10ペプチド/クラスター)クラスター分析、次いでエピトープフォーカシングを実施した、本発明のエピトープフォーカシングのスキームを描く。
本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描くグラフである。
本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描くグラフである。
本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描くグラフである。
本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描くグラフである。
本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描くグラフである。
黒色腫患者(図10と同一)からDCワクチン接種前および8回のDCワクチン接種後に得たPBMCを、単一の15−merのMART−1ペプチド若しくは希釈剤で刺激した、本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描くグラフである。
本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描くグラフである。
本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描くグラフである。
本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描くグラフである。
本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描くグラフである。
本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描くグラフである。
本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描くグラフである。
本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描くグラフである。
図19に示されるところの同定された15−merペプチドでの刺激に際してのCD4+ T細胞からのIL−2産生を描くグラフである。
図19に示される同一の黒色腫患者から得たPBMCを用いる、本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描くグラフである。
本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描くグラフである。
本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描くグラフである。
図23に示されるところの同定された15−merペプチドでの刺激に際してのCD4+ T細胞からのIL−5産生を描くグラフである。
本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描くグラフである。
本発明により評価されるところの3例の黒色腫患者の免疫応答を描くグラフである。
EPIMAX方法論で同定される、4種の黒色腫抗原すなわちgp100、MART−1、NY−ESO1およびTRP−1内のCD4+およびCD8+ T細胞の新たなエピトープの要約を描く。
本発明により評価されるところの3例の黒色腫患者の免疫応答を描く。
本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描くグラフである。
本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描くグラフを包含する。
本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描くグラフである。
本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描くグラフである。
本発明により評価されるところの3名の正常健康志願者の免疫応答を描くグラフを包含する。
本発明により評価されるところの3名の正常健康志願者の免疫応答を描くグラフを包含する。
本発明により評価されるところの正常健康志願者の免疫応答を描くグラフを包含する。
凍結および融解したPBMCからの、本発明により評価されるところの正常健康志願者の免疫応答を描くグラフである。
凍結および融解したPBMCからの、本発明により評価されるところの正常健康志願者の免疫応答を描くグラフである。
本発明により評価されるところの正常健康志願者の免疫応答を描くグラフである。
EPIMAXアッセイで同定されたペプチドに対する正常健康志願者の免疫応答を描くグラフであり、そしてEPIMAXが機能的なFlu−MP特異的CD4+ T細胞のエピトープの同定を見込むことを示す。
本発明により評価されるところの正常健康志願者の免疫応答を描きかつ特異的CD4+ T細胞の新規エピトープの同定を示すグラフである。
EPIMAXアッセイで同定されたペプチドに対する正常健康志願者の免疫応答を描くグラフである。
本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答および該患者についての抗原エピトープを描き(双方のペプチドがアミノ酸ミスマッチを含有するように)、そして臓器移植の設定で同種異系抗原特異的T細胞を同定する能力を示すグラフである。
本発明により評価されるところの1型糖尿病患者の免疫応答を描くグラフである。
多様な型の免疫応答の同定を可能にする、本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描く。
非T細胞による多様な型の免疫応答の同定を可能にする、本発明により評価されるところの5名の正常健康志願者の免疫応答を描くグラフである。
非T細胞による多様な型の免疫応答の同定を可能にする、本発明により評価されるところの黒色腫患者における免疫応答を描く2個のグラフを包含する。
非T細胞による多様な型の免疫応答の同定を可能にする、本発明により評価されるところの黒色腫患者における免疫応答を描くグラフである。
非T細胞による多様な型の免疫応答の同定を可能にする、本発明により評価されるところの黒色腫患者における免疫応答を描く4個のグラフを包含する。
本発明により評価されるところの黒色腫患者における免疫応答を描く2個のグラフを包含し、そして、非T細胞による多様な型の免疫応答の同定を示す。
Claims (21)
- 抗原性物質に対し被験体により発現される免疫反応性の型の同定方法であって、
被検体に由来する1種若しくはそれ以上の免疫細胞を準備し、そして1種若しくはそれ以上の抗原フラグメントの存在下で培養する工程;
該免疫細胞により産生されるサイトカインを同定する工程;および
該抗原性物質に応答しての協調的サイトカイン発現に基づき免疫反応性の型を決定する工程を含んでなる、上記方法。 - 抗原性物質が、抗原、ペプチド、微生物、細胞、タンパク質のアミノ酸配列が既知であってももしくはなくてもよく、かつ、フラグメントが、該タンパク質から採取されたオーバーラップペプチドのライブラリーから採取される抗原タンパク質、複数の抗原性物質およびそれらの組合せの混合物からなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
- 被験体の免疫状態の評価方法であって、
被験体から免疫細胞を準備する工程;
目的の抗原タンパク質から採取されたオーバーラップペプチドのライブラリーからの一連のペプチドの存在下で該免疫細胞を培養する工程;
免疫反応性の複数のパラメータについて該培養物を同時に分析し、該被験体について最低1種の免疫調節分子を同定して産生されるサイトカインの同定に基づき該免疫調節分子に対する免疫反応性の型を決定する工程を含んでなり、かつ、免疫反応性の型が該被験体の免疫状態の指標となることを特徴とする、上記方法。 - 被験体の免疫抑制の程度を評価することを特徴とする、請求項3に記載の方法。
- 被験体の免疫状態が、該被験体についての完全なT細胞レパートリーを提供するために複数の免疫調節分子について評価されることを特徴とする、請求項3に記載の方法。
- 免疫調節分子および免疫反応性の型が、感染性疾患、自己免疫疾患、自己炎症性疾患、癌、慢性炎症およびアレルギーよりなる群から選択される免疫関連疾患の該被験体の危険性の指標であることを特徴とする、請求項3に記載の方法。
- ワクチン接種、受動免疫療法および養子細胞移入のような免疫療法に対する被験体の応答の予測方法であって、
目的の抗原タンパク質から採取されたオーバーラップペプチドのライブラリーの存在下で、被験体からの免疫細胞を培養する工程;
免疫反応性の複数のパラメータについて該培養物を分析して、該被験体について最低1種の免疫調節分子を同定する工程;および
サイトカインの産生について該培養物を分析し、産生されるサイトカインの同定に基づき免疫調節分子に対する免疫反応性の型を決定して処置の転帰の指標としての処置前の被験体の該エピトープに特異的な免疫状態を決定する工程を含んでなる、上記方法。 - 被験体の疾患の経過および臨床転帰の予測方法であって、
目的の抗原タンパク質から採取されたオーバーラップペプチドのライブラリーからの一連のペプチドの存在下で、被験体からの1種若しくはそれ以上の免疫細胞を培養する工程;
細胞増殖およびサイトカイン産生プロファイルについて、該培養物を同時に分析して、該免疫調節分子に対する免疫反応性の型を決定する工程であって、かつ、
サイトカイン産生プロファイルが疾患の重症度および疾患の進行若しくは後退の状態のマーカーとする工程を含んでなり、上記方法。 - 疾患が、癌、腫瘍、自己免疫疾患、自己炎症性疾患、関節炎、糖尿病、アレルギー、臓器移植および骨髄移植よりなる群から選択されることを特徴とする、請求項8に記載の方法。
- 被験体の治療的介入の調整方法であって、
産生されるサイトカインの同定を包含する免疫反応性の複数のパラメータの分析に基づき、被験体について1種若しくはそれ以上の免疫調節分子を同定する工程;および
該1種若しくはそれ以上の免疫調節分子を含んでなるエピトープ特異的な免疫ワクチンを製造する工程を含んでなる、上記方法。 - ワクチンが、被験体における特異的な型の免疫応答を高めるか、被験体におけるエピトープ特異的なサイトカイン産生を低下若しくは高めるか、被験体における抗体産生を高めるか、または被験体におけるエピトープ特異的なサイトカイン産生を高める1種若しくはそれ以上の抗原を含んでなることを特徴とする、請求項10に記載の方法。
- 被験体の免疫モニタリング方法であって、
被験体から免疫細胞を準備し、そして該細胞をペプチドライブラリーから同定される1種若しくはそれ以上の免疫調節ペプチドにそれらを曝露することにより、被験体のエピトープ特異的な免疫状態を決定する工程;
ライブラリーから同定される免疫調節ペプチドの1種若しくはそれ以上で被験体を免疫化する工程;
1種若しくはそれ以上の免疫調節ペプチドへの曝露後に被験体から免疫細胞を準備することにより、被験体のエピトープ特異的な免疫状態を決定する工程;ならびに
免疫化の前および後の免疫応答の型を比較して、該被験体のエピトープ特異的な免疫状態の変化を決定する工程を含んでなる、上記方法。 - 免疫療法のための新たな治療薬の同定および特徴付け方法であって、
免疫調節物質、および目的の抗原タンパク質から採取されたオーバーラップペプチドのライブラリーからの1種若しくはそれ以上のペプチドの存在および非存在下で、単離された免疫細胞を培養する工程;
該ペプチド上のエピトープに対する特異性およびサイトカイン応答のような免疫反応性の複数のパラメータについて、該培養物を同時に分析する工程;ならびに
免疫調節物質が存在する場合の免疫反応性を、免疫調節物質が非存在である場合の免疫反応性と比較する工程であって、かつ、免疫反応性の阻害を免疫抑制性治療薬の指標とし、また、免疫反応性の増強をアジュバントの指標とする工程を含んで成る、上記方法。 - 治療薬が、Th1、Th2、Tc1、Tc2およびそれらの組合せに対する免疫応答の型を駆動する免疫調節ペプチドの組合せであることを特徴とする、請求項13に記載の方法。
- 免疫調節物質、および感染性疾患、癌、腫瘍、自己免疫疾患、自己炎症性疾患、関節炎、糖尿病、アレルギー、臓器移植および骨髄移植よりなる群から選択される目的の抗原からの1種若しくはそれ以上のフラグメントの存在および非存在下で、単離された免疫細胞を培養する工程;
該フラグメントに対する特異性およびサイトカイン応答のような免疫反応性の複数のパラメータについて、該培養物を同時に分析する工程;ならびに
免疫反応性の細胞を単離する工程
を含んでなる方法により同定される治療薬。 - ワクチンエピトープの同定方法であって、
目的の抗原タンパク質から採取されたオーバーラップペプチドのライブラリーからの1種若しくはそれ以上のペプチドの存在下で、単離された免疫細胞を培養する工程;
免疫反応性の複数のパラメータおよびサイトカイン産生について、該培養物を分析して、
産生されるサイトカインの同定により該ペプチドに対する免疫反応性の型を決定する工程;ならびに
同一の同定された配列を有する1種若しくはそれ以上のペプチドを伴うワクチンを製造する工程を含んでなる、上記方法。 - 1種若しくはそれ以上のペプチドの配列が単離後に決定されることを特徴とする、請求項16に記載の方法。
- ワクチンエピトープの特徴付け方法であって、
ウイルス、細菌、真菌、原生動物、寄生虫若しくは蠕虫を含んでなる抗原から採取されたオーバーラップペプチドのライブラリーからの一連のペプチドの存在下で、単離された免疫細胞を培養する工程;
培養物中での免疫反応性の複数のパラメータおよびサイトカイン産生について、該培養物を分析して、該1種若しくはそれ以上のペプチドに対する免疫反応性の型を決定する工程であって、かつ、該ワクチンエピトープが、それらが該抗原に対して導き出す免疫反応性を特徴とする工程を含んでなる、上記方法。 - 細胞培養物が分析され、そして、1種若しくはそれ以上のT細胞、B細胞、樹状細胞、単球、好中球、肥満細胞および赤血球のフロファイルが決定される、請求項18に記載の方法。
- Th1およびTh2双方若しくはTc1およびTc2双方のT細胞についての反応性ペプチドが同定された特定の個体に対して免疫反応性と同定されたペプチドライブラリーから単離された、免疫応答の型を改変するために選択される1種若しくはそれ以上のペプチドを含んでなる組成物。
- 免疫療法の必要な被検体の処置用医薬の製造するための免疫応答のある型に影響を与える免疫調節ペプチドの使用であって、かつ、
1種若しくはそれ以上の免疫調節ペプチドに被検体からの免疫細胞がインビトロで暴露されて該1種若しくはそれ以上の免疫調節ペプチドにより誘発される免疫応答の型が決定され、そして該免疫応答の型が1種若しくはそれ以上の免疫調節ペプチドの処置後に評価され、また、必要がある場合には、免疫応答の型を変えるように1種若しくはそれ以上の免疫調節ペプチド改変するものである、上記使用。
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