JP2018530334A - 免疫療法における使用のためのポリエピトープ構築物 - Google Patents
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Abstract
Description
抗癌効率の良いT細胞ベースの免疫療法は、腫瘍特異的抗原を認識するCD8及びCD4の両方の腫瘍反応性T細胞応答を含まなければならない。CD8細胞傷害性Tリンパ球(CTL)は、腫瘍関連抗原(TAA)を発現する腫瘍細胞に対して細胞傷害活性を示すため、細胞媒介性免疫応答の主要な役者であると考えられている。しかし、この免疫応答は、CD4 Tヘルパー1(Th1)細胞が同時に刺激される場合にだけ効率的である。これらのCD4細胞は、複数の相互作用を通じた助けを提供し、全体的な抗腫瘍応答を調整することにより、腫瘍に対するCD8 T細胞の誘導及び維持のために決定的である(Shedlock and Shen, 2003)。結果的に、複数のTAAからのMHCクラスI及びIIエピトープの同定に集中してきた(Cheever MA, et al., 2009)。過去数年の間に、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)が最初の一般的な腫瘍抗原として現れ、癌免疫療法のための普遍的な標的として積極的に研究されている。ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)は、染色体末端でテロメアDNAを合成するテロメラーゼ酵素の触媒サブユニットである。hTERTは、多様な癌表現型からのヒト腫瘍の85%超で過剰発現し、正常な体細胞ではほとんど又は全く発現しない(Shay and Bacchetti, 1997)。
本発明者らは、テロメラーゼ逆転写酵素(TERT)の特定のエピトープに制限されたペプチド(長いペプチドさえも)ワクチン接種の欠点を示さないDNAワクチン戦略を開発した。特に、DNAワクチン接種により、タンパク質産生及び精製のための高価で複雑な手順が回避される。本発明の構築物により、安全であり、より良好な定量的及び定性的免疫応答を誘導しながら、患者のHLA制限に非依存的にCTL及びCD4ヘルパーT細胞の両方が誘導される。
a.前記少なくとも2つのTERTのCD4エピトープをコードする少なくとも1つのDNA発現ベクターを含む第1の容器、及び
b.前記腫瘍、ウイルス、細菌、又は寄生虫のCD8エピトープをコードする少なくとも1つのDNA発現ベクターを含む第2の容器を含むキットである。
本発明者らは、免疫原性が不良な抗原に対する持続的な免疫応答を誘導するために、普遍的なブースターとして複数のTERT CD4無差別性TヘルパーエピトープをコードするDNA構築物を使用することを提案する。
テロメラーゼ複合体は、RNA鋳型及び、テロメラーゼ活性の主要な決定因子である「テロメラーゼ逆転写酵素」(TERT)と命名される逆転写酵素を含むタンパク質成分からなる。野生型ヒトテロメラーゼ(又はhTERT)が公知である(GeneBank受入番号NM_198253)。
本明細書では、患者においてワクチン接種を可能にするように設計された核酸構築物を提供する。
DNA発現ベクター又はDNA発現ベクターの混合物は、少なくとも2つ、好ましくは少なくとも3つ、さらに好ましくは少なくとも4つのTERTのCD4エピトープをコードする。
本発明のベクターによりコードされるCD8エピトープは、抗原に対するCD8 T細胞応答を活性化することができるペプチドである。好ましくは、前記CD8エピトープは、CD8抗腫瘍応答又はウイルス、細菌、又は寄生虫の抗原に対するCD8応答を活性化することができる。特定の実施形態では、ベクターはMHCクラスIエピトープを含むウイルス、細菌、又は寄生虫の抗原の全部又は一部をコードする。
本発明で使用する発現ベクターは、インビトロ及び/又はインビボで(例、適切な宿主細胞、宿主生物、及び/又は発現系において)発現を提供することができる。それらは、典型的には、上で定義したポリヌクレオチド配列、及び宿主細胞又は宿主生物においてタンパク質産物の発現(例、転写及び翻訳)を可能にする調節配列(適切なプロモーター、エンハンサー、ターミネーターなど)を含む。
a.前記少なくとも2つのTERTのCD4エピトープをコードする少なくとも1つのDNA発現ベクターを含む第1の容器、及び
b.少なくとも1つの腫瘍、ウイルス、細菌、又は寄生虫のCD8エピトープをコードする少なくとも1つのDNA発現ベクターを含む第2の容器。
これらは単なる例であり、任意の他のワクチン接種計画が本明細書で包含される。
本明細書に記載するベクター又はベクターの混合物を前記患者に投与することを含む、それを必要とする患者において腫瘍又は感染を処置するための方法を記載する。
上記のベクター又はベクターの混合物は、患者において腫瘍を予防又は処置するための方法において有用である。
HLA−A2/DR1:HLA−A*0201/HLA−DRB1*0101トランスジェニック、H2クラスI/クラスII KOマウス、CBA:サイトメトリービーズアレイ、CTL:細胞傷害性Tリンパ球、DNA:デオキシリボ核酸、EP:エレクトロポレーション、HLA:ヒト白血球抗原、HPV16:ヒトパピローマウイルス16型、hTERT:ヒトTERT、ID:皮内、IL:インターロイキン、IFN−γ:インターフェロンγ、MHC:主要組織適合性複合体、TAA:腫瘍関連抗原、TERT:テロメラーゼ逆転写酵素、TNF−α:腫瘍壊死因子α、RT:室温、wt:野生型、UCP:ユニバーサル癌ペプチド
プラスミドDNAベクター
pUCPbasic
pUCPbasicは、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)由来クラスIIエピトープ、すなわち、UCP1、UCP2、UCP3、及びUCP4(101AA)をコードする5717bpのプラスミド発現ベクターであり、14AA V5タグが連結されており(図1、図8)、約12.7kDaの分子量のポリペプチドに対応する。hTERT挿入配列は、野生型hTERT(受入番号NM_198253)にそれぞれ対応するAA 2−26、AA 27−51、AA 52−76、AA 77−101の4つのフラグメントで構成される:AA 39−63 hTERT、AA 573−597 hTERT、AA911−935 hTERT、及びAA1036−1060 hTERT(UCP1−4クラスIIエピトープ及びそれらの5AA隣接配列を含む)。これらのフラグメントは、4つの十分に特徴付けられた15−mer CD4+hTERTエピトープ(TERT 44−58 PAAFRALVAQCLVCV(配列番号1)、TERT 578−592 KSVWSKLQSIGIRQH(配列番号2)、TERT 916−930 GTAFVQMPAHGLFPW(配列番号3))、TERT 1041−1055 SLCYSILKAKNAGMS(配列番号4)、及び2つの9−mer内部CD8 +テロメラーゼエピトープ(Godet et al. 2012;Suso et al. 2011)を含む。
pUCP2(4×)は、各々の側に5AA隣接配列を伴うヒトテロメラーゼ逆転写酵素CD4+578−592(KSVWSKLQSIGIRQH、(配列番号2)、受入番号NM_198253)エピトープをコードする5717bpのプラスミド発現ベクターである。このUCP2エピトープユニットは、4回反復し、14A V5エピトープタグ(図2、図9)と連結しており、約12.7kDaの分子量のポリペプチドに一緒に対応する。
pDE7は、14AV V5エピトープタグ(図3、図10)と連結した非発癌性HPV16 E7変異体(98AA)(Wieking et al., 2012)をコードする5708bpのプラスミド発現ベクターであり、約14〜15kDaの分子量のタンパク質に相当する。発癌性HPV E7の送達に関連付けられるリスクを減少させるために、E7内の4つの公知の発癌領域を変異させた(Munger et al., 2004)。E7に導入された変異は、pRbに結合/不活性化し、細胞成長を増強するMi2βと会合するその能力を防止する(Brehm et al., 1999)。
重複40merオリゴヌクレオチドアセンブリプロセス(GeneCust、ルクセンブルク)を通じて遺伝子を合成し、固有の隣接制限部位HindIII/XhoIを含んだ。合成遺伝子を、pcDNA3.1(+)発現ベクター(Life Technologies、米国カールスバーグ)のHindIIIとXhoI制限部位の間にクローニングした。pcDNA3.1(+)は、哺乳類細胞における高レベルの安定な一過性発現のために設計したpcDNA3.0に由来する5.4kbのベクターである。このベクターは、ヒトサイトメガロウイルス前初期(CMV−IE)プロモーター及び終結配列としてのウシ成長ホルモンポリアデニル化(BHG−polyA)シグナルを含む。
プラスミドを、RD Biotech(フランス、ブザンソン)によるE. coli 5α細胞(fhuA2Δ(argF−lacZ)U169 phoA glnV44Φ80Δ(lacZ)M15 gyrA96 recA1 relA1 endA1 thi−1 hsdR17)(Lucigen Corporation、米国ミドルトン、ref.60602−2)中に形質転換し、産生した。エンドトキシン不含のプラスミドを1×滅菌PBSに4mg/mLで再懸濁した。構築物を制限酵素消化により検証した。
HEK293T細胞を、10%熱不活性化ウシ胎児血清(PAA、フランス、ヴェリジー=ヴィラクブレー)及び1%ペニシリン/ストレプトマイシン(Life technologies SAS、フランス、サン・トーバン)を添加したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)中で培養した。
pUCPbasic、pUCP2(4×)、pDE7、及びpcDNA3.1をトランスフェクトしたHEK293T細胞を、20分間にわたり氷上で、プロテアーゼ阻害剤カクテル(Roche Diagnostic、米国インディアナポリス)を添加したRIPA緩衝液(Sigma Aldrich SARL、フランス、サン=カンタン=ファラヴィエ)中に溶解した。溶解物を、14,000rpmで、15分間にわたる4℃での遠心により清澄化した。上清を収集し、タンパク質濃度を、Bradford比色アッセイを使用して測定した。
トランスジェニックHLA−A*0201/DRB1*0101(HLA−A2/DR1)マウス(13〜16週齢)は、Institut Pasteur(フランス、パリ)又はCDTA−TAAM(フランス、オルレアン)から供給された。これらのマウスは、ヒトHLA−A*0201α1α2ドメイン及びH2−D分子のマウスα3ドメイン、ヒトβ2−ミクログロブリン、並びにHLA−DRB1*0101分子及びHLA−DRA*0101分子を発現する。それらは、マウスのH2−Db、H2−Kb、及びIAb遺伝子についてノックアウトされている(Pajot et al., 2004)。
処置に先立ち、マウスを、個々の動物の体重及び麻酔の持続時間に従って腹腔内経路(IP)を通じてPBS(Life technologies SAS、フランス、サン・トーバン)中のキシラジン2%(Rompun, Bayer Sante、フランス、ロス)及びケタミン8%(Imalgen 1000, Merial、フランス、リヨン)の混合溶液で麻酔した。プラスミドを次に、0日目(初回)及び21日目(追加免疫)に腰部の皮内(ID)に注射し、エレクトロポレーションした。簡単に説明すると、ID注射の直後に、皮膚の折り目を注射部位に作り、導電性ゲルで全体を覆い、エレクトロポレーション装置(CLIPIATOR(登録商標)2、IGEA、イタリア、カルピ)の電極プレート間に置いた。異なる電圧の2つのパルスを、以下に記載するように適用した(HV−LV)。実験群は、表6にまとめたように定義した。
免疫応答分析のために、HLA−DRに限定されたhTERTペプチド及びHLA−A*0201に制限されたE7ペプチドは以前に記載されているか、又はオンラインで利用可能なSYFPEITHI(www.syfpeithi.de)Rammensee et al, 1999)又はNetMHCII 2.2(Nielsen and Lund, 2009)アルゴリズムを使用したインシリコエピトープ予測により決定した。全ての合成ペプチドを、Proimmune(英国オックスフォード)から凍結乾燥(>90%純度)で購入した。凍結乾燥ペプチドを滅菌水中に2mg/mLで溶解し、使用に先立ち−80℃で保存した。ペプチド配列及びMHC制限の詳細を表7に示す。
追加免疫ワクチン接種の10日後、マウスをCO2麻酔により安楽死させ、脾臓を収取した。脾臓を次に破砕し、脾細胞懸濁液を70μmのナイロンメッシュ(Cell Strainer、BD Biosciences、フランス、ル・ポン=ド=クレ)で濾過し、ficoll(リンパ球分離培地、Eurobio、Les、フランス、レ・ジュリス)で精製し、Cellometer(登録商標)Auto T4 Plusカウンター(Ozyme、フランス、モンティニー=ル=ブルトンヌー)で計数した。精製した脾細胞を次に、抗マウスIFN−γ抗体で被覆したELISpot PVDFマイクロプレート(IFN-γELISpotキット、Diaclone、フランス、ブザンソン)に2×105個細胞/ウェルで3通りに加え、5μg/mLのペプチド(表7を参照のこと)、10μg/mLのPMA−イオノマイシン(Sigma-Aldrich)で刺激し、又は無血清培地で偽刺激した。hTERT及びE7抗原特異的IFN−ρ分泌細胞の数をスコア化するために、3つの異なるペプチドプールを使用した:CD4+hTERT(プール1)、CD4 E7(プール2)、又はCD8 E7(プール3)(表7)。19時間後、スポットを、ビオチンコンジュゲート抗IFNγ検出抗体、それに続くストレプトアビジン−HRP及びBCIP/NBT基質溶液で明らかにした。スポットをカウントし、ImmunoSpot(登録商標)ELISpotカウンター及びソフトウェア(Cellular Technology Limited、ドイツ、ボン)を使用して分析した。
ワクチン接種したHLA−A2/DR1マウス由来の脾細胞(6×105個細胞)を、最終濃度5μg/mLのプール1からのHLA−DR制限hTERT由来ペプチドと37℃で24時間にわたり培養した。サイトカイン培養上清を回収し、試験まで−20℃で凍結させた。マウスTh1/Th2/Th17サイトメトリービーズアレイ(CBA、BD Biosciences)キットを使用し、IL−2、IFN−γ、TNF−α、IL−4、IL−6、IL−10、及びIL−17aの濃度をそれぞれ定量した。CBAイムノアッセイを製造者の指示に従って行った。フローサイトメトリーは、FACScan LSRIIフローサイトメーター(BD Biosciences)を使用して実施した。定量結果を、FCAP Array(商標)ソフトウェアバージョン3.0(Becton Dickinson、フランス、ル・ポン=ド=クレ)を使用して生成した。
2群間の差を、不対t検定又は非パラメトリックマンアンドホイットニーU検定により評価した。ピアソンの相関係数検定を使用し、免疫化マウスにおけるhTERTクラスII応答とE7クラスI応答の間での相関を評価した。全てのコンピュータ分析を、GraphPad Prism 6(GraphPad Software Inc.、米国カリフォルニア州ラホーヤ)を使用して実施した。p値<0.05は統計的に有意であると考えられた。
構築物の特徴付け及び配列分析
UCPbasic、UCP2(4×)及びDE7タンパク質を発現するDNA導入遺伝子を合成し、制限酵素消化及び電気泳動により示されるように、pcDNA3.1(+)Life Technologies発現ベクター中にクローニングした(図4)。インサート及び接合部を、DNAインサートに隣接するベクター配列と一致するT7(フォワード5’ATATACGACTCACTATAGGG3’(配列番号36))及び/又はBGH(リバース5’TAGAAGGCACAGTCGAGG3’(配列番号37))プライマーを使用して配列決定した(表8を参照のこと)。配列決定の結果により、導入遺伝子が正しく合成され、クローニングされていることが確認された。
pUCPbasic及びpUCP2(4×)ポリペプチド並びにpDE7タンパク質の発現をウエスタンブロットアッセイにより評価した。構築物をHEK293T細胞株中に一過性にトランスフェクションし、次に48時間にわたり培養した。pUCPbasic及びpUCP2(4×)ポリペプチドは、それぞれ約12.6及び12.8kDaの分子量で同定された。2つのさらなるバンドがUCP2(4×)について観察され(約11及び9kDa)、これらはタンパク質分解で説明されうる(図5a)。未知の理由のため、DE7タンパク質をウエスタンブロットにより直接的に検出することは困難であった(図5a)。抗V5コンジュゲートアガロースビーズを使用した免疫沈降工程が、この目的を達成するために必要であった(図5b)。pDE7タンパク質が約14.5kDaの予想分子量で検出された。pcDNA3.1トランスフェクト細胞を陰性対照として使用した。これらの結果により、インビトロ発現パターン及びpUCPbasic、pUCP2(4×)、及びpDE7DNA構築物の同一性が立証される。
pUCPbasic、pUCP2(4×)及びpDE7で免疫化したHLA−A2/DR1トランスジェニックマウスにおけるhTERT CD4+及びE7 CD8+/CD4+特異的T細胞の頻度を決定するために、ELISpot IFN−γ分析を実施した。
結果は、hTERT CD4ポリエピトープDNA構築物が正しくプロセッシングされ、HLAクラスII制限の状況においてHLA−A2/DR1トランスジェニックマウスにおいてCD4 T細胞に提示され、主にIFN−γ、TNFα、及びIL−2を産生する効率的なCD4 Th1細胞を生成しうることが示された。さらに、hTERT CD4 Th1細胞応答は、E7抗原に対するCD8 T細胞応答と高度に相関しており、E7クラスI制限エピトープに対するCD8 T細胞免疫応答及び、このように、E7抗原ワクチン接種の有効性を強く改善する。
Claims (15)
- 少なくとも2つのテロメラーゼ逆転写酵素(TERT)のCD4エピトープ及び少なくとも1つの腫瘍、ウイルス、細菌、又は寄生虫のCD8エピトープをコードするDNA発現ベクター又はDNA発現ベクターの混合物。
- i)前記少なくとも2つのTERTのCD4エピトープをコードする少なくとも1つのDNA発現ベクター、及びii)前記少なくとも1つの腫瘍、ウイルス、細菌、又は寄生虫のCD8エピトープをコードする少なくとも1つのDNA発現ベクターを含む、請求項1記載のDNA発現ベクターの混合物。
- 前記少なくとも2つのTERTのCD4エピトープ及び前記腫瘍、ウイルス、細菌、又は寄生虫のCD8エピトープをコードする、請求項1記載のDNA発現ベクター。
- 前記TERTがヒトTERTである、請求項1〜3のいずれか一項記載のDNA発現ベクター又はDNA発現ベクターの混合物。
- 前記少なくとも2つのTERTのCD4エピトープが互いに異なる、請求項1〜4のいずれか一項記載のDNA発現ベクター又はDNA発現ベクターの混合物。
- 前記少なくとも2つのTERTのCD4エピトープが同一であり、反復している、請求項1〜4のいずれか一項記載のDNA発現ベクター又はDNA発現ベクターの混合物。
- 2〜30、好ましくは2〜20、3〜18、3〜15、3〜12、4〜10、さらに好ましくは4〜8のTERTのCD4エピトープをコードする、請求項1〜6のいずれか一項記載のDNA発現ベクター又はDNA発現ベクターの混合物。
- 前記TERTのCD4エピトープの少なくとも1つが、配列番号1、配列番号2、配列番号3、及び配列番号4からなる群より選択され、好ましくはベクター又はベクターの混合物が、配列番号1、配列番号2、配列番号3、及び配列番号4の全てを含むポリエピトープ配列をコードする、請求項1〜7のいずれか一項記載のDNA発現ベクター又はDNA発現ベクターの混合物。
- 配列番号2の少なくとも2つ、好ましくは少なくとも4つのエピトープの反復をコードする、請求項8記載のDNA発現ベクター又はDNA発現ベクターの混合物。
- 前記CD8エピトープとして、MHCクラスIエピトープを含むウイルス、細菌、もしくは寄生虫の抗原の全部又は一部、好ましくはHPV E7抗原の非発癌性変異体をコードする、請求項1〜9のいずれかに一項記載のDNA発現ベクター又はDNA発現ベクターの混合物。
- a.前記少なくとも2つのTERTのCD4エピトープをコードする少なくとも1つのDNA発現ベクターを含む第1の容器、及び
b.腫瘍、ウイルス、細菌、又は寄生虫のCD8エピトープをコードする少なくとも1つのDNA発現ベクターを含む第2の容器を含むキット。 - 異なる腫瘍、ウイルス、細菌、又は寄生虫のCD8エピトープをコードする少なくとも1つのDNA発現ベクターを含む少なくとも1つの追加の容器をさらに含む、請求項11記載のキット。
- 患者における腫瘍又は感染を処置する際での使用のための、請求項1〜10のいずれかに一項記載のDNA発現ベクター又はDNA発現ベクターの混合物、或いは請求項12記載のキット。
- 腫瘍が、癌、例えば慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、悪性骨髄腫、ホジキン病、黒色腫、脳腫瘍、例えば神経膠芽細胞腫、神経芽細胞腫、及び星細胞腫など、膀胱、乳房、子宮頸部、結腸、肺、膵臓、前立腺、頭頸部、又は胃の癌腫からなる群より選択される癌などであり、好ましくは、腫瘍がウイルスにより誘導される、請求項13記載のDNA発現ベクター又はDNA発現ベクターの混合物、或いは請求項13記載の使用のためのキット。
- 好ましくはエレクトロポレーションと組み合わせられた皮内注射により投与される、請求項13又は14記載のDNA発現ベクター、DNA発現ベクターの混合物、又は請求項13又は14記載の使用のためのキット。
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