CN111670046A - 疫苗的t细胞增强剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含任选地与一种或多于一种抗原融合的真骨鱼类恒定链片段或与一种或多于一种抗原或其抗原片段融合的真骨鱼类恒定链的多肽、编码此类多肽的多核苷酸、包含此类多核苷酸的载体、包含此类多核苷酸的载体集合以及此类多肽、多核苷酸、载体用于治疗或预防疾病，特别是肿瘤疾病的用途。真骨鱼类恒定链多肽或其片段用作将非免疫原性抗原序列转化为免疫原性T细胞抗原的“T细胞增强剂”。

Description

疫苗的T细胞增强剂
本发明涉及包含任选地与一种或多于一种抗原融合的真骨鱼类恒定链片段或与一种或多于一种抗原或其抗原片段融合的真骨鱼类恒定链的多肽、编码此类多肽的多核苷酸、包含此类多核苷酸的载体、包含此类多核苷酸的载体集合以及此类多肽、多核苷酸、载体用于治疗或预防疾病，特别是肿瘤疾病的用途。真骨鱼类恒定链多肽或其片段用作将非免疫原性抗原序列转化为免疫原性T细胞抗原的“T细胞增强剂”。
发明背景
有时疫苗会引起次优T细胞免疫应答或不引起T细胞免疫应答。在接种靶向完全是自身分子的抗原，例如癌症特异性抗原，或部分自身抗原，例如癌症特异性新抗原的疫苗的情况下，更经常观察到这种T细胞免疫应答的不良诱导现象。癌症特异性新抗原主要来自基因编码区的点突变，其导致非同义的单核苷酸变异，这导致了一个氨基酸的改变。蛋白质序列中的单个氨基酸变化极少产生能够诱导有效免疫应答的新表位。在大多数情况下，这种微小变化根本不会产生新表位，或者可能产生非常弱的新表位。由于预先存在对自身抗原的中枢耐受，因此通过疫苗接种诱导针对癌症特异性抗原的有效免疫应答仍然是一项艰巨的任务。为了克服癌症特异性抗原和新抗原的免疫原性缺乏或不良，已经采用了几种策略来拯救一些基因疫苗的免疫原性缺乏/不良。在基因疫苗接种的情况下，恒定链(INV)显示出增强CD8+T细胞诱导的作用。恒定链是主要组织相容性复合体(MHC)II类分子的分子伴侣蛋白，是其成熟和组装所必需的。INV在呈递抗原肽中也发挥作用，并且已经证明在基因疫苗的背景下，其与抗原融合时，可以增加T细胞的诱导。已经描述了用表达与INV融合的卵清蛋白的慢病毒载体提高了免疫能力(Rowe等人2006 Mol Ther 13(2)310-9)。随后，各种报道记录了人腺病毒5和表达INV融合抗原的质粒DNA载体对CD8+T细胞应答的增强诱导作用。
在癌症疫苗接种中，重要的是要避免由于疫苗诱导的T细胞无法识别出现的新型癌症特异性抗原而引起的肿瘤逃逸。癌症疫苗治疗癌症的挑战是诱导能够同时识别和消除尽可能多的癌细胞的多种免疫T细胞群，以减少癌细胞“逃避”T细胞应答的机会。因此，期望疫苗编码相当大量的癌症特异性抗原。这与最近描述的基于癌症特异性新抗原的个性化疫苗方法特别相关。为了优化成功的可能性，疫苗应靶向尽可能多的新抗原，但是载体的最大插入片段大小是有限的。全长INV序列或其大片段占据疫苗抗原插入物的相对较大部分。因此，在抗癌疫苗接种的情况下，特别是在疫苗中使用几种癌症特异性抗原时，优选使用短多肽作为T细胞增强剂。
基于腺病毒，特别是类人猿衍生的腺病毒(GAd)病毒载体的基因疫苗接种平台已显示出对诱导T细胞应答是非常有效的，并且类人猿衍生的腺病毒适用于以由依次连接的不同蛋白质的多核苷酸编码片段组成的人工基因形式编码大抗原(Borthwick，N.等人，MolTher，2014.22(2)：p.464-75)。出人意料的是，当用于癌症特异性新抗原的情况下，没有诱导出T细胞介导的免疫应答。
本发明人鉴定了能够恢复免疫原性的特定INV序列，其在本申请中也称为“T细胞增强剂氨基酸序列”。这样的T细胞增强剂氨基酸序列适合克服癌症特异性新抗原的免疫原性缺乏或不良。特别地，鉴定了非人真骨鱼类(Teleostei)INV的两个短片段，两者均不包含用作有效T细胞增强剂的跨膜结构域。
在疫苗接种的情况下，使用人INV或系统发育上密切相关的物种的INV可能导致不希望的诱导针对该自身序列的免疫应答。在这种情况下，自身免疫应答将会针对表达INV的正常组织。本发明人出人意料地发现真骨鱼类的INV尽管与哺乳动物的INV有很大的不同，但是增加了针对哺乳动物中的抗原的T细胞应答，这种T细胞应答增强作用施加于与真骨鱼类恒定链融合的多种抗原上，并且已经是短片段的真骨鱼类INV便足以引起这种应答。因此，本发明尤其提供：(i)改良的针对哺乳动物中的抗原的T细胞应答的增强剂，其降低了引起针对健康组织的有害T细胞应答的可能性，(ii)针对多种抗原的T细胞应答的增强剂，以及(iii)能够引发T细胞应答的短片段，该短片段最大程度增强与大量抗原或其抗原片段融合的能力。
发明内容
在第一方面，本发明提供了一种多肽，其包含：
(a)具有T细胞应答增强剂活性的真骨鱼类恒定链(INV)的片段和任选的一种或多于一种抗原或其抗原片段，该真骨鱼类恒定链的片段包含或组成为真骨鱼类INV的膜近端结构域(MPD)的16个至27个氨基酸，其中优选地，MPD的特征在于以下氨基酸序列：
X1QKX2QIHTLQKX3SX4RX5X6X7QX8TRX9SX10AV
其中
X1是G、D、S或N；
X2是E或Q；
X3是N或S；
X4是D或E；
X5是M或L；
X6是G、N、S或T；
X7是K或R；
X8是L或M；
X9是S、T或A；和
X10是Q或H；
其中MPD的16个至27个氨基酸优选与SEQ ID NO：7至少70％相同；
或
(b)具有T细胞应答增强剂活性的全长真骨鱼类INV SEQ ID NO：1或其变体以及一种或多于一种抗原或其抗原片段，其中所述变体的MPD的氨基酸序列与SEQ ID NO：7至少80％相同。
在第二方面，本发明涉及编码根据本发明第一方面的多肽的多核苷酸。
在第三方面，本发明涉及包含根据本发明第二方面的多核苷酸的载体。
在第四方面，本发明涉及两种或多于两种不同载体的集合，其中所述不同载体各自包含根据本发明第二方面的多核苷酸，该多核苷酸编码根据本发明第一方面的不同多肽。
在第五方面，本发明涉及药物组合物，其包含本发明第一方面的多肽、本发明第二方面的多核苷酸或本发明第三方面的载体、或本发明第四方面的载体的集合，和药学上可接受的赋形剂以及任选的一种或多于一种佐剂。
在第六方面，本发明涉及试剂盒套装，其包含本发明第五方面的药物组合物，以及分别包装的至少一种免疫调节剂例如检查点分子的调节剂(MCM)、或至少一种编码免疫调节剂例如MCM的多核苷酸、或包含编码免疫调节剂例如MCM的多核苷酸的载体。
在第七方面，本发明涉及根据本发明第一方面的多肽、根据本发明第二方面的多核苷酸、或根据本发明第三或第四方面的载体或载体的集合，其用作药物。
在第八方面，本发明涉及根据本发明第一方面的多肽、根据本发明第二方面的多核苷酸、或根据本发明第三或第四方面的载体或载体的集合、或根据本发明的第五方面的药物组合物或根据本发明第六方面的包含那些药物组合物的试剂盒，其用于预防或治疗增生性疾病，优选癌症、病毒性疾病或细菌性疾病。
附图说明
图1：GAd载体在5x107vp或5x108vp剂量下的免疫原性。载体编码连接到CT26pentatope抗原的鳜鱼INV全长(MF_INV_FL)、鳜鱼INV短版本(残基1至81，MF_INV_SH)、鳜鱼INV变体A(残基62至88、MF_INV_A)和鳜鱼INV变体B(残基66至81，MF_INV_B)。Penta表示CT26 pentatope抗原没有鳜鱼INV序列或其片段且仅具有起始甲硫氨酸。通过ELISpot测定获得免疫动物脾细胞的报告值。疫苗接种后两周，用对应于包含突变的五种癌症特异性新抗原的序列的五种合成肽库离体刺激脾细胞。应答表示为每百万个脾细胞产生IFNγ的T细胞数。底部显示的是总数为6只经免疫的小鼠中对每种测试的载体构建体显示出阳性应答的小鼠数量。虚线表示阳性应答的阈值。
图2：各种真骨鱼类物种的恒定链的比对。第一个方框表征了26个氨基酸长的跨膜结构域(TMD)。膜近端结构域(MPD)紧邻TMD的C末端，并将其用第二个框突出显示。在第二个框下面用一系列星号(*)突出显示MPD中包含的16个氨基酸长的恒定链短片段MF_INV_B的位置和序列。INV序列从上至下是根据SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的氨基酸序列。
图3：编码20种CT26新抗原的GAd载体的免疫原性。用5x107的每种GAd载体(包含鳜鱼恒定链FRAG_A的MF_INV_A-20、不包含鳜鱼恒定链FRAG_A的CT26-20)对小鼠进行免疫，并在2周后通过对脾脏细胞进行ELISpot测定来测量免疫应答。显示的是对对应于20种编码的新抗原序列的20种合成肽库的应答(每百万个脾细胞产生IFNγ的T细胞数)。显示的值是对6只小鼠/组进行测量的平均值+/-SEM。
发明详述
在下面详细描述本发明之前，应当理解，本发明不限于本文描述的特定方法、方案和试剂，因为它们可以变化。还应理解，本文所使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，而不旨在限制本发明的范围，本发明的范围仅由所附权利要求书来限制。除非另外限定，否则本文使用的所有技术和科学术语具有如本领域普通技术人员通常所理解的相同含义。
优选地，本文所用的术语的限定如″A multilingual glossary ofbiotechnological terms：(IUPAC Recommendations)″，Leuenberger，H.G.W，Nagel，B.和Klbl，H.编(1995)，Helvetica Chimica Acta，CH-4010 Basel，Switzerland)中所描述，并且如″Pharmaceutical Substances：Syntheses，Patents，Applications″，Axel Kleemann和Jurgen Engel，Thieme Medical Publishing，1999；″Merck Index：An Encyclopedia ofChemicals，Drugs，and Biologicals″，由Susan Budavari等人编，CRC Press，1996，和theUnited States Pharmacopeia-25/National Formulary-20，由the United StatesPharmcopeial Convention，Inc.，Rockville Md.，2001出版中所描述。
在整个说明书和随后的权利要求书中，除非上下文另有要求，否则词语“包括”和“包含”将被理解为暗示包括所陈述的特征、整数或步骤，或特征、整数或步骤的组，但不排除任何其他特征、整数或步骤，或整数或步骤的组。在以下段落中，更详细地定义了本发明的不同方面。除非明确指出相反的情况，否则如此定义的每个方面可以与一个或多于一个其他方面组合。特别地，任何被指示为优选或有利的特征可以与被指示为优选或有利的任何其他特征组合。
在本说明书的全文中引用了一些文件。无论是上文还是下文，本文引用的每个文件(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、说明书等)均通过引用全文并入本文。本文中的任何内容均不得解释为承认本发明由于在先的发明而无权提前公布。
定义
在下文中，提供了本说明书中经常使用的术语的一些定义。在说明书的其余部分中，这些术语在其使用的每种情况下将分别具有定义的含义和优选的含义。
在本发明中使用的术语跨膜结构域(TMD)是指恒定链序列(INV)的TMD，其定义为起始于所有INV中保守的Gln(Q)残基的N端方向的第17个残基，终止于保守Q的C端方向第8个残基的氨基酸区段，因此总共包括26个残基。
术语膜近端结构域(MPD)在本发明中是指紧接INV的TMD的C末端的27个残基的区段。
术语“佐剂”在本发明中用作增强对抗原的免疫应答的物质。另外，佐剂也已经发展成为可以帮助稳定抗原制剂的物质。将佐剂添加到疫苗中以刺激免疫系统对靶抗原的应答，但其自身不提供免疫力。需要佐剂来改善对抗原的指定途径的适应性免疫应答。佐剂通过不同的机制发挥作用。例如，通过延长血液中抗原的存在或/和帮助抗原呈递细胞吸收抗原，和/或激活巨噬细胞和淋巴细胞，和/或支持细胞因子的产生。一些佐剂，例如明矾，用作递送系统，其通过产生在注射部位捕获抗原的贮库来提供持续刺激免疫系统的缓慢释放。在描述的佐剂类型中有：i)无机化合物：明矾、氢氧化铝、磷酸铝、碱式磷酸钙，ii)矿物油：石蜡油，iii)细菌产品：灭活的百日咳博德特氏杆菌、牛分枝杆菌、类毒素，iv)非细菌有机物：角鲨烯，v)递送系统：清净剂(Quil A)，vi)来自皂树(参见皂树属)的植物皂苷、大豆、美远志，vii)细胞因子：IL-1、IL-2、IL-12，viii)组合物：弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂。
术语“免疫调节剂”在本发明中是指对免疫系统有作用的任何药物或物质。免疫调节剂可通过i)增强弱免疫系统；ii)控制过度活跃的免疫系统，来将免疫应答调节至正确水平。能够增强弱免疫系统的特殊类型的免疫调节剂是免疫学检查点分子的调节剂(MCM)，其组成为：
i)激动性激活剂MCM，例如肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族成员，优选CD27、CD40、OX40、GITR或CD137，
ii)拮抗性抑制剂MCM，例如PD-1、CD274、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、CTLA-4、IDO、KIR、LAG3、TIM-3、VISTA或B7-CD28超家族成员、CD28或ICOS或其配体的拮抗剂。
可以增强弱免疫系统的另一类免疫调节剂是细胞因子，它们充当T细胞生长因子。这种细胞因子的优选实例是IL-2、IL-12、IL-15或IL-17。
在本发明的上下文中，术语“抗原”用于指由免疫应答的分子，例如抗体、T细胞受体(TCR)等识别的任何结构。优选的抗原是细胞的或外源的，例如与特定疾病相关的病毒、细菌或真菌的蛋白质。抗原被适应性免疫系统的高度可变的抗原受体(B细胞受体或T细胞受体)识别，并可引发体液免疫应答或细胞免疫应答。引起这种应答的抗原也称为免疫原。不论是外来的还是细胞的，一部分细胞内的蛋白质都被加工成较小的肽，并由主要的组织相容性复合体(MHC)呈递。
术语“其抗原片段”是指给定抗原的仍被免疫系统分子识别的部分。抗原片段将包含至少一个表位或抗原决定簇。优选地，本发明的抗原片段包含至少一种T细胞表位。
术语“表位”也称为抗原决定簇，在本发明的上下文中用于指抗原的区段，优选与免疫系统的分子例如B细胞受体、T细胞受体或抗体结合的肽。与抗体或B细胞结合的表位称为“B细胞表位”，与T细胞结合的表位称为“T细胞表位”。在本文中，术语“结合”优选地涉及特异性结合，其被定义为抗体或T细胞受体(TCR)与各自的表位以1x105M-1或高于1x105M-1，优选1x106M-1、1x107M-1、1x108M-1或高于1x108M-1的结合常数结合。技术人员非常了解如何确定结合常数(参见例如Caoili，S.E.(2012)Advances in Bioinformatics Vol.2012)。优选地，抗体与表位的特异性结合是通过抗体的Fab(抗原结合片段)区域介导的，B细胞的特异性结合是由B细胞受体所包含的抗体的Fab区域介导的，T细胞的特异性结合是由T细胞受体的可变(V)区域介导的。T细胞表位呈递于抗原呈递细胞的表面，并与主要组织相容性(MHC)分子结合。存在至少两种不同类别的MHC分子，分别称为I类MHC、II类MHC。通过MHC-I途径呈递的表位引起细胞毒性T淋巴细胞(CD8+细胞)的应答，而通过MHC-II途径呈递的表位引起T辅助细胞(CD4+细胞)的应答。由I类MHC分子呈递的T细胞表位通常是长度为8个至11个氨基酸的肽，而由II类MHC分子呈递的T细胞表位通常是长度为13个至17个氨基酸的肽。MHC III类分子还呈递糖脂形式的非肽表位。因此，术语“T细胞表位”优选是指可以由I类MHC或II类MHC分子呈递的长度为8个至11个或13个至17个氨基酸的肽。表位通常由氨基酸的化学活性表面基团组成，这些表面活性基团可以带有或不带有糖侧链，通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。构象性表位和非构象性表位的区别在于，在存在变性溶剂的情况下，与前者的结合丧失而与后者的结合不会丧失。
在本发明的上下文中，术语“癌症特异性抗原”用于指在癌细胞中特异性表达或在癌细胞中比在健康细胞中更丰富的蛋白质。癌症特异性抗原包括以下类型的抗原：
(i)癌胚抗原(通常仅在胎儿组织和癌性体细胞中表达)；或
(ii)致癌病毒抗原(由致瘤转化病毒编码)；或
(iii)过度表达/累积的抗原(正常组织和肿瘤性组织均表达，其中在肿瘤中表达水平高度升高)，例如黑色素瘤中的酪氨酸酶或乳腺癌中的Her-2受体；或
(iv)睾丸癌抗原(仅由癌细胞和成体生殖组织例如睾丸和胎盘表达)；或
(v)谱系受限的抗原(主要由单一癌症组织型表达)；或
(vi)癌症特异性异形体抗原(转录外显子组成的改变)。
在本发明的上下文中使用的术语“癌症特异性新抗原”是指不存在于正常细胞/生殖细胞中但存在于转化的细胞，特别是癌细胞中的抗原。癌症特异性新抗原可包含一种或多于一种，例如，2种、3种、4种、5种或多于5种新表位。优选地，选择本发明的多肽中包括的每种癌症特异性新抗原的长度，以确保它们包含正常细胞/生殖细胞中存在的表位的可能性很小。通常，可以通过癌症特异性新抗原在产生新表位的氨基酸变化的C末端和/或N末端包含12个或少于12个氨基酸来确定这一点。
癌症特异性新抗原优选地由在DNA水平上发生的突变产生，并且其中突变的蛋白可以包含：
a)由点突变非同义SNV引起的一个或多于一个单氨基酸变化；和/或
b)由产生移框肽的插入/缺失引起的非野生型氨基酸序列；和/或
c)由外显子边界的改变或由产生内含子保留的突变引起的非野生型氨基酸序列；和/或
d)由基因融合事件产生的突变的癌蛋白。
由基因组点突变非同义SNV引起的一个或多于一个单氨基酸变化产生的新抗原在本发明的上下文中被称为单氨基酸突变肽。
在本发明的上下文中使用的术语“移码肽”是指包含引起开放阅读框(ORF)移位的插入或缺失突变的多核苷酸的蛋白质编码片段的完整的非野生型翻译产物。
在本发明的上下文中，术语“开放阅读框”缩写为“ORF”，是指可翻译成连续氨基酸序列的核苷酸序列。通常，在给定的阅读框中，ORF包含起始密码子、长度通常是3个核苷酸的倍数的后续区域，但不包含终止密码子(TAG、TAA、TGA、UAG、UAA或UGA)。ORF编码的蛋白质中，可以翻译成的氨基酸形成肽连接的链。
术语“多核苷酸”或“核酸”包括单链和双链核苷酸聚合物。包含多核苷酸的核苷酸可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或任一类型核苷酸的修饰形式。所述修饰包括碱基修饰，例如溴尿苷和肌苷衍生物，核糖修饰，例如2′，3′-二脱氧核糖，和核苷酸间连接修饰，例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸硒酸酯、磷酸二硒酸酯、苯胺基硫代磷酸酯(phosphoroanilothioate)、苯胺基磷酸酯(phoshoraniladate)和氨基磷酸酯。多核苷酸的实例是DNA和RNA。
“分离的多核苷酸”是基因组、mRNA、cDNA或合成来源或其某些组合的DNA或RNA，其与在自然界中发现是分离的多核苷酸的全部或部分的多核苷酸无关，或连接至其不天然连接的多核苷酸。
在本发明的上下文中，术语“表达盒”用于指包含至少一个待表达的核酸序列的多核苷酸，待表达的核酸序列例如为编码与本发明的恒定链融合的癌症特异性新抗原或其片段的序列，表达盒可操作地连接至转录和/或翻译控制序列。优选地，表达盒包括用于有效表达给定基因的顺式调节元件，例如启动子、起始位点和/或聚腺苷酸化位点。优选地，表达盒包含在患者细胞中表达多核苷酸所需的所有其他元件。因此，典型的表达盒包含与待表达的多核苷酸序列可操作地连接的启动子，以及转录物的有效聚腺苷酸化、核糖体结合位点和翻译终止所需的信号。盒的其他元件可以包括例如增强子。表达盒优选还包含位于结构基因下游的转录终止区，以提供有效的终止。终止区可以从与启动子序列相同的基因获得，或者可以从不同的基因获得。
在本发明的上下文中使用的术语“可操作地连接”是指元件的布置，其中如此描述的组件被配置为执行其通常的功能。当多核苷酸与另一核酸序列处于功能关系时，该多核苷酸是“可操作地连接的”。例如，如果启动子影响一个或多于一个转基因的转录，则该启动子可操作地连接至一个或多于一个转基因。此外，可操作地连接至编码序列的控制元件能够实现编码序列的表达。控制元件不必与编码序列邻接，只要它们具有指导其表达的功能即可。因此，例如，在启动子序列和编码序列之间可以存在中间的未翻译但仍被转录的序列，并且仍然可以认为该启动子序列与编码序列“可操作地连接”。
术语“载体”或“表达载体”可互换使用，并且是指多核苷酸、某种类型的包膜内，例如病毒衣壳或脂质体内的多核苷酸、或与蛋白质复合的多核苷酸，所述蛋白质能够被引入或能够引入本发明的多核苷酸或将本发明的多核苷酸引入细胞中，优选哺乳动物细胞。载体的实例包括但不限于质粒、黏粒、噬菌体、脂质体、病毒或人工染色体。特别地，使用载体将本发明的启动子和多核苷酸转运到合适的宿主细胞中。表达载体可包含促进表达载体在宿主细胞中自主复制的“复制子”多核苷酸序列。进入宿主细胞后，表达载体可以独立于宿主染色体DNA复制或与宿主染色体DNA同时复制，并且可以生成该载体及其插入的DNA的多个拷贝。如果使用复制功能不佳的表达载体(通常是出于安全原因的情况)，则该载体可能不会复制而只能直接表达多核苷酸。取决于表达载体的类型，表达载体可以从细胞中丢失，即仅瞬时表达由多核苷酸编码的新抗原，或者可以在细胞中稳定。表达载体通常包含表达盒，即允许多核苷酸转录成mRNA分子的必需元件。如果多核苷酸是RNA，不需要转录，那么RNA分子仅需要翻译控制元件。
术语“T细胞增强剂氨基酸序列”是指当与抗原序列融合时在遗传接种的情况下增加T细胞诱导的多肽序列。
术语“T细胞应答增强剂活性”是指增加被抗原攻击的T细胞的应答的化合物，特别是多肽。这种化合物的实例是本发明的多肽，特别是在与抗原序列偶联的情况下。在疫苗接种的情况下，与T细胞对单独的抗原的应答相比，该多肽将增加T细胞对所述抗原的应答。用于测量T细胞应答的合适测定法是本领域已知的，包括通过ELISpot或通过细胞内细胞因子染色(ICS)来测量已活化的T细胞所释放的细胞因子，例如干扰素γ(IFN-γ)，其检测了细胞刺激后的内质网内细胞因子的产生和积累。具有T细胞应答增强活性的化合物如所例示的，例如通过增加细胞因子释放，增加了T细胞的应答。
在本发明的上下文中使用的术语“制剂”和“组合物”旨在包括活性化合物的制剂，例如具有载剂和/或赋形剂的本发明的类人猿腺病毒。
在本发明的上下文中使用的“药学上可接受的”是指由美国联邦或州政府的监管机构批准或在美国药典或其他公认的药典中列出的用于动物尤其是人类的药物。
如本文所用，术语“载剂”是指药理学上无活性的物质，例如但不限于与治疗活性成分一起施用的稀释剂、赋形剂、表面活性剂、稳定剂、生理缓冲溶液或运载剂。这样的药物载剂可以是液体或固体。液体载剂包括但不限于无菌液体，例如水和油中的盐溶液，包括但不限于石油、动物、植物或合成来源的那些，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。盐溶液以及葡萄糖水溶液和甘油溶液也可以用作液体载剂，特别是用于可注射溶液。当药物组合物静脉内施用时，盐溶液是优选的载剂。合适的药物载剂的实例描述于E.W.Martin的“Remington′s Pharmaceutical Sciences”中。
合适的药物“赋形剂”包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。
“表面活性剂”包括阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂和非离子表面活性剂，例如但不限于脱氧胆酸钠、十二烷基硫酸钠、Triton X-100、以及聚山梨酯、例如聚山梨酯20、聚山梨酯40、聚山梨酯60、聚山梨酯65和聚山梨酯80。
“稳定剂”包括但不限于甘露醇、蔗糖、海藻糖、白蛋白、以及蛋白酶和/或核酸酶拮抗剂。
可以在本发明的上下文中使用的“生理缓冲溶液”包括但不限于氯化钠溶液、去离子水以及合适的有机或无机缓冲溶液，例如但不限于磷酸盐缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂、tris缓冲液(三(羟甲基)氨基甲烷)、HEPES缓冲液([4(2羟乙基)哌嗪基]乙磺酸)或MOPS缓冲液(3吗啉代-1丙烷磺酸)。通常，各个缓冲液的选择取决于所需的缓冲液摩尔浓度。磷酸盐缓冲液适用于例如注射液和输注液。
“有效量”或“治疗有效量”是足以达到预期目的的治疗剂的量。给定治疗剂的有效量将随诸如治疗剂的性质、给药途径、接受该治疗剂的动物的大小和种类以及给药目的等因素而变化。每种情况下的有效量可以由技术人员根据本领域中已建立的方法凭经验确定。
如本文所用，对疾病或病症的“治疗”或“处理”是指完成以下一项或多于一项：(a)减少疾病的严重程度；(b)限制或预防所治疗病症特征性症状的发展；(c)抑制所治疗病症特征性症状的恶化；(d)限制或预防先前患有该病症的个体的该病症的复发；和(e)限制或预防先前有病症的症状的个体的症状复发。
发明的实施方案
在第一方面，本发明提供了一种多肽，其包含：
(a)优选具有T细胞应答增强剂活性的真骨鱼类INV的片段和任选的一种或多于一种抗原或其抗原片段，该真骨鱼类INV的片段包含或组成为真骨鱼类INV的膜近端结构域(MPD)的16个至27个连续氨基酸，其中优选地，MPD的特征在于以下氨基酸序列(SEQ ID NO：31)：
X1QKX2QIHTLQKX3SX4RX5X6X7QX8TRX9SX10AV
其中
X1为G、D、S或N，优选为G或S；更优选为G；
X2是E或Q；优选为E；
X3是N或S；优选为N；
X4是D或E；优选为E；
X5是M或L；优选为M；
X6是G、N、S或T；优选为S、G或T，更优选为S；
X7是K或R；优选为K；
X8是L或M；优选为L；
X9是S、T或A；优选为S；和
X10是Q或H；优选为Q；
其中MPD的16个至27个氨基酸优选与SEQ ID NO：7至少70％相同；
或
(b)具有T细胞应答增强剂活性的全长真骨鱼类INV SEQ ID NO：1或其变体以及一种或多于一种抗原或其抗原片段，其中所述变体的MPD的氨基酸序列与SEQ ID NO：7至少80％相同。
通常，期望INV的片段尽可能短，同时保留其T细胞抗原刺激作用。优选地，该片段包含、更优选地组成为INV的MPD的16个至27个、17个至26个、18个至25个、19个至24个、20个至23个、21个至22个连续氨基酸。
尽管INV的片段可以在MPD的N末端和/或C末端包含另外的序列，但是优选地，片段中不包含这样的序列，因此，优选地，该片段由MPD的相应连续氨基酸片段组成。
如果INV的片段在MPD的N末端和/或C末端包含另外的序列，则优选该片段包含整个MPD，即27个氨基酸。优选的是，该片段不包含TMD，但包含INV的其他C末端氨基酸。优选地，这些C末端氨基酸与MPD直接连续相连。
MPD的序列优选地基于根据SEQ ID NO：7的鳜鱼的MPD序列。优选地，该片段包含或组成为MPD的16个至27个氨基酸，其中MPD与SEQ ID NO：7至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％相同。
该片段可以包含另外的INV的N末端和/或C末端氨基酸序列。因此，优选INV片段的总长度为16个至80个、17个至72个、18个至55个、19个至50个、20个至45个、21个至40个、22个至35个、23个至30个连续的氨基酸。
在一个优选的实施方案中，该片段包含或组成为特征在于SEQ ID NO：31的氨基酸序列的MPD。优选地，该MPD至少包含QIHTLQKX3SX4RX5X6X7QX8的氨基酸序列(SEQ ID NO：51)，其中
X3是N或S；优选为N；
X4是D或E；优选为E；
X5是M或L；优选为M；
X6是G、N、S或T；优选为S、G或T，更优选为S；
X7是K或R；优选为K；
X8是L或M；优选为L。
在该优选实施方案的上下文中，特别优选地，该片段包含SEQ ID NO：51和0个至11个，即0个、1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或11个可位于SEQ ID NO：51的N末端和/或C末端的MPD的其他氨基酸。优选地，这1个至11个其他氨基酸与SEQ ID NO：7具有至少70％的同一性。优选地，包含根据SEQ ID NO：51的核心序列的整个片段与SEQ IDNO：7至少70％相同，更优选与SEQ ID NO：7至少75％相同，更优选至少80％相同，甚至更优选至少85％相同，或至少90％相同。在每种情况下，优选该片段具有T细胞应答增强剂活性。还优选不存在与片段的N末端和C末端连续相连的其他INV链序列，更优选该片段是多肽中唯一的INV序列。
在本发明第一方面的多肽的优选实施方案中：
(a)第一方面的替代方案(a)的MPD的氨基酸序列是SEQ ID NO：7至12中的任一个，即SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12；或
(b)本发明第一方面的替代方案(a)的INV片段的氨基酸序列包含SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：18中的任一个，优选包含SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：13；或由SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQID NO：16、SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：18中的任一个组成，优选由SEQ ID NO：7或SEQ IDNO：13组成；或
(c)本发明第一方面的替代方案(b)的真骨鱼类恒定链的氨基酸序列是SEQ IDNO：1至6中的任一个。
如果片段由INV的MPD的16个至27个氨基酸组成，则优选的片段具有根据SEQ IDNO：7至12的INV的MPD的长度为16至27、17至26、18至25、19至24、20至23、21至22的连续氨基酸。
在以上概述的每种情况下，片段或变体具有T细胞应答增强剂活性。T细胞应答增强剂活性可以如本领域已知的或如所附实验中所述进行测量。当与相同抗原或抗原片段连接时，优选T细胞应答增强剂活性是根据SEQ ID NO：13的INV片段的T细胞应答增强剂活性的至少50％，优选至少80％。
在本发明第一方面的替代方案(a)的多肽的特定实施方案中，片段组成为MPD的至少16个至27个N末端氨基酸和：
(i)紧接在MPD N末端的真骨鱼类INV的跨膜结构域(TMD)的1个至26个连续氨基酸，其中真骨鱼类INV的TMD的特征优选在于以下氨基酸序列(SEQ ID NO：32)：
AY1KY2AY3LTTLY4CLLY5Y6SQVFTAYY7VF
其中
Y1为L或F，优选为L；
Y2为I或V，优选为V；
Y3为G或A，优选为G；
Y4为T或A，优选为T；
Y5为L或V，优选为L；
Y6为A或S，优选为A；和
Y7为M或T，优选为M；
和/或
(ii)紧接在MPD C末端的真骨鱼类INV的1个至19个连续氨基酸，优选地，其特征在于以下氨基酸序列(SEQ ID NO：33)：
APZ1Z2MZ3Z4PMZ5SLPZ6Z7Z8DZ9Z10
其中
Z1为M、V或A，优选为M或V，更优选为M；
Z2为R或K，优选为K；
Z3为H、A或Q，优选为M或H，更优选为H；
Z4为M或L，优选为M；
Z5为N或S，优选为N；
Z6为M或L，优选为L；
Z7为M、L或V，优选为L；
Z8为M或S，优选为M；
Z9为F或Y，优选为F；和
Z10为T或S，优选为T。
如果所述片段包含另外的INV的N末端和/或C末端氨基酸序列，则优选所述INV的片段的全长为28个至72个、30个至65个、或35个至46个连续氨基酸。
本发明人出人预料地发现，通过将本发明第一方面的替代方案(a)的INV片段或本发明第一方面的替代方案(b)的INV与两种或多于两种抗原和/或其抗原片段融合，可以诱导对两种或多于两种抗原，优选新抗原的强T细胞应答。这允许同时诱导针对多种抗原的T细胞应答。因此，关于本发明第一方面的替代方案(a)和本发明第一方面的替代方案(b)，优选所述多肽包含多种抗原和/或其抗原片段。例如，优选多肽包含至少5种不同的抗原和/或其抗原片段，更优选至少20种不同的抗原和/或其抗原片段，甚至更优选至少50种不同的抗原和/或其抗原片段，甚至更优选至少100种不同的抗原和/或其抗原片段，甚至更优选至少200种不同的抗原和/或其抗原片段，甚至更优选至少300种不同的抗原和/或其抗原片段。
为了在一个多肽中容纳最大数量的不同抗原，特别优选的是该多肽包含抗原的抗原片段。
根据相应的治疗应用选择抗原。如果需要针对增生性疾病进行治疗或预防接种，则抗原选自癌症特异性抗原或癌症特异性新抗原。如上所述，特别是在癌症疫苗接种的背景下，优选第一方面的多肽包含两种或多于两种不同的抗原。优选多肽包含至少5种不同的癌症特异性抗原或其抗原片段，更优选至少20种不同的癌症特异性抗原或其抗原片段，甚至更优选至少50种不同的癌症特异性抗原或其抗原片段，甚至更优选至少100种不同的癌症特异性抗原或其抗原片段，甚至更优选至少200种不同的癌症特异性抗原或其抗原片段，甚至更优选至少300种不同的癌症特异性抗原或其抗原片段。或者，优选多肽包含至少5种不同的癌症特异性新抗原或其抗原片段，更优选至少20种不同的癌症特异性新抗原或其抗原片段，甚至更优选至少50种不同的癌症特异性新抗原或其抗原片段，甚至更优选至少100种不同的癌症特异性新抗原或其抗原片段，甚至更优选至少200种不同的癌症特异性新抗原或其抗原片段，甚至更优选至少300种不同的癌症特异性新抗原或其抗原片段。或者，优选多肽包含至少5种不同的癌症特异性抗原或新抗原或其抗原片段，更优选至少20种不同的癌症特异性抗原或新抗原或其抗原片段，甚至更优选至少50种不同的癌症特异性抗原或新抗原或其抗原片段，甚至更优选至少100种不同的癌症特异性抗原或新抗原或其抗原片段，甚至更优选至少200种不同的癌症特异性抗原或新抗原或其抗原片段，甚至更优选至少300种不同的癌症特异性抗原或新抗原或其抗原片段。
或者，抗原是病毒蛋白或其抗原片段、细菌蛋白或其抗原片段、或真菌蛋白或其抗原片段。
通常，针对病毒、细菌或真菌感染的预防性或治疗性疫苗不需要像治疗增生性疾病的疫苗那样的多种不同的有效抗原。尽管如此，有一些病毒，例如HIV，具有大量不同的表位，特别是在包被蛋白中。为了引起广泛的免疫应答，可以包括多种抗原。因此，优选多肽包含至少5种不同的病毒抗原或其抗原片段，更优选至少20种不同的病毒抗原或其抗原片段，甚至更优选地至少50种不同的病毒抗原或其抗原片段，甚至更优选至少100种不同的病毒抗原或其抗原片段，甚至更优选至少200种不同的病毒抗原或其抗原片段，甚至更优选至少300种不同的病毒抗原或其抗原片段。抗原可以选自相同病毒的不同病毒株和/或选自不同的病毒。在后一种情况下，疫苗可以针对多种不同的病毒产生免疫。
或者，优选多肽包含至少5种不同的细菌抗原或其抗原片段，更优选至少20种不同的细菌抗原或其抗原片段，甚至更优选至少50种不同的细菌抗原或其抗原片段，甚至更优选至少100种不同的细菌抗原或其抗原片段，甚至更优选至少200种不同的细菌抗原或其抗原片段，甚至更优选至少300种不同的细菌抗原或其抗原片段。
或者，优选多肽包含至少5种不同的真菌抗原或其抗原片段，更优选至少20种不同的真菌抗原或其抗原片段，甚至更优选至少50种不同的真菌抗原或其抗原片段，甚至更优选至少100种不同的真菌抗原或其抗原片段，甚至更优选至少200种不同的真菌抗原或其抗原片段，甚至更优选至少300种不同的真菌抗原或其抗原片段。
在所有上述实施方案中，优选抗原是T细胞抗原。T细胞抗原是由MHC呈递并引起T细胞应答的那些。
优选地，抗原或每种抗原或其抗原片段的长度为6个至100个氨基酸，更优选7个至50个氨基酸，更优选8个至30个氨基酸。
在本发明第一方面的多肽的优选实施方案中，一个或多于一个抗原和/或其一个或多于一个抗原片段位于根据本发明第一方面的替代方案(a)的INV片段的C末端或位于根据本发明第一方面的替代方案(b)的全长INV的C末端。特别优选抗原和/或其抗原片段紧接在根据本发明第一方面的替代方案(a)或(b)的INV的C末端。
优选本发明的多肽在待接种疫苗的患者的细胞内产生。细胞内表达是MHC呈递并因此刺激T细胞应答的先决条件。因此，在第二方面，本发明涉及编码根据本发明第一方面的多肽的多核苷酸。优选地，多核苷酸是DNA或RNA。更优选地，多核苷酸是DNA。RNA优选用于直接引发编码多肽的翻译。通常将编码第一方面多肽的DNA插入指导编码本发明多肽的mRNA的转录的表达盒中。但是，如果多核苷酸包含在载体中并且该载体是RNA病毒，则多核苷酸也可以是RNA。直接应用的优选RNA是自扩增RNA(SAM)。
在第三方面，本发明涉及包含根据本发明第二方面的多核苷酸的载体。优选地，本发明的多核苷酸可操作地连接至表达控制序列。
如果待递送至患者的不同抗原或其抗原片段的数目太大以至于编码INV及所有抗原或其抗原片段的融合多肽的多核苷酸不能容纳在所选择的载体中，则使用两个或多于两个载体。因此，在第四方面，本发明涉及两种或多于两种不同载体的集合，其中所述不同载体各自包含根据本发明第二方面的编码根据本发明第一方面的不同多肽的多核苷酸。
对于第三方面的载体或第四方面的载体集合，其中载体在每种情况下独立地选自质粒；黏粒；脂质体颗粒，病毒载体或病毒样颗粒；优选α病毒载体、委内瑞拉马脑炎(VEE)病毒载体、辛德毕斯(SIN)病毒载体、森林脑炎病毒(SFV)病毒载体、猿猴或人巨细胞病毒(CMV)载体、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、痘病毒载体、牛痘病毒载体或经修饰的牛痘安卡拉(MVA)载体。优选的是载体的集合，其中集合的每个成员包含编码不同抗原或其片段的多核苷酸，因此通常同时施用的载体使用相同的载体类型，例如腺病毒衍生的载体。
最优选的载体是腺病毒载体，特别是衍生自人或非人类人猿的腺病毒载体。优选的衍生腺病毒的类人猿是黑猩猩(Pan)、大猩猩(Gorilla)和猩猩(Pongo)，优选倭黑猩猩(Pan paniscus)和黑猩猩(Pan troglodytes)。通常，从相应类人猿的粪便样品中分离天然存在的非人类人猿腺病毒。最优选的载体是基于hAd5、hAd11、hAd26、hAd35、hAd49、ChAd3、ChAd4、ChAd5、ChAd6、ChAd7、ChAd8、ChAd9、ChAd10、ChAd11、ChAd16、ChAd17、ChAd19、ChAd20、ChAd22、ChAd24、ChAd26、ChAd30、ChAd31、ChAd37、ChAd38、ChAd44、ChAd55、ChAd63、ChAd73、ChAd82、ChAd83、ChAd146、ChAd147、PanAd1、PanAd2和PanAd3载体的无复制能力的腺病毒载体，或有复制能力的Ad4和Ad7载体。人腺病毒hAd4、hAd5、hAd7、hAd11、hAd26、hAd35和hAd49是本领域众所周知的。基于天然存在的ChAd3、ChAd4、ChAd5、ChAd6、ChAd7、ChAd8、ChAd9、ChAd10、ChAd11、ChAd16、ChAd17、ChAd19、ChAd20、ChAd22、ChAd24、ChAd26、ChAd30、ChAd31、ChAd37、ChAd38、ChAd44、ChAd63和ChAd82的载体详细描述于WO2005/071093中。在WO 2010/086189中详细描述了基于天然存在的PanAd1、PanAd2、PanAd3、ChAd55、ChAd73、ChAd83、ChAd146和ChAd147的载体。
在第五方面，本发明涉及药物组合物，其包含本发明第一方面的多肽、本发明第二方面的多核苷酸或本发明第三方面的载体、或本发明的第四方面的载体的集合，和药学上可接受的赋形剂以及任选的一种或多于一种佐剂。
本发明人发现，至少一种免疫调节剂，例如检查点分子的调节剂(MCM)的施用，进一步改善了针对抗原或其片段的T细胞应答强度。因此，在第六方面的优选实施方案中，药物组合物包含至少一种免疫调节剂例如MCM、或至少一种编码该免疫调节剂例如MCM的多核苷酸、或包含编码该免疫调节剂例如MCM的多核苷酸的载体或脂质体颗粒。
在第六方面，本发明涉及试剂盒套装，其包含本发明第五方面的药物组合物，以及分别包装的至少一种免疫调节剂例如MCM、或至少一种编码免疫调节剂例如MCM的多核苷酸、或包含编码免疫调节剂例如MCM的多核苷酸的载体。
在第五方面或第六方面的优选实施方案中，免疫调节剂是MCM，并且选自：
(a)肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族成员的激动剂，优选CD27(例如Varlilumab)、CD40(例如CP-870，893)、OX40(例如INCAGN01949或MEDI0562)、GITR(例如MEDI1873)或CD137(例如乌托米单抗)的激动剂；
(b)PD-1的拮抗剂(例如派姆单抗或纳武单抗)、CD274的拮抗剂(阿特珠单抗或德瓦鲁单抗)、A2AR的拮抗剂(例如Preladenant)、B7-H3的拮抗剂(例如MGA271)、B7-H4的拮抗剂、BTLA的拮抗剂、CTLA-4的拮抗剂(例如曲美单抗或AGEN1884)、IDO的拮抗剂、KIR的拮抗剂、LAG3的拮抗剂、TIM-3的拮抗剂(例如CA-327或RMT3-23)或VISTA的拮抗剂(例如CA-170)或B7-CD28超家族成员的拮抗剂，优选CD28或ICOS的拮抗剂或其配体的拮抗剂。
其他优选的免疫调节剂是用作T细胞生长因子的细胞因子，特别是IL-2、IL-12或IL-15。
在第七方面，本发明涉及根据本发明第一方面的多肽、根据本发明第二方面的多核苷酸、或根据本发明第三或第四方面的载体或载体的集合，其用作药物。
在第八方面，本发明涉及根据本发明第一方面的多肽、根据本发明第二方面的多核苷酸、或根据本发明第三或第四方面的载体或载体的集合、或根据本发明的第五方面的药物组合物或根据本发明第六方面的包含那些药物组合物的试剂盒，其用于预防或治疗增生性疾病，优选癌症、病毒性疾病、真菌性疾病或细菌性疾病。
在一个优选的实施方案中，根据本发明第一方面的多肽、根据本发明第二方面的多核苷酸、或根据本发明第三或第四方面的载体或载体的集合、或根据本发明第五方面的药物组合物、或包含根据本发明第五方面的此类药物组合物的试剂盒，其中所述癌症选自：唇、口腔、咽、消化器官、呼吸器官、胸腔内器官、骨骼、关节软骨、皮肤、间皮组织、软组织、乳房、女性生殖器官、男性生殖器官、泌尿道、大脑和中枢神经系统的其他部位、甲状腺、内分泌腺、淋巴组织和造血组织的恶性肿瘤。
在一个优选的实施方案中，根据本发明第一方面的多肽、根据本发明第二方面的多核苷酸、或根据本发明第三或第四方面的载体或载体的集合、或根据本发明第五方面的药物组合物、或包含根据本发明第五方面的这种药物组合物的试剂盒，其中在施用根据本发明第一方面的多肽、根据本发明第二方面的多核苷酸、或根据本发明第三或第四方面的载体或载体的集合、或根据本发明第五方面的药物组合物、或包含根据本发明第五方面的这种药物组合物的试剂盒之前、同时或之后，施用至少一种免疫调节剂例如MCM、或至少一种编码该免疫调节剂例如MCM的多核苷酸、或包含编码该免疫调节剂例如MCM的多核苷酸的载体或脂质体颗粒。
在本发明的第八方面的优选实施方案中，在开始施用疫苗之前开始检查点分子的调节剂的施用，或其中在开始施用疫苗之后开始检查点抑制剂的施用，或其中在开始接种疫苗的同时开始检查点抑制剂的施用。
在本发明的第八方面的优选实施方案中，疫苗接种方案是采用两种不同病毒载体进行异源初免加强免疫。优选的组合是用于引发的类人猿衍生的腺病毒载体和用于加强免疫的痘病毒载体、牛痘病毒载体或经修饰的牛痘安卡拉(MVA)载体。优选这些载体以至少1周，优选6周的间隔顺序给药。
实施例
实施例1：新抗原与鳜鱼恒定链或其片段的融合在类人猿腺病毒疫苗接种的情况下产生免疫原性
所选的癌症特异性新抗原由5个非同义单核苷酸变体(SNV)生成，这是在肿瘤中发现的最常见的突变类型。每个癌症特异性新抗原的氨基酸序列的突变氨基酸位于其中心，在上游和下游侧接12个野生型(wt)氨基酸，全长为25个氨基酸(表1)。新抗原序列首尾相连，形成人工抗原。
编码前面是衍生自CT26鼠类肿瘤的甲硫氨酸起始子的含有5种癌症特异性新抗原(表1)的pentatope(Penta：SEQ ID NO：25)的类人猿腺病毒载体(GAd)无法诱导针对癌症特异性新抗原的免疫应答(图1)，除非将鳜鱼恒定链(INV)序列(MF_INV_FL：SEQ ID NO：26)、或包括跨膜结构域的包含残基1至81的截短版本的鳜鱼INV(MF_INV_SH，SEQ ID NO：27)、或前面是甲硫氨酸起始子的鳜鱼INV序列的片段(MF_INV_A：SEQ ID NO：28；MF_INV_B：SEQ IDNO：29)放置在pentatope的N末端。在所有构建体中，将用于监测表达的HA肽序列(SEQ IDNO：30)融合在pentatope的下游。
对于每种疫苗构建体，以5x108个或5x107个GAd病毒颗粒(vp)的剂量进行一次肌内免疫后，对BalBC近交小鼠的免疫力进行评估。免疫后三周收集脾细胞，并通过在对应于5种癌症特异性新抗原的每种的25聚体合成肽库的存在下刺激细胞，通过IFN-γ ELISpot进行测试。对脾脏的单细胞悬液进行IFN-γ ELISpot测定。MSIP S4510平板(Millipore，Billerica，MA)包被有10μg/ml的抗小鼠IFN-γ抗体(U-CyTech Utrecht，荷兰)，并在4℃下孵育过夜。洗涤并封闭后，将小鼠脾细胞以两种不同的密度(每孔1×106和5×105个细胞)一式两份铺板，并用终浓度为1μg/ml的包含5种25聚体肽的肽库刺激过夜。肽稀释剂二甲基亚砜(Sigma-Aldrich，米兰，意大利)用作阴性对照。通过随后用生物素化抗小鼠IFN-γ抗体(U-CyTech Utrecht，荷兰)、结合的链霉抗生物素蛋白-碱性磷酸酶(BD Biosciences，圣何塞，CA)孵育，最后用5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸酯/硝基蓝四唑
Figure BPA0000288288260000231
1步溶液(Thermo FisherScientific，Rockford，IL)孵育，而将板显色。使用自动酶联免疫斑点(ELISA-spot)技术视频分析系统自动板读取器分析板。ELISpot数据表示为每百万个脾细胞的IFN-γ SFC。
免疫应答(每百万个脾细胞产生IFN-γ的T细胞数)如图1所示。如果(i)抗原孔的平均值大于20个斑点形成菌落SFC/106PBMC，并且(ii)大于用肽稀释剂DMSO孵育的孔的背景值的3倍，则认为应答为阳性。如图1所示，在以5x108vp的剂量进行疫苗接种的动物中，接种MF_INV_FL或MF_INV_A的动物中鳜鱼INV或其片段的添加使非免疫原性Penta抗原转化为具有100％应答率的免疫原性抗原。特别是用含有短片段MF_INV_A或MF_INV_B的构建体以5x108vp进行疫苗接种所诱导的免疫原性，其水平与包含全长鳜鱼INV(MF_INV_FL)或包括跨膜结构域的包含残基1至81的鳜鱼INV的截短版本(MF_INV_SH)所观察到的水平相当。5x107vp的疫苗接种(图1)可以区分不同的T细胞增强剂的效能，其中含有短片段MF_INV_A的构建体是唯一能够在100％的小鼠中拯救免疫原性的构建体，其水平与在包含全长鳜鱼INV(MF_INV_FL)的构建体中观察到的相当。
包括跨膜结构域的包含残基1至81的截短版本鳜鱼INV(MF_INV_SH)反而劣于MF_INV_A，并且仅能在6只小鼠中的1只中以较低剂量诱导免疫应答。
表1
Penta抗原：penta抗原的组成。CT26新抗原以所示顺序存在于组装的Penta抗原中。每种新抗原的突变氨基酸以粗体并加下划线显示。
Figure BPA0000288288260000241
实施例2：
然后使用含有来自CT26鼠模型的大量(20)新抗原的新型人造抗原，进一步测试鳜鱼恒定链片段MF_INV_A(SEQ ID NO：7)增强疫苗诱导的免疫应答的能力。来自实施例1的构建体MF_INV_A中存在的所有五种新抗原(表1)都包括在新型抗原中，但是与MF_INV_A相比顺序不同(表2)。制备分别编码按照表2的顺序头尾连接在一起的相同的20种新抗原的两种GAd载体：在抗原之前仅包含甲硫氨酸起始子的构建体CT26-20(SEQ ID NO：49)，前面是甲硫氨酸起始子的鳜鱼恒定链FRAG_A(SEQ ID NO：7)置于抗原N末端的构建体MF_INV_A-20(SEQ ID NO：50)。在两种构建体中，为了监测表达，将HA肽序列(SEQ ID NO：30)融合在抗原的下游。
在以5x107个病毒颗粒(vp)的剂量进行一次肌内免疫后，对BalBC近交小鼠体内的免疫应答进行了评估(每组n＝6)。免疫两周后收集脾细胞，并通过IFNγ ELISpot在对应于编码新抗原序列的20种合成肽库的存在下刺激细胞来进行测试。如前面观察到的，对于小pentatope抗原，鳜鱼恒定链FRAG_A(SEQ ID NO：7)的存在强烈增强了疫苗接种后的T细胞应答(图3)，与所编码的新抗原的顺序和总数无关。
表2
构建体CT26-20和MF_INV_A-20的抗原组成：鉴别存在于组装的CT26-20和MF_INV_A-20抗原中的20种CT26新抗原。新抗原以所示顺序存在于抗原中。每种新抗原的突变氨基酸以粗体和加下划线显示。SEQ ID NO：20至24对应于pentatope中存在的五种新抗原(参见表1)。
Figure BPA0000288288260000251
Figure IPA0000288288220000011
Figure IPA0000288288220000021
Figure IPA0000288288220000031
Figure IPA0000288288220000041
Figure IPA0000288288220000051
Figure IPA0000288288220000061
Figure IPA0000288288220000071
Figure IPA0000288288220000081
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Figure IPA0000288288220000101
Figure IPA0000288288220000111
Figure IPA0000288288220000121
Figure IPA0000288288220000131
Figure IPA0000288288220000141
Figure IPA0000288288220000151
Figure IPA0000288288220000161
Figure IPA0000288288220000171
Figure IPA0000288288220000181
Figure IPA0000288288220000191
Figure IPA0000288288220000201
Figure IPA0000288288220000211
Figure IPA0000288288220000221
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Figure IPA0000288288220000251
Figure IPA0000288288220000261
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Figure IPA0000288288220000281
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Figure IPA0000288288220000301
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Figure IPA0000288288220000321
Figure IPA0000288288220000331

Claims (15)

1.一种多肽，其包含：
(a)真骨鱼类恒定链(INV)的片段和任选的一种或多于一种抗原和/或其一种或多于一种抗原片段，该恒定链的片段包含或组成为真骨鱼类INV的膜近端结构域(MPD)的16个至27个氨基酸，其中MPD的特征在于以下氨基酸序列(SEQ ID NO：31)：
X1QKX2QIHTLQKX3SX4RX5X6X7QX8TRX9SX10AV
其中
X1是G、D、S或N；
X2是E或Q；
X3是N或S；
X4是D或E；
X5是M或L；
X6是G、N、S或T；
X7是K或R；
X8是L或M；
X9是S、T或A；和
X10是Q或H；
其中MPD的16个至27个氨基酸优选与SEQ ID NO：7至少70％相同；
或
(b)具有T细胞应答增强剂活性的全长真骨鱼类INV SEQ ID NO：1或其变体以及一种或多于一种抗原和/或其一种或多于一种抗原片段，其中所述变体的MPD的氨基酸序列与SEQID NO：7至少80％相同。
2.根据权利要求1所述的多肽，其中：
(a)根据权利要求1的替代方案(a)的MPD的氨基酸序列是SEQ ID NO：7至12中的任一个；或
(b)根据权利要求1的替代方案(a)的片段的氨基酸序列包含或组成为SEQ ID NO：7至18中的任一个；或
(c)根据权利要求1的替代方案(b)的真骨鱼类恒定链的氨基酸序列是SEQ ID NO：1至6中的任一个。
3.根据权利要求1(a)或权利要求2替代方案(a)或(b)所述的多肽，其中所述片段组成为MPD的至少16个至27个N末端氨基酸和：
(i)紧接在MPD N末端的真骨鱼类INV的跨膜结构域(TMD)的1个至26个连续氨基酸，其中真骨鱼类INV的TMD的特征优选在于以下氨基酸序列(SEQ ID NO：32)：
AY1KY2AY3LTTLY4CLLY5Y6SQVFTAYY7VF
其中
Y1是L或F；
Y2是I或V；
Y3是G或A；
Y4是T或A；
Y5是L或V；
Y6是A或S；和
Y7是M或T；
和/或
(ii)紧接在MPD C末端的真骨鱼类INV的1个至19个连续氨基酸，其特征优选在于以下氨基酸序列(SEQ ID NO：33)：
APZ1Z2MZ3Z4PMZ5SLPZ6Z7Z8DZ9Z10
其中
Z1是M、V或A；
Z2是R或K；
Z3是H、A或Q；
Z4是M或L；
Z5是N或S；
Z6是M或L；
Z7是M、L或V；
Z8是M或S；
Z9是F或Y；和
Z10是T或S。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的多肽，其中在每种情况下，所述抗原独立地选自癌症特异性抗原、癌症特异性新抗原或病毒蛋白、细菌蛋白，其中优选地：
(i)所述多肽包含至少五种不同的抗原和/或其抗原片段；
和/或
(ii)一种或多于一种抗原和/或其一种或多于一种抗原片段在根据权利要求1的替代方案(a)的INV片段的C末端或在根据权利要求1的替代方案(b)的全长INV的的C末端。
5.一种编码根据权利要求1至4中任一项所述的多肽的多核苷酸，其中所述多核苷酸优选为DNA或RNA，更优选为DNA。
6.一种载体，其包含根据权利要求5所述的多核苷酸。
7.两种或多于两种不同载体的集合，其中所述不同载体各自包含根据权利要求5所述的多核苷酸，该多核苷酸编码根据权利要求1至4的不同多肽。
8.根据权利要求9所述的载体或根据权利要求10所述的载体的集合，其中所述载体在每种情况下独立地选自质粒；黏粒；脂质体颗粒；病毒载体或病毒样颗粒；优选α病毒载体、委内瑞拉马脑炎(VEE)病毒载体、辛德毕斯(SIN)病毒载体、森林脑炎病毒(SFV)病毒载体、猿猴或人巨细胞病毒(CMV)载体、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、痘病毒载体、牛痘病毒载体、或经修饰的牛痘安卡拉(MVA)载体，其中所述腺病毒载体优选是类人猿腺病毒载体，更优选是黑猩猩或倭黑猩猩或大猩猩腺病毒载体。
9.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至4中任一项所述的多肽、根据权利要求5所述的多核苷酸或根据权利要求6至8所述的载体，药学上可接受的赋形剂和任选的一种或多于一种佐剂。
10.根据权利要求9所述的药物组合物，其包含至少一种免疫调节剂、或至少一种编码免疫调节剂的多核苷酸、或包含编码免疫调节剂的多核苷酸的载体或脂质体颗粒。
11.一种试剂盒套装，其包含权利要求9的药物组合物，以及分别包装的至少一种免疫调节剂、或至少一种编码免疫调节剂的多核苷酸、或包含编码免疫调节剂的多核苷酸的载体。
12.根据权利要求10所述的药物组合物或根据权利要求11所述的试剂盒套装，其中：
(i)免疫调节剂是MCM，并且选自：
(a)肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族成员的激动剂，优选CD27、CD40(例如CP-870，893)、OX40、GITR或CD137的激动剂；和/或
(b)PD-1、CD274、A2AR、B7-H3(例如MGA271)、B7-H4、BTLA、CTLA-4、IDO、KIR、LAG3、TIM-3或VISTA的拮抗剂或B7-CD28超家族成员的拮抗剂，优选为CD28或ICOS的拮抗剂或其配体的拮抗剂；
和/或
(ii)免疫调节剂是T细胞生长因子，优选IL-2、IL-12或IL-15。
13.根据权利要求1至4所述的多肽、根据权利要求5所述的多核苷酸、根据权利要求6至8所述的载体或载体的集合、或根据权利要求9至12所述的药物组合物或包含此类药物组合物的试剂盒，其用于预防或治疗增生性疾病，优选癌症、病毒性疾病、真菌性疾病或细菌性疾病。
14.根据权利要求1至4所述的多肽、根据权利要求5所述的多核苷酸、根据权利要求6至8所述的载体或载体的集合、或根据权利要求9至12所述的药物组合物或包含此类药物组合物的试剂盒，其中癌症选自：唇、口腔、咽、消化器官、呼吸器官、胸腔内器官、骨骼、关节软骨、皮肤、间皮组织、软组织、乳房、女性生殖器官、男性生殖器官、泌尿道、大脑和中枢神经系统的其他部位、甲状腺、内分泌腺、淋巴组织和造血组织的恶性肿瘤。
15.根据权利要求1至4所述的多肽、根据权利要求5所述的多核苷酸、根据权利要求6至8所述的载体或载体的集合、或根据权利要求9至12所述的药物组合物或包含此类药物组合物的试剂盒，其中在施用根据权利要求1至4所述的多肽、根据权利要求5所述的多核苷酸、根据权利要求6至8所述的载体或载体的集合、或根据权利要求9至12所述的药物组合物或包含此类药物组合物的试剂盒之前、同时或之后，施用至少一种免疫调节剂或至少一种编码免疫调节剂的多核苷酸、或包含编码免疫调节剂的多核苷酸的载体或脂质体颗粒。
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