ES2271940T3 - Secuencias nucleotidicas que codifican regiones variables de cadenas alfa de los receptores de linfocitos humanos asi como sus aplicaciones. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A NUEVAS SECUENCIAS NUCLEOTIDICAS QUE CODIFICAN REGIONES VARIABLES DE CADENAS ALFA DE LOS RECEPTORES DE LOS LINFOCITOS T HUMANOS, A LOS SEGMENTOS PEPTIDICOS CORRESPONDIENTES Y A LAS APLICACIONES DE DIAGNOSTICO Y DE TERAPIA.

Description

Secuencias nucleotídicas que codifican regiones variables de cadenas alfa de los receptores de linfocitos humanos así como sus aplicaciones.

La presente invención se refiere a una secuencia nucleotídica nueva que codifica una región variable de la cadena \alpha de los receptores de las células T, al segmento peptídico correspondiente y a las aplicaciones diagnósticas y terapéuticas.

Se sabe que los receptores que reconocen los antígenos en la superficie de los linfocitos T maduros (denominados de aquí en adelante receptores de las células T) poseen una estructura que tiene una cierta analogía con los de las inmunoglobulinas. Así, comprenden estructuras heterodiméricas que comprenden cadenas glicoproteicas \alpha y \beta o cadenas glicoproteicas \gamma y \delta (véanse Meuer et al. (1), Moingeon et al. (2), Brenner et al. (3), Bank et al. (4)).

El conjunto de los receptores de las células T debe poder hacer frente a la inmensa diversidad de determinantes antigénicos. Esto se obtiene por recombinación genética de los diferentes segmentos discontinuos de los genes que codifican las diferentes regiones estructurales de los receptores de las células T. Así, los genes comprenden los segmentos V (segmentos variables), opcionalmente los segmentos D (segmentos de diversidad), los segmentos J (segmentos de unión) y los segmentos C (segmentos constantes). Durante la diferenciación de las células T, los genes específicos se crean por recombinación de los segmentos V, D y J para los locus \beta y \delta y los segmentos V y J para los locus \alpha y \gamma. Estas combinaciones específicas así como el emparejamiento de dos cadenas crean la diversidad combinatoria. Esta diversidad se amplifica mucho mediante dos mecanismos adicionales, a saber, la unión imprecisa de los segmentos V-D-J o V-J y la adición de nucleótidos correspondientes a la región N (Davis et al. (5)).

Actualmente se conoce un determinado número de segmentos génicos V. Estos segmentos se han agrupado en sub-familias en función de la similitud de las secuencias. Por definición, los segmentos que presentan más del 75% de similitud en la secuencia nucleotídica se han considerado como miembros de la misma sub-familia (Crews et al. 6)). Así, los segmentos génicos V\alpha conocidos se han clasificado en 22 sub-familias de las que 14 tienen un solo miembro (véanse Concannon et al. (7), Kimura et al. (8), Wilson et al. (9)).

Por otro lado, se han descrito aproximadamente 60 segmentos génicos J\alpha (9).

Por otro lado, hemos descrito recientemente en el documento WO 90/06758 anticuerpos monoclonales dirigidos frente a segmentos específicos de las partes variables de los receptores de las células T, principalmente de las cadenas \beta y \delta. Estos anticuerpos monoclonales son útiles no solamente como herramientas de diagnóstico sino también como herramientas terapéuticas, por ejemplo frente a la artritis reumatoide.

También hemos descrito la utilización de péptidos sintéticos correspondientes a las regiones variables de las cadenas \alpha o \beta en el tratamiento de enfermedades auto-inmunes (23 y 24).

Se sabe, por otro lado, que existen variaciones de un individuo a otro en la expresión de los diferentes segmentos variables del receptor T en el ser humano (27 y 28).

La presente invención pretende enriquecer el conjunto de los segmentos génicos que codifican las regiones variables de las cadenas en los receptores de las células T proporcionando un segmento génico nuevo V\alpha.

La presente invención tiene así por objeto una secuencia nucleotídica que codifica una región variable de la cadena \alpha de los receptores de los linfocitos T humanos, correspondiente al ADNc que comprende la secuencia nucleotídica del segmento V\alpha que corresponde a 20 SEQ ID N° 1 y las secuencias que difieren en uno o varios nucleótidos.

La presente invención también tiene más especialmente por objeto:

-

Una secuencia nucleotídica que codifica una región variable de la cadena \alpha de los receptores de los linfocitos T humanos correspondiente al ADNc correspondiente a toda o parte de la secuencia nucleotídica del segmento V\alpha que corresponde a la secuencia 1 a 200 de SEQ ID N° 1.

Por la expresión "secuencias nucleotídicas correspondientes a los ADNc correspondientes a toda o parte de las secuencias nucleotídicas", se designan también tanto las secuencias completas como los fragmentos de estas secuencias incluidos los fragmentos cortos (oligonucleótidos) que encuentran aplicación como sondas (que comprenden generalmente al menos 10 nucleótidos) o como cebador (que comprende generalmente al menos 15 nucleótidos). De manera general, la invención engloba el conjunto de oligonucleótidos nuevos que son fragmentos de la secuencia V\alpha según la invención.

En relación a las secuencias que difieren en uno o dos nucleótidos, éstas se corresponden con las variaciones observadas experimentalmente durante la determinación de la secuencia nucleotídica de varios ADNc.

La presente invención también tiene por objeto los péptidos codificados por las secuencias nucleotídicas según la invención así como los alelos y los derivados de éstas que poseen la misma función.

De manera general, la presente invención engloba los péptidos constituidos por o que comprenden una secuencia peptídica codificada por las secuencias nucleotídicas según la invención así como los fragmentos de estos péptidos. También engloba los péptidos que difieren de éstos en uno o varios aminoácidos y que poseen la misma función. Estos péptidos pueden corresponder a modificaciones tales como las conocidas con las muteínas o a variaciones alélicas. En efecto, se ha mostrado en particular que determinados segmentos génicos que codifican las regiones variables de las cadenas del receptor T en el ser humano estaban sometidos a un fenómeno de polimorfismo genético denominado variación alélica (25). La presente invención engloba los péptidos que provienen de este fenómeno.

La secuencia nucleotídica según la invención se obtuvo según las etapas siguientes:

-

aislamiento de los ARN de linfocitos periféricos de un individuo;

-

obtención del ADN complementario mediante la transcriptasa inversa y un cebador A específico de la región C\alpha (SEQ ID N° 21);

-

amplificación génica (mediante Reacción en Cadena de la Polimerasa Anclada o A-PCR) mediante una ADN polimerasa, un cebador poli C (SEQ ID N° 22) y un cebador B específico de la región C\alpha (SEQ ID N° 23);

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nueva amplificación mediante A-PCR mediante ADN polimerasa y un cebador C específico de la región C\alpha (SEQ ID N° 24);

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inserción en un vector plasmídico;

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transformación de un anfitrión bacteriano con el vector recombinante;

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cribado de las colonias bacterianas recombinantes con un oligonucleótido D específico de C\alpha (SEQ ID N° 25) marcado;

-

extracción de los plásmidos de las colonias positivas,

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y secuenciación de los fragmentos de ADN que contienen la región C\alpha.

La presente invención puede reproducirse principalmente por amplificación génica biespecífica (reacción en cadena de la polimerasa o PCR) partiendo de linfocitos periféricos que expresan ARNm que incluyen el segmento variable correspondiente a la secuencia ID N° 1 de la invención o alternativamente aplicando esta técnica de PCR al ADN genómico de cualquier célula somática de un individuo en riesgo. La invención también puede reproducirse preparando las secuencias génicas anteriores mediante síntesis química de los oligonucleótidos.

Los péptidos según la invención pueden obtenerse mediante síntesis peptídica clásica. También pueden obtenerse mediante la aplicación de técnicas conocidas de ingeniería genética que comprenden la inserción de una secuencia de ADN que codifica un péptido según la invención en un vector de expresión tal como un plásmido y la transformación de células con este vector de expresión.

La presente invención también tiene, por lo tanto, por objeto los plásmidos y los vectores de expresión que comprenden una secuencia de ADN que codifica un péptido según la invención así como los anfitriones transformados con este vector.

La presente invención también tiene por objeto los anticuerpos, y principalmente los anticuerpos monoclonales, dirigidos frente a un determinante antigénico que pertenece a o que comprende un péptido según la invención.

Los anticuerpos monoclonales pueden obtenerse mediante todas las técnicas que permiten la producción de moléculas de anticuerpos a partir del cultivo de líneas celulares. Estas técnicas comprenden las diferentes técnicas que utilizan hibridomas.

La producción de anticuerpos puede obtenerse en el animal mediante inmunización de los animales por inyección de los péptidos o de los fragmentos según la invención, sean naturales, recombinantes o sintéticos, opcionalmente después de acoplamiento con un agente inmunógeno tal como la anatoxina tetánica, o por inyección de linfocitos T humanos que expresan las secuencias correspondientes en su superficie, incluidas las células recombinantes transfectadas con las secuencias codificadoras correspondientes.

La presente invención también tiene por objeto los hibridomas que producen anticuerpos monoclonales dirigidos frente a los polipéptidos según la invención.

La presente invención también engloba los fragmentos y los derivados de los anticuerpos monoclonales según la invención que son reactivos con las regiones variables definidas de los receptores de las células T. Estos fragmentos son principalmente los fragmentos F(ab')2 que pueden obtenerse por degradación enzimática de las moléculas de anticuerpos con pepsina, los fragmentos Fab' que pueden obtenerse por reducción de los puentes disulfuro de los fragmentos F(ab')2 y los fragmentos Fab que pueden obtenerse por degradación enzimática de las moléculas de anticuerpos con papaína en presencia de un agente reductor. Estos fragmentos también pueden obtenerse por ingeniería genética.

Los derivados de los anticuerpos monoclonales son por ejemplo los anticuerpos o los fragmentos de estos anticuerpos a los que están unidos marcadores tal como un radioisótopo. Los derivados de los anticuerpos monoclonales también son los anticuerpos o los fragmentos de estos anticuerpos a los que están unidos moléculas activas desde un punto de vista terapéutico, principalmente compuestos citotóxicos.

Los productos de la invención encuentran varios tipos de aplicaciones en el campo del diagnóstico y en el campo de la terapéutica.

1 - Aplicaciones en el campo del diagnóstico

Los oligonucleótidos contenidos en las secuencias nucleotídicas según la invención pueden utilizarse para constituir sondas de detección (generalmente al menos 10 nucleótidos) capaces de hibridarse a una región variable de la cadena \alpha o cebadores para la amplificación de ADN (que comprenden generalmente al menos 15 nucleótidos y preferentemente al menos 17 nucleótidos) capaces de unirse a una secuencia que se quiere amplificar.

Así, los oligonucleótidos encuentran una aplicación en el diagnóstico de los trastornos inmunitarios detectando la presencia de secuencias de ácidos nucleicos homólogas de un gen que codifica las regiones variables de las cadenas \alpha de los receptores de las células T en el ARNm de una muestra de un paciente. Pueden utilizarse diferentes métodos para establecer un vínculo entre la expresión de los genes de las células T y una enfermedad. Estos métodos compren-
den:

a-

producción y análisis de bancos de expresión de ADN obtenidos a partir de células T ligadas a la enfermedad para determinar la frecuencia de genes dominantes;

b-

análisis de muestras de ADN genómico mediante transferencia Southern para determinar si existen polimorfismos genéticos o reordenaciones de los genes que codifican los receptores de las células T;

c-

análisis de muestras mediante la obtención de ADNc, amplificación por PCR e hibridación con sondas marcadas;

d-

hibridación in situ de células T sin cultivo previo de las células T.

Los cebadores encuentran una aplicación en las reacciones de PCR en un método tal como el definido anteriormente.

Los anticuerpos monoclonales, los fragmentos o los derivados de estos anticuerpos según la invención, principalmente los anticuerpos anti V\alpha, pueden utilizarse para estudiar las respuestas inmunitarias de tipo T, por ejemplo en el campo de las enfermedades auto-inmunes, de la cancerología, de la alergia, del transplante y de las enfermedades infecciosas. En particular, puede estudiarse el conjunto de los diferentes segmentos variables del receptor T, ya se trate de células T sanguíneas o tisulares. De manera general, las técnicas utilizadas pueden ser métodos in vitro o in vivo.

En los métodos in vitro, las muestras utilizadas pueden ser muestras de líquidos corporales o muestras de tejidos. Las técnicas utilizadas pueden incluir principalmente la citofluorometría de flujo para analizar los linfocitos T de la sangre o marcajes con inmunoperoxidasa en cortes anatomopatológicos para estudiar los linfocitos que infiltran los tejidos.

En los métodos in vivo, los anticuerpos, sus fragmentos o sus derivados se administran por las vías habituales, por ejemplo por vía intravenosa, y se detectan las uniones inmunoespecíficas. Esto puede obtenerse, por ejemplo, en el caso en el que se utiliza un anticuerpo marcado con un radioisótopo.

2 - Aplicaciones en el campo terapéutico

Los oligonucleótidos contenidos en las secuencias nucleotídicas según la invención pueden utilizarse en terapéutica como oligonucleótidos antisentido. En efecto, se sabe que es posible inhibir in vitro la expresión de un gen transcrito en linfocitos humanos incubando estos linfocitos con un oligonucleótido antisentido específico del gen en cuestión (26). Estos oligonucleótidos antisentido comprenden generalmente al menos 10 y, preferentemente, al menos 16 nucleótidos. Estos oligonucleótidos antisentido pueden ser principalmente las secuencias inversas y complementarias correspondientes a los 20 nucleótidos en posición 5' respecto al sitio de inicio de la traducción (ATG). El interés de una utilización in vitro de los oligonucleótidos antisentido específicos de un segmento génico V\alpha es abolir (o disminuir mucho) la expresión de un receptor T que comprende este segmento V\alpha y, por lo tanto, obtener un fenómeno de deleción clonal a nivel de la reactividad específica de los linfocitos T. Los oligonucleótidos antisentido pueden utilizarse no sólo in vitro en los linfocitos T humanos que se vuelven a inyectar, sino también in vivo por inyección local o sistémica preferentemente después de modificaciones para incrementar la estabilidad in vivo y la penetración en el interior de los linfocitos T de estos oligonucleótidos.

Los anticuerpos monoclonales según la invención, principalmente los anticuerpos anti V\alpha, pueden utilizarse para modular el sistema inmunitario. Así, los anticuerpos pueden administrarse para bloquear la interacción de las células T efectoras con su antígeno específico. También pueden administrarse anticuerpos anti-receptores T unidos, por ejemplo, a una molécula citotóxica o a un radioisótopo de manera que se obtenga una deleción clonal, gracias a la fijación específica en una cadena \alpha de un receptor de la célula T. Los anticuerpos monoclonales según la invención pueden utilizarse en terapéutica a concentraciones poco mitogénicas de manera que se activen de manera específica determinados sub-conjuntos de células T o pueden utilizarse a concentraciones mucho más elevadas para fijarse a los receptores referidos y marcar así estos sub-conjuntos en vista de su eliminación por el sistema retículo-endotelial. Un criterio importante para el tratamiento de una enfermedad es la aptitud de modular los sub-conjuntos de células T ligados a una enfermedad. La naturaleza exacta de esta modulación terapéutica, a saber, bloquear o suprimir un sub-conjunto particular de células T o al contrario estimular y activar un sub-conjunto particular, dependerá de la enfermedad en cuestión y del sub-conjunto específico de células T referido.

Este tipo de tratamiento presenta una ventaja respecto a los tratamientos actuales que utilizan anticuerpos tales como el tratamiento con anticuerpos anti CD3 en pacientes que se han sometido a un transplante renal y que tienen un problema de rechazo, que se debe a que gracias a la invención no existirá la modulación de la totalidad de la población de las células T sino solamente del sub-conjunto de células T que expresan la sub-familia \alpha particular de receptores de células T.

Por otro lado, la respuesta de las células T es frecuentemente oligoclonal, por lo que conviene generalmente utilizar en terapéutica "mezclas" de varios anticuerpos.

Se pueden utilizar además anticuerpos anti V\alpha para seleccionar in vitro los linfocitos T, por ejemplo, pasándolos por una columna que contiene bolas que tienen los anticuerpos. Esta separación de determinados linfocitos T puede utilizarse en vista de cultivar estos linfocitos antes de reinyectarlos al paciente.

Además, se puede utilizar en terapéutica toda o parte de las secuencias peptídicas según la invención, es decir, las secuencias peptídicas codificadas por las secuencias nucleotídicas según la invención o los fragmentos de estas secuencias (que comprenden generalmente al menos 8 a 10 aminoácidos). Estas secuencias o estos fragmentos, administrados al ser humano o a un animal, pueden comportarse como un cebo, es decir, que se fijarán al epítopo que contiene el antígeno perjudicial e impedirán la reacción de las células T normales con el antígeno, impidiendo así el desarrollo de una enfermedad agresiva contra los determinantes propios. También pueden utilizarse como inmunógenos en la fabricación de vacunas (opcionalmente después de acoplarse a transportadores proteicos).

A continuación se describirá la presente invención más detalladamente, en referencia a las Fig. adjuntas en las que:

- las Fig. 1 A a E proporcionan de manera alineada a la vez una secuencia V\alpha conocida y una secuencia parcial de una extensión según la invención para las secuencias respectivas SEQ ID N° 6 a 10, denominadas IGRa 08 a IGRa 12. En estas Figuras, la numeración de los nucleótidos comienza en el codón ATG de iniciación (que está subrayado). Los puntos indican los nucleótidos idénticos. Las secuencias que se supone son las secuencias líder están remarcadas.

- La Fig. 2 proporciona alineadas las secuencias nuevas J\alpha (SEQ ID N° 12, 13 y 15 a 20) denominadas IGRJa 01, 02 y 04 a 09. En estas secuencias las señales de recombinación de la línea germinal están subrayadas. Los aminoácidos correspondientes a los codones altamente conservados están marcados por encima de las secuencias. Los codones correspondientes a una sustitución en una posición de un aminoácido conservado están doblemente subrayados.

- La Fig. 3 proporciona los análisis por transferencia Southern del ADN genómico tratado con una enzima de restricción utilizando sondas específicas de las secuencias SEQ ID N° 1 a 5. Las enzimas de restricción utilizadas son EcoRI (columna R), Hind III (columna H) y Bam III (columna B). En esta Figura, los triángulos marcan la posición de los fragmentos de ADN que hibridan de manera específica con C\alpha.

- La Fig. 4 representa la detección por autorradiografía de los transcritos amplificados de las cadenas \alpha de TCR expresado por los linfocitos periféricos de un individuo sano y del control \beta-actina, co-amplificado.

I - Obtención del ADNc y amplificación por PCR

Se utilizó como fuente de ARN los linfocitos periféricos de un individuo. El ARN total se preparó según el método del isotiocianato de guanidinio y cloruro de cesio (Chirgwin (10)) o según el método en una sola etapa por extracción con isotiocianato de guanidinio, fenol y cloroformo (Chomczynski (11)).

La primera hebra de ADNc se sintetizó en un volumen final de 50 microlitros a una temperatura de 42°C durante 1 hora utilizando 5 microgramos de ARN total, transcriptasa inversa y un cebador A específico de la región C\alpha constituido por la secuencia 5'-GTTGCTCCAGGCCACAGCACTG (SEQ ID N° 21). Este material se purificó a continuación por extracción con fenol/cloroformo y precipitación con acetato de amonio. Después de seleccionar una fracción 0,45/1 kb en gel de agarosa, se realizó la adición de un extremo dG en el hetero dúplex ARN/ADNc en un tampón de adición CoCl2 con 14 unidades de desoxinucleotidil transferasa terminal (Tdt) durante 30 mn a 37ºC. La reacción se paró manteniendo a 70ºC durante 10 mn. Se añadió NaOH 1N (1/3 de volumen) y la muestra se incubó a 50ºC durante 1 hora para hidrolizar el ARN y se neutralizó con Tris HCl 2M pH 8 y HCl 1N. Después de extraer con una mezcla fenol/cloroformo la primera hebra de ADNc con extremo G se precipitó con etanol y se sometió a una amplificación utilizando la técnica PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa descrita por Saiki et al. (12)) en un volumen final de 100 microlitros que contiene 50 mM de KCl, 10 mM de Tris-Cl pH 8,3, 1,5 mM de MgCl2, 0,1% (peso/ volumen) de gelatina, 200 micromoles de dNTP, 2,5 unidades de Taq polimerasa y 100 picomoles de dos cebadores. Los dos cebadores utilizados son, por una parte, un cebador poli-C (5'-GCATGCGCGCGG CCGCG
GAGG-14C) (SEQ ID N° 22) descrito por Loh et al. (13) así como un cebador B específico de la región C\alpha (5'-GTCCATAGACCTC ATGTCCAGCACAG) (SEQ ID N° 23).

Se realizan 25 ciclos de amplificación seguidos de un periodo de 15 mn de elongación final a 72ºC. Cada ciclo comprende una etapa de desnaturalización a 92ºC durante 1 minuto, una etapa de hibridación a 55ºC durante 2 mn y un periodo de elongación a 72ºC durante 4 mn. Los productos amplificados se precipitan a continuación con etanol, se vuelven a poner en suspensión en acetato de sodio 30 mM pH5, NaCl 50 mM, ZnC12 1 mM, glicerol 5% en volumen y 1/10 de este material se purifica en función del tamaño en un gel de agarosa con bajo punto de fusión 1%.

Una segunda fase de amplificación se realiza a continuación directamente sobre aproximadamente el 10% de la banda que contiene la agarosa siguiendo las mismas condiciones anteriores, excepto en que se utiliza como cebador C específico de la región C\alpha el cebador 5'-ATACACATCAGAATTC TTACTTTG (SEQ ID N° 24). La mezcla de reacción se precipita con etanol y se vuelve a poner en suspensión en 60 \mul de H2O.

II - Clonación y secuenciación de los ADNc

1/3 del producto de la segunda amplificación se digiere con Sac II, se separa en gel de agarosa 1% y se purifica por adsorción en bolas de vidrio. El material se inserta en el vector Bluescript SK+ (Stratagene, La Jolla, EEUU) y los recombinantes obtenidos se utilizan para transformar las cepas XL1-azul de E. Coli (Stratagene). Después de poner en presencia de X-gal e IPTG, se hace un ensayo en las colonias blancas utilizando una técnica "dot blot (hibridación sobre mancha)" y como sonda un tercer oligonucleótido específico de la región C\alpha (5'-GTCACTGG ATTTAGAGTCT) (SEQ ID N° 25) marcado con ^{32}P. Se extrae el ADN plasmídico de las colonias positivas y se secuencia en las dos hebras por el proceso didesoxi de terminación de la cadena (Sanger et al. (14)) con la Secuenasa 2,0 (United States Biochemicals, Cleveland, Estados Unidos) siguiendo las recomendaciones del proveedor. Salvo por la secuencia SEQ ID N° 5, todas las secuencias nucleotídicas se determinaron en las dos hebras utilizando al menos dos clones distintos de ADNc.

Las secuencias obtenidas se compararon con las secuencias publicadas V\alpha y J\alpha utilizando el método desarrollado por Lipman y Pearson (15). Los presuntos codones de inicio se identificaron investigando la presencia de la secuencia consenso Kozak para los sitios de iniciación de las traducciones en las células eucariotas (Kozak (16)). La presencia de secuencias líder hidrófobas del extremo N-terminal se descubrió por análisis de la hidrofobicidad según el método descrito por Kyte (17).

III - Análisis por transferencia Southern

El ADN se extrajo de la línea celular eritroleucémica humana K562 y se digirió con una de las enzimas de restricción siguientes: EcoR I, BamH I o Hind III. El ADN (15 microgramos) se sometió a una electroforesis en agarosa 0,7% y se transfirió a membranas de Nilón como describe Triebel et al. (18). Las hibridaciones se realizaron a 65ºC con 6 x SSC, 0,5% de SDS, 5 x Denhardt y 100 microgramos de ADN de esperma de salmón desnaturalizado durante 16 horas. Las membranas se lavaron a 65ºC con 2 x SSC, 0,2% de SDS.

Se utilizaron como sondas V\alpha específicas las sondas obtenidas por amplificación de ADNc V-J-C (> 500 pb) que comprenden los fragmentos V\alpha correspondientes a las secuencias SEQ ID N° 1 a 5 utilizando como cebador el cebador poli-C y el cebador C. Las sondas se purificaron en gel de agarosa 1%. Las sondas de ADN marcadas con ^{32}P se prepararon a partir de los fragmentos purificados en agarosa por el método de Feinberg (19).

IV - Resultados

Utilizando el método A-PCR, se clonaron y secuenciaron 308 ADNc que hibridan con la sonda C\alpha. Entre éstos, 172 ADNc corresponden a las regiones variables V-J-C\alpha únicas.

Las secuencias V\alpha y J\alpha descritas figuran en la lista de las secuencias respectivamente en las SEQ ID N°1 a 11 y SEQ ID N° 12, 13 y 15 a 20. Las secuencias SEQ ID N° 2 a 5 corresponden a las sub-familias nuevas (denominadas respectivamente V\alpha 25, V\alpha 26, V\alpha 27 y V\alpha 29) mientras que las secuencias SEQ ID N° 1 y 6 a 11 corresponden a las extensiones de segmentos V\alpha conocidos.

1. Secuencias V\alpha correspondientes a las sub-familias nuevas

Los análisis por transferencia Southern del ADN de la línea germinal sometida a una digestión con endonucleasas, utilizando las sondas V-J-C\alpha que comprenden los fragmentos V\alpha correspondientes a las secuencias SEQ ID N° 2 a 5 se realizaron en condiciones de hibridación de "baja astringencia" para identificar el número de segmentos génicos V\alpha que pertenece a cada familia y para caracterizar los fragmentos de restricción del ADN que tienen estos segmentos génicos V\alpha. Los resultados representativos se muestran en la Figura 3.

Estos análisis muestran que la sub-familia correspondiente a la secuencia SEQ ID N° 3 comprende al menos dos segmentos génicos mientras que las otras secuencias (SEQ ID N° 2, N° 4 y N° 5) corresponden probablemente a miembros únicos.

Los tamaños de los fragmentos de restricción del ADN germinal son los siguientes:

SEQ ID N° 2: EcoR I 2,2 kb, Hind III 4,8 y 5,7 kb, BamH I 25 kb

SEQ ID N° 3: EcoR I 4,6 y 7,5 kb, Hind III 4,2 y 6,4 kb, BamH I 23 y 4,5 kb

SEQ ID N° 4: EcoR I 7,6 kb, Hind III 18 kb, BamH I 9 y 0,9 kb

SEQ ID N° 5: ECOR I 5,9 y 4,8 kb, Hind III 6,6 kb, BamH I 6,5 kb.

2. Secuencias correspondientes a las extensiones de secuencias V\alpha conocidas

SEQ ID N° 1 (IGR a 02) corresponde a una extensión del extremo 5' de la secuencia LINV (171 pb) (Mengle-Gaw (20)): Esta secuencia define la sub-familia denominada provisionalmente V\alpha w24.

SEQ ID N° 6 (IGR a 08): Esta secuencia corresponde a una extensión del extremo 5' de la secuencia del clon Va1 AE11 (Klein et al. (21)). Las dos secuencias alineadas están representadas en la Figura 1A.

SEQ ID N° 7 (IGR a 09): Esta secuencia corresponde a una extensión que codifica el extremo NH2 terminal de la secuencia V\alpha2 AF110 (Klein ya citado). Las dos secuencias alineadas están representadas en la Fig. 1B. La secuencia ID N° 7 corresponde a una secuencia consenso. Se observó en posición 206 la existencia de una T en lugar de una
C.

SEQ ID N° 8 (IGR a 010): Esta secuencia corresponde a una extensión de la región 5' del clon V\alpha HAP35 (Yoshikai (22)). Las dos secuencias alineadas están representadas en la Fig. 1C. La secuencia ID N° 8 corresponde a una secuencia consenso. Se observó en posición 307 la existencia de una G en lugar de una A y en posición 360 la existencia de una T en lugar de una C.

SEQ ID N° 9 (IGR a 11): Esta secuencia corresponde a una extensión del extremo 3' de la secuencia V\alpha7 HAP12 (Yoshikai ya citado). La alineación de las secuencias está representada en la Fig. 1D. La secuencia ID N° 9 corresponde a una secuencia consenso. Se observó en posición 86 la existencia de una C en lugar de una T.

SEQ ID N° 10 (IGR a 12): Esta secuencia comprende la región codificadora completa de un gen de la sub-familia V\alpha 22 que anteriormente se identificó por la secuencia parcial (113 pb) AC9 (Klein ya citado). Las dos secuencias alineadas están representadas en la Fig. 1E.

SEQ ID N° 11 (IGR a 13): Esta secuencia corresponde por una parte a los clones HAVT 32 y HAVT 35 (que pertenecen a la sub-familia V\alpha 16 (8) y que se han descrito como pseudogenes. De hecho, como consecuencia de la adición de un nucleótido en posición 108, la SEQ ID N° 11 codifica una región variable original de un receptor de los linfocitos T. Por otro lado, esta secuencia es homóloga a una secuencia HSTCAYM (Klein et al. (21)) en la parte codificadora. Sin embargo, la secuencia SEQ ID N° 11 es la única completa y codificadora.

3. Secuencias J\alpha

En la Fig. 2 se representa el conjunto de secuencias nuevas J\alpha. Entre los 8 segmentos J\alpha, la mayoría de ellos presenta una secuencia de aminoácidos altamente conservada FGXGT de los segmentos J\alpha como describe Yoshikai ya citado. Sin embargo, en el segmento IGRJa 07 el resto treonina está reemplazado por un resto isoleucina.

Además, en el lugar del resto fenilalanina, se encontró un resto cisteína en IGRJa 02G.

La expresión predominante de determinadas sub-familias de V\alpha se ha estudiado ya mediante una gama incompleta de oligonucleótidos. Así, Nitta et al. (29) han descrito la expresión predominante de los genes V\alpha 7 en los linfocitos que infiltran los tumores. Por otro lado, Sottini et al. (30) han descrito en pacientes con artritis reumatoide el estudio del conjunto de V\alpha.

Se describe una gama completa de oligonucleótidos que permite el estudio a la vez de las sub-familias V\alpha conocidas y de las sub-familias V\alpha nuevas y que son totalmente específicos de cada sub-familia. Los oligonucleótidos, por lo tanto, se eligieron y sintetizaron con este objetivo y se introdujeron, según la necesidad, modificaciones en uno o dos nucleótidos respecto a las secuencias naturales para reducir las reactividades cruzadas entre sub-familias.

La presente invención también tiene así por objeto un oligonucleótido, utilizable como cebador para la amplificación del ADN correspondiente a una región variable de la cadena \alpha de los receptores de células T, (de secuencia SEQ ID N° 49).

La presente invención también tiene por objeto la utilización, como cebador para la amplificación del ADN correspondiente a una región variable de la cadena de los receptores de células T, de un oligonucleótido de secuencia SEQ ID N° 49.

La presente invención también tiene por objeto un proceso de detección de secuencias nucleotídicas que codifican los segmentos V\alpha de los receptores T o ADNc correspondientes a los productos de transcripción de éstos, en una muestra biológica, caracterizado porque comprende:

a)

amplificación del ADN con al menos un par de cebadores formado por un oligonucleótido de secuencia SEQ ID N° 49 y un oligonucleótido que pertenece al segmento C\alpha, y

b)

detección de las secuencias amplificadas con una sonda C\alpha.

El oligonucleótido que pertenece al segmento C\alpha utilizado para la amplificación puede elegirse principalmente entre las secuencias SEQ ID N° 55 y 56.

Para controlar la eficacia de la amplificación, se opera ventajosamente en presencia de un par de cebadores control y se detecta la secuencia control correspondiente amplificada mediante una sonda control correspondiente.

Este par de cebadores control puede corresponder a dos segmentos C\beta, por ejemplo los cebadores C\betaF y C\betaK corresponden a las secuencias SEQ ID N° 61 y 62. Se utiliza entonces una sonda de detección C\beta (correspondiente, por ejemplo, a la secuencia SEQ ID N° 63). Este par de cebadores también puede estar constituido por dos cebadores que pertenecen a la \beta-actina, principalmente los correspondientes a las secuencias SEQ ID N° 58 y 59. Se utiliza entonces una sonda de detección correspondiente a una secuencia de la \beta-actina, tal como la secuencia SEQ ID N° 60.

La presente invención también tiene por objeto un kit de diagnóstico para llevar a cabo el proceso definido anteriormente, que comprende:

a)

al menos un oligonucleótido de secuencia SEQ ID N° 49,

b)

un cebador C\alpha,

c)

una sonda C\alpha.

Dicho kit contiene ventajosamente además:

d)

un par de cebadores control,

e)

una sonda control.

En la información proporcionada en la lista de las secuencias para las secuencias 26 a 60, las secuencias SEQ ID N° 26 a 47 corresponden a las secuencias que pertenecen a los clones de sub-familias conocidas Va1 a V\alpha 22 (accesibles en la base de datos EMBL) o a las secuencias que difieren en uno o dos nucleótidos.

Las secuencias SEQ ID N° 49, 50, 51, 52 y 54 correspondientes a las secuencias que pertenecen a los clones de sub-familias nuevas de la invención, corresponden a las sub-familias denominadas provisionalmente V\alpha w24, V\alpha w25, V\alpha w26, V\alpha w27 y V\alpha w29 (indicando w que la designación está a la espera de una designación definitiva).

Las secuencias SEQ ID N° 48 y 53 corresponden a las secuencias que pertenecen a los clones respectivamente IGRa01 y IGRa06 de sub-familias conocidas pero para las que no se ha aprobado la designación definitiva (respectivamente V\alpha w23 y V\alpha w28) en las que un elemento miembro ya se ha descrito (respectivamente Hinkkanen A. et al. (31) y Bernard O. et al. (32)). La secuencia completa de IGRa06 no se ha publicado.

Las secuencias SEQ ID N° 55 y 56 son dos ejemplos de oligonucleótidos que pueden utilizarse como cebadores C\alpha para la amplificación.

La secuencia SEQ ID N° 57 es la secuencia de una sonda C\alpha que puede utilizarse para la detección de los ADN amplificados.

Las secuencias SEQ ID N° 58, 59 y 60 son respectivamente las secuencias de un par de oligonucleótidos que pertenecen a la secuencia de la \beta-actina que pueden utilizarse para el control de la amplificación y la secuencia de una sonda para detectar los ADN amplificados correspondientes.

En la lista de las secuencias, la posición indicada es la posición del extremo 5' a partir del sitio de iniciación predicho de la traducción ATG. En el caso en el que las secuencias están incompletas (región 5' desconocida), la posición (marcada con un asterisco) se proporciona respecto al primer nucleótido de la secuencia. Los nucleótidos subrayados corresponden a los desapareamientos introducidos respecto a la secuencia natural.

Los oligonucleótidos se sintetizaron en un sintetizador de ADN automatizado Applied Biosystems 381 A utilizando el método de la \beta-cianoetilfosforamidita (Sinha et al. (33)) y siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante. Los oligonucleótidos se detritilaron en el equipo, se separaron del soporte y se desprotegieron con amoniaco (a 60ºC durante 5 horas). Los productos brutos se purificaron mediante cromatografía de alta presión en fase inversa en una columna de \mu-bondapak C 18 utilizando un gradiente de acetonitrilo (9 a 15%) en un tampón acetato de trietilamonio 0,01 M a pH 5,5.

La amplificación efectuada utilizando los cebadores según la invención puede ser principalmente la técnica por PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) tal como la descrita por Saiki et al. (12) y las patentes de EEUU-A-4 683 195, 4 683 202, 4 889 818.

Para la PCR, se puede utilizar un ADN de doble hebra que se desnaturaliza o un ADNc obtenido a partir de ARN mediante la transcriptasa inversa como se ha mencionado más arriba.

El agente de polimerización es una ADN polimerasa, principalmente la Taq polimerasa.

Generalmente, el ciclo de amplificación se repite 25 a 40 veces.

Las sondas que se utilizan para la detección de las secuencias amplificadas pueden obtenerse por marcaje de los oligonucleótidos con un isótopo radiactivo, lo que da lugar a una detección por autorradiografía, o por acoplamiento con una enzima tal como la peroxidasa (sistema ECL Amersham), la fosfatasa alcalina o la \beta-galactosidasa (sistema Tropix Ozyme), lo que da lugar a una detección por quimioluminiscencia.

El ejemplo siguiente ilustra la realización del proceso de detección según la invención.

Los linfocitos periféricos de un individuo sano se prepararon por centrifugación en un gradiente de densidad. El ARN total se extrajo según el método en una sola etapa por extracción con isotiocianato de guanidinio, fenol y cloroformo (Chomczynski, 11). El ADN complementario se sintetizó en un volumen final de 20 \mul a 42°C durante 1 hora utilizando 1 a 5 \mug de ARN total, transcriptasa inversa y el cebador C\alpha B (1,25 \muM).

El material obtenido se calentó a 95ºC durante 3 minutos antes de ser sometido a una amplificación según la técnica PCR utilizando en paralelo cada uno de los cebadores V\alpha específicos correspondientes a las secuencias SEQ ID N° 26 a 54 y el cebador C\alpha B específico de la región C\alpha (SEQ ID N° 56). Esta amplificación se realizó en un volumen final de 10 \mul por tubo que contiene 50 mM de KCl, 10 mM de tris-HCl pH 8,3, 1,5 mM de MgCl2 0,1% (peso/volumen) de gelatina, 200 \muM de dNTP, 0,25 unidades de Taq polimerasa y 0,25 \muM de cada cebador. En cada tubo, se realizó una amplificación control a partir de 25 mM de un fragmento de ADN de \beta-actina de 877 pares de bases preparado por PCR y los cebadores Act 1 y Act 2 (SEQ ID N° 58 y 59) específicos de la actina. Se realizaron 30 ciclos de amplificación seguidos de una etapa de elongación final de 5 minutos a 72ºC. Cada ciclo comprendió una etapa de desnaturalización a 94ºC durante 1 minuto, una etapa de hibridación a 65ºC durante 1 minuto y un periodo de elongación a 72ºC durante 1 minuto.

Los productos obtenidos se separaron mediante electroforesis en un gel de agarosa al 2%, se transfirieron a membranas de nilón en un tampón alcalino y se hibridaron simultáneamente con las sondas oligonucleótidos C\alpha C (SEQ ID N° 57) y Act 3 (SEQ ID N° 60) marcadas con 32P con la enzima polinucleotidil T4 quinasa. La hibridación se realizó a 42ºC durante 16 horas en un tampón que contiene 6 x SSC, 0,5% SDS, 5 x Denhart, 0,05% PO4H2Na y 100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado. Las membranas se lavaron con 6 x SSC, 20 mM PO4H2Na, dos veces a temperatura ambiente durante 5 minutos y una vez a 50ºC durante 30 minutos y se sometieron a autorradiografía.

Los resultados se muestran en la figura 4.

El control de actina (banda de 877 pares de bases) permite verificar la amplificación en todos los pocillos. Debajo de esta banda aparece una señal específica cuyo tamaño corresponde al tamaño de los fragmentos amplificados correspondientes, teniendo cada fragmento una longitud correspondiente a la distancia entre la localización del oligonucleótido específico V\alpha y el cebador C\alpha.

En el individuo ensayado, la Figura 4 evidencia la expresión preferente de determinados segmentos génicos definidos respecto a los demás. Por ejemplo, las sub-familias V\alpha 27, 28 y 29 están menos representadas que las sub-familias V\alpha 2, 3 y 6.

Referencias

1. Meuer, S.C., et al., J. Exp. Med. 1983. 157:705.

2. Moingeon, P., et al., Nature 1986a. 323:638.

3. Brenner, M.B., et al., Nature 1986. 322:145.

4. Bank, I., et al., Nature 1986. 322:179.

5. Davis, M.M., et al., Nature 1988. 334:395.

6. Crews, S., et al., Cell 1981. 25:59.

7. Concannon, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1986. 83:6598.

8. Kimura, N., et al., Eur. J. Immunol. 1987. 17:375.

9. Wilson, R.K., et al., Immunological Reviews 1988c. 101:149.

10. Chirgwin, J.M., et al., Biochemistry 1979. 18:5294.

11. Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. 1987, 162:156.

12. Saiki, R.K., et al., Science 1988. 239:487.

13. Loh, E.Y., et al., Science 1989. 243:217.

14. Sanger, F., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1977. 74:5463.

15. Lipman, D.J., et al., Science 1985. 227:1435.

16. Kozak, M., Nucl. Acids Res. 1984. 12:857.

17. Kyte, J., et al., R.F., J. Mol. Biol. 1982. 157:105.

18. Triebel, F., et al., J. Immun. 1988. 140:300.

19. Feinberg, A.P., et al., Anal. Biochem. 1983. 132:6.

20. Mengle-Gaw, L., et al., The EMBO Journal, 1987. 6:2273.

21. Klein, M.H., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1987. 84:6884.

22. Yoshikai, Y., et al., J. Exp. med. 1986. 164:90.

23. Naudenbark A., et al., Nature, 341, 541.

24. Janeway C., Nature, 341, 482.

25. Lin Y., J. Exp. Med., 171, 221.

26. Acha-Orbea H., EMBO Journal, 1990, 9, 12, 3815.

27. Kappler J., Science, 244, 811.

28. Choi, Y., PNAS, 86, 8941.

29. Nitta T. et al., Science 1990, 249, 672.

30. Sottini A. et al., Eur. J. Immunol., 1991, 21, 461.

31. Hinkkanen A. et al., Immunogenetics, 1989, 29, 131.

32. Bernard O. et al., Oncogene, 1988, 2, 195.

33. Sinha N. et al., Nucleic Acids Res. 1984, 12, 4539.

I - INFORMACIÓN GENERAL

(1)	SOLICITANTE: Sociedad denominada ROUSSEL UCLAF
(2)	TÍTULO DE LA INVENCIÓN:
	\begin{minipage}[t]{150mm}Secuencias nucleotídicas que codifican regiones variables de las cadenas \alpha de los receptores de los linfocitos T humanos, segmentos peptídicos correspondientes y aplicaciones diagnósticas y terapéuticas.\end{minipage}
(3)	NÚMERO DE SECUENCIAS: 62

\vskip1.000000\baselineskip

II - INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID N° 1

CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIAS
	TIPO: nucleótido y su proteína correspondiente
	LONGITUD: 371 pares de bases
	NÚMERO DE CADENAS: simple
	CONFIGURACIÓN: lineal
	TIPO DE MOLÉCULA: ADNc para ARNm
ORIGEN
	ORGANISMO: humano
	LÍNEA CELULAR: linfocitos T humanos
CARACTERÍSTICAS
	NOMBRE DEL ADN: IGR a 02
	SECUENCIA V\alpha w24
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA

\vskip1.000000\baselineskip

1

III - INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID N° 2

CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIAS
	TIPO: nucleótido y su proteína correspondiente
	LONGITUD: 400 pares de bases
	NÚMERO DE CADENAS: simple
	CONFIGURACIÓN: lineal
	TIPO DE MOLÉCULA: ADNc para ARNm
ORIGEN
	ORGANISMO: humano
	LÍNEA CELULAR: linfocitos T humanos
CARACTERÍSTICAS
	NOMBRE DEL ADN: IGR a 03
	SECUENCIA V\alpha w25
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA

2

\vskip1.000000\baselineskip

IV - INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID N° 3

CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIAS
	TIPO: nucleótido y su proteína correspondiente
	LONGITUD: 339 pares de bases
	NÚMERO DE CADENAS: simple
	CONFIGURACIÓN: lineal
	TIPO DE MOLÉCULA: ADNc para ARNm
ORIGEN
	ORGANISMO: humano
	LÍNEA CELULAR: linfocitos T humanos
CARACTERÍSTICAS
	NOMBRE DEL ADN: IGR a 04
	SECUENCIA V\alpha w26
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA

3

\vskip1.000000\baselineskip

V - INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID N° 4

CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIAS
	TIPO: nucleótido y su proteína correspondiente
	LONGITUD: 335 pares de bases
	NÚMERO DE CADENAS: simple
	CONFIGURACIÓN: lineal
	TIPO DE MOLÉCULA: ADNc para ARNm
ORIGEN
	ORGANISMO: humano
	LÍNEA CELULAR: linfocitos T humanos
CARACTERÍSTICAS
	NOMBRE DEL ADN: IGR a 05
	SECUENCIA V\alpha w27
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA

4

VI - INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID N° 5

CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIAS
	TIPO: nucleótido y su proteína correspondiente
	LONGITUD: 361 pares de bases
	NÚMERO DE CADENAS: simple
	CONFIGURACIÓN: lineal
	TIPO DE MOLÉCULA: ADNc para ARNm
ORIGEN
	ORGANISMO: humano
	LÍNEA CELULAR: linfocitos T humanos
CARACTERÍSTICAS
	NOMBRE DEL ADN: IGR a 07
	SECUENCIA V\alpha w29
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA

5

\vskip1.000000\baselineskip

VII - INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID N° 6

CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIAS
	TIPO: nucleótido y su proteína correspondiente
	LONGITUD: 569 pares de bases
	NÚMERO DE CADENAS: simple
	CONFIGURACIÓN: lineal
	TIPO DE MOLÉCULA: ADNc para ARNm
ORIGEN
	ORGANISMO: humano
	LÍNEA CELULAR: linfocitos T humanos
CARACTERÍSTICAS
	NOMBRE DEL ADN: IGR a 08
	SECUENCIA V\alpha 1
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA

6

\vskip1.000000\baselineskip

VIII - INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID N° 7

CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIAS
	TIPO: nucleótido y su proteína correspondiente
	LONGITUD: 330 pares de bases
	NÚMERO DE CADENAS: simple
	CONFIGURACIÓN: lineal
	TIPO DE MOLÉCULA: ADNc para ARNm
SECUENCIA CONSENSO
	ORIGEN
	ORGANISMO: humano
	LÍNEA CELULAR: linfocitos T humanos
CARACTERÍSTICAS
	NOMBRE DEL ADN: IGR a 09
	SECUENCIA V\alpha 2
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA

7

\vskip1.000000\baselineskip

IX - INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID N° 8

CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIAS
	TIPO: nucleótido y su proteína correspondiente
	LONGITUD: 400 pares de bases
	NÚMERO DE CADENAS: simple
	CONFIGURACIÓN: lineal
	TIPO DE MOLÉCULA: ADNc para ARNm
	SECUENCIA CONSENSO
ORIGEN
	ORGANISMO: humano
	LÍNEA CELULAR: linfocitos T humanos
CARACTERÍSTICAS
	NOMBRE DEL ADN: IGR a 10
	SECUENCIA V\alpha 5
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA

8

\vskip1.000000\baselineskip

X - INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID N° 9

CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIAS
	TIPO: nucleótido y su proteína correspondiente
	LONGITUD: 386 pares de bases
	NÚMERO DE CADENAS: simple
	CONFIGURACIÓN: lineal
	TIPO DE MOLÉCULA: ADNc para ARNm
	SECUENCIA CONSENSO
ORIGEN
	ORGANISMO: humano
	LÍNEA CELULAR: linfocitos T humanos
CARACTERÍSTICAS
	NOMBRE DEL ADN: IGR a 11
	SECUENCIA V\alpha 7
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA

9

\vskip1.000000\baselineskip

XI - INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID N° 10

CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIAS
	TIPO: nucleótido y su proteína correspondiente
	LONGITUD: 383 pares de bases
	NÚMERO DE CADENAS: simple
	CONFIGURACIÓN: lineal
	TIPO DE MOLÉCULA: ADNc para ARNm
ORIGEN
	ORGANISMO: humano
	LÍNEA CELULAR: linfocitos T humanos
CARACTERÍSTICAS
	NOMBRE DEL ADN: IGR a 12
	SECUENCIA V\alpha 22
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA

10

\vskip1.000000\baselineskip

XII - INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID N° 11

CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIAS
	TIPO: nucleótido y su proteína correspondiente
	LONGITUD: 364 pares de bases
	NÚMERO DE CADENAS: simple
	CONFIGURACIÓN: lineal
	TIPO DE MOLÉCULA: ADNc para ARNm
ORIGEN
	ORGANISMO: humano
	LÍNEA CELULAR: linfocitos T humanos
CARACTERÍSTICAS
	NOMBRE DEL ADN: IGR a 13
	SECUENCIA V\alpha 16
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA

11

\vskip1.000000\baselineskip

XIII - INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID N° 12

CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIAS
	TIPO: nucleótido y su proteína correspondiente
	LONGITUD: 264 pares de bases
	NÚMERO DE CADENAS: simple
	CONFIGURACIÓN: lineal
	TIPO DE MOLÉCULA: ADNc para ARNm
ORIGEN
	ORGANISMO: humano
	LÍNEA CELULAR: linfocitos T humanos
CARACTERÍSTICAS
	NOMBRE DEL ADN: Ja 01
	SECUENCIA J\alpha
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA

\vskip1.000000\baselineskip

12

XIV - INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID N° 13

CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIAS
	TIPO: nucleótido y su proteína correspondiente
	LONGITUD: 277 pares de bases
	NÚMERO DE CADENAS: simple
	CONFIGURACIÓN: lineal
	TIPO DE MOLÉCULA: ADNc para ARNm
ORIGEN
	ORGANISMO: humano
	LÍNEA CELULAR: linfocitos T humanos
CARACTERÍSTICAS
	NOMBRE DEL ADN: Ja 02
	SECUENCIA J\alpha
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA

\vskip1.000000\baselineskip

13

\vskip1.000000\baselineskip

XVI - INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID N° 15

CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIAS
	TIPO: nucleótido y su proteína correspondiente
	LONGITUD: 60 pares de bases
	NÚMERO DE CADENAS: simple
	CONFIGURACIÓN: lineal
	TIPO DE MOLÉCULA: ADNc para ARNm
ORIGEN
	ORGANISMO: humano
	LÍNEA CELULAR: linfocitos T humanos
CARACTERÍSTICAS
	NOMBRE DEL ADN: Ja 04
	SECUENCIA J\alpha
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA

\vskip1.000000\baselineskip

14

XVII - INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID N° 16

CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIAS
	TIPO: nucleótido y su proteína correspondiente
	LONGITUD: 59 pares de bases
	NÚMERO DE CADENAS: simple
	CONFIGURACIÓN: lineal
	TIPO DE MOLÉCULA: ADNc para ARNm
ORIGEN
	ORGANISMO: humano
	LÍNEA CELULAR: linfocitos T humanos
CARACTERÍSTICAS
	NOMBRE DEL ADN: Ja 05
	SECUENCIA J\alpha
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA

15

XVIII - INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID N° 17

CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIAS
	TIPO: nucleótido y su proteína correspondiente
	LONGITUD: 60 pares de bases
	NÚMERO DE CADENAS: simple
	CONFIGURACIÓN: lineal
	TIPO DE MOLÉCULA: ADNc para ARNm
ORIGEN
	ORGANISMO: humano
	LÍNEA CELULAR: linfocitos T humanos
CARACTERÍSTICAS
	NOMBRE DEL ADN: Ja 06
	SECUENCIA J\alpha
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA

16

XIX - INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID N° 18

CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIAS
	TIPO: nucleótido y su proteína correspondiente
	LONGITUD: 56 pares de bases
	NÚMERO DE CADENAS: simple
	CONFIGURACIÓN: lineal
	TIPO DE MOLÉCULA: ADNc para ARNm
ORIGEN
	ORGANISMO: humano
	LÍNEA CELULAR: linfocitos T humanos
CARACTERÍSTICAS
	NOMBRE DEL ADN: Ja 07
	SECUENCIA J\alpha
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA

17

\vskip1.000000\baselineskip

XX - INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID N° 19

CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIAS
	TIPO: nucleótido y su proteína correspondiente
	LONGITUD: 57 pares de bases
	NÚMERO DE CADENAS: simple
	CONFIGURACIÓN: lineal
	TIPO DE MOLÉCULA: ADNc para ARNm
ORIGEN
	ORGANISMO: humano
	LÍNEA CELULAR: linfocitos T humanos
CARACTERÍSTICAS
	NOMBRE DEL ADN: Ja 08
	SECUENCIA J\alpha
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA

\vskip1.000000\baselineskip

18

\vskip1.000000\baselineskip

XXI - INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID N° 20

CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIAS
	TIPO: nucleótido y su proteína correspondiente
	LONGITUD: 50 pares de bases
	NÚMERO DE CADENAS: simple
	CONFIGURACIÓN: lineal
	TIPO DE MOLÉCULAS: ADNc para ARNm
ORIGEN
	ORGANISMO: humano
	LÍNEA CELULAR: linfocitos T humanos
CARACTERÍSTICAS
	NOMBRE DEL ADN: Ja 09
	SECUENCIA J\alpha
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA

\vskip1.000000\baselineskip

19

\vskip1.000000\baselineskip

XXII - INFORMACIÓN PARA LAS SECUENCIAS SEQ ID N° 21 a 25

TIPO OLIGONUCLEÓTIDOS

DESCRIPCIÓN DE LAS SECUENCIAS

20

\vskip1.000000\baselineskip

XXIII - INFORMACIÓN PARA LAS SECUENCIAS SEQ ID N° 26 a 63

TIPO OLIGONUCLEÓTIDOS

DESCRIPCIÓN DE LAS SECUENCIAS

21

22

23

Claims (23)

1. Secuencia nucleotídica que codifica una región variable de la cadena \alpha de los receptores de los linfocitos T humanos, correspondiente a un ADNc que comprende una secuencia nucleotídica correspondiente a la secuencia SEQ ID N° 1.

2. Secuencia nucleotídica que codifica una región variable de la cadena \alpha de los receptores de los linfocitos T humanos correspondiente a la secuencia 1 a 200 de SEQ ID N° 1.

3. Péptidos codificados por las secuencias nucleotídicas tales como las definidas en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2.

4. Vectores de expresión que comprenden una secuencia de ADN que codifica uno de los péptidos tal como se ha definido en la reivindicación 3.

5. Anfitriones no humanos transformados con un vector según la reivindicación 4.

6. Anticuerpos dirigidos frente a un determinante antigénico de uno de los péptidos definidos en la reivindicación 3.

7. Anticuerpo según la reivindicación 6 que es un anticuerpo monoclonal.

8. Fragmento Fab, Fab' o F(ab')2 de un anticuerpo monoclonal según la reivindicación 7.

9. Anticuerpo monoclonal o fragmento de éste según cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8 a los cuales están unidos un marcador detectable y/o al menos una molécula terapéutica.

10. Hibridomas que producen un anticuerpo según la reivindicación 7.

11. Composición de diagnóstico que comprende uno o varios anticuerpos monoclonales o fragmentos de éstos tales como los definidos en una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9.

12. Composición terapéutica que comprende uno o varios anticuerpos monoclonales o fragmentos de éstos tales como los definidos en una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9.

13. Composición según la reivindicación 12 que comprende derivados que contienen una molécula citotóxica o un radioisótopo.

14. Composición terapéutica que comprende al menos uno de los péptidos definidos en la reivindicación 3.

15. Composición terapéutica que comprende oligonucleótidos antisentido correspondientes a la secuencia de un segmento V\alpha tal como la definida en la reivindicación 2.

16. Utilización, como cebadores para la amplificación de ADN, de secuencias nucleotídicas de aproximadamente al menos 17 nucleótidos comprendidas en la secuencia de un segmento V\alpha tal como la definida en la reivindicación
2.

17. Utilización, como sonda de detección, de secuencias nucleotídicas de aproximadamente al menos 10 nucleótidos comprendidas en la secuencia de un segmento V\alpha tal como la definida en la reivindicación 2.

18. Oligonucleótido, utilizable como cebador para la amplificación del ADN correspondiente a una región variable de la cadena \alpha de los receptores de células T, de secuencia SEQ ID N° 49.

19. Utilización, como cebador para la amplificación del ADN correspondiente a una región variable de las cadenas \alpha de los receptores de células T, del oligonucleótido según la reivindicación 18.

20. Proceso de detección de secuencia nucleotídica que codifica un segmento V\alpha de los receptores T o de ADNc correspondiente al producto de transcripción de ésta, en una muestra biológica, caracterizado porque comprende:

a)

amplificación del ADN con al menos un par de cebadores formado por el oligonucleótido según la reivindicación 18 y un oligonucleótido que pertenece al segmento C\alpha, y

b)

detección de las secuencias amplificadas con una sonda C\alpha.

21. Proceso según la reivindicación 20, caracterizado porque la amplificación se realiza en presencia de un par de cebadores control y la detección mediante una sonda control.

22. Kit de diagnóstico para realizar un proceso según la reivindicación 20, caracterizado porque comprende:

a)

al menos un oligonucleótido según la reivindicación 18,

b)

un cebador C\alpha,

c)

una sonda C\alpha.

23. Kit de diagnóstico para realizar un proceso según la reivindicación 21, caracterizado porque comprende:

a)

al menos un oligonucleótido según la reivindicación 18,

b)

un cebador C\alpha,

c)

un par de cebadores control,

d)

una sonda C\alpha,

e)

una sonda control.