JPH0928385A - 可溶形態のｃｄ２３のｄｎａ配列及びその使用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】血液に存在するＩｇＥの量を調整し且つクロー
ニング及び増幅後ＩｇＥ介在疾病の治療に使用できるタ
ンパク質をコードする遺伝物質の精製・分離ヌクレオチ
ド配列を提供すること。 【解決手段】発現について通常の膜結合免疫調節タンパ
ク質ＣＤ２３の可溶形態をコードする遺伝物質を分離・
精製する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、一般的に遺伝物質
の操作に関し、より詳細には発現ついて調節タンパク質
ＣＤ２３の可溶形態をコードして、天然可溶性ＣＤ２３
の生理学的性質の一つ以上を有するタンパク質の産生を
可能にするＤＮＡの知見、分離及び精製に関する。

【０００２】

【従来の技術】分子生物学の背景 遺伝物質は、細胞の成分の製造をプログラムし且つ誘導
し、そして細胞の応答を管理する化学物質として広く定
義される。デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）と称されるヌク
レオチドからなる長鎖は、この遺伝物質を含んでなる。
ＤＮＡは、リン酸基が連結したデオキシリボース糖に結
合した４種のヌクレオチド、アデニン、グアニン、チミ
ン又はシトシンの反復単位からなる。機能性ＤＮＡは、
ヌクレオチドの一本鎖が安定な二本鎖会合した形態で生
じる。この会合は、アデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）との
間又はグアニン（Ｇ）とシトシン（Ｃ）との間に存在す
る「相補」ヌクレオチド塩基間の水素結合により生じ
る。細胞成分とタンパク質の製造は、アデニン、ウラシ
ル、グアニン及びシトシンの相補塩基がＤＮＡの未ハイ
ブリダイゼーションコード鎖に水素対合することにより
ＤＮＡヌクレオチド配列が比較的不安定なメッセンジャ
ーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に「転写」されるプロセスを介し
て行われる。二本鎖ＤＮＡは一本鎖に解離し、ＤＮＡの
一本鎖のみがメッセンジャーＲＮＡに転写される。

【０００３】ｍＲＮＡは、次にリボソームにおけるタン
パク質の形成の鋳型としての役割を果たす。これは、ｍ
ＲＮＡ翻訳のプロセスである。全てのＤＮＡ配列は、全
て必ずしもタンパク質をコードしているわけではない。
ｍＲＮＡに転写されないプロモーター領域、調節領域及
び制御領域等の転写を制御するＤＮＡのいくつかの非コ
ード領域がある。

【０００４】これらの配列はイントロンと呼ばれ、ＤＮ
Ａのコードセグメント間に分配されている。タンパク質
をコードするこれらのセグメントは、エクソンと称され
る。タンパク質に翻訳されるＲＮＡのメッセンジャーに
転写されるのがこれらのエクソンである。したがって、
ｍＲＮＡは、イントロン配列が省略されているので、タ
ンパク質をより直接的にコードする。選択的にエクソン
を使用することにより、異なる形態のタンパク質が翻訳
される。したがって、ＤＮＡから転写されるｍＲＮＡ転
写物の分析により、選択的にエクソンを使用しているの
でイソホームを含むどのタンパク質が細胞により翻訳又
は発現されているかが確認される。タンパク質ＣＤ２３ 糖タンパク質ＣＤ２３は、その免疫調節機能により分子
免疫学者の間で大きな関心を呼んだ。この関心により、
ほとんど同時に３つの研究所がクローン化ｃＤＮＡのヌ
クレオチド配列を公表されることとなる（Ｋｉｋｕｔａ
ｎｉ等、１９８６、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｔｒｕｃ
ｔｕｒｅ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ
Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌ
ｉｎ」、Ｅ．Ｃｅｌｌ ４７：６５７〜６６５）；（Ｉ
ｋｕｔａ，Ｋ．等、１９８７、「Ｈｕｍａｎ Ｌｙｍｐ
ｈｏｃｙｔｅ Ｆｃ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ Ｉｇ
Ｅ」；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｏｆ ｉ
ｔｓ Ｃｌｏｎｅｄ ｃＤＮＡ Ｗｉｔｈ Ａｎｉｍａ
ｌ Ｌｅｃｔｉｎｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：８１９〜８２３）（これらの両
方は、引用することにより本明細書の開示の一部とされ
る）。

【０００５】ＣＤ２３又はＦｃεｒＩＩは、体液性免疫
応答を引き起こす抗体（又は免疫グロブリン）を形成す
るヒト及びげっ歯Ｂリンパ球についての細胞膜内タンパ
ク質であることが明らかとなった（Ｆｒｉｔｓｃｈｅ，
Ｒ．、及びＳｐｉｅｇｅｌｂｅｒｇ、１９７８、「Ｆｃ
Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｆｏｒ ＩｇＥ ｏｎ Ｎｏｒ
ｍａｌ Ｒａｔ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ」、Ｊ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．１２１．４７１〜４７８）；（Ｙｏｄｏ
ｉ，Ｊ．、Ｉｓｈｉｚａｋａ，Ｋ．１９８０、「Ｉｎｄ
ｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｃｅ−Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｂｅ
ａｒｉｎｇ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｉｎ Ｈ
ｕｍａｎ Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔ
ｅｓ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２４：９３４〜９３
８）；（Ｋｏｔｏｎａ等、１９８４、「Ｃｈａｒａｃｔ
ｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｙｍｐｈ
ｏｃｙｔｅ ＩｇＥ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｂｙ Ｆｌ
ｏｒ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｙ」、Ｊ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．１３３：１５２１〜１５２８）；（Ｂｏｎ
ｎｅｆｏｙ等、１９８７、「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａ
ｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ
Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｓｐｅｃｉ
ｆｉｃ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ
Ｌｏｗ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ
ＩｇＥ」：ＣＤ２３ ｉｓ ａ Ｌｏｗ Ａｆｆｉｎ
ｉｔｙ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ ＩｇＥ、Ｊ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．、１３８：２９７０〜２９７８）；（Ｙｕ
ｋａｗａ等、１９８７、Ａ Ｂ Ｃｅｌｌ−Ｓｐｅｃｉ
ｆｉｃ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ａｎｔｉｇ
ｅｎ」、ＣＤ２３ ｉｓ ａ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏ
ｒ ＩｇＥ（ＦｃｅＲ） ｏｎ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ
ｓ」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３８：２５７６〜１５
８０）。さらに、ＣＤ２３は、β−リンパ球を調節する
Ｔ細胞又はＴリンパ球の膜上に存在することが判明し
た。ヒトにおいて、ＣＤ２３は、血小板、樹状細胞、胸
腺上皮、好酸球及び単球を含む数種の造血細胞において
発現することが判明した（Ｃａｐｒｉｎ等、１９７７、
「Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ Ｂｅｔｗｅｅｎ ＩｇＥ
Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ａｎｄ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ
ｉｎ ｔｈｅ Ｒａｔ」：ａ Ｎｅｗ Ｍｅｃｈａｎ
ｉｓｍ ｏｆＭａｃｒｏｐｈａｇｅ Ａｃｔｉｖａｔｉ
ｏｎ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：３１５〜３３
０）；（Ｖｅｒｃｅｌｌｉ，Ｄ．等、１９８８、「Ｈｕ
ｍａｎ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋ
ｉｎ−４ ＩｎｄｕｃｅｓＦｃＲ２／ＣＤ２３ ｉｎ
Ｎｏｒｍａｌ Ｈｕｍａｎ Ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ」、
Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６７：１４０６〜１４１６）；
（Ｂｅｉｂｅｒ等、１９８９、「Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ
ｏｆ ＦｃＲ２／ＣＤ２３ ｏｎ ＨｕｍａｎＥｐｉｄ
ｅｒｍａｌ Ｌａｎｇｅｒｈａｎ’ｓ Ｃｅｌｌｓ ｂ
ｙ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ
４ ａｎｄ α−Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ」、Ｊ．Ｅｘ
ｐ．Ｍｅｄ．１７０：３０９〜３１４）；（細田等、１
９８９、「Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｒｅｇｕｌａｔ
ｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｌｏｗａｆｆｉｎｉｔｙ Ｆｃ
Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ ＩｇＥ（ＦｃＲ２／ＣＤ
２３）ａｎｄ ｔｈｅ Ｈ−２ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（Ｔ
ａｃ／ｐ５５）ｏｎＥｏｓｉｎｏｐｈｉｌｉｃ Ｌｅｕ
ｋｅｍｉａ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ（Ｅｏｌ−１ ａｎｄ
Ｅｏｌ−３）」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：１４
７〜１５２）。ＣＤ２３は、一種の特異的免疫グロブリ
ン、グロブリンＥ（ＩｇＥ）を結合するこれらの細胞の
表面で低親和性レセプターとしての役割を果たす。

【０００６】免疫グロブリンＥは、アレルギーの病変を
引き起こす。この抗体は、寄生虫からの保護に必須であ
るが、過剰のＩｇＥが存在すると、特徴的なアレルギー
反応を生じると思われる。アレルギー性の人達は、伝統
的にＣＤ２３が異常である。したがって、ＣＤ２３は、
血流に存在するＩｇＥの量を制御するのに重要な調節ツ
ールである。

【０００７】マウスとヒトの両方において、ＣＤ２３の
アミノ酸は３領域又はドメインに分けられる：細胞質、
トランスメンブレン及び細胞外。アミノ末端を含有する
細胞質セグメントは、エクソン２と称される遺伝子のタ
ンパク質コードセグメントによりコードされる一連のア
ミノ酸からなる。細胞質ドメインのある残りのアミノ酸
とトランスメンブレンセグメントの全てのアミノ酸は、
エクソン３によりコードされる。トランスメンブレンセ
グメントは、タンパク質をビリピド膜にしっかりと固定
する大きく帯電した領域の後に一連の親水性残基を含有
している。細胞外ドメインのアミノ酸は、エクソン４〜
１２によりコードされている（Ｇｏｌｌｎｉｃｋ等、
「Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉ
ｏｎ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ
Ｃｌｏｎｅｓ Ｅｎｃｏｄｉｎｇｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ
Ｆｃ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ ＩｇＥ（Ｆｃεｒ
ＩＩ）」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４４：１９７４）配
列番号１（位置１５１〜１１５６）生田等、「Ｈｕｍａ
ｎ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｆｃ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ
ｆｏｒ ＩｇＥ ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｈｏｍｏｌｏｇｙ
ｏｆ ｉｔｓ Ｃｌｏｎｅｄ ｃＤＮＡ」、Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８４、８１
９、１９８７（図１参照）。細胞外ドメインは、ＩｇＥ
結合領域を含有している。

【０００８】最近、より小さい形態のＣＤ２３、可溶Ｃ
Ｄ２３がＢリンパ球の上清に存在することが分かった。
このより小さい可溶性形態は、従来の膜結合ＣＤ２３の
ＩｇＥ結合細胞外セグメントを含有し、且つさらにＩｇ
Ｅを結合する。より最近に、膜結合ＣＤ２３のタンパク
質分解開裂により、可溶性ＩｇＥ結合因子、可溶性ＣＤ
２３を生じると結論された（Ｆｒｉｄｍａｎ等、１９８
０、「Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｅｎｈａｎｃｅｓ ｔｈ
ｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｆｃ Ｒｅｃｅｐｔ
ｏｒｓ」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２４：２４３６〜２
４４１）。

【０００９】本発明は、従来の考えとは異なり、遠心分
離したベータ細胞の上清に存在するより小さい可溶形態
のＣＤ２３は、従来の膜結合ＣＤ２３から酵素開裂され
ず、実際には、タンパク質が、選択的なエクソンの使用
及び従来のＣＤ２３遺伝子のｍＲＮＡスプライシングに
より形成される転写物から翻訳されたタンパク質である
との知見に基づいている。ＣＤ２３の種々のイソホーム
のｍＲＮＡが、いくつかのマウス及びヒトの造血細胞か
ら見出され、分離された。

【００１０】これらのｍＲＮＡ転写物は、ＣＤ２３遺伝
子のエクソン３（アンカー及び親水性セグメントをコー
ドして膜としっかりと会合できるエクソン）が省略され
ている。得られた翻訳された可溶ＣＤ２３は、細胞外領
域のみを含有するであろう開裂により形成されるセグメ
ントとは異なり、細胞外結合領域と、細胞の機構と相互
作用する細胞内領域とを含有していた。

【００１１】可溶性ＣＤ２３のｍＲＮＡの存在は、細胞
自身が実際により小さい可溶性ＣＤ２３を製造している
こと、及びｍＲＮＡが逆転写酵素、ポリメラーゼ連鎖反
応（ＰＣＲ）を使用することによりｃＤＮＡとしてクロ
ーニングでき、ｃＤＮＡのヌクレオチド配列が得られ、
したがってエクソン３によりコードされている親水性セ
グメントのない分子ＣＤ２３の大規模合成の手段を得る
ことができることにおいて非常に重要である。

【００１２】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、Ｉｇ
Ｅ結合を担うことが知られている領域を保持することか
ら、ＩｇＥ結合能を維持する可溶形態のＣＤ２３の大規
模合成を可能とすることである。このようなタンパク質
には、ＣＤ２３の性質の研究用モデル、そのＩｇＥ結合
特性の研究、Ｂリンパ球の分化の研究への使用などの多
種多様な用途があり、最後には、ＣＤ２３は、ＩｇＥを
結合し調節する可溶性ＣＤ２３の性質のため、アレルギ
ー性疾患及び他の免疫疾患において薬理学的及び治療薬
剤として使用されるＩｇＥと同じ結合特性を有するであ
ろう化合物の同定にも使用できる。

【００１３】本発明の別の目的は、ヒトにおいてＩｇＥ
産生を調節する細胞外手段を提供することである。本発
明の別の目的は、可溶形態のＣＤ２３のＤＮＡ配列を分
離且つ精製して、クローニングにより大量の可溶性ＣＤ
２３の産生を可能とすることである。本発明のさらに別
の目的は、増幅用ウイルス若しくはバクテリア又遺伝子
産物にクローニングできる可溶性ＣＤ２３遺伝子配列を
含有するベクターを提供することである。

【００１４】これら及び他の目的を達成する方法は、以
下の本発明の詳細な説明から明らかになるであろう。

【００１５】

【課題を解決するための手段】本発明によれば、翻訳に
際して可溶形態のタンパク質ＣＤ２３をコードする新規
な精製・分離ヌクレオチド配列がはじめて提供される。
これらの配列が開示される。また、本発明は、開示され
る配列にストリンジェント条件下でハイブリダイゼーシ
ョンする配列を意図する。ストリンジェントハイブリダ
イゼーション条件は、当業者に公知である。また、本発
明は、エクソン３によりコードされるアミノ酸なしのタ
ンパク質生成物を製造するための手段を提供する。この
生成物は、ＣＤ２３の細胞内細胞相互作用機構部の他
に、従来の膜結合ＣＤ２３のＩｇＥ結合機能を保持する
ものである。これらの生成物の合成により、対立変異体
を含む天然可溶性ＣＤ２３の生物学的性質の一つ以上を
有するＣＤ２３形態の製造が可能となる。

【００１６】本発明によれば、発現についてヒト及びマ
ウス可溶性イソホームＣＤ２３のアミノ酸配列の一部分
又は全てをコードするＤＮＡ配列が分離され特性付けさ
れた。これらの分離ＤＮＡ配列は、次に適合単細胞宿主
生物に形質転換して、外生ＤＮＡを発現させることによ
りこのタンパク質を大規模合成する。次に、タンパク質
を収穫し、喘息及び他のアレルギー応答当業者のＩｇＥ
介在疾患の治療用医薬組成物に使用したり、ＣＤ２３結
合機構及びその機能的特徴のさらなる研究のモデルとし
て使用できる。

【００１７】ｃＤＮＡとしてのｍＲＮＡ分子の分析及び
クローニングにより、トランスメンブレン親水性領域を
コードするエクソン３及び高度に帯電した膜アンカー領
域が省略され、トランケート可溶性イソホームＣＤ２３
タンパク質の製造を可能とする遺伝子配列が得られた。

【００１８】

【発明の実施の形態】本発明は、ＩｇＥを結合すること
が知られているより小さな可溶形態のＣＤ２３が細胞外
膜結合ＣＤ２３の切除部としてではなく、トランスメン
ブレンをコードするエクソンと細胞質セグメントＣＤ２
３とがないｍＲＮＡから得られる別個に転写されたタン
パク質として存在するとの予想外の知見に関する。

【００１９】本発明によれば、発現についてヒト及びマ
ウス種可溶性イソホームＣＤ２３のアミノ酸配列の一部
分又全てをコードするＤＮＡ配列が分離され且つ特性付
けされた。ヒト及びマウス種起源のＤＮＡは、両方とも
同様の方法で処理した。マウスの場合には、Ｔリンパ球
及びＢリンパ球の細胞系を、胸腺及び脾臓から採集し
た。ヒト細胞から、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ
ｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎからの細胞系と日本
国京都大学のＪｕｎｊｉ Ｙｏｄｏｉ博士から贈呈され
た細胞系を使用した。

【００２０】細胞系は、抗体で染色することにより検査
して、ＣＤ２３及びＩｇＥ結合活性の存在を検出した。
次に、ＣＤ２３プローブを、公知のＣＤ２３配列及びそ
こに開示されている公知のプローブから合成し（生田
等、１９８７、「Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｃＤＮＡ ｆ
ｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｆｃｅ Ｒ
ｅｃｅｐｔｏｒ；Ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｗｉｔｈ Ａｎｉ
ｍａｌ Ｌｅｃｔｉｎｓ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８４：８１９〜８２３）；（Ｌ
ｕｄｉｎ等、１９８７、「Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｅ
ｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃＤＮＡ Ｃｏｄ
ｉｎｇ ｆｏｒ ａ Ｈｕｍａｎ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔ
ｅ ＩｇＥ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ」、ＥＭＢＯ Ｊ．６：
１０９〜１１４、細胞性ｍＲＮＡを分離し且つ変性し
た。変性ＲＮＡをＣＤ２３プローブとともに溶液中に配
置し、ＣＤ２３ｍＲＮＡを同定した。最終的に、一連の
プライマーを、ＣＤ２３の公表されている配列に基づい
て構築し、プライマーをＲＮＡ鋳型にハイブリダイゼー
ション後、逆転写酵素を使用してｍＲＮＡのｃＤＮＡコ
ピーを形成した。ＣＤ２３をコードするＤＮＡを含有す
る所望のｃＤＮＡクローンの分離を、前記した３２−Ｐ
標識ＣＤ２３プローブを用いたＤＮＡ−コロニーハイブ
リダイゼーションを用いることにより達成した。次に、
得られた分離ＤＮＡセグメントを分析して、ＤＮＡ配列
を決定した。これらの分離配列により、収穫して喘息等
のアレルギー応答等のＩｇＥ介在疾病の治療に使用でき
るだけでなく、ＩｇＥ結合活性の研究モデルとしても使
用できる可溶ＣＤ２３の大規模製造が可能となる。

【００２１】以下、実施例により本発明を説明するが、
これらの実施例は、とりわけＣＤ２３コードマウスｃＤ
ＮＡクローン及びヒトゲノムｃＤＮＡクローンの同定前
に実施される方法、このような同定の方法、最後に配列
決定及び得られた発現系の発現並びに産生した可溶性Ｃ
Ｄ２３の治療及び生体外使用のための医薬担体に関す
る。

【００２２】

【実施例】

実施例１ マウスＣＤ２３配列 分離及び精製 成マウスＢ、Ｔの細胞系並びに胸腺及び脾臓から得たマ
クロファージ系列を分析に使用し、マウス及びサル繊維
芽細胞を対照として使用した。細胞を、ＲＰＭＩ １６
４０又はＤｕｌｂｅｃｃｏ培地（子ウシ血清１０％含
有）中で、３７℃、ＣＯ₂ ７％の条件で培養した。培養
には、マイトジェンは添加しなかった。

【００２３】ＡＫＲマウスから得た胸腺細胞並びにＢａ
ｌｂ／ｃマウスから得た胸腺細胞及び脾臓細胞の新鮮な
試料を試験した。ＷＥＨＩ ２７９、ＥＬ−４、ＣＴＬ
−２、Ｊ７７４、ＭＣ５７、Ｐ３８８、３Ｔ３及びＣＯ
Ｓを、ＡＴＣＣ、Ｇａｉｔｈｅｓｂｕｒｇ、ＭＤから得
た。Ｒ１．１及びＴｈ９は好意によりＤ．Ｓｐｉｎｅｌ
ｌａのために提供され、Ｄ１０はＣ．Ｊａｎｅｗａｙか
ら贈呈された。ＣＤＣ３５は、Ｄ．Ｐａｒｋｅｒから贈
呈された。ＣＨ１は、Ｊ．Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅから得た
２Ｃ１１から得た。Ｂ５３は、Ｚ Ｏｖａｒｙにより提
供された。１Ｃ９は、本研究所において生体外において
分離したクローンである（Ｂａｌｂ／ｃ胸腺リンパ腫Ｂ
ａｌｅｎｔｌ−８から適合させ且つ誘導した）。使用し
た細胞系列を、表１にまとめて示す。

【００２４】

【表１】 表１ ―――――――――――――――――― マウス細胞系 ＷＥＨＩ２７９ Ｂ細胞リンパ腫 ＣＨ１ Ｂ細胞Ｌｙ １ｂ Ｄ１０ Ｔｈ２細胞 ＣＤＣ３５ Ｔｈ２細胞 ＩＣ９ 胸腺リンパ腫系 ＥＬ４ Ｔリンパ腫 ＣＴＬ２ Ｔ細胞クローン Ｒ１．１ Ｔ細胞クローン Ｔｈ９ Ｔ細胞クローン Ｊ７７４ マクロファージ細胞系 ＭＣ５７ 骨髄単球細胞系 Ｐ３８８ マクロファージ細胞系 Ｂ５３ マウスハイブリドーマ抗ＴＮＰ ＩｇＥ Ｃ１１ ハムスターハイブリドーマ抗Ｔ３ Ｔ３ マウス繊維芽細胞 ＯＳ サル腎繊維芽細胞 ―――――――――――――――――― 表面及び細胞質染色 Ｔ細胞及びＢ細胞系を、ＣＤ２３とＩｇＥの結合活性を
検出するために、モノクローナル抗体で、表面及び細胞
質の染色を行った。ビオチニル化Ｂ３Ｂ４（ラットＩｇ
Ｇ２ａ抗マウスＣＤ２３）、ＦＩＴＣ Ａ３Ｂ１（モノ
クローナルＩｇＥＫマウス抗ＤＮＰ）、ビオチニル化Ｂ
５３（モノクローナルＩｇＥＫマウス抗ＤＮＰ）及び５
３−６．７２、非関連抗体（ラットＩｇＧ２ａ）を使用
した。標識細胞を、ＦＡＣＳ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋ
ｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳ４４０）により分析し、また、フ
ルオレセイン用フィルターを備えたオリンパス顕微鏡で
手動観察した。

【００２５】ＣＤ２３プローブ ＣＤ２３プローブを、Ｋｅｖｉｎ Ｍｏｏｒｅ、Ｂｅｔ
ｔｌｅｒ等「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ
ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｕ
ｒｉｎｅ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ＦｃεＲＩＩ ＰＮ
ＡＳ ８６：７５６６〜７０（引用することにより本明
細書の開示の一部とされる）により分離されたｃＤＮＡ
ｐＬ２３．６を含有するＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラス
ミド構造物１０ｎｇを鋳型として使用したＰＣＲにより
合成した。

【００２６】ＲＮＡ分析 細胞を変性溶液（４Ｍイソチオシアン酸グアニジウム、
２４ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ７．０、０．５％ラウ
リルサルコシンナトリウム、０．１Ｍ２−メルカプトエ
タノール）で細胞１，０００，０００個当り変性溶液２
０μｌの割合により溶解することにより、総細胞ＲＮＡ
を分離した。０．１容の２Ｍ Ｎａアセテート、１容の
フェノール及び０．２容のクロロホルム：イソアミルア
ルコールを順次添加した。１００００ｇで遠心分離後、
上の水性相を１容のイソプロパノールで析出させ、ペレ
ットを初期容積０．３容の変性溶液及び等容のイソプロ
パノールに再懸濁した。ペレットを、７５％エタノール
に再懸濁し、沈降させた。乾燥ＲＮＡをＤＥＰＣ水に溶
解し、ＯＤを測定し、ＲＮＡを使用するのにＡ２６０／
Ａ２８０比が少なくとも１．７必要であった。

【００２７】ポリ（ａ）ｍＲＮＡを、Ｆａｓｔｒａｃｋ
ｍＲＮＡ分離キット（インビトロゲン、カリファルニ
ア州サンディエゴ）を用いて分離した。 ＲＮＡのドットブロット 総又はポリ（Ａ）ｍＲＮＡを、サイズが２〜１０μｇの
ＲＮＡ試料を用いてＨｙｂｏｎｄメンブレン上に斑点状
につけた後、希釈した。メンブレンを８０℃で２時間ベ
ークするか紫外線架橋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅクロスリ
ンカー）した後、ＣＤ２３プローブといっしょにプレ及
びハイブリダイゼーション溶液に入れた。高ストリンジ
ェンシーで洗浄（０．１ｘ ＳＳＣ、ＳＤＳ０．１％、
６２℃で３０’）し、Ｘ線フィルムを備えたフィルター
を、増感スクリーンを備えたカセットに、−７０℃で種
々の時間配置した。シグナル強度を、デンシトメトリー
により測定した。

【００２８】プライマー １１種のオリゴヌクレオチドを、ヒト及びマウスＣＤ２
３ｃＤＮＡの公表されている配列に基づいて合成した
（Ｒｉｃｈａｒｄ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：１
０６７〜１０７４（１９９１）；引用することにより本
明細書の開示の一部とされる）。プライマーを、ヒトと
マウスＢ細胞のｃＤＮＡ間の３’領域において最高の相
同性を有するように設計した。これらのプライマーを、
ヒト及びマウス実験の両方に使用した。配列をコンピュ
ータ解析したところ、いずれの対も、プライマー二量体
を形成しないか、自己アニーリングを示さなかった。プ
ライマー配列を、表２に示す。プライマーを、Ａｐｐｌ
ｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｍｏｄｅｌ３９１自動化Ｄ
ＮＡ合成装置（カリファルニア州フォスターシティー）
を用いて合成した。

【００２９】

【表２】 表２ プライマーの配列 マウスｃＤＮＡの ヌクレオチド位置 プライマーのヌクレオチド配列 ♯ １ ５’GGAGAAGACTACTGTCTTCAACACACTAGCCTGA３’ １６４ ５’CAAGACTGCCATGGAA３’ （２） １５１ ５’GGAAGGATCCAAACAAGACTGCCATGG ３’ （１） ２２０ ５’CGTTGCTGCTGTGCAAGACGTGGGACA ３’ （３） ６２２ ５’GGCTTGAATGAGAAGCGCACAGCCTCC ３’ ８５０ ５’AGCCAAAAGGAACAGGACTTCCTGATG ３’ １１５６ ５’TTGGGGTGGGCCTTGTTGGAGTCACG３’ （６） ８６７ ５’GTCCTGTTCCTTTTGGCTGTGGATGC３’ （５） ７８６ ５’GGAGCCCTTGCCAAAATAGTAGCAC ３’ （４） ４４８ ５’GTGACATCTGAACAACCTGG３’ ――――――――――――――――――――――――――――――――――― ♯は、プライマーの確認番号である。

【００３０】最初の６種のプライマーはコード（セン
ス）鎖と一致し、最後の４種のプライマーは相補（アン
チセンス）鎖と一致する。ヒトＣＤ２３のＢイソホーム
と相同性の追加のプライマーも、合成し使用した（５’
ＧＣＧＧＧＧＡＣＧＣＡＡＴＡＧＡＧＴＣＡＧＡＧＧＣ
３’）。使用したプライマーと予想生成物サイズを、マ
ウスについては図２に、ヒトについては図１１に示す。

【００３１】ｃＤＮＡ合成とポリメラーゼ連鎖反応（Ｐ
ＣＲ） ＰＣＲ反応を、Ａｍｐｌｉ−Ｔａｑ ＤＮＡポリメラー
ゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）、ｄＮＴＰｓ及び１０
Ｘ ＰＣＲ緩衝液を用いてセットアップした。ｃＤＮＡ
合成用ＲＮＡ鋳型は１μｇであったが、試料のなかには
０．２μｇしか使用しないものもあった。Ｍ−ＭＬＶ逆
転写酵素及びランダム６量体を、第一鎖ｃＤＮＡ合成に
使用した。

【００３２】ｃＤＮＡ合成直後、ＰＣＲ反応混合物８０
μｌを、Ｔａｑポリメラーゼ５単位並びに５’−及び
３’プライマー各々５０ｐＭといっしょにｃＤＮＡ反応
に添加した。混合物をサーマルサイクラーに入れ、９４
℃で３分間保持、５５〜６２℃で１分間アニーリング、
７２℃で１分間延長後、実験に応じて２５〜４０サイク
ル、９４℃で１分間、６２℃で１分間及び７２℃で１分
間、最終延長３分間を行った。各増幅物１０〜２０μｌ
を、アガロースゲル（ＴＢＥ中１．５〜３％）電気泳動
により分離した後、臭化エチジウムで染色した。全ての
ゲルをＨｙｂｏｎｄメンブレンにブロッティングし、特
異的ＣＤ２３プローブで探査した。

【００３３】実験によっては、第一ＰＣＲ反応の鋳型１
０μｌの１：１００水希釈物を使用して、「ネステッ
ド」第二ラウンドＰＣＲを行った。ほとんどの実験で
は、２種の新しいインターナルプライマーを使用して、
増幅の特異性を向上させた。第二ラウンドのネステッド
ＰＣＲを、２５〜３０サイクル実施した。試料によって
は、一種のインターナルプライマーのみを使用した。各
反応混合物１０〜２０μｌを、臭化エチジウムで染色し
たアガロースゲルで分離した後、ゲルをブロッティング
してから、ＣＤ２３プローブで探査した。

【００３４】サザンブロッティング ＰＣＲ生成物を、１Ｘ ＴＢＥ緩衝液を用いて１．５〜
３％アガロース電気泳動した。アガロース濃度は、被分
析断片のサイズに応じて変えた。ゲルを、浄化・変性溶
液に入れた後、一晩Ｈｙｂｏｎｄメンブレンに移し、そ
の後、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｒ
により架橋させた。フィルターを、予備ハイブリダイゼ
ーションした後、３２−Ｐ標識ＣＤ２３プローブでハイ
ブリダイゼーションした。ランダム６量体プライミング
キットを使用して、ＣＤ２３プローブを標識した。

【００３５】ＤＮＡ配列分析 Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ３７３Ａ自動Ｄ
ＮＡ塩基配列決定装置（カリフォルニア州フォスターシ
ティー）を使用して、得られたＰＣＲ断片のＤＮＡ配列
を決定した。両鎖を、Ｓａｎｇｅｒをベースとしたジデ
オキシ配列決定法により配列決定した。これには、ｔａ
ｑポリメラーゼを酵素として使用し、蛍光色素標識ター
ミネーターを反応に組み込んで使用した。４塩基の各々
について種々の色素標識を使用することにより、配列が
単一レーンにおいて決定され、且つポリアクリルアミド
ゲルの低部付近に位置させた操作アルゴンレーザーを越
えて移動したので検出ができた。 マウスＴ細胞系及びＢ細胞系についてのＣＤ２３の代謝
標識及びイムノプレシピテーション 培養細胞（１０ｘ１０）を、メチオニン非含有ＲＰＭＩ
１６４０を用いて、子ウシ血清なしで、３０分間成長
させ、その後この培地を捨て、細胞１０ｘ１０６個／ｍ
ｌを、メチオニン非含有ＲＰＭＩ １６４０において、
子ウシ血清なしで６時間成長させ、１００ｕＣｉ／ｍｌ
（３５Ｓ）メチオニンを添加した。終了時点での生存度
は、常に９０％を超えていた。培養を遠心分離し、上清
と細胞ペレットを平行実験で処理した。細胞を、ＰＢＳ
で３回洗浄した。熱細胞溶解緩衝液（２％ＳＤＳ、１０
Ｘトリス、ＥＤＴＡ、１．２Ｍ ＮａＣｌ、トリトン１
００）８００μｌをペレットに添加し、ＤＮＡを、シリ
ンジに反復して通過させることにより剪断した。２ｍｌ
カラムに緩衝液（トリス、ＥＤＴＡ、ＮａＣｌ、トリト
ン）を充填した。４℃で、溶解産物と上清を、アガロー
ス−ストレプトアビジンビーズ及び同じイソタイプの非
関連ビオチニル化抗体（１：１０００希釈）でプレクリ
アした。ビオチニル化Ｂ３Ｂ４及びＩｇＥを使用してイ
ムノプレシピテーションし、ビーズを緩衝液（トリス−
グリシンｐＨ２．３）で溶離し、中和後、試料をＳＤＳ
−ＰＡＧＥ試料緩衝液中で５分間煮沸し、１５％ＰＡＧ
Ｅにロードした。ニトロセルロースフィルターにブロッ
ティングした乾燥ゲルを、オートラジオグラフフィルム
に種々の時間暴露させた。

【００３６】実施例２ マウスＲＮＡ分析 細胞ＲＮＡを、２つ異なる方法で分析した：１）総又は
ポリＡ ＲＮＡのドットブロッティング及び２）ＰＣＲ
（ポリメラーゼ鎖反応）による増幅を用いた逆転写酵素
法によるｃＤＮＡ合成。

【００３７】ドットブロッティングでは、試料を連続希
釈し、特異的ＣＤ２３プローブとハイブリダイゼーショ
ンした。この方法では、極めてストリンジェントな条件
で洗浄を行った（０．１Ｘ ＳＳＣ、０．１ＳＤＳ、６
２℃で３０’）。ＣＤ２３転写物を、ＣＴＬ２以外の試
験した全てのＴ細胞試料で検出された。対照試料（肝臓
ＲＮＡ及び３種のマクロファージ細胞系）は、ＣＤ２３
転写物に関して陰性であることが判明した。

【００３８】逆転写酵素−ポリメラーゼ 連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ） ＲＴ−ＰＣＲの３０サイクル後、ＣＤＣ３５から得た、
ポリＡ ＲＮＡ、Ｔ細胞クローン（表面でＣＤ２３を発
現するように誘発できる）は、６２２ｂｐ生成物を生
じ、この生成物は、臭化エチジウム染色アガロースミニ
ゲルで視覚化された。同条件下で、マクロファージ細胞
系は、ＣＤ２３について陰性であり、鋳型なしで行った
ＰＣＲ対照も陰性であった。６２２ｂｐ生成物は、マウ
スＢ細胞においては予測された知見であるが、マウスＴ
細胞では新規な知見である。

【００３９】プライマー３及び６を使用したＲＴ−ＰＣ
Ｒ（プライマー配列に関する表２参照）は、単一ラウン
ドのＰＣＲ反応（４０サイクル）において、サザンブロ
ッティングにより視覚化された７Ｔ細胞試料のうちの６
細胞試料において、９３６ｂｐ断片を生じた。ハイブリ
ダイゼーション条件及び洗浄は極めてストリンジェント
（０．１Ｘ ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、６２℃で３
０’）であり、検出には、ＣＤ２３Ｂ細胞ｃＤＮＡプロ
ーブを使用した。Ｔ細胞から得られた９３６ｂｐＰＣＲ
生成物の構造を決定するために、最初はＣＤＣ３５から
ＰＣＲ生成物（Ｔ細胞クローン）として分離し、一連の
ネステッド増幅において、全長９３６ｂｐの重複断片が
得られた。これらの断片を分離し、ヌクレオチド配列を
決定した。他のＴ細胞試料のＲＴ−ＰＣＲ生成物につい
て同様な手法を行った。

【００４０】Ｔ細胞及びＢ細胞から得たＣＤ２３の細胞
質及び膜内外領域を、ヒトＣＤ２３と同様に検討して
５’領域における異質性を見出した。これらの領域に関
する特異的プライマーを形成し、同じ鋳型と実験条件を
用いて平行実験を実施した。表２に記載のプライマー１
及び５を初期ＰＣＲ反応に使用し、２５サイクルのＰＣ
Ｒを行った。

【００４１】得られたＴ細胞ＣＤ２３関連生成物は、臭
化エチジウム染色ゲル電気泳動により異質であることが
分かった。２Ｔ細胞源（１Ｃ９及びＴＨＹＭＵＳ）にお
いて、３種以下のＰＣＲ生成物が存在し、一方、他の２
試料（ＣＤＣ３５及びＥＬ４）では、単一ＰＣＲ生成物
のみが検出された。予測された７１６ｂｐの上バンド
（バンド１）と予測されなかった５９６ｂｐの下バンド
（バンド３）との間の分子量差は、１２０塩基対であ
る。中央生成物（バンド２）は、予測された上バンドに
おける生成物よりも約５０塩基対小さかった。Ｂ細胞の
うち、１つの系（ＷＥＨＩ２７９）は３つのバンドを示
したが、他のＢ細胞試料（Ｂ５３）（ＩｇＥハイブリド
ーマ）は単一バンドであった。

【００４２】これらの結果から、（ａ）ＣＤ２３関連転
写物がマウスＴ細胞だけでてくＢ細胞にも存在するこ
と；及び（ｂ）ＣＤ２３転写物の観察されたパターンは
ヘテロジニアスであることが明らかである。 実施例３ ＣＤ２３ＰＣＲ生成物のＤＮＡ配列分析 Ｔ細胞及びＢ細胞から得たＰＣＲ生成物のバンド１、
２、及び３についてＤＮＡ配列分析を実施した。数種の
マウスＴ細胞源から得られたバンド１から、Ｂ細胞ｃＤ
ＮＡの公表されている配列のヌクレオチド１１５６〜１
７５（アミノ酸３２７〜１）と同一である配列が得られ
た（エクソン３が示されている図１並びに図３及び４参
照）。

【００４３】下バンドを生じる３細胞系（ＡＫＲ、１Ｃ
９及びＷＥＨＩ ２７９）（バンド３）について、ＤＮ
Ａ配列を決定した。これらの３試料は、互いに同一であ
ることが判明した。公表されているＢ細胞ＣＤ２３のＤ
ＮＡ配列と比較して、これらの３試料の各々の配列は、
１２０塩基を欠いていることが分かった。これは、エク
ソン３（ヌクレオチド位置１９７〜３１６）の欠失であ
ることが分かった。エクソン２とエクソン４の間に新し
いスプライシングジョイントが形成されたため、ヒスチ
ジン（ｃＤＮＡ位置４８）からアスパラギン酸へのアミ
ノ酸における予測された変化がある。（図１）図５及び
図６での配列。

【００４４】ＣＤ２３の領域の公知の配列及び機能に基
づいてある種のＴ細胞及びＢ細胞においてエクソン３を
欠失すると、トランスメンブレンや細胞質セグメントの
アンカー領域をもはやコードしない転写物が得られた。
このトランケート転写物は、発現により、オリジナルの
細胞外領域にスプライシングし、位置４８がヒスチジン
からアスパラギン酸に変化したさらなる差異がある細胞
質尾部のオリジナルのアミノ酸１〜７のみをコードして
いる。

【００４５】このトランケートＣＤ２３関連生成物の親
水性プロフィール（図１７〜１８）により、ＣＤ２３の
可溶性分泌形態であることが確認される。以前はタンパ
ク質分解により生じると考えられていた可溶性ＣＤ２３
は、ＩｇＥ、Ｂリンパ球のＧ０〜Ｇ１の進行及び初期ヒ
ト骨髄前駆体及びプロ胸腺細胞〜胸腺細胞の両方の分化
を含む多数の機能を有する。このタンパク質の精製及び
最終的な製造は、これらの全てのプロセスの研究に役立
つであろう。

【００４６】中間サイズのＰＣＲ生成物（バンド２、図
１並びに図７及び８）は、ＤＮＡ配列分析、ＰＣＲマッ
ピング及び分子量分析により特性付けされた。これらの
研究の結果は、この生成物は、細胞質ドメインのアンカ
ー領域と膜内外セグメントの５’半分を欠いていること
を示している。この転写物は、エクソン３の中央におけ
るヌクレオチド位置２７３〜２７８に隠蔽スプライシン
グ部位を使用することにより得られる。このトランケー
ト転写物は、ＣＤ２３の膜スパンニングセグメントの１
３疎水性アミノ酸をコードするエクソン３の３’部を含
有している。このようなスプライスを有する生成物の予
測分子量は、バンド２（図１並びに図７及び８）におい
て得られた観察生成物とよく一致している。この転写物
の生理学的重要性は未知であるが、異なる配向、おそら
くＩ型膜タンパク質の配向をとるタンパク質をコードす
ることができるであろう。

【００４７】実施例４ ヒトＣＤ２３分析 細胞系 この研究で使用したヒト細胞系を、京都大学のＪｕｎｊ
ｉ Ｙｏｄｏｉ博士、及びＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ
Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、
メリーランド州ロックビル）から入手した。

【００４８】細胞系を、表３にまとめて示す。

【００４９】

【表３】 表３ ヒト細胞系 ―――――――――――――――――――――――――――――――――――細胞系 特性 ８８６６ Ｂ細胞系、Ｅｐｓｔｅｉｎ Ｂａｒｒ Ｖｉｒｕｓ Ｔｒａｎｓ ｆｏｒｍｅｄ、Ｌａｍｓｏｎ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １２５ ：２９３（１９８０） ＭＴ−２ Ｔ細胞系、ＣＤ４＋、ＨＴＬＶ＋、Ｃｏｒｄ Ｏｒｉｇｉｎ、Ｍ ｉｙｏｓｈｉ等、Ｎａｔｕｒｅ ２９４：７７０〜７７１（１９ ８１） ＭＴ−１ Ｔ細胞系、ＣＤ４＋、ＨＴＬＶ＋、Ｍｉｙｏｓｈｉ等、Ｇａｎｎ ７２：９７８〜９８１（１９８１） ＥＤ Ｔ細胞系、ＨＴＬＶ＋、前田等、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ． １６２ ：２１６９〜２１７４（１９８６） ＡＴＬ−２ Ｔ細胞系、ＨＴＬＶ＋、前田等、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ． １６２ ：２１６９〜２１７４（１９８６） ＭＯＬＴ４ Ｔ細胞系、ＡＬＬ、ＨＴＬＶ−、Ｓｕｇａｍａｒａ等、Ｉｎｔ． Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ３４：２２１〜２２８（１９８４） ＪＵＲＫＡＴ Ｔ細胞系、ＡＬＬ、ＨＴＬＶ−、Ｓｕｇａｍａｒａ等、Ｉｎｔ． Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ３４：２２１〜２２８（１９８４） Ｕ９３７ 単球様細胞系、Ｒａｌｐｈ等、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ． １４３： １５２８（１９７６） ――――――――――――――――――――――――――――――――――― ヒトＢリンパ球におけるＣＤ２３にはＡ（アルファ）型
とＢ（ベータ）型があり、これらは、アミノ酸配列にお
いて、エクソンを選択使用したためによる、原形質内部
の最初の６アミノ酸のみが異なるだけである（図６参
照）。Ａ型は異なる最初の７アミノ酸をコードし、一
方、Ｂ型の最初の６アミノ酸が異なる。アミノ酸及びｃ
ＤＮＡ配列の残部は、同一である。２つの型のｃＤＮＡ
は、単に最初の６アミノ酸が異なるだけでなく、ｃＤＮ
Ａの５’非翻訳領域においてもコードしている。Ａ型非
翻訳領域は、顕著に長く、約１８５非翻訳塩基であり、
コード領域が位置１８６から始まる。Ｂ型は６５非翻訳
塩基であり、コード領域は位置６６から始まる。図１０
に、Ａ型とＢ型のｃＤＮＡを比較して示す。両方のｃＤ
ＮＡの垂直線の下流の配列は同一である。アルファ型は
実質的にＢリンパ球で発現するのに対して、ベータ型は
Ｂリンパ球及び他の細胞のＩｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ４
により誘発される。

【００５０】可溶ＣＤ２３の測定 可溶ＣＤ２３（細胞結合せず且つ培養上清に存在するＣ
Ｄ２３として定義される）が、酵素結合免疫吸着剤アッ
セイ（ＥＬＩＳＡ）により検出された。ＣＤ２３につい
ての異なるエピトープに特異的な２種のモノクローナル
抗ＣＤ２３抗体を用いたサンドイッチ法を使用した。

【００５１】細胞系８８６６及びＭＴ−２を、細胞１Ｘ
１０個／ｍｌの濃度で、培地において３７℃で７２時間
培養した。培養７２時間での細胞生存度は５０％未満で
あり、その後上清８０ｍｌを集め、４℃に冷却し、ミリ
ポアフィルター（排除分画、１０，０００）を用いた超
遠心分離により濃縮した。濃縮物を、ミリポアフィルタ
ー（排除分画、３０，０００）で分画した。濃縮物を、
新しい３０，０００分画フィルターで再ろ過した。濃縮
直後、濃縮物２ｍｌを、イムノアッセイによりＣＤ２３
の存在について分析した。

【００５２】９６ウエルプレート（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｎ
ＩＩ、Ｄｙｎａｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
社製）に、０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）におい
て、精製抗ＣＤ２３モノクローナル抗体２μｇ／ｍｌの
１００μｌ／ウエルで、４℃で一晩塗布した。ウエル
を、次に０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、０．１％ウシ血清
を含有するＰＢＳで洗浄し、そして２％ＢＳＡを含むＰ
ＢＳで３７℃で３時間塗布した。ウエルを洗浄し、試料
を各ウエルに添加した。各試料を、３重反復において、
未希釈又は１：２、１：４及び１：８希釈で処理した。
試料５０μｌを、各ウエルに添加し、３７℃で３時間イ
ンキュベーションした。プレートを洗浄し、生物接合抗
ＣＤ２３モノクローナル抗体５０μｌを各ウエルに添加
した。プレートを３７℃で３時間インキュベーション
し、洗浄し、アルカリ性ホスファターゼ接合アビビン
（Ｃａｐｐｅｌ、ペンシルベニア州ウエストチェスタ
ー）５０μｌとともにインキュベーションし、４℃で３
時間インキュベーションし、洗浄し、１ｍｇ／ｍｌホス
ファターゼ基質（Ｓｉｇｍａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ
ｓ、ミズーリ州セントルイス）とともに、室温で４５分
間インキュベーションした。Ａ４０５をＭｉｃｒｏｐｌ
ａｔｅ Ａｕｔｏｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎ
ｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて測定し、データを、Ｌｏ
ｔｕｓ １−２−３のＷｉｎｄｏｗｓ Ｒｅｌｅａｓｅ
１．０（Ｌｏｔｕｓ社、マサチューセッツ州ケンブリ
ッジ）を用いて分析し、グラフィックをＷｉｎｄｏｗｓ
用Ｆｒｅｅｌａｎｃｅ Ｇｒａｐｈｉｃｓ、Ｒｅｌｅａ
ｓｅ １．０（Ｌｏｔｕｓ）で作成した。組み換えヒト
可溶ＣＤ２３を、対照標準としてと品質管理に使用し
た。このアッセイの感度を測定したところ、２ｎｇ／ｍ
ｌであった。

【００５３】ＣＤ２３プローブ ＣＤ２３プローブを、ｃＤＮＡ ｐＬ２３．６を含有す
るＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミド構造物１０ｎｇを鋳
型として使用したＰＣＲにより合成した。Ａ型及びＢ型
並びに各トランケート生成物に特異的な一つのプローブ
を使用した。図９参照。

【００５４】逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応 細胞系のポリＡ ｍＲＮＡを、Ｆａｓｔｒａｃｋキット
（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）かＱｕｉｃｋＰｒｅｐキット
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて抽出した。第一鎖の合
成とＰＣＲを、マウス実験と同様にして実施した。但
し、唯一の相違点は、ヒトでの研究では「ホットスター
ト」プロトコールを使用したことであった。簡単に述べ
ると、ＣＲ緩衝液、プライマー及びｄＮＴＰの混合物の
入った試験管を８０℃にし、鋳型を添加した後、ｔａｑ
ポリメラーゼを添加した。サイクルプログラムと条件
は、マウスの研究について記載したのと同じであった。

【００５５】ＤＮＡ配列分析 方法はマウスの分析についてと同じであり；ヒトの研究
について使用されるプライマーを、以前に記載され且つ
マウス型と相同であるＣＤ２３のヒトＡ型及びＢ型の公
表されているｃＤＮＡ配列に基づいて説明されているよ
うにして合成した。横田等、Ｔｗｏ Ｓｐｅｃｉｅｓ
ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｆｃｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｈ（Ｆ
ｃεｒＩＩ／ＣＤ２３）：Ｔｉｓｓｕｅ−Ｓｐｅｃｉｆ
ｉｃ及びＩ１−４ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｒｅｇｕｌａｔ
ｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ６５
Ｃｅｌｌ ６１１〜６１８（１９８８）（ここに開示
されている内容は、引用することにより本明細書の開示
の一部とされる）、及びＧｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓ
ｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｍ２３５６２配列番号：２（位
置１１２〜１０３７）Ａ型 配列番号：５（位置７〜１
０２５）Ｂ型。

【００５６】ヒトについての研究に使用したプライマー
を、ｃＤＮＡについてのＡにおけるハイブリダイゼーシ
ョン位置とともに、表４に示す。

【００５７】

【表４】 表４ プライマーの配列 ――――――――――――――――――――――――――――――――――― ヌクレオチド ハイブリダイゼーション位置（ｃＤＮＡ） プライマーヌクレオチド配列 ♯ ７（Ｂ型） ５’GCGGGGACGCAATAGAGTCAGAGGC ３’ Ｂ （配列番号：５の７） １６３（Ａ型） ５’GGAAGGATCCAAACAAGACTGCCATGG ３’ １ （配列番号：３の５１） ５’GTGACATCTGAACAACCTGG３’ ７２８（Ａ型） ５’GGAGCCCTTGCCAAAATAGTAGCAC ３’ ４ （配列番号：３の６１６） ７８４（Ａ型） ５’GTCCTGTTCCTTTTGGCTGTGGATGC３’ ５ （配列番号：３の６７２） ――――――――――――――――――――――――――――――――――― 最初の２つのプライマーはコード（センス）鎖と同一で
あり、最後の３つのプライマーは相補（アンチセンス）
鎖と一致する。プライマー＃３は配列の目的のためのみ
に使用した。（＃）はプライマーの確認番号であり、そ
の結合部位を示す。ＰＣＲプライマーと予測される増幅
生成物については、図１１を参照のこと。

【００５８】実施例５ ＲＮＡ分析ＲＴ−ＰＣＲ結果 ヒトＣＤ２３のＡ型及びＢ型の確認について上記で説明
したプライマーを用いたＢ細胞系及びＴ細胞系ｍＲＮＡ
のＲＴ−ＰＣＲ（図９）： ａ）ヒトＣＤ２３のＡ型用５’プライマー、Ａ型ｃＤＮ
Ａの配列位置１６３〜１８９及び一般的な３’プライマ
ーにハイブリダイゼーションする（プライマー１）、Ａ
型ｃＤＮＡの配列位置７８４〜８０９にハイブリダイゼ
ーションするプライマー５’を用いて、Ｂ細胞系８８６
６から、エクソン３を含むＣＤ２３生成物用プライマー
の場合の予測された増幅サイズである６４７ｂｐの生成
物が得られた。しかしながら、２つの追加の予測されな
い生成物、一つが５３３ｂｐであって第二が約５７０／
５８０（図９には示されていない）が検出された。ＰＣ
Ｒ生成物は、アガロース臭化エチジウム染色ゲルで視覚
化された。同じプライマーと実験条件で、Ｔ細胞試料Ｍ
Ｔ−１、ＭＴ−２、ＡＴＬ−２、ＥＤ、ＭＯＬＴ４及び
好酸球細胞系ＥＯＬ３は陰性であった。

【００５９】ｂ）Ｂ型ｃＤＮＡのｃＤＮＡ位置１〜２５
にハイブリダイゼーションするＢ型ヒトＣＤ２３に特異
的な５’プライマーと、同じ３’プライマー、プライマ
ー５（Ｂ型の位置６６１及び６８６に相当するＡ型の位
置７８４〜８０９にハイブリダイゼーションする）を用
いて、Ｂ細胞系８８６６から、予測されたサイズである
６８６ｂｐの生成物が得られた。しかしながら、２つの
追加の予測されない生成物、サイズ約５７２ｂｐ及び６
１０／６２０ｂｐ（図９には示されていない）が得られ
た。

【００６０】ｃ）また、好酸球細胞系ＥＯＬ３からも、
６８６ｂｐ生成物が得られた。ＲＴ−ＰＣＴにより、Ｂ
型のＣＤ２３がヒト好酸球細胞において確認されたのは
最初であるので、これはいままでにない結果である。 ｄ）Ｂ型に特異的な５’プライマーを使用することによ
り、Ｔ細胞系ＭＴ−２から、Ｂ細胞について予測された
結果であるがＴ細胞では新規な知見である６８６ｂｐの
生成物と別のバンド５７２ｂｐが得られた。

【００６１】これらの結果から、Ａ型ヒトＣＤ２３のｍ
ＲＮＡはヒトＢ細胞系８８６６で発現すること、及び２
つのさらなるＡ型関連転写物も存在することが明らかで
ある。また、これらの結果から、Ｂ型ヒトＣＤ２３のｍ
ＲＮＡがＢ細胞系８８６６、Ｔ細胞系ＭＭＴ−２及び好
酸球系ＥＯＬ−３で発現することが明らかである。さら
なるＢ型関連転写物が、Ｂ細胞系８８６６及びＴ細胞系
ＭＴ−２、ＭＴ−１で確認された。

【００６２】ＰＣＲ法の特異性及び感度を向上させるた
めに、「ネステッド」ＰＣＲ法も使用された。新規な
３’プライマー、第一ラウンドのＰＣＲに使用した３’
プライマーの７１ｂｐ上流に位置するプライマー４（Ａ
型のｃＤＮＡ位置７０４〜７２８をハイブリダイゼーシ
ョンする）を、ネステッド第二ラウンドに使用した。Ａ
型ヒトＣＤ２３についてのネステッド実験の結果は、以
下の通りである： ａ）ヒトＡ型ＣＤ２３細胞に特異的なプライマーを用い
て、８８６６細胞系から４種のＰＣＲ生成物が得られ
た。ヒトＣＤ２３Ａ型については予測された５７６ｂｐ
生成物（６４７〜７１）が得られたが、さらなる生成物
４６２ｂｐ及び５００ｂｐが存在していた。これらの生
成物は、予測された通り、単一ラウンドのＰＣＲにより
得られた他のトランケート生成物よりも７１ｂｐ短かっ
た。このサイズがより小さいことにより、新規な内部
３’プライマーのプライミング部位がオリジナルな３’
プライミング部位よりも７１ｂｐ上流であった。

【００６３】ｂ）Ａ型ヒトＣＤ２３に特異的なプライマ
ーを用いて、ＥＯＬ３細胞系から、４６２ｂｐの単一生
成物が得られた。Ｂ細胞において検出された５０１ｂｐ
及び５７６ｂｐの生成物は、好酸球細胞系には検出され
なかった。 ｃ）Ｔ細胞系は、陰性であった。 ネステッドＰＣＲ実験におけるＢ型ヒトＣＤ２３につい
ての結果は、以下の通りである： ａ）８８６６細胞系から、３種のＰＣＲ生成物が得られ
た。一つは、６１５ｂｐ生成物（予測された増幅サイ
ズ）であった。さらに、５０１ｂｐ及び５４０／５５０
ｂｐ断片が存在し、単一ラウンドのＰＣＲの２５サイク
ル中に形成した２つのさらなる生成物（５３３及び５７
０／５８０）が観察されることと関連がある。サイズが
より小さいことから、内部３’プライマーについてのネ
ステッドＰＣＲにおけるプライミング部位は、オリジナ
ルプライミング部位から７１ｂｐ上流である。

【００６４】ｂ）ネステッドＰＣＲにおいて、ＥＯＬ−
３系から、３種の生成物、６１５ｂｐの予測された生成
物並びに予測されない生成物５０１ｂｐ及び５４０／５
５０ｂｐが得られた。この結果は、Ｂ細胞系の結果と同
じである。 ｃ）Ｔ細胞系ＭＴ−２及びＥＤから、６１５ｂｐの生成
物（Ｂ細胞ＣＤ２３について予測された増幅サイズであ
るがＴ細胞においては新規な結果である）が得られた。
また、１つのＴ細胞系も、２つのさらなる生成物５０１
ｂｐ及び５４０／５５０ｂｐが得られた。

【００６５】ｄ）Ｔ細胞系ＭＴ−１から、５０１ｂｐ生
成物が得られた。 ｅ）Ｔ細胞系ＡＴＬ−２は、ネステッドＰＣＲにおいて
でさえ、Ｂ型ＣＤ２３転写物に関して陰性であった。即
ち、トランケートＣＤ２３生成物の存在は、ＲＮＡ保護
アッセイよりも１００倍感度がよいＲＴ−ＰＣＲ及びＲ
Ｔ−ＰＣＲよりも最大１０倍感度がよいネステッドＰＣ
Ｒと関連がある。表５に、両方の試験を通して相関があ
るＰＣＲ生成物を示す。図１１及び９も参照されたい。

【００６６】

【表５】 表５ イソホームＡ イソホームＢ イソホームＣ イソホームＤ 予測された 予測された エクソン３ エクソン３ Ａ型 Ｂ型 のないＡ型 のないＢ型 ＲＴ−ＰＣＲ ６４７ｂｐ ６８６ｂｐ ５３３ｂｐ ５７２ｂｐ ネステッド ５７６ｂｐ ６１５ｂｐ ４６２ｂｐ ５０１ｂｐ ＰＣＲ（Ｘ−７１） 実施例６ ヒトＣＤ２３のＤＮＡ配列分析 Ｂ細胞系８８６６から得られた６４７ｂｐ及び５７６ｂ
ｐＰＣＲ生成物の配列は、Ａ型ＣＤ２３の公表された配
列と同一であることが判明した。この配列の位置１８６
〜８００を示している図１３を参照されたい。また、５
３３及び４６２ｂｐ生成物も、エクソン３の全長が検出
されたＣＤ２３配列と同一であった。エクソン２とエク
ソン４との間の新規に形成されたスプライシング部位に
より、この転写物によりコードされた予測されたアミノ
酸配列における変化を生じ、アスパラギン酸の代わりに
ヒスチジンが置換していた。図１３及び１５を参照され
たい。

【００６７】８８６６及びＥＯＬ３において、４６２ｂ
ｐネステッドＰＣＲ生成物も、トランケート転写物であ
り、そこから全てのエクソン３が欠失していることが分
かった。このＣＤ２３のトランケート型は、膜内外セグ
メントの全て及び細胞質尾部の一部分を欠いていた。こ
れらのエクソン３欠失トランケート転写物は、可溶形態
のＣＤ２３であるタンパク質をコードする。

【００６８】Ｂ型ヒトＣＤ２３に特異的なプライマーを
用いて形成した断片の配列から、８８６６、ＥＯＬ３及
びＭＴ−２からの６８６ｂｐ生成物は、Ｂ型ＣＤ２３に
ついて公表されている配列と同一であることが分かっ
た。これらの知見はＢ細胞については予測されるが、好
酸球細胞系及びＴ細胞系については新規である。６１５
ｂｐネステッドＰＣＲ生成物のヌクレオチド配列分析
が、Ｂ細胞系（８８６６）、好酸球細胞系（ＥＯＬ−
３）及びＴ細胞系（ＭＴ−２及びＥＤ）から、これらの
生成物はＢ型ＣＤ２３の公表された配列と同一であるこ
とが分かった。図１４（Ｂ型ｃＤＮＡ位置６６〜Ａ型位
置８００）を参照されたい。これは、Ｂ細胞系について
は予測された結果であるが、好酸球及びＴ細胞系につい
ては新規な知見である。

【００６９】Ｂ細胞及び一Ｔ細胞系からの５７２ｂｐ断
片並びにＢ細胞系、好酸球細胞系及び一Ｔ細胞系からの
５０１ｂｐネステッドＰＣＲ断片をヌクレオチド配列分
析したところ、全てにおいて、この転写物がエクソン３
全体を欠失していることが分かった。図１６を参照され
たい。エクソン３欠失の他に、位置４５にヒスチジンか
らアスパラギン酸への予測された変化がある。

【００７０】Ａ型及びＢ型の存在を超えてヒトＣＤ２３
が不均一であることが、ＲＴ−ＰＣＲ実験及び配列分析
により示唆される。これらの知見は、Ｂ細胞系だけでな
くＴ細胞系及び好酸球系全てが、さらなるＣＤ２３関連
転写物を有することを示している。これらの転写物の一
つは、エクソン３が完全に欠失したトランケート型ＣＤ
２３である。エクソン３の欠失により、膜結合せず且つ
可溶ＣＤ２３として放出されるＣＤ２３タンパク質をコ
ードする転写物を生じるであろう。

【００７１】実施例７ 可溶性ＣＤ２３タンパク質の産生 ＣＤ２３についての遺伝子配列を精製分離すると、分子
生物学の当該技術分野において一般的に公知であり且つ
一般的に実施されている多数の組み換え法を使用して、
このポリペプチドを大量生産できる。第一の方法では、
プラスミドシャトルベクターを形成する。この方法で
は、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性遺伝子を含
有するＰＢＲ３２２等のバクテリアプラスミドを制限酵
素で切断し、所望の外来ＤＮＡ断片（ここでは可溶形態
ＣＤ２３ＤＮＡセグメント）をプラスミドにより接合さ
れる。次に、プラスミドベクターを、ＰＥＧの存在下で
Ｅ．ｃｏｌｉ等の受容菌宿主に形質転換して、挿入した
外来ＤＮＡ断片のバクテリアによる発現を可能にする。

【００７２】別の組み込み法では、外来ＤＮＡ所望配列
をバクテリアファージラムダベクターに配置する。外来
遺伝子を挿入すると、ファージを所望の宿主細胞を感染
させ且つ形質転換できるようになり、ここでも宿主が外
来ＤＮＡ可溶ＣＤ２３遺伝子を発現できる。これらの組
み込み法を使用することにより、バクテリア宿主細胞を
形質転換してヒト又はマウス型可溶ＣＤ２３を含有さ
せ、このタンパク質を発現及び産生できる。バクテリア
についての複製速度が極めて高いことから、所望のタン
パク質が、これらの方法により大量に再生産できる。

【００７３】生体外翻訳（図１９） ４種のＣＤ２３／ＦｃεＲＩＩ ｃＤＮＡ’ｓ（イソホ
ームＡ、Ｂ、Ｃ及びＤ）を、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ Ｉ
ＩのＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングした。これらの
ベクターを、ＸｈｏＩ消化により線状化し、生体外転写
反応をＴ３ＲＮＡポリメラーゼを用いて実施した。未キ
ャップド転写物を、「Ａｍｂｉｏｎ Ｒｅｔｉｃ Ｌｙ
ｓａｔｅ ＩＶＴ（商標）Ｋｉｔ ｉｎ ｖｉｔｒｏ
Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ」を用いてメーカーの
マニュアルに準じて〔³⁵Ｓ〕メチオニンで翻訳した。
２．５％ＳＤＳ試料緩衝液１０μｌで希釈した試料２．
５μｌを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析した。ゲルを、Ｗｈａ
ｔｍａｎクロマトグラフィー紙上で乾燥させ、オートラ
ジオグラフィーに附した。４種のＣＤ２３／ＦｃεＲＩ
Ｉタンパク質が、予測したサイズで検出された。

【００７４】抗ＣＤ２３／ＦｃεＲＩＩ血清の製造 完全フロインドアジュバントで乳化した組み換え２５ｋ
Ｄａ ＣＤ２３／ＦｃεＲＩＩ １．０ｍｇを、免疫抗
原として３匹のウサギに皮下注射した。さらに、２週間
ごとに、不完全フロインドアジュバントで乳化した同量
の抗原を用いて２回追加免疫した。最終追加免疫してか
ら７日後、カテーテルを頸動脈に入れて採血した。 抗組み換え２５ｋＤａ ＣＤ２３／ＦｃεＲＩＩポリク
ローナル抗体用血清の滴定 ５μｇ／ｍｌ組み換え２５ｋＤａ ＣＤ２３／ＦｃεＲ
ＩＩ ５０μｌを９６ウエルＥ１Ａプレート（Ｃｏｒｓ
ｔｏｒ ３５９０、Ｃｏｒｓｔｏｒ）の各ウエルに添加
し、３７℃で１時間でインキュベーションした。洗浄
後、各ウエルを３％スキムミルク（森永）を含むＰＢＳ
２００μｌとともに、３７℃で１時間インキュベーショ
ンした。ウサギ血清を、スキムミルク１％を含有するＰ
ＢＳで連続希釈し、抗原塗布プレートに添加した。３７
℃で２時間インキュベーションした後、２，０００倍希
釈アルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰ）接合ヤギ抗ウサ
ギＩｇＧ ５０μｌを添加し、３７℃で１時間インキュ
ベーションした。酵素反応を、１．０ｍｇ／ｍｌ ｏ−
フェニレンジアミン溶液５０μｌを添加することにより
開始した。捕捉抗組み換え２５ｋＤａ ＣＤ２３／Ｆｃ
εＲＩＩポリクローナル抗体のタイターを、ミクロプレ
ートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、
Ｗａｋｏ）により、ＯＤ ４９０ｎｍで評価した。３匹
のウサギからのシーア（ｓｅａｒ）は、全て２７０，０
００倍希釈後でさえ、組み換え２５ｋＤａ ＣＤ２３／
ＦｃεＲＩＩと反応することが判明した。

【００７５】ＣＯＳ細胞における発現（図２０） ４種のＣＤ２３／ＦｃεＲＩＩ ｃＤＮＡを、ＳＶ４０
プロモーターの制御下でサブクローニングした。ＣＯＳ
−７細胞を、ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ（ＢｉｏＲａｄ）を
用いたエレクトロポレーションにより各発現ベクター１
０μｇでトランスフェクションした。７２時間後、細胞
を採取し、ＣＤ２３／ＦｃεＲＩＩ発現のレベルについ
てアッセイした。０．５％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ ４０に
可溶化したＣＯＳ−７細胞の溶解産物は、非還元条件下
で１０％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した。ポリ
二フッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒ
ｅ）へエレクトロトランスファー後、膜を、３％スキム
ミルク含有ＰＢＳでブロックし、２，０００倍希釈抗Ｃ
Ｄ２３／ＦｃεＲＩＩ血清とともに、３７℃で２時間イ
ンキュベーションした。ホースラディッシュペルオキシ
ダーゼ標識抗ウサギＩｇＧを、第２抗体として使用し
た。血清と反応性のバンドを、ホースラディッシュペル
オキシダーゼ−ＥＣＬ法（Ａｍｅｒｓｈａｍ）により視
覚化した。４種のＣＤ２３／ＦｃεＲＩＩイソホーム
が、予測されたサイズで検出された。

【００７６】実施例８（予測） 医薬及び治療法 ＣＤ２３の公知の活性及びコード領域に基づいて、収穫
した可溶形態ＣＤ２３を、喘息、アレルギー応答及び寄
生虫に対する反応等のＩｇＥ介在疾病の治療に使用でき
た。上記したように、可溶ＣＤ２３は、結合領域全体を
含有し且つ単に膜アンカー領域を欠失している。適当な
医薬ビヒクルは、疾患を患った患者の系に導入できる錠
剤、等張注射液又は食塩水形態等の形態から選択され
る。

【００７７】薬学的に許容されるビヒクルは、不活性で
あり、医学的に許容され且つ活性成分と適合する固体、
液体又は水性物質でよい収穫したＣＤ２３を投与する目
的に有用である物質である。これらの医薬組成物は、経
口的、静脈内、ＩＶ溶液の貫流注入又は皮下投与でき
る。ＩｇＥの推奨される投与量は、おそらくナノグラム
以下の極少量であろう。投与量は、患者の隔膜における
過剰のＩｇＥの量に応じて、所望の調節応答を達成する
のに効果的な量と等しい。このタンパク質は可溶であり
天然であるので、おそらくヒトには毒性がないであろ
う。疾病の性質に応じて、恐らくＩｇＥを調節するため
の通常の基準に基づき複数の投与が必要であろう。

【００７８】系に存在する追加の可溶形態ＣＤ２３は、
次に相互作用してＩｇＥを停止させ、それによりＩｇＥ
が介在するアレルギー反応から患者を軽減する。ＩｇＥ
と膜結合ＣＤ２３との相互作用のこのプロセスは、当該
技術分野において明らかにされた（Ｎｅｌｍｓ等、「Ｅ
ｎｈａｎｃｅｄ Ｍｅｄｅａｔｅｄ Ｓｕｐｐｒｅｓｓ
ｉｏｎ ｏｆ Ｅｐｓｉｌｏｎ Ｈｅａｖｙ Ｃｈａｉ
ｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ａ Ｍ
ｕｒｉｎｅ ＩｇＥ Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｈｙｂｒｉ
ｄｏｍａ」、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎ． 第２
８巻、第５９９〜６０６頁（１９９１））。この論文で
は、癌細胞をＩｇＥ細胞とともに使用して、ＩｇＥを産
生するハイブリドーマを製造している。このハイブリド
ーマを、次にＣＤ２３を含有するＴ細胞に暴露した。Ｔ
細胞はハイブリドーマと相互作用してＩｇＥの重鎖を停
止させるので、ＣＤ２３が反応してＩｇＥ合成を抑制す
ることが明らかである。したがって、冒されている患者
の系に可溶ＣＤ２３を導入することにより、同様の応答
を生じ、ＩｇＥの合成を遮断するであろう。

【００７９】このタンパク質についてのさらなる使用に
は、ＩｇＥ結合の機構の研究モデル、また、上記したよ
うに生体内と生体外の両方において可溶ＣＤ２３を用い
て生理活性に関して他の分子をスクリーニングするため
のモデルなどがある。

【００８０】

【発明の効果】以上の説明から明らかなように、本発明
によれば、ＩｇＥ結合能を維持する可溶形態のＣＤ２３
の大規模合成が可能となる。このようなタンパク質は、
ＣＤ２３の性質の研究用モデル、そのＩｇＥ結合特性の
研究、Ｂリンパ球の分化の研究における使用等多種多様
な用途がある。また、ＣＤ２３は、アレルギー性疾患及
び他の免疫疾患において薬理学的及び治療薬剤として使
用されるＩｇＥと同じ結合特性を有するであろう化合物
の同定にも使用できる。さらに本発明によれば、増幅用
ウイルス若しくはバクテリア又遺伝子産物にクローニン
グできる可溶性ＣＤ２３遺伝物質配列を含有するベクタ
ーが提供される。

【００８１】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：１００５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ハイポセティカル配列：Ｎｏ アンチセンス：Ｎｏ 配列の特徴： 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：２４．．１００４ 配列 GGAAGGATCC AAACAAGACT GCC ATG GAA GAA AAT GAA TAC TCA GGA TAC 50 Met Glu Glu Asn Glu Tyr Ser Gly Tyr 1 5 TGG GAA CCT CCT AGA AAG CGT TGC TGC TGT GCA AGA CGT GGG ACA CAG 98 Trp Glu Pro Pro Arg Lys Arg Cys Cys Cys Ala Arg Arg Gly Thr Gln 10 15 20 25 CTC ATG TTG GTG GGG CTG CTG AGC ACA GCA ATG TGG GCT GGC CTG CTG 146 Leu Met Leu Val Gly Leu Leu Ser Thr Ala Met Trp Ala Gly Leu Leu 30 35 40 GCC CTG CTT CTT CTG TGG CAC TGG GAA ACG GAG AAG AAT CTA AAA CAG 194 Ala Leu Leu Leu Leu Trp His Trp Glu Thr Glu Lys Asn Leu Lys Gln 45 50 55 CTG GGA GAC ACT GCA ATT CAG AAT GTC TCT CAT GTT ACC AAG GAC TTA 242 Leu Gly Asp Thr Ala Ile Gln Asn Val Ser His Val Thr Lys Asp Leu 60 65 70 CAA AAA TTC CAG AGT AAT CAA TTG GCC CAG AAG TCC CAG GTT GTT CAG 290 Gln Lys Phe Gln Ser Asn Gln Leu Ala Gln Lys Ser Gln Val Val Gln 75 80 85 ATG TCA CAA AAC TTG CAA GAA CTC CAA GCT GAA CAG AAG CAA ATG AAA 338 Met Ser Gln Asn Leu Gln Glu Leu Gln Ala Glu Gln Lys Gln Mer Lys 90 95 100 105 GCT CAG GAC TCT CGG CTC TCC CAG AAC CTG ACC GGA CTC CAG GAG GAT 386 Ala Gln Asp Ser Arg Leu Ser Gln Asn Leu Thr Gly Leu Gln Glu Asp 110 115 120 CTA AGG AAC GCC CAA TCC CAG AAC TCA AAA CTC TCC CAG AAC CTG AAC 434 Leu Arg Asn Ala Gln Ser Gln Asn Ser Lys Leu Ser Gln Asn Leu Asn 125 130 135 AGA CTC CAA GAC GAT CTA GTC AAC ATC AAA TCC CTG GGC TTG AAT GAG 482 Arg Leu Gln Asp Asp Leu Val Asn Ile Lys Ser Leu Gly Leu Asn Glu 140 145 150 AAG CGC ACA GCC TCC GAT TCT CTA GAG AAA CTC CAG GAA GAG GTG GCA 530L ys Arg Thr Ala Ser Asp Ser Leu Glu Lys Leu Gln Glu Glu Val Ala 155 160 165 AAG CTG TGG ATA GAG ATA CTG ATT TCA AAG GGA ACT GCA TGC AAC ATA 578 Lys Leu Trp Ile Glu Ile Leu Ile Ser Lys Gly Thr Ala Cys Asn Ile 170 175 180 185 TGT CCC AAG AAC TGG CTC CAT TTC CAA CAG AAG TGC TAC TAT TTT GGC 626 Cys Pro Lys Asn Trp Leu His Phe Gln Gln Lys Cys Tyr Tyr Phe Gly 190 195 200 AAG GGC TCC AAG CAG TGG ATC CAG GCC AGG TTC GCC TGC AGT GAC CTG 674 Lys Gly Ser Lys Gln Trp Ile Gln Ala Arg Phe Ala Cys Ser Asp Leu 205 210 215 CAA GGG CGA CTA GTC AGC ATC CAC AGC CAA AAG GAA CAG GAC TTC CTG 722 Gln Gly Arg Leu Val Ser Ile His Ser Gln Lys Glu Gln Asp Phe Leu 220 225 230 ATG CAA CAC ATC AAC AAG AAG GAT TCC TGG ATT GGC CTC CAG GAT CTC 770 Met Gln His Ile Asn Lys Lys Asp Ser Trp Ile Gly Leu Gln Asp Leu 235 240 245 AAT ATG GAG GGA GAG TTT GTA TGG TCG GAC GGG AGC CCT GTG GGT TAT 818 Asn Met Glu Gly Glu Phe Val Trp Ser Asp Gly Ser Pro Val Gly Tyr 250 255 260 265 AGC AAC TGG AAT CCA GGG GAG CCC AAT AAC GGG GGC CAG GGT GAG GAC 866 Ser Asn Trp Asn Pro Gly Glu Pro Asn Asn Gly Gly Gln Gly Glu Asp 270 275 280 TGT GTG ATG ATG CGG GGA TCC GGC CAG TGG AAC GAC GCC TTC TGC CGC 914 Cys Val Met Met Arg Gly Ser Gly Gln Trp Asn Asp Ala Phe Cys Arg 285 290 295 AGC TAC TTG GAT GCA TGG GTG TGT GAG CAG CTG GCA ACA TGT GAG ATA 962 Ser Tyr Leu Asp Ala Trp Val Cys Glu Gln Leu Ala Thr Cys Glu Ile 300 305 310 TCT GCC CCC TTA GCC TCT GTG ACT CCA ACA AGG CCC ACC CCA 1004 Ser Ala Pro Leu Ala Ser Val Thr Pro Thr Arg Pro Thr Pro 315 320 325 A 1005

【００８２】配列番号：２ 配列の長さ：３２７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Glu Glu Asn Glu Tyr Ser Gly Tyr Trp Glu Pro Pro Arg Lys Arg 1 5 10 15 Cys Cys Cys Ala Arg Arg Gly Thr Gln Leu Met Leu Val Gly Leu Leu 20 25 30 Ser Thr Ala Met Trp Ala Gly Leu Leu Ala Leu Leu Leu Leu Trp His 35 40 45 Trp Glu Thr Glu Lys Asn Leu Lys Gln Leu Gly Asp Thr Ala Ile Gln 50 55 60 Asn Val Ser His Val Thr Lys Asp Leu Gln Lys Phe Gln Ser Asn Gln 65 70 75 80 Leu Ala Gln Lys Ser Gln Val Val Gln Met Ser Gln Asn Leu Gln Glu 85 90 95 Leu Gln Ala Glu Gln Lys Gln Met Lys Ala Gln Asp Ser Arg Leu Ser 100 105 110 Gln Asn Leu Thr Gly Leu Gln Glu Asp Leu Arg Asn Ala Gln Ser Gln 115 120 125 Asn Ser Lys Leu Ser Gln Asn Leu Asn Arg Leu Gln Asp Asp Leu Val 130 135 140 Asn Ile Lys Ser Leu Gly Leu Asn Glu Lys Arg Thr Ala Ser Asp Ser 145 150 155 160 Leu Glu Lys Leu Gln Glu Glu Val Ala Lys Leu Trp Ile Glu Ile Leu 165 170 175 Ile Ser Lys Gly Thr Ala Cys Asn Ile Cys Pro Lys Asn Trp Leu His 180 185 190 Phe Gln Gln Lys Cys Tyr Tyr Phe Gly Lys Gly Ser Lys Gln Trp Ile 195 200 205 Gln Ala Arg Phe Ala Cys Ser Asp Leu Gln Gly Arg Leu Val Ser Ile 210 215 220 His Ser Gln Lys Glu Gln Asp Phe Leu Met Gln His Ile Asn Lys Lys 225 230 235 240 Asp Ser Trp Ile Gly Leu Gln Asp Leu Asn Met Glu Gly Glu Phe Val 245 250 255 Trp Ser Asp Gly Ser Pro Val Gly Tyr Ser Asn Trp Asn Pro Gly Glu 260 265 270 Pro Asn Asn Gly Gly Gln Gly Glu Asp Cys Val Met Met Arg Gly Ser 275 280 285 Gly Gln Trp Asn Asp Ala Phe Cys Arg Ser Tyr Leu Asp Ala Trp Val 290 295 300 Cys Glu Gln Leu Ala Thr Cys Glu Ile Ser Ala Pro Leu Ala Ser Val 305 310 315 320 Thr Pro Thr Arg Pro Thr Pro 325

【００８３】配列番号：３ 配列の長さ：１０３７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ハイポセティカル配列：Ｎｏ アンチセンス：Ｎｏ 配列の特徴： 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：７５．．１０３７ 配列 ATTGTGCCCG CTGAGTGGAC TGCGTTGTCA GGGAGTGAGT GCTCCATCAT CGGGAGAATC 60 CAAGCAGGAC CGCC ATG GAG GAA GGT CAA TAT TCA GAG ATC GAG GAG CTT 110 Met Glu Glu Gly Gln Tyr Ser Glu Ile Glu Glu Leu 1 5 10 CCC AGG AGG CGG TGT TGC AGG CGT GGG ACT CAG ATC GTG CTG CTG GGG 158 Pro Arg Arg Arg Cys Cys Arg Arg Gly Thr Gln Ile Val Leu Leu Gly 15 20 25 CTG GTG ACC GCC GCT CTG TGG GCT GGC CTG CTG ACT CTG CTT CTC CTG 206 Leu Val Thr Ala Ala Leu Trp Ala Gly Leu Leu Thr Leu Leu Leu Leu 30 35 40 TGG CAC TGG GAC ACC ACA CAG AGT CTA AAA CAG CTG GAA GAG AGG GCT 254 Trp His Trp Asp Thr Thr Gln Ser Leu Lys Gln Leu Glu Glu Arg Ala 45 50 55 60 GCC CGG AAC GTC TCT CAA GTT TCC AAG AAC TTG GAA AGC CAC CAC GGT 302 Ala Arg Asn Val Ser Gln Val Ser Lys Asn Leu Glu Ser His His Gly 65 70 75 GAC CAG ATG GCG CAG AAA TCC CAG TCC ACG CAG ATT TCA CAG GAA CTG 350 Asp Gln Met Ala Gln Lys Ser Gln Ser Thr Gln Ile Ser Gln Glu Leu 80 85 90 GAG GAA CTT CGA GCT GAA CAG CAG AGA TTG AAA TCT CAG GAC TTG GAG 398 Glu Glu Leu Arg Ala Glu Gln Gln Arg Leu Lys Ser Gln Asp Leu Glu 95 100 105 CTG TCC TGG AAC CTG AAC GGG CTT CAA GCA GAT CTG AGC AGC TTC AAG 446 Leu Ser Trp Asn Leu Asn Gly Leu Gln Ala Asp Leu Ser Ser Phe Lys 110 115 120 TCC CAG GAA TTG AAC GAG AGG AAC GAA GCT TCA GAT TTG CTG GAA AGA 494 Ser Gln Glu Leu Asn Glu Arg Asn Glu Ala Ser Asp Leu Leu Glu Arg 125 130 135 140 CTC CGC GAG GAG GTG ACA AAG CTA AGG ATG GAG TTG CAG GTC TCC AGC 542 Leu Arg Glu Glu Val Thr Lys Leu Arg Met Glu Leu Gln Val Ser Ser 145 150 155 GGC TTT GTG TGC AAC ACG TGC CCT GAA AAG TGG ATC AAT TTC CAA CGC 590 Gly Phe Val Cys Asn Thr Cys Pro Glu Lys Trp Ile Asn Phe Gln Arg 160 165 170 AAG TGC TAC TAC TTC GGC AAG GGC ACC AAG CAG TGG GTC CAC GCC CGG 638 Lys Cys Tyr Tyr Phe Gly Lys Gly Thr Lys Gln Trp Val His Ala Arg 175 180 185 TAT GCC TGT GAC GAC ATG GAA GGG CAG CTG GTC AGC ATC CAC AGC CCG 686 Tyr Ala Cys Asp Asp Met Glu Gly Gln Leu Val Ser Ile His Ser Pro 190 195 200 GAG GAG CAG GAC TTC CTG ACC AAG CAT GCC AGC CAC ACC GGC TCC TGG 734 Glu Glu Gln Asp Phe Leu Thr Lys His Ala Ser His Thr Gly Ser Trp 205 210 215 220 ATT GGC CTT CGG AAC TTG GAC CTG AAG GGA GAG TTT ATC TGG GTG GAT 782 Ile Gly Leu Arg Asn Leu Asp Leu Lys Gly Glu Phe Ile Trp Val Asp 225 230 235 GGG AGC CAT GTG GAC TAC AGC AAC TGG GCT CCA GGG GAG CCC ACC AGC 830 Gly Ser His Val Asp Tyr Ser Asn Trp Ala Pro Gly Glu Pro Thr Ser 240 245 250 CGG AGC CAG GGC GAG GAC TGC GTG ATG ATG CGG GGC TCC GGT CGC TGG 878 Arg Ser Gln Gly Glu Asp Cys Val Met Met Arg Gly Ser Gly Arg Trp 255 260 265 AAC GAC GCC TTC TGC GAC CGT AAG CTG GGC GCC TGG GTG TGC GAC CGG 926 Asn Asp Ala Phe Cys Asp Arg Lys Leu Gly Ala Trp Val Cys Asp Arg 270 275 280 CTG GCC ACA TGC ACG CCG CCA GCC AGC GAA GGT TCC GCG GAG TCC ATG 974 Leu Ala Thr Cys Thr Pro Pro Ala Ser Glu Gly Ser Ala Glu Ser Met 285 290 295 300 GGA CCT GAT TCA AGA CCA GAC CCT GAC GGC CGC CTG CCC ACC CCC TCT 1022 Gly Pro Asp Ser Arg Pro Asp Pro Asp Gly Arg Leu Pro Thr Pro Ser 305 310 315 GCC CCT CTC CAC TCT 1037 Ala Pro Leu His Ser 320

【００８４】配列番号：４ 配列の長さ：３２１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Glu Glu Gly Gln Tyr Ser Glu Ile Glu Glu Leu Pro Arg Arg Arg 1 5 10 15 Cys Cys Arg Arg Gly Thr Gln Ile Val Leu Leu Gly Leu Val Thr Ala 20 25 30 Ala Leu Trp Ala Gly Leu Leu Thr Leu Leu Leu Leu Trp His Trp Asp 35 40 45 Thr Thr Gln Ser Leu Lys Gln Leu Glu Glu Arg Ala Ala Arg Asn Val 50 55 60 Ser Gln Val Ser Lys Asn Leu Glu Ser His His Gly Asp Gln Met Ala 65 70 75 80 Gln Lys Ser Gln Ser Thr Gln Ile Ser Gln Glu Leu Glu Glu Leu Arg 85 90 95 Ala Glu Gln Gln Arg Leu Lys Ser Gln Asp Leu Glu Leu Ser Trp Asn 100 105 110 Leu Asn Gly Leu Gln Ala Asp Leu Ser Ser Phe Lys Ser Gln Glu Leu 115 120 125 Asn Glu Arg Asn Glu Ala Ser Asp Leu Leu Glu Arg Leu Arg Glu Glu 130 135 140 Val Thr Lys Leu Arg Met Glu Leu Gln Val Ser Ser Gly Phe Val Cys 145 150 155 160 Asn Thr Cys Pro Glu Lys Trp Ile Asn Phe Gln Arg Lys Cys Tyr Tyr 165 170 175 Phe Gly Lys Gly Thr Lys Gln Trp Val His Ala Arg Tyr Ala Cys Asp 180 185 190 Asp Met Glu Gly Gln Leu Val Ser Ile His Ser Pro Glu Glu Gln Asp 195 200 205 Phe Leu Thr Lys His Ala Ser His Thr Gly Ser Trp Ile Gly Leu Arg 210 215 220 Asn Leu Asp Leu Lys Gly Glu Phe Ile Trp Val Asp Gly Ser His Val 225 230 235 240 Asp Tyr Ser Asn Trp Ala Pro Gly Glu Pro Thr Ser Arg Ser Gln Gly 245 250 255 Glu Asp Cys Val Met Met Arg Gly Ser Gly Arg Trp Asn Asp Ala Phe 260 265 270 Cys Asp Arg Lys Leu Gly Ala Trp Val Cys Asp Arg Leu Ala Thr Cys 275 280 285 Thr Pro Pro Ala Ser Glu Gly Ser Ala Glu Ser Met Gly Pro Asp Ser 290 295 300 Arg Pro Asp Pro Asp Gly Arg Leu Pro Thr Pro Ser Ala Pro Leu His 305 310 315 320 Ser

【００８５】配列番号：５ 配列の長さ：１０２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ハイポセティカル配列：Ｎｏ アンチセンス：Ｎｏ 配列の特徴： 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：６６．．１０２５ 配列 GCGGGGACGC AATAGAGTCA GAGGCCAAAT AGAACAGGAA CTTGGAACAA GCAGAATTTA 60 GCATA ATG AAT CCT CCA AGC CAG GAG ATC GAG GAG CTT CCC AGG AGG 107 Met Asn Pro Pro Ser Gln Glu Ile Glu Glu Leu Pro Arg Arg 1 5 10 CGG TGT TGC AGG CGT GGG ACT CAG ATC GTG CTG CTG GGG CTG GTG ACC 155 Arg Cys Cys Arg Arg Gly Thr Gln Ile Val Leu Leu Gly Leu Val Thr 15 20 25 30 GCC GCT CTG TGG GCT GGC CTG CTG ACT CTG CTT CTC CTG TGG CAC TGG 203 Ala Ala Leu Trp Ala Gly Leu Leu Thr Leu Leu Leu Leu Trp His Trp 35 40 45 GAC ACC ACA CAG AGT CTA AAA CAG CTG GAA GAG AGG GCT GCC CGG AAC 251 Asp Thr Thr Gln Ser Leu Lys Gln Leu Glu Glu Arg Ala Ala Arg Asn 50 55 60 GTC TCT CAA GTT TCC AAG AAC TTG GAA AGC CAC CAC GGT GAC CAG ATG 299 Val Ser Gln Val Ser Lys Asn Leu Glu Ser His His Gly Asp Gln Met 65 70 75 GCG CAG AAA TCC CAG TCC ACG CAG ATT TCA CAG GAA CTG GAG GAA CTT 347 Ala Gln Lys Ser Gln Ser Thr Gln Ile Ser Gln Glu Leu Glu Glu Leu 80 85 90 CGA GCT GAA CAG CAG AGA TTG AAA TCT CAG GAC TTG GAG CTG TCC TGG 395 Arg Ala Glu Gln Gln Arg Leu Lys Ser Gln Asp Leu Glu Leu Ser Trp 95 100 105 110 AAC CTG AAC GGG CTT CAA GCA GAT CTG AGC AGC TTC AAG TCC CAG GAA 443 Asn Leu Asn Gly Leu Gln Ala Asp Leu Ser Ser Phe Lys Ser Gln Glu 115 120 125 TTG AAC GAG AGG AAC GAA GCT TCA GAT TTG CTG GAA AGA CTC CGC GAG 491 Leu Asn Glu Arg Asn Glu Ala Ser Asp Leu Leu Glu Arg Leu Arg Glu 130 135 140 GAG GTG ACA AAG CTA AGG ATG GAG TTG CAG GTC TCC AGC GGC TTT GTG 539 Glu Val Thr Lys Leu Arg Met Glu Leu Gln Val Ser Ser Gly Phe Val 145 150 155 TGC AAC ACG TGC CCT GAA AAG TGG ATC AAT TTC CAA CGC AAG TGC TAC 587 Cys Asn Thr Cys Pro Glu Lys Trp Ile Asn Phe Gln Arg Lys Cys Tyr 160 165 170 TAC TTC GGC AAG GGC ACC AAG CAG TGG GTC CAC GCC CGG TAT GCC TGT 635 Tyr Phe Gly Lys Gly Thr Lys Gln Trp Val His Ala Arg Tyr Ala Cys 175 180 185 190 GAC GAC ATG GAA GGG CAG CTG GTC AGC ATC CAC AGC CCG GAG GAG CAG 683 Asp Asp Met Glu Gly Gln Leu Val Ser Ile His Ser Pro Glu Glu Gln 195 200 205 GAC TTC CTG ACC AAG CAT GCC AGC CAC ACC GGC TCC TGG ATT GGC CTT 731 Asp Phe Leu Thr Lys His Ala Ser His Thr Gly Ser Trp Ile Gly Leu 210 215 220 CGG AAC TTG GAC CTG AAG GGA GAG TTT ATC TGG GTG GAT GGG AGC CAT 779 Arg Asn Leu Asp Leu Lys Gly Glu Phe Ile Trp Val Asp Gly Ser His 225 230 235 GTG GAC TAC AGC AAC TGG GCT CCA GGG GAG CCC ACC AGC CGG AGC CAG 827 Val Asp Tyr Ser Asn Trp Ala Pro Gly Glu Pro Thr Ser Arg Ser Gln 240 245 250 GGC GAG GAC TGC GTG ATG ATG CGG GGC TCC GGT CGC TGG AAC GAC GCC 875 Gly Glu Asp Cys Val Met Met Arg Gly Ser Gly Arg Trp Asn Asp Ala 255 260 265 270 TTC TGC GAC CGT AAG CTG GGC GCC TGG GTG TGC GAC CGG CTG GCC ACA 923 Phe Cys Asp Arg Lys Leu Gly Ala Trp Val Cys Asp Arg Leu Ala Thr 275 280 285 TGC ACG CCG CCA GCC AGC GAA GGT TCC GCG GAG TCC ATG GGA CCT GAT 971 Cys Thr Pro Pro Ala Ser Glu Gly Ser Ala Glu Ser Met Gly Pro Asp 290 295 300 TCA AGA CCA GAC CCT GAC GGC CGC CTG CCC ACC CCC TCT GCC CCT CTC 1019 Ser Arg Pro Asp Pro Asp Gly Arg Leu Pro Thr Pro Ser Ala Pro Leu 305 310 315 CAC TCT His Ser 320

【００８６】配列番号：６ 配列の長さ：３２０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Asn Pro Pro Ser Gln Glu Ile Glu Glu Leu Pro Arg Arg Arg Cys 1 5 10 15 Cys Arg Arg Gly Thr Gln Ile Val Leu Leu Gly Leu Val Thr Ala Ala 20 25 30 Leu Trp Ala Gly Leu Leu Thr Leu Leu Leu Leu Trp His Trp Asp Thr 35 40 45 Thr Gln Ser Leu Lys Gln Leu Glu Glu Arg Ala Ala Arg Asn Val Ser 50 55 60 Gln Val Ser Lys Asn Leu Glu Ser His His Gly Asp Gln Met Ala Gln 65 70 75 80 Lys Ser Gln Ser Thr Gln Ile Ser Gln Glu Leu Glu Glu Leu Arg Ala 85 90 95 Glu Gln Gln Arg Leu Lys Ser Gln Asp Leu Glu Leu Ser Trp Asn Leu 100 105 110 Asn Gly Leu Gln Ala Asp Leu Ser Ser Phe Lys Ser Gln Glu Leu Asn 115 120 125 Glu Arg Asn Glu Ala Ser Asp Leu Leu Glu Arg Leu Arg Glu Glu Val 130 135 140 Thr Lys Leu Arg Met Glu Leu Gln Val Ser Ser Gly Phe Val Cys Asn 145 150 155 160 Thr Cys Pro Glu Lys Trp Ile Asn Phe Gln Arg Lys Cys Tyr Tyr Phe 165 170 175 Gly Lys Gly Thr Lys Gln Trp Val His Ala Arg Tyr Ala Cys Asp Asp 180 185 190 Met Glu Gly Gln Leu Val Ser Ile His Ser Pro Glu Glu Gln Asp Phe 195 200 205 Leu Thr Lys His Ala Ser His Thr Gly Ser Trp Ile Gly Leu Arg Asn 210 215 220 Leu Asp Leu Lys Gly Glu Phe Ile Trp Val Asp Gly Ser His Val Asp 225 230 235 240 Tyr Ser Asn Trp Ala Pro Gly Glu Pro Thr Ser Arg Ser Gln Gly Glu 245 250 255 Asp Cys Val Met Met Arg Gly Ser Gly Arg Trp Asn Asp Ala Phe Cys 260 265 270 Asp Arg Lys Leu Gly Ala Trp Val Cys Asp Arg Leu Ala Thr Cys Thr 275 290 295 Pro Pro Ala Ser Glu Gly Ser Ala Glu Ser Met Gly Pro Asp Ser Arg 290 295 300 Pro Asp Pro Asp Gly Arg Leu Pro Thr Pro Ser Ala Pro Leu His Ser 305 310 315 320

【図面の簡単な説明】

【図１】マウスＣＤ２３イソホームの概略図である。

【図２】マウスｃＤＮＡ配列及び予測されるＰＣＲ生成
物の分離に使用されるプライマーを示す概略図である。

【図３】マウスＣＤ２３のイソホームＡのｃＤＮＡ配列
である。全ての配列に関して、エクソン３は、太文字で
示してある。スプライス接合部位を矢印で示し、下線を
付けた塩基は別のエクソンの使用による配列の変化を示
す。

【図４】マウスＣＤ２３のイソホームＡのｃＤＮＡ配列
である。全ての配列に関して、エクソン３は、太文字で
示してある。スプライス接合部位を矢印で示し、下線を
付けた塩基は別のエクソンの使用による配列の変化を示
す。

【図５】マウスＣＤ２３のイソホームＢのｃＤＮＡ配列
である。

【図６】マウスＣＤ２３のイソホームＢのｃＤＮＡ配列
である。

【図７】マウスＣＤ２３のイソホームＣのｃＤＮＡ配列
である。

【図８】マウスＣＤ２３のイソホームＣのｃＤＮＡ配列
である。

【図９】ヒトＣＤ２３イソホームの概略図である。

【図１０】Ａ型及びＢ型ヒトＣＤ２３の配列の整合を示
す。線より前方の配列は、両方の型について同一であ
る。

【図１１】ヒトＣＤ２３についてのプライマーと予測さ
れるＰＣＲ生成物の概略図である。

【図１２】ヒトＣＤアルファ及びベータイソホームを検
出するのに使用されるプローブの概略図である。

【図１３】エクソン３を包囲する領域についてのアルフ
ァ型ヒトＣＤ２３位置１８６〜８００に関するｃＤＮＡ
配列である（イソホームＡ）。

【図１４】エクソン３を包囲する領域についてのベータ
型ヒトＣＤ２３Ｂ型位置６６〜Ａ型位置８００（Ｂ型位
置６８６）に関するｃＤＮＡ配列である（イソホーム
Ｂ）。

【図１５】エクソン３を包囲する領域についてのイソホ
ームＣヒトＣＤ２３位置１８６〜８００に関するｃＤＮ
Ａ配列であり、スプライス部位が示されている。

【図１６】エクソン３を包囲する領域についてのイソホ
ームＤヒトＣＤ２３Ｂ型位置６６〜Ａ型位置８００（Ｂ
型位置６８６）に関するｃＤＮＡ配列であり、スプライ
ス部位が示されている。

【図１７】マウスＣＤ２３のイソホームＡ及びＢの親水
性プロットである。

【図１８】マウスＣＤ２３のイソホームＡ及びＢの親水
性プロットである。

【図１９】生体外産生のＣＤ２３／ＦｃεＲＩＩイソホ
ームタンパク質の検出を示し、レーン１：陰性対照（Ｒ
ＮＡなし）、レーン２：陽性対照（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｅ
ｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ １−α ＲＮＡ、
５０ｋＤａ）、レーン３：分子サイズマーカー、レーン
４：ＣＤ２３／ＦｃεＲＩＩａ型、レーン５：ＣＤ２３
／ＦｃεＲＩＩａ’型、レーン６：ＣＤ２３／ＦｃεＲ
ＩＩｂ型、レーン７：ＣＤ２３／ＦｃεＲＩＩｂ’型で
ある。分子サイズが、左側に示してある。

【図２０】ＣＯＳ−７細胞において発現されるＣＤ２３
／ＦｃεＲＩＩイソホームのウエスタンブロット分析で
あり、レーン１：対照ベクター、レーン２：ＣＤ２３ａ
型、レーン３：ＣＤ２３ａ’型、レーン４：ＣＤ２３ｂ
型、レーン５：ＣＤ２３ｂ’型である。分子サイズマー
カーが、左側に示されている。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＢＦ 9281−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ０７Ｋ 14/725 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＦ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (71)出願人 596000682 ラファエル・エム・ヌネ Ｒａｆａｅｌ Ｍ． Ｎｕｎｅｚ スイス国 ベルプ、ヒューナーフーバー・ シュトラーセ ＃13 (71)出願人 596000693 松井 稔 京都府京都市左京区菊鉾町326−313 (72)発明者 リチャード・ジー・リンチ アメリカ合衆国 アイオワ、アイオワ・シ ティー、ロッキー・ショアー・ドライヴ 20 (72)発明者 淀井 淳司 京都府京都市左京区北白川西瀬ノ内町39 (72)発明者 ラファエル・エム・ヌネ スイス国 ベルプ、ヒューナーフーバー・ シュトラーセ ＃13 (72)発明者 松井 稔 京都府京都市左京区菊鉾町326−313

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】発現について可溶性イソホームＣＤ２３を
   コードする精製・分離ヌクレオチド配列であって、 ａ）図４（ａ）及び（ｂ）、５（ａ）及び（ｂ）、１２
   （ａ）及び（ｂ）並びに１３（ａ）及び（ｂ）に記載の
   配列又はそれらの相補鎖から実質的になるヌクレオチド
   配列； ｂ）ストリンジェント条件下で（ａ）に記載のヌクレオ
   チド配列にハイブリダイゼーションするヌクレオチド配
   列、からなることを特徴とするヌクレオチド配列。
2. 【請求項２】発現について可溶性イソホームのヒトＣＤ
   ２３をコードし且つエクソン３のないヌクレオチド配列
   から実質的になることを特徴とする精製・分離ヌクレオ
   チド配列。
3. 【請求項３】発現について可溶性イソホームのマウスＣ
   Ｄ２３をコードし且つエクソン３のないヌクレオチド配
   列から実質的になることを特徴とする精製・分離ヌクレ
   オチド配列。
4. 【請求項４】宿主細胞が可溶性ＣＤ２３を発現できるよ
   うに請求項１、２又は３に記載のＤＮＡ配列で形質転換
   したかトランスフェクションした原核又は真核宿主細
   胞。
5. 【請求項５】請求項１、２又は３に記載のＤＮＡ配列を
   含む生理学的機能性環状プラスミド又はウイルスＤＮＡ
   ベクター。
6. 【請求項６】請求項５に記載のＤＮＡベクターで安定に
   形質転換したかトランスフェクションした原核又は真核
   宿主細胞。
7. 【請求項７】膜結合ＣＤ２３のトランスメンブレン親水
   性残基を含まないタンパク質ＣＤ２３の一形態を生じる
   請求項１、２、又は３のヌクレオチド配列。