JPH02441A - 遺伝子複合体及びこれを用いる診断法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、免疫学、遺伝学、癌研究の分野で、特に動物
の癌等の診断・予防・治療に有用な癌関連遺伝子複合体
の発見および当該遺伝子複合体を同定することを特徴と
する癌の診断法に関する。

［従来の技術および発明が解決しようとする問題点］ 免疫遺伝学の研究の進展により、染色体の分子レベルで
の解析が進み、患者との関連性や遺伝子発現のメカニズ
ムが明らかにされつつある。染色体の転座、欠失あるい
は逆位などの染色体異常が、癌、特に血球系細胞の癌に
高頻度に観察されている。たとえば、慢性骨髄性白血病
（Ｃｈｒｏｎｉｃｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ　ｌｅｕｋｅｍ
ｉａ）には、フィラデルフィア（ｐｈ）染色体と呼ばれ
る極めて小型の染色体を特徴的に伴なっていることが古
くから知られ、現在このｐｈ染色体が特有の染色体２２
と染色体９間の転座［しく９；２２）転座］による２２
９−異常染色体であることが明らかになっている。この
転座にはｃ−ａｂｌ癌遺伝子がかかわっており、普通、
染色体９に存在したものがｐｈ染色体に転座したもので
ある。

方、バーキットリンパ腫には染色体８と、染色体２、Ｉ
４．２２のいずれかが転座にかかわっていることが知ら
れ、免疫グロブリン遺伝子がその転座にかかわっている
ことが知られ、またバーキットリンパ腫特有の染色体転
座ｔ（８；１４）　、　ｔ（２；８）およびｔ、（８；
２２）のうち　ｔ（８；１４）転座には、染色体８のｃ
１バ遺伝子とそれぞれ染色体１４の免疫グロブリンＨ鎖
直接遺伝子２のに鎖が、２２の大願が直接関与している
ことが明らかにされてきた。

最近では、慢性Ｂｗｉ胞リンパ腫および白血病では、ｔ
（１１、Ｉｎ）転座、急性ｐｒｅＢｉ胞白血病ではしく
１４、＋８）転座が証明され、その結果新たな発癌遺伝
子ｂｃｌ−１が染色体１１に、履−２が染色体１８に同
定された（辻木賀英；染色体転座と遺伝子の活性化、細
胞工学、第４巻９号、７３２頁〜、１９８５参照）。

他方、免疫グロブリンと基本的な構造が類似のＴ細胞上
の抗原受容体はα鎖およびβ鎖からなり、その遺伝子は
それぞれ染色体１４および染色体７にコードされ、その
うちβ鎖の可変部位は、■β、ＤβおよびＪβの３つの
５ｐｌｉｔ　Ｌ／た遺伝子にコードされており、ＤＮＡ
再配列により完全な活性のある可変部位Ｖ遺伝子が形成
することが知られている（黒沢良和；免疫応答系の多様
性発現機構、蛋白質　核酸　酵素、第３１巻９号、７５
６頁〜、１９８６参照）。しかしながら、このＴｉＩＥ
胞受容鉢受容体胞癌、および癌遺伝子活性化のかかわり
については、世界的に研究が緒についたばかりであり、
明らかにされてはいない。

［問題点を解決するための手段］ かかる研究現状において本発明者らはより広範に癌患者
のＴ細胞受容体のＤＮＡ再配列をつぶさに検討していけ
ば、新たな染色体異常、惹起される発癌メカニズム、そ
してそれに関与する発癌遺伝子等を解明することができ
るわけで、鋭意研究を進めた。また、癌の種類と染色体
異常部位との関係に関する知見がより集積すれば、より
繁用性の高い癌の診断手法が浮かび上がり、新たな診断
法が開発できるものと考えた。

そしてまず、急性Ｔリンパ性白血病患者の細胞のＴ細胞
受容β鎖遺伝子領域のＤＮＡ再配列を詳細に検討したと
ころ、β鎖不変部位Ｃβ１に対するＤＮＡ断片（フラグ
メント）が他の染色体、染色体６に挿入されていること
をつきとめた。

即ち、血清幹細胞がＢ細胞やＴ細胞へと分化していくと
、免疫グロブリンおよびＴ細胞受容体遺伝子領域でＤ−
ＪとかＶ−Ｄといった遺伝子関でのＤＮＡ欠失を伴なう
ＤＮＡ再配列が起る。通常りとＪ、ＶとＤとの間のＤＮ
Ａが細胞から失なわれるのであり、そのＤＮＡがどこか
別の染色体に挿入されたという報告は未だ本発明以前に
は見あたらない。

しかし、ある頻度（例えば１０−’）で偶然どこかに挿
入されても何の不思議もなく、−個体の有するリンパ球
総数が１０′２個であり、あるいはリンパ細胞が短寿命
（数日）であることからして、そのようなことは個体全
体からみれば頻繁に起っていることと考えられる。とこ
ろがそれは、その細胞がクローンとして増えない限り検
出され得ない。

本発明者らは、この現象を発癌と結びつけてけて考える
根拠はここにある。これが癌化と関連あり、クローンと
して増殖したからこそ見つかったのである。Ｔ細胞受容
体のβ鎖遺伝子のみがＪ３．−Ｊβ１−Ｃβ、−Ｄβ２
−Ｊβ２Ｃβ２という二回の繰り返し構造を有している
。

そして遺伝子発現に関連あるＤＮＡセグメント（エンハ
ンサ−）はＪβとＣβの間にある。そこで、Ｄβ、−Ｊ
β２の間のＤＮＡが切り出さね、他の染色体に挿入され
ると、挿入光のＤＮＡ近傍の発癌遺伝子（ｃ−１遺伝子
）等を活性化する可能性があること、また更にＴ細胞の
腫瘍化機序の本体と考えられることから、本発明者らは
、このＣβ１遺伝子を含む複合体遺伝子群が前癌状態、
発癌の１つのマーカーとして価値があり、癌の診断に有
用であることを解明し、本発明を完成した。

本発明の遺伝子複合体は、Ｔ細胞受容体β鎖不変部位を
コードするＣβ、遺伝子を含むＤＮＡ断片が転座した癌
細胞の有する染色体に由来し、Ｃβ１遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片と他の遺伝子とを含むものである。

本発明の遺伝子複合体は、癌細略の有するＣβ１遺伝子
を含むＤＮＡ断片が転座した染色体から、種々の遺伝子
工学的手法により所望のＣβ１遺伝子を含む遺伝子複合
体を直接切り出して、あるいはクローン化して得ること
ができる。

本発明の遺伝子複合体を得るための癌細胞としては、Ｃ
β１遺伝子の染色体への転座が起っているものであわば
どのようなものでも利用可能であり、例えば急性Ｔリン
パ性白血病細胞、成人性Ｔリンパ性白血病細胞等から染
色体へのＣβ１遺伝子転座が起きているものを選択して
用いれば良い。

Ｃβ１遺伝子の染色体への転座は、染色体の構成を解析
することにより確認できる。例えば、染色体を適当な制
限酵素で消化して得られる消化物をＣβ、遺伝子プロー
ブを用いたサザーンハイブリダイゼーション法により分
析して、染色体中へのＣβ１′Ｊ１伝子の転座を検出で
きる。その際、例えばＤβ、プローブ、Ｊβ２プローブ
を用いて染色体由来のＤＮＡ断片を分析することによっ
て、Ｄβ−Ｊβあるいは■β−Ｄβ再配列の存在を確認
することは、Ｃβ１遺伝子の転座をサポートするうえで
望ましい。

これらのプローブは、例えばマニアナイスのヒト遺伝子
ライブラリーから、適当なＴ細胞受容体β鎖遺伝子のｃ
ＤＮＡクローンをプローブとして使用したプラークハイ
ブリダイゼーション法により得たクローンから適当な制
限酵素で切り出したもの等が利用できる。

本発明の遺伝子複合体のＣβ、遺伝子を含むＤＮＡ断片
と複合化した遺伝子としては、ｃ−ｍ遺伝子（Ｋｌｅｍ
ｐｎａｕｅｒに−Ｈ，ｅｔ　ａｌ；Ｃｅ１１．３７，５
３７．１９８４）　、　ｓｙｎ、ｒｏｓ、ｐｉｍ等の発
癌遺伝子などを挙げることができる。

本発明の遺伝子複合体は、癌細胞中のマーカーとしての
Ｃβ、遺伝子の検出用技術のへ開発に用いる試料として
、あるいはそれ自身を含む癌のＤＮＡ診断用試薬あるい
はプローブとして有用であるまた、上述のようにＣβ１
遺伝子を含むＤＮＡ断片と発癌遺伝子とが複合化されて
いることにより、ヒト由来細胞の発癌実験系の構築に利
用できる。

なお、本発明のように、様々な、特にＴ細胞白血病ある
いはＴ細胞腫などの細胞の染色体解析を行ない、Ｔ細胞
受容体遺伝子等の再配列を行なう遺伝子の挙動を解明し
てゆけば、未知の他の癌遺伝子を発見・同定することが
できよう。

以下に、本発明を、実施例をもってより詳細に説明する
が、本発明はこれらに限定されない。

［実施例］ 実施例１ （Ｔ’Ｊンバ性白血病細胞の高分子量ＤＮＡの分取）急
性Ｔリンパ性白血病患者より末梢血をｌ０ｍ１採血し、
これを常法に従って、Ｆｉｃｏｌ　Ｉ−ｔ（ｙｐａｑｕ
ｅ密度勾配遠心してリンパ球分画を分取した。得られた
細胞浮遊液は５　ｘ　１０’個の細胞を含み、そのうち
の９５を以上が腫瘍細胞でありだ。

次にこの細胞よりグロスーベラールの方法（Ｇｒｏｓｓ
−Ｂｅｌｌａｒｄ、Ｍａｒｉａ　ｅｔ　ａｌ　；ユーロ
ピアン・ジャーナル。オブ。バイオケミストリー、Ｅｕ
ｒ、Ｊ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、、３６．３２〜，１９７３）に従いＤ
ＮＡを分取していった。

まず細胞をリン酸で緩衝化した生理食塩水で２回洗った
ん後、ただちに５０μｇ／ｍｌのブロテイナーゼＫ　（
Ｅ、Ｍｅｒｋ社製）および１０ｍＭエチレンジアミン四
酢酸ナトリウム（ＥＤＴＡ）、１０ｍＭ塩化ナトリウム
、０．５％ドデシル硫酸ナトリウムを含むｌ０ｍＭトリ
ス−塩酸緩衝液（ｐＨ８）を加え、３７℃で１２時間、
時折軽く振って細胞を溶解した。この溶解混合物を遠心
管に移し、フェノールで飽和した１０ｍＭ　ＥＤＴＡ、
ｌ０ｍＭ塩化ナトリウム、０．５ｔドデシル硫酸ナトリ
ウムを含む５００ｍＭ　）リス−塩酸緩衝液（ｐｌ＋８
）を等容量加えて、室温で１０分間、　６０ｒｐｍの速
さで水平位置で遠心した。次に、遠心管を７℃に冷却し
、１０分間５００Ｘｇで遠心した。非常に粘稠な水層を
広ロビベットで次の遠心管に移し、もう−度フエノール
抽出を行なった。得られた水層を処理済透析バックに入
れ、ｌ０ｍＭ　ＥＤＴＡ、Ｉ　０ｍＭ塩化ナトリウムを
含む５０Ｉ！ＩＭトリスー塩酸緩衝液（ｐＨ８）に対し
、室温で透析を行ない、透析外液の２７０１ｆｉｌの吸
光度が０．０５以下になるまで続行した。この粘稠な溶
液を未処理透析バックに入れ、リボヌクレアーゼＡおよ
びリボヌクレアーゼＴ、をそれぞれ５０μｇ／ｍ　Ｉ、
２μｇ／ｒｎ　Ｉとなるように加えて、同じ緩衝液に対
して透析を３７℃で４時間行なった。次にまた透析バッ
クに移し、ドデシル硫酸ナトリウムを０．５ｔとなるよ
うに、またブロティナーゼＫを５０μｇ／ｍ　ｌになる
ように加え、３７℃で１２時間透析を行なった。

更に、上記のようにフェノール抽出を２回行ない粘稠な
水層を処理済透析バックに移して０．５ｍＭＥＤＴＡ、
ｌ０ｍＭ塩化ナトリウムを含むｌ０ｍＭトリス−塩酸緩
衝液（ｐＨ８）に対し、室温で１時間更に４℃で透析外
液の紫外吸収が０になるまで透析を行ない、高分子ｆｉ
ＤＮＡ１ｍｇを得た。

実施例２ （ヒトＴ細胞受容体β鎖の遺伝子領域の制限酵素地図の
作製） エム・デービス（Ｍ、Ｄａｖｉｓ　）より寄贈を受けた
マウスＴ細胞受容体β鎖遺伝子のｃＤＮＡクローンであ
る８６Ｔ５をプローブとして使用し、マニアティス（Ｍ
ａｎｉａｔｉｓ）のヒト遺伝子ライブラリーからクロー
ンの選択をプラークハイブリダイゼーションによって行
なった。

ハイブリッドを形成しているプラークを単離して３つの
クローンλＨＴＢ−１、λＨＴＢ−２およびλＨＴＢ−
３を得た。

これらのそれぞれのクローンファージを大量に調整し、
ＤＮＡを抽出したのちＥｃｏＲＩ　、　Ｘｂａ　Ｉ、Ｘ
ｈｏＩ、旧ｎｄ　１１Ｉ、５ａｃＩ　、５ｃａＩなどの
制限酵素で切断し、アガロース電気泳動でそれぞれの断
片の大きさを決定した。これら３つのクローンは互いに
重複しており、ヒトＴ細胞受容体Ｄβ、Ｊβ、Ｃβ遺伝
子領域をすべてカバーしていた。これからヒトＴｉ１ｌ
ＪＩＱ受容体Ｄβ、Ｊβ５Ｃβ遺伝子領域の制限酵素地
図が作製され、それを第２図に示した。

なお、この制限酵素地図は本質的にトヨナガ（Ｔｏｙａ
ｏｎａｇａ、Ｂ、　ｅｔ　ａｌ　；ブロシーディング−
オプーナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス、Ｐ
ｒｏｃ、ＮａＬｌ　、八ｃａｄ、ｓｃｉ、Ｕ、ｓ、Ａ、
、８２．８６２４　〜，１９８５　　）のものと同じで
ある。

以後の実施例で用いるヒトＤβ１プローブは上記クロー
ンの０．９ｋｂ　　Ｋｐｎ　Ｉ　−ｔ（ｉｎｄｍ断片に
対応し、Ｊβ２プローブは４．Ｉｋｂ　ＥｃｏＲＩ断片
に対応する。また、マウスＣβ１プローブ（スタンフォ
ード（Ｓ　ｔａｎｆｏｒｄ）大学、Ｈ，Ｄａｖｉｓ博士
より供与された））は、サザンプロットにおいてヒトの
Ｃβ１およびＣβ２のコードされている領域を同じ強度
のバンドとして検出する。

このマウスＣβ１プローブは、胎児型ＤＮＡのＸｂａＩ
消化物中のＣβ１に対応する２、２　ｋｂのバンドとＣ
β２に対応する８、８ｋｂのバンドを、またＥｃｏＲＩ
消化物の中のＣβ１に対応する９、６ｋｂのバンドとＣ
β２に対応する３、６ｋｂのバンドを検出する。

Ｊβ１遺伝子群（ｃｌｕｓｔｅｒ　）の再配列およびＪ
β２遺伝子群の再配列は、それぞれＥｃｏＲＩ消化物お
よびＸｂａ　Ｉ消化物中に検出できる。また、Ｄβ−Ｊ
βあるいはＶβ−Ｄβ再配列はＤβ１およびＪβ２プロ
ーブの両方を用いることにより間接的に同定できる。Ｄ
β、およびＪβ２プローブはユニークな断片を検出する
。

実施例３ （Ｔリンパ性白血病細胞の高分子量ＤＮＡのサザンプロ
ット） 実施例１においてＴリンパ性白血病細胞から分取した高
分子ＤＮＡ　２０ｐｇを制限酵素ＥｃｏＲＩ　　２０単
位で消化した。

得られた消化物を６５℃１０分間熱処理して酵素を失活
させたのち、ＤＮＡ濃度を０．５μｇ／ｌｎ　ｌとし、
そのｌＯμＩを取りこれに電気法動用のマーカー色素液
１μｌを加えてよく混ぜ、アガロースゲルのゲルスロッ
トに添加した。アガロースゲルは０．８ｔの濃度のもの
を作成した。

５Ｖ／ｃｍの電圧で電気泳動を行ない、ＵｖランプでＤ
ＮＡが十分に長く泳動されたか確かめた。

泳動終了後、０．２Ｎ塩酸に３０分間ひたした（ＤＮＡ
の部分的切断のため）のち、ゲル中のＤＮＡ断片が一本
鎖になるように０．２Ｎ水酸化ナトリウム０．６Ｍ塩化
ナトリウム溶液に３０分間ひたし、０．５　Ｍ　トリス
−塩酸緩衝液（ｐＨ７，４）　、　０．９　Ｍ塩化ナト
リウム溶液に放置した。

この−本ｊＪＩＤＮＡ断片をニトロセルロースフィルタ
ーに移した。このニトロセルロースフィルターを真空中
で８０℃２時間保ちＤＮＡを固定した後、プレハイブリ
ダイゼーション溶液［６Ｘ　ＳＳＣ（２０ｘ　ＳＳＣは
塩化ナトリウム１７３．５ｇとクエン酸三ナトリウム８
８．２ｇを塩酸でそのｐＨを７，４にしながら蒸留水で
１リツトルとしたもの］、１％ドデシル硫酸ナトリウム
、５０％ホルムアミド、５×デンハルトの溶液（１×デ
ンハルトの溶液は０．０２４Ｊポリビニルピロリドン、
０．０２４ｋ　Ｆｉｃｏｌ＋　４００．０．０２＊　Ｂ
ＳＡの溶液）］中で４２℃で一晩保温した。ハイブリダ
イゼーション溶液（ブレハイブリダイゼーション溶液に
ＩＯ！デキストラン硫酸を含むもの）を１ａ＋１加え、
その中にニックトランスレーションにより３２ｐで標識
したプローブＤＮＡ（Ｄβ１プローブＤＮＡ　、　　Ｊ
β２プローブＤＮＡ　、およびマウスＣβ１プローブＤ
ＮＡを個々に使用、なお１０８ｃｐａ＋／μｇのものを
ＩＯ’ｃｐｍ用いる）と＋００μｇのサケ特子ＤＮＡを
あらかじめ熱処理したものを入れ、シールして４２℃で
１５〜２０時間放置した。

反応終了後、０．１零ＳＤＳ、２ｘＳＳＣ溶液で２回す
すぎ、同溶液で４２℃で３０分洗ったのち、０．１　ｘ
ＳＳＣ−０，１！ｋ　５０Ｓ溶液で３０分洗って放置し
た。更に、フィルターは風９７．７１オートラジオグラ
フイーにかけた。

得られた結果をパイプリダイゼーションバンドに斜線を
付して表わした模式図として第１図Ａに示す。また、ｒ
ｆまじめの制限酵素消化をＸｂａＩで行なう以外は上記
と同様の操作を縁り返して得られた結果を同様に模式図
として第１図Ｂに示す。

第１図Ａ、Ｈにおいてレーン１．３．５は胎盤由来ＤＮ
Ａ　　（胎児型ＤＮＡ　）をＩＯμｇ、ジーンン２．４
．６は本発明の対象であるＴリンパ性白血病細胞ＤＮＡ
を１０ｐｇ用いて分析した結果を示す。なお、レーン１
．２はＣβ、プローブを、レーン３．４はＤβ、プロー
ブを、レーン５．６はＪβ２プローブを用いて行なった
結果である。

その結果第１図Ａのレーン４．６には６．Ｏｋｂの新し
いバンドが現れ、また第１図Ｂのレーン２．４に１５ｋ
ｂの新しいバンドが現れ、染色体上の再配列によるＤβ
、−Ｊβ２−３　ｖｉ合の存在が示唆された。また、第
１図Ａのレーン２でのｌ　ｌｋｂのバンドの出現は、上
記の染色体の再配列の際に、新たな遺伝子複合体が形成
されたことが示唆された。

すなわち、第１図に示した結果から明らかなように上記
のようにして調製したＤＮＡのサザンプロットでは、異
常なパターンが観察された。

本実施例において用いたプローブによりＥｃｏＲＩ（第
１図Ａ）およびＸｂａＩ　（第１図Ｂ）消化物すべてに
胎児型由来のバンド（第１図レーン１．３．５参照）に
加えて遺伝子の再配列によるバンド（第１図レーン２．
４．６参照）がそれぞれ−本ずつ検出された。この結果
は本細胞中に２種類の染色体７の存在を推定させた。

Ｘｂａ　Ｉ消化物中にはマウスＣβｌプローブ（このプ
ローブでレーン１．２が検出された）と、ヒトＤβ１プ
ローブ（このプローブでレーン３．４が検出された）の
両方で検出される１５ｋｂのバンド（第１図Ｂ、レーン
２．４参照）が、またＥｃｏＲ１消化物中にはＪβ２プ
ローブ（このプローブでレーン５．６が検出された）と
Ｄβ１プローブの両方で検出される６ｋｂのバンド（第
１図Ａ、レーン４．６参照）が存在するので、この癌で
はＤβ、−Ｄβ２再配列が起フていることが明らかとな
った。

通常、Ｄβ−Ｊβ結合、再配列は中間の配列の欠失によ
り起るので、Ｃβ！遺伝子はＤＮＡ再配列配列後消失は
ずである。ところがマウスＣβ１プローブによりＥｃｏ
ＲＩ消化物中にｌ１ｋｂ、９．６ｋｂ、３．６ｋｂの３
つのバンドが検出された（第１図Ａ、レーン２参照）。

９．６ｋｂおよび３．６ｋｂのバンドはそれぞれ胎児型
のＣβ１およびＣβ２を含む断片に対応する。もう１つ
のｌ１ｋｂのバンドはＣβ２付近のＥｃｏＲＩ切断点の
多形性を考えるとＣβ２を含む可能性はあるが、これは
Ｉ　ｌｋｂバンドがＪβ２プローブで検出されないこと
、およびＣβ２遺伝子の下流には２個所のＥｃｏＲＩ切
断個所があることを考慮すると考えにくい。この１１ｋ
ｂのバンドを除けば、他のすべてのバンドは、２つの染
色体のうち一方は胎児型配列を保持し、もう一方の染色
体はＤβ、−Ｊβ２．３結合を含んでいると仮説するこ
とにより説明がつく。

実施例４ （Ｔリンパ性白血病細胞の高分子ＤＮＡのＥｃｏＲＩ消
化物中でＤβ、プローブとＪβ２プローブの両方で検出
される６、０ｋｂ断片のクローン化）ＥｃｏＲＩ消化物
をアガロースゲル電気泳動後、６．０ｋｂに対応する部
分のゲルよりＤＮＡをハイドロキシアパタイトに吸着さ
せ、アガロースを除いたのち抽出した。

この［）ＮＡ　ＩμｇとファージベクターλｇｔｌｆＥ
ｓ・λＢの４ｕｇを１ｍＭ　ＥＤＴＡを含むｌＯｆｆＩ
Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）　、２０μＩに溶
解し、　１ｍＭ　ＡＴＰと１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２存在下
で１単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを加えて１５℃、−晩反
応させた。このＤＮＡ溶液４μｌをホーンの方法（ティ
ー・マニアティス他、「モレキュラー　クローニング」
、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−、ニ
ューヨーク、Ｐ２Ｓ５　（１９８２）で調製した２桓類
の抽出液（菌株ＢＨＢ２６８８とＢＨＢ２６９０を使用
）の混合物に加え攪拌し、２５℃で１〜１．５時間放置
した。５００μｍのファージ希釈液（１０ｍＭ塩酸マグ
ネシウム、０．０１！にゼラチンを含むｌ０ｍＭトリス
−塩酸緩衝液（ｐＨ７，４）　）を加え、２滴のクロロ
ホルムを加え穏やかに混合し、８０００ｒｐｍ　１分間
遠心し、上澄みを得た。その中から次のようにＢｅｎｔ
ｏｎ−Ｄａｖｉｓ法で目的とするクローンを得た。

一晩培養した宿主菌１ｍｌに１００万ＰＦＵからなるｌ
Ｏ万個のファージを含む上記ファージ溶液を加え、３５
℃１５分間保温して寒天（ＬＢ培地に電気泳動用のアガ
ロースを０．７ｔになるように加えたもの）を加えかき
混ぜて、ＬＢ培地に１．５％；になるように寒天を加え
て作ったプレートにまき、３７℃で一晩培養し、プレー
トにプラークを形成させた。

次に、このプレートからニトロセルロースフィルターに
ファージを吸着させ、アルカリ変性することによりファ
ージＤＮＡをフィルターに固定した。

３２ｐ−標識したＤＢＩプローブまたはＪβ２プローブ
とハイブリッド形成を行ない、オートラジオグラフィー
にかけ、ハイブリットを形成しているプラークを４を離
した。プラークよりファージを回収し大量に調製したの
ち、ファージＤＮＡを抽出した。

実施例５ （Ｔリンパ性白血病細胞の高分子ｌＤＮＡ　ＥｃｏＲＩ
消化物中で、Ｄβ１プローブとＪβ２プローブの両方で
検出される６、Ｏｋｂ断片の塩基配列の決定）Ｄβ１プ
ローブとＪβ２プローブの両方で検出される６、０ｋｂ
断片を含むクローンファージＤＮＡにつき、Ｄβ１の上
流にあるＮｃｏ　Ｉ部位でＤＮＡを切断し、３２ｐで標
識した後、　Ｓａｃ　Ｉで切断して得たＤＮＡ断片をマ
クサム−ギルバート法で塩基配列を決定した。

まず、１〜ｌｏｐｍｏｌＤＮＡ断片の試料を四つに分け
た。

１つはグアニン部位で切断した様々な長さのヌクレオチ
ドを得るため、５μｍの標識ＤＮＡ断片を１０ｍＭ塩化
マグネシウムを含む５０ｍＭカコジル酸ナトリウム緩衝
液、ｐＨ８，０、２００μｌに溶かし、０℃に冷却して
１μｍの硫酸ジメチルを加え０℃で１分間反応させてメ
チル化し、次に１．０ｍＭメルカプトエタノール、１０
０μｇ／ｒｎ　ｌの担体用ＲＮＡを含む！。

５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７，０、５０μｌを加
えメチル化反応を停止させた。更に、エタノールで沈殿
させて乾燥後、１Ｍピペリジン水溶液を加え９０℃で３
０分間加熱した。

このグアニン部位で切断されたＤＮＡ鎖を乾燥、水２０
μｌに溶解、乾燥、水２０μｌに溶解、乾燥してヒヘリ
ジンを除き、９０＊（Ｖ／Ｖ）ホルムアミド、１ｍＭＥ
ＤＴＡ　、０．０５％；ｆｌ／Ｖ）キシＬ／：／−、／
７／−ル、０．０５９６（Ｉｆ／Ｖ）ブロモフェノール
ブルーを含む１０ｍＭ　　トリス−ホウ酸緩衝液、ｐＨ
８，３、を１０μｍ加え３分間９０℃にして溶解し、そ
の１〜３μＩをポリアクリルアミドゲルに載せた。

第２は、グアニンとアデニンの両部位で切断したさまざ
まな長さのヌクレオチドをポリアクリルアミドゲルに載
せるため、５μｍの標識ＤＮＡ断片を水４０μ■に溶か
し、ＩＭギ酸５μｍを加えて３７℃、２５分間反応させ
、０．１＋１１Ｍ　ＥＤＴＡ、２５　μｇ／ｍｌ担体用
ＲＮＡを含む０．３Ｍ　　酢酸ナトリウム緩衝液、ｐｈ
ｉ７．０、を２００μｌ加えた後、エタノールで沈殿し
て乾燥し、以後はグアニンで切断する場合と全く同じ操
作を行なった。

第３は、チミンとシトシンの両部位で切断したさまざま
な長さのヌクレオチドをポリアクリルアミドゲルに栽せ
るために、５μｌ標識ＤＮＡ断片を水２０μｌに溶かし
、２５μｌヒドラジンを加えて２０”Ｃ１５分間反応さ
せ、以後グアニンとアデニンの両部位で切断する場合と
同じ操作を行なった。

最後の１つはシトシンの部位で切断したさまざまな長さ
のヌクレオチドをポリアクリルアミドゲルに載せるため
に、チミンとシトシンの両部位で分解する場合に、２０
μ、１の水に溶かす操作を、この場合には２０μｍの５
Ｍ塩化ナトリウム溶液に溶かす操作に変えた他はすべて
同じ操作を行なった。

以上のように得られた四つのＤＮＡ断片の試料をポリア
クリルアミドゲル電気泳動にかけて、塩基対の大きさの
順に分層しオートラジオグラフィーを行ない、そのパタ
ーンより塩基配列を決定した。このうち再配列近傍の塩
基配列を第３図に示した。

以上のように、実施例３の最後にたてた仮定を証明する
ために、上記実施例４でＥｃｏＲＩ消化物中のＤβ１プ
ローブとＪβ２プローブの両方で検出される６、０ｋｂ
断片をクローン化し、更にこのクローンの制限酵素地図
分析を行なったところ、Ｄβ、のｌＯヌクレオチド上流
にＮｃｏ　Ｉ切断個所の存在、Ｄβ、の１５０ヌクレオ
チド下流での旧ｎｄＩ［［切断個所の消失、Ｊβ２．２
とＪβ２．、の間に位置するＳａｃ　Ｉ切断個所の消失
、Ｊβ２．６とＪβ２．７の間に位置するＳａｃ　Ｉ切
断個所の保持が明らかになった。さらに、上記のように
マクサム・ギルバート法によりＤＮＡの塩基配列を決定
すると、再配列による組換えは、Ｄβ１とＪβ２．３の
間で起っていること、またＤβ１とＪβ２．３の境界に
はＮセグメントとして知られている５ヌクレオチドの挿
入（ＡＩＬ、Ｆ、Ｗ、　ｅｔ　ａｌ：Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ
ｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

Ｕ、Ｓ、Ａ、、７９．４１１８〜．［９８２）があるこ
とが示された（第３図）。即ち、この癌においては、Ｄ
β、−Ｊβ２．３結合が一方の染色体で起り、他方の染
色体は胎児型配列を保持していることが実証された。

実施例６ （Ｔリンパ性白血病細胞の高分子ｌＤＮＡのＥｃｏＲＩ
消化物中からマウスＣβ１プローブにより検出されたｌ
　ｌｋｂ断片の制限酵素地図） 実施例３〜５の結果から、Ｄβ、−Ｊβ２．３再記列に
伴ないＣＩ３＋遺伝子は他の染色体に転座したことが確
認された。そこで、以下のようにしてＥｃｏＩｔ　Ｉ消
化物中のマウスＣβ１プローブより検出されたＩ　Ｉｋ
ｂバンドをクローン化し、第４図に示すようなこのクロ
ーンの制限酵素地図を得た。

すなわち、Ｔリンパ性白血病細胞の高分子量ＤＮＡのＥ
ｃｏＲＩ消化物中のマウスＣＩ３＋プローブにより検出
されたｌ　Ｉｋｂ断片を、実施例４と同じ方法でクロー
ン化し、このＩ　Ｉｋｂ断片を含む十分量のクローンフ
ァージＤＮＡを得た。

このＤＮＡをＥｃｏＲＩ　、　Ｘｂａｌ　Ｉ　、Ｘｈｏ
Ｉ、ＨｉｎｄｌＵ　、　Ｓｃａ工、５ｃａＩなどの制限
酵素で消化し、制限酵素地図を得た。

得られた結果において、Ｃβ１遺伝子領域由来部分と未
知部分との境界は正確には分らないが、ＪＢ＋・２とＪ
β１・３の間のＳｃａ　Ｉ切断個所の存在とＪβ１．１
の内部の旧ｎｄ１１Ｉ切断個所の消失より、挿入Ｊβ１
，２近傍で起っていることは明らかである。

そこで、この挿入の起っている第４図に示す陰影をつけ
た部分右端の斜線個所近傍の塩基配列を決め、また胎児
型配列のＪβ８．２近傍の塩基配列を決定して比較する
と、第６図のようになった。

第６図から明らかなように図中縦線で示す個所より３′
末端側の塩基配列は同一であり、この個所で挿入が起っ
ていることが同定された。

このことから、Ｃβ１遺伝子を含むＤＮＡ部分は約５ｋ
ｂの塩基対を持つことが示された。

次にこのＣβ１遺伝子由来断片に結合している未知部分
の属する染色体を同定するため、第４図に示すプローブ
■を用いて、ヒト染色体を選択的に欠失したマウス−ヒ
ト体細胞間雑種細胞の１３種類（表１＃照）から調整し
たＤＮＡにつきサザンプロットを行なった。

ブローブエは、ＥｃｏＲＩで消化したヒトＤＮＡでは、
９．６ｋｂの唯一のバンドを、またＥｃｏＲＩで消化し
たマウスＤＮＡでは、１１．９．０．６．５．５．０ｋ
ｂの４つの弱いバンドを与えた。

サザンプロットの結果３Ａ６およびＡ／８７−５細胞か
らのＨＡのみが９．ｌ１ｉｋｂのシグナルを与え、他の
雑種細胞からのＤＮＡはマウス染色体由来のシグナルの
みを与えた。この結果と表１に示した雑種細胞の抜型分
析データにより未知部分はヒト染色体６に帰属される。

以上より急性Ｔリンパ性白血病細胞のＣβ１遺伝子領域
を含む２本の染色体のうち、一方は胎児型で、もう一方
はＤβ、−Ｊβ２．３結合が起っていること、およびこ
の再配列の過程で欠失すると考えられているＤβ１とＪ
β２．３の間に位置するＣβ１を含むＤＮＡ断片がこの
白血病細胞では染色体６に挿入されていることが明らか
になった。

本来染色体７に存在していたＤＮＡ断片が染色体６に挿
入されていった過程は第５図に示したように、Ｄβ１と
Ｊβ２．３を隔てていたＤＮＡが中間体として環状ＤＮ
Ａ（第５図にｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ　ｊｏｉｎｔｃｏｎ
ｔａｉｎｉｎｇｆｒａｇｍｅｎｔ　（ＲＪＣ断片）とし
て示した）という段階を経て再び挿入されたと考えられ
る。

免疫グロブリンにおけると同様、Ｔ細胞受容体Ｃβ遺伝
子の各々の５′上流側には、エンハンサ−類似ＤＮＡ配
列の存在が想定されている（ＢｉｅｒＥ、　ｅｔ　ａｌ
；５ｃｉｅｎｃｅ、２２９，５２８〜，１９８５　）　
。このＣβ１含有断片が染色体６に挿入された際、挿入
個所の近傍に存在する遺伝子の無制御な発現を惹起する
としたら、Ｔ細胞白血病の場合この遺伝子を本発明者ら
はｔｅｌ−１と名づけだい。しかしながら、最も研究が
進んでいるＣ−工遺伝子と同様に核局在ＤＮＡ結合蛋白
をコードしているとされるｃ−＝ｒ遺伝子（Ｋｌｅｍｐ
ｎａｕｅｒ、に−Ｈ，ｅｔ　ａｌ；［：ａｌｌ、３７，
５３７〜１９８４）が染色体６に同定されている（　Ｄ
ａｌ　１ａ−Ｆａｖｅｒａ、Ｒ，；Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ
、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、、７９．４７１４〜
，１９８２）。そしてまたレトロウィルス挿入等による
Ｃ−Ｉ遺伝子の無制限の発現と造血細胞の発癌との関連
が指摘されており（Ｓｈｅｎ−Ｏｎｇ、Ｇ、Ｌ、Ｃ，ｅ
ｔ　ａｌ；５ｃｉｅｎｃｅ、２２４．１０１７〜．１９
８４ｇよびＰｅ１ｉｃｃｉ、Ｐ−Ｇ、ａｔ　ａｌ；５ｃ
ｉｅｎｃｅ、２２４．１１１７〜，１９８４）、本発明
者らがＴ細胞白血病に関与するとして仮にｔｃｌｌと名
づけだ遺伝子が実はこのｃ−＝ｎ遺伝子である可能性が
ある。また本発明者らのＣｆ３１遺伝子がＣ−屡遺伝子
等既知の発癌遺伝子近傍に挿入され、Ｃ−拓遺伝子等発
癌遺伝子を活性化・発現させる可能性がでてきた。

［発明の効果コ 免疫グロブリン遺伝子の再配列発現の機序解明のＪ、（
媒酌研究と、癌患者の染色体、遺伝子解析の臨床的研究
が融合して、免疫グロブリン遺伝子に関午する染色体異
常、再配列異常と癌との関連が明らかにされてきた。同
様の研究手法で、様々な癌、特にリンパ系癌細Ｗｄの染
色体異常を広範に研究すれば、ＴＩ′Ｏ胞受容鉢受容体
遺伝子列異常との関連も解明できると本発明者らは考え
研究を進め、実際本発明者らはＴ細胞受容体Ｃβ１遺伝
子が別な染色体に転座する事実を発見し、癌診断の新し
い診断方法、マーカーとしての価値を見い出した。

Ｃβ１遺伝子の染色体６への転座、それによる染色体６
上の新たな遺伝子複合体の形成の発見は、新たな発癌メ
カニズムの解明に道を開くものである。

この知見を契機として、エンハンサ−を含むＣβ１遺伝
子が挿入された、本発明の各染色体上の遺伝子複合体に
含まれる、Ｃβ１遺伝子の下流の遺伝子群（例えばｃ−
ｍ遺伝子、ｃ−堕遺伝子等）をエンハンサ−を含むＣβ
１遺伝子が活性化し、発癌の引き金となる可能性が明ら
かにされよう。

染色体６あるいは他の染色体上にＣβ１遺伝子を同定す
るという手段、より具体的には例えば約１１ｋｂの塩基
対を持つクローンｌ−４ＥＩ＋のようなＣβ１遺伝子等
を含む遺伝子複合体を、検体の細胞ＤＮＡ内に同定する
という方法は、癌の新しい診断法として作用である。

【図面の簡単な説明】

第１図は急性リンパ性白血病細胞から分離したＤＮＡの
サザンプロットにおけるハイブリダイゼーション・バン
ドを斜線を付して表した模式図であり、第１図ＡはＤＮ
ＡをＥｃｏＲＩで、第１図ＢはＤＮＡをＸｂａ　Ｉで消
化し、０．８％アガロースゲル上で電気泳動を行なった
場合をそれぞれ示す。 第２図はヒトＴ細胞受容体β鎖遺伝子領域の制限酵素地
図であり、本発明で使用したプローブＤβ１とＪβ２の
領域を明示する。 第３図は急性リンパ性白血病細胞がらのＯＮへの再配列
領域のヌクレオチド配列を示す図である。 比較のため胎児型遺伝子のＤβ１およびＪβ２．３近傍
のヌクレオチド配列も図示し、シグナル配列のへブタマ
ーとノナマーには下線を引き、切断点は縦線で示した。 第４図は、急性リンパ性白血病細胞からのＤＮＡのＥｃ
ｏＲＩ消化物よりマウスＣβ１プローブで検出されたｌ
　ｌｋｂヌクレオチド断片（１−４Ｅ１１クローン）の
制限酵素地図である。ＥはＥｃｏＲＩの、ＸはＸｂａ　
Ｉの、ｘｈはＸｈｏ　Ｉの、Ｈは旧ｎｄＩ［＋の、Ｓａ
はＳａｃ　Ｉの、Ｓｃａ　Ｉのそれぞれの切断点を示す
。約６ｋｂがＣβ１遺伝子領域に由来する部分である。 比較のためジャームライン型のＣβＩ遺伝子近傍の地図
も示す。コード領域は黒塗りで示す。組み換え部分はＪ
β８．２の近くである。矢印で示したプローブは染色体
の同定に使用した。 第５ａ図はＤβ遺伝子とＪβ遺伝子の間での組み換えの
模式図である。ＤβとＪβの間でＤβ−Ｊβ結合ができ
るが、その際２つの遺伝子を隔てるＤＮＡは、シグナル
配列がｈｅａｄ−Ｌｏ−ｈｅａｄでつながった形をした
ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ　ｊｏｉｎｔを作ると想定されて
いる。 第５ｂ図は、ＲＪＣセグメントの他の染色体への挿入の
模式図である。 第６図は、クローンｌ−４Ｅ１１におけるＣβ１遺伝子
の挿入部分の塩基配列と胎児型配列のＪβ９，２近傍の
塩基配列との比較図である。 特許出願人　三井東圧化学株式会社 三井製薬工業株式会社 学校法人　　藤田学園

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）Ｔ細胞受容体β鎖不変部位をコードするＣβ＿１遺
   伝子を含むＤＮＡ断片が転座した癌細胞の有する染色体
   由来のＣβ＿１遺伝子を含むＤＮＡ断片と、他の遺伝子
   とを含むことを特徴とする遺伝子複合体。 ２）前記癌細胞が、急性Ｔリンパ性白血病細胞である特
   許請求の範囲第１項に記載の遺伝子複合体。 ３）前記染色体が染色体６である特許請求の範囲第１項
   または第２項に記載の遺伝子複合体。 ４）前記Ｃβ＿１遺伝子を含むＤＮＡ断片が約６ｋｂの
   塩基対を持つ特許請求の範囲第１項〜第３項のいずれか
   に記載の遺伝子複合体。 ５）約１１ｋｂの塩基対からなるクローン１−４Ｅ１１
   である特許請求の範囲第１項〜第４項のいずれかに記載
   の遺伝子複合体。 ６）前記他の遺伝子が発癌遺伝子である特許請求の範囲
   第１項〜第５項のいずれかに記載の遺伝子複合体。 ７）前記発癌遺伝子がｃ−￥ｍｙｂ￥遺伝子である特許
   請求の範囲第６項に記載の遺伝子複合体。 ８）染色体６にＣβ＿１遺伝子を含むＤＮＡ断片を同定
   することを特徴とする癌の診断法。 ９）前記癌が急性Ｔリンパ性白血病である特許請求の範
   囲第８項に記載の診断法。 １０）前記癌が成人性Ｔリンパ性白血病である特許請求
   の範囲第８項に記載の診断法。 １１）Ｔ細胞受容体β鎖不変部位をコードするＣβ＿１
   遺伝子を含むＤＮＡ断片が転座した癌細胞の有する染色
   体に由来し、かつＣβ＿１遺伝子を含むＤＮＡ断片と他
   の遺伝子とを含む約１１ｋｂの塩基対を有するクローン
   １−４Ｅ１１をＤＮＡ診断マーカーとすることを特徴と
   する癌の診断法。 １２）前記癌が急性Ｔリンパ性白血病である特許請求の
   範囲第１１項に記載の診断法。 １３）前記癌が成人性Ｔリンパ性白血病である特許請求
   の範囲第１１項に記載の診断法。