KR101621643B1 - 다중 pcr 반응에서 증폭 바이어스를 측정 및 교정하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

Abstract

T 세포 수용체 (TCR) 또는 면역글로불린 (IG)을 암호화하는 재배열된 림프계 세포 DNA를 함유하는 DNA 주형의 이질성 세트를 증폭시키는데 전형적으로 사용될 수 있는 바와 같은 올리고뉴클레오티드 프라이머의 고도로 이질성 세트의 DNA 증폭 효율을 표준화하기 위한 조성물 및 방법이 기재되어 있다. 현재 개시된 실시양태는 증폭 프라이머의 서브세트의 이용에서, 샘플 중의 특유의 TCR 또는 Ig 암호화 게놈을 정량화하기 위해 증폭 생성물의 다중 고 처리량 서열분석에서 부정확성을 야기하는, 바람직하지 않은 바이어스를 해결하는데 유용하다. 증폭 프라이머 세트의 교정 표준으로서 사용하기 위한, 다양한 복수개의 주형 올리고뉴클레오티드를 실질적으로 등몰량으로 포함하는 조성물이 제공된다. 또한, 증폭 동안 바이어스된 프라이머 효율을 동정 및 보정하는 방법이 제공된다.

Description

다중 PCR 반응에서 증폭 바이어스를 측정 및 교정하기 위한 조성물 및 방법 {COMPOSITIONS AND METHOD FOR MEASURING AND CALIBRATING AMPLIFICATION BIAS IN MULTIPLEXED PCR REACTIONS}

관련 출원의 상호 참조

본 출원은 2012년 11월 14일에 출원된 미국 가출원 번호 61/726,489 및 2012년 5월 8일에 출원된 미국 가출원 번호 61/644,294를 우선권 주장하며, 이들 가출원의 전체 개시내용은 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

발명의 분야

본 개시내용은 일반적으로 다중 핵산 증폭 반응에서 적응 면역 수용체 암호화 DNA (예를 들어, T 세포 수용체 (TCR) 및 면역글로불린 (IG)을 암호화하는 DNA)의 정량적 고 처리량 서열분석(high-throughput sequencing)에 관한 것이다. 특히, 본원에 기재된 조성물 및 방법은 다중 DNA 증폭에서 특이적 올리고뉴클레오티드 프라이머의 바이어스된(biased) 과다 이용 및/또는 과소 이용으로 인해 생길 수 있는 적응 면역 수용체 암호화 서열의 정량화에서 바람직하지 않은 왜곡을 해결한다.

관련 기술의 설명

적응 면역계는 잠재적 병원체의 세계를 인식하기 위해 충분한 다양성을 갖는, T- 및 B-세포 항원 수용체, 즉 적응 면역 수용체의 레퍼토리를 생성하는 몇몇 전략을 이용한다. 다양한 암 또는 전염성 미생물과 연관된 항원의 세계를 인식하는 T 세포의 능력은 그의 T 세포 항원 수용체 (TCR)에 의해 부여되며, 이는 TCRA 유전자자리로부터의 α (알파) 쇄와 TCRB 유전자자리로부터의 β (베타) 쇄의 헤테로이량체, 또는 TCRG 유전자자리로부터의 γ (감마) 쇄와 TCRD 유전자자리로부터의 δ (델타) 쇄의 헤테로이량체이다. 이들 쇄를 이루는 단백질은 DNA에 의해 암호화되며, 이는 림프계 세포에서 TCR의 엄청난 다양성을 생성하기 위한 특유의 재배열 기전을 이용한다. 이러한 다중-서브유닛 면역 인식 수용체는 CD3 복합체와 회합하고 항원-제시 세포 (APC)의 표면 상에 주 조직적합 복합체 (MHC) 부류 I 또는 MHC 부류 II 단백질에 의해 제시되는 펩티드에 결합한다. APC 상에서 항원 펩티드로의 TCR의 결합은 T 세포와 APC 사이의 접촉시 면역학적 시냅스에서 일어나는, T 세포 활성화에서 중요한 사건이다.

각각의 TCR 펩티드는 가변 상보성 결정 영역 (CDR)뿐만 아니라, 프레임워크 영역 (FR) 및 불변 영역도 함유한다. αβ T 세포의 서열 다양성은 α 및 β 쇄 가변 도메인의 제3 상보성 결정 영역 (CDR3) 루프의 아미노산 서열에 의해 주로 결정되며, 이러한 다양성은 각각, β 쇄 유전자자리에서 가변 (V_β), 다양성 (D_β), 및 결합 (J_β) 유전자 절편 사이, 및 α 쇄 유전자자리에서 유사한 V_α 및 J_α 유전자 절편 사이의 재조합의 결과이다. TCR α 및 β 쇄 유전자자리에 이러한 다수의 유전자 절편의 존재로 인해 수많은 구별되는 CDR3 서열의 암호화가 가능하게 된다. CDR3 서열 다양성은 TCR 유전자 재배열의 과정 동안 V_β-D_β, D_β-J_β, 및 V_α-J_α 결합부에서 뉴클레오티드의 독립적인 부가 및 결실에 의해 추가로 증가된다. 이 점에 있어서, 면역적격(immunocompetence)은 TCR의 다양성으로부터 유래된다.

γδ TCR 헤테로이량체는 이것이 선천 면역계와 밀접하게 상호작용하며 비(non)-HLA-의존 방식으로 항원을 인식하는 수용체를 암호화한다는 점에서 αβ TCR과 차이가 있다. TCRγδ는 발생 초기에 발현되며, 특수화된 해부학적 분포, 특유의 병원체 및 소분자 특이성, 및 광범위한 선천 및 적응 세포 상호작용을 갖는다. TCRγ V 및 J 절편 발현의 바이어스된 패턴은 개체발생 초기에 확립된다. 그 결과, 성체 조직에서의 다양한 TCRγ 레퍼토리는 병원체 및 유해 분자로의 환경적 노출에 의한 자극 후에 광범위한 주변적 확장의 결과이다.

면역글로불린 (Ig 또는 IG) (본원에서 B 세포 수용체 (BCR)로도 지칭됨)은, 4개의 폴리펩티드 쇄, 즉 IGH 유전자자리로부터의 2개의 중쇄 (H 쇄) 및 IGK 또는 IGL 유전자자리로부터의 2개의 경쇄 (L 쇄)로 이루어져 H₂L₂ 구조를 형성하는 B 세포에 의해 발현되는 단백질이다. H 및 L 쇄는 각각, TCR과 유사하게, 항원 인식에 관여하는 3개의 상보성 결정 영역 (CDR)뿐만 아니라, 프레임워크 영역 및 불변 도메인도 함유한다 Ig의 H 쇄는 IGM 또는 IGD 불변 영역 엑손을 사용하여 막 결합 이소폼(membrane-bound isoform)으로서 처음에 발현되나, 항원 인식 후 불변 영역은 IGG, IGE 및 IGA를 포함한 몇몇 추가의 이소타입(isotype)으로 클래스전환될 수 있다. TCR과 같이, 개체내에서 천연(

) Ig의 다양성은 초가변 상보성 결정 영역 (CDR)에 의해 주로 결정된다. TCRB와 유사하게, H 쇄의 CDR3 도메인은 V_H, D_H, 및 J_H 유전자 절편의 조합적 결합에 의해 창출된다. 초가변 도메인 서열 다양성은 Ig 유전자 재배열의 과정 동안 V_H-D_H, D_H-J_H, 및 V_H-J_H 결합부에서 뉴클레오티드의 독립적인 부가 및 결실에 의해 추가로 증가된다. TCR과 다르게, Ig 서열 다양성은 천연 B 세포가 처음에 항원을 인식한 후 재배열된 IG 유전자에 걸친 체세포 초돌연변이 (SHM)에 의해 추가로 증대된다. SHM의 과정은 CDR3에 제한되지 않고, 따라서 프레임워크 영역, CDR1 및 CDR2에서뿐만 아니라, 체세포적으로 재배열된 CDR3에서도 생식세포주(germline) 서열의 변화를 초래할 수 있다.

적응 면역계는 특유의 TCR 또는 BCR을 발현하는 세포의 클론 확장에 의해 부분적으로 기능하기 때문에, 각각의 T 세포 또는 B 세포 클론의 전체 존재량(abundance)의 변화를 정확하게 측정하는 것은 적응 면역 반응의 동역학을 이해하는데 중요하다. 예를 들어, 건강한 인간은 수백만의 특유의 재배열된 TCRβ 쇄를 갖고, 이 각각은 건강한 개체에서 대략 1조의 T 세포로부터, 수백 내지 수천의 클론성 T 세포로 운반된다. 고 처리량 서열분석의 발전을 이용함으로써, 막대한 TCR 및 BCR 레퍼토리를 프로파일링하는 분자 면역학의 새로운 분야가 최근에 부각되었다. 재배열된 적응 면역 수용체 유전자 서열의 서열분석 및 적응 면역 수용체 클론형 결정을 위한 조성물 및 방법은 U.S.A.N. 13/217,126; U.S.A.N. 12/794,507; PCT/US2011/026373; 및 PCT/US2011/049012에 기재되어 있으며, 이들 출원 모두가 본원에 참조로 포함된다.

지금까지, 몇몇 상이한 전략이 이용되어 적응 면역 수용체를 암호화하는 핵산을 고 처리량으로 정량적으로 서열분석하여 왔고, 이들 전략은, 예를 들어, CDR3-암호화 영역을 증폭시키는데 사용되는 접근법에 의해, 그리고 게놈 DNA (gDNA) 또는 전령 RNA (mRNA)의 서열분석의 선택에 의해 구별될 수 있다.

mRNA 서열분석은 gDNA 서열분석보다 잠재적으로 용이한 방법인데, 그 이유는 mRNA 스플라이싱 사건이 J와 C 절편 사이의 인트론을 제거하기 때문이다. 이로 인해 C 영역에서 공동 3' PCR 프라이머를 사용하여 상이한 V 영역 및 J 영역을 갖는 적응 면역 수용체 (예를 들어, TCR 또는 Ig)의 증폭이 가능하게 된다. 각각의 TCRβ의 경우, 예를 들어, 13개의 J 절편은 길이가 모두 60개 미만의 염기쌍 (bp)이다. 따라서, 스플라이싱 사건은 재배열된 VDJ 결합부의 100 bp 미만 내에서 (어떤 V 및 J 서열이 사용되는지와 상관없이) TCRβ 불변 영역을 암호화하는 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 야기한다. 그 다음, 스플라이싱된 mRNA는 mRNA의 폴리-A-테일(poly-A-tail)에 상보적인 폴리-dT 프라이머, 랜덤 소형 프라이머 (대개 육량체 또는 구량체) 또는 C-절편-특이적 올리고뉴클레오티드를 사용하여 상보적 DNA (cDNA)로 역전사될 수 있다. 이는 TCR cDNA의 바이어스되지 않은 라이브러리를 생성시켜야 하며 (모든 cDNA가, 폴리-dT, 랜덤 육량체, 또는 C 절편-특이적 올리고이든, 동일한 올리고뉴클레오티드로 프라이밍되기 때문임) 그 다음, 이를 서열분석하여 각각의 재배열에서 사용된 V 및 J 절편에 관한 정보뿐만 아니라, CDR3의 특이적 서열에 관한 정보도 얻을 수 있다. 이러한 서열분석은 단일의, 롱 리드 스패닝(long reads spanning) CDR3 ("롱 리드(long read)") 기술을 사용할 수 있거나, 대신에 단편화 라이브러리를 사용하여 더 긴 서열의 숏건 어셈블리(shotgun assembly)를 포함할 수 있을 것이고 처리량이 더 높을수록 서열 판독이 더 짧아진다.

그러나, mRNA 서열분석을 기반으로 특정의 재배열된 TCR (또는 Ig)을 발현하는 샘플에서의 세포의 수를 정량화하려는 노력은 해석하기가 곤란한데, 그 이유는 각각의 세포가 상이한 양의 TCR mRNA를 잠재적으로 발현하기 때문이다. 예를 들어, 시험관내에서 활성화된 T 세포는 정지 T 세포보다 세포당 10-100배 많은 mRNA를 갖는다. 지금까지, 상이한 기능 상태의 T 세포에서 TCR mRNA의 상대량에 관한 매우 제한된 정보가 존재하며, 따라서 대량으로 mRNA의 정량화가 각각의 클론성 TCR 재배열을 지닌 세포의 수를 반드시 정확히 측정하는 것은 아니다.

다른 한편으로는, 대부분의 T 세포는 하나의 생산적으로 재배열된 TCRα 및 하나의 생산적으로 재배열된 TCRβ 유전자 (또는 2개의 재배열된 TCRγ 및 TCRδ)를 갖고, 대부분의 B 세포는 하나의 생산적으로 재배열된 Ig 중쇄 유전자 및 하나의 생산적으로 재배열된 Ig 경쇄 유전자 (IGK 또는 IGL)를 갖고 따라서 TCR 또는 BCR을 암호화하는 게놈 DNA의 샘플에서의 정량화는, 각각, 샘플에서의 T 또는 B 세포의 수와 직접적인 상관관계가 있어야 한다. 적응 면역 수용체 쇄 중 어느 하나 이상을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 게놈 서열분석은 바람직하게는 대상체의 림프계 세포로부터의 DNA를 함유하는 샘플에 존재하는 많은 가능한 재배열된 CDR3 서열 모두를 동등한 효율로 증폭시킨 후, 정량적으로 서열분석하는 것을 수반하여, 각각의 재배열된 CDR3 클론형의 상대 존재량의 정량적 측정이 수득될 수 있도록 한다.

그러나, 이러한 접근법으로는 다중 PCR을 사용하여 각각의 재배열된 클론에 대해 동등한 증폭 및 서열분석 효율이 용이하게 달성될 수 없다는 점에서 난관에 직면하게 된다. 예를 들어, TCRB에서 각각의 클론은 54개의 가능한 생식세포주 V 영역-암호화 유전자 중 하나 및 13개의 가능한 J 영역-암호화 유전자 중 하나를 이용한다. V 및 J 절편의 DNA 서열은 다양한 적응 면역 레퍼토리를 생성하기 위해, 필연적으로 다양하다. 이러한 서열 다양성으로 인해 동등한 친화도로 모든 V 절편 (또는 J 절편)에 어닐링될 단일의, 범용 프라이머 서열을 설계하는 것이 불가능하게 되고, 복합 DNA 샘플이 산출되며, 여기서 거기에 함유된 다수의 구별되는 서열의 정확한 결정은 다중 증폭 및 고 처리량 서열분석을 동시에 사용하여 복수개의 분자 종을 정량화하는 능력에 대한 기술적 제한에 의해 저해된다.

하나 이상의 인자는 서열분석 데이터 출력과 입력 클론형의 카피수 사이의 상관관계를 왜곡하는 아티팩트(artfact)를 야기할 수 있고, 이는 TCRβ 유전자 주형의 매우 다양한 무리의 다중 증폭을 기반으로 하는 서열분석 전략으로부터 신뢰할만한 정량적 데이터를 수득하는 능력을 손상시킨다. 이들 아티팩트는 종종 다중 증폭 단계 동안 다양한 프라이머의 동등하지 않은 사용으로 인해 생긴다. 다양한 증폭 주형을 사용하는 다중 반응에서 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머의 이러한 바이어스된 이용은 주형 및/또는 올리고뉴클레오티드 프라이머의 뉴클레오티드 염기 조성의 차이, 주형 및/또는 프라이머 길이의 차이, 사용된 특정의 중합효소, 증폭 반응 온도 (예를 들어, 어닐링, 신장 및/또는 변성 온도), 및/또는 다른 인자 중 하나 이상으로 인해 차별적 어닐링 반응속도론(kinetics)에 따라 생길 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Kanagawa, 2003 J. Biosci. Bioeng. 96:317]; [Day et al., 1996 Hum. Mol. Genet. 5:2039]; [Ogino et al., 2002 J. Mol. Diagnost. 4:185]; [Barnard et al., 1998 Biotechniques 25:684]; [Aird et al., 2011 Genome Biol. 12:R18]).

복합 주형 DNA 집단의 다중 증폭에 사용된 올리고뉴클레오티드 프라이머의 세트에서 특이적 주형의 증폭에서 바이어스(bias)로 인해 개별 서열의 과다 표시(overrepresentation) 또는 과소 표시를 오도하는 것과 같은 왜곡된 결과를 피하는 방식으로, 복합 샘플에서 적응 면역 수용체-암호화 DNA 서열 다양성의 정확한 정량화를 가능하게 할 개선된 조성물 및 방법의 필요성이 분명히 여전히 남아 있다. 현재 기재된 실시양태는 이러한 필요성을 해결하고 다른 관련된 이점을 제공한다.

발명의 개요

포유동물 대상체의 림프계 세포로부터의 재배열된 핵산 분자를 포함하는 생물학적 샘플에서 각각 가변 영역 및 결합 영역을 포함하는 하나 이상의 적응 면역 수용체를 암호화하는 재배열된 핵산 분자를 증폭시킬 수 있는 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트의 증폭 효율을 표준화하기 위한 조성물로서, 조성물은 일반식 5'-U1-B1-V-B2-R-B3-J-B4-U2-3' [I]의 복수개의 올리고뉴클레오티드 서열을 갖는 복수개의 주형 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물: 상기 식에서, (a) V는 적응 면역 수용체 가변 (V) 영역 암호화 유전자 서열의 20개 이상 1000개 이하의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드, 또는 그의 보체이고, 각각의 V 폴리뉴클레오티드는 특유의 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하며; (b) J는 적응 면역 수용체 결합 (J) 영역 암호화 유전자 서열의 15개 이상 내지 600개 이하의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드, 또는 그의 보체이고, 각각의 J 폴리뉴클레오티드는 특유의 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하며; (c) U1은 부재하거나 (i) 제1 범용 어댑터 올리고뉴클레오티드 서열 및 (ii) 제1 범용 어댑터 올리고뉴클레오티드 서열에 연결되고 5'에 위치되는 제1 서열분석 플랫폼-특이적 올리고뉴클레오티드 서열로부터 선택되는 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하고; (d) U2는 부재하거나 (i) 제2 범용 어댑터 올리고뉴클레오티드 서열, 및 (ii) 제2 범용 어댑터 올리고뉴클레오티드 서열에 연결되고 5'에 위치되는 제2 서열분석 플랫폼-특이적 올리고뉴클레오티드 서열로부터 선택되는 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하고; (e) B1, B2, B3, 및 B4는 각각 독립적으로 부재하거나 각각 3-25개의 인접 뉴클레오티드의 바코드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 B를 포함하고, 여기서 각각의 B1, B2, B3 및 B4는, 쌍체 조합(paired combination)으로서, (i) (a)의 특유의 V 올리고뉴클레오티드 서열 및 (ii) (b)의 특유의 J 올리고뉴클레오티드 서열을 특유하게 동정하는 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하고; (f) R은 부재하거나 (a)-(e)에 없는 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는 제한 효소 인식 부위를 포함하고, 여기서, (g) 복수개의 주형 올리고뉴클레오티드는, 어느 쪽이든 더 큰 것인, a개 이상 또는 b개 이상의 특유의 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 a는 대상체에서 특유의 적응 면역 수용체 V 영역-암호화 유전자 절편의 수이고, b는 대상체에서 특유의 적응 면역 수용체 J 영역-암호화 유전자 절편의 수이고, 조성물은 각각의 특유의 V 폴리뉴클레오티드에 대해 1개 이상의 주형 올리고뉴클레오티드 및 각각의 특유의 J 폴리뉴클레오티드에 대해 1개 이상의 주형 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것인 조성물.

한 실시양태에서, a는 1 내지 대상체의 포유동물 게놈 중의 다수의 최대 V 유전자 절편이다. 또 다른 실시양태에서, b는 1 내지 대상체의 포유동물 게놈 중의 다수의 최대 J 유전자 절편이다. 다른 실시양태에서, a는 1이거나 b는 1이다.

일부 실시양태에서, 복수개의 주형 올리고뉴클레오티드는 (a × b)개 이상의 특유의 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 a는 포유동물 대상체에서 특유의 적응 면역 수용체 V 영역-암호화 유전자 절편의 수이고, b는 포유동물 대상체에서 특유의 적응 면역 수용체 J 영역-암호화 유전자 절편의 수이고, 조성물은 V 영역-암호화 유전자 절편과 J 영역-암호화 유전자 절편의 모든 가능한 조합에 대해 1개 이상의 주형 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 한 실시양태에서, J는 적응 면역 수용체 J 영역 암호화 유전자 서열의 불변 영역을 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 적응 면역 수용체는 TCRB, TCRG, TCRA, TCRD, IGH, IGK, 및 IGL로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, (a)의 V 폴리뉴클레오티드는 TCRB, TCRG, TCRA, TCRD, IGH, IGK, 또는 IGL 수용체 V-영역 폴리펩티드를 암호화한다. 다른 실시양태에서, (b)의 J 폴리뉴클레오티드는 TCRB, TCRG, TCRA, TCRD, IGH, IGK, 또는 IGL 수용체 J-영역 폴리펩티드를 암호화한다.

일부 실시양태에서, 정지 코돈은 V와 B2 사이이다.

한 실시양태에서, 복수개의 주형 올리고뉴클레오티드에서 각각의 주형 올리고뉴클레오티드는 실질적으로 등몰량으로 존재한다. 또 다른 실시양태에서, 복수개의 주형 올리고뉴클레오티드는, (1) V 및 J 폴리뉴클레오티드가 도 5a-5l에서 TCRB V/J 세트 1, TCRB V/J 세트 2, TCRB V/J 세트 3, TCRB V/J 세트 4, TCRB V/J 세트 5, TCRB V/J 세트 6, TCRB V/J 세트 7, TCRB V/J 세트 8, TCRB V/J 세트 9, TCRB V/J 세트 10, TCRB V/J 세트 11, TCRB V/J 세트 12 및 TCRB V/J 세트 13으로서 68개의 TCRB V 및 J 서열 번호의 1개 이상의 세트에 명기된 TCRB V 및 J 서열을 갖는 것인 일반식 (I)의 복수개의 올리고뉴클레오티드 서열; (2) V 및 J 폴리뉴클레오티드가 도 6a 및 6b에서 TCRG V/J 세트 1, TCRG V/J 세트 2, TCRG V/J 세트 3, TCRG V/J 세트 4 및 TCRG V/J 세트 5로서 14개의 TCRG V 및 J 서열 번호의 1개 이상의 세트에 명기된 TCRG V 및 J 서열을 갖는 것인 일반식 (I)의 복수개의 올리고뉴클레오티드 서열; (3) V 및 J 폴리뉴클레오티드가 도 7a-7m에서 IGH V/J 세트 1, IGH V/J 세트 2, IGH V/J 세트 3, IGH V/J 세트 4, IGH V/J 세트 5, IGH V/J 세트 6, IGH V/J 세트 7, IGH V/J 세트 8 및 IGH V/J 세트 9로서 127개의 IGH V 및 J 서열 번호의 1개 이상의 세트에 명기된 IGH V 및 J 서열을 갖는 것인 일반식 (I)의 복수개의 올리고뉴클레오티드 서열; (4) 서열 번호:3157-4014에 명기된 바와 같은 일반식 (I)의 복수개의 올리고뉴클레오티드 서열; (5) 서열 번호:4015-4084에 명기된 바와 같은 일반식 (I)의 복수개의 올리고뉴클레오티드 서열; (6) 서열 번호:4085-5200에 명기된 바와 같은 일반식 (I)의 복수개의 올리고뉴클레오티드 서열; (7) 서열 번호:5579-5821에 명기된 바와 같은 일반식 (I)의 복수개의 올리고뉴클레오티드 서열; (8) 서열 번호: 5822-6066에 명기된 바와 같은 일반식 (I)의 복수개의 올리고뉴클레오티드 서열; 및 (9) 서열 번호: 6067-6191에 명기된 바와 같은 일반식 (I)의 복수개의 올리고뉴클레오티드 서열로부터 선택되는 일반식 (I)의 복수개의 서열을 갖는다.

일부 실시양태에서, V는 적응 면역 수용체 V 영역 암호화 유전자 서열의 30, 60, 90, 120, 150, 180, 또는 210개 이상의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드, 또는 그의 보체이다. 또 다른 실시양태에서, V는 적응 면역 수용체 V 영역 암호화 유전자 서열의 900, 800, 700, 600 또는 500개 이하의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드, 또는 그의 보체이다.

다른 실시양태에서, J는 적응 면역 수용체 J 영역 암호화 유전자 서열의 16-30, 31-60, 61-90, 91-120, 또는 120-150개 이상의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드, 또는 그의 보체이다. 또 다른 실시양태에서, J는 적응 면역 수용체 J 영역 암호화 유전자 서열의 500, 400, 300 또는 200개 이하의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드, 또는 그의 보체이다.

일부 실시양태에서, 각각의 주형 올리고뉴클레오티드는 길이가 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300 또는 200개 미만의 뉴클레오티드이다.

다른 실시양태에서, 조성물은 복수 a'개의 특유의 V-절편 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 복수 b'개의 특유의 J-절편 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하는 하나 이상의 적응 면역 수용체를 암호화하는 재배열된 핵산 분자를 증폭시킬 수 있는 올리고뉴클레오티드 프라이머의 세트를 포함한다. 일부 실시양태에서, a'는 1 내지 포유동물 게놈에서 다수의 최대 V 유전자 절편이고, b'는 1 내지 포유동물 게놈에서 다수의 최대수 J 유전자 절편이다. 한 실시양태에서, a'는 a이다. 또 다른 실시양태에서, b'는 b이다.

또 다른 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트에서 각각의 V-절편 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 각각의 J-절편 올리고뉴클레오티드 프라이머는 복수개의 주형 올리고뉴클레오티드에서 1개 이상의 주형 올리고뉴클레오티드에 특이적으로 혼성화될 수 있다. 다른 실시양태에서, 각각의 V-절편 올리고뉴클레오티드 프라이머는 1개 이상의 적응 면역 수용체 V 영역-암호화 유전자 절편에 상보적인 15개 이상의 인접 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 다른 실시양태에서, 각각의 J-절편 올리고뉴클레오티드 프라이머는 1개 이상의 적응 면역 수용체 J 영역-암호화 유전자 절편에 상보적인 15개 이상의 인접 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

다른 실시양태에서, 조성물은 각각의 V-절편 올리고뉴클레오티드 프라이머가 특이적으로 혼성화될 수 있는 일반식 (I)의 올리고뉴클레오티드 서열을 갖는 1개 이상의 주형 올리고뉴클레오티드, 및 각각의 J-절편 올리고뉴클레오티드 프라이머가 특이적으로 혼성화될 수 있는 일반식 (I)의 올리고뉴클레오티드 서열을 갖는 1개 이상의 주형 올리고뉴클레오티드를 포함한다.

본 발명은 포유동물 대상체의 림프계 세포로부터의 재배열된 핵산 분자를 포함하는 생물학적 샘플에서의 하나 이상의 적응 면역 수용체를 암호화하는 재배열된 핵산 분자를 증폭시킬 수 있는 올리고뉴클레오티드 프라이머의 세트의 구성원 중에서 불균일 핵산 증폭능(amplification potential)을 측정하는 방법을 포함한다. 방법은 (a) 다중 PCR 반응으로 본원에 기재된 바와 같은 조성물을 증폭시켜 복수개의 증폭된 주형 올리고뉴클레오티드를 수득하는 단계; (b) 상기 복수개의 증폭된 주형 올리고뉴클레오티드를 서열분석하여 상기 복수개를 포함하는 각각의 특유의 주형 올리고뉴클레오티드에 대해, (i) 주형 올리고뉴클레오티드 서열 및 (ii) 상기 주형 올리고뉴클레오티드 서열의 발생 빈도를 결정하는 단계; 및 (c) 상기 주형 올리고뉴클레오티드 서열 각각의 발생 빈도를 기대 분포와 비교하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 기대 분포는 상기 조성물을 포함하는 상기 복수개의 주형 올리고뉴클레오티드의 예정된 몰비를 기반으로 하고, 여기서 상기 주형 올리고뉴클레오티드 서열의 상기 발생 빈도와 상기 기대 분포 사이의 편차는 올리고뉴클레오티드 증폭 프라이머의 세트의 구성원 중에서 불균일 핵산 증폭능을 나타내는 것이다.

한 실시양태에서, 예정된 몰비는 등몰이다. 또 다른 실시양태에서, 기대 분포는 올리고뉴클레오티드 프라이머의 상기 세트에 의해 증폭된 주형 올리고뉴클레오티드의 상기 세트에 관한 균일 증폭 수준을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 각각의 증폭된 주형 핵산 분자는 길이가 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100, 90, 80 또는 70개 미만의 뉴클레오티드이다.

방법은 기대 분포에 비해 불균일 증폭능을 나타내는 올리고뉴클레오티드 프라이머의 세트의 각각의 구성원에 대해, 올리고뉴클레오티드 증폭 프라이머의 세트에서 올리고뉴클레오티드 프라이머 구성원의 상대적 표시를 조정하는 것을 포함하는 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, 조정하는 것은 올리고뉴클레오티드 프라이머의 세트에서 구성원의 상대적 표시를 증가시키고, 그로 인해 올리고뉴클레오티드 프라이머의 세트의 구성원 중에서 불균일 핵산 증폭능을 보정하는 것을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 조정하는 것은 올리고뉴클레오티드 프라이머의 세트에서 구성원의 상대적 표시를 감소시키고, 그로 인해 올리고뉴클레오티드 프라이머의 세트의 구성원 중에서 불균일 핵산 증폭능을 보정하는 것을 포함한다.

다른 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 프라이머의 세트는 V-영역 위유전자(pseudogene) 또는 오르폰(orphon)에 또는 J-영역 위유전자 또는 오르폰에 특이적으로 혼성화되는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하지 않는다.

또한, 방법은 기대 분포에 비해 불균일 증폭능을 나타내는 올리고뉴클레오티드 증폭 프라이머의 세트의 각각의 구성원에 대해, 증폭이 상기 구성원에 의해 촉진되는, 증폭된 주형 핵산 분자의 비례해서 증가 또는 감소된 발생 빈도를 계산하고, 그로 인해 올리고뉴클레오티드 프라이머의 세트의 구성원 중에서 불균일 핵산 증폭능을 보정하는 것을 포함하는 단계를 포함한다.

본 발명은 포유동물 대상체의 림프계 세포로부터의 재배열된 핵산 분자를 포함하는 생물학적 샘플에서 각각 가변 (V) 영역 및 결합 (J) 영역을 포함하는 하나의 또는 복수개의 적응 면역 수용체를 암호화하는 복수개의 재배열된 핵산 분자를 정량화하는 방법으로서, (A) (1) 포유동물 대상체의 림프계 세포를 포함하는 생물학적 샘플로부터의 재배열된 핵산 분자; (2) 특유의 올리고뉴클레오티드 서열을 갖는 복수개의 주형 올리고뉴클레오티드 각각의 알려진 수가 존재하는 본원에 기재된 바와 같은 조성물; (3) 생물학적 샘플로부터의 하나의 또는 복수개의 적응 면역 수용체를 암호화하는 재배열된 핵산 분자를 증폭시킬 수 있는 올리고뉴클레오티드 증폭 프라이머 세트를 포함하는 다중 중합효소 연쇄 반응 (PCR)으로 재배열된 핵산 분자를 증폭시키는 것을 포함하는 방법을 포함한다.

일부 실시양태에서, 프라이머 세트는 (a) 실질적으로 등몰량으로, 각각 독립적으로 적응 면역 수용체 V-영역 폴리펩티드를 암호화하는 1개 이상의 폴리뉴클레오티드에 또는 그의 보체에 특이적으로 혼성화될 수 있는 복수개의 V-절편 올리고뉴클레오티드 프라이머 (여기서 각각의 V-절편 프라이머는 1개 이상의 기능성 적응 면역 수용체 V 영역-암호화 유전자 절편에 상보적인 15개 이상의 인접 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 여기서 복수개의 V-절편 프라이머는 조성물에 존재하는 실질적으로 모든 기능성 적응 면역 수용체 V 영역-암호화 유전자 절편에 특이적으로 혼성화된다), 및 (b) 실질적으로 등몰량으로, 각각 독립적으로 적응 면역 수용체 J-영역 폴리펩티드를 암호화하는 1개 이상의 폴리뉴클레오티드에 또는 그의 보체에 특이적으로 혼성화될 수 있는 복수개의 J-절편 올리고뉴클레오티드 프라이머 (여기서 각각의 J-절편 프라이머는 1개 이상의 기능성 적응 면역 수용체 J 영역-암호화 유전자 절편에 상보적인 15개 이상의 인접 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 여기서 복수개의 J-절편 프라이머는 조성물에 존재하는 실질적으로 모든 기능성 적응 면역 수용체 J 영역-암호화 유전자 절편에 특이적으로 혼성화된다)를 포함한다.

또 다른 실시양태에서, V-절편 및 J-절편 올리고뉴클레오티드 프라이머는 상기 다중 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에서 (i) 다수의 증폭된 주형 올리고뉴클레오티드를 생성하기 위해 조성물 중 실질적으로 모든 주형 올리고뉴클레오티드 (상기 다수의 증폭된 주형 핵산 분자는 조성물 중 주형 올리고뉴클레오티드의 다양성을 정량화하기에 충분하다), 및 (ii) 다수의 증폭된 재배열된 DNA 분자를 생성하기 위해 생물학적 샘플에서 적응 면역 수용체를 암호화하는 실질적으로 모든 재배열된 핵산 분자 (상기 다수의 증폭된 재배열된 핵산 분자는 생물학적 샘플로부터의 DNA 중 재배열된 핵산 분자의 다양성을 정량화하기에 충분하다)의 증폭을 촉진시킬 수 있다.

한 실시양태에서, 복수개의 증폭된 주형 올리고뉴클레오티드 및 복수개의 증폭된 재배열된 핵산 분자 중 각각의 증폭된 핵산 분자는 길이가 1000개 미만의 뉴클레오티드이고; (B) 상기 증폭된 주형 올리고뉴클레오티드 및 상기 증폭된 재배열된 핵산 분자를 정량적으로 서열분석하여 (i) 1개 이상의 올리고뉴클레오티드 바코드 서열을 함유하는 증폭된 주형 올리고뉴클레오티드의 주형 생성물 수, 및 (ii) 올리고뉴클레오티드 바코드 서열이 결여된 증폭된 재배열된 핵산 분자의 재배열된 생성물 수를 정량화하는 것; (C) (B)(i)의 주형 생성물 수를 (A)(2)의 특유의 올리고뉴클레오티드 서열을 갖는 복수개의 주형 올리고뉴클레오티드 각각의 알려진 수로 나누어 증폭 인자를 계산하는 것; 및 (D) (B)(ii)의 재배열된 생성물 수를 (C)에서 계산된 증폭 인자로 나누어 샘플 중의 특유의 적응 면역 수용체 암호화 재배열된 핵산 분자의 수를 정량화하는 것.

다른 실시양태에서, 샘플 중의 특유의 적응 면역 수용체 암호화 재배열된 핵산 분자의 정량화된 수는 샘플 중의 특유의 B 세포 또는 특유의 T 세포 게놈 주형의 수이다.

본 발명은, 포유동물 대상체의 림프계 세포로부터의 재배열된 핵산 분자를 포함하는 생물학적 샘플을 수득하는 것; 상기 샘플을 본원에 기재된 바와 같은 조성물을 포함하는 알려진 양의 주형 올리고뉴클레오티드와 접촉시키는 것; 다중 PCR 반응으로 주형 올리고뉴클레오티드 및 포유동물 대상체의 림프계 세포로부터의 재배열된 핵산 분자를 증폭시켜 복수개의 증폭된 주형 올리고뉴클레오티드 및 복수개의 증폭된 재배열된 핵산 분자를 수득하는 것; 상기 복수개의 증폭된 주형 올리고뉴클레오티드를 서열분석하여 상기 복수개를 포함하는 각각의 특유의 주형 올리고뉴클레오티드에 대해, (i) 주형 올리고뉴클레오티드 서열 및 (ii) 상기 주형 올리고뉴클레오티드 서열의 발생 빈도를 결정하는 것; 및 상기 알려진 양의 상기 주형 올리고뉴클레오티드 및 상기 복수개의 증폭된 주형 올리고뉴클레오티드의 평균 카피수를 기반으로 상기 다중 PCR 반응에 대한 평균 증폭 인자를 측정하는 것을 포함하는, 다중 PCR 검정에서의 평균 증폭 인자를 계산하는 방법을 포함한다.

또한, 방법은 포유동물 대상체의 림프계 세포로부터의 상기 복수개의 증폭된 재배열된 핵산 분자를 서열분석하여 상기 복수개를 포함하는 각각의 특유의 재배열된 핵산 분자에 대해, i) 재배열된 핵산 분자 서열 및 (ii) 상기 재배열된 핵산 분자 서열의 발생 수를 측정하는 것; 및 상기 다중 PCR 반응에 대한 평균 증폭 인자 및 상기 재배열된 핵산 분자의 상기 발생 수를 기반으로 상기 샘플 중의 림프계 세포의 수를 측정하는 것을 포함한다.

다른 실시양태에서, 방법은, 상기 샘플 중의 림프계 세포의 수를 측정하는 것이 상기 증폭된 재배열된 핵산 서열 각각의 발생 수의 합계를 산출하고 상기 합계를 상기 평균 증폭 인자로 나누는 것을 포함하는 것을, 포함한다. 일부 실시양태에서, 알려진 양은 상기 주형 올리고뉴클레오티드 각각의 1개의 카피이다. 한 실시양태에서, 100 < a < 500이다. 또 다른 실시양태에서, 100 < b < 500이다.

포유동물 대상체의 림프계 세포로부터의 재배열된 핵산 분자를 포함하는 생물학적 샘플에서의 하나의 또는 복수개의 적응 면역 수용체를 암호화하는 재배열된 핵산 분자를 정량화하기 위해 다중 PCR 증폭 반응에서 증폭 바이어스를 보정하는 방법으로서, (a) 상기 샘플을 본원에 기재된 조성물과 접촉시켜 주형-스파이킹된 샘플을 생성시키는 것 (여기서 상기 주형 및 상기 재배열된 핵산 분자는 상응하는 V 및 J 영역 서열을 포함한다); (b) 상기 주형-스파이킹된 샘플을 다중 PCR 반응으로 증폭시켜 복수개의 증폭된 주형 올리고뉴클레오티드 및 복수개의 적응 면역 수용체를 암호화하는 복수개의 증폭된 재배열된 핵산 분자를 수득하는 것; (c) 상기 복수개의 증폭된 주형 올리고뉴클레오티드를 서열분석하여 상기 복수개를 포함하는 각각의 특유의 주형 올리고뉴클레오티드에 대해, (i) 주형 올리고뉴클레오티드 서열 및 (ii) 상기 주형 올리고뉴클레오티드 서열의 발생 빈도를 결정하는 것; (d) 하나의 또는 복수개의 적응 면역 수용체를 암호화하는 상기 복수개의 증폭된 재배열된 핵산 분자를 서열분석하여 상기 복수개를 포함하는 상기 복수개의 적응 면역 수용체를 암호화하는 각각의 특유의 재배열된 핵산 분자에 대해, (i) 재배열된 핵산 분자 서열 및 (ii) 상기 재배열된 핵산 분자 서열의 발생 빈도를; (e) 상기 주형 올리고뉴클레오티드 서열의 발생 빈도를 기대 분포와 비교하는 것 (여기서 상기 기대 분포는 상기 조성물을 포함하는 상기 복수개의 주형 올리고뉴클레오티드의 예정된 몰비를 기반으로 하고, 여기서 상기 주형 올리고뉴클레오티드 서열의 상기 발생 빈도와 상기 기대 분포 사이의 편차는 올리고뉴클레오티드 증폭 프라이머의 세트의 구성원 중에서 불균일 핵산 증폭능을 나타낸다); (f) 상기 명시된 불균일 핵산 증폭능을 갖는 올리고뉴클레오티드 증폭 프라이머의 세트의 상기 구성원에 의해 증폭된 주형 분자 및 재배열된 핵산 분자 서열의 세트에 대한 보정값의 세트를 산출하는 것 (여기서 보정값의 상기 세트는 상기 다중 PCR 반응에서 증폭 바이어스를 보정한다); 및 (g) 임의로 보정값의 상기 세트를 상기 재배열된 핵산 분자 서열의 상기 발생 빈도에 적용하여 상기 다중 PCR 반응에서 증폭 바이어스를 보정하는 것을 포함하는 방법이 제공된다.

본 발명은, 본원에 기재된 바와 같은 복수개의 주형 올리고뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드 프라이머의 세트를 포함하는 조성물을 포함하는 시약; 포유동물 대상체의 림프계 세포로부터의 재배열된 핵산 분자를 포함하는 생물학적 샘플에서의 하나 이상의 적응 면역 수용체를 암호화하는 재배열된 핵산 분자를 증폭시킬 수 있는 올리고뉴클레오티드 프라이머의 세트의 구성원 중에서 불균일 핵산 증폭능을 측정하기 위한 사용 설명서를 포함하는 키트를 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 키트는 불균일 핵산 증폭능을 갖는 올리고뉴클레오티드 프라이머의 세트의 하나 이상의 구성원을 보정하기 위한 사용 설명서를 포함한다.

다른 실시양태에서, 키트는 샘플 중의 특유의 적응 면역 수용체 암호화 재배열된 핵산 분자의 수를 정량화하기 위한 사용 설명서를 포함한다.

본원에 기재된 발명 실시양태의 이들 및 다른 측면은 하기 상세한 설명 및 첨부된 도면을 참조로 하면 명백해질 것이다. 본 명세서에서 언급되고/거나 적용 데이터 시트에 열거된 모든 미국 특허, 미국 특허 출원 공보, 미국 특허 출원, 외국 특허, 외국 특허 출원 및 비특허 간행물은, 마치 각각이 개별적으로 포함된 것과 같이, 그 전문이 본원에 참고로 포함된다. 본 발명의 측면 및 실시양태는, 필요한 경우, 수정되어 또 다른 추가 실시양태를 제공하기 위해 다양한 특허, 출원 및 간행물의 개념을 이용할 수 있다.

본 발명의 이들 및 다른 특질, 측면, 및 이점은 하기 설명, 및 첨부된 도면과 관련하여 더 잘 이해될 것이다.
<도 1>
도면 (도) 1은 적응 면역 수용체 (TCR 또는 BCR)를 암호화하는 재배열된 DNA를 증폭시킬 수 있는 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트의 증폭 효율을 표준화하는데 사용하기 위한 예시적 주형 올리고뉴클레오티드의 개략도를 나타낸다. U1, U2, 범용 어댑터 올리고뉴클레오티드; B1-4, 바코드 올리고뉴클레오티드; V, 가변 영역 올리고뉴클레오티드; J, 결합 영역 올리고뉴클레오티드; R, 제한 효소 인식 부위; S, 임의적 정지 코돈.
<도 2>
도 2는 52개의 PCR 프라이머 (서열 번호:1753-1804)의 등몰 (미조정) 풀을 사용하여 표준화 올리고뉴클레오티드 주형 조성물 (서열 번호:872-1560에 명기된 주형의 등몰 풀)로부터 증폭되고 일루미나(Illumina) HiSeq™ DNA 서열분석기 상에서 정량적으로 서열분석된 개별 TCRB V 유전자 절편 서열의 증폭후 빈도(post-amplification frequency)를 나타낸다. 바이어스의 부재하에 빈도는 0.0188로서 계산되었다.
<도 3>
도 3은 TCRB V 영역-특이적 프라이머를 사용한 주형 올리고뉴클레오티드의 교차 증폭(cross-amplification)후 정량적 서열분석의 결과를 나타낸다. Y-축은 표준화 올리고뉴클레오티드 주형 조성물 (서열 번호:872-1560에 명기된 주형의 등몰 풀)의 증폭을 위해, 동일 프라이머 세트로부터 다른 프라이머의 몰 농도의 2배 (2X)로 각각의 별개의 증폭 반응기에 존재했던 개별 증폭 프라이머 (서열 번호:1753-1804)를 나타내고; X-축은 표지되어 있지는 않으나 데이터점은 Y-축과 동일한 순서로 제시되며, 여기서 X-축은 정량적 서열분석에 의해 동정된 바와 같은 상응하는 증폭된 V 유전자 주형을 나타낸다. 흑색 사각형은 모든 다른 프라이머의 등몰 농도에 비해 2X로 존재하는 각각의 프라이머를 사용한 증폭의 정도에서 어떤 변화도 없음을 나타내고; 백색 사각형은 증폭의 10배 증가를 나타내고; 회색 사각형은 0 내지 10배 사이의 증폭의 중간 정도 (그레이스케일 구배(greyscale gradient) 상에서)를 나타낸다. 백색 사각형의 대각선은 소정의 프라이머에 대한 2X 농도가 대부분의 프라이머에 대한 각각의 주형의 증폭의 약 10배 증가를 초래하였음을 나타낸다. 비대각 백색 사각형은 특정 프라이머가 어닐링 및 증폭시킬 수 있었던 비상응 주형을 나타낸다.
<도 4>
도 4는 프라이머 이용 바이어스를 조정하기 전에 TCRB 증폭 프라이머 세트 (서열 번호:1753-1804)의 모든 구성원의 등몰 농도를 사용하여 (흑색 바, 모든 V-영역 프라이머는 등몰 농도로 존재한다), 그리고 바이어스를 보상하기 위해 다중 개별 프라이머 농도를 조정한 후 동일 프라이머 세트 (서열 번호:1753-1804)를 사용하여 (회색 바, 고효율의 프라이머의 농도는 감소되고 저조하게 효율적인 프라이머의 농도는 증가되었다, 표 6 참조), 표준화 올리고뉴클레오티드 주형 조성물 (서열 번호:872-1560에 명기된 주형의 등몰 풀)로부터 증폭된 개별 TCRB V 유전자 절편 서열의 증폭후 빈도를 나타낸다. 증폭후 빈도를 일루미나 HiSeq™ DNA 서열분석기 상에서 정량적 서열분석에 의해 측정하였다.
<도 5a 내지 도 5l>
도 5a-5l은 하나의 또는 복수개의 인간 T 세포 수용체 β (TCRB) 쇄 폴리펩티드를 암호화하는 재배열된 DNA를 증폭시킬 수 있는 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트의 증폭 효율을 표준화하는데 사용하기 위한, 일반식 5'-U1-B1-V-B2-R-B3-J-B4-U2-3' [I]의 복수개의 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는 주형 조성물에서 사용하기 위한 TCRB V/J 세트 (68 V + 13 J)를 나타낸다.
<도 6a 및 도 6b>
도 6a 및 6b는 하나의 또는 복수개의 인간 T 세포 수용체 γ (TCRG) 쇄 폴리펩티드를 암호화하는 재배열된 DNA를 증폭시킬 수 있는 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트의 증폭 효율을 표준화하는데 사용하기 위한, 일반식 5'-U1-B1-V-B2-R-B3-J-B4-U2-3' [I]의 복수개의 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는 주형 조성물에서 사용하기 위한 TCRG V/J 세트 (14 V + 5 J)를 나타낸다.
<도 7a 내지 도 7m>
도 7a-7m은 하나의 또는 복수개의 인간 면역글로불린 중 (IGH) 쇄 폴리펩티드를 암호화하는 재배열된 DNA를 증폭시킬 수 있는 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트의 증폭 효율을 표준화하는데 사용하기 위한, 일반식 5'-U1-B1-V-B2-R-B3-J-B4-U2-3' [I]의 복수개의 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는 주형 조성물에서 사용하기 위한 IGH V/J 세트 (127 V + 9 J)를 나타낸다.
<도 8>
도 8은 IGH 서열의 다중 PCR 증폭에 부가된 주형 조성물에서 각각의 VJ 쌍에 대한 증폭 인자를 계산한 다음, 모든 합성 주형에 걸쳐서 증폭 입자를 평균내어 모든 합성 주형 분자에 걸쳐서 배수 서열 커버리지(fold sequence coverge)를 추정한 결과를 나타낸다.
<도 9>
도 9는 본원에 기재된 바와 같은 합성 주형 조성물 및 증폭 인자를 사용하여 추정된 B 세포의 수, 대 자연 DNA 주형의 공급원으로서 사용된 B 세포의 알려진 수의 플롯을 나타낸다.
<도 10>
도 10은 1116개의 IGH VJ 바이어스 제어 분자 및 243개의 IGH DJ 바이어스 제어 분자 각각에 대한 사전-PCR 증폭 서열분석 카운트를 나타낸다.
<도 11>
도 11은 상대적 증폭 바이어스에 대해 그래프로 나타낸 합성 TCRB VJ 주형에 대한 TCRB-프라이머 반복을 나타낸다.
<도 12>
도 12는 상대적 증폭 바이어스에 대해 그래프로 나타낸 합성 IGH VJ 주형에 대한 IGH 프라이머 반복을 나타낸다.
<도 13>
도 13은 V 유전자의 27개의 합성 IGH DJ 주형에 대한 상대적 증폭 바이어스를 나타낸다.
<도 14a 내지 도 14d>
도 14a-d는 55개의 합성 TCRG VJ 주형에 대한 TCRG-프라이머 반복을 나타낸다. 화학적 바이어스 제어 보정 이전에 (도 14a), 화학적 보정의 1회차 반복 (도 14b), 화학적 보정의 2회차 반복 (도 14c), 및 화학적 보정의 최종 반복 (도 14d) TCRG VJ 프라이머에 대해 상대적 증폭 바이어스를 측정하였다.

본 발명은, 특정 실시양태에서 및 본원에 기재된 바와 같이, 적응 면역 수용체, 예컨대 면역글로불린 (Ig) 및/또는 T 세포 수용체 (TCR)를 암호화하는 재배열된 유전자의 크고 구조적으로 다양한 집단을 신뢰할 수 있게 정량화하는데 유용한 조성물 및 방법을 제공한다. 이들 재배열된 유전자는 인간 대상체를 포함한, 대상체 또는 생물학적 공급원의 림프계 세포로부터의 DNA를 함유하는 생물학적 샘플에 존재할 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같은, "재배열된 핵산 분자"는, 재배열된 적응 면역 수용체를 암호화하는 서열을 포함하는 림프계 세포주로부터 직접 또는 간접적으로 수득된 임의의 게놈 DNA, cDNA, 또는 mRNA를 포함할 수 있다.

본원에는 이러한 증폭된 생성물의 정량적 고 처리량 서열분석 이전에, 적응 면역 수용체를 암호화하는 재배열된 유전자를 함유하는 생물학적 샘플로부터의 증폭된 재배열된 DNA 분자의 집단을 생성하기 위해 다중 핵산 증폭 반응에서 사용되는 복합 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트의 표준화 및 교정에 관한 예상외로 유리한 접근법이 개시된다. 재배열된 TCR 및 BCR (IG) 암호화 DNA 서열의 다중 증폭 및 고 처리량 서열분석은, 예를 들어, 문헌 [Robins et al., 2009 Blood 114, 4099]; [Robins et al., 2010 Sci. Translat. Med. 2:47ra64]; [Robins et al., 2011 J. Immunol. Meth. doi:10.1016/j.jim.2011.09. 001]; [Sherwood et al. 2011 Sci. Translat. Med. 3:90ra61]; [U.S.A.N. 13/217,126 (미국 공개 번호 2012/0058902), U.S.A.N. 12/794,507 (미국 공개 번호 2010/0330571), WO/2010/151416, WO/2011/106738 (PCT/US2011/026373), WO2012/027503 (PCT/US2011/049012), U.S.A.N. 61/550,311, 및 U.S.A.N. 61/569,118]에 기재되어 있고; 따라서 이들 개시내용은 참조로 포함되며 본원에 기재된 실시양태에 따른 사용에 적합화시킬 수 있다.

간략하게 그리고 비제한적 이론에 따르면, 본 조성물 및 방법은 다중 핵산 증폭의 생성물을 서열분석함으로써 TCR 및 BCR 유전자 다양성을 정량화하는 현재 방법에서 일어날 수 있는 부정확성을 해결한다. 생물학적 샘플에 존재할 수 있는 TCR 및 BCR 유전자 주형 서열의 막대한 다양성에 부응하기 위해, 다중 증폭 반응에서 사용된 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 전형적으로 다종 다양한 서열 길이 및 뉴클레오티드 조성 (예를 들어, GC 함량)을 포함한다. 그 결과, 증폭 반응 조건의 소정의 세트하에, 상이한 프라이머가 그의 동족(cognate) 주형 서열에 어닐링되고 그의 증폭을 지지하는 효율은 현저하게 상이할 수 있고, 이로써 상이한 프라이머의 불균일 이용이 초래되며, 이는 구별되는 증폭 생성물의 상대 정량적 표시에 인위적 바이어스를 야기한다.

예를 들어, 일부 고효율 프라이머의 상대적 과다 이용은 특정 증폭 생성물의 과다 표시를 초래하고, 일부 다른 저효율 프라이머의 상대적 과소이용은 특정 다른 증폭 생성물의 과소표시를 초래한다. 증폭 생성물을 서열분석함으로써 달성되는, 림프계 세포 DNA-함유 샘플에 존재하는 각각의 주형 종의 상대량의 정량적 측정(quantitative determination)은, 그 다음, 증폭 이전에 샘플 중의 구별되는 주형 종의 실제 상대적 표시에 대하여 허위 정보를 산출할 수 있다. 예비 연구에서, 예를 들어, 인간 림프계 세포 DNA 주형으로부터 모든 가능한 인간 TCRB 가변 (V) 영역 유전자의 서열을 증폭시킬 수 있도록 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머의 세트를 사용하는 다중 PCR은 TCRB V 유전자 절편을 균일하게 증폭시키지 않은 것으로 관찰되었다. 대신에, 일부 V 유전자 절편은 상대적으로 과다 증폭 (총 서열의 ~10% 표시)되고 다른 V 유전자 절편은 상대적으로 과소 증폭 (총 서열의 약 4 × 10^-3% 표시)되었고; 또한, 예를 들어 도 2 참조.

증폭 프라이머의 아집단의 이러한 바이어스된 이용의 문제를 해결하기 위해, 본 개시내용은 처음으로 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트의 구성원의 증폭 효율을 표준화하기 위한 주형 조성물 및 방법을 제공하며, 여기서 프라이머 세트는 림프계 세포로부터의 DNA를 포함하는 생물학적 샘플에서의 복수개의 적응 면역 수용체 (TCR 또는 Ig)를 암호화하는 재배열된 DNA를 증폭시킬 수 있다. 주형 조성물은 본원에서 더 상세히 기재된 바와 같은 일반식 (I)의 복수개의 다양한 주형 올리고뉴클레오티드를 포함한다:

5'-U1-B1-V-B2-R-B3-J-B4-U2-3' (I)

주형 조성물을 이루는 구성 주형 올리고뉴클레오티드는 개별 주형 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열에 대하여 다양하다. 따라서 개별 주형 올리고뉴클레오티드는 수많은 가능한 TCR 또는 BCR 가변 (V) 및 결합 (J) 영역 폴리뉴클레오티드 중에서 상당한 서열 가변성에 따라 뉴클레오티드 서열이 서로 대폭 달라질 수 있다. 개별 주형 올리고뉴클레오티드 종의 서열은 또한 다양한 복수개의 주형내에 특정의 주형에 포함되는 U1, U2, B (B1, B2, B3, 및 B4) 및 R 올리고뉴크레오티드의 서열 차이에 따라 서로 달라질 수 있다.

특정 실시양태에서 바코드 올리고뉴클레오티드 B (B1, B2, B3, 및 B4)는 독립적으로 및 임의로 올리고뉴클레오티드 바코드 서열을 포함할 수 있고, 여기서 바코드 서열을 선택하여 특정의 특유의 V 올리고뉴클레오티드 서열과 특정의 특유의 J 올리고뉴클레오티드 서열의 특정의 쌍체 조합을 특유하게 동정한다. 바코드 올리고뉴클레오티드 B1 및 B4 및 범용 어댑터의 상대 위치 결정 방법(relative positioning)으로 인해 유리하게는 자동 DNA 서열분석기 (예를 들어, 일루미나 HiSeq™ 또는 일루미나 MiSEQ®, 또는 진어낼라이저(GeneAnalyzer)™-2, 일루미나 코포레이션(Illumina Corp.), 캘리포니아주 샌 디에이고) 상에서의 짧은 서열 판독 및 페어드-엔드(paired-end) 서열분석에 의한 소정의 특유의 주형 올리고뉴클레오티드의 증폭 생성물의 신속한 동정 및 정량화가 가능하게 된다. 특히, 이들 및 관련 실시양태로 인해 증폭 생성물에 존재하는 V 및 J 서열의 특이적 조합의 신속한 고 처리량 결정이 가능해지고, 그로 인해 샘플 중의 재배열된 TCR 또는 BCR 암호화 DNA를 증폭시킬 수 있는 프라이머 세트에 존재할 수 있는 각각의 V-특이적 프라이머 및 각각의 J-특이적 프라이머의 상대 증폭 효율을 특성화하게 된다. 증폭 생성물의 동정 및/또는 양의 검증은, 임의로 B2로 연장되는 서열 판독을 포함한 더 긴 서열 판독에 의해 완수될 수 있다.

사용 중에, 복수개의 주형 올리고뉴클레오티드에서 각각의 주형 올리고뉴클레오티드는 실질적으로 등몰량으로 존재하며, 이는 특정의 바람직한 실시양태에서 모든 올리고뉴클레오티드의 몰 농도가 서로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25 퍼센트인 제제를 포함한다. 본원에 제공된 바와 같은 특정 다른 바람직한 실시양태에서, 주형 올리고뉴클레오티드는, 임의의 소정의 특유의 주형 올리고뉴클레오티드 종이 가질 수 있는 최대 몰 농도가 조성물에서 최저 농도를 갖는 특유의 주형 올리고뉴클레오티드 종이 존재하는 몰 농도보다 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 440, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40 또는 30 퍼센트 이하만큼 큰 제제를 포함하여, 모든 올리고뉴클레오티드의 몰 농도가 서로 10배 이내에 있는 경우 실질적으로 등몰량으로 존재하는 것으로 간주된다.

유사한 방식으로, 본원에 개시된 특정 실시양태는 증폭을 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 고려하며, 여기서 세트 성분 프라이머는 실질적으로 등몰량으로 제공될 수 있다. 또한, 본원에 기재된 바와 같이, 특정 다른 실시양태에 따르면, 프라이머 세트에서 하나 이상의 프라이머의 농도를 의도적으로 조정할 수 있어서 특정 프라이머가 등몰량 또는 실질적으로 등몰량으로 존재하지 않도록 한다.

본원에 기재된 주형 조성물은, 바람직한 실시양태에서, 핵산 증폭 (예를 들어, PCR) 주형으로서 이용되어, 재배열된 TCR 또는 Ig 유전자의 다중 증폭에서 사용될 수 있는, 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 예컨대 V-절편 및 J-절편 올리고뉴클레오티드 프라이머의 복합 세트, 예를 들어, 본원에 제공된 바와 같은 프라이머 세트 또는 문헌 [Robins et al., 2009 Blood 114, 4099]; [Robins et al., 2010 Sci. Translat. Med. 2:47ra64]; [Robins et al., 2011 J. Immunol. Meth. doi:10.1016/j.jim.2011.09. 001]; [Sherwood et al. 2011 Sci. Translat. Med. 3:90ra61]; [U.S.A.N. 13/217,126 (US 공개 번호 2012/0058902), U.S.A.N. 12/794,507 (US 공개 번호 2010/0330571), WO/2010/151416, WO/2011/106738 (PCT/US2011/026373), WO2012/027503 (PCT/US2011/049012), U.S.A.N. 61/550,311, 및 U.S.A.N. 61/569,118]등에 기재된 프라이머 세트 중 어느 한 세트를 특성화할 수 있다.

바람직하게는, 본원에 기재되어 있고 다양한 서열 및 일반식 (I)의 일반 구조를 갖는 복수개의 주형 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 증폭 효율을 표준화하기 위한 주형 조성물 중의 모든 주형은 실질적으로 동일한 길이의 올리고뉴클레오티드이다. 이론에 의해 얽매이는 것을 바라지 않으면서, 일반적으로 핵산 증폭 반응, 예컨대 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에서, 주형 DNA 길이는 프라이머와 뉴클레오티드 염기 보체를 통해 특이적, 뉴클레오티드 서열-유도(directed) 혼성화에 의해 프라이머가 어닐링되는 주형 DNA 분자 사이의 상호작용의 반응속도론에 영향을 미침으로써 올리고뉴클레오티드 프라이머의 증폭 효율에 영향을 줄 수 있는 것으로 여겨진다. 더 긴 주형이 일반적으로 상대적으로 더 짧은 주형보다 덜 효율적으로 작동하는 것으로 간주된다. 특정 실시양태에서, 복수개의 TCR 또는 BCR을 암호화하는 재배열된 DNA를 증폭시킬 수 있는 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트의 증폭 효율을 표준화하기 위한 현재 개시된 주형 조성물은 본원에 제공된 바와 같은 일반식 (I)의 복수개의 주형 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 주형 올리고뉴클레오티드는 길이가 1000, 950, 900, 850, 800, 750, 700, 650, 600, 550, 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150 또는 100개 이하의 뉴클레오티드 (그 사이에 모든 정수값 포함)인, 길이가 동일하거나 길이가 실질적으로 동일하다.

따라서, 다중 중폭 동안 올리고뉴클레오티드 프라이머 이용에서 바람직하지 않은 바이어스의 잠재적 원인 제공을 감소, 제거 또는 최소화하기 위해, 본원에 개시된 바람직한 실시양태는 복수개의 주형 올리고뉴클레오티드를 이용할 수 있고 여기서 서열-다양한 복수의 주형 올리고뉴클레오티드에서의 모든 주형 올리고뉴클레오티드는 길이가 실질적으로 동일하다. 복수개의 주형 올리고뉴클레오티드는, 주형 조성물 중 모든 (예를 들어, 100%) 또는 대부분의 (예를 들어, 50% 초과) 이러한 올리고뉴클레오티드가 각각 정확히 동일한 수의 뉴클레오티드를 갖는 올리고뉴클레오티드인 경우, 또는 주형 조성물 중 하나 이상의 주형 올리고뉴클레오티드가 길이가 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100개 이하의 뉴클레오티드로 서로 길이가 다를 수 있는 경우, 길이가 실질적으로 동일할 수 있다. 본 개시내용으로부터 반드시 모든 주형 올리고뉴클레오티드가 정확히 동일한 길이를 갖지 않는 상황에서 조차, 본원에 기재된 조성물 및 방법을 여전히 이용하여 올리고뉴클레오티드 증폭 프라이머의 세트의 구성원 중에서 불균일 핵산 증폭능을 측정하고 임의로 보정할 수 있다는 점을 알게 될 것이다.

특정의 현재 개시된 실시양태에 따르면, (i) 현재 기재된 주형 조성물의 각각의 주형 올리고뉴클레오티드는 실질적으로 등몰량으로 제공되고, (ii) 복수개의 적응 면역 수용체를 암호화하는 재배열된 DNA를 증폭시킬 수 있는 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 실질적으로 등몰량으로 제공되는 복수개의 V-절편 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하고, (iii) 복수개의 적응 면역 수용체를 암호화하는 재배열된 DNA를 증폭시킬 수 있는 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 실질적으로 등몰량으로 제공되는 복수개의 J-절편 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하고, (iv) 증폭은 소정의 서열의 출발 주형의 수와 함께 직선적으로 변경된다.

따라서, 각각의 주형의 증폭 생성물에 대한 기대 수율이 계산되고 100%의 이론적 균일 증폭 수준값으로 임의적으로 지정될 수 있다. 프라이머 세트가 증폭 반응에서 주형 올리고뉴클레오티드의 서열을 증폭시키는 것을 허용한 후, 구별되는 증폭 생성물의 상대 비율 중에서 관찰되는 실질적 등가로부터의 임의의 통계학상 유의한 편차는 증폭 동안 프라이머 이용에서 바이어스 (즉, 동등하지 않은 효율)가 있었음을 나타내는 것이다. 환언하면, 수득된 상이한 증폭 생성물의 상대량의 정량적 차이는 프라이머 세트의 모든 프라이머가 필적하는 효율로 그의 각각의 주형을 증폭시킨 것은 아님을 나타내는 것이다. 특정 실시양태는 이론적 100% 수율의 상하로 내성(tolerance)의 범위를 할당하는 것을 고려하여, 내성의 범위 내에 임의의 증폭 수준값이 실질적 등가로서 간주될 수 있도록 한다.

특정의 이러한 실시양태에서, 증폭 생성물 수율의 범위는 생성물 수율이 모두 동일 자릿수 내에 (예를 들어, 10배 미만으로 차이가 남) 있는 경우 실질적으로 등가인 것로서 간주될 수 있다. 특정 다른 이러한 실시양태에서, 증폭 생성물 수율의 범위는 생성물 수율이 9배, 8배, 7배, 6배, 5배, 4배 또는 3배 이하로 서로 상이한 경우 실질적으로 등가인 것로서 간주될수 있다. 특정 다른 실시양태에서, 허용되는 내성 범위내에 있는 것으로 간주될 수 있는 생성물 수율은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 100, 또는 200% 만큼 계산된 100% 수율의 초과 또는 미만일 수 있다.

방법은 정량화 과정의 일부로서 공지된 기법을 사용하여 각각의 증폭 생성물의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 것을 포함하기 때문에, 각각의 특유의 (서열에 의해 정의된 바와 같음) 생성물의 증폭에 관여하는 프라이머(들)를 동정할 수 있고 프라이머 세트 중의 그의 상대량(들)을 그에 따라 조정할 수 있다 (예를 들어, 통계학상 유의한 방식으로 증가 또는 감소시킴). 프라이머 세트 중 과도하게 효율적인 프라이머의 농도를 다른 프라이머의 농도에 비해 감소시킬 수 있고, 따라서 본원에 기재된 주형 조성물 중 주형의 이러한 프라이머에 의한 특이적 증폭의 수준이 이론적 균일 증폭 수준을 전달하거나, 허용되는 내성 범위 내에 있는 수준을 전달하는 프라이머의 대다수에 의해 전달된 증폭의 수준과 실질적으로 등가가 되도록 한다. 프라이머 세트 중 저조하게 효율적인 프라이머의 농도를 다른 프라이머의 농도에 비해 증가시킬 수 있고, 따라서 본원에 기재된 주형 조성물 중 주형의 이러한 프라이머에 의한 특이적 증폭의 수준이 이론적 균일 증폭 수준을 전달하거나, 허용되는 내성 범위 내에 있는 수준을 전달하는 프라이머의 대다수에 의해 전달된 증폭의 수준과 실질적으로 등가가 되도록 한다.

그런 이유로 그리고 본원에 기재된 바와 같이, 따라서 현재 소정의 TCR 또는 Ig 쇄의 완전 레퍼토리를 위한 암호화 서열을 증폭시키도록 설계되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트의 증폭 효율을 표준화하기 위한 주형 조성물, 이러한 프라이머 세트의 구성원 중에서 불균일 증폭 효율 ("불균일 증폭능")을 측정하는 방법, 및 이러한 불균일 증폭능을 교정하는 방법이 제공된다. 본원에 기재된 주형 조성물을 올리고뉴클레오티드 세트를 교정할 수 있는 표준으로서 제공함으로써, 그리고 각각의 주형 올리고뉴클레오티드가 실질적으로 등몰량으로 존재하여, 개별 프라이머 농도를 조정하여 증폭 생성물의 구조적으로 다양한 어레이의 실질적으로 균일한 증폭을 산출할 수 있도록 하는 특정 실시양태에서, 따라서 본 개시내용은 개별 프라이머 효율에서 바이어스와 연관된 상기 기재된 문제점을 유리하게 해결한다.

본원에 제공된 조성물 및 방법을 사용하여, 개별 프라이머는, (i) 서로 실질적으로 등몰량으로 모든 주형 올리고뉴클레오티드, (ii) 서로 실질적으로 등몰량으로 모든 V-절편 프라이머, 및 (iii) 서로 실질적으로 등몰량으로 모든 J-절편 프라이머의 증폭 반응에서의 존재에도 불구하고, 균일 증폭 수준에 비해 특이적 주형 올리고뉴클레오티드의 증가된 (예를 들어, 통계학상 유의한 방식으로 더 큰) 또는 감소된 (예를 들어, 통계학상 유의한 방식으로 더 낮은) 증폭에 의해 입증된 바와 같이 불균일 증폭의 그의 촉진에 의하여 불균일 증폭능을 갖는 것으로 동정될 수 있다.

그 다음 이러한 프라이머의 상대 농도를 감소 또는 증가시켜 모든 프라이머가 서로에 대해 실질적으로 등몰량으로 존재하는 것은 아닌 프라이머의 변형된 완전 세트를 수득하여, 각각, 균일 증폭 수준에 비해 증폭의 증가 또는 감소된 수준을 보상할 수 있다. 그 다음 프라이머 세트를 균일 증폭 수준에서, 또는 허용되는 내성 범위 내에서 본원에 개시된 주형 조성물에서 모든 서열을 증폭시키는 그의 능력에 대해 재시험할 수 있다.

모든 주형 올리고뉴클레오티드가 서로 실질적으로 등몰량으로 존재하는, 변형된 프라이머 세트를 본원에 개시된 주형 조성물을 증폭시키는 그의 능력에 대해 시험하는 방법을, 모든 생성물이 균일 증폭 수준에서, 또는 허용되는 내성 범위내에서 되풀이하여 증폭될 때까지 반복할 수 있다. 본원에 개시된 주형 조성물을 사용하는 이러한 과정에 의해, 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트의 증폭 효율을 표준화할 수 있고, 여기서 프라이머 세트는 대상체의 림프계 세포로부터의 DNA를 포함하는 생물학적 샘플에서의 하나의 또는 복수개의 적응 면역 수용체를 암호화하는 생산적으로 재배열된 DNA를 증폭시킬 수 있다

게다가 또는 대안으로, 본 개시내용에 따르면 올리고뉴클레오티드 증폭 프라이머의 임의의 특정의 쌍이 불균일 증폭능, 예컨대 올리고뉴클레오티드 증폭 프라이머의 대다수에 의해 나타낸 균일 증폭 수준에 비해 주형 조성물의 증가 또는 감소된 증폭을 나타내는지를 측정할 수 있고, 그 다음 정규화 조정 인자(normalizing adjustment factor)를 사용하여, 각각 이러한 증폭 프라이머 쌍에 의해 촉진되는 증폭 생성물의 비례적으로 감소 또는 증가된 발생 빈도를 각각 계산할 수 있다. 따라서 본 주형 조성물은, 특정 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 증폭 프라이머의 세트의 구성원 중에서 불균일 핵산 증폭능을 보정하는 방법을 제공한다.

특정의 이러한 실시양태로 유리하게는 불균일 증폭 사건의 결과로서 수득되는 데이터의 보정, 교정, 표준화, 정규화 등이 가능해질 수 있다. 따라서, 본 실시양태로 인해, 하나 이상의 증폭 프라이머의 농도를 되풀이하여 조정하고 본원에 기재된 주형 조성물을 증폭시키는 단계를 반복할 필요 없이, 예컨대 바이어스된 올리고뉴클레오티드 프라이머 이용으로부터 생길 수 있는 데이터의 부정확성이 보정가능하게 된다. 따라서 증폭 생성물을 정량적으로 서열분석하는 단계의 반복을 피할 수 있는 유리한 효율이 수득될 수 있다. 그러나, 특정 다른 고려된 실시양태는, 이러한 반복 접근법을 이용할 수 있다.

따라서, 그리고 본원에 기재된 바와 같이, 현재 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트의 증폭 효율을 표준화하기 위한 주형 조성물이, 이러한 주형 조성물을 사용하여 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트의 개별 구성원 중에서 불균일 핵산 증폭능 (예를 들어, 바이어스)을 측정하는 방법과 함께 제공된다. 또한, 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트의 구성원 중에서 이러한 불균일 핵산 증폭능 (예를 들어, 바이어스)을 보정하는 방법이 본원에 기재된다. 이들 및 관련 실시양태는 본원에 기재된 특질을 갖는 증폭 효율을 표준화하기 위한 주형 조성물을 사용하여 복합 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 교정하여 바람직하지 않은 증폭 바이어스를 보상하는 것에 의해 수득되는 이전에 인식되지 않은 이점을 활용하며, 이전에 기재된 방법론에 비해, 특이적 클론형 TCR 및/또는 Ig 암호화 DNA 서열을 정량화할 수 있는 정확도를 개선하는데 있어서의 용도를 밝힐 것이다.

또한 상기에서 언급되고 본원에 다른 곳에서 기재된 바와 같이, 본 개시 내용 이전에는, 샘플에서 실질적으로 모든 생산적으로 재배열된 적응 면역 수용체 유전자를 증폭시키도록 설계된 올리고뉴클레오티드 증폭 프라이머의 복합 세트를 사용한 다중 증폭 후, (i) 대상체로부터의 림프계 세포 DNA를 포함하는 생물학적 샘플에서 특유의 서열을 갖는, 재배열된 적응 면역 수용체-암호화 DNA 주형의 실제 정량적 분포와, (ii) 이러한 주형의 핵산 증폭 생성물의 상대적 표시 사이의 불만족스럽고 식별하기 곤란한 차이가 존재하였다. 예를 들어, 주형 집단과 증폭 프라이머 세트 둘 다의 이질성으로 인해, 그리고 본원에 나타낸 바와 같이, 상이한 증폭 프라이머의 증폭 효율의 상당한 격차는 흔할 수 있고, 이는 증폭 반응 후 수득되고 정량적으로 서열분석되는 증폭 생성물의 상대적 비율의 실질적 왜곡을 야기한다.

주형 및 프라이머

따라서 특정의 바람직한 실시양태에 따르면 대상체의 림프계 세포로부터의 DNA를 포함하는 생물학적 샘플에서의 하나의 또는 복수개의 적응 면역 수용체를 암호화하는 재배열된 DNA (이는 특정 실시양태에서 생산적으로 재배열된 DNA를 지칭할 수 있지만 특정 다른 실시양태에서는 그렇게 제한될 필요가 없음)를 증폭시킬 수 있는 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트의 증폭 효율을 표준화하기 위한, 본원에 제공된 바와 같은 일반식 (I)의 복수개의 주형 올리고뉴클레오티드를 포함하는 주형 조성물이 제공된다:

5'-U1-B1-V-B2-R-B3-J-B4-U2-3' (I)

특정의 바람직한 실시양태에서 복수개의 주형 올리고뉴클레오티드에서 각각의 주형 올리고뉴클레오티드는 실질적으로 등몰량으로 존재하고, 이는 특정 실시양태에서 및 상기에서 언급된 바와 같이 주형 올리고뉴클레오티드 각각이 등몰 농도로 또는 몰 기준으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 50, 60, 70, 80, 90, 100 또는 200% 이하로 등몰량에서 벗어난 몰 농도로 존재하는 조성물을 지칭할 수 있고, 특정 다른 실시양태에서 주형 올리고뉴클레오티드 모두가 서로 10배 내인 몰 농도로 존재하는 조성물을 지칭할 수 있다. 복수개의 주형은 각각이 구별되는 뉴클레오티드 서열를 갖는, 적어도 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100개 또는 그 초과의 구별되는 올리고뉴클레오티드 종을 포함할 수 있다 (그 사이에 모든 중간 정수값 포함).

따라서 본원에 개시된 주형 조성물은 하기 일반식의 복수개의 주형 올리고뉴클레오티드를 포함한다:

5'-U1-B1-V-B2-R-B3-J-B4-U2-3' [I]

상기 식에서, 간략하게 그리고 본원에 다른 곳에서 더 상세히 설명된 바와 같이, 특정의 바람직한 실시양태에 따르면,

V는 적응 면역 수용체 가변 (V) 영역 암호화 유전자 서열의 20, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 또는 210개 이상, 1000, 900, 800, 700, 600 또는 500개 이하의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드, 또는 그의 보체이고, 복수개의 주형 올리고뉴클레오티드 서열 각각에서 V는 특유의 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하고;

J는 적응 면역 수용체 결합 (J) 영역 암호화 유전자 서열의 15-30, 31-60, 61-90, 91-120, 또는 120-150 이상, 600, 500, 400, 300 또는 200개 이하의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드, 또는 그의 보체이고, 복수개의 주형 올리고뉴클레오티드 서열 각각에서 J는 특유의 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하고;

U1 및 U2는 각각 부재하거나 각각, 독립적으로, (i) 범용 어댑터 올리고뉴클레오티드 서열, 및 (ii) 범용 어댑터 올리고뉴클레오티드 서열에 연결되고 5'에 위치되는 서열분석 플랫폼-특이적 올리고뉴클레오티드 서열로부터 선택되는 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함하고;

B1, B2, B3, 및 B4는 각각 독립적으로 부재하거나 각각 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000개의 인접 뉴클레오티드 (그 사이에 모든 정수값 포함)의 올리고뉴클레오티드 바코드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 B를 포함하고, 여기서 복수개의 주형 올리고뉴클레오티드 서열 각각에서 B는 (i) 주형 올리고뉴클레오티드의 특유의 V 올리고뉴클레오티드 서열 및 (ii) 주형 올리고뉴클레오티드의 특유의 J 올리고뉴클레오티드 서열을 특유하게 동정하거나, 쌍체 조합으로서 동정하는 특유의 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하고;

R은 부재하거나 V, J, U1, U2, B1, B2, B3, 및 B4가 없는 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는 제한 효소 인식 부위를 포함한다.

일부 실시양태에서, 주형 올리고뉴클레오티드 조성물은 추가의 비암호화(non-coding) 또는 랜덤 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 이들 올리고뉴클레오티드는 일반식 I (5'-U1-B1-V-B2-R-B3-J-B4-U2-3')의 성분 사이에 또는 성분 내에 다양한 부분에 삽입될 수 있고 크기가 다양한 길이일 수 있다.

한 실시양태에서, a는 1 내지 대상체의 포유동물 게놈 중의 다수의 최대 V 유전자 절편이다. 또 다른 실시양태에서, b는 1 내지 대상체의 포유동물 게놈 중의 다수의 최대 J 유전자 절편이다. 다른 실시양태에서, a는 1이거나 b는 1이다. 일부 실시양태에서, a는 TCRA의 경우 1개의 V 유전자 절편 내지 54개의 V 유전자 절편, TCRB의 경우 1-76개의 V 유전자 절편, TCRG의 경우 1-15개의 V 유전자 절편, TCRD의 경우 1-7개의 V 유전자 절편, IGH의 경우 1-165개의 V 유전자 절편, IGK의 경우 1-111개, 또는 IGL의 경우 1-79개의 V 유전자 절편의 범위일 수 있다. 다른 실시양태에서, b는 TCRA의 경우 1개의 J 유전자 절편 내지 61개의 J 유전자 절편, TCRB의 경우 1-14개의 J 유전자 절편, TCRG의 경우 1-5개의 J 유전자 절편, TCRD의 경우 1-4개의 유전자 절편, IGH의 경우 1-9개의 J 유전자 절편, IGK의 경우 1-5개의 J 유전자 절편, 또는 IGL의 경우 1-11개의 J 유전자 절편의 범위일 수 있다.

하기 표는 기능성 V 및 J 절편을 포함한, 각각의 인간 적응 면역 수용체 유전자자리에 대한 V 유전자 절편 (a) 및 J 유전자 절편 (b)의 수를 열거한다.

일부 실시양태에서, J 폴리뉴클레오티드는 적응 면역 수용체 J 불변 영역의 15-30, 31-60, 61-90, 91-120, 또는 120-150개 이상, 600, 500, 400, 300 또는 200개 이하의 인접 뉴클레오티드, 또는 그의 보체를 포함한다.

특정 실시양태에서 복수개의 주형 올리고뉴클레오티드는 (a x b)개 이상의 특유의 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 a는 대상체에서 특유의 적응 면역 수용체 V 영역-암호화 유전자 절편의 수이고, b는 대상체에서 특유의 적응 면역 수용체 J 영역-암호화 유전자 절편의 수이고, 조성물은 V 영역-암호화 유전자 절편과 J 영역-암호화 유전자 절편의 모든 가능한 조합에 대해 1개 이상의 주형 올리고뉴클레오티드를 포함한다.

그러나, 현재 고려된 발명은 그다지 제한되는 것으로 의도되지는 않아서, 특정 실시양태에서, 실질적으로 더 작은 수의 주형 올리고뉴클레오티드가 유리하게 사용될 수 있다. a가 대상체에서 특유의 적응 면역 수용체 V 영역-암호화 유전자 절편의 수이고 b가 대상체에서 특유의 적응 면역 수용체 J 영역-암호화 유전자 절편의 수인 이들 및 관련 실시양태에서, 복수개의 주형 올리고뉴클레오티드로 이루어진 특유의 올리고뉴클레오티드 서열의 최소 수는, 각각의 특유의 V 폴리뉴클레오티드 서열 및 각각의 특유의 J 폴리뉴클레오티드 서열이 주형 조성물에서 1개 이상의 주형 올리고뉴클레오티드에 존재하는 한, a 및 b중 어느 쪽이든 더 큰 것에 의해 결정될 수 있다. 따라서, 특정 관련 실시양태에 따르면 주형 조성물은, 예를 들어, 일반식 (I)에 따른 각각의 특유의 V 폴리뉴클레오티드의 단 하나를 포함하는, 각각의 특유의 V 폴리뉴클레오티드에 대한 1개 이상의 주형 올리고뉴클레오티드, 및 예를 들어, 일반식 (I)에 따른 각각의 특유의 J 폴리뉴클레오티드의 단 하나를 포함하는, 각각의 특유의 J 폴리뉴클레오티드에 대한 1개 이상의 주형 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

특정 다른 실시양태에서, 주형 조성물은 증폭 프라이머 세트에서 각각의 올리고뉴클레오티드 증폭 프라이머가 어닐링될 수 있는 1개 이상의 주형 올리고뉴클레오티드를 포함한다.

즉, 특정 실시양태에서, 주형 조성물은 각각의 V-절편 올리고뉴클레오티드 프라이머가 특이적으로 혼성화될 수 있는 일반식 (I)의 올리고뉴클레오티드 서열을 갖는 1개 이상의 주형 올리고뉴클레오티드, 및 각각의 J-절편 올리고뉴클레오티드 프라이머가 특이적으로 혼성화될 수 있는 일반식 (I)의 올리고뉴클레오티드 서열을 갖는 1개 이상의 주형 올리고뉴클레오티드를 포함한다.

이러한 실시양태에 따르면 하나의 또는 복수개의 적응 면역 수용체를 암호화하는 재배열된 DNA를 증폭시킬 수 있는 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 복수 a'개의 특유의 V-절편 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 복수 b'개의 특유의 J-절편 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함한다. 복수개의 a' V-절편 올리고뉴클레오티드 프라이머는 각각 독립적으로 적응 면역 수용체 V-영역 폴리펩티드를 암호화하는 1개 이상의 폴리뉴클레오티드에 또는 그의 보체에 어닐링되거나 특이적으로 혼성화될 수 있으며, 여기서 각각의 V-절편 프라이머는 1개 이상의 적응 면역 수용체 V 영역-암호화 유전자 절편에 상보적인 15개 이상의 인접 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 복수개의 b' J-절편 올리고뉴클레오티드 프라이머는 각각 독립적으로 적응 면역 수용체 J-영역 폴리펩티드를 암호화하는 1개 이상의 폴리뉴클레오티드에 또는 그의 보체에 어닐링되거나 특이적으로 혼성화될 수 있으며, 여기서 각각의 J-절편 프라이머는 1개 이상의 적응 면역 수용체 J 영역-암호화 유전자 절편에 상보적인 15개 이상의 인접 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

일부 실시양태에서, a'는 a (주형 올리고뉴클레오티드에 대해 상기 기재됨)와 동일하다. 다른 실시양태에서, b'는 b (주형 올리고뉴클레오티드에 대해 상기 기재됨)와 동일하다

따라서, 특정 실시양태에서 및 본원에 다른 곳에서 또한 논의된 바와 같이, 본 주형 조성물은, 발현되지 않는 것을 포함하여, 모든 재배열된 적응 면역 수용체 암호화 유전자 서열을 증폭시키도록 설계되는 증폭 프라이머와 함께 증폭 반응에서 사용될 수 있으며, 한편 특정 다른 실시양태에서 주형 조성물 및 증폭 프라이머는 발현되지 않은 재배열된 유전자 (예를 들어, 위유전자, 오르폰)의 증폭 생성물을 산출하지 않도록 설계될 수 있다. 따라서, 특정 실시양태에서 재배열된 적응 면역 수용체 암호화 유전자의 서브세트만을 바람직하게는 증폭시킬 수 있어, 적합한 증폭 프라이머 서브세트가 관심있는 단지 그러한 재배열된 V-J 서열을 증폭시키도록 설계되고 이용될 수 있도록 할 수 있다는 점을 알게 될 것이다. 이들 및 관련 실시양태에서, 상응하게, 재배열된 V-J 재배열된 서열의 관심 서브세트만을 포함하는 본원에 기재된 주형 조성물을, 주형 조성물이 증폭 프라이머 세트에서 각각의 올리고뉴클레오티드 증폭 프라이머가 어닐링될 수 있는 1개 이상의 주형 올리고뉴클레오티드를 포함하는 한, 사용할 수 있다. 따라서 주형 조성물 중 주형 올리고뉴클레오티드의 실제 수는 사용될 증폭 프라이머 세트에 따라, 고려된 실시양태 중에서 상당히 달라질 수 있다.

예를 들어, 특정 관련 실시양태에서, 주형 조성물에서 복수개의 주형 올리고뉴클레오티드는, (1) 폴리뉴클레오티드 V 및 J가 각각 도 5a-5l에 TCRB V/J 세트 1, TCRB V/J 세트 2, TCRB V/J 세트 3, TCRB V/J 세트 4, TCRB V/J 세트 5, TCRB V/J 세트 6, TCRB V/J 세트 7, TCRB V/J 세트 8, TCRB V/J 세트 9, TCRB V/J 세트 10, TCRB V/J 세트 11, TCRB V/J 세트 12 및 TCRB V/J 세트 13으로서 명기된 바와 같이, 68개의 TCRB V 및 J 서열 번호의 1개 이상의 세트에 명기된 TCRB V 및 J 서열을 갖는 것인 일반식 (I)의 복수개의 올리고뉴클레오티드 서열; (2) 폴리뉴클레오티드 V 및 J가 각각 도 6에 TCRG V/J 세트 1, TCRG V/J 세트 2, TCRG V/J 세트 3, TCRG V/J 세트 4 및 TCRG V/J 세트 5로서 명기된 바와 같이, 14개의 TCRG V 및 J 서열 번호의 1개 이상의 세트에 명기된 TCRG V 및 J 서열을 갖는 것인 일반식 (I)의 복수개의 올리고뉴클레오티드 서열; 및 (3) 폴리뉴클레오티드 V 및 J가 각각 도 7에 IGH V/J 세트 1, IGH V/J 세트 2, IGH V/J 세트 3, IGH V/J 세트 4, IGH V/J 세트 5, IGH V/J 세트 6, IGH V/J 세트 7, IGH V/J 세트 8 및 IGH V/J 세트 9로서 명기된 바와 같이, 127개의 IGH V 및 J 서열 번호의 1개 이상의 세트에 명기된 IGH V 및 J 서열을 갖는 것인 일반식 (I)의 복수개의 올리고뉴클레오티드 서열로부터 선택되는 일반식 (I)의 복수개의 서열을 가질 수 있다.

특정 실시양태에서, V는 적응 면역 수용체 V-영역의 10-70개 이상의 인접 아미노산을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 그의 보체이고; J는 적응 면역 수용체 J-영역의 5-30개 이상의 인접 아미노산을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 그의 보체이고; U1 및 U2는 각각 부재하거나 (i) 범용 어댑터 올리고뉴클레오티드 서열, 및 (ii) 범용 어댑터 올리고뉴클레오티드 서열에 연결되고 5'에 위치되는 서열분석 플랫폼-특이적 올리고뉴클레오티드 서열로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 포함하고; B1, B2, B3 및 B4는 각각 독립적으로 부재하거나 각각 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 인접 뉴클레오티드의 올리고뉴클레오티드 바코드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 B를 포함하고, 여기서 복수개의 올리고뉴클레오티드 서열 각각에서 B는, 쌍체 조합으로서, (i) 특유의 V 올리고뉴클레오티드 서열 및 (ii) 특유의 J 올리고뉴클레오티드 서열을 특유하게 동정하는 특유의 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하고; R은 부재하거나 V, J, U1, U2, B1, B2, B3, 및 B4가 없는 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는 제한 효소 인식 부위를 포함한다. 특정의 바람직한 실시양태에서 복수개의 주형 올리고뉴클레오티드는 a 또는 b개 이상의 특유의 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 a는 대상체에서 특유의 적응 면역 수용체 V 영역-암호화 유전자 절편의 수이고 b는 대상체에서 특유의 적응 면역 수용체 J 영역-암호화 유전자 절편의 수이고, 조성물은, 적어도 a 또는 b 중 어느 쪽이든 더 큰 것의 특유의 주형 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는 복수개의 주형 올리고뉴클레오티드를 포함하되, 단, 각각의 V 영역-암호화 유전자 절편에 상응하는 1개 이상의 V 폴리뉴클레오티드 및 각각의 J 영역-암호화 유전자 절편에 상응하는 1개 이상의 J 폴리뉴클레오티드가 포함된다.

수많은 적응 면역 수용체 가변 (V) 영역 및 결합 (J) 영역 유전자 서열은, TCR 및 Ig 유전자자리의 재배열되지 않은 게놈 DNA 서열, 및 이러한 유전자자리에서 생산적으로 재배열된 DNA 서열 및 그의 암호화된 생성물을 포함한, 그리고 또한 이들 유전자자리에서 위유전자를 포함한, 그리고 또한 관련 오르폰을 포함한, 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 서열로서 공지되어 있다. 예를 들어, U.S.A.N. 13/217,126; U.S.A.N. 12/794,507; PCT/US2011/026373; PCT/US2011/049012 참조. 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트의 증폭 효율을 표준화하기 위한 현재 제공된 주형 조성물에 포함되는 주형 올리고뉴클레오티드의 설계 및 생산, 및 TCR 또는 Ig 폴리펩티드 쇄를 암호화하는 재배열된 DNA (이러한 재배열된 DNA는 림프계 세포 DNA를 포함하는 생물학적 샘플에 존재할 수 있음)를 증폭시킬 수 있는 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트의 설계 및 생산을 위해 본 기술분야에 공지된 이들 및 기타 서열을 본 개시내용에 따라 사용할 수 있다.

일반식 (I)에서, V는 적응 면역 수용체 (예를 들어, TCR 또는 BCR) 가변 (V) 영역 유전자 서열의 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400 또는 450개 이상, 1000, 900, 800, 700, 600 또는 500개 이하의 인접 뉴클레오티드의 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 그의 보체이고, 복수개의 올리고뉴클레오티드 서열 각각에서 V는 특유의 올리고뉴클레오티드 서열을 포함한다. 인간 및 다른 종의 TCR 및 BCR V 영역 유전자에 대한 게놈 서열은 공지되어 있으며 젠뱅크(Genbank)와 같은 공개 데이터베이스로부터 입수가능하고; V 영역 유전자 서열은 발현된, 재배열된 TCR 및 BCR 유전자의 생성물을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고 또한 V 영역 유전자자리에서 동정된 위유전자의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일반식 (I)의 현재 개시된 주형내로 편입될 수 있는 다양한 V 폴리뉴클레오티드 서열은 뉴클레오티드 조성 (예를 들어, GC 함량), 및 실제 선형 폴리뉴클레오티드 서열에서 길이가 광범위하게 달라질 수 있고, 예를 들어, 특정의 서열 다양성을 나타내는 "핫 스팟(hot spot)" 또는 초가변 영역을 포함하는 것으로 알려져 있다.

일반식 (I)에서의 폴리뉴클레오티드 V (또는 그의 보체)는 TCR 또는 BCR 유전자에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트의 구성원이 특이적으로 어닐링될 수 있는 서열을 포함한다. 복수개의 TCR 또는 BCR을 암호화하는 재배열된 DNA를 증폭시킬 수 있는 프라이머 세트는 예를 들어 U.S.A.N. 13/217,126; U.S.A.N. 12/794,507; PCT/US2011/026373; 또는 PCT/US2011/049012 등에 기재되어 있거나; 문헌에 기재된 바와 같이 특정의 TCR 또는 BCR 유전자 유전자자리 (예를 들어, TCR α, β, γ 또는 δ, 또는 IgH μ, γ, δ, α 또는 ε, 또는 IgL κ 또는 λ)에서 각각의 특유의 V 유전자 및 각각의 J 유전자에 특이적으로 혼성화될 수 있는 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하도록 설계될 수 있다. 예를 들어 한정됨이 없이 실례로서, 하나의 또는 복수개의 TCR 또는 BCR을 암호화하는 재배열된 DNA를 증폭시킬 수 있는 올리고뉴클레오티드 프라이머 증폭 세트의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 전형적으로 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40개의 인접 뉴클레오티드, 또는 그 초과의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있고, 본원에 제공된 바와 같은 V 또는 J 폴리뉴클레오티드의 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40개의 인접 뉴클레오티드의 상보적 서열에 특이적으로 어닐링될 수 있다. 특정 실시양태에서 프라이머는 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 특정 실시양태에서 프라이머는 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40개 이하의 인접 뉴클레오티드의 서열을 포함할 수 있다. 프라이머 및 다른 길이의 프라이머 어닐링 부위가 또한, 본원에 개시된 바와 같이, 명시적으로 고려된다.

일반식 (I)에서의 각각의 폴리뉴클레오티드 V의 전체 폴리뉴클레오티드 서열은, 각각의 구별되는 V 유전자로부터 인접 뉴클레오티드로만 이루어질 수 있지만, 반드시 그럴 필요는 없다. 예를 들어 그리고 특정 실시양태에 따르면, 본원에 기재된 주형 조성물에서, 일반식 (I)의 각각의 폴리뉴클레오티드 V는 하나의 V 유전자에서 발견되고 프라미어 세트 중 단일 V 영역 프라이머가 특이적으로 어닐링될 수 있는 특유의 V 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는 1개 이상의 영역을 갖기만 하면 된다. 따라서, 일반식 (I)의 V 폴리뉴클레오티드는, 임의의 다른 주형 V 폴리뉴클레오티드에 포함되지 않은 1개 이상의 특유의 V 올리고뉴클레오티드 서열 영역 (프라이머 어닐링 부위)이 포함되는 한, 자연 발생 V 유전자 서열 (V 위유전자 서열 포함)의 모든 또는 임의의 소정의 부분 (예를 들어, 15, 20, 30, 60, 90, 120, 150, 180 또는 210개 이상의 인접 뉴클레오티드, 또는 그 사이에 임의의 정수값)을 포함할 수 있다.

특정 실시양태에서 본원에 기재된 주형 조성물에 존재하는 복수개의 V 폴리뉴클레오티드가, 특이적 뉴클레오티드 서열이 주형 V 영역과 임의의 자연 발생 V 유전자 사이에 차이가 있는 경우에서 조차, 알려진 자연 발생 V 유전자 뉴클레오티드 서열의 전체 길이를 모의하는 길이를 갖는 것이 바람직할 수 있다. 본원에 기재된 주형에서의 V 영역 길이는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 퍼센트 이하로 자연 발생 V 유전자 서열의 길이와 상이할 수 있다.

따라서, 일반식 (I)에서의 V 폴리뉴클레오티드는, 특정 실시양태에서, 그의 출발 코돈에서 그의 CDR 3 암호화 영역까지의 전형적인 V 유전자의 길이의 것과 동일하거나 유사한 길이를 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, CDR 3 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있지만, 반드시 그럴 필요는 없다. CDR3 암호화 뉴클레오티드 서열 및 서열 길이는 몇몇 상이한 번호 부여 방식에 의해 상당히 달라질 수 있고 특성화되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Lefranc, 1999 The Immunologist 7:132]; [Kabat et al., 1991 In: Sequence of Proteins of Immunological Interest, NIH Publication 91-3242]; [Chothia et al., 1987 J. Mol. Biol.Biol. 196:901]; [Chothia et al., 1989 Nature 342:877]; [Al-Lazikani et al., 1997 J. Mol. Biol. 273:927]; 또한, 예를 들어, 문헌 [Rock et al., 1994 J. Exp. Med. 179:323]; [Saada et al., 2007 Immunol. Cell Biol. 85:323] 참조).

간략하게, CDR3 영역은 전형적으로 V 절편에서 고도로 보존된 시스테인 잔기 (트라이뉴클레오티드 코돈 TGY; Y = T 또는 C에 의해 암호화됨)로부터 TCR의 J 절편에서 고도로 보존된 페닐알라닌 잔기 (TTY에 의해 암호화됨)로, 또는 IGH에서 고도로 보존된 트립토판 (TGG에 의해 암호화됨)으로 연장되는 폴리펩티드 부분을 포괄한다. TCRB 유전자자리에서 90% 초과의 자연, 생산적 재배열은 9 내지 17개의 암호화된 아미노산에 상응하는, 24 내지 54개의 뉴클레오티드의 이러한 기준에 의해 CDR3 암호화 길이를 갖는다. 현재 개시된 합성 주형 올리고뉴클레오티드의 CDR3 길이는, 임의의 소정의 TCR 또는 BCR 유전자자리의 경우, 95%의 자연 발생 재배열과 동일한 범위내에 있다. 따라서, 예를 들어, 복수개의 TCRB 폴리펩티드를 암호화하는 재배열된 DNA를 증폭시킬 수 있는 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트의 증폭 효율을 표준화하기 위한 본원에 기재된 주형 조성물에서, V 폴리뉴클레오티드의 CDR3 암호화 부분은 24 내지 54개의 뉴클레오티드 (그 사이에 모든 정수 포함)의 길이를 가질 수 있다. 상기 기재된 CDR3 암호화 영역에 대한 번호 부여 체계는 보존된 시스테인, 페닐알라닌 및 트립토판 코돈의 위치를 나타내고, 이들 번호 부여 체계는 또한 이들 보존된 아미노산을 암호화하는 하나 이상의 코돈이 상이한 아미노산을 암호화하는 코돈으로 대체되어 있는 위유전자에 적용될 수 있다 이들 보존된 아미노산을 사용하지 않는 위유전자의 경우에, 보존된 잔기가 상기에서 언급된 확립된 CDR3 서열 위치 번호 부여 체계 중 하나에 따라, 치환이 부재한 것으로 관찰되었을 상응하는 위치에 대해, CDR3 길이가 정의될 수 있다.

또한, 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 주형 조성물에 존재하는 복수개의 V 폴리뉴클레오티드가, 특이적 뉴클레오티드 서열이 상이한 경우에서 조차, 알려진 자연 발생 V 유전자 뉴클레오티드 서열의 전체 뉴클레오티드 조성물을 모의하는 뉴클레오티드 조성물 (예를 들어, GC 함량의 백분율)를 갖는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 주형 V 영역 뉴클레오티드 조성물은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 퍼센트 이하로 자연 발생 V 유전자 서열의 뉴클레오티드 조성물과 상이할 수 있다. 임의로 그리고 특정 실시양태에 따르면, 본원에 기재된 주형 올리고뉴클레오티드의 V 폴리뉴클레오티드는 일반식 (I)에서의 V의 3' 말단에서 또는 근처에서 정지 코돈을 포함한다.

일반식 (I)에서 J는 적응 면역 수용체 결합 (J) 영역 암호화 유전자 서열의 15-30, 31-60, 61-90, 91-120, 또는 120-150 이상, 600, 500, 400, 300 또는 200개 이하의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드, 또는 그의 보체이고, 복수개의 올리고뉴클레오티드 서열 각각에서 J는 특유의 올리고뉴클레오티드 서열을 포함한다.

일반식 (I)에서의 폴리뉴클레오티드 J (또는 그의 보체)는 TCR 또는 BCR 유전자에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트의 구성원이 특이적으로 어닐링될 수 있는 서열을 포함한다. 복수개의 TCR 또는 BCR을 암호화하는 재배열된 DNA를 증폭시킬 수 있는 프라이머 세트는 예를 들어 U.S.A.N. 13/217,126; U.S.A.N. 12/794,507; PCT/US2011/026373; 또는 PCT/US2011/049012 등에 기재되어 있거나; 문헌에 기재된 바와 같이 특정의 TCR 또는 BCR 유전자 유전자자리 (예를 들어, TCR α, β, γ 또는 δ, 또는 IgH μ, γ, δ, α 또는 ε, 또는 IgL κ 또는 λ)에서 각각의 특유의 V 유전자 및 각각의 특유의 J 유전자에 특이적으로 혼성화될 수 있는 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하도록 설계될 수 있다.

일반식 (I)에서의 각각의 폴리뉴클레오티드 J의 전체 폴리뉴클레오티드 서열은, 각각의 구별되는 J 유전자로부터 인접 뉴클레오티드로만 이루어질 수 있지만, 반드시 그럴 필요는 없다. 예를 들어 그리고 특정 실시양태에 따르면, 본원에 기재된 주형 조성물에서, 일반식 (I)의 각각의 폴리뉴클레오티드 J는 하나의 J 유전자에서 발견되고 프라미어 세트 중 단일 V 영역 프라이머가 특이적으로 어닐링될 수 있는 특유의 J 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는 1개 이상의 영역을 갖기만 하면 된다. 따라서, 일반식 (I)의 V 폴리뉴클레오티드는, 임의의 다른 주형 J 폴리뉴클레오티드에 포함되지 않은 1개 이상의 특유의 V 올리고뉴클레오티드 서열 영역 (프라이머 어닐링 부위)이 포함되는 한, 자연 발생 V 유전자 서열 (V 위유전자 서열 포함)의 모든 또는 임의의 소정의 부분 (예를 들어, 15, 20, 30, 60, 90, 120, 150, 180 또는 210개 이상의 인접 뉴클레오티드, 또는 그 사이에 임의의 정수값)을 포함할 수 있다.

특정 실시양태에서 본원에 기재된 주형 조성물에 존재하는 복수개의 J 폴리뉴클레오티드가, 특이적 뉴클레오티드 서열이 주형 J 영역과 임의의 자연 발생 J 유전자 사이에 차이가 있는 경우에서 조차, 알려진 자연 발생 J 유전자 뉴클레오티드 서열의 전체 길이를 모의하는 길이를 갖는 것이 바람직할 수 있다. 본원에 기재된 주형에서의 J 영역 길이는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 퍼센트 이하로 자연 발생 J 유전자 서열의 길이와 상이할 수 있다.

따라서 일반식 (I)에서의 J 폴리뉴클레오티드는, 특정 실시양태에서, 전형적인 자연 발생 J 유전자의 길이의 것과 동일하거나 유사한 길이를 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 논의된 바와 같이, CDR 3 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있지만, 반드시 그럴 필요는 없다.

인간 및 다른 종의 TCR 및 BCR J 영역 유전자에 대한 게놈 서열은 공지되어 있으며 젠뱅크와 같은 공개 데이터베이스로부터 입수가능하고; J 영역 유전자 서열은 발현된 및 미발현된 재배열된 TCR 및 BCR 유전자의 생성물을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일반식 (I)의 현재 개시된 주형내로 편입될 수 있는 다양한 J 폴리뉴클레오티드 서열은 뉴클레오티드 조성 (예를 들어, GC 함량), 및 실제 선형 폴리뉴클레오티드 서열에서 길이가 광범위하게 달라질 수 있다.

본원에 기재된 주형 올리고뉴클레오티드 및/또는 V-절편 및 J-절편 올리고뉴클레오티드 프라이머의 구축에서 사용하기 위한, 본원에 기재된 V 및 J 서열에 대한 대안은, 각각의 TCR 및 Ig 서브유닛에 대한 유전자의 V- 및 J-암호화 영역에 대한 공개된 유전자 서열에 관한 본 기술분야의 지식을 사용하여 본 개시내용을 기반으로 당업자에 의해 선택될 수 있다. 인간 적응 면역 수용체 서열에 대한 참조 젠뱅크 엔트리는, TCRα: (TCRA/D): NC_000014.8 (chr14:22090057.23021075); TCRβ: (TCRB): NC_000007.13 (chr7:141998851.142510972); TCRγ: (TCRG): NC_000007.13 (chr7:38279625.38407656); 면역글로불린 중쇄, IgH (IGH): NC_000014.8 (chr14: 106032614.107288051); 면역글로불린 경쇄-카파, IgLκ (IGK): NC_000002.11 (chr2: 89156874.90274235); 및 면역글로불린 경쇄-람다, IgLλ (IGL): NC_000022.10 (chr22: 22380474.23265085)를 포함한다. 마우스 적응 면역 수용체 유전자자리 서열에 대한 참조 젠뱅크 엔트리는, TCRβ: (TCRB): NC_000072.5 (chr6: 40841295.41508370), 및 면역글로불린 중쇄, IgH (IGH): NC_000078.5 (chr12:114496979.117248165)를 포함한다.

주형 및 프라이머 설계 분석 및 표적 부위 선택 고려사항은, 예를 들어, OLIGO 프라이머 분석 소프트웨어 및/또는 BLASTN 2.0.5 알고리즘 소프트웨어 (문헌 [Altschul et al., Nucleic Acids Res. 1997, 25(17):3389-402]), 또는 본 기술분야에서 입수가능한 다른 유사한 프로그램을 사용하여, 수행될 수 있다.

따라서, 본 개시내용을 기반으로 그리고 이들 공지된 적응 면역 수용체 유전자 서열 및 올리고뉴클레오티드 설계 방법론의 관점에서, 본 발명의 주형 올리고뉴클레오티드에 포함시키기 위해, 당업자는, 각각 독립적으로 소정의 V 및 J 유전자 각각에 특유한 올리고뉴클레오티드 서열을 함유하는 복수개의 V 영역-특이적 및 J 영역-특이적 폴리뉴클레오티드 서열을 설계할 수 있다. 유사하게, 본 개시내용으로부터 그리고 공지된 적응 면역 수용체 서열의 관점에서, 당업자는 또한 각각 독립적으로 소정의 V 및 J 유전자 각각에 특유한 특이적 서열에 어닐링될 수 있는 복수개의 V 영역-특이적 및 J 영역-특이적 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 설계할 수 있고, 그로 인해 복수개의 프라이머는 소정의 적응 면역 수용체-암호화 유전자자리 (예를 들어, 인간 TCR 또는 IgH 유전자자리)에서 실질적으로 모든 V 유전자 및 실질적으로 모든 J 유전자를 증폭시킬 수 있다. 이러한 프라이머 세트로 인해, 다중 (예를 들어, 다수의 정방향 및 역방향 프라이머쌍을 사용) PCR로, 재배열된 V 영역-암호화 유전자 절편에 의해 암호화되는 제1 말단 및 J 영역-암호화 유전자 절편에 의해 암호화되는 제2 말단을 갖는 증폭 생성물의 생성이 가능하게 된다.

전형적으로 및 특정 실시양태에서, 이러한 증폭 생성물은 CDR3-암호화 서열을 포함할 수 있지만, 본 발명이 그렇게 제한되는 것으로 의도되는 것은 아니고 CDR3-암호화 서열을 포함하지 않는 증폭 생성물을 고려한다. 프라이머는 바람직하게는 본원에 기재된 바와 같이 V 및 J 서열 및/또는 V-J 바코드 (B) 서열의 충분한 부분을 갖는 증폭 생성물을 산출하도록 설계될 수 있어서, 생성물 (앰플리콘(amplicon))을 서열분석함으로써, 기능성 적응 면역 수용체-암호화 유전자를 산출하기 위해 V 유전자가 재배열을 겪는 근처에서 각각의 유전자 절편에 특유한 서열을 기반으로 (i) 특정의 V 유전자, 및 (ii) 특정의 J 유전자를 동정하는 것이 가능하도록 한다. 전형적으로, 및 바람직한 실시양태에서, PCR 증폭 생성물은 600개를 초과하지 않는 염기쌍 크기일 것이며, 이는 비제한적 이론에 따르면, 재배열되지 않은 적응 면역 수용체 유전자로부터 증폭 생성물을 제외할 것이다. 특정 다른 바람직한 실시양태에서 증폭 생성물은, 유리하게는 짧은 서열 판독에 의해 서열-구별되는 앰플리콘의 신속한, 고 처리량 정량화를 제공할 수 있을 정도의, 500, 400, 300, 250, 200, 150, 125, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30 또는 20개를 초과하지 않는 염기쌍 크기일 것이다.

특정의 바람직한 실시양태에서, 복수개의 주형 올리고뉴클레오티드는, 어느 쪽이든 더 큰 것인, a개 이상 또는 b개 이상의 특유의 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 a는 대상체에서 특유의 적응 면역 수용체 V 영역-암호화 유전자 절편의 수이고, b는 대상체에서 특유의 적응 면역 수용체 J 영역-암호화 유전자 절편의 수이고, 조성물은 각각의 특유의 V 폴리뉴클레오티드에 대한 1개 이상의 주형 올리고뉴클레오티드 및 각각의 특유의 J폴리뉴클레오티드에 대한 1개 이상의 주형 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 주형 올리고뉴클레오티드가, V 폴리뉴클레오티드를 포함하고 또한 J 폴리뉴클레오티드를 포함하는 일반식 (I)의 복수개의 올리고뉴클레오티드 서열을 갖기 때문에, 따라서 주형 조성물은 (a x b)개보다 작은 특유의 올리고뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있지만, 적어도 a개 또는 b개 중 더 큰 것의 특유의 올리고뉴클레오티드 서열을 포함할 것이라는 점을 알게 될 것이다. 따라서, 조성물은 각각의 특유의 V 폴리뉴클레오티드 서열의 1회 이상의 발생 및 각각의 특유의 J 폴리뉴클레오티드 서열의 1회 이상의 발생을 수용할 수 있고, 여기서 일부 경우에서 특정의 특유의 V 폴리뉴클레오티드의 1회 이상의 발생은 특정의 특유의 J 폴리뉴클레오티드의 1회 이상의 발생에서 발견될 수 있는 동일한 주형 올리고뉴클레오티드에 존재할 것이다. 따라서, 예를 들어, "각각의 특유의 V 폴리뉴클레오티드에 대한 1개 이상의 주형 올리고뉴클레오티드 및 각각의 특유의 J 폴리뉴클레오티드에 대한 1개 이상의 주형 올리고뉴클레오티드"는 특정 경우에서 하나의 특유의 V 폴리뉴클레오티드 및 하나의 특유의 J 폴리뉴클레오티드가 존재하는 단일 주형 올리고뉴클레오티드를 지칭할 수 있다.

또한, 본원에 다른 곳에 개시된 바와 같이, 특정 다른 바람직한 실시양태에서 주형 조성물은, 증폭 프라이머 세트에서 각각의 올리고뉴클레오티드 증폭 프라이머가 어닐링될 수 있는 1개 이상의 주형 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 따라서, 조성물은, 예를 들어, a개 또는 b개보다 작은 특유의 서열을 포함할 수 있고, 여기서 증폭 프라이머 세트는 모든 가능한 V 및/또는 J 서열에 대해 특유의 프라이머를 포함하지 않을 수 있다.

특정 실시양태는 본원에 제공된 바와 같이 대상체의 림프계 세포로부터의 DNA를 포함하는 생물학적 샘플에서의 하나의 또는 복수개의 적응 면역 수용체를 암호화하는 생산적으로 재배열된 DNA를 증폭시킬 수 있는 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트의 증폭 효율을 표준화하기 위한 주형 조성물 [여기서 주형 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 일반식 5'-U1-B1-V-B2-R-B3-J-B4-U2-3' (I)의 복수개의 올리고뉴클레오티드 서열을 갖는 복수개의 주형 올리고뉴클레오티드를 포함한다]을 고려한다는 점을 주목하게 될 것이다. 이들 및 관련 실시양태에 따라 그리고 또한 본원에 다른 곳에 기재된 바와 같이, 생산적으로 재배열된 DNA를 증폭시킬 수 있는 올리고뉴클레오티드 증폭 프라이머의 세트는 V-영역 위유전자 또는 오르폰에 또는 J-영역 위유전자 또는 오르폰에 특이적으로 혼성화되는 임의의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 제외시킬 수 있다. 따라서, 이러한 실시양태에서 주형 조성물은 바람직하게는 특유의 V 올리고뉴클레오티드 서열 및/또는 특유의 J 올리고뉴클레오티드 서열이 각각 V-영역 위유전자 또는 오르폰에 또는 J-영역 위유전자 또는 오르폰에 특유한 서열인 일반식 (I)의 주형 올리고뉴클레오티드를 제외시킬 것이다.

858개의 구별되는 주형 올리고뉴클레오티드를 포함하는 예시적 TCRB 주형 조성물은 서열 번호:3157-4014로 서열 목록에 개시되어 있다. 871개의 구별되는 주형 올리고뉴클레오티드를 포함하는 또 다른 예시적 TCRB 주형 조성물은 서열 번호:1-871로 서열 목록에 개시되어 있다. 689개의 구별되는 주형 올리고뉴클레오티드를 포함하는 또 다른 예시적 TCRB 주형 조성물은 서열 번호:872-1560으로 서열 목록에 개시되어 있다.

70개의 구별되는 주형 올리고뉴클레오티드를 포함하는 예시적 TCRG 주형 조성물은 서열 번호:4015-4084로 서열 목록에 개시되어 있다. 또한, 70개의 구별되는 주형 올리고뉴클레오티드를 포함하는 예시적 TCRG 주형 조성물은 서열 번호:1561-1630으로 서열 목록에 개시되어 있다.

1116개의 구별되는 주형 올리고뉴클레오티드를 포함하는 예시적 IGH 주형 조성물은 서열 번호:4085-5200으로 서열 목록에 개시되어 있다. 또한, 1116개의 구별되는 주형 올리고뉴클레오티드를 포함하는 예시적 IGH 주형 조성물은 서열 번호:1805-2920으로 서열 목록에 개시되어 있다.

또한, 본원에는 일반식 (I)의 복수개의 올리고뉴클레오티드 서열을 갖는 본원에 기재된 주형 올리고뉴클레오티드에 포함시키기 위한 V 및 J 폴리뉴클레오티드의 예시적 세트가 개시되어 있다. TCRB의 경우, 복수개의 주형 올리고뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드 V 및 J가 각각 도 5에 TCRB V/J 세트 1, TCRB V/J 세트 2, TCRB V/J 세트 3, TCRB V/J 세트 4, TCRB V/J 세트 5, TCRB V/J 세트 6, TCRB V/J 세트 7, TCRB V/J 세트 8, TCRB V/J 세트 9, TCRB V/J 세트 10, TCRB V/J 세트 11, TCRB V/J 세트 12 및 TCRB V/J 세트 13으로서 명기된 바와 같이, 68개의 TCRB V 및 J 서열 번호의 1개 이상의 세트에 명기된 TCRB V 및 J 서열을 갖는 것인 일반식 (I)의 복수개의 올리고뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다.

TCRG의 경우, 복수개의 주형 올리고뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드 V 및 J가 각각 도 6에 TCRG V/J 세트 1, TCRG V/J 세트 2, TCRG V/J 세트 3, TCRG V/J 세트 4 및 TCRG V/J 세트 5로서 명기된 바와 같이, 14개의 TCRG V 및 J 서열 번호의 1개 이상의 세트에 명기된 TCRG V 및 J 서열을 갖는 것인 일반식 (I)의 복수개의 올리고뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다.

IGH의 경우, 복수개의 주형 올리고뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드 V 및 J가 각각 도 7에 IGH V/J 세트 1, IGH V/J 세트 2, IGH V/J 세트 3, IGH V/J 세트 4, IGH V/J 세트 5, IGH V/J 세트 6, IGH V/J 세트 7, IGH V/J 세트 8 및 IGH V/J 세트 9로서 명기된 바와 같이, 127개의 IGH V 및 J 서열 번호의 1개 이상의 세트에 명기된 IGH V 및 J 서열을 갖는 것인 일반식 (I)의 복수개의 올리고뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다.

프라이머

본 개시내용에 따르면, 올리고뉴클레오티드 프라이머는 복수개의 V-절편 프라이머 및 복수개의 J-절편 프라이머를 포함하는 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 제공되며, 여기서 프라이머 세트는 림프계 세포 DNA를 포함하는 생물학적 샘플에서의 적응 면역 수용체를 암호화하는 재배열된 DNA를 증폭시킬 수 있다. 적합한 프라이머 세트는 본 기술분야에 공지되어 있고, 본원에는, 예를 들어, U.S.A.N. 13/217,126; U.S.A.N. 12/794,507; PCT/US2011/026373; 또는 PCT/US2011/049012 등에서의 프라이머 세트; 또는 표 1에 나타낸 것들이 개시된다. 특정 실시양태에서 프라이머 세트는 샘플에서 각각의 특유의 V 영역 유전자 (위유전자 포함)에 대해, 특유의 V 영역 서열에 특이적으로 어닐링될 수 있는 1개 이상의 프라이머; 및 샘플에서 각각의 특유의 J 영역 유전자에 대해, 특유의 J 영역 서열에 특이적으로 어닐링될 수 있는 1개 이상의 프라이머를 포함하는, 복수개의 V 서열-특이적 프라이머를 포함하도록 설계된다.

프라이머 설계는 알려진 TCR 및 BCR 게놈 서열의 관점에서 통상의 방법론에 의해 달성될 수 있다. 따라서, 프라이머 세트는 바람직하게는 TCR 또는 BCR 유전자자리에서의 DNA 재배열로부터 생길 수 있는 모든 가능한 V-J 조합을 증폭시킬 수 있다. 또한, 하기에 기재된 바와 같이, 특정 실시양태는, 하나 이상의 V 프라이머가 2개 이상의 V 영역에 의해 공유될 수 있지만 모든 V 영역에 공통되는 것은 아닌 "특유의" 서열에 특이적으로 어닐링되는 것이 가능할 수 있고/있거나, 하나 이상의 J 프라이머가 2개 이상의 J 영역에 의해 공유될 수 있지만 모든 J 영역에 공통되는 것은 아닌 "특유의" 서열에 특이적으로 어닐링되는 것이 가능할 수 있는 프라이머 세트를 고려한다.

특정의 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물 및 방법에서 사용하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머는 표적 V- 또는 J- 절편의 15개의 뉴클레오티드 길이 인접 서열 (즉, V-영역 또는 J-영역 폴리펩티드를 암호화하는 게놈 폴리뉴클레오티드의 부분)과 동일한 서열을 갖거나, 그에 상보적인, 길이가 약 15개 이상의 뉴클레오티드의 핵산을 포함하거나 그로 이루어질 수 있다. 더 긴 프라이머, 예를 들어, 표적 V- 또는 J- 영역 암호화 폴리뉴클레오티드 절편의 인접 서열과 동일한 서열을 갖거나, 그에 상보적인 서열을 갖는 길이가 약 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 45, 또는 50개의 뉴클레오티드인 것이 또한 특정 실시양태에서 사용될 것이다. 현재 기재된 올리고뉴클레오티드 프라이머의 모든 중간 길이가 본원에서 사용이 고려된다. 당업자에 의해 인식될 것인 바와 같이, 프라이머는 부가된 추가 서열 (예를 들어, 표적 V- 또는 J-영역 암호화 폴리뉴클레오티드 절편과 동일하거나 그에 상보적일 수 없는 뉴클레오티드), 예컨대 제한 효소 인식 부위, 서열분석을 위한 어댑터 서열, 바코드 서열 등을 가질 수 있다 (예를 들어, 본원에서 표 및 서열 목록에서 제공된 프라이머 서열 참조). 따라서, 프라이머의 길이는 구체적인 용도 또는 필요에 따라, 길이가 약 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 80, 85, 90, 95, 100개 또는 그 초과의 뉴클레오티드 또는 그 초과와 같이 더 길 수 있다.

또한, 특정 실시양태에서 서열 목록에 명기된 것을 포함하여, 뉴클레오티드 서열이 본원에 제시되어 있는 올리고뉴클레오티드 프라이머에 대한 고도의 서열 동일성을 공유할 수 있는 적응 면역 수용체 V-절편 또는 J-절편 올리고뉴클레오티드 프라이머 변이체를 사용하는 것이 고려된다. 따라서, 이들 및 관련 실시양태에서, 적응 면역 수용체 V-절편 또는 J-절편 올리고뉴클레오티드 프라이머 변이체는 본원에 개시된 적응 면역 수용체 V-절편 또는 J-절편 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열에 실질적 동일성을 가질 수 있고, 예를 들어, 본원에 기재된 방법 (예를 들어, 표준 파라미터를 사용하는 BLAST 분석)을 사용하여, 참조 폴리뉴클레오티드 서열, 예컨대 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열과 비교하여 이러한 올리고뉴클레오티드 프라이머 변이체는 적어도 70% 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 또는 그 초과의 서열 동일성을 포함할 수 있다. 당업자는 이들 값을 코돈 축중(degeneracy), 판독 프레임 위치결정 등을 고려함으로써 적절히 조정하여 적응 면역 수용체 절편-암호화 폴리뉴클레오티드에 어닐링되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 변이체의 상응하는 능력을 측정할 수 있다는 것을 인식할 것이다.

전형적으로, 바람직하게는 변이체 올리고뉴클레오티드의 어닐링 능력이 본원에 구체적으로 명기된 적응 면역 수용체 V-절편 또는 J-절편 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열의 것에 비해 실질적으로 감소하지 않도록, 올리고뉴클레오티드 프라이머 변이체는 하나 이상의 치환, 부가, 결실 및/또는 삽입을 함유할 것이다.

표 1은 비제한적 예로서 대상체의 림프계 세포로부터의 DNA를 포함하는 생물학적 샘플에서의 TCR β-쇄 (TCRB)를 암호화하는 생산적으로 재배열된 DNA를 증폭시킬 수 있는 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 제시한다. 이 프라이머 세트에서 J 절편 프라이머는 실질적 서열 상동성을 공유하고, 따라서 1개 초과의 표적 J 폴리뉴클레오티드 서열 중에서 크로스-프라이밍(cross-priming)할 수 있지만, V 절편 프라이머는 V의 CDR2 영역 내에서 표적 서열에 특이적으로 어닐링되도록 설계되고 따라서 각각의 V 절편에 특유하다. 그러나, 밀접하게 관련된 표적 유전자의 패밀리내(within-family) 서열이 동일한 몇몇 V 프라이머의 경우에 예외가 존재한다 (예를 들어, V6-2 및 V6-3은 V 절편의 암호화 서열에 걸쳐서 뉴클레오티드 수준에서 동일하고, 따라서 단일 프라이머, TRB2V6-2/3을 가질 수 있음).

따라서 특정 실시양태에서 주형 조성물 중 상이한 주형 올리고뉴클레오티드의 수, 및/또는 프라이머 세트 중 상이한 올리고뉴클레오티드 프라이머의 수는 유리하게는, V 및/또는 J 서열에서의 특정의 알려진 유사성을 활용하도록 주형 및/또는 프라이머를 설계함으로써, 감소될 수 있다는 점을 알게 될 것이다. 따라서, 이들 및 관련 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 "특유의" 올리고뉴클레오티드 서열은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 구별되는 주형 올리고뉴클레오티드에 의해 공유되는 특이적 V 폴리뉴클레오티드 서열 및/또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개의 구별되는 주형 올리고뉴클레오티드에 의해 공유되는 특이적 J 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있고, 여기서 이러한 주형은 공유된 V 및/또는 J 서열 이외에 서로 서열이 상이하다.

특정의 현재 고려된 실시양태에 따르면, 모든 자연 발생 V 및 J 유전자의 제한된 서브세트만을 위한 동등하지 않은 프라이머 효율 (예를 들어, 동등하지 않은 프라미어 이용)로부터 생길 수 있는 증폭 프라이머의 세트의 구성원 중에서 불균일 핵산 증폭능과 같은 주형 증폭 바이어스를 감소 (예를 들어, 통계학상 유의한 방식으로 감소)시키는 것이 유용할 수 있다 예를 들어, 백신의 경우와 같이 특이적 항원에 대해서든, 자가면역 질환의 경우와 같이 조직에 대해서든, 면역 반응에 관여한 TCR 또는 BCR 면역 레퍼토리의 분석에서, 단지 생산적 TCR 또는 Ig 재배열이 관심일 수 있다. 이러한 상황에서, TCR 또는 BCR 암호화 DNA의 생산적 재배열의 한 원인이 되는 그러한 V 및 J 절편 프라이머에 대해서만 불균일 핵산 증폭능을 동정 및 보정하고 위유전자 및 오르폰의 불균일 증폭 (즉, 다른 염색체 상으로 중복된 TCR 또는 BCR V 영역-암호화 절편)을 보정하는 노력을 제외시키는 것이 경제적으로 유리할 수 있다.

인간 IGH 유전자자리에서, 예를 들어, 이뮤노지네틱스(ImmunoGeneTics: IMGT) 데이터베이스 (M.-P. LeFranc,

Montpellier, Montpellier, France; www.imgt.org)는 165개의 V 절편 유전자에 주석을 달고 있으며, 그 중 26개는 다른 염색체 상의 오르폰이고 139개는 염색체 14에서 IGH 유전자자리에 있다 IGH 유전자자리내에 139개의 V 절편 중에서, 51개는 1개 이상의 기능성 대립유전자이며, 한편 6개는 1개 이상의 고도로 보존된 아미노산 잔기가 없는 ORF (오픈-리딩 프레임(open-reading frame))이고, 81개는 위유전자이다. 위유전자는 V-절편 암호화 서열 내에 프레임내 정지 코돈, 개시 코돈과 CDR3 암호화 서열 사이의 프레임시프트(frameshift), 하나 이상의 반복-요소 삽입, 및 중대 영역, 예컨대 제1 엑손 또는 RSS의 결실을 함유하는 V 절편을 포함할 수 있다. 위유전자 및/또는 오르폰을 특성화하는 시간 및 비용을 피하면서 샘플에서 기능성 IGH 재배열을 특성화하기 위해서, 따라서 위유전자 서열에 특이적인 증폭 프라이머 및 주형 올리고뉴클레오티드를 합성 또는 교정해야만 할 필요없이, TCR 또는 BCR을 암호화하는 기능성 재배열에 참여하는 그러한 V 절편만을 포함하도록 설계되는 본원에 기재된 합성 주형 올리고뉴클레오티드의 서브세트를 사용하는 것이 고려된다. 따라서 특히 시간과 비용에 대하여 유리한 효율이 수득된다.

[표 1]

특정 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 V-절편 및 J-절편 올리고뉴클레오티드 프라이머는 적당한 정보가 재배열된 적응 면역 수용체 (TCR 또는 Ig) 유전자의 증폭 생성물의 서열 내에 존재하여 재배열된 적응 면역 수용체 유전자자리에서 증폭 생성물을 생성시키는 특이적 V 및 특이적 J 유전자 둘 다를 특유하게 동정하도록 뉴클레오티드 서열을 포함하도록 설계된다 (예를 들어, V 유전자 재조합 신호 서열 (RSS) 상류의 서열의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개 이상의 염기쌍, 바람직하게는 V 유전자 재조합 신호 서열 (RSS) 상류의 서열의 약 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40개 이상의 염기쌍, 및 특정의 바람직한 실시양태에서 V 유전자 재조합 신호 서열 (RSS) 상류의 서열의 40개 초과의 염기쌍, 및 J 유전자 RSS의 하류의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개 이상의 염기쌍, 바람직하게는 J 유전자 RSS의 하류의 약 22, 24, 26, 28 또는 30개 이상의 염기쌍, 및 특정의 바람직한 실시양태에서 J 유전자 RSS의 하류의 30개 초과의 염기쌍).

이러한 특질은, V 및 J 절편에 대한 적절한 크기의 생성물의 존재 또는 부재의 검출만을 위한 증폭 반응에 주로 의존하는, TCR-암호화 또는 Ig-암호화 유전자 서열의 증폭에 대해 본 기술분야에 기재된 올리고뉴클레오티드 프라이머와 대조가 된다 (예를 들어, 특정의 크기의 앰플리콘의 PCR 반응 생성물에서의 존재는 V 또는 J 절편의 존재를 나타내지만 증폭된 PCR 생성물의 서열을 제공할 수 없고 따라서 스펙트라타이핑의 일반적 관행과 같은 그의 동일성을 확인할 수 없다).

올리고뉴클레오티드 (예를 들어, 프라이머)는 문헌 [Narang et al., 1979, Meth. Enzymol. 68:90-99]의 포스포트라이에스테르 방법; 문헌 [Brown et al., 1979, Meth. Enzymol. 68:109-151]의 포스포다이에스테르 방법; 문헌 [Beaucage et al., 1981, Tetrahedron Lett. 22:1859-1862]의 다이에틸포스포르아미다이트 방법; 및 미국 특허 번호 4,458,066의 고체 지지체 방법 (각각이 본원에 참조로 포함됨)과 같은 방법에 의한 직접 화학적 합성을 포함한 임의의 적합한 방법에 의해 제조될 수 있다. 올리고뉴클레오티드 및 변형 뉴클레오티드의 접합체의 합성 방법의 검토가 본원에 참조로 포함된 문헌 [Goodchild, 1990, Bioconjugate Chemistry 1(3): 165-187]에 제공되어 있다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "프라이머"는 적합한 조건하에 DNA 합성의 개시점으로서 작용할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. 이러한 조건은 핵산 가닥에 상보적인 프라이머 연장 생성물의 합성이 적합한 온도에서 및 적절한 완충제 중 연장을 위한 작용제 (예를 들어, DNA 중합효소 또는 역전사효소) 및 4개의 상이한 뉴클레오시드 트라이포스페이트의 존재하에 유도되는 것을 포함한다.

프라이머는 바람직하게는 단일 가닥 DNA이다. 프라이머의 적절한 길이는 프라이머의 의도된 용도에 좌우되지만 전형적으로 6 내지 50개의 뉴클레오티드, 또는 특정 실시양태에서, 15-35개 뉴클레오티드의 범위이다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 충분히 안정한 혼성 복합체(hybrid complex)를 형성하기 위해 더 냉한 온도를 필요로 한다. 프라이머가 주형 핵산의 정확한 서열을 반영할 필요는 없지만, 주형과 혼성화하기에 충분히 상보적이어야 한다. 소정의 표적 서열의 증폭을 위한 적합한 프라이머의 설계는 본 기술분야에 주지되어 있고 본원에 인용된 문헌에 기재되어 있다.

본원에 기재된 바와 같이, 프라이머는 프라이머의 검출 또는 고정을 가능하게 하지만, DNA 합성의 개시점으로서 작용하는 프라이머의 기본 특성을 변경하지 않는 추가의 특질을 편입할 수 있다 예를 들어, 프라이머는 표적 핵산에 혼성화되지는 않으나, 증폭된 생성물의 클로닝, 검출, 또는 서열분석을 촉진시키는, 5' 말단에서 추가의 핵산 서열을 함유할 수 있다. 혼성화되는 주형에 충분히 상보적인 프라이머의 영역은 본원에서 혼성화 영역(hybridizing region)으로 지칭된다.

본원에 사용된 바와 같이, 프라이머는, 충분히 엄격한 조건하에 증폭 반응에서 사용시, 프라이머가 주로 표적 핵산에 혼성화된다면, 표적 서열에 대해 "특이적"이다. 전형적으로, 프라이머는, 프라이머-표적 이중체(duplex) 안정성이 프라이머와 샘플에서 발견된 임의의 다른 서열 사이에 형성된 이중체의 안정성보다 크다면, 표적 서열에 대해 특이적이다. 당업자는 다양한 인자, 예컨대 염 조건뿐만 아니라 프라이머의 염기 조성 및 미스매치(mismatch)의 위치가, 프라이머의 특이성에 영향을 미칠 것이고, 프라이머 특이성의 통상의 실험에 의한 확인이 많은 경우에 필요할 것이라는 것을 인식할 것이다. 프라이머가 단지 표적 서열과 안정한 이중체를 형성할 수 있는 혼성화 조건이 선택될 수 있다. 따라서, 적합하게 염격한 증폭 조건하에 표적-특이적 프라이머의 사용으로 인해 표적 프라이머 결합 부위를 함유하는 그러한 표적 서열의 선택적 증폭이 가능하게 된다.

특정의 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에서 사용하기 위한 프라이머는 표적 V 또는 J 절편의 15개의 뉴클레오티드 길이 인접 서열과 동일한 서열을 갖거나, 그에 상보적인, 길이가 약 15개 이상의 뉴클레오티드의 핵산을 포함하거나 그로 이루어진다. 더 긴 프라이머, 예를 들어, 표적 V 또는 J 절편의 인접 서열과 동일한 서열을 갖거나, 그에 상보적인 서열을 갖는, 길이가 약 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 45, 또는 50개의 뉴클레오티드인 것이 또한 특정 실시양태에서 사용될 것이다. 상기 언급된 프라이머의 모든 중간 길이가 본원에서 사용이 고려된다. 당업자에 의해 인식될 것인 바와 같이, 프라이머는 부가된 추가의 서열 (예를 들어, 표적 V 또는 J 절편과 동일하거나 상보적일 수 없는 뉴클레오티드), 예컨대 제한 효소 인식 부위, 서열분석을 위한 어댑터 서열, 바코드 서열 등을 가질 수 있다 (예를 들어, 본원에서 및 서열 목록에서 제공된 프라이머 서열 참조). 따라서, 프라이머의 길이는 구체적인 용도 또는 필요에 따라, 길이가 55, 56, 57, 58, 59, 60, 65, 70, 75개의 뉴클레오티드 또는 그 초과와 같이 더 길 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 정방향 및 역방향 프라이머는 둘 다 DNA 서열분석기에 적합한 범용 정방향 프라이머 서열로 5' 말단에서 변형된다.

또한, 특정 실시양태에서, 서열 목록에 명기된 것을 포함하여, 뉴클레오티드 서열이 본원에 제시되어 있는 올리고뉴클레오티드 프라이머에 대한 고도의 서열 동일성을 공유할 수 있는 적응 면역 수용체 V-절편 또는 J-절편 올리고뉴클레오티드 프라이머 변이체를 사용하는 것이 고려된다. 따라서, 이들 및 관련 실시양태에서, 적응 면역 수용체 V-절편 또는 J-절편 올리고뉴클레오티드 프라이머 변이체는 본원에 개시된 적응 면역 수용체 V-절편 또는 J-절편 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열에 대해 실질적 동일성을 가질 수 있고, 예를 들어, 본원에 기재된 방법 (예를 들어, 표준 파라미터를 사용하는 BLAST 분석)을 사용하여, 참조 폴리뉴클레오티드 서열, 예컨대 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열과 비교하여 이러한 올리고뉴클레오티드 프라이머 변이체는 적어도 70% 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 또는 그 초과의 서열 동일성을 포함할 수 있다. 당업자는 이들 값을 코돈 축중, 판독 프레임 위치결정 등을 고려함으로써 적절히 조정하여 적응 면역 수용체 절편-암호화 폴리뉴클레오티드에 어닐링되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 변이체의 상응하는 능력을 측정할 수 있다는 것을 인식할 것이다.

전형적으로, 바람직하게는 변이체 올리고뉴클레오티드의 어닐링 능력이 본원에 구체적으로 명기된 적응 면역 수용체 V-절편 또는 J-절편 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열의 것에 비해 실질적으로 감소하지 않도록, 올리고뉴클레오티드 프라이머 변이체는 하나 이상의 치환, 부가, 결실 및/또는 삽입을 함유할 것이다. 또한, 본원에 다른 곳에 언급된 바와 같이, 바람직한 실시양태에서 적응 면역 수용체 V-절편 및 J-절편 올리고뉴클레오티드 프라이머는 CDR3에 대한 암호화 영역을 포함하는 재배열된 TCR 또는 IgH 서열을 증폭시킬 수 있도록 설계된다.

본원에서 고려된 특정 실시양태에 따르면, 본 개시내용의 다중 PCR 방법에서 사용하기 위한 프라이머는 비(non)-T 또는 B 세포 서열의 비특이적 프라이밍을 방지하도록 기능적으로 차단될 수 있다. 예를 들어, 프라이머는 미국 특허 출원 공개 US2010/0167353에 기재된 바와 같이 화학적 변형으로 차단될 수 있다. 특정의 본원에 개시된 실시양태에 따르면, 본 다중 PCR 반응에서 이러한 차단된 프라이머의 사용은 DNA 복제 (즉, 프라이머 연장)가 차단되는 비활성 배열, 및 DNA 복제가 진행되는 활성화 배열을 가질 수 있는 프라이머를 포함한다. 프라이머의 비활성 배열은 프라이머가 단일 가닥인 경우, 또는 프라이머가 관심 표적 DNA 서열에 특이적으로 혼성화되나 프라이머의 3' 말단에서 또는 근처에서 연결되는 화학 모이어티에 의해 프라미어 연장이 차단된 채로 남아있는 경우에 존재한다.

프라이머의 활성화 배열은 프라이머가 관심 표적 핵산 서열에 혼성화되고 후속적으로 RNase H 또는 또 다른 절단제(cleaving agent)에 의해 작용되어 3' 차단 기를 제거하고, 그로 인해 효소 (예를 들어, DNA 중합효소)가 증폭 반응에서 프라이머 연장을 촉매하는 것이 가능해지는 경우 존재한다. 이론에 의해 얽매이는 것을 바라지 않으면서, 이러한 프라이머의 혼성화의 반응속도론은 2차 반응과 흡사하고, 따라서 혼합물 중 T 세포 또는 B 세포 유전자 서열 농도에 따르는 것으로 여겨진다. 차단된 프라이머는 표적에의 혼성화에 이어서 프라이머 연장이 진행될 수 있기 이전에 절단을 필요로 함으로써 비특이적 반응을 최소화한다. 프라이머가, 목적하는 표적 서열에 관련되지만 염기쌍 형성(base-pairing) 미스매치를 초래하는 하나 이상의 비상보적 뉴클레오티드를 가짐으로써 차이가 나는 서열에 부정확하게 혼성화된다면, 특히 절단 부위에서 또는 근처에 놓인 미스매치가 있는 경우, 프라이머의 절단이 억제된다. 증폭의 충실도를 개선시키는 이러한 전략은 이러한 위치에서 위 프라이밍(false priming)의 빈도를 감소시키고, 그로 인해 반응의 특이성을 증가시킨다. 당업자에 의해 인식될 것인 바와 같이, 반응 조건, 특히 각각의 사이클에서 혼성화 및 연장에 허용되는 시간 및 RNase H의 농도를 최적화하여, 프라이머가 그의 진정(true) 표적 서열에 정확하게 혼성화되는 경우 프라이머의 고 효율 절단과, 프라이머와 그것이 불완전하게 어닐링될 수 있는 주형 서열 사이의 미스매치가 있는 경우 프라이머의 저조한 절단 사이에 절단 효율의 차이를 최대화할 수 있다.

US2010/0167353에 기재된 바와 같이, 연장을 방지하기 위해 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, 프라이머)의 3' 말단에서 또는 근처에 위치될 수 있는 다수의 차단 기가 본 기술분야에 공지되어 있다. 프라이머 또는 다른 올리고뉴클레오티드를 3'-말단 뉴클레오티드에서 변형시켜, 예를 들어, 3' 데옥시리보뉴클레오티드 잔기 (예를 들어, 코르디세핀), 2',3'-다이데옥시리보뉴클레오티드 잔기, 비-뉴클레오티드 결합 또는 알칸-다이올 변형 (미국 특허 번호 5,554,516)의 부가에 의해 DNA 합성의 개시를 방지 또는 억제할 수 있다. 프라이머 연장을 억제 또는 차단하는데 사용될 수 있는 알칸 다이올 변형은 또한 문헌 [Wilk et al., (1990 Nucleic Acids Res. 18 (8):2065)], 및 [Arnold et al. (미국 특허 번호 6,031,091)]에 의해 기재되어 있다. 적합한 차단 기의 추가의 예는 3' 히드록실 치환 (예를 들어, 3'-포스페이트, 3'-트라이포스페이트 또는 3'-포스페이트 다이에스테르 (알코올, 예컨대 3-히드록시프로필 사용)), 2'3'-사이클릭 포스페이트, 말단 RNA 염기의 2' 히드록실 치환 (예를 들어, 포스페이트 또는 입체적으로 벌키한 기, 예컨대 트라이이소프로필 실릴 (TIPS) 또는 tert-부틸 디메틸 실릴 (TBDMS))을 포함한다. 2'-알킬 실릴 기, 예컨대 올리고뉴클레오티드의 3'-말단에서 치환된 TIPS 및 TBDMS는 문헌 [Laikhter et al., 미국 특허 출원 일련 번호 11/686,894]에 기재되어 있으며, 이 출원은 본원에 참조로 포함된다. 또한, 프라이머 연장을 차단하기 위해 올리고뉴클레오티드의 3'-말단 잔기의 염기 상에 벌키한 치환기를 편입할 수 있다.

특정 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 프라이머 연장을 억제하는데 사용된 차단 기의 상류 (예를 들어, 5'에서)에 위치되는 절단 도메인을 포함할 수 있다. 예로서, 절단 도메인은 RNase H 절단 도메인일 수 있거나, 절단 도메인은 단일 RNA 잔기를 포함하는 RNase H2 절단 도메인일 수 있거나, 올리고뉴클레오티드는 RNA 염기의 하나 이상의 대안적 뉴클레오시드로의 대체를 포함할 수 있다. 추가의 실례가 되는 절단 도메인은 US2010/0167353에 기재되어 있다.

따라서, 다중 PCR 시스템은 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85개, 또는 그 초과의 정방향 프라이머 [여기서 각각의 정방향 프라이머는 단일 기능성 TCR 또는 Ig V 절편 또는 소규모(small family)의 기능성 TCR 또는 Ig V 절편, 예를 들어, TCR Vβ 절편, (예를 들어, 표 1, 서열 번호:1644-1695에 나타낸 바와 같은 TCRBV 프라이머)에 상보적임], 및, 예를 들어, 각각이 TCR 또는 Ig J 절편, 예컨대 TCR Jβ 절편 (예를 들어, 표 1, 서열 번호:1631-1643에서의 TCRBJ 프라이머)에 특이적인 13개의 역방향 프라이머를 사용할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 다중 PCR 반응은 각각이 하나 이상의 기능성 TCRγ V 절편에 특이적인 4개의 정방향 프라이머 및 각각이 하나 이상의 TCRγ J 절편에 특이적인 4개의 역방향 프라이머를 사용할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 다중 PCR 반응은 각각이 하나 이상의 기능성 V 절편에 특이적인 84개의 정방향 프라이머 및 각각이 하나 이상의 J 절편에 특이적인 6개의 역방향 프라이머를 사용할 수 있다.

열 사이클 조건은 당업자의 방법에 따를 수 있다. 예를 들어, PCR 익스프레스(Express)™ 열 사이클러 (하이베이드(Hybaid), 영국 애쉬포드)를 사용하여, 하기 사이클 조건이 사용될 수 있다: 95℃에서 15분 동안 1회 사이클, 94℃에서 30초 동안, 59℃에서 30초 동안 및 72℃에서 1분 동안 25 내지 40회 사이클, 이어서 72℃에서 10분 동안 1회 사이클. 당업자에 의해 인식되는 바와 같이, 예를 들어, 어닐링 온도, 어닐링 시간, 사이클 수 및 연장 시간을 변형시킴으로써 열 사이클 조건을 최적화할 수 있다. 당업자에 의해 인식될 것인 바와 같이, 사용되는 프라이머 및 다른 PCR 시약의 양뿐만 아니라, PCR 파라미터 (예를 들어, 어닐링 온도, 연장 시간 및 사이클 수)를 최적화하여, 목적하는 PCR 증폭 효율을 달성할 수 있다.

대안으로, 또한, 본원에서 고려된 특정 관련 실시양태에서, "디지털 PCR" 방법을 사용하여, 표준 곡선의 필요 없이, 샘플 중의 표적 게놈의 수를 정량화할 수 있다. 디지털 PCR에서, 단일 샘플에 대한 PCR 반응은, 다수의 100 초과의 마이크로셀 또는 액적에서 수행되어, 각각의 액적은 증폭 (예를 들어, 증폭 생성물의 생성은 마이크로셀 또는 액적에서 1개 이상의 주형 분자의 존재의 증거를 제공한다)하거나 증폭하지 못하도록 한다 (소정의 마이크로셀 또는 액적에 주형이 존재하지 않았던 증거). 포지티브 마이크로셀의 수를 단지 셈으로써, 입력 샘플에 존재하는 표적 게놈의 수를 직접 세는 것이 가능하다.

디지털 PCR 방법은 전형적으로 열 사이클 반응에서 각각의 사이클 후 측정되는 종래의 정량적 PCR 신호라기보다는 종말점 판독(endpoint readout)을 사용한다 (예를 들어, 문헌 [Pekin et al., 2011 Lab. Chip 11(13):2156]; [Zhong et al., 2011 Lab. Chip 11(13):2167]; [Tewhey et al., 2009 Nature Biotechnol. 27:1025]; [2010 Nature Biotechnol. 28:178]; [Vogelstein and Kinzler, 1999 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:9236-41]; [Pohl and Shih, 2004 Expert Rev. Mol. Diagn. 4(1);41-7, 2004] 참조). 전통적인 PCR과 비교하여, dPCR은 하기 이점을 갖는다: (1) 기준 또는 표준에 의존할 필요가 없고, (2) PCR 반복실험의 총 수를 증가시킴으로써 목적하는 정밀도를 달성할 수 있고, (3) 이는 억제제에 고도로 내성이고, (4) 이는 복합 혼합물을 분석할 수 있고, (5) 샘플에 존재하는 카피의 수에 선형 응답을 제공하여 검출되는 카피 수의 작은 변화를 허용한다. 따라서, 본원에 기재된 조성물 (예를 들어, 주형 조성물 및 적응 면역 수용체 유전자-특이적 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트) 및 방법 중 어느 것이든 이러한 디지털 PCR 방법론, 예를 들어, ABI 퀀트스튜디오(QuantStudio)™ 12K 플렉스 시스템(Flex System) (라이프 테트놀로지즈(Life Technologies), 캘리포니아주 칼즈배드), QX100™ 드롭플렛(Droplet) 디지털(Digital)™ PCR 시스템 (바이오래드(Biorad), 캘리포니아주 헬큘리즈), 퀀타라이프(QuantaLife)™ 디지털 PCR 시스템 (바이오래드, 캘리포니아주 헬큘리즈) 또는 레인댄스(RainDance)™ 마이크로드롭플렛(microdroplet) 디지털 PCR 시스템 (레인댄스 테크롤로지즈(RainDance Technologies), 매사추세츠주 랙싱톤)에 사용하기 위해 적합화될 수 있다.

어댑터

또한, 본원에 기재된 일반식 (I)의 주형 올리고뉴클레오티드는 특정 실시양태에서 제1 (U1) 및 제2 (U2) 범용 어댑터 올리고뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있거나, U1 및 U2 중 하나 또는 둘 다가 결여될 수 있다. 따라서 U1은 부재하거나 (i) 제1 범용 어댑터 올리고뉴클레오티드 서열 및 (ii) 제1 범용 어댑터 올리고뉴클레오티드 서열에 연결되고 5'에 위치되는 제1 서열분석 플랫폼-특이적 올리고뉴클레오티드 서열로부터 선택되는 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있고, U2는 부재하거나 (i) 제2 범용 어댑터 올리고뉴클레오티드 서열, 및 (ii) 제2 범용 어댑터 올리고뉴클레오티드 서열에 연결되고 5'에 위치되는 제2 서열분석 플랫폼-특이적 올리고뉴클레오티드 서열로부터 선택되는 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.

U1 및/또는 U2는, 예를 들어, 범용 어댑터 올리고뉴클레오티드 서열 및/또는 단일-분자 서열분석 기술, 예를 들어 HiSeq™ 또는 진어낼라이저™-2 (GA-2) 시스템 (일루미나 인코포레이티드(Illumina Inc.), 캘리포니아주 샌 디에이고) 또는 기기 장치, 시약 및 소프트웨어의 또 다른 적합한 서열분석 세트에 특이적인 서열분석 플랫폼-특이적 올리고뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 이러한 플랫폼-특이적 어댑터 서열의 포함으로 인해, 뉴클레오티드 서열분석 방법론, 예컨대 HiSeq™ 또는 GA2 또는 등가물을 사용하여, 복수개의 상이한 일반식 (I)의 주형 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 현재 기재된 주형 조성물의 직접 정량적 서열분석이 가능하게 된다. 따라서 이러한 특질로 인해 유리하게는 주형 조성물의 정성 및 정량 특성화가 가능하게 된다.

특히, 주형 조성물의 모든 성분을 서열분석하는 능력으로 인해 복수개의 주형 올리고뉴클레오티드에서 각각의 주형 올리고뉴클레오티드가 실질적으로 등몰량으로 존재한다는 검증이 직접 가능하게 된다. 예를 들어, 양 말단에 범용 어댑터 서열을 갖는 현재 기재된 주형 올리고뉴클레오티드의 세트가 생성될 수 있어, 어댑터 서열을 사용하여 각각의 주형의 각각의 말단에 서열분석 플랫폼-특이적 올리고뉴클레오티드를 추가로 편입할 수 있게 된다.

이론에 의해 얽매이는 것을 바라지 않으면서, 변성, 어닐링 및 연장의 최소 2회 사이클로 5' (5'-플랫폼 서열-범용 어댑터-1 서열-3') 및 3' (5'-플랫폼 서열-범용 어댑터-2 서열-3') 올리고뉴클레오티드를 사용하여 이러한 변형된 주형의 말단 상에 플랫폼-특이적 올리고뉴클레오티드를 부가할 수 있어, 성분 주형 올리고뉴클레오티드 각각의 주형 조성물에서의 상대적 표시가 정량적으로 변경되지 않게 된다. 특유의 동정자 서열 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이, 각각, 개별 V 및 J 영역과 연관되고 따라서 개별 V 및 J 영역을 동정하는 특유의 V 및 B 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는 바코드 서열 B)은 어댑터 서열에 인접하게 위치되고, 따라서 짧은 서열 판독으로 정량적 서열분석이 가능하게 되어, 존재하는 각각의 특유의 주형 서열의 상대량의 기준에 의해 주형 집단을 특성화하도록 한다.

이러한 직접 정량적 서열분석이 하나 이상의 특정의 올리고뉴클레오티드가 주형 조성물의 제조에서 과도 표시 또는 과소 표시될 수 있음을 나타내는 경우, 그에 따라 주형 조성물의 조정이 이루어져 모든 올리고뉴클레오티드가 실질적으로 등몰량으로 존재하는 주형 조성물을 수득할 수 있다. 그 다음 모든 올리고뉴클레오티드가 실질적으로 등몰량으로 존재하는 주형 조성물을, 예컨대 프라이머 세트의 구성원 중에서 불균일 증폭능을 측정 및 보정하는 현재 개시된 방법에서, 증폭 프라이머 세트의 교정 표준으로서 사용할 수 있다.

실시예에 기재되고 서열 목록 (예를 들어, 서열 번호:1-1630의 5' 및 3' 말단에서)에서의 예시적 주형 서열에 포함된 어댑터 서열 이외에도, 범용 어댑터 서열로서 사용될 수 있는 다른 올리고뉴클레오티드 서열은, 본원에 기재된 주형의 다른 부분에서 발견되는 서열과 구별되는 어댑터 올리고뉴클레오티드 서열의 선택을 포함하여, 본 개시내용의 관점에서 당업자에게 알려질 것이다. 추가의 어댑터 서열의 비제한적 예를 표 2에 나타냈고 서열 번호:1710-1731에 명기하였다.

[표 2]

바코드

본원에 기재된 바와 같이, 특정 실시양태는 전체 증폭 생성물을 서열분석할 필요없이, 주형 서열, 및 따라서 그 주형의 증폭에 관여하는 1개 이상의 프라이머의 분명한 동정을 가능하게 하는 짧은 신호 서열을 함유하는 주형 올리고뉴클레오티드 서열을 설계하는 것을 고려한다. 본원에 기재된 일반식 (I)의 주형 올리고뉴클레오티드에서, B1, B2, B3, 및 B4는 각각 독립적으로 부재하거나 각각 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000개 또는 그 초과의 인접 뉴클레오티드 (그 사이에 모든 정수값 포함)의 올리고뉴클레오티드 바코드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 B를 포함하고, 여기서 복수개의 주형 올리고뉴클레오티드 서열 각각에서 B는, 쌍체 조합으로서, (i) 주형 올리고뉴클레오티드의 특유의 V 올리고뉴클레오티드 서열 및 (ii) 주형 올리고뉴클레오티드의 특유의 J 올리고뉴클레오티드 서열을 특유하게 동정하는 특유의 올리고뉴클레오티드 서열을 포함한다.

따라서, 예를 들어, 바코드 동정자 서열을 갖는 주형 올리고뉴클레오티드로 인해 비교적 짧은 증폭 생성물 서열 판독, 예컨대 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100, 90, 80, 70, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4개 또는 그 미만의 뉴클레오티드 이하의 바코드 서열 판독이 가능하게 될 수 있고, 이어서 이러한 바코드 서열 정보는 주형 설계의 부분으로서 바코드를 갖는 주형으로 편입되는 연관된 V 및 J 서열에 매치된다. 이러한 접근법에 의해, 수많은 증폭 생성물이 고 처리량 병행 서열분석에 의해 동시에 부분적으로 서열분석되어, 복합 프라이머 세트에서 증폭 바이어스에 관여하는 프라이머를 동정할 수 있다.

예시적 바코드는 주형에서 각각의 V 폴리뉴클레오티드를 특유하게 동정하는 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개 뉴클레오티드의 제1 바코드 올리고뉴클레오티드 및 주형에서 각각의 J 폴리뉴클레오티드를 특유하게 동정하는 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개 뉴클레오티드의 제2 바코드 올리고뉴클레오티드를 포함하여, 각각, 길이가 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 또는 32개 뉴클레오티드의 바코드를 제공할 수 있지만, 이들 및 관련 실시양태가 그렇게 제한되는 것으로 의도되지는 않는다. 바코드 올리고뉴클레오티드는, 달리 구별되는 서열 (예를 들어, V 및 J 서열)을 갖는 2개 이상의 주형 올리고뉴클레오티드에서 소정의 바코드 서열이 발생하지 못하도록 하는 최소 바코드 길이가 수득되는 한, 임의의 길이의 올리고뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.

따라서, 최소 바코드 길이는, 상이한 V-J 서열 쌍형성을 특유하게 동정하는데 사용되는 바코드 중에서 이러한 중복을 피하기 위해, X 뉴클레오티드이며, 여기서 4^x는 동일하지 않은 서열을 갖는 것을 기준으로 차별되는 구별되는 주형 종의 수보다 크다. 예를 들어, 본원에서 서열 번호:1-871로서 명기된 871개의 주형 올리고뉴클레오티드의 세트의 경우, 최소 바코드 길이는 5개의 뉴클레오티드가 될 것이고, 이로써 1024개 (즉, 871 초과)의 상이한 가능한 펜타뉴클레오티드 서열의 이론적 총계가 가능하게 될 것이다. 실제로, 바코드 올리고뉴클레오티드 서열 판독 길이는 이용되는 뉴클레오티드 서열분석 기기의 서열 판독-길이 한계에 의해서만 제한될 수 있다. 특정 실시양태의 경우, 주형 올리고뉴클레오티드의 개별 종과 구별될 상이한 바코드 올리고뉴클레오티드는, 바코드 올리고뉴클레오티드 서열에서 특정의 위치에서 매치되는 뉴클레오티드의 수를 최대화하도록 조정된 경우 2개 이상의 뉴클레오티드 미스매치 (예를 들어, 최소 해밍(hamming) 거리 2)를 가져야 할 것이다.

바람직한 실시양태에서, 일반식 (I)의 주형 조성물 내에서 특유의 서열을 갖는 각각의 구별되는 주형 올리고뉴클레오티드 종의 경우, B1, B2, B3, 및 B4는 동일할 것이다.

당업자는, 예를 들어, 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 300, 500개 또는 그 초과의 인접 뉴클레오티드 (그 사이에 모든 정수값 포함)의 올리고뉴클레오티드 바코드 서열의 더 큰 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 구축물의 설계, 합성, 및 그로의 편입에 친숙할 것이다. 올리고뉴클레오티드 바코드 서열 동정 전략의 설계 및 이행의 비제한적 예에 관해서는, 예를 들어, 문헌 [de Carcer et al., 2011 Adv. Env. Microbiol. 77:6310]; [Parameswaran et al., 2007 Nucl. Ac. Res. 35(19):330]; [Roh et al., 2010 Trends Biotechnol. 28:291]을 참조.

전형적으로, 바코드는 이들이 자연적으로 발견되지 않는 위치에서 주형에 위치되고, 즉, 바코드는 바코드가 인접하여 위치되는 서열 부근에서 발견될 수 있는 임의의 자연 발생 올리고뉴클레오티드 서열 (예를 들어, V 및/또는 J 서열)로부터 구별되는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이러한 바코드 서열은 본원에 기재된 특정 실시양태에 따르면, 현재 개시된 일반식 (I)의 주형 올리고뉴클레오티드의 요소 B1, B2 및/또는 B3으로서 포함될 수 있다. 따라서, 또한, 본원에 기재된 일반식 (I)의 특정 주형 올리고뉴클레오티드는 특정 실시양태에서 바코드 B1, B2 및 B3 중 1개, 2개 또는 3개 모두를 포함할 수 있으며, 한편 특정 다른 실시양태에서 이들 바코드 일부 또는 모두가 부재할 수 있다. 특정 실시양태에서 모든 바코드 서열은 동일하거나 유사한 GC 함량을 가질 것이다 (예를 들어, 20% 이하, 또는 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11 또는 10% 이하의 GC 함량의 차이).

특정의 본원에 개시된 실시양태에 따른 주형 조성물에서 바코드-함유 요소 B (예를 들어, B1, B2, B3, 및/또는 B4)는 단일 쌍체 V-J 조합을 특유하게 동정하는 올리고뉴클레오티드 서열을 포함한다. 또한, 임의로 및 특정 실시양태에서 바코드-함유 요소 B는, 각각의 특이적 쌍체 V-J 조합을 특유하게 동정하는 특이적 바코드 서열의 상류 및/또는 하류에 위치된, 랜덤 뉴클레오티드, 또는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 300, 500개 또는 그 초과의 인접 뉴클레오티드의 랜덤 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 특이적 바코드 서열의 상류 및 하류 둘 다에 존재하는 경우, 랜덤 뉴클레오티드 또는 랜덤 폴리뉴클레오티드 서열은 서로 독립적이며, 즉, 이들은 동일 뉴클레오티드 또는 동일 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있지만, 반드시 그럴 필요는 없다.

제한 효소 부위

본원에 개시된 특정 실시양태에 따르면, 주형 올리고뉴클레오티드는 V와 J 서열 사이에 위치되고 주형 올리고뉴클레오티드 서열의 다른 곳에서는 발생하지 않는 제한 엔도뉴클레아제 (RE) 인식 부위를 포함할 수 있다. RE 인식 부위는 V 영역 서열을 동정하는 바코드 부위에 임의로 인접할 수 있다. RE 부위는, 주형을 적절한 제한 효소와 접촉시킴으로써 이를 선택적으로 파괴하기 위해 활용될 수 있는 구조적 특질로서 제한없이 포함하여, 다수의 목적 중 어느 것을 위해서도 포함될 수 있다. 예를 들어, 고의적으로 또는 우연히 도입될 수 있었을 다른 조성물로부터 주형 올리고뉴클레오티드를 제거하기 위해, 이를 적합한 RE와 접촉시킴으로써 본 주형 올리고뉴클레오티드를 선택적으로 분해시키는 것이 바람직할 수 있다. 대안으로, RE 부위는 주형 조성물에서 주형 올리고뉴클레오티드를 서열분석하는 과정에서, 및/또는 주형 올리고뉴클레오티드 서열에서 이것이 제한 효소에 의해 절단되는지의 여부와 상관없이 포지셔날(positional) 서열 마커로서 유용하게 활용될 수 있다. 예시적 RE 부위는 올리고뉴클레오티드 모티프 GTCGAC이고, 이는 제한 효소 Sal I에 의해 인식된다. 수많은 추가 제한 효소 및 그 각각의 인식 부위 서열은 본 기술분야에 공지되어 있고 시판되고 있다 (예를 들어, 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs), 매사추세츠주 베벌리). 이들은, 예를 들어, EcoRI (GAATTC) 및 SphI (GCATGC)를 포함한다. 당업자는 다양한 이러한 RE 인식 부위 중 어느 것이든 현재 개시된 주형 올리고뉴클레오티드의 특정 실시양태에 편입될 수 있음을 알 것이다.

서열분석

다양한 입수가능한 고 처리량 단일 분자 서열분석 기계 및 시스템 중 어느 것이든 사용하여 서열분석을 수행할 수 있다 예시적 서열 시스템은 합성에 의한 서열 시스템, 예컨대 일루미나 게놈 분석기 및 관련 기기 (일루미나 인코포레이티드, 캘리포니아주 샌 디에이고), 헬리코스(Helicos) 유전자 분석 시스템 (헬리코스 바이오사이언시즈 코포레이션(Helicos BioSciences Corp.), 매사추세츠주 케임브리지), 퍼시픽 바이오사이언시즈(Pacific Biosciences) PacBio RS (퍼시픽 바이오사이언시즈, 캘리포니아주 멘로 파크), 또는 유사한 성능을 갖는 기타 시스템을 포함한다. 서열 분석은 증폭된 DNA 분자의 규정 영역에 혼성화되는 서열분석 올리고뉴클레오티드의 세트를 사용하여 달성된다. 서열분석 올리고뉴클레오티드는 V- 및 J- 암호화 유전자 절편이 본 개시내용을 기반으로 및 공적으로 입수가능한 데이터베이스에 나타난 공지된 적응 면역 수용체 유전자 서열의 관점에서, 생성되는 서열에 의해 특유하게 동정될 수 있도록 설계된다. 예를 들어, U.S.A.N. 13/217,126; U.S.A.N. 12/794,507; PCT/US2011/026373; 또는 PCT/US2011/049012 참조. 예시적 TCRB J-영역 서열분석 프라이머는 표 3에 명기되어 있다:

[표 3]

용어 "유전자"는 폴리펩티드 쇄, 예컨대 TCR 또는 Ig 폴리펩티드 (예를 들어, CDR3-함유 폴리펩티드)의 모두 또는 일부를 생성하는데 관여하는 DNA의 절편을 의미하고; 이는 암호화 영역의 앞과 뒤에 존재하는 영역 "리더 앤 트레일러(leader and trailer)"뿐만 아니라 개별 암호화 절편 (엑손) 사이의 개재 서열 (인트론)을 포함하고, 또한 조절 요소 (예를 들어, 프로모터, 인핸서, 리프레서 결합 부위 등)를 포함할 수 있고, 또한 본원에 기재된 바와 같은 재조합 신호 서열 (RSS)을 포함할 수 있다.

본원에서 폴리뉴클레오티드로도 지칭되는 본 실시양태의 핵산은, RNA의 형태 또는 DNA의 형태일 수 있고, 이러한 DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 및 합성 DNA를 포함한다. DNA는 이중 가닥 또는 단일 가닥일 수 있고, 단일 가닥이라면, 암호화 가닥 또는 비암호화 (안티센스) 가닥일 수 있다. 본 실시양태에 따라 사용하기 위한 TCR 또는 면역글로불린 또는 그의 영역 (예를 들어, V 영역, D 절편, J 영역, C 영역 등)을 암호화하는 암호화 서열은 임의의 소정의 TCR 또는 면역글로불린 유전자 영역 또는 폴리펩티드 도메인 (예를 들어, V-영역 도메인, CDR3 도메인 등)을 위한 본 기술분야에 공지된 암호화 서열과 동일할 수 있거나, 상이한 암호화 서열일 수 있고, 이는 유전 암호의 중복 또는 축중의 결과로서 동일 TCR 또는 면역글로불린 영역 또는 폴리펩티드를 암호화한다.

특정 실시양태에서, 증폭된 J-영역 암호화 유전자 절편은 각각 RSS 부위에 대해 규정된 위치에 위치된, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 약 15, 20개 또는 그 초과의 뉴클레오티드의 특유의 서열-규정된 동정자 태그를 가질 수 있다. 예를 들어, RSS 부위로부터 하류의 위치 +11 내지 +14에서, 증폭된 TCRβ CDR3-암호화 영역의 Jβ-영역 암호화 절편에서 4-염기 태그를 사용할 수 있다. 그러나, 이들 및 관련 실시양태는 그렇게 제한될 필요는 없고 또한 J-영역 암호화 유전자 절편에서 검출되고 RSS 부위에 대해 그의 위치를 기반으로 규정될 수 있는 다른 상대적으로 짧은 뉴클레오티드 서열-규정된 동정자 태그를 고려한다. 이들은 상이한 적응 면역 수용체 암호화 유전자자리 사이에서 달라질 수 있다.

재조합 신호 서열 (RSS)은 12 +/- 1 bp ("12-신호") 또는 23 +/- 1 bp ("23-신호")의 스페이서에 의해 분리된, 2개의 보존된 서열 (칠량체, 5'-CACAGTG-3', 및 구량체, 5'-ACAAAAACC-3')로 이루어진다. 칠량체의 위치 1 및 2에서 CA 다이뉴클레오티드를 포함하여 다수의 뉴클레오티드 위치가 재조합에 중요한 것으로 동정되어 있고, 칠량체 위치 3에서의 C는 또한 구량체의 위치 5, 6, 7에서의 A 뉴클레오티드와 마찬가지로 강력하게 바람직한 것으로 확인되었다. (문헌 [Ramsden et. al 1994]; [Akamatsu et. al. 1994]; [Hesse et. al. 1989]). 다른 뉴클레오티드의 돌연변이는 최소한의 또는 부합되지 않는 효과를 갖는다. 스페이서는, 비록 더 가변성이긴 하지만, 재조합에 또한 영향을 주며, 단일-뉴클레오티드 대치가 재조합 효율에 상당히 영향을 주는 것으로 확인되었다 (문헌 [Fanning et. al. 1996], [Larijani et. al 1999]; [Nadel et. al. 1998]). 상당히 상이한 재조합 효율을 갖는 RSS 폴리뉴클레오티드 서열을 동정하기 위한 기준이 기재되어 있다 (문헌 [Ramsden et. al 1994]; [Akamatsu et. al. 1994]; [Hesse et. al. 1989] 및 [Cowell et. al. 1994]). 따라서, 서열분석 올리고뉴클레오티드는 RSS 부위의 하류의 위치 +11 내지 +14에서 증폭된 J-암호화 유전자 절편 내에 4개 염기 태그에 인접하여 혼성화될 수 있다. 예를 들어, TCRB에 대한 서열분석 올리고뉴클레오티드는 이러한 "태그"의 바로 하류에서 관찰된 컨센서스 뉴클레오티드 모티프에 어닐링되도록 설계될 수 있어서, 서열 판독의 최초 4개의 염기는 J-암호화 유전자 절편을 특유하게 동정할 것이다 (예를 들어, WO/2012/027503 참조).

V 절편의 제2 보존된 시스테인과 J 절편의 보존된 페닐알라닌 사이의 TCR 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드로서 규정된, TCR에 대한 CDR3-암호화 영역의 평균 길이는 35+/-3 뉴클레오티드이다. 따라서 그리고 특정 실시양태에서, 특정의 TCR 또는 IgH J 영역의 J 절편 태그 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 TCR Jβ, TCR Jγ 또는 IgH JH)로부터 개시하는 J-절편 올리고뉴클레오티드 프라이머와 함께 V-절편 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하는 PCR 증폭은 50 염기쌍 판독에서 완전 V-D-J 결합부를 거의 언제나 포획할 것이다. V 절편에서 보존된 시스테인과 J 절편에서 보존된 페닐알라닌 사이의 뉴클레오티드로서 규정된 IgH CDR3 영역의 평균 길이는 TCRβ 유전자자리에서 보다 덜 제약을 받지만, 전형적으로 약 10 내지 약 70개 뉴클레오티드일 것이다. 따라서 그리고 특정 실시양태에서, IgH J 절편 태그로부터 개시하는 J-절편 올리고뉴클레오티드 프라이머와 함께 V-절편 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하는 PCR 증폭은 100개 염기쌍 판독에서 완전 V-D-J 결합부를 포획할 것이다.

미스매치된 주형 서열에 어닐링되고 폴리뉴클레오티드 연장을 지지하는 PCR 프라이머는 혼잡 프라이머로서 지칭된다. 특정 실시양태에서, TCR 및 Ig J-절편 역방향 PCR 프라이머는 서열분석 올리고뉴클레오티드와의 중첩을 최소화하여, 다중 PCR과 관련하여 혼잡 프라이밍을 최소화하도록 설계될 수 있다. 한 실시양태에서, TCR 및 Ig J-절편 역방향 프라이머는, 서열분석 프라이머의 최소 중첩과 함께, 컨센서스 스플라이스 부위 모티프에 어닐링됨으로써 3' 말단에 고정될 수 있다. 일반적으로, TCR 및 Ig V 및 J-절편 프라이머는 디폴트 파라미터하에 공지된 서열/프라이머 설계 및 분석 프로그램을 사용하여 일정 어닐링 온도에서 PCR에서 작동하도록 선택될 수 있다.

서열분석 반응을 위해, 예시적 IGHJ 서열분석 프라이머는 WO/2012/027503에 기재된 바와 같이 보존된 CAG 서열에 걸쳐서 3개의 뉴클레오티드를 연장시킨다.

샘플

시험 생물학적 샘플이 수득될 수 있는, 대상체 또는 생물학적 공급원은, 인간 또는 인간 이외의 동물, 또는 형질전환된 또는 클로닝된 또는 조직공학적으로 작제된 (줄기 세포의 이용에 의한 것 포함) 생물일 수 있다. 본 발명의 특정의 바람직한 실시양태에서, 대상체 또는 생물학적 공급원은, 순환 또는 고형 종양 또는 다른 악성 병태, 또는 자가면역 질환, 또는 염증성 병태를 가진 것으로 알려질 수 있거나, 갖거나 가질 위험이 있는 것으로 의심될 수 있고, 본 발명의 특정의 바람직한 실시양태에서 대상체 또는 생물학적 공급원은 이러한 질환의 위험 또는 존재가 없는 것으로 알려질 수 있다.

특정의 바람직한 실시양태는, 미국의 국립 암 연구소 (미국, 메릴랜드주 베데스다)의 것 또는 문헌 [DeVita, Hellman, and Rosenberg's Cancer: Principles and Practice of Oncology (2008, Lippincott, Williams and Wilkins, Philadelphia/ Ovid, New York)]; [Pizzo and Poplack, Principles and Practice of Pediatric Oncology (Fourth edition, 2001, Lippincott, Williams and Wilkins, Philadelphia/ Ovid, New York)]; 및 [Vogelstein and Kinzler, The Genetic Basis of Human Cancer (Second edition, 2002, McGraw Hill Professional, New York)]에 기재된 바와 같은, 본 기술분야-허용 임상 진단 기준에 따라, 암을 갖거나, 발증하거나 걸릴 위험이 있는 것으로 진단받은 환자와 같은 인간 대상체인 대상체 또는 생물학적 공급원을 고려하며; 특정 실시양태는 이러한 기준에 의해 암을 갖거나, 발증하거나 걸릴 위험이 없는 것으로 알려진 인간 대상체를 고려한다.

특정 다른 실시양태는 인간 이외의 대상체 또는 생물학적 공급원, 예를 들어 인간 이외의 영장류, 예컨대 마카크, 침팬지, 고릴라, 버빗 원숭이, 오랑우탄, 개코원숭이 또는 다른 인간 이외의 영장류 (고형 종양 및/또는 다른 암에 대한 전임상 모델을 포함한, 전임상 모델로서 본 기술분야에 공지될 수 있는 이러한 인간외 대상체 포함)를 고려한다. 특정 다른 실시양태는 포유동물인 인간 이외의 대상체, 예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 돼지, 양, 말, 소, 염소, 저빌쥐, 햄스터, 기니아 피그 또는 다른 포유동물을 고려하며; 많은 이러한 포유동물은 순환 또는 고형 종양 및/또는 다른 암을 포함한, 특정 질환 또는 장애에 대한 전임상 모델로서 본 기술분야에 공지된 대상체일 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Talmadge et al., 2007 Am. J. Pathol. 170:793]; [Kerbel, 2003 Canc. Biol. Therap. 2(4 Suppl 1):S134]; [Man et al., 2007 Canc. Met. Rev. 26:737]; [Cespedes et al., 2006 Clin. Transl. Oncol. 8:318]). 그러나, 실시양태의 범위는 그렇게 제한되는 것으로 의도되지는 않아서, 또한, 대상체 또는 생물학적 공급원은 포유동물 이외의 척추 동물, 예를 들어, 또 다른 고등 척추동물, 또는 조류, 양서류 또는 파충류 종, 또는 또 다른 대상체 또는 생물학적 공급원일 수 있는 고려된 다른 실시양태가 존재하게 된다.

생물학적 샘플은 대상체 또는 생물학적 공급원으로부터 혈액 샘플, 생검 표본, 조직 외식편, 기관 배양물, 생체액 또는 임의의 다른 조직 또는 세포 제제를 수득함으로써 제공될 수 있다. 바람직하게는 샘플은 대상체 또는 생물학적 공급원의 림프계 세포로부터의 DNA를 포함하고, 이는 한정됨이 없이 실례로서, 하나 이상의 TCR 또는 BCR 유전자자리에서 재배열된 DNA를 함유할 수 있다. 특정 실시양태에서 시험 생물학적 샘플은, 예를 들어 외과적 절제, 침 생검 또는 세포의 혼합물을 함유하는 시험 생물학적 샘플을 수득하기 위한 다른 수단에 의해 고형 조직 (예를 들어, 고형 종양)으로부터 수득될 수 있다.

특정 실시양태에 따르면, 수많은 확립된 방법론 중 어느 것이든지에 따라 림프계 세포 (예를 들어, T 세포 및/또는 B 세포)를 단리하는 것이 바람직할 수 있고, 여기서 단리된 림프계 세포는 이들이 자연 발생하는 조직, 환경 또는 경우로부터 제거 또는 단리된 것이다. 따라서 B 세포 및 T 세포는 생물학적 샘플로부터, 예컨대 골수, 흉선, 림프선, 림프절, 말초 조직 및 혈액을 포함한, 다양한 조직 및 생체액 샘플부터 수득될 수 있고, 말초 혈액이 가장 쉽게 이용된다. 임의의 말초 조직은 B 및 T 세포의 존재에 대해 샘플 추출될 수 있고 따라서 본원에 기재된 방법에서 사용이 고려된다. 적응 면역 세포가 수득될 수 있는 조직 및 생체액은, 피부, 상피 조직, 결장, 비장, 점막 분비물, 구강 점막, 장 점막, 질 점막 또는 질 분비물, 경부 조직, 신경절, 타액, 뇌척수액 (CSF), 골수, 제대혈, 혈청, 장막액(serosal fluid), 혈장, 림프, 소변, 복수(ascites fluid), 흉수(pleural fluid), 심막액, 복막액(peritoneal fluid), 복부액(abdominal fluid), 배양 배지, 컨디셔닝된 배양 배지 또는 세정액(lavage fluid)을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 적응 면역 세포는 아페레시스(apheresis) 샘플로부터 단리될 수 있다. 말초 혈액 샘플은 대상체로부터 정맥절개술에 의해 수득될 수 있다. 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)는 당업자에게 공지된 기법에 의해, 예를 들어, 피콜-하이파크(Ficoll-Hypaque)^® 밀도 구배 분리에 의해 단리된다. 특정 실시양태에서, 전체 PBMC가 분석용으로 사용된다.

핵산 추출을 위해, 총 게놈 DNA는 본 기술분야에 공지된 방법 및/또는 시판되는 키트, 예를 들어, QIAamp^® DNA 혈액 미니 키트 (퀴아젠(QIAGEN)^®)를 사용하여 세포로부터 추출할 수 있다. 단일 반수체 게놈의 대략적 질량은 3 pg이다. 바람직하게는, 100,000 내지 200,000개 이상의 세포를 분석에 사용한다 (즉, 이배체 T 또는 B 세포로부터 약 0.6 내지 1.2 ㎍ DNA). PBMC를 공급원으로 사용하면, T 세포의 수는 총 세포의 약 30%인 것으로 추정될 수 있다. 또한, B 세포의 수는 PBMC 제제에서 총 세포의 약 30%인 것으로 추정될 수 있다.

Ig 및 TCR 유전자 유전자자리는 많은 상이한 가변 (V), 다양성 (D), 및 결합 (J) 유전자 절편을 함유하며, 이는 조기 림프계 분화 동안 재배열 과정에 적용될 수 있다. Ig 및 TCR V, D 및 J 유전자 절편 서열은 본 기술분야에 공지되어 있으며 젠뱅크와 같은 공개 데이터베이스로 입수가능하다. V-D-J 재배열은 재조합 효소 복합체를 통해 매개되고 여기서 RAG1 및 RAG2 단백질은 재조합 신호 서열 (RSS)에서 DNA를 인식하고 절단함으로써 주요한 역할을 하며, 이는 D 유전자 절편의 양쪽에서 V 유전자 절편의 하류에 위치되고, J 유전자 절편의 상류에 위치된다. 부적절한 RSS는 재배열을 감소시키거나 심지어 완전히 방지한다. 재조합 신호 서열 (RSS)은 12 +/- 1 bp ("12-신호") 또는 23 +/- 1 bp ("23-신호")의 스페이서에 의해 분리된, 2개의 컨센서스 서열 (칠량체, 5'-CACAGTG-3', 및 구량체, 5'-ACAAAAACC-3')을 포함한다. V 절편 및 D 절편의 3' 말단에서 RSS 서열은 칠량체 (CACAGTG)-스페이서-구량체 (ACAAAAACC)이다. J 절편 및 D 절편의 5' 말단에서 RSS 서열은, 각각의 특이적 유전자 절편의 칠량체 및 구량체 서열에서의 실질적인 서열 변이와 함께, 구량체 (GGTTTTTGT)-스페이서-칠량체 (CACTGTG)이다.

칠량체의 위치 1 및 2에서 CA 다이뉴클레오티드를 포함하여 다수의 뉴클레오티드 위치가 재조합에 중요한 것으로 동정되어 있고, 칠량체 위치 3에서의 C는 또한, 구량체의 위치 5, 6, 7에서의 A 뉴클레오티드와 마찬가지로 강력하게 바람직한 것으로 확인되었다. (문헌 [Ramsden et. al 1994 Nucl. Res. 22:1785]; [Akamatsu et. al. 1994 J. Immunol. 153:4520]; [Hesse et. al. 1989 Genes Dev. 3:1053]). 다른 뉴클레오티드의 돌변변이는 최소한의 또는 부합되지 않는 효과를 갖는다. 스페이서는 비록 더 가변성이긴 하지만, 재조합에 또한 영향을 주며, 단일-뉴클레오티드 대치가 재조합 효율에 상당히 영향을 주는 것으로 확인되었다 (문헌 [Fanning et. al. 1996 Cell. Immunol. Immumnopath. 79:1], [Larijani et. al 1999 Nucl. Ac. Res. 27:2304]; [Nadel et. al. 1998 J. Immunol. 161:6068]; [Nadel et al., 1998 J. Exp. Med. 187:1495]). 상당히 상이한 재조합 효율을 갖는 RSS 폴리뉴클레오티드 서열을 동정하기 위한 기준이 기재되어 있다 (문헌 [Ramsden et. al 1994 Nucl. Ac. Res. 22:1785]; [Akamatsu et. al. 1994 J. Immunol. 153:4520]; [Hesse et. al. 1989 Genes Dev. 3:1053], 및 [Lee et al., 2003 PLoS 1(1):E1]).

Ig 중쇄 (IgH), TCR 베타 (TCRB), 및 TCR 델타 (TCRD) 유전자에서의 재배열 과정은 일반적으로 D 내지 J 재배열에 이어서 V 내지 D-J 재배열로 개시되며, 한편 직접적 V 내지 J 재배열은 Ig 카파 (IgK), Ig 람다 (IgL), TCR 알파 (TCRA), 및 TCR 감마 (TCRG) 유전자에서 일어난다. 재배열 유전자 절편 사이의 서열은 일반적으로 TCR 절제 원형(excision circle) (TREC) 또는 B 세포 수용체 절제 원형 (BREC)으로도 칭해지는 원형 절제 생성물의 형태로 결실된다.

V, D, 및 J 유전자 절편의 많은 상이한 조합은 소위 조합 레퍼토리를 나타내고, 이는 Ig 분자의 경우 ~2x10⁶, TCRαβ 분자의 경우 ~3x10⁶ 및 TCRγδ 분자의 경우 ~ 5x10³로 추정된다. V, D, 및 J 유전자 절편의 결합 부위에서, 뉴클레오티드의 결실 및 랜덤 삽입은 재배열 과정 동안 일어나고, 이로써 매우 다양한 결합 영역이 초래되며, 이는 > 10¹²개 이상의 가능한 아미노산 서열로 추정되는, Ig 및 TCR 분자의 총 레퍼토리의 상당한 한 원인이 된다.

성숙 B-림프구는, Ig 분자의 친화도 성숙을 야기하는 과정인 체세포 초돌연변이를 통해 배 중심에서 항원 인식에 대해 그의 Ig 레퍼토리를 추가로 연장한다. 체세포 초돌연변이 과정은 IgH 및 Ig 경쇄 유전자의 V- (D-) J 엑손에 중점을 두며 주로 단일 뉴클레오티드 돌연변이를 발생시키지만 또한 때때로 뉴클레오티드의 삽입 또는 결실을 발생시킨다. 체세포 돌연변이된 Ig 유전자는 또한 전형적으로 성숙 B-세포 악성종양에서 발견된다.

본원에 기재된 특정 실시양태에서, V-절편 및 J-절편 프라이머를 PCR 반응에서 이용하여 시험 생물학적 샘플에서의 재배열된 TCR 또는 BCR CDR3-암호화 DNA 영역을 증폭시킬 수 있고, 여기서 각각의 기능성 TCR 또는 Ig V-암호화 유전자 절편은 V 유전자 재조합 신호 서열 (RSS)을 포함하고 각각의 기능성 TCR 또는 Ig J-암호화 유전자 절편은 J 유전자 RSS를 포함한다. 이들 및 관련 실시양태에서, 각각의 증폭된 재배열된 DNA분자는 (i) TCR 또는 Ig V-암호화 유전자 절편의 센스 가닥의 적어도 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000개 (그 사이에 모든 정수값 포함) 또는 그 초과의 인접 뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 여기서 적어도 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000개 또는 그 초과의 인접 뉴클레오티드는 V 유전자 RSS에 대해 5'에 위치되고/거나 각각의 증폭된 재배열된 DNA 분자는 (ii) TCR 또는 Ig J-암호화 유전자 절편의 센스 가닥의 적어도 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500개 (그 사이에 모든 정수값 포함) 또는 그 초과의 인접 뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 여기서 적어도 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500개 또는 그 초과의 인접 뉴클레오티드는 J 유전자 RSS에 대해 3'에 위치된다.

증폭 인자 측정

본원에 기재된 바와 같은 올리고뉴클레오티드 증폭 프라이머 세트의 증폭 효율을 표준화하기 위한 현재 개시된 주형 조성물의 용도 이외에도, 특정 다른 실시양태는 샘플 중의 재배열된 적응 면역 수용체 암호화 서열의 수를 추정하기 위한 증폭 인자를 측정하는 주형 조성물의 용도를 고려한다. 이들 및 관련 실시양태는 적응 면역 수용체를 암호화하는 DNA가 DNA 재배열을 겪은 세포를 포함하는 세포의 혼합물에 존재하는 림프계 세포를 포함한, 림프계 세포로부터 수득된 DNA 샘플 중의 적응 면역 수용체 암호화 서열의 수를 정량화하는 용도를 밝힐 수 있지만, 여기서 샘플은 또한 어떤 이러한 재배열도 일어나지 않은 세포 (예를 들어, 비-림프계 세포, 미성숙 세포, 중간엽 세포, 암 세포 등)로부터의 DNA를 함유한다.

대상체 중의 소정의 부류의 적응 면역 수용체 (예를 들어, TCR 또는 IG)의 상이한 구성원의 총수를 포괄적 V-J 증폭 프라이머 세트를 사용한 다중 PCR에 이어서 증폭 생성물의 정량적 서열분석에 의해 추정할 수 있다. 재배열된 TCR 및 BCR (IG) 암호화 DNA 서열의 다중 증폭 및 고 처리량 서열분석은, 예를 들어, 문헌 [Robins et al., 2009 Blood 114, 4099]; [Robins et al., 2010 Sci. Translat. Med. 2:47ra64]; [Robins et al., 2011 J. Immunol. Meth. doi:10.1016/j.jim.2011.09. 001]; [Sherwood et al. 2011 Sci. Translat. Med. 3:90ra61]; [U.S.A.N. 13/217,126 (미국 공개 번호 2012/0058902), U.S.A.N. 12/794,507 (미국 공개 번호 2010/0330571), WO/2010/151416, WO/2011/106738 (PCT/US2011/026373), WO2012/027503 (PCT/US2011/049012), U.S.A.N. 61/550,311, 및 U.S.A.N. 61/569,118]에 기재되어 있다.

이러한 방법론은 전형적으로 림프계 세포, 예컨대 재배열된 TCR 또는 Ig 암호화 DNA가 결여된 핵화 세포를 함유하는 것으로도 공지된, 혈액 샘플에 존재하는 림프계 세포의 아집단으로부터 DNA를 샘플 추출하는 것을 포함한다. 본 조성물 및 방법으로 이러한 샘플 중의 재배열된 TCR 및 IG 암호화 DNA 분자의 수의 측정의 개선된 정확도 및 정밀도가 가능하게 될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 예를 들어, DNA 샘플을 본 주형 조성물로 스파이킹함으로써, 내부 증폭 주형 표준이 다중 증폭 프라이머 세트에 존재하는 올리고뉴클레오티드 프라이머의 범위에 걸쳐서 상대적 효율을 평가하기 위해 제공된다. 알려진 양으로 증폭 반응에 부가되는 본 인공 주형 조성물의 증폭 생성물을 평가함으로써, 증폭 인자 (예를 들어 배수, 정규화, 계수(scaling) 또는 기하학적 인자 등)를 올리고뉴클레오티드 증폭 프라이머 세트에 대해 측정한 다음, 샘플 중의 자연 DNA 주형의 수를 계산하는데 사용할 수 있다.

또 다른 예로서, 이들 및 관련 실시양태로 인해 지속성 림프종 또는 백혈병 세포를 포함한, 림프계 및 비-림프계 세포의 혼합 제제로부터 수득된 샘플 중의 재배열된 TCR 또는 IG 암호화 DNA의 정량적 검출에 의해, 림프종 또는 백혈병에서 미세 잔존 질환 (MRD)의 정량화가 가능하게 된다. 이전의 방법은 샘플 중의 세포의 총 수의 비율로서 검출가능한 악성 세포의 수로서 MRD를 측정한다. 대조적으로, 본 방법으로 인해, 재배열된 TCR 또는 IG 암호화 DNA를 갖는 샘플 중의 세포의 총수가 추정가능하게 되어, 악성 세포 (예를 들어, 특정의 TCR 또는 IG 재배열을 갖는 것, 예컨대 클론형)는 모든 세포의 비율로서가 아니라 이러한 재배열된 세포의 비율로서 정량화될 수 있다. 비제한적 이론에 의해, MRD를 갖거나 갖는 것으로 의심되는 대상체로부터의 임상 샘플에서 모든 재배열된 세포의 표시가 전형적으로 매우 낮기 때문에, 본 방법은 MRD가 검출될 수 있는 민감도를 극적으로 개선할 것 (신호-대 잡음 비를 증가시킴으로써 이러한 민감도를 개선하는 것 포함)으로 여겨진다.

따라서 특정 실시양태는 대상체의 림프계 세포로부터의 재배열된 DNA를 포함하는 생물학적 샘플에서 각각 가변 영역 및 결합 영역을 포함하는 하나의 또는 복수개의 적응 면역 수용체를 암호화하는 재배열된 DNA 분자를 정량화하는 방법을 제공한다. 간략하게, 방법은,

(A) 소정의 적응 면역 수용체에 대한 실질적으로 모든 V-J 암호화 조합을 증폭시킬 수 있는 본원에 기재된 올리고뉴클레오티드 증폭 프라이머 세트를 사용하는 다중 증폭 반응으로, 증폭 효율을 표준화하기 위한 알려진 양의 본원에 기재된 주형 조성물이 부가된 샘플로부터의 DNA를 증폭시켜, 증폭 생성물을 수득하는 단계;

(B) (A)의 증폭 생성물을 정량적으로 서열분석하여 (i) 본원에 기재된 주형 조성물의 증폭 생성물이고 이들이 1개 이상의 바코드 올리고뉴클레오티드 서열을 함유하기 때문에 동정가능할 것인 주형 증폭 생성물, 및 (ii) 특이적 V 및 J 서열을 함유하지만 올리고뉴클레오티드 바코드 서열이 결여되어 있기 때문에 동정가능할 것인, 샘플 중의 재배열된 적응 면역 수용체 암호화 DNA 서열의 증폭 생성물을 정량화하는 단계;

(C) 단계 (B)에서 수득된 정량적 정보를 기반으로 증폭 인자를 계산하는 단계; 및

(D) (C)의 증폭 인자를 사용하여, 계산에 의해, 샘플 중 특유의 적응 면역 수용체 암호화 DNA 분자의 수를 측정하는 단계를 포함한다.

이론에 의해 얽매이는 것을 바라지 않으면서, 이들 및 관련 방법에 따르면, 다중 증폭 반응에서 샘플 추출되는 재배열된 TCR 또는 IG 암호화 DNA 분자의 수가 측정된다. 그렇게 하기 위해, 서열 커버리지 값, 예를 들어, 각각의 입력 (주형) 분자에 대해 측정되는 출력 서열 판독의 수를, 존재하는 상이한 주형 올리고뉴클레오티드의 전체 수에 걸쳐서 측정하고 평균을 내어, 평균 서열 커버리지 값을 수득한다. (i) 소정의 서열에 대해 수득되는 판독의 수를 (ii) 평균 서열 커버리지 값으로 나눔으로써, 증폭 반응의 개시에서 주형으로서 존재하는 재배열된 분자의 수를 계산할 수 있다.

따라서, 예를 들어, 서열 커버리지 값을 계산하기 위해, 현재 개시된 주형 조성물의 합성 분자의 세트의 알려진 양을 각각의 PCR 증폭에 부가하며, 합성 주형은 일반식 (I) 5' U-B1-V-B2-R-(B3)-J-B4-U 3'의 기본 구조를 갖고, 상기 식에서, 각각의 V는 TCR 또는 Ig V 유전자 서열에 매치하는 서열을 갖는 300개의 염기쌍 절편이고 J는 TCR 또는 IG J 유전자에 매치하는 서열을 갖는 100개의 염기쌍 절편이다. B2는 각각의 VJ 쌍을 특유하게 동정하고 또한 합성 DNA 주형의 증폭 생성물 (이는 바코드 서열을 함유할 것임)을 림프계 DNA 샘플에 의해 기여되는 자연 발생 생물학적 주형 DNA 분자의 증폭 생성물 (이는 바코드 서열이 결여될 것임)과 구별하는 특유의 바코드 올리고뉴클레오티드 서열이다. 이 예에서, 일반식 (I)의 B3은 부재한다. PCR 증폭 및 서열분석 후, 각각의 서열분석된 합성 분자의 수 (즉, 바코드 서열을 함유하는 증폭 생성물)를 센다. 그 다음 합성 분자의 서열 커버리지를 증폭 반응을 스파이킹하는데 사용되는 알려진 수의 출발 합성 주형 분자를 기반으로 계산한다.

예를 들어, 1100개의 특유의 합성 주형 올리고뉴클레오티드 서열 각각의 4-5개 카피를 포함하는 5000개의 합성, 바코드-함유 주형 분자의 풀 (모든 가능한 VJ 쌍을 나타냄)을 증폭 반응에 부가할 수 있다. 증폭 생성물이 합성 주형 분자에 매치하는 50,000개의 서열을 포함하는 경우, 10X의 서열 커버리지 값이 수득되며 증폭 인자는 10이다. 샘플로부터 수득된 DNA 중의 자연 VDJ-재배열된 주형 분자의 수를 추정하기 위해, 그 다음, 자연 주형의 증폭 생성물 (즉, 임의의 바코드 서열이 결여된 증폭 생성물)의 수를 증폭 인자로 나눈다. 정확도를 부가하기 위해, 이 예에서 5000개의 합성 분자는 모든 VJ 쌍을 나타내는 1100개 분자의 복합 풀이기 때문에, 모든 VJ 쌍에 대한 증폭 인자를 개별적으로 계산할 수 있다. 그 다음 증폭 인자를 합성 분자 모두에 걸쳐서 평균낼 수 있다.(도 8). 방법의 정확도 및 강인성을 도 9에 나타내었고 세부 사항은 실시예 5에서 하기에 기재하였다.

대안적 실시양태에서, 합성 주형 분자의 총 풀의 서브세트의 사용에서의 차이를 제외하고는 본 섹션에서 상기 및 하기에 기재된 것과 동일한 것을, 샘플에 대해 구별되는 주형 분자의 서브세트의 1개 이하의 카피가 샘플에 부가되는 방식으로 사용한다. 당업자에게 주지된 푸아송(Poisson) 통계 방법의 적용을 사용하여 풀의 공지된 특성 (예를 들어, 구별되는 서열의 총수 및 주형 분자의 농도)을 기반으로 부가하는 주형의 양을 결정한다. 예를 들어, 평균하여 풀에 존재하는 주형 분자의 서브세트 각각의 1개 이하의 카피가 존재하도록 200-500개의 주형 분자를 증폭 반응에 부가한다.

따라서, 이들 실시양태에서 방법은, (A) (1) 대상체의 림프계 세포를 포함하는 생물학적 샘플로부터의 DNA, (2) 특유의 올리고뉴클레오티드 서열을 갖는 복수개의 주형 올리고뉴클레오티드 각각의 알려진 수가 존재하는 청구항 1의 주형 조성물; (3) 생물학적 샘플로부터의 하나의 또는 복수개의 적응 면역 수용체를 암호화하는 재배열된 DNA를 증폭시킬 수 있는 올리고뉴클레오티드 증폭 프라이머 세트를 포함하는 다중 중합효소 연쇄 반응 (PCR)으로 DNA를 증폭시키는 것 [여기서 프라이머 세트는 (a) 실질적으로 등몰량으로, 각각 독립적으로 적응 면역 수용체 V-영역 폴리펩티드를 암호화하는 1개 이상의 폴리뉴클레오티드에 또는 그의 보체에 특이적으로 혼성화될 수 있는 복수개의 V-절편 올리고뉴클레오티드 프라이머 (여기서 각각의 V-절편 프라이머는 1개 이상의 기능성 적응 면역 수용체 V 영역-암호화 유전자 절편에 상보적인 15개 이상의 인접 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 여기서 복수개의 V-절편 프라이머는 주형 조성물에 존재하는 실질적으로 모든 기능성 적응 면역 수용체 V 영역-암호화 유전자 절편에 특이적으로 혼성화된다), 및 (b) 실질적으로 등몰량으로, 각각 독립적으로 적응 면역 수용체 J-영역 폴리펩티드를 암호화하는 1개 이상의 폴리뉴클레오티드에 또는 그의 보체에 특이적으로 혼성화될 수 있는 복수개의 J-절편 올리고뉴클레오티드 프라이머 (여기서 각각의 J-절편 프라이머는 1개 이상의 기능성 적응 면역 수용체 J 영역-암호화 유전자 절편에 상보적인 15개 이상의인접 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 여기서 복수개의 J-절편 프라이머는 주형 조성물에 존재하는 실질적으로 모든 기능성 적응 면역 수용체 J 영역-암호화 유전자 절편에 특이적으로 혼성화된다)를 포함하고, 여기서 V-절편 및 J-절편 올리고뉴클레오티드 프라이머는 상기 다중 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에서 (i) 다수의 증폭된 주형 DNA 분자를 생성하기 위해 주형 조성물 중 실질적으로 모든 주형 올리고뉴클레오티드 (상기 다수의 증폭된 주형 DNA 분자는 주형 조성물 중 주형 올리고뉴클레오티드의 다양성을 정량화하기에 충분하다), 및 (ii) 다수의 증폭된 재배열된 DNA 분자를 생성하기 위해 생물학적 샘플에서의 적응 면역 수용체를 암호화하는 실질적으로 모든 재배열된 DNA 분자 (상기 다수의 증폭된 재배열된 DNA 분자는 생물학적 샘플로부터의 DNA 중 재배열된 DNA 분자의 다양성을 정량화하기에 충분하다)의 증폭을 촉진시킬 수 있고, 여기서 다수의 증폭된 주형 DNA 분자 및 다수의 증폭된 재배열된 DNA 분자에서 각각의 증폭된 DNA 분자는 길이가 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100, 90, 80 또는 70개 미만의 뉴클레오티드이다];

(B) 상기 증폭된 주형 DNA 분자 각각 및 상기 증폭된 재배열된 DNA 분자 각각 모두 또는 충분 분량을 정량적으로 서열분석하여 (i) 1개 이상의 올리고뉴클레오티드 바코드 서열을 함유하는 증폭된 주형 DNA 분자의 주형 생성물 수, 및 (ii) 올리고뉴클레오티드 바코드 서열이 결여된 증폭된 재배열된 DNA 분자의 재배열된 생성물 수를 정량화하는 것;

(C) (B)(i)의 주형 생성물 수를 (A)(2)의 특유의 올리고뉴클레오티드 서열을 갖는 복수개의 주형 올리고뉴클레오티드 각각의 알려진 수로 나누어 증폭 인자를 계산하는 것; 및

(D) (B)(ii)의 재배열된 생성물 수를 (C)에서 계산된 증폭 인자로 나누어 샘플 중의 특유의 적응 면역 수용체 암호화 DNA 분자를 정량화하는 것을 포함한다.

고려된 실시양태가 상기 기재된 방법으로 제한되는 것으로 의도되지 않으므로, 본 개시내용으로부터 당업자는 이용할 수 있는 변형을 알 것이다. 대안적 접근법은, 예를 들어, 재배열된 림프계 세포 TCR 및/또는 IG 암호화 DNA뿐만 아니라 재배열되지 않은 DNA도 함유하는 DNA 샘플의 다중 PCR 증폭으로 스파이크트-인(spiked-in) 대조 주형으로서 본원에 기재된 합성 주형 조성물을 사용할 수 없다. 대신에, 한 이러한 대안에 따르면, V 및 J 증폭 프라이머를 사용하는 증폭 반응에 구별되는 고도로 보존된 게놈 서열 영역을 증폭시키는 올리고뉴클레오티드 증폭 프라이머의 공지된 세트를 부가할 수 있다. 이들 게놈 대조군 프라이머는 DNA 샘플이 재배열된 TCR 및/또는 IG 암호화 서열을 함유하는지 여부와 상관없이 DNA 샘플에 존재하는 모든 게놈을 증폭시킬 수 있으며, 반면 V 및 J 프라이머는 재배열된 VDJ 영역을 갖는 게놈으로부터만 생성물을 증폭시킬 수 있다. 이들 두 부류의 증폭 생성물 분자 간의 비로 인해 샘플 중의 B 세포 게놈의 총수의 추정이 가능하게 된다.

달리 구체적으로 명시되지 않는 한, 본 발명의 특정 실시양태의 관행은, 본 기술분야, 및 예증을 목적으로 하기에 언급된 몇가지 내에 있는, 미생물학, 분자 생물학, 생화학, 분자 유전학, 세포 생물학, 바이러스학 및 면역 기법에서의 종래의 방법을 이용할 것이다. 이러한 기법은 문헌에 충분히 설명되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3^rd Edition, 2001)]; [Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2^nd Edition, 1989)]; [Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982)]; [Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, updated July 2008)]; [Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience]; [Glover, DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (IRL Press, Oxford Univ. Press USA, 1985)]; [Current Protocols in Immunology (Edited by: John E. Coligan, Ada M. Kruisbeek, David H. Margulies, Ethan M. Shevach, Warren Strober 2001 John Wiley & Sons, NY, NY)]; [Real-Time PCR: Current Technology and Applications, Edited by Julie Logan, Kirstin Edwards and Nick Saunders, 2009, Caister Academic Press, Norfolk, UK]; [Anand, Techniques for the Analysis of Complex Genomes, (Academic Press, New York, 1992)]; [Guthrie and Fink, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology (Academic Press, New York, 1991)]; [Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, Ed., 1984)]; [Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, Eds., 1985)]; [Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, Eds., 1984)]; [Animal Cell Culture (R. Freshney, Ed., 1986)]; [Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984)]; [Next-Generation Genome Sequencing (Janitz, 2008 Wiley-VCH)]; [PCR Protocols (Methods in Molecular Biology) (Park, Ed., 3^rd Edition, 2010 Humana Press)]; [Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986)]; [the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.)]; [Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory)]; [Harlow and Lane, Antibodies, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1998)]; [Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987)]; [Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir and CC Blackwell, eds., 1986)]; [Riott, Essential Immunology, 6th Edition, (Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1988)]; [Embryonic Stem Cells: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology) (Kurstad Turksen, Ed., 2002)]; [Embryonic Stem Cell Protocols: Volume I: Isolation and Characterization (Methods in Molecular Biology) (Kurstad Turksen, Ed., 2006)]; [Embryonic Stem Cell Protocols: Volume II: Differentiation Models (Methods in Molecular Biology) (Kurstad Turksen, Ed., 2006)]; [Human Embryonic Stem Cell Protocols (Methods in Molecular Biology) (Kursad Turksen Ed., 2006)]; [Mesenchymal Stem Cells: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology) (Darwin J. Prockop, Donald G. Phinney, and Bruce A. Bunnell Eds., 2008)]; [Hematopoietic Stem Cell Protocols (Methods in Molecular Medicine) (Christopher A. Klug, and Craig T. Jordan Eds., 2001)]; [Hematopoietic Stem Cell Protocols (Methods in Molecular Biology) (Kevin D. Bunting Ed., 2008) Neural Stem Cells: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology) (Leslie P. Weiner Ed., 2008)] 참조.

구체적 정의가 제공되지 않는 한, 본원에 기재된 분자 생물학, 분석 화학, 합성 유기 화학, 및 의약품 및 제약 화학과 관련하여, 및 그의 실험실 절차 및 기법에서 이용된 명명법은 본 기술분야에 주지되고 통상 사용되는 것이다. 표준 기법을 재조합 기술, 분자 생물학, 미생물학, 화학 합성, 화학 분석, 제약 제제, 제형, 및 전달, 및 환자의 치료에 사용할 수 있다.

문맥상 달리 필요로 하지 않는 한, 본 명세서 및 특허청구범위에 걸쳐서, 어휘 "포함하다" 및 이의 변형, 예컨대, "포함하다" 및 "포함하는"은 개방, 포괄적 의미, 즉 "을 포함하지만, 이에 제한되지 않는"으로서 이해되어야 한다. "로 이루어진"은 무엇이 후속되든, 어구 "로 이루어진"을 포함하고 그에 전형적으로 제한되는 것을 의미한다. "로 본질적으로 이루어진"은 문구 뒤에 열거된 임의의 요소를 포함하며, 열거된 요소에 관한 개시내용에서 특정된 활성 또는 작용에 지장을 주거나 그의 한 원인이 되지 않는 다른 요소에 제한되는 것을 의미한다. 따라서, 문구 "로 본질적으로 이루어진"은 열거된 요소가 필요하거나 필수적이지만, 열거된 요소의 활성 또는 작용에 어떤 영향을 미치는지 여부에 따라 어떤 다른 요소도 필요하지 않고 존재할 수 있거나 존재할 수 없는 것을 나타낸다.

본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에서, 단수 형태는 내용이 달리 명백하게 지시되지 않는 한 복수 언급대상을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 특정의 실시양태에서, 용어 "약" 또는 "대략"은 수치에 선행하는 경우 5%, 6%, 7%, 8% 또는 9%의 범위의 안팎의 값을 나타낸다. 다른 실시양태에서, 용어 "약" 또는 "대략"은 수치에 선행하는 경우 10%, 11%, 12%, 13% 또는 14%의 범위의 안팎의 값을 나타낸다. 또 다른 실시양태에서, 용어 "약" 또는 "대략"은 수치에 선행하는 경우 15%, 16%, 17%, 18%, 19% 또는 20%의 범위의 안팎의 값을 나타낸다.

본 명세서에 걸쳐서 "한 실시양태" 또는 "실시양태" 또는 "측면"에 대한 언급은 실시양태와 관련하여 기재된 특정의 특질, 구조 또는 특징이 본 발명의 하나 이상의 실시양태에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서에 걸쳐서 다양한 곳에서의 문구 "한 실시양태에서" 또는 "실시양태에서"의 출현이 반드시 모두 동일 실시양태를 언급하는 것은 아니다. 더욱이, 특정의 특질, 구조, 또는 특징이 하나 이상의 실시양태에서 임의의 적합한 방식으로 조합될 수 있다.

실시예

실시예 1: 증폭 프라이머 바이어스 제어를 교정하기 위한 주형 올리고뉴클레오티드의 설계

본 실시예 및 하기 실시예에서, 예를 들어, 문헌 [Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3^rd Edition, 2001)]; [Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2^nd Edition, 1989)]; [Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982)]; [Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, updated July 2008)]; [Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience; Glover, DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (IRL Press, Oxford Univ. Press USA, 1985)]; [Anand, Techniques for the Analysis of Complex Genomes, (Academic Press, New York, 1992)]; [Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, Ed., 1984)]; [Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, Eds., 1985)]; [Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, Eds., 1984)]; [Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984)]; [Next-Generation Genome Sequencing (Janitz, 2008 Wiley-VCH)]; [PCR Protocols (Methods in Molecular Biology) (Park, Ed., 3^rd Edition, 2010 Humana Press)]에 기재된 기법을 포함한, 표준 분자 생물학 및 생화학 물질 및 방법론을 이용하였다.

이중 가닥 DNA (dsDNA) 주형 올리고뉴클레오티드의 세트를 특정된 적응 면역 수용체 (TCR 또는 BCR) 유전자자리에서 모든 가능한 V/J 조합을 모의한 대조군 주형으로서 사용하기 위한 교정 표준으로서 설계하였다. 각각의 인간 TCR 및 BCR 유전자자리에 대해, RSS의 공지된 게놈 V 절편 서열 5'의 목록, 및 RSS의 공지된 게놈 J 절편 3'의 목록을 컴파일링하였다. dsDNA 주형의 암호화 가닥 서열을 5'에서 3' 배향이 좌에서 우로 판독되는 관행에 따라, 여기서 해석의 용이함을 위해 제시한다.

주형 올리고뉴클레오티드의 일반 구조의 개략도를 도 1에 나타냈다. 다중 맥락으로 각각의 특유의 주형 올리고뉴클레오티드의 동일성의 상호 검증에서 사용하기 위해, 상이한 16 bp 바코드 올리고뉴클레오티드 (B)를 바코드의 최초 8 bp 내에 주형의 V 절편 폴리뉴클레오티드를 그리고 바코드의 제2의 8 bp 내에 J절편을 특유하게 동정한 각각의 주형에 편입하였다. 이러한 바코드의 카피를 3회 편입하였다: 표준 일루미나 또는 이온(Ion) 프라이머를 사용한 짧은 단일-말단 판독이 각각의 주형 올리고뉴클레오티드에서 V와 J 서열의 특유의 조합의 동일성을 나타낼 수 있도록, 외부 어댑터 (U2)와 J 절편 서열 (J) 사이에 (B3), 표준 서열분석 전략 (예를 들어, 일루미나 GA-2 또는 HiSeq™ 또는 MiSEQ®)이 각각의 주형 올리고뉴클레오티드에서 V와 J 서열의 특유의 조합을 포획할, V와 J 절편 사이에 (B2), 및 짧은 쌍체-말단 판독이 원하는 경우 각각의 주형 올리고뉴클레오티드에서 V와 J 서열의 특유의 조합의 동일성을 확인할 수 있도록, V 절편과 다른 외부 어댑터 (U1) 사이에 (B3).

도 1에 나타낸 바와 같이, 주형 올리고뉴클레오티드 서열은 분자의 말단에서 서열분석 플랫폼-특이적 짧은 올리고뉴클레오티드 서열을 편입할 수 있는 어댑터 서열 (U1)로 개시되었다. 본 실시예에서 일루미나 넥스테라(Nextera)™ 어댑터를 사용하였지만, 본질적으로 강인한 PCR 프라이머의 임의의 쌍이 동등하게 잘 작용할 것이라는 점을 주목하여야 한다. 예시적 어댑터로서, 올리고뉴클레오티드 서열 GCCTTGCCAGCCCGCTCAG [서열 번호:1746]을 U1의 V 절편 말단에 부착하여 (도 1), 단일 또는 쌍체 말단 일루미나 서열분석 플로우셀(flowcell)과 적합성인, 표준 일루미나 올리고뉴클레오티드 상에 부가하는 넥스테라™ 일루미나 어댑터 (일루미나 인코포레이티드, 캘리포니아주 샌 디에이고) (CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTGCCTTGCCAGCCCGCTCAG) [서열 번호:1747]와의 적합성을 유지하도록 하였다.

(3' 에서) U1로의 바로(immediately) 하류는 바코드 올리고뉴클레오티드 ACACACGTGACACTCT [서열 번호:1748]의 최초 카피 (B1)이었다. 그 다음, V 절편 서열의 고정 길이를 주형 올리고뉴클레오티드에 편입하였고, 여기서 주형 세트에서의 모든 주형은 자연 RSS 전에 소정의 수의 염기로 종료되어, V 절편에서 결실된 고정된 수의 염기를 갖는 자연 TCR 또는 BCR 유전자 재배열을 모방하도록 하였다. 본 실시예에서 제로(zero) 염기를 RSS 전에 초기에 결실시켰다. 이들 서열의 인식 가능성을 최대화하기 위해, 그 다음 모든 V 절편 폴리뉴클레오티드 서열을 트리밍하여 RSS에 인접한 부분 코돈을 제거하여, 잔존 V 절편 서열은 개시 코돈으로 프레임이 완성되도록 하였다. 다양한 V 절편 서열은 서열 목록에 제시된 예시적 주형 올리고뉴클레오티드 세트에 나타낸 것이었고 (예를 들어, 서열 번호:1-871에서 TCRB 주형 올리고뉴클레오티드 세트의 일반식 (I) 서열 내에 TCRB V 절편의 세트; 서열 번호:872-1560에서 TCRB 주형 올리고뉴클레오티드 세트의 일반식 (I) 서열 내에 TCRB V 절편의 구별되는 세트; 서열 번호:1561-1630에서 TCRG 주형 올리고뉴클레오티드 세트의 일반식 (I) 서열 내에 TCRG V 절편의 세트); 단일 예시적 V 폴리뉴클레오티드는 다음과 같았다:

TCTTATTTTCATAGGCTCCATGGATACTGGAATTACCCAGACACCAAAATACCTGGTCACAGCAATGGGGAGTAAAAGGACAATGAAACGTGAGCATCTGGGACATGATTCTATGTATTGGTACAGACAGAAAGCTAAGAAATCCCTGGAGTTCATGTTTTACTACAACTGTAAGGAATTCATTGAAAACAAGACTGTGCCAAATCACTTCACACCTGAATGCCCTGACAGCTCTCGCTTATACCTTCATGTGGTCGCACTGCAGCAAGAAGACTCAGCTGCGTATCTCTGCACCAGCAG [서열 번호:1749].

정지 코돈 TGA를 각각의 주형 올리고뉴클레오티드에서 V 폴리뉴클레오티드 서열의 3' 말단에서 프레임내(in-frame) 편입하여, 주형 올리고뉴클레오티드 서열이 생물학적 샘플을 오염시키는 경우에 반드시 관련되는 것으로 고려되지 않도록 하였다. NDN이 정상적일 경우 V 절편과 J 절편 사이에 정지 코돈으로부터의 하류에, V/J 동정자 바코드 서열 B2 (서열 번호:1748)의 제2 카피를 삽입하였다. 그 다음 Sal1 제한 효소 인식 부위 (R) 서열 GTCGAC를 편입하였고; 이 서열을 TCRB V 또는 J 절편 게놈 서열 중 어느 것에나 자연적으로 존재하지 않은 서열을 기준으로 선택하였고, 이는 원하는 경우 합성 주형을 특이적으로 파괴하거나, 합성 서열을 동정하는 정보 마커로서 사용하기 위한 능력을 부여하였다. 주형의 이러한 버전에서 B3 부위는 비어 있다.

J 폴리뉴클레오티드 (J)를 J 유전자 절편으로부터 서열의 고정된 길이로서 편입하였고, 자연 재배열을 모방하는 자연 RSS 후 고정된 수의 염기로부터 측정하였고, 본 실시예에서 J-C 인트론으로 연장되었다. 본 실시예에서 제로 염기는 J 절편으로부터 결실된 염기이지만, 다른 주형 올리고뉴클레오티드 설계에서 5 bp의 결실을 사용하여 자연 범위에서 전체 J 절편 길이를 유지하면서 V-J 결합부에서 VJ 바코드 (B2)에 대한 공간을 만들었다. 예시적 J 폴리뉴클레오티드는

ACTGAAGCTTTCTTTGGACAAGGCACCAGACTCACAGTTGTAGGTAAGACATTTTTCAGGTTCTTTTGCAGATCCGTCACAGGGAAAAGTGGGTCCACAG [서열 번호:1750]이었다.

J 절편 폴리뉴클레오티드로부터의 하류에 V/J 바코드 동정자 올리고뉴클레오티드 (서열 번호:1748)의 제3 카피 (B4)가 있었다. 예시적 주형 올리고뉴클레오티드 서열 분자의 말단에서 플랫폼-특이적 서열을 편입할 수 있는 제2 어댑터 서열 (U2)로 종료된 서열. 상기에서 언급된 바와 같이,넥스테라™-적합성 어댑터 (CTGATGGCGCGAGGGAGGC) [서열 번호:1751]를, 단일 또는 쌍체 말단 플로우셀과 적합성인, 표준 일루미나 서열분석 올리고뉴클레오티드 상에 부가를 허용하는, 넥스테라™ 일루미나 어댑터 (AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGCCTCCCTCGCGCCATCAG) [서열 번호:1752]와 함께 사용하기 위해, U2의 J 절편 말단 상에서 사용하였다.

본 개시내용에 따른 예시적 TCRB 및 TCRG 주형 올리고뉴클레오티드 세트가 제조되었고 서열 번호:1-1630에 명기된 뉴클레오티드 서열을 가졌다. 서열 번호:1-871 및 1561-1630에 명기된 서열을 갖는 주형 올리고뉴클레오티드 세트를 gBlocks™ 유전자 분절(Gene Fragments) 화학을 사용하여 인테그레이티드 DNA 테크놀로지즈 인코퍼레이티드(Integrated DNA Technologies, Inc.) (아이오와주 코럴빌)에 의해 본원에 개시된 서열 설계 정보를 기반으로 주문 합성하였다. 서열 번호:872-1560에 명기된 서열을 갖는 주형 올리고뉴클레오티드의 세트는 실시예 2에 기재된 PCR 타일링(tiling) 접근법에 의해 생성시켰다.

TCRB 주형 올리고뉴클레오티드 (서열 번호:1-871). 일반식 (I) (여기서 B3은 부재)의 871개의 주형 올리고뉴클레오티드의 세트를 인간 TCRB V 및 J 폴리뉴클레오티드 서열을 사용하여 설계하였다:

5'-U1-B1-V-B2-R-(B3)-J-B4-U2-3' (I).

각각의 주형 올리고뉴클레오티드는 495개의 염기쌍 DNA 분자로 이루어졌다. 센스 가닥 서열은 서열 번호:1-871로서 제시되어 있다.

이러한 주형 세트의 설계를 도시하는 개략도를 도 1에 나타냈다. 관례상, 다이어그램은 5'-에서'3' (좌에서 우) 방향으로 올리고뉴클레오티드 설계를 도시한다. "V 절편"은 적응 면역 수용체 가변 (V) 영역 암호화 유전자 서열, 또는 그의 보체를 나타낸다. "J 절편"은 적응 면역 수용체 결합 (J) 영역 암호화 유전자 서열, 또는 그의 보체를 나타낸다. U1 및 U2는 각각 제1 및 제2 범용 어댑터 올리고뉴클레오티드 서열을 나타내고, 이는 임의로 각각 제1 및 제2 범용 어댑터 올리고뉴클레오티드 서열에 연결되고 5'에 위치된 제1 및 제2 서열분석 플랫폼-특이적 올리고뉴클레오티드 서열을 추가로 포함할 수 있다. B1, B2 및 B4는 각각이, 쌍체 조합으로서, (i) 특유의 V 절편 서열, 및 (ii) 특유의 J 절편 서열을 특유하게 동정하는 특유의 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 바코드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 바코드 서열을 나타내며; 본 실시예에서, B3은 부재하였다.

S는 V의 3' 말단에서 프레임내 또는 프레임외일 수 있는 임의적 정지 코돈을 나타낸다. R은 임의적 제한 효소 인식 부위를 나타낸다. 서열 번호:1-871에서 U1 및 U2 어댑터는 상기 기재된 바와 같이 19-량체를 포함하였고 (각각 서열 번호:1746 및 1751), 모든 (V+J)-동정 바코드 (B) 서열 (B1, B2, B4)은 길이가 16개 뉴클레오티드이었고; 정지 코돈 TGA 및 Sal1 제한 효소 인식 부위 (GTCGAC)가 포함되었다.

TCRB 주형 올리고뉴클레오티드 (서열 번호:872-1560). 689개의 주형 올리고뉴클레오티드의 제2 세트를 설계하였고, 여기서 일반식 (I)에 따라서, V 및 J는 각각 인간 TCRB V 및 J 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하였고, U1 및 U2는 독립적으로 구별되는 제한 효소 인식 부위 (R1 및 R3)를 포함하였고, B1, B3, 및 B4는 독립적으로 부재하여, 일반식 (II)에 이르렀다:

R1-V-B2-R2-J-R3 (II)

상기 식에서, B2는 8-뉴클레오티드 바코드 동정자이었고 (예를 들어, 표 7에 명기된 바와 같은 바코드 서열); R1, R2 및 R3은 각각 제한 효소 인식 부위 EcoR1 (GAATTC), Sal1 (GTCGAC) 및 Sph1 (GCATGC)이었고; V 및 J는 각각 본원에 기재된 바와 같은 V 영역 및 J 영역 폴리뉴클레오티드이었다. 각각의 주형 올리고뉴클레오티드는 239개의 염기쌍 DNA 분자로 이루어졌다. 센스 가닥 서열은 서열 번호:872-1560로서 제시되어 있다.

TCRG 주형 올리고뉴클레오티드 (서열 번호:1561-1630). 일반식 (I)의 70개의 주형 올리고뉴클레오티드의 제3 세트를 인간 TCRG V 및 J 폴리뉴클레오티드 서열을 사용하여 설계하였다. 각각의 주형 올리고뉴클레오티드는 495개의 염기쌍 DNA 분자로 이루어졌다. 센스 가닥 서열은 서열 번호:1561-1630으로서 제시되어 있다. TCRG 주형의 70-올리고뉴클레오티드 세트의 세부 사항 (서열 번호:1561-1630)은 대표적이며 다음과 같았다:

이전에 결정된 게놈 서열을 기반으로 인간 TCRG 유전자자리는 각각이 RSS 서열을 갖고 따라서 재배열-적격(rearrangement-competent)으로서 간주되는 14개의 Vγ 절편을 함유하는 것으로 확인되었다. 이들 14 Vγ 절편은 발현되는 것으로 알려진 6개의 유전자 절편, 개방 판독 프레임을 갖는 것으로 분류된 3개의 V 절편, 및 5개의 V 위유전자를 포함하였다. Vγ 유전자 절편을 5개의 Jγ 유전자 절편에 연결시켰다. 14개의 V 및 5개의 J 절편에 대해 모든 가능한 V+J 유전자 조합을 포함시키기 위해, 모든 가능한 VJ 조합을 나타내는 70 (5 x 14)개의 주형을 설계하였다. 각각의 주형은 일반식 (I) (5'-U1-B1-V-B2-R-(B3)-J-B4-U2-3')(도 1)에 합치되었고 따라서 9개의 섹션, 19개의 염기쌍 (bp) 범용 어댑터 (U1), V 유전자 및 J 유전자 절편의 각각의 쌍체 조합을 특유하게 동정하는 16 bp 뉴클레오티드 태그 (B1), 300 bp의 V 유전자 특이적 서열 (V), 3 bp 정지 코돈 (S), 16 bp 뉴클레오티드 태그의 또 다른 카피 (B2), 모든 분자에 의해 공유된 6 bp 결합 태그 (R), B3은 부재, 100 bp의 J 유전자 특이적 서열 (J), 16 bp 뉴클레오티드 태그의 제3 카피 (B4), 및 19 bp 범용 어댑터 서열 (U2)을 포함하였다.

70개의 주형 (서열 번호:1561-1630) 각각을 범용 어댑터 서열 (U1, U2)에 어닐링되도록 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머 (표 4; 서열 번호:1732-1745)를 사용하여 개별적으로 증폭시켰다.

[표 4]

각각의 증폭된 주형 올리고뉴클레오티드 생성물의 생성 농도를 제조업자의 사용 설명서에 따라 LabChip GX™ 모세관 전기영동 시스템 (캘리퍼 라이프 사이언시즈 인코포레이티드(Caliper Life Sciences, Inc.), 매사추세츠주 홉킨턴)을 사용하여 정량화하였다. 서열 분석 바코드 B1에 의해 측정된 바와 같은, 70개의 가능한 V-J 조합 각각의 발생 빈도를 표 5에 나타냈다. 70개의 증폭된 주형 올리고뉴클레오티드 제제를 표준 농도로 정규화한 다음, 모았다.

모든 70개의 주형 올리고뉴클레오티드가 실질적으로 등몰 농도로 존재하는 것을 검증하기 위해, 제조업자의 권고에 따라 일루미나 HiSeq™ 서열분석 플랫폼을 사용하여 풀을 서열분석하였다. 간략하게, 플랫폼-특이적 올리고뉴클레오티드 서열을 모아진 주형 올리고뉴클레오티드에 편입하기 위해, 범용 프라이밍 부위 (U1, U2)에 어닐링되고 5' 말단으로서 일루미나 넥스테라™ 어댑터 서열 테일을 갖는 테일드 프라이머를 설계하였다. 그 다음 7-사이클 PCR 반응을 수행하여 일루미나 어댑터를 주형 올리고뉴클레오티드에 어닐링하였다. 그 다음 제조업자에 의해 권장된 조건하에 아젠코트(Agencourt)® AMPure® XP 비드 (베크만 코울터 인코포레이티드(Beckman Coulter, Inc.), 캘리포니아주 플러턴)를 사용하여 PCR 반응 생성물 혼합물을 정제하였다. PCR 반응 생성물의 최초 60 bp를 일루미나 HiSEQ™ 서열분석기 (일루미나 인코퍼레이티드, 캘리포니아주 샌 디에이고)를 사용하여 서열분석하고 각각의 16 bp 분자 바코드 태그 (B1)의 빈도를 평가함으로써 분석하였다.

70개의 구별되는 주형 올리고뉴클레오티드 세트에 대한 실질적으로 등몰 제제를 세트의 각각의 구성원 대략 1.4%를 함유하도록 계산하였고, 모든 종에 대해 10배 빈도 안팎의 역치 내성 (0.14-14%)을 목적으로 하였다. 정량적 서열분석에 의하면 초기 풀 내에 어댑터-변형된 주형 올리고뉴클레오티드의 70개의 종이 균등하게 표시되지 않은 것으로 나타났다.

따라서, 각각의 분자가 역치 내성 농도 (0.14-14%) 내에 존재할 때까지 개별 주형 올리고뉴클레오티드의 농도의 조정 및 정량적 서열분석 단계의 반복을 수행한다.

[표 5]

실시예 2: TCRB V 유전자 증폭 바이어스의 검출

본 실시예는 인간 TCRB 서열을 증폭시킬 수 있었던 올리고뉴클레오티드 프라이머의 세트에서 모든 가능한 V-J 조합에 대해 혼성화 표적을 함유하는 주형 세트를 생성시키기 위해 각각 50-90개 뉴클레오티드의 4개의 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 함께 타일링함으로써 689개의 일반식 (I)의 인간 TCRB 주형 올리고뉴클레오티드의 세트를 어셈블링하는 방법을 기재한다. 그 다음 주형 올리고뉴클레오티드의 세트를 사용하여 TCRB V 및 J 증폭 프라이머의 세트의 상대 증폭 효율을 특성화하였다.

인간 TCRB 쇄에 대한 모든 가능한 생산적으로 재배열된 V 및 J 조합을 나타내는 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 TCRB 689개의 주형 올리고뉴클레오티드의 세트를 표준 PCR 반응에서 4개의 단일 가닥 DNA 프라이머를 함께 "타일링"함으로써 합성하였다. 간략하게, 각각의 TCRB V 유전자 절편에 대해 2개의 90 bp 분절 ("정방향" 배향으로 하나 및 "역방향"으로 다른 하나)을 설계하고, 각각의 TCRB J 유전자 절편에 대해 1개의 90 bp 분절 ("역방향" 배향)을 설계하고, 50 bp (정방향) 링커 분자를 설계하여 V 및 J 유전자 분절을 함께 연결하였다. 전체로서, 52개의 V 정방향 및 52개의 V 역방향, 13개의 J 역방향, 및 689개의 링커 분자가 설계되었다. V 유전자 절편 각각에 상응하는 2개의 90 bp 분절 (1개의 정방향, 1개의 역방향)은 39 bp의 상보적 중첩 서열을 가졌다. 각각의 V 역방향 분절의 한쪽 말단은 50 bp 링커 분자와 중첩되는 25 bp의 상보적 서열을 가졌다. 링커 분자 각각에서 잔류 25 bp는 J 분자의 한쪽 말단과 상보적으로 중첩되는 서열이었다. 상보적 서열이 서로 어닐링되고 이중 가닥 DNA를 형성하고 여기에 Taq 중합효소가 결합하고 효소적으로 분자를 연장시킬 수 있도록 분자를 설계하였다.

타일링된 분자를 어셈블링하는 각각의 PCR 반응은 퀴아젠 (QIAGEN) 멀티플렉스(Multiplex) PCR 마스터 믹스 (퀴아젠 부품 번호 206145, 퀴아젠, 캘리포니아주 발렌시아), 10% Q- 용액 (퀴아젠), 및 4개의 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열 (상기 기재된 바와 같은, 2개의 TCRB V, 1개의 TCRB J 및 1개의 링커)을 사용하였다. 2개의 외부 분자 (1개의 V 정방향 및 1개의 J 역방향)를 각각 1 μM의 최종 농도에서 부가하였으며, 한편 2개의 내부 분자 (1개의 V 역방향 및 정방향 링커)를 각각 0.01 μM의 최종 농도에서 부가하였다. 열사이클러 조건은 95℃에서 15분 동안, 이어서 94℃에서 30초 동안, 59℃에서 30초 동안, 및 72℃에서 1분 동안 35회 사이클, 이어서 72℃에서 10분 동안 1회 사이클이었다. 합성 후, 제조업자의 사용 설명서에 따라 LabChip GX™ 모세관 전기영동 시스템 (캘리퍼 라이프 사이언시즈 인코포레이티드, 매사추세츠주 홉킨턴)에 의해 분자를 정량화하고 각각의 생성 밴드의 농도 (ng/μl로)를 캘리퍼 LabChip GX 소프트웨어를 사용하여 계산하였다.

689개 TCRB 주형 올리고뉴클레오티드의 생성 세트에 대한 뉴클레오티드 서열은 서열 번호:872-1560에 명기되어 있다. 서열 번호:872-1560에서, 각각의 구별되는 V 영역 서열은, 표 7에 나타낸 바와 같이, 8개의 뉴클레오티드의 특유의 바코드 서열에 의해 동정되었다. 모든 689개의 주형을 25 ng/μl의 표준 농도로 정규화한 다음, 모았다. 생성된 풀을 본원에 기재된 TCRB 검정에 사용하여 689-주형 올리고뉴클레오티드 세트 (서열 번호:872-1560)의 증폭 동안 TCRB 증폭 프라이머의 바이어스된 (불균일) 이용을 검출하였다.

689개의 주형 각각은 실험상 가능한 한 등몰 농도에 근접하게 주형 올리고뉴클레오티드 풀에 존재하였고, 일루미나 어댑터-적합성 서열을 포함하는 52개의 TCRB V 영역 프라이머 (서열 번호:1753-1804, 표 6)의 등몰 혼합물 및 13개의 TCRB J 영역 프라이머 (서열 번호:1631-1643, 표 1)의 등몰 믹스를 사용하는 TCRB 증폭 PCR 반응의 주형으로서 풀을 사용하였다. 표 1 (서열 번호:1631-1695)에 나타낸 바와 같은 52개 TCRB VβF (정방향) 프라이머의 등몰 풀 ("VF 풀") 및 13개 TCRB JβR (역방향) 프라이머의 등몰 풀 ("JR 풀")을 사용하여 689개의 주형의 풀의 구성원을 증폭시켰다. 중합효소 연쇄 반응 (PCR) (50 μL 각각)을 1.0 μM VF 풀 (각각의 특유의 TCRB VβF 프라이머에 대해 22 nM), 1.0 μM JR 풀 (각각의 특유의 TCRB JβR 프라이머에 대해 77 nM), 1 μM 퀴아젠 멀티플렉스 PCR 마스터 믹스 (퀴아젠 부품 번호 206145, 퀴아젠 코퍼레이션(Qiagen Corp.), 캘리포니아주 발렌시아), 10% Q-용액 (퀴아젠), 및 16 ng/μL 게놈 DNA (gDNA)에서 설정하였다. C 100 열 사이클러 (바이오-래드 라보라토리즈(Bio-Rad Laboratories), 미국 캘리포니아주 헬큘리즈)에서 하기 열 사이클 조건을 사용하였다: 95℃에서 15분 동안 1회 사이클, 94℃에서 30초 동안, 59℃에서 30초 동안 및 72℃에서 1분 동안 25 내지 40회 사이클, 이어서 72℃에서10분 동안 1회 사이클. 수백만의 재배열된 TCRβ CDR3 유전자자리를 샘플 추출하기 위해, 12 내지 20개 웰의 PCR을 각각의 라이브러리에 대해 수행하였다. 상기에서 언급된 바와 같이, V 및 J 프라이머는 서열분석을 위한 일루미나 어댑터에 부합하고 적합성인 테일을 포함하였다.

증폭 생성물을 일루미나 HiSeq™ 서열분석기 상에서 정량적으로 서열분석하였다. 각각의 생성물 분자의 60-염기쌍 영역을 J 분자로부터 개시하는 표준 J 서열분석 프라이머 (표 3)를 사용하여 서열분석하였다. 반응 생성물 중의 각각의 TCRB 서열의 발생 빈도를 표 2에 나타냈고, 그로부터 모든 TCRB 서열이 필적하는 정도로 증폭된 것은 아니라는 것이 명백하였다.

[표 6]

[표 7]

상기 기재된 바와 같이, 수득된 데이터를 사용하여 도 2를 생성시켜, 교차 증폭 능력 (프라이머가 어닐링 서열 상보성을 기반으로 특이적으로 설계된 것이 아닌 V 유전자 절편을 증폭시키는 능력)을 특이적 V 유전자 절편에 어닐링되도록 설계된 각각의 증폭 프라이머에 대해 평가하였다. 52개의 독립 증폭 프라이머 풀을 제조하였고, 여기서 각각의 프라이머 풀은 등몰 농도에서 모아진 표 6의 52개 TCRB V 영역 프라이머 중 51개를 가졌고, 52번째 TCRB V 영역 프라이머는 다른 51개 프라이머의 몰 농도의 2배로 풀에 존재하였다. 52개의 V 프라이머 각각에 대해 1개의 풀이 존재하고 여기서 단일 프라이머가 다른 프라이머의 농도의 2배로 존재하며, 이로써 52개의 특유의 프라이머 풀이 초래되도록 별개의 증폭 프라이머 풀을 제조하였다. 그 다음, 특유의 증폭 프라이머 풀 각각에 대해 하나인, 52개의 별개의 증폭 반응을 설정하였고, 여기서 각각의 반응은 상기 기재된 689개의 주형 올리고뉴클레오티드의 세트 (서열 번호:872-1560)를 사용하였다. 주형 올리고뉴클레오티드는 서로에 대해 등몰 농도로 존재하였다. 상기 기재된 조건을 사용하여 증폭 및 서열분석을 수행하였다. 결과를 도 3에 나타냈다.

도 3에서, 흑색 사각형은 모든 다른 프라이머의 등몰 농도에 비해 2배의 농도로 존재하는 각각의 명시된 TCRB V 영역-특이적 프라이머를 사용한 증폭의 정도에서 어떤 변화도 없음을 나타냈고; 백색 사각형은 증폭의 10배 증가를 나타냈고; 회색 사각형은 0 내지 10배 사이의 증폭의 중간 정도 (그레이스케일 구배 상에서)를 나타냈다. 대각선은 소정의 프라이머에 대한 몰 농도를 2배로 하는 것이 대부분의 시험된 TCRB V 영역 프라이머의 경우에서, 특이적 어닐링 표적 서열을 갖는 각각의 주형 올리고뉴클레오티드의 증폭의 약 10배 증가를 초래하였음을 나타냈다. 비대각 백색 사각형은 특정 프라이머가 어닐링 및 증폭시킬 수 있었던 비상응 주형을 나타냈다.

하나 이상의 프라이머가 증폭능의 허용되는 범위 (예를 들어, 지정된 균일한 증폭능 범위)보다 상당히 크거나 작은 증폭능을 나타낸 경우, 생성물 분자의 각각의 종이 증폭 프라이머 세트 내에 프라이머 중에서 불균일 중폭능의 교정을 시사하는 목적하는 범위내에 존재할 때까지, 개별 프라이머 올리고뉴클레오티드의 농도의 추가 조정 및 주형 증폭 및 정량적 서열분석 단계의 반복을 수행하였다.

따라서, 프라이머 농도를 표 6에 명시된 바와 같이 조정하여, 고도로 효율적이거나 저조하게 효율적인 증폭 프라이머 각각의 상대적 존재를 증가 또는 감소시킴으로써 도 2 및 3에서 명백한 바이어스된 증폭 결과의 심각성이 감소될 수 있는지를 측정하도록 하였다. 조정된 프라이머 세트를 사용한 다중 PCR의 경우, V 유전자 프라이머 서열은 동일하게 유지되나 (표 6에 보고된 서열), 각각의 프라이머의 상대 농도는, 프라이머가 그의 주형을 과소 증폭시키면 증가되거나 (도 3), 프라이머가 그의 주형을 과다 증폭시키면 감소되었다 (도 3). 그 다음 증폭 프라이머의 조정된 혼합물을 PCR에서 사용하여, 도 2 및 3에서의 데이터를 생성시키는데 사용된 689개의 주형 올리고뉴클레오티드의 세트 (서열 번호:872-1560)를 등몰량으로 함유하는 주형 조성물을 증폭시켰다.

증폭 및 정량적 서열분석을 상기한 바와 같이 수행하였고, 결과는 도 4에 나타냈으며, 이는 모든 증폭 프라이머가 등몰 농도로 존재하는 경우 (흑색 바) 각각 명시된 증폭된 V 영역 서열-함유 생성물이 수득된 빈도를 증폭 프라이머의 농도를 표 6에 명시된 농도로 조정한 후 (회색 바) 각각의 이러한 생성물이 수득된 빈도와 비교하는 것이다.

추가의 hs-TCRB 프라이머 서열은 서열 번호 6192-6264에서 발견된다.

실시예 3: TCR-증폭 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트에서 불균일 증폭능 (PCR 바이어스)의 보정

다양한 TCR 증폭 프라이머를 대상체로부터의 림프계 세포 DNA를 함유하는 생물학적 샘플에서의 재배열된 TCR V 및 J 유전자 절편의 모든 가능한 조합을 증폭시키도록 설계한다. 다양한 증폭 프라이머의 등몰 농도를 함유하는 제제를 다중 PCR에서 사용하여 일반식 (I)에 따른 TCR-특이적 주형 올리고뉴클레오티드의 등몰 농도를 포함하는 다양한 주형 조성물을 증폭시키고 여기서 1개 이상의 주형은 TCR 유전자자리에 대해 모든 가능한 V-J 조합을 나타낸다. 증폭 생성물을 정량적으로 서열분석하고 각각의 특유의 V-J 생성물 서열의 발생 빈도는 각각의 V-J 조합을 특유하게 동정하는 각각의 16 bp 분자 바코드 서열 (일반식 (I)에서의 B)의 발생 빈도로부터 수득한다.

TCRG의 경우, TCRG 주형 올리고뉴클레오티드 (서열 번호:1561-1630)를 TCRG V- 및 J-특이적 프라이머 (서열 번호:1732-1745, 표 4)를 사용하여 증폭시킨다. 각각 쌍체 V 프라이머와 독립적으로 J 프라이머를 8개의 TCRG V 유전자 절편 특이적 프라이머 각각을 5개의 J 유전자 절편 특이적 프라이머의 풀과 함께 별도로 증폭시킴으로써 동정한다. 증폭 생성물을 일루미나 HiSeq™ 서열분석 플랫폼 상에서 정량적으로 서열분석하고 특이적 V-J 조합을 특유하게 동정하는 내부 16 bp 바코드 서열 (B)의 발생 빈도로 인해 각각의 V-J 쌍의 정량화가 가능하게 된다. 각각 쌍체 J 프라이머와 독립적으로 V 프라이머를 인버스 반응을 수행함으로써, 즉, 5개의 TCRG J 유전자 절편 프라이머 각각을 8개의 V 유전자 절편 특이적 프라이머의 풀과 함께 별도로 증폭시킴으로써 동정한다.

TCRG V 프라이머 또는 J 프라이머가 교차 증폭시키는지를 시험하기 위해 (예를 들어, 유전자 절편 특이적 프라이머가 비특이적으로 증폭시키는지, 예를 들어, TCRG V7 절편을 증폭시키도록 특이적으로 설계된 V 프라이머가 TCRG V6 및 TCRG V7 V 유전자 절편 둘 다를 증폭시킬 수 있는지를 시험하기 위해), 1개를 제외한 모든 프라이머의 등몰 농도를 함유하는 독립적인 프라이머 풀을 생성시킨 다음, 생략된 프라이머를 모든 다른 프라이머의 몰 농도의 2배로 풀에 부가한다. 그 다음 프라이머를 사용하여, 각각 일반식 (I)의 V 및 J 폴리뉴클레오티드에서 TCRG V 및 J 유전자 서열을 사용하는, 본원에 기재된 바와 같은 일반식 (I)의 복수개의 주형 올리고뉴클레오티드를 포함하는 주형 조성물을 증폭시켰다. 정량적 서열분석은 단일 증폭 프라이머가 프라이머의 풀에 모든 다른 프라이머의 농도의 2개로 존재하는 경우 증폭 생성물 중에서 과다 표시되는 임의의 하나 이상의 주형의 동일성을 나타낸다. 그 다음 프라이머 혼합물을 조정하여 하나 이상의 프라이머의 상대 농도를 증가 또는 감소시켜, 허용되는 정량적 내성내에 있는 반복 라운드로 증폭 빈도를 수득하도록 한다. 그렇게 수득된 조정된 프라이머 혼합물은 프라이머 세트의 구성원 중에서 불균일 증폭능을 감소시키도록 보정된 것으로 간주된다.

보정된 프라이머 혼합물이 대상체의 림프계 세포로부터의 생물학적 샘플에서의 재배열된 TCR 주형 DNA를 증폭시키는데 사용되는 경우 바이어스되지 않은 증폭능을 나타내는지를 측정하기 위해, 유사한 빈도로 존재하는 모든 VJ 쌍을 사용하고, 또한 특정 VJ 쌍의 상대적 표시의 비를 달리하여 본원에 기재된 바와 같은 인공 주형 조성물을 제조한다. 각각의 유형의 주형 제제를 프라이머 세트의 특정 구성원 중에서 불균일 증폭능을 감소시키도록 보정된 증폭 프라이머 세트에 대한 증폭 주형으로서 별도로 시험한다. 증폭 생성물의 정량적 서열 결정은 주형 제제의 특이적 서열의 상대 정량적 표시가 증폭 생성물 중에서 특이적 서열의 상대 정량적 표시에 반영됨을 확인해준다.

상기 기재된 반복 과정에 대한 대안으로서, 또는 이러한 반복 증폭 단계에 이어서 정량적 서열분석 이외에도, 증폭 바이어스를 또한 컴퓨터적으로 보정할 수 있다. 이러한 컴퓨터적 접근법에 따르면, 합성된 주형 조성물에서 주형 올리고뉴클레오티드 서열의 종 각각의 개시 빈도는 알려진다. PCR 증폭후 수득되는 증폭 생성물 중에서 올리고뉴클레오티드 서열의 이들 종 각각의 빈도가 정량적 서열분석에 의해 측정된다. PCR 증폭 이전 주형 올리고뉴클레오티드 서열의 상대 빈도와 PCR 증폭후 그의 빈도와의 차이가 "PCR 바이어스"다." 이러한 차이는, 예를 들어, 다양한 증폭 프라이머 중에서 상이한 증폭 효율의 결과로서, 증폭 동안 도입된 증폭 바이어스다.

각각의 알려진 주형 올리고뉴클레오티드 서열에 대해 정량적으로 측정된 바와 같이, 각각의 프라이머에 대한 PCR 바이어스를 사용하여 증폭 바이어스 (정규화) 인자를 계산하고 이에 의해 각각의 증폭 생성물에 대한 관찰된 빈도를 보정하여 주형 조성물에서 각각의 주형 서열의 실제 빈도를 반영한다. 증폭 프라이머 세트에 대한 PCR 바이어스가 10배 내에 있는 것으로 본 주형 조성물을 사용하여 경험적으로 검출된다면, 미지의 조성물의 DNA 샘플을 증폭시키기 위해 동일 증폭 프라이머 세트를 사용한 경우 수득된 증폭 생성물에서 바이어스를 컴퓨터적으로 보정할 수 있다. 그로 인해 DNA 샘플에서 주형 종의 정량화에서의 개선된 정확도가 수득된다.

V 및 J 프라이머를 경험적으로 시험하여 독립적인 것으로 확인되기 때문에, 증폭 바이어스 인자는 각각의 V 종에 대해 및 각각의 J 종에 대해 유래될 수 있고, 각각의 VJ 종 쌍에 대한 증폭 인자는 필요하지 않다. 따라서, 각각의 V 종 및 J 종에 대한 증폭 바이어스 인자는 본 주형 조성물을 사용하여 유래된다. 본 방법에 의해, 주형 조성물에서 V 및 J 유전자 서열의 빈도는 PCR 증폭 이전에 알려진다 (또는 합성된 바와 같은 주형 조성물 중 각각의 주형 올리고뉴클레오티드 종의 농도에 대한 지식을 기반으로 계산될 수 있다). PCR 증폭 후, 정량적 서열분석을 사용하여 증폭 생성물 중 각각의 V 및 J 유전자 절편 서열의 빈도를 검출한다. 각각의 서열에 대해, 유전자 절편 빈도의 차이가 증폭 바이어스이다:

초기 빈도/최종 빈도 = 증폭 바이어스 인자

증폭 바이어스 인자는 모든 V 유전자 절편 및 모든 J 유전자 절편에 대해 계산된다. 이들 증폭 인자가, 일단 계산되면, V 및 J 유전자의 개시 빈도가 알려지지 않은 샘플에 적용될 수 있다.

혼합 주형 집단 (예컨대 재배열된 적응 면역 수용체 암호화 DNA를 함유하는 것으로 추정되는 림프계 세포로부터의 DNA를 포함하는 생물학적 공급원으로부터 수득된 복합 DNA 샘플, 또는 이러한 재배열이 결여된 다른 세포로부터 DNA를 추가로 포함하는 복합 DNA 샘플)에서, 각각의 V 및 J 유전자 절편의 개시 빈도가 알려지지 않은 경우, 본 주형 조성물을 사용하여 특성화된 프라이머 세트에 대한 계산된 증폭 인자를 사용하여 잔존 PCT 증폭 바이어스를 보정할 수 있다. 서열분석된 증폭 생성물 분자의 각각의 종에 대해, 분자에 의해 사용된 V 및 J 유전자는 서열 유사성을 기반으로 측정된다. 증폭 바이어스를 보정하기 위해, 분자가 서열분석되는 횟수에 정확한 V 및 J 증폭 인자 둘 다를 곱한다. 생성된 서열 카운트는 컴퓨터적으로 "정규화된" 세트이다.

실시예 4: 추가의 주형 조성물의 생성

본질적으로 상기 기재된 방법론에 따라 추가의 주형 조성물을 설계하고 제조하였다.

V 및 J 폴리뉴클레오티드. TCRB V 및 J 폴리뉴클레오티드 서열을 본원에 기재된 복수개의 주형 올리고뉴클레오티드에 포함시키기 위해 생성시켰고 각각 도 5a-5l에 TCRB V/J 세트 1, TCRB V/J 세트 2, TCRB V/J 세트 3, TCRB V/J 세트 4, TCRB V/J 세트 5, TCRB V/J 세트 6, TCRB V/J 세트 7, TCRB V/J 세트 8, TCRB V/J 세트 9, TCRB V/J 세트 10, TCRB V/J 세트 11, TCRB V/J 세트 12 및 TCRB V/J 세트 13으로서 나타낸 바와 같이, 68개의 TCRB V 및 J 서열 번호의 세트에 명기하였다.

TCRG V 및 J 폴리뉴클레오티드 서열을 본원에 기재된 복수개의 주형 올리고뉴클레오티드에 포함시키기 위해 생성시켰고 각각 도 6a-6b에 TCRG V/J 세트 1, TCRG V/J 세트 2, TCRG V/J 세트 3, TCRG V/J 세트 4 및 TCRG V/J 세트 5로서 명기된 바와 같이, 14개의 TCRG V 및 J 서열 번호의 세트에 명기하였다.

IGH V 및 J 폴리뉴클레오티드 서열을 본원에 기재된 복수개의 주형 올리고뉴클레오티드에 포함시키기 위해 생성시켰고 각각 도 7a-7m에 IGH V/J 세트 1, IGH V/J 세트 2, IGH V/J 세트 3, IGH V/J 세트 4, IGH V/J 세트 5, IGH V/J 세트 6, IGH V/J 세트 7, IGH V/J 세트 8 및 IGH V/J 세트 9로서 명기된 바와 같이, 127개의 IGH V 및 J 서열 번호의 세트에 명기하였다.

주형 조성물. TCRB 증폭 프라이머 세트의 증폭 효율을 표준화하기 위해 주형 조성물을 제조하였다. 조성물은 일반식 (I)의 복수개의 올리고뉴클레오티드 서열을 갖는 복수개의 주형 올리고뉴클레오티드를 포함하였다. 858개의 구별되는 주형 올리고뉴클레오티드를 포함하는 TCRB 주형 조성물이 서열 번호:3157-4014로 서열 목록에 개시되어 있다.

TCRG 증폭 프라이머 세트의 증폭 효율을 표준화하기 위해 주형 조성물을 제조하였다. 조성물은 일반식 (I)의 복수개의 올리고뉴클레오티드 서열을 갖는 복수개의 주형 올리고뉴클레오티드를 포함하였다. 70개의 구별되는 주형 올리고뉴클레오티드를 포함하는 TCRG 주형 조성물이 서열 번호:4015-4084로 서열 목록에 개시되어 있다.

IGH 증폭 프라이머 세트의 증폭 효율을 표준화하기 위해 주형 조성물을 제조하였다. 조성물은 일반식 (I)의 복수개의 올리고뉴클레오티드 서열을 갖는 복수개의 주형 올리고뉴클레오티드를 포함하였다. 1116개의 구별되는 주형 올리고뉴클레오티드를 포함하는 IGH 주형 조성물이 서열 번호:4085-5200으로 서열 목록에 개시되어 있다. 또한, 1116개의 주형 올리고뉴클레오티드의 세트를 포함하는 IGH 주형 조성물이 서열 번호:1805-2920으로 서열 목록에 개시되어 있다.

실시예 5: 증폭 인자를 측정하기 위한 주형 조성물의 용도

본 실시예는 B 세포 및 섬유모세포 DNA를 함유하는 DNA 샘플의 다중 PCR 증폭에서 "스파이크트-인" 합성 주형으로서 현재 기재된 주형 올리고뉴클레오티드 조성물을 사용하여, 복수개의 IG 분자를 암호화하는 재배열된 DNA 분자의 정량화를 기재한다.

생물학적 주형 DNA: 8개의 생물학적 샘플을 주형 DNA의 공급원으로서 사용하였고, 여기서 각각의 생물학적 샘플은 동일량의 총 게놈 DNA (gDNA), 300ng이지만, (i) B 세포로부터 추출된 DNA 대 (ii) 인간 섬유모세포 (IG 및 TCR 암호화 유전자가 재배열하지 않는 세포 유형)로부터 추출된 DNA의 상이한 비율을 함유하였다. 샘플은 0, 0.07, 0.3, 1, 4, 18, 75 또는 300 ng B 세포 gDNA를 함유하였고, 여기서 섬유모세포 gDNA는 각각의 300 ng gDNA 제제의 잔여분을 공급하였다. 각각의 샘플의 4회의 반복실험이 이루어졌다.

합성 주형 DNA: 각각의 PCR 반응 (하기)에 1116개의 합성 IGH 주형 올리고뉴클레오티드 분자의 풀 (서열 번호:4085-5200)을 포함하는 올리고뉴클레오티드 주형 조성물로부터 5000개의 분자 (각각의 서열의 4-5개 분자)를 부가하였다. 또한, 1116개의 주형 올리고뉴클레오티드의 세트를 포함하는 IGH 주형 조성물이 서열 번호:1805-2920으로서 서열 목록에 개시되어 있다.

PCR 반응: PCR 반응은 퀴아젠 멀티플렉스 플러스(QIAGEN Multiplex Plus)™ PCR 마스터 믹스 (퀴아젠 부품 번호 206152, 퀴아젠, 캘리포니아주 발렌시아), 10% Q- 용액 (퀴아젠), 및 300 ng의 생물학적 주형 DNA (상기 기재됨)를 사용하였다. 모아진 증폭 프라이머를 첨가하여 최종 반응이 2 μM의 집합체 정방향 프라이머 농도 및 2 μM의 집합체 역방향 프라이머 농도를 갖도록 하였다. 정방향 프라이머 (서열 번호:5201-5286)는 3' 말단에서 IGH V 절편 암호화 서열에 어닐링된 대략 20 bp 절편 및 5' 말단에서 대략 20 bp 범용 프라이머 pGEXf를 갖는 86개의 프라이머를 포함하였다. 역방향 프라이머 (서열 번호:5287-5293)는 3' 말단에서 IGH J 절편 암호화 서열에 어닐링된 대략 20 bp 절편을 갖는 J 절편 특이적 프라이머의 집합체를 포함하였고 J 프라이머의 5' 말단에서는 범용 프라이머 pGEXr이었다. C100 열 사이클러 (바이오-래드 라보라토리즈, 미국 캘리포니아주 헬큘리즈)에서 하기 열 사이클 조건을 사용하였다: 95℃에서 10분 동안 1회 사이클, 94℃에서 30초 동안, 63℃에서 30초 동안 및 72℃에서 1분 동안 30회 사이클, 이어서 72℃에서 10분 동안 1회 사이클. 각각의 반응은 4회 시행하였다.

서열분석을 위해, 8 bp 태그 및 6bp 랜덤 세트의 뉴클레오티드를 또한 포함하는 일루미나 어댑터 (일루미나 인코포레이티드, 캘리포니아주 샌 디에이고)를 7회 사이클 PCR 반응에서 PCR 반응 생성물의 말단에 편입하였다. PCR 시약 및 조건은, 95℃에서 5분 동안, 이어서 95°에서 30초, 68°에서 90초 및 72°에서 30초 동안 7회 사이클인 열사이클 조건을 제외하고는 상기 기재된 바와 같았다. 열 사이클 후, 반응을 72°에서 10분 동안 유지하였고 프라이머는 일루미나 어댑터 테일링(tailing) 프라이머 (서열 번호:5387-5578)이었다. 일루미나_PE_RD2 프라이머를 사용하여 일루미나 MiSEQ™ 서열분석기 상에서 샘플을 서열분석하였다.

결과: 각각의 샘플에 대해 서열 데이터를 수득하고 합성 주형의 증폭 생성물을 바코드 올리고뉴클레오티드 서열의 존재에 의해 동정하였다. 각각의 샘플에 대해, 주형 생성물의 수를 특유의 합성 주형 올리고뉴클레오티드 서열의 수 (1116)로 나누어 샘플 증폭 인자에 이르렀다. 그 다음 각각의 샘플에 대해 생물학적 주형의 증폭 생성물의 총수를 증폭 인자로 나누어 특유의 B 세포 게놈 주형의 수의 추정치로서 개시 증폭 반응에서 재배열된 생물학적 주형 분자 (예를 들어, VDJ 재조합)의 수를 계산하였다. 표준 편차와 함께 평균값을 B 세포 입력을 기반으로 재배열된 생물학적 주형 분자의 알려진 수에 대해 플로팅하였다 (도 9). 도 9에서, 도트는 평균 증폭 인자를 나타내고 바아는 4회의 반복실험에 걸친 표준 편차를 나타낸다. VJ-재배열된 IG 암호화 분자의 수 (B 세포의 수에 대한 프록시 값으로서)를 추정하는 본원에 기재된 바와 같이 계산된 증폭 인자의 사용으로 적어도 100개의 B 세포의 입력에 이르는 알려진 B 세포 수에 일치하는 측정치를 산출하였다. 추정된 증폭 인자 값 및 관찰된 증폭 인자는 고도로 상관관계가 있다 (도 9, R² = 0.9988).

실시예 6: IgH, IgL, 및 IgK 바이어스 제어 주형

IgH VJ 주형 올리고뉴클레오티드

한 실시양태에서, IgH VJ 주형 올리고뉴클레오티드를 생성시키고 분석하였다. 일반식 (I)의 1134개의 주형 올리고뉴클레오티드의 세트를 인간 IgH V 및 J 폴리뉴클레오티드 서열을 사용하여 설계하였다. 각각의 주형 올리고뉴클레오티드는 495개의 염기쌍 DNA 분자로 이루어졌다. IgH 주형의 1134-올리고뉴클레오티드 세트의 세부 사항은 대표적이며 다음과 같았다.

이전에 결정된 게놈 서열을 기반으로, 인간 IgH 유전자자리는 각각이 RSS 서열을 갖고 따라서 재배열-적격으로서 간주된 126개의 Vh 절편을 함유하는 것으로 확인되었다. 이들 126개의 Vh 절편은 발현되는 것으로 알려진 52개의 유전자 절편, 개방 판독 프레임을 갖는 것으로 분류된 5개의 V 절편, 및 69개의 V 위유전자를 포함하였다. Vh 유전자 절편을 9개의 Jh 유전자 절편에 연결시켰다. 126개의 V 및 9개의 J 절편에 대해 모든 가능한 V+J 절편 조합을 포함시키기 위해, 모든 가능한 VJ 조합을 나타내는 1134 (9 x 126)개의 주형을 설계하였다. 각각의 주형은 일반식 (I) (5'-U1-B1-V-B2-R-J-B4-U2-3')(도 1)에 합치되었고 따라서 9개의 섹션, 19개의 염기쌍 (bp) 범용 어댑터 (U1), V 유전자 및 J 유전자 절편의 각각의 쌍체 조합을 특유하게 동정하는 16 bp 뉴클레오티드 태그 (B1), 300 bp의 V 유전자 특이적 서열 (V), 3 bp 정지 코돈 (S), 16 bp 뉴클레오티드 태그의 또 다른 카피 (B2), 모든 분자에 의해 공유된 6 bp 결합 태그 (R), B3은 부재, 100 bp의 J 유전자 특이적 서열 (J), 16 bp 뉴클레오티드 태그의 제3 카피 (B4), 및 19 bp 범용 어댑터 서열 (U2)을 포함하였다. 2개의 V 절편은 또 다른 2개의 V 절편과 동일한 뉴클레오티드이었고 - 따라서 순서화(ordered)하지 않았다. 이는 1134 내지 1116개의 포함된 절편의 수를 감소시켰다. 1116개의 구별되는 주형 올리고뉴클레오티드를 포함하는 IGH 주형 조성물은 서열 번호:4085-5200으로 서열 목록에 개시되어 있다.

1116개의 주형 각각을 범용 어댑터 서열 (U1, U2)에 어닐링되도록 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 개별적으로 증폭시켰다. 이들 올리고뉴클레오티드 서열은 임의의 범용 프라이머일 수 있다. 본 적용을 위해 범용 프라이머 암호화된 넥스테라를 사용하였다.

[표 8]

범용 프라이머 서열은 본원에 개시된 임의의 프라이머 서열에 어닐링될 수 있다. 범용 프라이머 서열을 포함한 PCR 프라이머의 예는 하기에 나타냈다:

[표 9]

각각의 증폭된 주형 올리고뉴클레오티드 생성물의 생성 농도를 제조업자의 사용 설명서에 따라 LabChip GX™ 모세관 전기영동 시스템 (캘리퍼 라이프 사이언시즈 인코포레이티드, 매사추세츠주 홉킨턴)을 사용하여 정량화하였다. 1116개의 증폭된 주형 올리고뉴클레오티드 제제를 표준 농도로 정규화한 다음, 모았다.

모든 1116개의 주형 올리고뉴클레오티드가 실질적으로 등몰 농도로 존재하는 것을 검증하기 위해, 제조업자의 권고에 따라 일루미나 MiSeq™ 서열분석 플랫폼을 사용하여 풀을 서열분석하였다. 플랫폼-특이적 올리고뉴클레오티드 서열을 모아진 주형 올리고뉴클레오티드에 편입하기 위해, 범용 프라이밍 부위 (U1, U2)에 어닐링되고 5' 말단으로서 일루미나™ 어댑터 서열 테일을 갖는 테일드 프라이머를 설계하였다. 그 다음 7-사이클 PCR 반응을 수행하여 일루미나 어댑터를 주형 올리고뉴클레오티드에 어닐링하였다. 그 다음 제조업자에 의해 권장된 조건하에 아젠코트® AMPure® XP 비드 (베크만 코울터 인코포레이티드, 캘리포니아주 플러턴)를 사용하여 PCR 반응 생성물 혼합물을 정제하였다. PCR 반응 생성물의 최초 29 bp를 일루미나 MiSEQ™ 서열분석기 (일루미나 인코퍼레이티드, 캘리포니아주 샌 디에이고)를 사용하여 서열분석하고 각각의 16 bp 분자 바코드 태그 (B1)의 빈도를 평가함으로써 분석하였다.

1116개의 구별되는 주형 올리고뉴클레오티드의 세트에 대한 실질적으로 등몰 제제를 세트의 각각의 구성원의 대략 ~0.09%를 함유하도록 계산하였고, 모든 종에 대해 10배 빈도 안팎의 역치 내성 (0.009 - 0.9%)을 목적으로 하였다. 정량적 서열분석에 의하면 초기 풀 내에 어댑터-변형된 주형 올리고뉴클레오티드의 1116개의 종이 균등하게 표시되지 않은 것으로 나타났다.

따라서, 각각의 분자가 역치 내성 농도 (0.009 - 0.9%) 내에 존재할 때까지 개별 주형 올리고뉴클레오티드의 농도의 조정 및 정량적 서열분석 단계의 반복을 수행한다.

IgH DJ 주형 올리고뉴클레오티드

또 다른 실시양태에서, IgH DJ 주형 올리고뉴클레오티드를 생성시키고 분석하였다. 일반식 (I)의 243개의 주형 올리고뉴클레오티드의 세트를 인간 IgH D 및 J 폴리뉴클레오티드 서열을 사용하여 설계하였다. 각각의 주형 올리고뉴클레오티드는 382개의 염기쌍 DNA 분자로 이루어졌다. IgH DJ 주형 올리고뉴클레오티드 서열은 서열 번호: 5579-5821로 제시되어 있다. IgH 주형의 243-올리고뉴클레오티드 세트의 세부 사항은 대표적이며 다음과 같았다.

이전에 결정된 게놈 서열을 기반으로, 인간 IgH 유전자자리는 27개의 Dh 절편을 함유하는 것으로 확인되었다. 27개의 Dh 유전자 절편을 9개의 Jh 유전자 절편에 연결시켰다. 27개의 D 및 9개의 J 절편에 대해 모든 가능한 D+J 유전자 조합을 포함시키기 위해, 모든 가능한 DJ 조합을 나타내는 243 (9 x 27)개의 주형을 설계하였다. 각각의 주형은 일반식 (I) (5'-U1-B1-V-B2-R-J-B4-U2-3') (도 1)에 합치되었고 따라서 9개의 섹션, 19개의 염기쌍 (bp) 범용 어댑터 (U1), D 유전자 및 J 유전자 절편의 각각의 쌍체 조합을 특유하게 동정하는 16 bp 뉴클레오티드 태그 (B1)를 포함하였다. 그러나, 이들 분자를 위해, V 유전자 특이적 서열 (V)의 300 bp를 D 유전자 특이적 서열의 182 bp의 절편으로 대체하였다. 이 절편은 엑손 및 인트론 뉴클레오티드 절편 둘 다를 포함하였다. 다른 분자와 마찬가지로, 이들은 3 염기쌍 (bp) 정지 코돈 (S), 16 bp 뉴클레오티드 태그의 또 다른 카피 (B2), 모든 분자에 의해 공유된 6 bp 결합 태그 (R), B3은 부재, 100 bp의 J 유전자 특이적 서열 (J), 16 bp 뉴클레오티드 태그의 제3 카피 (B4), 및 19 bp 범용 어댑터 서열 (U2)을 포함하였다.

243개의 주형 각각 (서열 번호:5579-5821)을 범용 어댑터 서열 (U1, U2; 표 8 참조)에 어닐링되도록 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 개별적으로 증폭시켰다. 이들 올리고뉴클레오티드 서열은 임의의 범용 프라이머일 수 있고; 이러한 적용을 위해 범용 프라이머 암호화된 넥스테라를 사용하였다.

범용 어댑터 서열을 갖는 PCR 프라이머의 예를 표 10에 나타냈다.

[표 10]

각각의 증폭된 주형 올리고뉴클레오티드 생성물의 생성 농도를 제조업자의 사용 설명서에 따라 LabChip GX™ 모세관 전기영동 시스템 (캘리퍼 라이프 사이언시즈 인코포레이티드, 매사추세츠주 홉킨턴)을 사용하여 정량화하였다. 243개의 증폭된 주형 올리고뉴클레오티드 제제를 표준 농도로 정규화한 다음, 모았다.

모든 243개의 주형 올리고뉴클레오티드가 실질적으로 등몰 농도로 존재하는 것을 검증하기 위해, 제조업자의 권고에 따라 일루미나 MiSeq™ 서열분석 플랫폼을 사용하여 풀을 서열분석하였다. 플랫폼-특이적 올리고뉴클레오티드 서열을 모아진 주형 올리고뉴클레오티드에 편입하기 위해, 범용 프라이밍 부위 (U1, U2)에 어닐링되고 5' 말단으로서 일루미나™ 어댑터 서열 테일을 갖는 테일드 프라이머를 설계하였다. 그 다음 7-사이클 PCR 반응을 수행하여 일루미나 어댑터를 주형 올리고뉴클레오티드에 어닐링하였다. 그 다음 제조업자에 의해 권장된 조건하에 아젠코트® AMPure® XP 비드 (베크만 코울터 인코포레이티드, 캘리포니아주 플러턴)를 사용하여 PCR 반응 생성물 혼합물을 정제하였다. PCR 반응 생성물의 최초 29 bp를 일루미나 MiSEQ™ 서열분석기 (일루미나 인코퍼레이티드, 캘리포니아주 샌 디에이고)를 사용하여 서열분석하고 각각의 16 bp 분자 바코드 태그 (B1)의 빈도를 평가함으로써 분석하였다.

243개의 구별되는 주형 올리고뉴클레오티드 세트에 대한 실질적으로 등몰 제제를 세트의 각각의 구성원 대략 ~0.4%를 함유하도록 계산하였고, 모든 종에 대해 10배 빈도 안팎의 역치 내성 (0.04 - 4.0%)을 목적으로 하였다. 정량적 서열분석에 의하면 초기 풀 내에 어댑터-변형된 주형 올리고뉴클레오티드의 243개의 종이 균등하게 표시되지 않은 것으로 나타났다.

따라서, 각각의 분자가 역치 내성 농도 (0.04 - 4.0%) 내에 존재할 때까지 개별 주형 올리고뉴클레오티드의 농도의 조정 및 정량적 서열분석 단계의 반복을 수행한다. 정량화 후, 이러한 세트를 1359개의 주형의 풀에 대해 1116개의 IgH VJ 바이어스 제어 세트와 조합하였다.

도 10은 1116개의 IGH VJ 바이어스 제어 분자 및 243개의 IGH DJ 바이어스 제어 분자 각각에 대한 사전-PCR 증폭 서열분석 카운트의 결과를 나타낸다. 개별 바이어스 제어 분자는 x-축에 따른다. 세트는 총 1359 g블록에 대해 1116개의 IGH VJ 바이어스 제어 분자 및 243개의 IGH DJ 바이어스 제어 분자를 포함한다. Y축은 각각의 개별 g블록에 대한 서열 카운트이다 이러한 계산은 각각의 VJ 쌍의 사전-증폭 표시의 조성물의 정량화를 제공한다. 이러한 데이터를 사용하여 사전-샘플과 PCR 증폭후 샘플 사이의 빈도의 변화를 추정하여 프라이머에 의해 도입된 증폭 바이어스를 계산한다.

IgL VJ 주형 올리고뉴클레오티드

또 다른 실시양태에서, IgL VJ 주형 올리고뉴클레오티드를 생성시키고 분석하였다. 일반식 (I)의 245개의 주형 올리고뉴클레오티드의 세트를 인간 IgL V 및 J 폴리뉴클레오티드 서열을 사용하여 설계하였다. 각각의 주형 올리고뉴클레오티드는 495개의 염기쌍 DNA 분자로 이루어졌다. IgL 주형 올리고뉴클레오티드는 서열 번호: 5822-6066으로서 제시되어 있다. IgL 주형의 245-올리고뉴클레오티드 세트의 세부 사항은 대표적이며 다음과 같았다.

이전에 결정된 게놈 서열을 기반으로, 인간 IgL 유전자자리는 각각이 RSS 서열을 갖고 따라서 재배열-적격으로서 간주되는 75개의 VL 절편을 함유하는 것으로 확인되었다. 이들 33개의 VL 절편은 발현되는 것으로 알려진 유전자 절편, 개방 판독 프레임을 갖는 것으로 분류된 5개의 V 절편, 및 37개의 V 위유전자를 포함하였다. VL 유전자 절편을 5개의 6 JL 유전자 절편에 연결시켰다. 33개의 기능성 V 및 6개의 J 절편에 대해 모든 가능한 기능성 및 발현된 V+J 유전자 조합을 포함시키기 위해, 모든 가능한 발현된 VJ 조합을 나타내는 204 (6 x 33)개의 주형을 설계하였다. 게다가, V 위유전자 중 2개는 문제가 있었고; 추가의 12 (2 x 6)개의 VJ 주형을 설계하여, 이로써 총 216개가 초래되었다. 각각의 주형은 일반식 (I) (5'-U1-B1-V-B2-R-J-B4-U2-3')(도 1)에 합치되었고 따라서 9개의 섹션, 19개의 염기쌍 (bp) 범용 어댑터 (U1), V 유전자 및 J 유전자 절편의 각각의 쌍체 조합을 특유하게 동정하는 16 bp 뉴클레오티드 태그 (B1), 300 bp의 V 유전자 특이적 서열 (V), 3 bp 정지 코돈 (S), 16 bp 뉴클레오티드 태그의 또 다른 카피 (B2), 모든 분자에 의해 공유된 6 bp 결합 태그 (R), B3은 부재, 100 bp의 J 유전자 특이적 서열 (J), 16 bp 뉴클레오티드 태그의 제3 카피 (B4), 및 19 bp 범용 어댑터 서열 (U2)을 포함하였다.

216개의 주형 각각을 범용 어댑터 서열 (U1, U2)에 어닐링되도록 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 개별적으로 증폭시켰다. 이들 올리고뉴클레오티드 서열은 임의의 범용 프라이머일 수 있고, 이러한 적용을 위해, 범용 프라이머 암호화된 넥스테라를 사용하였다.

각각의 증폭된 주형 올리고뉴클레오티드 생성물의 생성 농도를 제조업자의 사용 설명서에 따라 LabChip GX™ 모세관 전기영동 시스템 (캘리퍼 라이프 사이언시즈 인코포레이티드, 매사추세츠주 홉킨턴)을 사용하여 정량화하였다. 216개의 증폭된 주형 올리고뉴클레오티드 제제를 표준 농도로 정규화한 다음, 모았다.

모든 216개의 주형 올리고뉴클레오티드가 실질적으로 등몰 농도로 존재하는 것을 검증하기 위해, 제조업자의 권고에 따라 일루미나 MiSeq™ 서열분석 플랫폼을 사용하여 풀을 서열분석하였다. 플랫폼-특이적 올리고뉴클레오티드 서열을 모아진 주형 올리고뉴클레오티드에 편입하기 위해, 범용 프라이밍 부위 (U1, U2)에 어닐링되고 5' 말단으로서 일루미나™ 어댑터 서열 테일을 갖는 테일드 프라이머를 설계하였다. 그 다음 7-사이클 PCR 반응을 수행하여 일루미나 어댑터를 주형 올리고뉴클레오티드에 어닐링하였다. 그 다음 제조업자에 의해 권장된 조건하에 아젠코트® AMPure® XP 비드 (베크만 코울터 인코포레이티드, 캘리포니아주 플러턴)를 사용하여 PCR 반응 생성물 혼합물을 정제하였다. PCR 반응 생성물의 최초 29 bp를 일루미나 MiSEQ™ 서열분석기 (일루미나 인코퍼레이티드, 캘리포니아주 샌 디에이고)를 사용하여 서열분석하고 각각의 16 bp 분자 바코드 태그 (B1)의 빈도를 평가함으로써 분석하였다.

216개의 구별되는 주형 올리고뉴클레오티드의 세트에 대한 실질적으로 등몰 제제를 세트의 각각의 구성원 대략 ~0.46%를 함유하도록 계산하였고, 모든 종에 대해 10배 빈도 안팎의 역치 내성 (0.046 - 4.6%)을 목적으로 하였다. 정량적 서열분석에 의하면 초기 풀 내에 어댑터-변형된 주형 올리고뉴클레오티드의 216개의 종이 균등하게 표시된 것으로 나타났다.

IgK VJ 주형 올리고뉴클레오티드

한 실시양태에서, IgK VJ 주형 올리고뉴클레오티드를 생성시키고 분석하였다. 일반식 (I)의 560개의 주형 올리고뉴클레오티드의 세트를 인간 IgK V 및 J 폴리뉴클레오티드 서열을 사용하여 설계하였다. 각각의 주형 올리고뉴클레오티드는 495개의 염기쌍 DNA 분자로 이루어졌다. IgK 주형 올리고뉴클레오티드의 예는 서열 번호: 6067-6191에서 발견된다. IgK 주형의 560-올리고뉴클레오티드 세트의 세부 사항은 대표적이며 다음과 같았다.

이전에 결정된 게놈 서열을 기반으로, 인간 IgK 유전자자리는 각각이 RSS 서열을 갖고 따라서 재배열-적격으로서 간주되는 112개의 Vk 절편을 함유하는 것으로 확인되었다. 이들 112개의 Vk 절편은 발현되는 것으로 알려진 46개의 유전자 절편, 개방 판독 프레임을 갖는 것으로 분류된 8개의 V 절편, 및 50개의 V 위유전자를 포함하였다. 이러한 IgK에 대해, 단지 발현된 IgK VJ 재배열을 분석하였다. 위유전자 및 개방 판독 프레임으로서 분류된 유전자는 제외시켰다. Vk 유전자 절편을 5개의 Jk 유전자 절편에 연결시켰다. 이로써 230개의 VJ 유전자 재배열 (46 x 5)이 수득되었다 46개의 기능성 V 및 5개의 J 절편에 대해 모든 가능한 기능성 V+J 유전자 조합을 포함시키기 위해, 모든 가능한 VJ 조합을 나타내는 230 (5 x 46)개의 주형을 설계하였다. 각각의 주형은 일반식 (I) (5'-U1-B1-V-B2-R-J-B4-U2-3')(도 1)에 합치되었고 따라서 9개의 섹션, 19개의 염기쌍 (bp) 범용 어댑터 (U1), V 유전자 및 J 유전자 절편의 각각의 쌍체 조합을 특유하게 동정하는 16 bp 뉴클레오티드 태그 (B1), 300 bp의 V 유전자 특이적 서열 서열 (V), 3 bp 정지 코돈 (S), 16 bp 뉴클레오티드 태그의 또 다른 카피 (B2), 모든 분자에 의해 공유된 6 bp 결합 태그 (R), B3은 부재, 100 bp의 J 유전자 특이적 서열 (J), 16 bp 뉴클레오티드 태그의 제3 카피 (B4), 및 19 bp 범용 어댑터 서열 (U2)을 포함하였다.

230개의 주형 각각을 범용 어댑터 서열 (U1, U2)에 어닐링되도록 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 개별적으로 증폭시켰다. 이들 올리고뉴클레오티드 서열은 임의의 범용 프라이머일 수 있고 - 이러한 적용을 위해 범용 프라이머 암호화된 넥스테라를 사용하였다.

각각의 증폭된 주형 올리고뉴클레오티드 생성물의 생성 농도를 제조업자의 권고에 따라 LabChip GX™ 모세관 전기영동 시스템 (캘리퍼 라이프 사이언시즈 인코포레이티드, 매사추세츠주 홉킨턴)을 사용하여 정량화하였다. 230개의 증폭된 주형 올리고뉴클레오티드 제제를 표준 농도로 정규화한 다음, 모았다.

모든 230개의 주형 올리고뉴클레오티드가 실질적으로 등몰 농도로 존재하는 것을 검증하기 위해, 제조업자의 사용 설명서에 따라 일루미나 MiSeq™ 서열분석 플랫폼을 사용하여 풀을 서열분석하였다. 간략하게, 플랫폼-특이적 올리고뉴클레오티드 서열을 모아진 주형 올리고뉴클레오티드에 편입하기 위해, 범용 프라이밍 부위 (U1, U2)에 어닐링되고 5' 말단으로서 일루미나™ 어댑터 서열 테일을 갖는 테일드 프라이머를 설계하였다. 그 다음 7-사이클 PCR 반응을 수행하여 일루미나 어댑터를 주형 올리고뉴클레오티드에 어닐링하였다. 그 다음 제조업자에 의해 권장된 조건하에 아젠코트® AMPure® XP 비드 (베크만 코울터 인코포레이티드, 캘리포니아주 플러턴)를 사용하여 PCR 반응 생성물 혼합물을 정제하였다. PCR 반응 생성물의 최초 29 bp를 일루미나 MiSEQ™ 서열분석기 (일루미나 인코퍼레이티드, 캘리포니아주 샌 디에이고)를 사용하여 서열분석하고 각각의 16 bp 분자 바코드 태그 (B1)의 빈도를 평가함으로써 분석하였다.

230개의 구별되는 주형 올리고뉴클레오티드의 세트에 대한 실질적으로 등몰 제제를 세트의 각각의 구성원 대략 ~0.4%를 함유하도록 계산하였고, 모든 종에 대해 10배 빈도 안팎의 역치 내성 (4.0 - 0.04%)을 목적으로 하였다. 정량적 서열분석에 의하면 초기 풀 내에 어댑터-변형된 주형 올리고뉴클레오티드의 230개의 종이 균등하게 표시된 것으로 나타났다.

실시예 7: 조합 검정

IgH DJ 및 IgH VJ 조합 검정

일부 실시양태에서, 재배열된 IgH VDJ CDR3 쇄 및 재배열된 IgH DJ 쇄를 동시 증폭시키고 서열분석하는 것이 바람직하다. IgH DJ 및 IgH VJ 주형을 사용하여 조합 IgH DJ 및 IgH VJ 검정을 시험하기 위해 주형의 풀을 생성시키기 위해. 모아진 경우-, 최종 생성물은 1116개의 VJ 및 243개의 DJ 주형을 포함하며, 이로써 1359개의 개별 주형이 초래되었다. 1116개의구별되는 주형 올리고뉴클레오티드를 포함하는 IgH VJ 주형 조성물이 서열 번호:4085-5200으로 서열 목록에 개시되어 있다. IgH DJ 주형 올리고뉴클레오티드 서열은 서열 번호: 5579-5821로 제시되어 있다.

모든 1359개의 주형 올리고뉴클레오티드가 실질적으로 등몰 농도로 존재하는 것을 검증하기 위해, 제조업자의 권장에 따라 일루미나 MiSeq™ 서열분석 플랫폼을 사용하여 풀을 서열분석하였다. 플랫폼-특이적 올리고뉴클레오티드 서열을 모아진 주형 올리고뉴클레오티드에 편입하기 위해, 범용 프라이밍 부위 (U1, U2)에 어닐링되고 5' 말단으로서 일루미나™ 어댑터 서열 테일을 갖는 테일드 프라이머를 설계하였다. 그 다음 7-사이클 PCR 반응을 수행하여 일루미나 어댑터를 주형 올리고뉴클레오티드에 어닐링하였다. 그 다음 제조업자에 의해 권장된 조건하에 아젠코트® AMPure® XP 비드 (베크만 코울터 인코포레이티드, 캘리포니아주 플러턴)를 사용하여 PCR 반응 생성물 혼합물을 정제하였다. PCR 반응 생성물의 최초 29 bp를 일루미나 MiSEQ™ 서열분석기 (일루미나 인코퍼레이티드, 캘리포니아주 샌 디에이고)를 사용하여 서열분석하고 각각의 16 bp 분자 바코드 태그 (B1)의 빈도를 평가함으로써 분석하였다.

1359개의 구별되는 주형 올리고뉴클레오티드의 세트에 대한 실질적으로 등몰 제제를 세트의 각각의 구성원 대략 ~0.073%를 함유하도록 계산하였고, 모든 종에 대해 10배 빈도 안팎의 역치 내성 (0.73 - 0.0073%)을 목적으로 하였다. 정량적 서열분석에 의하면 초기 풀 내에 어댑터-변형된 주형 올리고뉴클레오티드의 1359개의 종이 균등하게 표시된 것으로 나타났다.

IgL 및 IgK 조합 검정

다른 실시양태에서, 재배열된 IgL 및 IgK 재배열된 CDR3 쇄를 동시 증폭시키고 서열분석하는 것이 바람직하다. 조합 IgL 및 IgK 검정을 시험하기 위해 주형의 풀을 생성시키기 위해 (IgL 및 IgK 주형을 조합하였음). 모아진 경우, 최종 생성물은 216개의 IgL 및 230개의 IgK 주형을 포함하며, 이로써 446개의 개별 주형이 초래되었다. IgL 주형 올리고뉴클레오티드는 서열 번호: 5822-6066으로서 제시하였다.

모든 446개의 주형 올리고뉴클레오티드가 실질적으로 등몰 농도로 존재하는 것을 검증하기 위해, 제조업자의 권고에 따라 일루미나 MiSeq™ 서열분석 플랫폼을 사용하여 풀을 서열분석하였다. 간략하게, 플랫폼-특이적 올리고뉴클레오티드 서열을 모아진 주형 올리고뉴클레오티드에 편입하기 위해, 범용 프라이밍 부위 (U1, U2)에 어닐링되고 5' 말단으로서 일루미나™ 어댑터 서열 테일을 갖는 테일드 프라이머를 설계하였다. 그 다음 7-사이클 PCR 반응을 수행하여 일루미나 어댑터를 주형 올리고뉴클레오티드에 어닐링하였다. 그 다음 제조업자에 의해 권장된 조건하에 아젠코트® AMPure® XP 비드 (베크만 코울터 인코포레이티드, 캘리포니아주 플러턴)를 사용하여 PCR 반응 생성물 혼합물을 정제하였다. PCR 반응 생성물의 최초 29 bp를 일루미나 MiSEQ™ 서열분석기 (일루미나 인코퍼레이티드, 캘리포니아주 샌 디에이고)를 사용하여 서열분석하고 각각의 16 bp 분자 바코드 태그 (B1)의 빈도를 평가함으로써 분석하였다.

446개의 구별되는 주형 올리고뉴클레오티드의 세트에 대한 실질적으로 등몰 제제를 세트의 각각의 구성원 대략 ~0.22%를 함유하도록 계산하였고, 모든 종에 대해 10배 빈도 안팎의 역치 내성 (2.2 - 0.022%)을 목적으로 하였다 정량적 서열분석에 의하면 초기 풀 내에 어댑터-변형된 주형 올리고뉴클레오티드의 446개의 종이 균등하게 표시된 것으로 나타났다.

실시예 8: IGH-증폭 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트에서 불균일 증폭능 (PCR 바이어스)의 보정

다양한 IgH 증폭 프라이머를 대상체로부터의 림프계 세포 DNA를 함유하는 생물학적 샘플에서의 재배열된 IgH V 및 J 유전자 절편의 모든 가능한 조합을 증폭시키도록 설계하였다. 다양한 증폭 프라이머의 등몰 농도를 함유하는 제제를 다중 PCR에서 사용하여 일반식 (I)에 따른 IgH-특이적 주형 올리고뉴클레오티드의 등몰 농도를 포함하는 다양한 주형 조성물을 증폭시키고 여기서 1개 이상의 주형은 IgH 유전자자리에 대해 모든 가능한 V-J 조합을 나타낸다. 증폭 생성물을 정량적으로 서열분석하고 각각의 특유의 V-J 생성물 서열의 발생 빈도는 각각의 V-J 조합을 특유하게 동정하는 각각의 16 bp 분자 바코드 서열 (일반식 (I)에서의 B)의 발생 빈도로부터 수득하였다.

IMGT 콜라보레이션(collaboration)에 의해 주석이 달린 바와 같이, IgH 유전자자리의 모든 가능한 V 및 J 유전자 재배열을 증폭시키도록 다중 PCR 반응을 설계하였다. 문헌 [Yousfi Monod M, Giudicelli V, Chaume D, Lefranc. MP. MGT/JunctionAnalysis: the first tool for the analysis of the Immunoglobuln and T cell receptor complex V-J and V-D-J JUNCTIONs. Bioinformatics. 2004;20(suppl 1):i379-i385] 참조. 유전자자리는 126개의 특유의 V 유전자; 52개의 기능성 유전자, 기능을 위한 중대 아미노산이 결여된 6개의 추정 개방 판독 프레임 및 69개의 위유전자; 및 9개의 J 유전자, 6개의 기능성 및 3개의 위유전자를 포함하였다. 프라이머 어닐링을 위한 표적 서열은 일부 V 절편에 대해 동일하였고, 이로써 86개의 특유의 정방향 프라이머를 사용한 모든 126개의 V 절편의 증폭이 가능하게 되었다. 유사하게, 7개의 특유의 역방향 프라이머가 모든 9개의 J 유전자에 어닐링되었다. 바이어스 평가를 위한 기준치로서, 86개의 V 정방향 프라이머 (VF; V 유전자에 특이적)의 등몰 풀 및 7개의 J 역방향 프라이머 (JR; J 유전자에 특이적)의 등몰 풀을 사용하여 1116개의 주형의 풀을 증폭시켰다.

중합효소 연쇄 반응 (PCR) (각각 25 μL)을 2.0 μM VF, 2.0 μM JR 풀 (인테그레이티드 DNA 테크놀로지즈), 1 μM 퀴아젠 멀티플렉스 플러스 PCR 마스터 믹스 (퀴아젠, 캘리포니아주 발렌시아), 10% Q- 용액 (퀴아젠), 및 본 출원인의 합성 IgH 레퍼토리 믹스로부터의 200,000개의 표적 분자에서 설정하였다. C100 열 사이클러 (바이오-래드 라보라토리즈, 캘리포니아주 헬큘리즈)에서 하기 열 사이클 조건을 사용하였다: 95℃에서 6분 동안 1회 사이클, 95℃에서 30초 동안, 64℃에서 120초 동안 및 72℃에서 90초 동안 31회 사이클, 이어서 72℃에서 3분 동안 1회 사이클. 모든 실험을 위해, 각각의 PCR 조건을 3회 반복실험하였다.

초기 바이어스 평가 후, 실험을 수행하여 모든 개별 프라이머 증폭 특성을 규정하였다. VF 및 JR 프라이머의 특이성을 측정하기 위해, 단일 VF 프라이머와 모든 JR 프라이머를 함유하는 86종의 혼합물, 및 단일 JR 프라이머와 모든 VF 프라이머를 함유하는 7종의 혼합물을 제조하였다. 이들 프라이머 세트를 사용하여 합성 주형을 증폭시키고 생성된 라이브러리를 서열분석하여 표적화 V 또는 J 유전자 절편에 대한 각각의 프라이머의 특이성을 측정하고, 표적 이탈(off-target) 프라이밍의 경우를 동정하였다. 모든 다른 등몰 프라이머의 맥락 내에서 각각의 개별 VF 또는 JF의 2배 및 4배 농도의 풀 (예를 들어, 2x-배 IgHV1-01+ 모든 다른 등몰의 VF 및 JR 프라이머)을 사용하여 적정 실험을 수행하여 프라이머 농도를 관찰된 주형 빈도와 관련시키는 스케일링 인자(scaling factor)를 추정하였다.

프라이머 믹스 최적화

프라이머를 차례로 적정함으로써 유래된 스케일링 인자를 사용하여, 대안적 프라이머 믹스를 발생시켰으며, 여기서 프라이머를 불균등 농도로 조합하여 증폭 바이어스를 최소화하였다. 그 다음, 수정된 프라이머 믹스를 사용하여 주형 풀을 증폭시키고 잔존 증폭 바이어스를 측정하였다. 각각의 프라이머 농도를 그 프라이머에 의해 증폭된 주형이 이전 라운드의 결과에서 과다 표시 또는 과소 표시되었는지의 여부를 기반으로 적절하게 감소 또는 증가시켜 이 과정을 되풀이하였다. 이러한 반복 과정의 각 단계에서, 증폭 바이어스의 전체 정도를, 제곱합 (SS, 로그(바이어스) 값에 대해 계산됨) 및 동적 범위 (최대 바이어스/최소 바이어스)에 대한 메트릭스(metrics)를 계산함으로써 측정하고, 반복 사이에 최소한의 개선이 있을 때까지 프라이머 농도를 조정하는 과정을 되풀이하였다. 등몰 주형 입력으로부터의 편차에 대한 스케일링 인자 및 최종 최적화된 프라이머 믹스의 강인성을 평가하기 위해, 본 출원인은 IgH 참조 주형의 고도로 불균등한 혼합물을 사용하여 서열분석 출력에 대한 영향을 측정하였다. 최종 믹스는 등몰 믹스보다 실질적으로 양호하였다.

실시예 9: TCRB-증폭 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트에서 불균일 증폭능 (PCR 바이어스)의 보정

다양한 TCRB 증폭 프라이머를 대상체로부터의 림프계 세포 DNA를 함유하는 생물학적 샘플에서의 재배열된 TCRB V 및 J 유전자 절편의 모든 가능한 조합을 증폭시키도록 설계하였다. 다양한 증폭 프라이머의 등몰 농도를 함유하는 제제를 다중 PCR에서 사용하여 일반식 (I)에 따른 TCRB-특이적 주형 올리고뉴클레오티드의 등몰 농도를 포함하는 다양한 주형 조성물을 증폭시키고 여기서 1개 이상의 주형은 TCRB 유전자자리에 대해 모든 가능한 V-J 조합을 나타낸다. 증폭 생성물을 정량적으로 서열분석하고 각각의 특유의 V-J 생성물 서열의 발생 빈도는 각각의 V-J 조합을 특유하게 동정하는 각각의 16 bp 분자 바코드 서열 (일반식 (I)에서의 B)의 발생 빈도로부터 수득하였다.

IMGT 콜라보레이션에 의해 주석이 달린 바와 같이, TCRB 유전자자리의 모든 가능한 V 및 J 유전자 재배열을 증폭시키도록 다중 PCR 반응을 설계하였다. 문헌 [Yousfi Monod M, Giudicelli V, Chaume D, Lefranc. MP. MGT/JunctionAnalysis: the first tool for the analysis of the Immunoglobuln and T cell receptor complex V-J and V-D-J JUNCTIONs. Bioinformatics. 2004;20(suppl 1):i379-i385] 참조. 유전자자리는 67개의 특유의 V 유전자를 포함하였다. 프라이머 어닐링을 위한 표적 서열은 일부 V 절편에 대해 동일하였고, 이로써 60개의 특유의 정방향 프라이머를 사용한 모든 67개의 V 절편의 증폭이 가능하게 되었다. J 유전자자리의 경우, 13개의 특유의 역방향 프라이머가 13개의 J 유전자에 어닐링되었다. 바이어스 평가를 위한 기준치로서, 60개의 V 정방향 프라이머 (VF; V 유전자에 특이적)의 등몰 풀 및 13개의 J 역방향 프라이머 (JR; J 유전자에 특이적)의 등몰 풀을 사용하여 868개의 주형의 풀을 증폭시켰다. 중합효소 연쇄 반응 (PCR) (각각 25 μL)을 3.0 μM VF, 3.0 μM JR 풀 (인테그레이티드 DNA 테크놀로지즈), 1 μM 퀴아젠 멀티플렉스 플러스 PCR 마스터 믹스 (퀴아젠, 캘리포니아주 발렌시아), 10% Q- 용액 (퀴아젠), 및 본 출원인의 합성 TCRB 레퍼토리 믹스로부터의 200,000개의 표적 분자에서 설정하였다. C100 열 사이클러 (바이오-래드 라보라토리즈, 캘리포니아주 헬큘리즈)에서 하기 열 사이클 조건을 사용하였다: 95℃에서 5분 동안 1회 사이클, 95℃에서 30초 동안, 62℃에서 90초 동안 및 72℃에서 90초 동안 31회 사이클, 이어서 72℃에서 3분 동안 1회 사이클. 모든 실험을 위해, 각각의 PCR 조건을 3회 반복실험하였다.

초기 바이어스 평가 후, 실험을 수행하여 모든 개별 프라이머 증폭 특성을 규정하였다. 본 출원인의 VF 및 JR 프라이머의 특이성을 측정하기 위해, 단일 VF 프라이머와 모든 JR 프라이머를 함유하는 60종의 혼합물, 및 단일 JR 프라이머와 모든 VF 프라이머를 함유하는 13종의 혼합물을 제조하였다. 이들 프라이머 세트를 사용하여 합성 주형을 증폭시키고 생성된 라이브러리를 서열분석하여 표적화 V 또는 J 유전자 절편에 대한 각각의 프라이머의 특이성을 측정하고 표적 이탈 프라이밍의 경우를 동정하였다. 모든 다른 등몰 프라이머의 맥락 내에서 각각의 개별 VF 또는 JF의 2배 및 4배 농도의 풀 (예를 들어, 2x-배 TCRBV07-6 + 모든 다른 등몰의 VF 및 JR 프라이머)을 사용하여 적정 실험을 수행하여 본 출원인이 프라이머 농도를 관찰된 주형 빈도와 관련시키는 스케일링 인자를 평가가능하도록 하였다.

프라이머 믹스 최적화

프라이머를 차례로 적정함으로써 유래된 스케일링 인자를 사용하여, 대안적 프라이머 믹스를 발생시켰으며, 여기서 프라이머를 불균등 농도로 조합하여 증폭 바이어스를 최소화하였다. 그 다음, 수정된 프라이머 믹스를 사용하여 주형 풀을 증폭시키고 잔존 증폭 바이어스를 측정하였다. 각각의 프라이머 농도를 그 프라이머에 의해 증폭된 주형이 이전 라운드의 결과에서 과다 표시 또는 과소 표시되었는지의 여부를 기반으로 적절하게 감소 또는 증가시켜 이 과정을 되풀이하였다. 이러한 반복 과정의 각 단계에서, 증폭 바이어스의 전체 정도를, 제곱합 (SS, 로그(바이어스) 값에 대해 계산됨) 및 동적 범위 (최대 바이어스/최소 바이어스)에 대한 메트릭스를 계산함으로써 측정하고, 반복 사이에 최소한의 개선이 있을 때까지 프라이머 농도를 조정하는 과정을 되풀이하였다. 최종 믹스는 프라이머의 등몰 믹스보다 실질적으로 양호하였다.

도 11은 상대적 증폭 바이어스에 대해 그래프로 나타낸 합성 TCRB VJ 주형에 대한 TCRB-프라이머 반복을 나타낸다. 화학적 바이어스 제어 보정 이전에 (등몰 프라이머 (흑색)), 화학적 보정 후 (최적화 프라이머 (암회색), 및 화학적 및 컴퓨터적 보정 후 (컴퓨터적 조정후 (담회색)) 858개의 합성 TCRB VJ 주형에 대해 상대적 증폭 바이어스를 측정하였다. 등몰 프라이머는 동적 범위 264, 사분 범위 0.841, 및 제곱합 (로그 바이어스) 132를 가졌다. 최적화 프라이머는 동적 범위 147, 사분 범위 0.581, 및 제곱합 (로그 바이어스) 50.7을 가졌다. 보정된 프라이머 (컴퓨터에 의한 조정후)는 동적 범위 90.8, 사분 범위 0.248, 및 제곱합 (로그 바이어스) 12.8을 가졌다.

실시예 10: 조합 IGH VJ 및 DJ-증폭 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트에서 불균일 증폭능 (PCR 바이어스)의 보정

다양한 IgH 증폭 프라이머를 대상체로부터의 림프계 세포 DNA를 함유한 생물학적 샘플에서의 재배열된 IgH V 및 J 유전자 절편 및 IgH D 및 J 유전자 절편의 모든 가능한 조합을 증폭시키도록 설계하였다. 다양한 증폭 프라이머의 등몰 농도를 함유하는 제제를 다중 PCR에서 사용하여 일반식 (I)에 따른 IgH-특이적 주형 올리고뉴클레오티드의 등몰 농도를 포함하는 다양한 주형 조성물을 증폭시키고 여기서 1개 이상의 주형은 IgH 유전자자리에 대해 모든 가능한 V-J 조합 및 IgH 유전자자리에 대해 모든 가능한 D-J 조합을 나타낸다. 증폭 생성물을 정량적으로 서열분석하고 각각의 특유의 V-J 및 D-J 생성물 서열의 발생 빈도는 각각의 V-J 및 D-J 조합을 특유하게 동정하는 각각의 16 bp 분자 바코드 서열 (일반식 (I)에서의 B)의 발생 빈도로부터 수득하였다.

IMGT 콜라보레이션에 의해 주석이 달린 바와 같이, IgH 유전자자리의 모든 가능한 V 및 J 유전자 재배열 및 D 및 J 유전자 재배열을 증폭시키도록 다중 PCR 반응을 설계하였다. 유전자자리는 126개의 특유의 V 유전자; 52개의 기능성 유전자, 기능을 위한 중대 아미노산이 결여된 6개의 추정 개방 판독 프레임 및 69개의 위유전자; 및 9개의 J 유전자, 6개의 기능성 및 3개의 위유전자를 포함하였다. 유전자자리는 또한 27개의 특유의 D 유전자를 포함하였다. 프라이머 어닐링을 위한 표적 서열은 일부 V 절편에 대해 동일하였고, 이로써 86개의 특유의 정방향 프라이머를 사용한 모든 126개의 V 절편의 증폭이 가능하게 되었다. 유사하게, 7개의 특유의 역방향 프라이머가 모든 9개의 J 유전자에 어닐링되었다. D-J 검정을 위해, 프라이머를 재배열된 -DJ 스템(stem)에 어닐링되도록 설계하였다. B 세포 발생 동안, 대립유전자 둘 다 D 및 J유전자 절편 사이에서 재배열을 겪으며, 이로써 2개의 -DJ 스템이 초래되었다. -DJ 스템은 J 유전자, 1개의 N 영역, 및 D 유전자를 포함한다. DJ 재배열 후, 2개의 대립유전자 V 유전자 중 하나는 -DJ 스템으로 재배열되어 CDR3 유전자 영역 (VnDnJ)을 암호화한다. -DJ 스템을 증폭시키기 위해, 27 특유의 프라이머를 D 유전자 엑손의 상류의 인트론 영역에서 각각의 특이적 D 유전자에 어닐링되도록 설계하였다. 이들 절편은, -DJ 스템에 존재하는 동안, V에서 -DJ 재배열 후 절제된다. 그러나, J 프라이머를 재설계하지 않았고; DJ 검정은 VJ 검정과 동일한 J 프라이머를 사용하였다.

바이어스 평가를 위한 기준치로서, 86개의 V 정방향 프라이머 (VF; V 유전자에 특이적), 27개의 D 정방향 프라이머 (DF; D 유전자에 특이적)의 최적화 (믹스 2-1) 풀 및 7개의 J 역방향 프라이머 (JR; J 유전자에 특이적)의 등몰 풀을 사용하여 1359개의 주형의 풀을 증폭시켰다. 중합효소 연쇄 반응 (PCR) (각각 25 μL)을 1.0 μM VF, 1.0 μM DF, 및 2.0 μM JR 풀 (인테그레이티드 DNA 테크놀로지즈), 1 X 퀴아젠 멀티플렉스 플러스 PCR 마스터 믹스 (퀴아젠, 캘리포니아주 발렌시아), 10% Q- 용액 (퀴아젠), 및 본 출원인의 합성 IgH VJ 및 DJ 레퍼토리 믹스로부터의 200,000개의 표적 분자에서 설정하였다. C100 열 사이클러 (바이오-래드 라보라토리즈, 캘리포니아주 헬큘리즈)에서 하기 열 사이클 조건을 사용하였다: 95℃에서 6분 동안 1회 사이클, 95℃에서 30초 동안, 64℃에서 120초 동안 및 72℃에서 90초 동안 31회 사이클, 이어서 72℃에서 3분 동안 1회 사이클. 모든 실험을 위해, 각각의 PCR 조건을 3회 반복실험하였다.

초기 바이어스 평가 후, 실험을 수행하여 모든 개별 프라이머 증폭 특성을 규정하였다. 본 출원인의 DF 및 JR 프라이머의 특이성을 측정하기 위해, 단일 DF 프라이머와 모든 JR 프라이머 및 이전에 동정된 최적화 VF 풀을 함유하는 27종의 혼합물, 및 단일 JR 프라이머와 모든 VF 및 DR 프라이머를 함유하는 7종의 혼합물을 제조하였다. 이들 프라이머 세트를 사용하여 합성 주형을 증폭시키고 생성된 라이브러리를 서열분석하여 표적화 V, D 또는 J 유전자 절편에 대한 각각의 프라이머의 특이성을 측정하고, 표적 이탈 프라이밍의 경우를 동정하였다.

VF 프라이머의 최적화된 믹스를 포함하여, 모든 다른 프라이머의 맥락 내에서 각각의 개별 DF 또는 JF의 2배 및 4배 농도의 풀 (예를 들어, 2x-배 IgHD2-08 + 모든 다른 등몰의 DF, 최적 VF 믹스, 및 JR 프라이머)을 사용하여 적정 실험을 수행하여 본 출원인이 프라이머 농도를 관찰된 주형 빈도와 관련시키는 스케일링 인자를 평가가능하도록 하였다.

프라이머 믹스 최적화

교차 증폭 시험을 사용하여, DF 프라이머를 교차 증폭된 것으로서 동정하였다. DF 프라이머 중 12개를 제거하고, 이로써 15개의 DF 프라이머의 최종 풀이 초래되었다. 프라이머를 차례로 적정함으로써 유래된 스케일링 인자를 사용하여, 대안적 프라이머 믹스를 발생시켰으며, 여기서 프라이머를 불균등 농도로 조합하여 증폭 바이어스를 최소화하였다. 그 다음, 수정된 프라이머 믹스를 사용하여 주형 풀을 증폭시키고 잔존 증폭 바이어스를 측정하였다. 각각의 프라이머 농도를 그 프라이머에 의해 증폭된 주형이 이전 라운드의 결과에서 과다 표시 또는 과소 표시되었는지의 여부를 기반으로 적절하게 감소 또는 증가시켜 이 과정을 되풀이하였다. 이러한 반복 과정의 각 단계에서, 증폭 바이어스의 전체 정도를, 제곱합 (SS, 로그(바이어스) 값에 대해 계산됨) 및 동적 범위 (최대 바이어스/최소 바이어스)의 메트릭스를 계산함으로써 측정하고, 반복 사이에 최소한의 개선이 있을 때까지 프라이머 농도를 조정하는 과정을 되풀이하였다. 최종 프라이머 믹스는 등몰 프라이머 믹스보다 실질적으로 적은 프라이머 바이어스를 갖는다.

도 12는 상대적 증폭 바이어스에 대해 그래프로 나타낸 합성 IGH VJ 주형에 대한 IGH 프라이머 반복을 나타낸다. 화학적 바이어스 제어 보정 이전에 (등몰 프라이머 (흑색)), 화학적 보정 후 (최적화 프라이머 (암회색), 및 화학적 및 컴퓨터에 의한 보정 후 (컴퓨터에 의한 조정후 (담회색)) 1116개의 합성 IGH VJ 주형 상대적 증폭 바이어스에 대해 상대적 증폭 바이어스를 측정하였다. 등몰 프라이머는 동적 범위 1130, 사분 범위 0.991, 및 제곱합 (로그 바이어스) 233을 가졌다. 최적화 프라이머는 동적 범위 129, 사분 범위 0.732, 및 제곱합 (로그 바이어스) 88.2를 가졌다. 컴퓨터에 의한 조정후 프라이머는 동적 범위 76.9, 사분 범위 0.545, 및 제곱합 (로그 바이어스) 37.9를 가졌다.

도 13은 V 유전자의 27개의 합성 IGH DJ 주형에 대한 상대적 증폭 바이어스를 나타낸다. V 유전자 절편의 상대적 증폭 바이어스는 3회 프라이머 반복으로 나타낸다: 1) 화학적 바이어스 제어 보정 이전에 (흑색), 2) 화학적 보정의 1회 반복 (백색), 및 3) 화학적 보정의 2회 반복 후 (담회색).

실시예 11: TCRG VJ 프라이머 반복

다른 실시양태에서, TCRG VJ 프라이머를 다중 프라이머 반복에서 상대적 증폭 바이어스에 대해 시험하였다. 도 14a-d는 55개의 합성 TCRG VJ 주형에 대한 TCRG-프라이머 반복을 나타낸다. 화학적 바이어스 제어 보정 이전에 (도 14a), 화학적 보정의 1회 반복 (도 14b), 화학적 보정의 2회 반복 (도 14c), 및 화학적 보정의 최종 반복 (도 14d) TCRG VJ 프라이머에 대해 상대적 증폭 바이어스를 측정하였다.

실시예 12: 대안적 바이어스 제어 및 스파이크-인 방법

다른 실시양태에서, 대안적 방법을 사용하여 증폭 바이어스를 측정할 수 있다. 방법의 두 가지 주요 목표는 다음과 같다: (1) BCR 또는 TCR 유전자의 다중 PCR 증폭에서 증폭 바이어스를 제거하는 것 및 (2) 개시 주형에서 B 또는 T 세포의 분율을 추정하는 것.

방법은 B 및/또는 T 세포를 포함하는 샘플로부터 추출된 DNA, 또는 cDNA 를 포함하는 세포의 세트로 개시하는 것을 포함한다. 세포를 포함하는 샘플에서, DNA는 본 기술분야에서의 방법 표준을 사용하여 추출한다.

추출된 DNA를 다수개의 부분으로 분할하고 상이한 PCT 웰에 투입한다. 일부 실시양태에서, 1개의 웰을 사용하여 용량을 채우거나 수천개의 웰을 사용할 수 있다. 한 실시양태에서, 188개의 웰을 PCR (2개의 96 웰 플레이트)용으로 사용한다. 동일 웰에서 동일 클론형으로부터 다수의 분자를 갖는 일이 드물도록, 웰당 TCR 또는 BCR 주형의 수는 희소(sparse)해야 한다.

그 다음, 방법은 프라이머의 동일한 다중 세트를 사용하여 각각의 웰에서 DNA를 별도로 증폭시키는 것을 포함한다. 본원에 기재된 프라이머의 세트를 사용할 수 있다. 상기 기재된 바와 같이, 바 코딩 방법을 동일 바코드 서열로 각각의 웰에서의 증폭된 분자에 적용한다. 예를 들어, 각각의 웰은 그 자체의 바코드를 얻는다.

그 다음 분자를 고 처리량 서열분석기 상에서 충분량의 증폭된 BCR 또는 TCR 서열과 함께 서열분석하여 사용된 V 및 J 쇄의 서열뿐만 아니라 바코드 서열에 의해서도 동정한다.

각각의 웰은 평균 카피 수를 갖는다. 각각의 클론형이 웰에 1회 발현하기 때문에, 평균에 비해 그 주형의 양은 그 V-J 조합에 대한 바이어스이다. V 및 J 바이어스는 독립적이기 때문에, 모든 V-J 조합이 바이어스를 측정하는데 필요한 것은 아니다. 그 다음 이들 상대 바이어스를 사용하여 매우 과소 증폭 또는 과다 증폭인 프라이머를 재설계하거나 증폭을 증가 또는 감소시키기 위해 프라이머 농도를 적정한다. 새로운 프라이머 로트(lot)를 사용하여 전 과정을 반복하고 되풀이하여 계속 바이어스를 감소시킨다.

반복의 임의의 사이클 후, 컴퓨터적 인자 (상대 증폭 인자)의 세트를 적용하여 바이어스를 제거할 수 있다. 바이어스는 프라이머 변화 및 컴퓨터에 의한 보정 둘 다 (또는 둘 중 하나)에 의해 감소될 수 있다.

방법은 유사한 검정으로부터 핵화 세포의 분율을 컴퓨터처리하는 것을 포함한다. 각각의 웰에 대해, 각각의 클론형을 동정하고, 서열분석 판독의 수를 각각의 클론에 대해 측정한다. 일부 실시양태에서, 주형의 수가 희소할 필요는 없다. 각각의 클론에 대한 판독 카운트를 상기 기재된 바와 같은 바이어스 제어 인자에 의해 보정한다.

보정된 판독 카운트의 히스토그램을 창출하고, 그래프는 프라이머리 모드(primary mode) (증폭 인자)를 갖는다. 이러한 모드는 검사 (제1의 큰 영역의 동정을 기반으로 한다)에 의해, 또는 푸리에 변환, 또는 다른 공지된 방법에 의해 동정된다.

각각의 웰에서의 보정된 판독의 총수를 그 웰에 대한 증폭 인자로 나눈다. 이는 웰에 있는 TCR 또는 BCR 게놈 주형의 추정수이다. 샘플로부터의 BCR 또는 TCR의 총수는 모든 웰로부터의 수의 합계이다. 각각의 웰 중 게놈의 총수는 PCR 이전에 측정한다. 이는 나노드롭(nanodrop), 또는 DNA를 정량화하는데 사용된 다른 공지된 방법에 의해 행할 수 있다. DNA의 측정 중량을 이중 가닥 게놈의 중량 (예를 들어, 인간에서 ~6.2 피코 그램)으로 나눈다.

샘플 중 B 세포 또는 T 세포의 분율은 반응에 부가된 이중 가닥 DNA 분자의 총수로 나눠진 샘플 중 BCR 또는 TCR의 총수이다. T 세포의 작은 분율이 재배열된 두 대립유전자를 갖고 있으므로 결과는 경미한 수정을 필요로 한다. 이러한 수정 인자는 알파 베타 T 세포에 대해 대략 15%, B 세포에 대해 10%이다. 감마 델타 T 세포에 대해, 거의 모든 세포가 재배열된 두 대립유전자를 갖고, 따라서 수정은 2의 배수이다.

이들 추가의 방법은 BCR 또는 TCR 유전자의 다중 PCR 증폭에서의 증폭 바이어스를 측정할 수 있고 개시 주형에서의 B 또는 T 세포의 분율을 추정하는데 사용될 수 있다.

상기 기재된 다양한 실시양태를 조합하여 추가 실시양태를 제공할 수 있다. 본 명세서에서 언급되고/거나 출원 데이터 시트에 열거된 미국 특허, 미국 특허 출원 공개, 미국 특허 출원, 외국 특허, 외국 특허 출원 및 비특허 간행물은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 실시양태의 측면은, 필요한 경우 수정되어 또 다른 추가 실시양태를 제공하기 위해 다양한 특허, 출원 및 간행물의 개념을 이용할 수 있다.

상기-상세한 설명의 관점에서 실시양태에 대해 이들 및 다른 변화가 이루어질 수 있다. 일반적으로, 하기 특허청구범위에서, 사용된 용어는 명세서 및 특허청구범위에 개시된 구체적 실시양태로 특허청구범위를 제한하는 것으로 이해되어야 하는 것이 아니라, 이러한 특허청구범위가 부여되는 등가물의 전체 범위에 따라 모든 가능한 실시양태를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 특허청구범위는 개시내용에 의해 제한되지 않는다.

비공식 서열 목록

SEQUENCE LISTING <110> ADAPTIVE BIOTECHNOLOGIES CORPORATION <120> COMPOSITIONS AND METHOD FOR MEASURING AND CALIBRATING AMPLIFICATION BIAS IN MULTIPLEXED PCR REACTIONS <130> IPA140899-US <150> 61/726,489 <151> 2012-11-14 <150> 61/644,294 <151> 2012-05-08 <160> 6616 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 1 gcctccctcg cgccatcaga gagtgtcacg tgtgtctgtg gacccacttt tccctgtgac 60 ggatctgcaa aagaacctga aaaatgtctt acctacaact gtgagtctgg tgccttgtcc 120 aaagaaagct tcagtgtcga cagagtgtca cgtgtgttca ctgctggtgc agagatacgc 180 agctgagtct tcttgctgca gtgcgaccac atgaaggtat aagcgagagc tgtcagggca 240 ttcaggtgtg aagtgatttg gcacagtctt gttttcaatg aattccttac agttgtagta 300 aaacatgaac tccagggatt tcttagcttt ctgtctgtac caatacatag aatcatgtcc 360 cagatgctca cgtttcattg tccttttact ccccattgct gtgaccaggt attttggtgt 420 ctgggtaatt ccagtatcca tggagcctat gaaaataaga agagtgtcac 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Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 14 gcctccctcg cgccatcaga gagtgtctcc gtctactgtg gacccacttt tccctgtgac 60 ggatctgcaa aagaacctga aaaatgtctt acctacaact gtgagtctgg tgccttgtcc 120 aaagaaagct tcagtgtcga cagagtgtct ccgtctatca ctgctggcac agaagtacat 180 ggctgagtcc tccagctttg tggaccggat cttcagagtg aaatttgatc catcaggcct 240 ttcaactgag aattgatcat cgaatatttc agacttctct gagatttcat tattataaaa 300 ggaaaccaga aactcgactt tctgccccaa gatttgtctg taccaataga agtataagtg 360 attagagatg gggacacagc gcaagatcac ttcctgtccc atctgtgtga cctgatggct 420 gggagtctgg gtgacttcag gttctgtgag tcctgtgaga agagtgtctc cgtctactga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 15 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 15 gcctccctcg cgccatcagg ttccgaatcc gtctaatttc ccaggacaga gtcctccctc 60 atcgcacccc tcctagagac ccccagcctt acctacaacg gttaacctgg tccccgaacc 120 gaaggtgtag ccatagtcga cgttccgaat ccgtctatca ctgctggcac agaagtacat 180 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polynucleotide" <400> 18 gcctccctcg cgccatcagg acactcttcc gtctaagaga actctgcctt caagggacaa 60 tggccatacc accctgattc tgcaacttac ctaggatgga gagtcgagtc ccatcaccaa 120 aatgctgggg ctgatgtcga cgacactctt ccgtctatca ctgctggcac agaagtacat 180 ggctgagtcc tccagctttg tggaccggat cttcagagtg aaatttgatc catcaggcct 240 ttcaactgag aattgatcat cgaatatttc agacttctct gagatttcat tattataaaa 300 ggaaaccaga aactcgactt tctgccccaa gatttgtctg taccaataga agtataagtg 360 attagagatg gggacacagc gcaagatcac ttcctgtccc atctgtgtga cctgatggct 420 gggagtctgg gtgacttcag gttctgtgag tcctgtgaga gacactcttc cgtctactga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 19 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 19 gcctccctcg cgccatcagt tcggaactcc gtctaatcat tgcagtcaaa cccaggcacc 60 cccgagtcaa gagtggagcc cccatacctg tcacagtgag cctggtcccg ttcccaaagt 120 ggaggggtga attatgtcga cttcggaact ccgtctatca ctgctggcac agaagtacat 180 ggctgagtcc tccagctttg 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/note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 99 gcctccctcg cgccatcagg tctcctacag tccaacctct gcccatcccg ccctctcgga 60 gctctccgga gccccaaccg cctccttacc cagtacggtc agcctagagc cttctccaaa 120 aaacagctcc ccggtgtcga cgtctcctac agtccaatca tgctggcgca aagataaagg 180 gccgagtccc ccagctccaa ggtgctcaca ttcatctcag agcgagagtt agagaactgg 240 cgccctgaga atcgaccagg gaagtttcct ttgtttctct gtgtctcact gaagtattca 300 aagaggaact gaaggccctg tcctggggtc tgttggtacc aggatacact cctatgccca 360 gagatagggg agcagctcag tgtcacttgc tgtcctctcg ttttgatcag atatcttgga 420 gtttgagtga ctccagcctt tactgggcct gtgggaaaag gtctcctaca gtccaactga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 100 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 100 gcctccctcg cgccatcagg tagacaccag tccaagcgtc ccggggcgcc ccctccccag 60 ttccggggct tcagcgggag cccccgctta ccgagcactg tcagccgggt gcctgggcca 120 aaatactgcg tatctgtcga cgtagacacc agtccaatca 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of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 138 gcctccctcg cgccatcagg tctcctagga tcatccctct gcccatcccg ccctctcgga 60 gctctccgga gccccaaccg cctccttacc cagtacggtc agcctagagc cttctccaaa 120 aaacagctcc ccggtgtcga cgtctcctag gatcatctca tgctggcaca gagatacagg 180 gccgagtcgt ccagctccaa ggcgttcaca ttcagctcag agctataatt agggaactgg 240 agacctgaga atctaggagg gaagtttcct ctgccattct cttcctccct ataatactga 300 aagataaact ggggcccctg acccagggcc tgttggtacc aggacacagt gttgtgccca 360 gactgagaag agcatctcag agtcacttgc tgtcctctcg ttttgatcag gtgtgtggga 420 ctttgggtga ctccagtctc cactgagcct gtgggaaaag gtctcctagg atcatcctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 139 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 139 gcctccctcg cgccatcagg tagacacgga tcatcgcgtc ccggggcgcc ccctccccag 60 ttccggggct tcagcgggag cccccgctta ccgagcactg tcagccgggt gcctgggcca 120 aaatactgcg tatctgtcga cgtagacacg gatcatctca tgctggcaca 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Synthetic polynucleotide" <400> 142 gcctccctcg cgccatcagc gccaatagga tcatcccgcc gccttccacc tgaatcccgc 60 cgcccgggtg gtcccgcgaa aactcaccca gcacggtcag cctgctgccg gccccgaaag 120 tcaggacgtt ggcccgtcga ccgccaatag gatcatctca tgctggcaca gagatacagg 180 gccgagtcgt ccagctccaa ggcgttcaca ttcagctcag agctataatt agggaactgg 240 agacctgaga atctaggagg gaagtttcct ctgccattct cttcctccct ataatactga 300 aagataaact ggggcccctg acccagggcc tgttggtacc aggacacagt gttgtgccca 360 gactgagaag agcatctcag agtcacttgc tgtcctctcg ttttgatcag gtgtgtggga 420 ctttgggtga ctccagtctc cactgagcct gtgggaaaag cgccaatagg atcatcctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 143 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 143 gcctccctcg cgccatcagt caagcctgga tcatcccacc ctccgactcc ggggaccgag 60 gggctggaag gtggggagac gcccgaatct cacctgtgac cgtgagcctg gtgcccggcc 120 cgaagtactg ctcgtgtcga ctcaagcctg gatcatctca tgctggcaca gagatacagg 180 gccgagtcgt 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<213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 165 gcctccctcg cgccatcagg tagacacagg cttgagcgtc ccggggcgcc ccctccccag 60 ttccggggct tcagcgggag cccccgctta ccgagcactg tcagccgggt gcctgggcca 120 aaatactgcg tatctgtcga cgtagacaca ggcttgatca tgctggcaca gagatagagg 180 gccgagtccc ccagcaacaa ggcgttcaca ttcagctcag agctatagtt agggaactgg 240 tgacctgaga atcgatcagg gaagttgcct ctctgtctct cttcctcctc ataatactga 300 aagataaact ggggcccctg acccagggcc tgttggtacc aggacacagt gtcatgccca 360 gacttaggag agcatctcag agtcacttgc tgtcctctcg ttttgatcag gtgtgtggga 420 ctttgggtga ctccagcgtc cactaagcct gtgggaaaag gtagacacag gcttgactga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 166 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 166 gcctccctcg cgccatcagc actgtacagg cttgacgcac aaaaacccga gcgcagtctc 60 gtccccggtc ccccggcggc cccagcttac ccagcactga gagccgggtc 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of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 173 gcctccctcg cgccatcagt aggagacaca cacgtctcct ggaactccga ccttatgata 60 cactatcccg aaagaagtct tttacatacc caagacagag agctgggttc cactgccaaa 120 aaacagtttt tcattgtcga ctaggagaca cacacgttca tgctggcaca gagatagagg 180 gccgagtccc ctagcaacaa ggcgttcaca ttcagctcag agctatagtt agggaactgg 240 tgacctgaga attgatcagg gaagtttcct cttcctctct cttctttctc ataatactga 300 aagataaact ggggcccctg acccagggcc tgttggtacg aggacacact ggtgtgccca 360 gagataggag agcatctcag agtcacgtgc tgtcctctcg ttttgatcag gtgtgtggga 420 ctttgggtga ctccagcgtc cactgggcct gtgggaaaag taggagacac acacgtctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 174 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 174 gcctccctcg cgccatcagg acactctaca cacgtagaga actctgcctt caagggacaa 60 tggccatacc accctgattc tgcaacttac ctaggatgga gagtcgagtc ccatcaccaa 120 aatgctgggg ctgatgtcga cgacactcta cacacgttca tgctggcaca 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of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 208 gcctccctcg cgccatcagt caagcctcag ctcttccacc ctccgactcc ggggaccgag 60 gggctggaag gtggggagac gcccgaatct cacctgtgac cgtgagcctg gtgcccggcc 120 cgaagtactg ctcgtgtcga ctcaagcctc agctctttca ctgctggcac agaagtacac 180 agatgtctgg gagggagcag ccgactccag cctgagcgag aactcccgtt tgtttaatct 240 ggagacattg tagccattgg ggacttctcc tttgtcagtg gtaccctcag aagctgagta 300 ataaatcagc ctcagtccca tgcctgggtc ttgtcgatac cagtacatgg agttatggtt 360 catatcctgg gcacactgca gtgtcatgct ctgtcctgtc ttcaggacct ggaattttgg 420 ggtctgagtg acaccagcat tcactggacc tgcagagaag tcaagcctca gctcttctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 209 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 209 gcctccctcg cgccatcaga gagtgtcgag cgatactgtg gacccacttt tccctgtgac 60 ggatctgcaa aagaacctga aaaatgtctt acctacaact gtgagtctgg tgccttgtcc 120 aaagaaagct tcagtgtcga cagagtgtcg agcgatatca ctgctggcac 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Synthetic polynucleotide" <400> 212 gcctccctcg cgccatcagt aggagacgag cgatactcct ggaactccga ccttatgata 60 cactatcccg aaagaagtct tttacatacc caagacagag agctgggttc cactgccaaa 120 aaacagtttt tcattgtcga ctaggagacg agcgatatca ctgctggcac agaagtacac 180 agatgtttgg gagggagcag ccgactccaa ccccagcagg aaattctgtt tttttaatct 240 ggagacattg tagccatcag ggacctctcc tttggcagtt gtaccctcac caactgagta 300 atgaatcagc ctcagcccca tgcctgggtc ttgtcgatac cagtacatgt attcatggtt 360 catatcctgg gcacacagca gtgtcatgct ctgtcctgtc ttcaggaccc ggaattttgg 420 ggtctgagtg acaccagcat tcactggacc tgcagagaag taggagacga gcgatactga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 213 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 213 gcctccctcg cgccatcagg acactctgag cgataagaga actctgcctt caagggacaa 60 tggccatacc accctgattc tgcaacttac ctaggatgga gagtcgagtc ccatcaccaa 120 aatgctgggg ctgatgtcga cgacactctg agcgatatca ctgctggcac agaagtacac 180 agatgtttgg 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<400> 216 gcctccctcg cgccatcagg tctcctagag cgatacctct gcccatcccg ccctctcgga 60 gctctccgga gccccaaccg cctccttacc cagtacggtc agcctagagc cttctccaaa 120 aaacagctcc ccggtgtcga cgtctcctag agcgatatca ctgctggcac agaagtacac 180 agatgtttgg gagggagcag ccgactccaa ccccagcagg aaattctgtt tttttaatct 240 ggagacattg tagccatcag ggacctctcc tttggcagtt gtaccctcac caactgagta 300 atgaatcagc ctcagcccca tgcctgggtc ttgtcgatac cagtacatgt attcatggtt 360 catatcctgg gcacacagca gtgtcatgct ctgtcctgtc ttcaggaccc ggaattttgg 420 ggtctgagtg acaccagcat tcactggacc tgcagagaag gtctcctaga gcgatactga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 217 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 217 gcctccctcg cgccatcagg tagacacgag cgatagcgtc ccggggcgcc ccctccccag 60 ttccggggct tcagcgggag cccccgctta ccgagcactg tcagccgggt gcctgggcca 120 aaatactgcg tatctgtcga cgtagacacg agcgatatca ctgctggcac agaagtacac 180 agatgtttgg gagggagcag ccgactccaa 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<213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 235 gcctccctcg cgccatcaga gagtgtctgc tacacctgtg gacccacttt tccctgtgac 60 ggatctgcaa aagaacctga aaaatgtctt acctacaact gtgagtctgg tgccttgtcc 120 aaagaaagct tcagtgtcga cagagtgtct gctacactca ctgctggcac agaagtacac 180 agatgtctga gagggtacag cagacgccaa cgtgaggggg aaatcatctg tgtttgctct 240 ggagacacta taaccatcag ggacttctcc tttgccagtg gtacctgcag tatttgaata 300 atggatgagc cttagcccca gtcctagatc ttgtctatac cagtacatgg cattatgtct 360 catatcctgg gtacatctca gtgtcatgcg ccgtcctgct gccaggatct gagatgttgg 420 tgcctgggtg atcccagcaa tcactggacc tacagagaag agagtgtctg ctacacctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 236 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 236 gcctccctcg cgccatcagg ttccgaatgc tacacatttc ccaggacaga gtcctccctc 60 atcgcacccc tcctagagac ccccagcctt acctacaacg gttaacctgg 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of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 243 gcctccctcg cgccatcagg tagacactgc tacacgcgtc ccggggcgcc ccctccccag 60 ttccggggct tcagcgggag cccccgctta ccgagcactg tcagccgggt gcctgggcca 120 aaatactgcg tatctgtcga cgtagacact gctacactca ctgctggcac agaagtacac 180 agatgtctga gagggtacag cagacgccaa cgtgaggggg aaatcatctg tgtttgctct 240 ggagacacta taaccatcag ggacttctcc tttgccagtg gtacctgcag tatttgaata 300 atggatgagc cttagcccca gtcctagatc ttgtctatac cagtacatgg cattatgtct 360 catatcctgg gtacatctca gtgtcatgcg ccgtcctgct gccaggatct gagatgttgg 420 tgcctgggtg atcccagcaa tcactggacc tacagagaag gtagacactg ctacacctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 244 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 244 gcctccctcg cgccatcagc actgtactgc tacaccgcac aaaaacccga gcgcagtctc 60 gtccccggtc ccccggcggc cccagcttac ccagcactga gagccgggtc ccggcgccga 120 agtactgaat gttttgtcga ccactgtact gctacactca ctgctggcac 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<400> 251 gcctccctcg cgccatcagt aggagacaac tgccactcct ggaactccga ccttatgata 60 cactatcccg aaagaagtct tttacatacc caagacagag agctgggttc cactgccaaa 120 aaacagtttt tcattgtcga ctaggagaca actgccatca ctgctggcac agaagtacac 180 agatgtctgg gagggagcag ccgacagcag cctgagcggg aaatcctctg tggttgatct 240 ggagacattg tagccattgg ggacttctcc ttggtcagtg ataccagcac caactgagta 300 atgaatcagc ctcagcccca tgcctgggtc ttgtcgatac caggacatgt attcatggtt 360 catatcctgg gcacactgca gtgtcatgct ctgtcctgtc ttcaggacct ggaattttgg 420 ggtctgagtg acaccagcat tcactggacc tgcagagaag taggagacaa ctgccactga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 252 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 252 gcctccctcg cgccatcagg acactctaac tgccaagaga actctgcctt caagggacaa 60 tggccatacc accctgattc tgcaacttac ctaggatgga gagtcgagtc ccatcaccaa 120 aatgctgggg ctgatgtcga cgacactcta actgccatca ctgctggcac agaagtacac 180 agatgtctgg gagggagcag ccgacagcag 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<213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 270 gcctccctcg cgccatcagc actgtacttg gactgcgcac aaaaacccga gcgcagtctc 60 gtccccggtc ccccggcggc cccagcttac ccagcactga gagccgggtc ccggcgccga 120 agtactgaat gttttgtcga ccactgtact tggactgtca ctgctggcac agaagtacac 180 agatgtctgg gagggagcag ccaactccag cctgagcggg aaatcctctg tggttgatct 240 ggagacgttg tagccattcg ggacttctcc tttatcagtg ataccagcac caactgaata 300 ataaatcagc ttcagcccca tgcctgggtc ttgtcgatac cagtacatgt agttatggtt 360 catatcctgg gtacactgca gtgtcatgct ctgtcctatc ttcaggatgc ggaattttgg 420 ggtctgagtg acaccagcat tcactggacc tgcagagaag cactgtactt ggactgctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 271 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 271 gcctccctcg cgccatcagg atgatccttg gactgccccg caaaaaccag acccaagccg 60 cccgcgcccg cgccccagca gcccgcgctc accgagcacc aggagccgcg 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<221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 274 gcctccctcg cgccatcaga gagtgtccgt acgtactgtg gacccacttt tccctgtgac 60 ggatctgcaa aagaacctga aaaatgtctt acctacaact gtgagtctgg tgccttgtcc 120 aaagaaagct tcagtgtcga cagagtgtcc gtacgtatca ctgctggcac agaagtaaac 180 agaagtctga gagggagcag ctgactccag cttgaggggg aaatcctctg tgtttgatct 240 ggagacattg tagccattgg gaacttctcc tttgtcagtg agagcagcag caactgagta 300 gtaaatcagc ctcagcccct tgcctgggtc ttgtcgatac cgatacatgt attcatggtt 360 catatcctgg gcacacagca gagtcatgct ctgtcctgtc ttcaggacgt ggaattttgg 420 ggtctgagtg acaccagcat tcattggacc tgcagggaag agagtgtccg tacgtactga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 275 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 275 gcctccctcg cgccatcagg ttccgaacgt acgtaatttc ccaggacaga gtcctccctc 60 atcgcacccc tcctagagac ccccagcctt acctacaacg gttaacctgg tccccgaacc 120 gaaggtgtag ccatagtcga 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of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 278 gcctccctcg cgccatcagg acactctcgt acgtaagaga actctgcctt caagggacaa 60 tggccatacc accctgattc tgcaacttac ctaggatgga gagtcgagtc ccatcaccaa 120 aatgctgggg ctgatgtcga cgacactctc gtacgtatca ctgctggcac agaagtaaac 180 agaagtctga gagggagcag ctgactccag cttgaggggg aaatcctctg tgtttgatct 240 ggagacattg tagccattgg gaacttctcc tttgtcagtg agagcagcag caactgagta 300 gtaaatcagc ctcagcccct tgcctgggtc ttgtcgatac cgatacatgt attcatggtt 360 catatcctgg gcacacagca gagtcatgct ctgtcctgtc ttcaggacgt ggaattttgg 420 ggtctgagtg acaccagcat tcattggacc tgcagggaag gacactctcg tacgtactga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 279 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 279 gcctccctcg cgccatcagt tcggaaccgt acgtaatcat tgcagtcaaa cccaggcacc 60 cccgagtcaa gagtggagcc cccatacctg tcacagtgag cctggtcccg ttcccaaagt 120 ggaggggtga attatgtcga cttcggaacc gtacgtatca ctgctggcac 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Synthetic polynucleotide" <400> 282 gcctccctcg cgccatcagg tagacaccgt acgtagcgtc ccggggcgcc ccctccccag 60 ttccggggct tcagcgggag cccccgctta ccgagcactg tcagccgggt gcctgggcca 120 aaatactgcg tatctgtcga cgtagacacc gtacgtatca ctgctggcac agaagtaaac 180 agaagtctga gagggagcag ctgactccag cttgaggggg aaatcctctg tgtttgatct 240 ggagacattg tagccattgg gaacttctcc tttgtcagtg agagcagcag caactgagta 300 gtaaatcagc ctcagcccct tgcctgggtc ttgtcgatac cgatacatgt attcatggtt 360 catatcctgg gcacacagca gagtcatgct ctgtcctgtc ttcaggacgt ggaattttgg 420 ggtctgagtg acaccagcat tcattggacc tgcagggaag gtagacaccg tacgtactga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 283 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 283 gcctccctcg cgccatcagc actgtaccgt acgtacgcac aaaaacccga gcgcagtctc 60 gtccccggtc ccccggcggc cccagcttac ccagcactga gagccgggtc ccggcgccga 120 agtactgaat gttttgtcga ccactgtacc gtacgtatca ctgctggcac agaagtaaac 180 agaagtctga 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of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 313 gcctccctcg cgccatcaga gagtgtcact gctacctgtg gacccacttt tccctgtgac 60 ggatctgcaa aagaacctga aaaatgtctt acctacaact gtgagtctgg tgccttgtcc 120 aaagaaagct tcagtgtcga cagagtgtca ctgctactca ctgctggcac agagatacac 180 agccaagtcc ccctgctgtg tgcgctggaa cttcagagtg gagatggatc cctcagacct 240 ctgtgcagag aaccgatcac ggggaagccc cgatttgtct gctgcatcct tgccttggaa 300 gtaaattgga aactccaggc cctgccccag gctctgtcgg taccaataaa gggcattatg 360 acctgaaatt ggatcatatc tgagagctac atcctttccc ttctttgcta ccttgtgtct 420 cagggactgg gagactccag cacctgtgtg atctgtggag agagtgtcac tgctacctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 314 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 314 gcctccctcg cgccatcagg ttccgaaact gctacatttc ccaggacaga gtcctccctc 60 atcgcacccc tcctagagac ccccagcctt acctacaacg gttaacctgg tccccgaacc 120 gaaggtgtag ccatagtcga cgttccgaaa ctgctactca ctgctggcac 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Synthetic polynucleotide" <400> 317 gcctccctcg cgccatcagg acactctact gctacagaga actctgcctt caagggacaa 60 tggccatacc accctgattc tgcaacttac ctaggatgga gagtcgagtc ccatcaccaa 120 aatgctgggg ctgatgtcga cgacactcta ctgctactca ctgctggcac agagatacac 180 agccaagtcc ccctgctgtg tgcgctggaa cttcagagtg gagatggatc cctcagacct 240 ctgtgcagag aaccgatcac ggggaagccc cgatttgtct gctgcatcct tgccttggaa 300 gtaaattgga aactccaggc cctgccccag gctctgtcgg taccaataaa gggcattatg 360 acctgaaatt ggatcatatc tgagagctac atcctttccc ttctttgcta ccttgtgtct 420 cagggactgg gagactccag cacctgtgtg atctgtggag gacactctac tgctacctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 318 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 318 gcctccctcg cgccatcagt tcggaacact gctacatcat tgcagtcaaa cccaggcacc 60 cccgagtcaa gagtggagcc cccatacctg tcacagtgag cctggtcccg ttcccaaagt 120 ggaggggtga attatgtcga cttcggaaca ctgctactca ctgctggcac agagatacac 180 agccaagtcc 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<213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 340 gcctccctcg cgccatcagg ttccgaaact gtggaatttc ccaggacaga gtcctccctc 60 atcgcacccc tcctagagac ccccagcctt acctacaacg gttaacctgg tccccgaacc 120 gaaggtgtag ccatagtcga cgttccgaaa ctgtggatca ctgctggcac agagatacac 180 ggctgagtcc ccccgctctg tgcgctggat cttcagagta gagacggatc cctcaggcct 240 gactgcaaag aaccgatcgt tgggcagccc tgagtcatct gccgcacccg tgccttggaa 300 gtaaattaga aactctgggc cctgccccag gctttgtcgg taccagtaaa gggcagtatg 360 acctgaaatt ggatcacacc tgagctctac atattttccc ttctctgtga ccttgttact 420 gggggtctgg gagactccag cacctgtgtg atctgcggag gttccgaaac tgtggactga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 341 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 341 gcctccctcg cgccatcagc gttacttact gtggactgga ttccagcccc tttttgcaag 60 ttcccagctg tccagccttg acttactcac ctacaacagt gagccaactt 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of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 348 gcctccctcg cgccatcagc actgtacact gtggacgcac aaaaacccga gcgcagtctc 60 gtccccggtc ccccggcggc cccagcttac ccagcactga gagccgggtc ccggcgccga 120 agtactgaat gttttgtcga ccactgtaca ctgtggatca ctgctggcac agagatacac 180 ggctgagtcc ccccgctctg tgcgctggat cttcagagta gagacggatc cctcaggcct 240 gactgcaaag aaccgatcgt tgggcagccc tgagtcatct gccgcacccg tgccttggaa 300 gtaaattaga aactctgggc cctgccccag gctttgtcgg taccagtaaa gggcagtatg 360 acctgaaatt ggatcacacc tgagctctac atattttccc ttctctgtga ccttgttact 420 gggggtctgg gagactccag cacctgtgtg atctgcggag cactgtacac tgtggactga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 349 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 349 gcctccctcg cgccatcagg atgatccact gtggaccccg caaaaaccag acccaagccg 60 cccgcgcccg cgccccagca gcccgcgctc accgagcacc aggagccgcg tgcctggccc 120 gaagtactgg gtctcgtcga cgatgatcca ctgtggatca ctgctggcac 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Synthetic polynucleotide" <400> 352 gcctccctcg cgccatcaga gagtgtcggt gtcatctgtg gacccacttt tccctgtgac 60 ggatctgcaa aagaacctga aaaatgtctt acctacaact gtgagtctgg tgccttgtcc 120 aaagaaagct tcagtgtcga cagagtgtcg gtgtcattca ctgctggcac agagatacac 180 agctgagtcc ccctgctctg tgcgctggat cttcagagtg gagacggatc tctcaggcct 240 ctctgcagag aaccgaccac tgggccgccc tgatttgtct cgttgagcat cactctggga 300 gtaagtcaga acctctgagc cctgccccag ggtctgtcgg taccaataaa gggttacatg 360 acccgaaatt gaatcacacc tgagagctac atcccgtccc ctctttgcga ctttgtacct 420 tggggactgg gagactccag cacctgtgtg atctgtggaa agagtgtcgg tgtcatctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 353 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 353 gcctccctcg cgccatcagg ttccgaaggt gtcatatttc ccaggacaga gtcctccctc 60 atcgcacccc tcctagagac ccccagcctt acctacaacg gttaacctgg tccccgaacc 120 gaaggtgtag ccatagtcga cgttccgaag gtgtcattca ctgctggcac agagatacac 180 agctgagtcc 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<400> 356 gcctccctcg cgccatcagg acactctggt gtcatagaga actctgcctt caagggacaa 60 tggccatacc accctgattc tgcaacttac ctaggatgga gagtcgagtc ccatcaccaa 120 aatgctgggg ctgatgtcga cgacactctg gtgtcattca ctgctggcac agagatacac 180 agctgagtcc ccctgctctg tgcgctggat cttcagagtg gagacggatc tctcaggcct 240 ctctgcagag aaccgaccac tgggccgccc tgatttgtct cgttgagcat cactctggga 300 gtaagtcaga acctctgagc cctgccccag ggtctgtcgg taccaataaa gggttacatg 360 acccgaaatt gaatcacacc tgagagctac atcccgtccc ctctttgcga ctttgtacct 420 tggggactgg gagactccag cacctgtgtg atctgtggaa gacactctgg tgtcatctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 357 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 357 gcctccctcg cgccatcagt tcggaacggt gtcatatcat tgcagtcaaa cccaggcacc 60 cccgagtcaa gagtggagcc cccatacctg tcacagtgag cctggtcccg ttcccaaagt 120 ggaggggtga attatgtcga cttcggaacg gtgtcattca ctgctggcac agagatacac 180 agctgagtcc ccctgctctg tgcgctggat 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<221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 379 gcctccctcg cgccatcagg ttccgaacac tagctatttc ccaggacaga gtcctccctc 60 atcgcacccc tcctagagac ccccagcctt acctacaacg gttaacctgg tccccgaacc 120 gaaggtgtag ccatagtcga cgttccgaac actagcttca ctgctggcac agcgatacat 180 ggccgagtcc cgctgctctg tgcgctggat cgtcagagtg gagatggatc cctcaggcct 240 ctctgcagag aaccgatcat tgggcagccc tgatttgtct tgttgggctt cataattgaa 300 gtaagtcaga aactctgggc cctgccccag ggcctgtcgg taccaataaa gggatacatg 360 acccgaaatt ggatcacacc tgagagctac atcctgtccc ctctttgtga ctttgtacct 420 gggagactgg gagactccag cacctgtgtg atctgtggaa gttccgaaca ctagctctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 380 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 380 gcctccctcg cgccatcagc gttacttcac tagctctgga ttccagcccc tttttgcaag 60 ttcccagctg tccagccttg acttactcac ctacaacagt gagccaactt ccctctccaa 120 aatatatggt gtttcgtcga ccgttacttc actagcttca ctgctggcac agcgatacat 180 ggccgagtcc cgctgctctg tgcgctggat cgtcagagtg gagatggatc cctcaggcct 240 ctctgcagag aaccgatcat tgggcagccc tgatttgtct tgttgggctt cataattgaa 300 gtaagtcaga aactctgggc cctgccccag ggcctgtcgg taccaataaa gggatacatg 360 acccgaaatt ggatcacacc tgagagctac atcctgtccc ctctttgtga ctttgtacct 420 gggagactgg gagactccag cacctgtgtg atctgtggaa cgttacttca ctagctctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 381 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 381 gcctccctcg cgccatcagt aggagaccac tagctctcct ggaactccga ccttatgata 60 cactatcccg aaagaagtct tttacatacc caagacagag agctgggttc cactgccaaa 120 aaacagtttt tcattgtcga ctaggagacc actagcttca ctgctggcac agcgatacat 180 ggccgagtcc cgctgctctg tgcgctggat cgtcagagtg gagatggatc cctcaggcct 240 ctctgcagag aaccgatcat tgggcagccc tgatttgtct tgttgggctt cataattgaa 300 gtaagtcaga aactctgggc cctgccccag ggcctgtcgg taccaataaa gggatacatg 360 acccgaaatt ggatcacacc tgagagctac atcctgtccc ctctttgtga ctttgtacct 420 gggagactgg gagactccag cacctgtgtg atctgtggaa taggagacca ctagctctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 382 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 382 gcctccctcg cgccatcagg acactctcac tagctagaga actctgcctt caagggacaa 60 tggccatacc accctgattc tgcaacttac ctaggatgga gagtcgagtc ccatcaccaa 120 aatgctgggg ctgatgtcga cgacactctc actagcttca ctgctggcac agcgatacat 180 ggccgagtcc cgctgctctg tgcgctggat cgtcagagtg gagatggatc cctcaggcct 240 ctctgcagag aaccgatcat tgggcagccc tgatttgtct tgttgggctt cataattgaa 300 gtaagtcaga aactctgggc cctgccccag ggcctgtcgg taccaataaa gggatacatg 360 acccgaaatt ggatcacacc tgagagctac atcctgtccc ctctttgtga ctttgtacct 420 gggagactgg gagactccag cacctgtgtg atctgtggaa gacactctca ctagctctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 383 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 383 gcctccctcg cgccatcagt tcggaaccac tagctatcat tgcagtcaaa cccaggcacc 60 cccgagtcaa gagtggagcc cccatacctg tcacagtgag cctggtcccg ttcccaaagt 120 ggaggggtga attatgtcga cttcggaacc actagcttca ctgctggcac agcgatacat 180 ggccgagtcc cgctgctctg tgcgctggat cgtcagagtg gagatggatc cctcaggcct 240 ctctgcagag aaccgatcat tgggcagccc tgatttgtct tgttgggctt cataattgaa 300 gtaagtcaga aactctgggc cctgccccag ggcctgtcgg taccaataaa gggatacatg 360 acccgaaatt ggatcacacc tgagagctac atcctgtccc ctctttgtga ctttgtacct 420 gggagactgg gagactccag cacctgtgtg atctgtggaa ttcggaacca ctagctctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 384 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 384 gcctccctcg cgccatcaga agtaacgcac tagctgggtc gtgcaggctg ggctgctcac 60 cctctctccc acctggagcc cccttcttac ctagcacggt gagccgtgtc cctggcccga 120 agaactgctc attgtgtcga caagtaacgc actagcttca ctgctggcac 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Synthetic polynucleotide" <400> 387 gcctccctcg cgccatcagc actgtaccac tagctcgcac aaaaacccga gcgcagtctc 60 gtccccggtc ccccggcggc cccagcttac ccagcactga gagccgggtc ccggcgccga 120 agtactgaat gttttgtcga ccactgtacc actagcttca ctgctggcac agcgatacat 180 ggccgagtcc cgctgctctg tgcgctggat cgtcagagtg gagatggatc cctcaggcct 240 ctctgcagag aaccgatcat tgggcagccc tgatttgtct tgttgggctt cataattgaa 300 gtaagtcaga aactctgggc cctgccccag ggcctgtcgg taccaataaa gggatacatg 360 acccgaaatt ggatcacacc tgagagctac atcctgtccc ctctttgtga ctttgtacct 420 gggagactgg gagactccag cacctgtgtg atctgtggaa cactgtacca ctagctctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 388 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 388 gcctccctcg cgccatcagg atgatcccac tagctccccg caaaaaccag acccaagccg 60 cccgcgcccg cgccccagca gcccgcgctc accgagcacc aggagccgcg tgcctggccc 120 gaagtactgg gtctcgtcga cgatgatccc actagcttca ctgctggcac agcgatacat 180 ggccgagtcc 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of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 418 gcctccctcg cgccatcagg ttccgaactg attctatttc ccaggacaga gtcctccctc 60 atcgcacccc tcctagagac ccccagcctt acctacaacg gttaacctgg tccccgaacc 120 gaaggtgtag ccatagtcga cgttccgaac tgattcttca ctgctggcac agagatacat 180 ggccgagtcc ccctgctctg tgcgctggat ctccaaggtg gagaaagatc ccttaggcct 240 ctctgcagag aaccgatcac tgagcagcct tgatttttct agttgagctt cattctggaa 300 gtaagtcaga aactctgggc cctgccccag ggtctgtcgg taccaataaa ggcggttgtg 360 ttcagaaatt ggatcacacc tgaaagttac attctgtccc ctctttgtga tcttgtgtct 420 ggggttctgg gagactccag tatctgcgtg atctgtggag gttccgaact gattctctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 419 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 419 gcctccctcg cgccatcagc gttacttctg attctctgga ttccagcccc tttttgcaag 60 ttcccagctg tccagccttg acttactcac ctacaacagt gagccaactt ccctctccaa 120 aatatatggt gtttcgtcga ccgttacttc tgattcttca ctgctggcac 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Synthetic polynucleotide" <400> 422 gcctccctcg cgccatcagt tcggaacctg attctatcat tgcagtcaaa cccaggcacc 60 cccgagtcaa gagtggagcc cccatacctg tcacagtgag cctggtcccg ttcccaaagt 120 ggaggggtga attatgtcga cttcggaacc tgattcttca ctgctggcac agagatacat 180 ggccgagtcc ccctgctctg tgcgctggat ctccaaggtg gagaaagatc ccttaggcct 240 ctctgcagag aaccgatcac tgagcagcct tgatttttct agttgagctt cattctggaa 300 gtaagtcaga aactctgggc cctgccccag ggtctgtcgg taccaataaa ggcggttgtg 360 ttcagaaatt ggatcacacc tgaaagttac attctgtccc ctctttgtga tcttgtgtct 420 ggggttctgg gagactccag tatctgcgtg atctgtggag ttcggaacct gattctctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 423 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 423 gcctccctcg cgccatcaga agtaacgctg attctgggtc gtgcaggctg ggctgctcac 60 cctctctccc acctggagcc cccttcttac ctagcacggt gagccgtgtc cctggcccga 120 agaactgctc attgtgtcga caagtaacgc tgattcttca ctgctggcac agagatacat 180 ggccgagtcc 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<400> 426 gcctccctcg cgccatcagc actgtacctg attctcgcac aaaaacccga gcgcagtctc 60 gtccccggtc ccccggcggc cccagcttac ccagcactga gagccgggtc ccggcgccga 120 agtactgaat gttttgtcga ccactgtacc tgattcttca ctgctggcac agagatacat 180 ggccgagtcc ccctgctctg tgcgctggat ctccaaggtg gagaaagatc ccttaggcct 240 ctctgcagag aaccgatcac tgagcagcct tgatttttct agttgagctt cattctggaa 300 gtaagtcaga aactctgggc cctgccccag ggtctgtcgg taccaataaa ggcggttgtg 360 ttcagaaatt ggatcacacc tgaaagttac attctgtccc ctctttgtga tcttgtgtct 420 ggggttctgg gagactccag tatctgcgtg atctgtggag cactgtacct gattctctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 427 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 427 gcctccctcg cgccatcagg atgatccctg attctccccg caaaaaccag acccaagccg 60 cccgcgcccg cgccccagca gcccgcgctc accgagcacc aggagccgcg tgcctggccc 120 gaagtactgg gtctcgtcga cgatgatccc tgattcttca ctgctggcac agagatacat 180 ggccgagtcc ccctgctctg tgcgctggat 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caactagaga actctgcctt caagggacaa 60 tggccatacc accctgattc tgcaacttac ctaggatgga gagtcgagtc ccatcaccaa 120 aatgctgggg ctgatgtcga cgacactctg gtcaacttca ctgccacaga ggtacagagg 180 tctggctggt gctagtagac tccagggttg agggaaaatg cttgagtttg tttccagaga 240 cattgtaccc ttccttggca ccgcctttgg tcatgctgcc aatactacct gaataatgga 300 tcagcctcag cccctattct tggtcttatt gataacagaa cactgaataa tggttcctaa 360 tctgagcaaa tttcaggatg atctttttcc ctgtgtgtct gtgatatctt ggtatctggc 420 tgatccctgc ctccatgggg gctgtgggag aggcaggcag gacactctgg tcaactctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 435 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 435 gcctccctcg cgccatcagt tcggaacggt caactatcat tgcagtcaaa cccaggcacc 60 cccgagtcaa gagtggagcc cccatacctg tcacagtgag cctggtcccg ttcccaaagt 120 ggaggggtga attatgtcga cttcggaacg gtcaacttca ctgccacaga ggtacagagg 180 tctggctggt gctagtagac tccagggttg agggaaaatg cttgagtttg tttccagaga 240 cattgtaccc 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<213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 445 gcctccctcg cgccatcagc gttactttac gtacgctgga ttccagcccc tttttgcaag 60 ttcccagctg tccagccttg acttactcac ctacaacagt gagccaactt ccctctccaa 120 aatatatggt gtttcgtcga ccgttacttt acgtacgtca ctgccacagt ggtacagata 180 ggtctggctg gtgctggtgg atgccaggat tggggaaatg ctcaagcttg tttcaagaaa 240 cacagtaccc ctctgtgaca tcaactttgg tcctgctgtg accactgcct gaatagtgga 300 taagcttcag cccccgtctt gggtcctgtc gatatcagaa cactgttcct aacctgagca 360 cattccagga tcatctcttt cttctgtaca atgtgatatc ttggcatctg ggtgatccca 420 gcatcaatag agcctgctgg agaggcagac agaaagtgaa cgttacttta cgtacgctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 446 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 446 gcctccctcg cgccatcagt aggagactac gtacgctcct ggaactccga ccttatgata 60 cactatcccg aaagaagtct tttacatacc caagacagag agctgggttc 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of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 453 gcctccctcg cgccatcagg atgatcctac gtacgccccg caaaaaccag acccaagccg 60 cccgcgcccg cgccccagca gcccgcgctc accgagcacc aggagccgcg tgcctggccc 120 gaagtactgg gtctcgtcga cgatgatcct acgtacgtca ctgccacagt ggtacagata 180 ggtctggctg gtgctggtgg atgccaggat tggggaaatg ctcaagcttg tttcaagaaa 240 cacagtaccc ctctgtgaca tcaactttgg tcctgctgtg accactgcct gaatagtgga 300 taagcttcag cccccgtctt gggtcctgtc gatatcagaa cactgttcct aacctgagca 360 cattccagga tcatctcttt cttctgtaca atgtgatatc ttggcatctg ggtgatccca 420 gcatcaatag agcctgctgg agaggcagac agaaagtgaa gatgatccta cgtacgctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 454 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 454 gcctccctcg cgccatcagc gccaatatac gtacgccgcc gccttccacc tgaatcccgc 60 cgcccgggtg gtcccgcgaa aactcaccca gcacggtcag cctgctgccg gccccgaaag 120 tcaggacgtt ggcccgtcga ccgccaatat acgtacgtca ctgccacagt 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atggatcagc ctcagcccat gtcccaggtc ttgtcgatac cagaacatat tgttgtggtt 360 ccaagtctgg tgacacgcca aggtcacctg ccttcctgtc tctgtgatct tgtgtcttgg 420 gctctgggtg atttcagcat ccctgtgtcc tgtaatagag cactgtacat ccatggctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 479 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 479 gcctccctcg cgccatcagg atgatccatc catggccccg caaaaaccag acccaagccg 60 cccgcgcccg cgccccagca gcccgcgctc accgagcacc aggagccgcg tgcctggccc 120 gaagtactgg gtctcgtcga cgatgatcca tccatggtca ctgctggcgc agaaatatac 180 agatgtctgg gaggaggcag cagactccag agtgaggggg aggtcctctg tgtttgatct 240 agagacactg tagccatctg agacttctcc tttgttagtg tcttgaacac catatgagta 300 atggatcagc ctcagcccat gtcccaggtc ttgtcgatac cagaacatat tgttgtggtt 360 ccaagtctgg tgacacgcca aggtcacctg ccttcctgtc tctgtgatct tgtgtcttgg 420 gctctgggtg atttcagcat ccctgtgtcc tgtaatagag gatgatccat ccatggctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 480 <211> 495 <212> DNA 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of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 488 gcctccctcg cgccatcaga agtaacggta gcagtgggtc gtgcaggctg ggctgctcac 60 cctctctccc acctggagcc cccttcttac ctagcacggt gagccgtgtc cctggcccga 120 agaactgctc attgtgtcga caagtaacgg tagcagttca ctgctggcgc agaaatacac 180 agatgtctgg gagcgggtag ctgactccag agtgaggggg aaattctctg tcttggatct 240 ggagacaaca tagccatcgg ggacttctcc tttatctgta atatcagcag ctgctgagta 300 atagatcagc ctcagcccat gtcccaggtc ttgtcgatac cagaacatat agctgtggct 360 ccaagtctgg tgacacatca aggtcacctg ccttcctgtc tctgtgatct tgtatcttgg 420 gctctgggtg attccagcat ccctgtgtcc tgtaatagag aagtaacggt agcagtctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 489 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 489 gcctccctcg cgccatcagg tctcctagta gcagtcctct gcccatcccg ccctctcgga 60 gctctccgga gccccaaccg cctccttacc cagtacggtc agcctagagc cttctccaaa 120 aaacagctcc ccggtgtcga cgtctcctag tagcagttca ctgctggcgc 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ccttcctgtc tctgtgatct tgtatcttgg 420 gctctgggtg attccagcat ccctgtgtcc tgtaatagag gtagacacgt agcagtctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 491 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 491 gcctccctcg cgccatcagc actgtacgta gcagtcgcac aaaaacccga gcgcagtctc 60 gtccccggtc ccccggcggc cccagcttac ccagcactga gagccgggtc ccggcgccga 120 agtactgaat gttttgtcga ccactgtacg tagcagttca ctgctggcgc agaaatacac 180 agatgtctgg gagcgggtag ctgactccag agtgaggggg aaattctctg tcttggatct 240 ggagacaaca tagccatcgg ggacttctcc tttatctgta atatcagcag ctgctgagta 300 atagatcagc ctcagcccat gtcccaggtc ttgtcgatac cagaacatat agctgtggct 360 ccaagtctgg tgacacatca aggtcacctg ccttcctgtc tctgtgatct tgtatcttgg 420 gctctgggtg attccagcat ccctgtgtcc tgtaatagag cactgtacgt agcagtctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 492 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 492 gcctccctcg cgccatcagg atgatccgta gcagtccccg caaaaaccag acccaagccg 60 cccgcgcccg cgccccagca gcccgcgctc accgagcacc aggagccgcg tgcctggccc 120 gaagtactgg gtctcgtcga cgatgatccg tagcagttca ctgctggcgc agaaatacac 180 agatgtctgg gagcgggtag ctgactccag agtgaggggg aaattctctg tcttggatct 240 ggagacaaca tagccatcgg ggacttctcc tttatctgta atatcagcag ctgctgagta 300 atagatcagc ctcagcccat gtcccaggtc ttgtcgatac cagaacatat agctgtggct 360 ccaagtctgg tgacacatca aggtcacctg ccttcctgtc tctgtgatct tgtatcttgg 420 gctctgggtg attccagcat ccctgtgtcc tgtaatagag gatgatccgt agcagtctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 493 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 493 gcctccctcg cgccatcagc gccaatagta gcagtccgcc gccttccacc tgaatcccgc 60 cgcccgggtg gtcccgcgaa aactcaccca gcacggtcag cctgctgccg gccccgaaag 120 tcaggacgtt ggcccgtcga ccgccaatag tagcagttca ctgctggcgc agaaatacac 180 agatgtctgg 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<400> 496 gcctccctcg cgccatcagg ttccgaaatc ttcgtatttc ccaggacaga gtcctccctc 60 atcgcacccc tcctagagac ccccagcctt acctacaacg gttaacctgg tccccgaacc 120 gaaggtgtag ccatagtcga cgttccgaaa tcttcgttca ctgatggcac agaagtacac 180 agatgtctgg gagctggtag cggactccag agtgaggagg aaatcctctg tctttgatct 240 agagacacta tagccatctg agacttctcc tttgtcagta tctttaacac catatgagta 300 atggatcagc ctcagcccat gccccgggtc ttgtcgatac cagtacatat agcggtggtt 360 ctcagtctgg tgacatctca gagtcactgg tgttcctgtc tctgtgacct tgtgtcttgg 420 gctctgggtg attccagcat ccatgtgtcc tgtaatagaa gttccgaaat cttcgtctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 497 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 497 gcctccctcg cgccatcagc gttacttatc ttcgtctgga ttccagcccc tttttgcaag 60 ttcccagctg tccagccttg acttactcac ctacaacagt gagccaactt ccctctccaa 120 aatatatggt gtttcgtcga ccgttactta tcttcgttca ctgatggcac agaagtacac 180 agatgtctgg gagctggtag cggactccag 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of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 523 gcctccctcg cgccatcagc gttacttatg acaccctgga ttccagcccc tttttgcaag 60 ttcccagctg tccagccttg acttactcac ctacaacagt gagccaactt ccctctccaa 120 aatatatggt gtttcgtcga ccgttactta tgacacctca ctgctggcac agagatacac 180 ggccgagtcc tcaagctttg caggctggat cttgagagtg gagtctactc ctttgagcct 240 ctctgcagaa aatcgatcct taggcaactg tgaatcatcc actacaccgt tattctgaaa 300 ctgaatcaga agctttgggc cctgtcccag gatctgctgg taccagtaaa gggtagcatg 360 gccagatata ggattgcacc aaaaagccac actctgcctt ttctctataa tcttatatct 420 gggagactgg gcaactccag cttctgtgag ttctgagaag cgttacttat gacaccctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 524 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 524 gcctccctcg cgccatcagt aggagacatg acaccctcct ggaactccga ccttatgata 60 cactatcccg aaagaagtct tttacatacc caagacagag agctgggttc cactgccaaa 120 aaacagtttt tcattgtcga ctaggagaca tgacacctca ctgctggcac 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Synthetic polynucleotide" <400> 527 gcctccctcg cgccatcaga agtaacgatg acaccgggtc gtgcaggctg ggctgctcac 60 cctctctccc acctggagcc cccttcttac ctagcacggt gagccgtgtc cctggcccga 120 agaactgctc attgtgtcga caagtaacga tgacacctca ctgctggcac agagatacac 180 ggccgagtcc tcaagctttg caggctggat cttgagagtg gagtctactc ctttgagcct 240 ctctgcagaa aatcgatcct taggcaactg tgaatcatcc actacaccgt tattctgaaa 300 ctgaatcaga agctttgggc cctgtcccag gatctgctgg taccagtaaa gggtagcatg 360 gccagatata ggattgcacc aaaaagccac actctgcctt ttctctataa tcttatatct 420 gggagactgg gcaactccag cttctgtgag ttctgagaag aagtaacgat gacaccctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 528 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 528 gcctccctcg cgccatcagg tctcctaatg acacccctct gcccatcccg ccctctcgga 60 gctctccgga gccccaaccg cctccttacc cagtacggtc agcctagagc cttctccaaa 120 aaacagctcc ccggtgtcga cgtctcctaa tgacacctca ctgctggcac agagatacac 180 ggccgagtcc 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<400> 531 gcctccctcg cgccatcagg atgatccatg acaccccccg caaaaaccag acccaagccg 60 cccgcgcccg cgccccagca gcccgcgctc accgagcacc aggagccgcg tgcctggccc 120 gaagtactgg gtctcgtcga cgatgatcca tgacacctca ctgctggcac agagatacac 180 ggccgagtcc tcaagctttg caggctggat cttgagagtg gagtctactc ctttgagcct 240 ctctgcagaa aatcgatcct taggcaactg tgaatcatcc actacaccgt tattctgaaa 300 ctgaatcaga agctttgggc cctgtcccag gatctgctgg taccagtaaa gggtagcatg 360 gccagatata ggattgcacc aaaaagccac actctgcctt ttctctataa tcttatatct 420 gggagactgg gcaactccag cttctgtgag ttctgagaag gatgatccat gacaccctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 532 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 532 gcctccctcg cgccatcagc gccaataatg acaccccgcc gccttccacc tgaatcccgc 60 cgcccgggtg gtcccgcgaa aactcaccca gcacggtcag cctgctgccg gccccgaaag 120 tcaggacgtt ggcccgtcga ccgccaataa tgacacctca ctgctggcac agagatacac 180 ggccgagtcc tcaagctttg caggctggat 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<213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 550 gcctccctcg cgccatcagt aggagacagc tagtgctcct ggaactccga ccttatgata 60 cactatcccg aaagaagtct tttacatacc caagacagag agctgggttc cactgccaaa 120 aaacagtttt tcattgtcga ctaggagaca gctagtgtca ctgctggcac agaaatatag 180 gcccaagtcc ctgggttcca tgggctggat cctcagagtg gagaatgata catcaggcat 240 ctgtgctgag aatcaatcct tggacactcc tgagtcatct acgagggtcc agctgcagaa 300 gtaattcagc aattccagtc cctgcacaaa ggtctgtctg taccagagaa gatcattgtg 360 gcctgaaatt ggttcgcatc tcagagttac tgattgtccc atctctgtca ctttgtgcct 420 gggtgactgg ataacaccag catctgtgtg tgctataaaa taggagacag ctagtgctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 551 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 551 gcctccctcg cgccatcagg acactctagc tagtgagaga actctgcctt caagggacaa 60 tggccatacc accctgattc tgcaacttac ctaggatgga gagtcgagtc 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ggtctgtctg taccagagaa gatcattgtg 360 gcctgaaatt ggttcgcatc tcagagttac tgattgtccc atctctgtca ctttgtgcct 420 gggtgactgg ataacaccag catctgtgtg tgctataaaa ttcggaacag ctagtgctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 553 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 553 gcctccctcg cgccatcaga agtaacgagc tagtggggtc gtgcaggctg ggctgctcac 60 cctctctccc acctggagcc cccttcttac ctagcacggt gagccgtgtc cctggcccga 120 agaactgctc attgtgtcga caagtaacga gctagtgtca ctgctggcac agaaatatag 180 gcccaagtcc ctgggttcca tgggctggat cctcagagtg gagaatgata catcaggcat 240 ctgtgctgag aatcaatcct tggacactcc tgagtcatct acgagggtcc agctgcagaa 300 gtaattcagc aattccagtc cctgcacaaa ggtctgtctg taccagagaa gatcattgtg 360 gcctgaaatt ggttcgcatc tcagagttac tgattgtccc atctctgtca ctttgtgcct 420 gggtgactgg ataacaccag catctgtgtg tgctataaaa aagtaacgag ctagtgctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 554 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 554 gcctccctcg cgccatcagg tctcctaagc tagtgcctct gcccatcccg ccctctcgga 60 gctctccgga gccccaaccg cctccttacc cagtacggtc agcctagagc cttctccaaa 120 aaacagctcc ccggtgtcga cgtctcctaa gctagtgtca ctgctggcac agaaatatag 180 gcccaagtcc ctgggttcca tgggctggat cctcagagtg gagaatgata catcaggcat 240 ctgtgctgag aatcaatcct tggacactcc tgagtcatct acgagggtcc agctgcagaa 300 gtaattcagc aattccagtc cctgcacaaa ggtctgtctg taccagagaa gatcattgtg 360 gcctgaaatt ggttcgcatc tcagagttac tgattgtccc atctctgtca ctttgtgcct 420 gggtgactgg ataacaccag catctgtgtg tgctataaaa gtctcctaag ctagtgctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 555 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 555 gcctccctcg cgccatcagg tagacacagc tagtggcgtc ccggggcgcc ccctccccag 60 ttccggggct tcagcgggag cccccgctta ccgagcactg tcagccgggt gcctgggcca 120 aaatactgcg tatctgtcga 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gcctgaaatt ggttcgcatc tcagagttac tgattgtccc atctctgtca ctttgtgcct 420 gggtgactgg ataacaccag catctgtgtg tgctataaaa cactgtacag ctagtgctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 557 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 557 gcctccctcg cgccatcagg atgatccagc tagtgccccg caaaaaccag acccaagccg 60 cccgcgcccg cgccccagca gcccgcgctc accgagcacc aggagccgcg tgcctggccc 120 gaagtactgg gtctcgtcga cgatgatcca gctagtgtca ctgctggcac agaaatatag 180 gcccaagtcc ctgggttcca tgggctggat cctcagagtg gagaatgata catcaggcat 240 ctgtgctgag aatcaatcct tggacactcc tgagtcatct acgagggtcc agctgcagaa 300 gtaattcagc aattccagtc cctgcacaaa ggtctgtctg taccagagaa gatcattgtg 360 gcctgaaatt ggttcgcatc tcagagttac tgattgtccc atctctgtca ctttgtgcct 420 gggtgactgg ataacaccag catctgtgtg tgctataaaa gatgatccag ctagtgctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 558 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 558 gcctccctcg cgccatcagc gccaataagc tagtgccgcc gccttccacc tgaatcccgc 60 cgcccgggtg gtcccgcgaa aactcaccca gcacggtcag cctgctgccg gccccgaaag 120 tcaggacgtt ggcccgtcga ccgccaataa gctagtgtca ctgctggcac agaaatatag 180 gcccaagtcc ctgggttcca tgggctggat cctcagagtg gagaatgata catcaggcat 240 ctgtgctgag aatcaatcct tggacactcc tgagtcatct acgagggtcc agctgcagaa 300 gtaattcagc aattccagtc cctgcacaaa ggtctgtctg taccagagaa gatcattgtg 360 gcctgaaatt ggttcgcatc tcagagttac tgattgtccc atctctgtca ctttgtgcct 420 gggtgactgg ataacaccag catctgtgtg tgctataaaa cgccaataag ctagtgctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 559 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 559 gcctccctcg cgccatcagt caagcctagc tagtgccacc ctccgactcc ggggaccgag 60 gggctggaag gtggggagac gcccgaatct cacctgtgac cgtgagcctg gtgcccggcc 120 cgaagtactg ctcgtgtcga ctcaagccta gctagtgtca ctgctggcac 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Synthetic polynucleotide" <400> 562 gcctccctcg cgccatcagc gttactttaa ccaagctgga ttccagcccc tttttgcaag 60 ttcccagctg tccagccttg acttactcac ctacaacagt gagccaactt ccctctccaa 120 aatatatggt gtttcgtcga ccgttacttt aaccaagtca cgacttgcac agacatacac 180 ggccgagtcc ccctgctctg caggctggat cttcagagta gagaatgatc catcaggcct 240 ctcagctgag aatcgctctg tgggcatacc tgcattatct ataatagatc agctccggaa 300 gtaactcagc aattccagtc cctgcacgaa ggtatctctg taccagaaaa ggaaattgtg 360 gccaaaaatt ggctcacatc tcagagtcac tgtttgtccc atttctgtca cctcatgctt 420 gggtgactgg ataatgccag catctgtgca tgctataaaa cgttacttta accaagctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 563 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 563 gcctccctcg cgccatcagt aggagactaa ccaagctcct ggaactccga ccttatgata 60 cactatcccg aaagaagtct tttacatacc caagacagag agctgggttc cactgccaaa 120 aaacagtttt tcattgtcga ctaggagact aaccaagtca cgacttgcac agacatacac 180 ggccgagtcc ccctgctctg caggctggat cttcagagta gagaatgatc catcaggcct 240 ctcagctgag aatcgctctg tgggcatacc tgcattatct ataatagatc agctccggaa 300 gtaactcagc aattccagtc cctgcacgaa ggtatctctg taccagaaaa ggaaattgtg 360 gccaaaaatt ggctcacatc tcagagtcac tgtttgtccc atttctgtca cctcatgctt 420 gggtgactgg ataatgccag catctgtgca tgctataaaa taggagacta accaagctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 564 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 564 gcctccctcg cgccatcagg acactcttaa ccaagagaga actctgcctt caagggacaa 60 tggccatacc accctgattc tgcaacttac ctaggatgga gagtcgagtc ccatcaccaa 120 aatgctgggg ctgatgtcga cgacactctt aaccaagtca cgacttgcac agacatacac 180 ggccgagtcc ccctgctctg caggctggat cttcagagta gagaatgatc catcaggcct 240 ctcagctgag aatcgctctg tgggcatacc tgcattatct ataatagatc agctccggaa 300 gtaactcagc aattccagtc cctgcacgaa ggtatctctg taccagaaaa ggaaattgtg 360 gccaaaaatt ggctcacatc tcagagtcac tgtttgtccc atttctgtca 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<400> 566 gcctccctcg cgccatcaga agtaacgtaa ccaaggggtc gtgcaggctg ggctgctcac 60 cctctctccc acctggagcc cccttcttac ctagcacggt gagccgtgtc cctggcccga 120 agaactgctc attgtgtcga caagtaacgt aaccaagtca cgacttgcac agacatacac 180 ggccgagtcc ccctgctctg caggctggat cttcagagta gagaatgatc catcaggcct 240 ctcagctgag aatcgctctg tgggcatacc tgcattatct ataatagatc agctccggaa 300 gtaactcagc aattccagtc cctgcacgaa ggtatctctg taccagaaaa ggaaattgtg 360 gccaaaaatt ggctcacatc tcagagtcac tgtttgtccc atttctgtca cctcatgctt 420 gggtgactgg ataatgccag catctgtgca tgctataaaa aagtaacgta accaagctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 567 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 567 gcctccctcg cgccatcagg tctcctataa ccaagcctct gcccatcccg ccctctcgga 60 gctctccgga gccccaaccg cctccttacc cagtacggtc agcctagagc cttctccaaa 120 aaacagctcc ccggtgtcga cgtctcctat aaccaagtca cgacttgcac agacatacac 180 ggccgagtcc ccctgctctg caggctggat 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of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 593 gcctccctcg cgccatcagg tctcctaaga atcagcctct gcccatcccg ccctctcgga 60 gctctccgga gccccaaccg cctccttacc cagtacggtc agcctagagc cttctccaaa 120 aaacagctcc ccggtgtcga cgtctcctaa gaatcagtca ctgctggcac agaagtacac 180 agctgagtcc ctgggttctg agggctggat cttcagagtg gagaatgatg cattaggcat 240 cttagctgag aatcgatcct cgggcatccc tgaatcatct atcggaacgt tgttgttaaa 300 gtaaatgagc aactccagtc cccgcatcat ggtctgtctg taccagaaaa ggtagtcgtg 360 tcctgaaatt ggtttacatc tcagagtcac ttcttgtccc atctctgtca cctcgtgccg 420 gggtgactgg ataactccag catctgtgtg ctctatgaag gtctcctaag aatcagctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 594 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 594 gcctccctcg cgccatcagg tagacacaga atcaggcgtc ccggggcgcc ccctccccag 60 ttccggggct tcagcgggag cccccgctta ccgagcactg tcagccgggt gcctgggcca 120 aaatactgcg tatctgtcga cgtagacaca gaatcagtca ctgctggcac 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Synthetic polynucleotide" <400> 597 gcctccctcg cgccatcagc gccaataaga atcagccgcc gccttccacc tgaatcccgc 60 cgcccgggtg gtcccgcgaa aactcaccca gcacggtcag cctgctgccg gccccgaaag 120 tcaggacgtt ggcccgtcga ccgccaataa gaatcagtca ctgctggcac agaagtacac 180 agctgagtcc ctgggttctg agggctggat cttcagagtg gagaatgatg cattaggcat 240 cttagctgag aatcgatcct cgggcatccc tgaatcatct atcggaacgt tgttgttaaa 300 gtaaatgagc aactccagtc cccgcatcat ggtctgtctg taccagaaaa ggtagtcgtg 360 tcctgaaatt ggtttacatc tcagagtcac ttcttgtccc atctctgtca cctcgtgccg 420 gggtgactgg ataactccag catctgtgtg ctctatgaag cgccaataag aatcagctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 598 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 598 gcctccctcg cgccatcagt caagcctaga atcagccacc ctccgactcc ggggaccgag 60 gggctggaag gtggggagac gcccgaatct cacctgtgac cgtgagcctg gtgcccggcc 120 cgaagtactg ctcgtgtcga ctcaagccta gaatcagtca ctgctggcac agaagtacac 180 agctgagtcc 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Synthetic polynucleotide" <400> 632 gcctccctcg cgccatcagg tctcctacag catatcctct gcccatcccg ccctctcgga 60 gctctccgga gccccaaccg cctccttacc cagtacggtc agcctagagc cttctccaaa 120 aaacagctcc ccggtgtcga cgtctcctac agcatattca ctgctggcac agaaataaac 180 tccagaatcc tccagttctg caggctgcac cttcagagta gaatacgtcc ctccagtcct 240 ttcagctaag aatcgattgt tgggcatacc ggactcatcc tgtttagact ctttcacaaa 300 atgtaacaga aattttattt cttttcccat aacacgtcga taccaataaa gattatcatg 360 tccagaaatt gggtcacatc tcagagtcac agtctggccc ttctctatta cgctgtggct 420 ggggaactga gtaactccag cttctatgtg ctctgtggga gtctcctaca gcatatctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 633 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 633 gcctccctcg cgccatcagg tagacaccag catatgcgtc ccggggcgcc ccctccccag 60 ttccggggct tcagcgggag cccccgctta ccgagcactg tcagccgggt gcctgggcca 120 aaatactgcg tatctgtcga cgtagacacc agcatattca ctgctggcac agaaataaac 180 tccagaatcc 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<221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 659 gcctccctcg cgccatcagg tagacacagg tctcagcgtc ccggggcgcc ccctccccag 60 ttccggggct tcagcgggag cccccgctta ccgagcactg tcagccgggt gcctgggcca 120 aaatactgcg tatctgtcga cgtagacaca ggtctcatca ctgctggcac aaaaatacac 180 tgctgaatcc tcaagcttcg tagcctggat ctcaaggcta cagggtgaat ttgggaggca 240 cttagctgaa aatctttcct tgggcatacc tgtttcatca aagacatttt cattctggaa 300 ggaaatcaag aacttgaact cgtttttcag gacctgttgg taccaaaaaa cataactgtg 360 tccttttatt ggggcacaat ataattttgc tttctgtcct tcccctctga caagatgttt 420 tggagtctgg gcgacttctt caccaggaga acctgtaaag gtagacacag gtctcactga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 660 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 660 gcctccctcg cgccatcagc actgtacagg tctcacgcac aaaaacccga gcgcagtctc 60 gtccccggtc ccccggcggc cccagcttac ccagcactga gagccgggtc ccggcgccga 120 agtactgaat gttttgtcga 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of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 663 gcctccctcg cgccatcagt caagcctagg tctcaccacc ctccgactcc ggggaccgag 60 gggctggaag gtggggagac gcccgaatct cacctgtgac cgtgagcctg gtgcccggcc 120 cgaagtactg ctcgtgtcga ctcaagccta ggtctcatca ctgctggcac aaaaatacac 180 tgctgaatcc tcaagcttcg tagcctggat ctcaaggcta cagggtgaat ttgggaggca 240 cttagctgaa aatctttcct tgggcatacc tgtttcatca aagacatttt cattctggaa 300 ggaaatcaag aacttgaact cgtttttcag gacctgttgg taccaaaaaa cataactgtg 360 tccttttatt ggggcacaat ataattttgc tttctgtcct tcccctctga caagatgttt 420 tggagtctgg gcgacttctt caccaggaga acctgtaaag tcaagcctag gtctcactga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 664 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 664 gcctccctcg cgccatcaga gagtgtcgtc cattcctgtg gacccacttt tccctgtgac 60 ggatctgcaa aagaacctga aaaatgtctt acctacaact gtgagtctgg tgccttgtcc 120 aaagaaagct tcagtgtcga cagagtgtcg tccattctca ctactgtaga 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Synthetic polynucleotide" <400> 667 gcctccctcg cgccatcagt aggagacgtc cattcctcct ggaactccga ccttatgata 60 cactatcccg aaagaagtct tttacatacc caagacagag agctgggttc cactgccaaa 120 aaacagtttt tcattgtcga ctaggagacg tccattctca ctactgtaga gatacacggc 180 tgagtccctc ggctctgcgg gatggatctt cagcgtggaa gacgttccgt taggtctttc 240 agctgtgaat cgttccttgg gcatccctga atcaactgca atgttttggt actggaagga 300 aatcagcaac ttcatttctt gcctcagatt ctgtcggtac cagtgaacaa acatgtgacc 360 agaagatgga tcgcacctca gaatcacctc ctgtcccatg ttggtgacct tgtgtctggg 420 ggtctggctg actccaggct ccgagtgtcc tgtggaagaa taggagacgt ccattcctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 668 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 668 gcctccctcg cgccatcagg acactctgtc cattcagaga actctgcctt caagggacaa 60 tggccatacc accctgattc tgcaacttac ctaggatgga gagtcgagtc ccatcaccaa 120 aatgctgggg ctgatgtcga cgacactctg tccattctca ctactgtaga gatacacggc 180 tgagtccctc 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of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 698 gcctccctcg cgccatcagg tagacacata tgctggcgtc ccggggcgcc ccctccccag 60 ttccggggct tcagcgggag cccccgctta ccgagcactg tcagccgggt gcctgggcca 120 aaatactgcg tatctgtcga cgtagacaca tatgctgtca ctactggcac agagatagaa 180 agctgtcggg ttcttttggg ccgatgtcac agtgagagga aaggattcct tcttctcccg 240 agagacgctg tacccttcag ctatatctcc tttctgaaag tcatttacta tctgtgagta 300 gtagatcaat ctcagccctt gccctgggtc ctgtcggtac cagtacatgg catcgtggtt 360 caaattctgt tcacaactca gggtcacatt ctgtccttcc tttctgaaca ggtactttgg 420 ggactgagtg attccaccat ccacggtgtc tggaaaagaa gtagacacat atgctgctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 699 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 699 gcctccctcg cgccatcagc actgtacata tgctgcgcac aaaaacccga gcgcagtctc 60 gtccccggtc ccccggcggc cccagcttac ccagcactga gagccgggtc ccggcgccga 120 agtactgaat gttttgtcga ccactgtaca tatgctgtca ctactggcac 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Synthetic polynucleotide" <400> 702 gcctccctcg cgccatcagt caagcctata tgctgccacc ctccgactcc ggggaccgag 60 gggctggaag gtggggagac gcccgaatct cacctgtgac cgtgagcctg gtgcccggcc 120 cgaagtactg ctcgtgtcga ctcaagccta tatgctgtca ctactggcac agagatagaa 180 agctgtcggg ttcttttggg ccgatgtcac agtgagagga aaggattcct tcttctcccg 240 agagacgctg tacccttcag ctatatctcc tttctgaaag tcatttacta tctgtgagta 300 gtagatcaat ctcagccctt gccctgggtc ctgtcggtac cagtacatgg catcgtggtt 360 caaattctgt tcacaactca gggtcacatt ctgtccttcc tttctgaaca ggtactttgg 420 ggactgagtg attccaccat ccacggtgtc tggaaaagaa tcaagcctat atgctgctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 703 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 703 gcctccctcg cgccatcaga gagtgtcaat cctgcctgtg gacccacttt tccctgtgac 60 ggatctgcaa aagaacctga aaaatgtctt acctacaact gtgagtctgg tgccttgtcc 120 aaagaaagct tcagtgtcga cagagtgtca atcctgctca gcactgcaga tgtagaagct 180 gctgtcttca 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of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 733 gcctccctcg cgccatcagg acactctgaa tggacagaga actctgcctt caagggacaa 60 tggccatacc accctgattc tgcaacttac ctaggatgga gagtcgagtc ccatcaccaa 120 aatgctgggg ctgatgtcga cgacactctg aatggactca tcccaggaca gaagtacaaa 180 gctgtttggc tggtgtgggc caacttcacc ctgagaagaa atagcccctt ctcctcttgg 240 cagacacgta gccttcagtt agatctcctc tctgaatatc cttttcaacc cttgagtaat 300 agatcagtct cagattttgc tttgggtcct gccagtacca gtagcagtac atgtcattgt 360 gtctcaaatt ccgtttccac tccagagtca catcccatcc agccccagtg agctggaatg 420 gcatctgata gatgtcagca tccaagggtc caagagacaa gacactctga atggacctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 734 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 734 gcctccctcg cgccatcagt tcggaacgaa tggacatcat tgcagtcaaa cccaggcacc 60 cccgagtcaa gagtggagcc cccatacctg tcacagtgag cctggtcccg ttcccaaagt 120 ggaggggtga attatgtcga cttcggaacg aatggactca tcccaggaca 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of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 768 gcctccctcg cgccatcaga gagtgtcttg accatctgtg gacccacttt tccctgtgac 60 ggatctgcaa aagaacctga aaaatgtctt acctacaact gtgagtctgg tgccttgtcc 120 aaagaaagct tcagtgtcga cagagtgtct tgaccattca ctgctggcac agaggtactg 180 agaggtatgt gagggcctgg cagactccag ggtcagggga aaatgctccg tccttattct 240 ggagactgtt gactcagagg aaagatctcc cttctctgtg gaattaactc cataggaata 300 gtggatgagg tgtagttcca ttcctggatc ttgttgatac cagtacattt tgtcatggcc 360 catggtttga gaacattcca gagtgatctt ctttcctgtc cctataacaa ggtatcttgg 420 ggtctggtag atgtcagctt ccatgaggcc tatgggaaga agagtgtctt gaccatctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 769 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 769 gcctccctcg cgccatcagg ttccgaattg accatatttc ccaggacaga gtcctccctc 60 atcgcacccc tcctagagac ccccagcctt acctacaacg gttaacctgg tccccgaacc 120 gaaggtgtag ccatagtcga cgttccgaat tgaccattca ctgctggcac 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Synthetic polynucleotide" <400> 772 gcctccctcg cgccatcagg acactctttg accatagaga actctgcctt caagggacaa 60 tggccatacc accctgattc tgcaacttac ctaggatgga gagtcgagtc ccatcaccaa 120 aatgctgggg ctgatgtcga cgacactctt tgaccattca ctgctggcac agaggtactg 180 agaggtatgt gagggcctgg cagactccag ggtcagggga aaatgctccg tccttattct 240 ggagactgtt gactcagagg aaagatctcc cttctctgtg gaattaactc cataggaata 300 gtggatgagg tgtagttcca ttcctggatc ttgttgatac cagtacattt tgtcatggcc 360 catggtttga gaacattcca gagtgatctt ctttcctgtc cctataacaa ggtatcttgg 420 ggtctggtag atgtcagctt ccatgaggcc tatgggaaga gacactcttt gaccatctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 773 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 773 gcctccctcg cgccatcagt tcggaacttg accatatcat tgcagtcaaa cccaggcacc 60 cccgagtcaa gagtggagcc cccatacctg tcacagtgag cctggtcccg ttcccaaagt 120 ggaggggtga attatgtcga cttcggaact tgaccattca ctgctggcac agaggtactg 180 agaggtatgt 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<400> 811 gcctccctcg cgccatcagg acactctgat tgcagagaga actctgcctt caagggacaa 60 tggccatacc accctgattc tgcaacttac ctaggatgga gagtcgagtc ccatcaccaa 120 aatgctgggg ctgatgtcga cgacactctg attgcagtca ctgctggcac agaggtacat 180 agatgtctgg ttggtgctgg cggactccag aatcagggag aagcgctcct tcttctctct 240 agagacactg tacccctcag gaatatctcc tttttctttc attttaacat catatgagaa 300 atagatcagc cgtagcccca gacctgggtc ttgtcgatac cagaacatat tttcatggtc 360 catatcctgg acacattcca gaaaaacttt ctctcccgtc cttttgacta gatatctcga 420 gctctgggtt actttcacat ctacgaggcc tgtgagagac gacactctga ttgcagctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 812 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 812 gcctccctcg cgccatcagt tcggaacgat tgcagatcat tgcagtcaaa cccaggcacc 60 cccgagtcaa gagtggagcc cccatacctg tcacagtgag cctggtcccg ttcccaaagt 120 ggaggggtga attatgtcga cttcggaacg attgcagtca ctgctggcac agaggtacat 180 agatgtctgg ttggtgctgg cggactccag 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of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 838 gcctccctcg cgccatcagt tcggaactcc atgtgatcat tgcagtcaaa cccaggcacc 60 cccgagtcaa gagtggagcc cccatacctg tcacagtgag cctggtcccg ttcccaaagt 120 ggaggggtga attatgtcga cttcggaact ccatgtgtca caggcacaga gatagaagcc 180 agagtcactg agaaggagct tcttagaact caggatgaac tgccggtcct ggggtctgga 240 ggctgagaga ttctggggca cctcagagct gatctggcca ataccaacgg agtagaagag 300 cagctggagg cccctgcctg cagcctgtcg gtaccagtat aggttggggt ttgatgttcc 360 ctccacagtg cactccagag agagcgggct gcccacaggc tgcaccaggg tcgctggcca 420 ttgatgaata gtctgagatc tgacccctgt gggaaagata ttcggaactc catgtgctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 839 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 839 gcctccctcg cgccatcaga agtaacgtcc atgtggggtc gtgcaggctg ggctgctcac 60 cctctctccc acctggagcc cccttcttac ctagcacggt gagccgtgtc cctggcccga 120 agaactgctc attgtgtcga caagtaacgt ccatgtgtca caggcacaga 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/note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 876 atgaattcgt ctacagtctt gaagaacggg ttgaaaacaa cagtgtgcca agtcgcttct 60 cacctgaatg ccccaacagc tctcacttat ctacacaccc tgcagccaga agactcggcc 120 ctgtatctct gcgccagcag cgtgtctacg tcgacactga agctttcttt ggacaaggca 180 ccagactcac agttgtaggt aagacatttt tcaggttctt ttgcagatcc ggcatgcat 239 <210> 877 <211> 239 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 877 atgaattctg aatacttcag tgagacacag agaaacaaag gaaacttccc tggtcgattc 60 tcagggcgcc agttctctaa ctctcgctct tgtgagcacc ttggagctgg gggactcggc 120 cctttatctt tgcgccagca gagtaccgag tcgacactga agctttcttt ggacaaggca 180 ccagactcac agttgtaggt aagacatttt tcaggttctt ttgcagatcc ggcatgcat 239 <210> 878 <211> 239 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 878 atgaattctg aatatgctaa tgagttaagg agatcagaag gaaacttccc taatcgattc 60 tcagggcgcc agttccatga ctgttgctct tgtgagtgcc ttggagctgg gggactcggc 120 cctgtatctc tgtgccagaa gttgcctcag tcgacactga agctttcttt ggacaaggca 180 ccagactcac agttgtaggt aagacatttt tcaggttctt ttgcagatcc ggcatgcat 239 <210> 879 <211> 239 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 879 atgaattctc agtattatag ggaggaagag aatggcagag gaaacttccc tcctagattc 60 tcaggtctcc agttccctaa ttatagctct tgtgaacgcc ttggagctgg acgactcggc 120 cctgtatctc tgtgccagca gtcgttagcg tcgacactga agctttcttt ggacaaggca 180 ccagactcac agttgtaggt aagacatttt tcaggttctt ttgcagatcc ggcatgcat 239 <210> 880 <211> 239 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 880 atgaattctc agtattatga gaaagaagag agaggaagag gaaacttccc tgatcgattc 60 tcagctcgcc agttccctaa ctatagctct tgtgaacgcc ttgttgctgg gggactcggc 120 cctgtatctc tgtgccagca 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Synthetic polynucleotide" <400> 885 atgaattcta ctcagttggt gagggtacaa ctgccaaagg agaggtccct gatggctaca 60 atgtctccag attaaaaaaa cagaatttcc ttggagtcgg ctgctccctc ccaaacatct 120 gtgtacttct gtgccagcag tgtagcagtg tcgacactga agctttcttt ggacaaggca 180 ccagactcac agttgtaggt aagacatttt tcaggttctt ttgcagatcc ggcatgcat 239 <210> 886 <211> 239 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 886 atgaattcta ctcagttggt gagggtacaa ctgccaaagg agaggtccct gatggctaca 60 atgtctccag attaaaaaaa cagaatttcc ttggagtcgg ctgctccctc ccaaacatct 120 gtgtacttct gtgccagcag tggatcatcg tcgacactga agctttcttt ggacaaggca 180 ccagactcac agttgtaggt aagacatttt tcaggttctt ttgcagatcc ggcatgcat 239 <210> 887 <211> 239 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 887 atgaattcta ttcaaatact gcaggtacca ctggcaaagg agaagtccct gatggttata 60 gtgtctccag 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Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 892 atgaattcta ctcagttgct gctggtatca ctgacaaagg agaagtcccc gatggctaca 60 atgtatccag atcaaacaca gaggatttcc ctggagtcag ctgctccctc ccagacatct 120 gtatacttct gtgccagcag tcagtctgtg tcgacactga agctttcttt ggacaaggca 180 ccagactcac agttgtaggt aagacatttt tcaggttctt ttgcagatcc ggcatgcat 239 <210> 893 <211> 239 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 893 atgaattctt ccaaggcaag gatgcagcag acaaatcggg gcttccccgt gatcggttct 60 ctgcacagag gtctgaggga tccatctcca ttccagcgca cacagcaggg ggacttggct 120 gtgtatctct gtgccagcag ctccatgtgg tcgacactga agctttcttt ggacaaggca 180 ccagactcac agttgtaggt aagacatttt tcaggttctt ttgcagatcc ggcatgcat 239 <210> 894 <211> 239 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 894 atgaattctt 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ttgcagatcc ggcatgcat 239 <210> 899 <211> 239 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 899 atgaattctt ccagaatgaa gctcaactag acaaatcggg gctgcccagt gatcgcttct 60 ttgcagaaag gcctgaggga tccgtctcca atccagcgca cacagcagga ggactccgcc 120 gtgtatctct gtgccagcag catgacaccg tcgacactga agctttcttt ggacaaggca 180 ccagactcac agttgtaggt aagacatttt tcaggttctt ttgcagatcc ggcatgcat 239 <210> 900 <211> 239 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 900 atgaattctt ccagaatgaa gctcaactag aaaaatcaag gctgctcagt gatcggttct 60 ctgcagagag gcctaaggga tctttctcca atccagcgca cagagcaggg ggactcggcc 120 atgtatctct gtgccagcag ccttcacgag tcgacactga agctttcttt ggacaaggca 180 ccagactcac agttgtaggt aagacatttt tcaggttctt ttgcagatcc ggcatgcat 239 <210> 901 <211> 239 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 901 atgaattctc agtattataa tggagaagag agagcaaaag gaaacattct tgaacgattc 60 tccgcacaac agttccctga cttgcactct cctgagctct ctggagctgg gggactcagc 120 tttgtatttc tgtgccagca gcgtagagtg tcgacactga agctttcttt ggacaaggca 180 ccagactcac agttgtaggt aagacatttt tcaggttctt ttgcagatcc ggcatgcat 239 <210> 902 <211> 239 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 902 atgaattcta ctcatatggt gttcacgaca ctaacaaagg agaagtctca gatggctaca 60 gtgtctctag atcaaacaca gaggacctcc ctggagtctg ctgcctcctc ccagacatct 120 gtatatttct gcgccagcag ttcgtcgatg tcgacactga agctttcttt ggacaaggca 180 ccagactcac agttgtaggt aagacatttt tcaggttctt ttgcagatcc ggcatgcat 239 <210> 903 <211> 239 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 903 atgaattcta ctcagcagct gctgatatta cagataaagg agaagtcccc 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polynucleotide" <400> 910 atgaattctt ccgcaaccgg gctcctctag atgattcggg gatgccgaag gatcgattct 60 cagcagagat gcctgatgca actttagcca atccagccct cagaacccag ggactcagct 120 gtgtattttt gtgctagtgg tttcggaacg tcgacactga agctttcttt ggacaaggca 180 ccagactcac agttgtaggt aagacatttt tcaggttctt ttgcagatcc ggcatgcat 239 <210> 911 <211> 239 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 911 atgaattctc gttttatgaa aagatgcaga gcgataaagg aagcatccct gatcgattct 60 cagctcaaca gttcagtgac tatcattctg atgagctcct tggagctggg ggactcagcc 120 ctgtacttct gtgccagcag cgcaattcgg tcgacactga agctttcttt ggacaaggca 180 ccagactcac agttgtaggt aagacatttt tcaggttctt ttgcagatcc ggcatgcat 239 <210> 912 <211> 239 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 912 atgaattctt tgtgaaagag tctaaacagg atgagtccgg tatgcccaac aatcgattct 60 tagctgaaag gactggaggg 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of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 926 atgaattcag ctacaataat aaggagctca ttataaatga aacagttcca aatcgcttct 60 cacctaaatc tccagacaaa gctcacttaa atcaattccc tggagcttgg tgactctgct 120 gtgtatttct gtgccagcag ctacgtacgg tcgactatgg ctacaccttc ggttcgggga 180 ccaggttaac cgttgtaggt aaggctgggg gtctctagga ggggtgcgat ggcatgcat 239 <210> 927 <211> 239 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 927 atgaattcgt ctacagctat gagaaactct ctataaatga aagtgtgcca agtcgcttct 60 cacctgaatg ccccaacagc tctctcttaa ctacacgccc tgcagccaga agactcagcc 120 ctgtatctct gcgccagcag ctacgcgttg tcgactatgg ctacaccttc ggttcgggga 180 ccaggttaac cgttgtaggt aaggctgggg gtctctagga ggggtgcgat ggcatgcat 239 <210> 928 <211> 239 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 928 atgaattcgt ctacaacttt aaagaacaga ctgaaaacaa cagtgtgcca 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120 gtgtatctct gtgccagcag ctccatgtgg tcgactatgg ctacaccttc ggttcgggga 180 ccaggttaac cgttgtaggt aaggctgggg gtctctagga ggggtgcgat ggcatgcat 239 <210> 947 <211> 239 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 947 atgaattctt ccaaggcaac agtgcaccag acaaatcagg gctgcccagt gatcgcttct 60 ctgcagagag gactggggga tccgtctcca atccagcgca cacagcagga ggactcggcc 120 gtgtatctct gtgccagcag ctcactgcag tcgactatgg ctacaccttc ggttcgggga 180 ccaggttaac cgttgtaggt aaggctgggg gtctctagga ggggtgcgat ggcatgcat 239 <210> 948 <211> 239 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 948 atgaattctt ccaaggcacg ggtgcggcag atgactcagg gctgcccaac gatcggttct 60 ttgcagtcag gcctgaggga tccgtctcta atccagcgca cagagcgggg ggactcagcc 120 gtgtatctct gtgccagcag ccaagtcacg tcgactatgg ctacaccttc ggttcgggga 180 ccaggttaac cgttgtaggt aaggctgggg gtctctagga 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of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 951 atgaattctt caattatgaa gctcaaccag acaaatcagg gctgcccagt gatcggttct 60 ctgcagagag gcctgaggga tccatctcca attcagcgca cagagcagcg ggactcagcc 120 atgtatcgct gtgccagcag cctcgagaag tcgactatgg ctacaccttc ggttcgggga 180 ccaggttaac cgttgtaggt aaggctgggg gtctctagga ggggtgcgat ggcatgcat 239 <210> 952 <211> 239 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 952 atgaattctt ccagaatgaa gctcaactag acaaatcggg gctgcccagt gatcgcttct 60 ttgcagaaag gcctgaggga tccgtctcca atccagcgca cacagcagga ggactccgcc 120 gtgtatctct gtgccagcag catgacaccg tcgactatgg ctacaccttc ggttcgggga 180 ccaggttaac cgttgtaggt aaggctgggg gtctctagga ggggtgcgat ggcatgcat 239 <210> 953 <211> 239 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 953 atgaattctt ccagaatgaa gctcaactag aaaaatcaag gctgctcagt 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of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 976 atgaattcgc aaatcagggc tctgaggcca catatgagag tggatttgtc attgacaagt 60 ttcccatcag ccgcccaaac ctaacattct actgtgagca acatgagccc tgaagacagc 120 agcatatatc tctgcagcgt tagcaatccg tcgactatgg ctacaccttc ggttcgggga 180 ccaggttaac cgttgtaggt aaggctgggg gtctctagga ggggtgcgat ggcatgcat 239 <210> 977 <211> 239 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 977 atgaattcct cttctactcc gttggtattg gccagatcag ctctgaggtg ccccagaatc 60 tctcagcctc cagaccccag gaccggcagt agttctaaga agctccttct cagtgactct 120 ggcttctatc tctgtgcctg gcgaactacg tcgactatgg ctacaccttc ggttcgggga 180 ccaggttaac cgttgtaggt aaggctgggg gtctctagga ggggtgcgat ggcatgcat 239 <210> 978 <211> 239 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 978 atgaattctt ttataataat gaaatctcag agaagtctga aatattcgat 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1028 atgaattctt ctcatatgat gttaaaatga aagaaaaagg agatattcct gaggggtaca 60 gtgtctctag agagaagaag gagcgcttct ctggagtccg ccagcaccaa ccagacatct 120 atgtacctct gtgccagcag tttggactgg tcgacgaaac accatatatt ttggagaggg 180 aagttggctc actgttgtag gtgagtaagt caaggctgga cagctgggaa cgcatgcat 239 <210> 1029 <211> 239 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 1029 atgaattcgc aaatcagggc tctgaggcca catatgagag tggatttgtc attgacaagt 60 ttcccatcag ccgcccaaac ctaacattct actgtgagca acatgagccc tgaagacagc 120 agcatatatc tctgcagcgt tagcaatccg tcgacgaaac accatatatt ttggagaggg 180 aagttggctc actgttgtag gtgagtaagt caaggctgga cagctgggaa cgcatgcat 239 <210> 1030 <211> 239 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 1030 atgaattcct cttctactcc gttggtattg gccagatcag ctctgaggtg ccccagaatc 60 tctcagcctc cagaccccag gaccggcagt agttctaaga 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Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 1053 atgaattctt ccaaggcaac agtgcaccag acaaatcagg gctgcccagt gatcgcttct 60 ctgcagagag gactggggga tccgtctcca atccagcgca cacagcagga ggactcggcc 120 gtgtatctct gtgccagcag ctcactgcag tcgacaatga aaaactgttt tttggcagtg 180 gaacccagct ctctgtcttg ggtatgtaaa agacttcttt cgggatagtg tgcatgcat 239 <210> 1054 <211> 239 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 1054 atgaattctt ccaaggcacg ggtgcggcag atgactcagg gctgcccaac gatcggttct 60 ttgcagtcag gcctgaggga tccgtctcta atccagcgca cagagcgggg ggactcagcc 120 gtgtatctct gtgccagcag ccaagtcacg tcgacaatga aaaactgttt tttggcagtg 180 gaacccagct ctctgtcttg ggtatgtaaa agacttcttt cgggatagtg tgcatgcat 239 <210> 1055 <211> 239 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 1055 atgaattctc ccagagtgat gctcaacgag acaaatcagg gcggcccagt 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Synthetic polynucleotide" <400> 1062 atgaattcta ctcagcagct gctgatatta cagataaagg agaagtcccc gatggctatg 60 ttgtctccag atccaagaca gagaatttcc ctggagtcag ctacccgctc ccagacatct 120 gtgtatttct gcgccagcag tagctagtgg tcgacaatga aaaactgttt tttggcagtg 180 gaacccagct ctctgtcttg ggtatgtaaa agacttcttt cgggatagtg tgcatgcat 239 <210> 1063 <211> 239 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 1063 atgaattcta ctcatatggt gttaaagata ctgacaaagg agaagtctca gatggctata 60 gtgtctctag atcaaagaca gaggatttcc ctggagtccg ctaccagctc ccagacatct 120 gtgtacttct gtgccatcag ttgagacctg tcgacaatga aaaactgttt tttggcagtg 180 gaacccagct ctctgtcttg ggtatgtaaa agacttcttt cgggatagtg tgcatgcat 239 <210> 1064 <211> 239 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 1064 atgaattctt tcaggatgag agtgtagtag atgattcaca gttgcctaag gatcgatttt 60 ctgcagagag 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1071 atgaattctt tgtgaaagag tctaaacagg atgagtccgg tatgcccaac aatcgattct 60 tagctgaaag gactggaggg acgtattcta gtgcagcctg cagaactgga ggattctgga 120 gtttatttct gtgccagcag ccaagaggtg tcgacaatga aaaactgttt tttggcagtg 180 gaacccagct ctctgtcttg ggtatgtaaa agacttcttt cgggatagtg tgcatgcat 239 <210> 1072 <211> 239 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 1072 atgaattcca ctactatgac aaagatttta acaatgaagc agacacccct gataacttcc 60 aatccaggag gccgaacact tctttctgct atccgctcac caggcctggg ggacgcagcc 120 atgtacctgt gtgccaccag cgaatggacg tcgacaatga aaaactgttt tttggcagtg 180 gaacccagct ctctgtcttg ggtatgtaaa agacttcttt cgggatagtg tgcatgcat 239 <210> 1073 <211> 239 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 1073 atgaattctt ccagaatgaa aatgtctttg atgaaacagg tatgcccaag gaaagatttt 60 cagctaagtg cctcccaaat tcaccctgta atccaggcta 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Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 1096 atgaattcta ctcagcttct gagggtacca ctgacaaagg agaagtcccc aatggctaca 60 atgtctccag attaaacaaa cgggagttct ctggagtcgg ctgctccctc ccagacatct 120 gtgtacttct gtgccagcag ttgatgcgag tcgacatcag ccccagcatt ttggtgatgg 180 gactcgactc tccatcctag gtaagttgca gaatcagggt ggtatggcca tgcatgcat 239 <210> 1097 <211> 239 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 1097 atgaattcta ctcagttggt gagggtacaa ctgccaaagg agaggtccct gatggctaca 60 atgtctccag attaaaaaaa cagaatttcc ttggagtcgg ctgctccctc ccaaacatct 120 gtgtacttct gtgccagcag tgtagcagtg tcgacatcag ccccagcatt ttggtgatgg 180 gactcgactc tccatcctag gtaagttgca gaatcagggt ggtatggcca tgcatgcat 239 <210> 1098 <211> 239 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 1098 atgaattcta ctcagttggt gagggtacaa ctgccaaagg agaggtccct 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/note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 1130 atgaattctc caatgagggc tccaaggcca catacgagca aggcgtcgag aaggacaagt 60 ttctcatcaa ccatgcaagc ctgaccttgt acagtgacca gtgcccatcc tgaagacagc 120 agcttctaca tctgcagtgc tagttgaccg tcgacatcag ccccagcatt ttggtgatgg 180 gactcgactc tccatcctag gtaagttgca gaatcagggt ggtatggcca tgcatgcat 239 <210> 1131 <211> 239 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 1131 atgaattcac tcctttgatg tcaaagatat aaacaaagga gagatctctg atggatacag 60 tgtctctcga caggcacagg ctaaattctc tagagtctgc catccccaac cagacagctc 120 tttacttctg tgccaccagt ggtctcctag tcgacatcag ccccagcatt ttggtgatgg 180 gactcgactc tccatcctag gtaagttgca gaatcagggt ggtatggcca tgcatgcat 239 <210> 1132 <211> 239 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 1132 atgaattcta ttcctatgga gttaattcca 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Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 1139 atgaattcgt ctacagctat gagaaactct ctataaatga aagtgtgcca agtcgcttct 60 cacctgaatg ccccaacagc tctctcttaa ctacacgccc tgcagccaga agactcagcc 120 ctgtatctct gcgccagcag ctacgcgttg tcgacataat tcacccctcc actttgggaa 180 cgggaccagg ctcactgtga caggtatggg ggctccactc ttgactcggg ggcatgcat 239 <210> 1140 <211> 239 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 1140 atgaattcgt ctacaacttt aaagaacaga ctgaaaacaa cagtgtgcca agtcgcttct 60 cacctgaatg ccccaacagc tctcacttat ctacacaccc tgcagccaga agactcggcc 120 ctgtatctct gcgccagcag cctcagtgag tcgacataat tcacccctcc actttgggaa 180 cgggaccagg ctcactgtga caggtatggg ggctccactc ttgactcggg ggcatgcat 239 <210> 1141 <211> 239 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 1141 atgaattcgt ctacagtctt gaagaacggg ttgaaaacaa cagtgtgcca 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tggagaagag agagcaaaag gaaacattct tgaacgattc 60 tccgcacaac agttccctga cttgcactct cctgagctct ctggagctgg gggactcagc 120 tttgtatttc tgtgccagca gcgtagagtg tcgacataat tcacccctcc actttgggaa 180 cgggaccagg ctcactgtga caggtatggg ggctccactc ttgactcggg ggcatgcat 239 <210> 1167 <211> 239 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 1167 atgaattcta ctcatatggt gttcacgaca ctaacaaagg agaagtctca gatggctaca 60 gtgtctctag atcaaacaca gaggacctcc ctggagtctg ctgcctcctc ccagacatct 120 gtatatttct gcgccagcag ttcgtcgatg tcgacataat tcacccctcc actttgggaa 180 cgggaccagg ctcactgtga caggtatggg ggctccactc ttgactcggg ggcatgcat 239 <210> 1168 <211> 239 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 1168 atgaattcta ctcagcagct gctgatatta cagataaagg agaagtcccc gatggctatg 60 ttgtctccag atccaagaca gagaatttcc ctggagtcag ctacccgctc ccagacatct 120 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Synthetic polynucleotide" <400> 1277 atgaattctt tcagaataac ggtgtagtgg atgattcaca gttgcctaag gatcgatttt 60 ctgcagagag gctcaaagga gtagactcca atccagcctg caaagcttga ggactcggcc 120 gtgtatctct gtgccagcag cgcatctgag tcgacaccgg ggagctgttt tttggagaag 180 gctctaggct gaccgtactg ggtaaggagg cggttggggc tccggagagc tgcatgcat 239 <210> 1278 <211> 239 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 1278 atgaattcta tgagaatgag gaagcagtag acgattcaca gttgcctaag gatcgatttt 60 ctgcagagag gctcaaagga gtagactcca atccagcctg cagagcttgg ggactcggcc 120 gtgtatctct gtgccagcag cgacactctg tcgacaccgg ggagctgttt tttggagaag 180 gctctaggct gaccgtactg ggtaaggagg cggttggggc tccggagagc tgcatgcat 239 <210> 1279 <211> 239 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 1279 atgaattctt taacaacaac gttccgatag atgattcagg gatgcccgag gatcgattct 60 cagctaagat 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Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 1311 atgaattcta ttcaaatact gcaggtacca ctggcaaagg agaagtccct gatggttata 60 gtgtctccag agcaaacaca gatgatttcc ttggcgtctg ctgtaccctc tcagacatct 120 gtgtacttct gtgccagcag tgtgaacgtg tcgacagata cgcagtattt tggcccaggc 180 acccggctga cagtgctcgg taagcggggg ctcccgctga agccccggaa cgcatgcat 239 <210> 1312 <211> 239 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 1312 atgaattcta ctcagttggt gctggtatca ctgaccaagg agaagtcccc aatggctaca 60 atgtctccag atcaaccaca gaggatttcc ctgctgtcgg ctgctccctc ccagacatct 120 gtgtacttct gtgccagcag ttgtcatcgg tcgacagata cgcagtattt tggcccaggc 180 acccggctga cagtgctcgg taagcggggg ctcccgctga agccccggaa cgcatgcat 239 <210> 1313 <211> 239 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 1313 atgaattcta ttcagttggt gctggtatca ctgacaaagg agaagtcccg 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Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 1354 atgaattctg aatacttcag tgagacacag agaaacaaag gaaacttccc tggtcgattc 60 tcagggcgcc agttctctaa ctctcgctct tgtgagcacc ttggagctgg gggactcggc 120 cctttatctt tgcgccagca gagtaccgag tcgacaaaac attcagtact tcggcgccgg 180 gacccggctc tcagtgctgg gtaagctggg gccgccgggg gaccggggac ggcatgcat 239 <210> 1355 <211> 239 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 1355 atgaattctg aatatgctaa tgagttaagg agatcagaag gaaacttccc taatcgattc 60 tcagggcgcc agttccatga ctgttgctct tgtgagtgcc ttggagctgg gggactcggc 120 cctgtatctc tgtgccagaa gttgcctcag tcgacaaaac attcagtact tcggcgccgg 180 gacccggctc tcagtgctgg gtaagctggg gccgccgggg gaccggggac ggcatgcat 239 <210> 1356 <211> 239 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 1356 atgaattctc agtattatag ggaggaagag aatggcagag gaaacttccc 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/note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 1388 atgaattctc gttttatgaa aagatgcaga gcgataaagg aagcatccct gatcgattct 60 cagctcaaca gttcagtgac tatcattctg atgagctcct tggagctggg ggactcagcc 120 ctgtacttct gtgccagcag cgcaattcgg tcgacaaaac attcagtact tcggcgccgg 180 gacccggctc tcagtgctgg gtaagctggg gccgccgggg gaccggggac ggcatgcat 239 <210> 1389 <211> 239 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 1389 atgaattctt tgtgaaagag tctaaacagg atgagtccgg tatgcccaac aatcgattct 60 tagctgaaag gactggaggg acgtattcta gtgcagcctg cagaactgga ggattctgga 120 gtttatttct gtgccagcag ccaagaggtg tcgacaaaac attcagtact tcggcgccgg 180 gacccggctc tcagtgctgg gtaagctggg gccgccgggg gaccggggac ggcatgcat 239 <210> 1390 <211> 239 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 1390 atgaattcca ctactatgac aaagatttta 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Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 1456 atgaattcag ctacaataat aaggagctca ttataaatga aacagttcca aatcgcttct 60 cacctaaatc tccagacaaa gctcacttaa atcaattccc tggagcttgg tgactctgct 120 gtgtatttct gtgccagcag ctacgtacgg tcgacgggcc aacgtcctga ctttcggggc 180 cggcagcagg ctgaccgtgc tgggtgagtt ttcgcgggac cacccgggcg ggcatgcat 239 <210> 1457 <211> 239 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 1457 atgaattcgt ctacagctat gagaaactct ctataaatga aagtgtgcca agtcgcttct 60 cacctgaatg ccccaacagc tctctcttaa ctacacgccc tgcagccaga agactcagcc 120 ctgtatctct gcgccagcag ctacgcgttg tcgacgggcc aacgtcctga ctttcggggc 180 cggcagcagg ctgaccgtgc tgggtgagtt ttcgcgggac cacccgggcg ggcatgcat 239 <210> 1458 <211> 239 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 1458 atgaattcgt ctacaacttt aaagaacaga ctgaaaacaa cagtgtgcca agtcgcttct 60 cacctgaatg ccccaacagc tctcacttat ctacacaccc tgcagccaga agactcggcc 120 ctgtatctct gcgccagcag cctcagtgag tcgacgggcc aacgtcctga ctttcggggc 180 cggcagcagg ctgaccgtgc tgggtgagtt ttcgcgggac cacccgggcg ggcatgcat 239 <210> 1459 <211> 239 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 1459 atgaattcgt ctacagtctt gaagaacggg ttgaaaacaa cagtgtgcca agtcgcttct 60 cacctgaatg ccccaacagc tctcacttat ctacacaccc tgcagccaga agactcggcc 120 ctgtatctct gcgccagcag cgtgtctacg tcgacgggcc aacgtcctga ctttcggggc 180 cggcagcagg ctgaccgtgc tgggtgagtt ttcgcgggac cacccgggcg ggcatgcat 239 <210> 1460 <211> 239 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 1460 atgaattctg aatacttcag tgagacacag agaaacaaag gaaacttccc tggtcgattc 60 tcagggcgcc agttctctaa ctctcgctct tgtgagcacc 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Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 1526 atgaattcta ctcagttgct gctgctctca ctgacaaagg agaagttccc aatggctaca 60 atgtctccag atcaaacaca gaggatttcc ctggagtcag ctgctccctc tcagacttct 120 gtttacttct gtgccagcag tacacacgtg tcgacacgag cagtacttcg ggccgggcac 180 caggctcacg gtcacaggtg agattcgggc gtctccccac cttccagccc cgcatgcat 239 <210> 1527 <211> 239 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 1527 atgaattcta ctactcagct gctgctggta ctactgacaa agaagtcccc aatggctaca 60 atgtctctag attaaacaca gaggatttcc ctggtgtcgg ctgctccctc ccagacatct 120 gtgtacttgt gtgccagcag ttccacagtg tcgacacgag cagtacttcg ggccgggcac 180 caggctcacg gtcacaggtg agattcgggc gtctccccac cttccagccc cgcatgcat 239 <210> 1528 <211> 239 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 1528 atgaattcta ctcagttgct gctggtatca ctgacaaagg agaagtcccc 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<400> 1563 gccttgccag cccgctcagc tctgattttg cctcacagaa atcttccaac ttggaaggga 60 gaacgaagtc agtcaccagg cagactgggt catctgctga aatcacttgc gatcttactg 120 taacaaatac cttctacatc cactggtacc tacaccagga ggggaaggcc ccacagcgtc 180 ttctgtacta tgacgtctcc accgcaaggg atgtgttgga atcaggactc agtccaggaa 240 agtattatac tcatacaccc aggaggtgga gctggatatt gagactgcaa aatctaattg 300 aaaatgattc tggggtctat tactgtgcca cctggtgact ctgattttgc ctcagtcgac 360 attataagaa actctttggc agtggaacaa cacttgttgt cacaggtaag tatcggaaga 420 atacaacatt tccaaggtaa tagagggaag gcaggaaatg ctctgatttt gcctcactga 480 tggcgcgagg gaggc 495 <210> 1564 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 1564 gccttgccag cccgctcagt acgtacgttg cctcacagaa atcttccaac ttggaaggga 60 gaacgaagtc agtcatcagg cagactgggt catctgctga aatcacttgt gatcttgctg 120 aaggaagtac cggctacatc cactggtacc tacaccagga ggggaaggcc ccacagcgtc 180 ttctgtacta tgactcctac acctccagcg 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Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 1586 gccttgccag cccgctcaga ctatgactcg ttagcgggca gttggaacaa cctgaaatat 60 ctatttccag accagcaaat aagagtgccc acatatcttg gaaggcatcc atccaaggct 120 ttagcagtaa aatcatacac tggtactggc agaaaccaaa caaaggctta gaatatttat 180 tacatgtctt cttgacaatc tctgctcaag attgctcagg tgggaagact aagaaacttg 240 aggtaagtaa aaatgctcac acttccactt ccactttgaa aataaagttc ttagagaaag 300 aagatgaggt ggtgtaccac tgtgcctgct ggatttgaac tatgactcgt tagcgtcgac 360 attataagaa actctttggc agtggaacaa cacttgttgt cacaggtaag tatcggaaga 420 atacaacatt tccaaggtaa tagagggaaa gcaggaaatt actatgactc gttagcctga 480 tggcgcgagg gaggc 495 <210> 1587 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 1587 gccttgccag cccgctcagg acgttaatcg ttagctccct gacagctggc tggtggctca 60 tcaggccgga gcagctggcc catgtcctgg ggcactaggg aagcttggtc 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Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 1629 gccttgccag cccgctcagg acgttaatgg acatgtccct gacagctggc tggtggctca 60 tcaggccgga gcagctggcc catgtcctgg ggcactaggg aagcttggtc atcctgcagt 120 gcgtggtccg caccaggatc agctacaccc actggtacca gcagaagggc caggtccctg 180 aggcactcca ccagctggcc atgtccaagt tggatgtgca gtgggattcc atcctgaaag 240 cagataaaat catagccaag gatggcagca gctctatctt ggcagtactg aagttggaga 300 caggcatcga gggcatgaac tactgcacaa cctggtgaga cgttaatgga catggtcgac 360 agtgattgga tcaagacgtt tgcaaaaggg actaggctca tagtaacttc gcctggtaag 420 taattttttt tctgttttta ttccagtaat gaaaaactga gacgttaatg gacatgctga 480 tggcgcgagg gaggc 495 <210> 1630 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 1630 gccttgccag cccgctcaga caagatatgg acatggcaat aaaaaatgtc aactacattt 60 ttgtcaacag agcaacagat aaaagtgtct aggtatcttg tgtggtgtcc 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of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 1644 aacaaaggag aagtctcaga tggctacag 29 <210> 1645 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 1645 gataaaggag aagtccccga tggctatgt 29 <210> 1646 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 1646 gacaaaggag aagtctcaga tggctatag 29 <210> 1647 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 1647 gccaaaggag aggtccctga tggctacaa 29 <210> 1648 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 1648 ctctagatta aacacagagg atttcccac 29 <210> 1649 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 1649 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Sequence: Synthetic primer" <400> 1697 acaacggtta acctggtccc cgaaccgaag gtg 33 <210> 1698 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 1698 acaacagtga gccaacttcc ctctccaaaa tat 33 <210> 1699 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 1699 aagacagaga gctgggttcc actgccaaaa aac 33 <210> 1700 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 1700 aggatggaga gtcgagtccc atcaccaaaa tgc 33 <210> 1701 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 1701 gtcacagtga gcctggtccc gttcccaaag tgg 33 <210> 1702 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 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of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 1735 ggaggggaag gccccacagc atcttc 26 <210> 1736 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 1736 ggcggggaag gccccacagc atcttc 26 <210> 1737 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 1737 tgaagtcata cagttcctgg tgtccat 27 <210> 1738 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 1738 ccaaatcagg ctttggagca cctgatct 28 <210> 1739 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 1739 caaaggctta gaatatttat tacatgt 27 <210> 1740 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 1740 ccaggtccct 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Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 1771 caagcagaag acggcatacg agctcttccg atctatctct gatggataca gtgtctctcg 60 aca 63 <210> 1772 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 1772 caagcagaag acggcatacg agctcttccg atcttttcct ctgagtcaac agtctccaga 60 ata 63 <210> 1773 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 1773 caagcagaag acggcatacg agctcttccg atctctctga gaggtatcat gtttcttgaa 60 ata 63 <210> 1774 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 1774 caagcagaag acggcatacg agctcttccg atcttcctga agggtacaaa gtctctcgaa 60 aag 63 <210> 1775 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 1775 caagcagaag acggcatacg agctcttccg 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Synthetic primer" <400> 1797 caagcagaag acggcatacg agctcttccg atcttccccg tgatcggttc tctgcacaga 60 ggt 63 <210> 1798 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 1798 caagcagaag acggcatacg agctcttccg atctagtgat cgcttctctg cagagaggac 60 tgg 63 <210> 1799 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 1799 caagcagaag acggcatacg agctcttccg atctggctgc ccaacgatcg gttctttgca 60 gt 62 <210> 1800 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 1800 caagcagaag acggcatacg agctcttccg atctggcggc ccagtggtcg gttctctgca 60 gag 63 <210> 1801 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 1801 caagcagaag acggcatacg agctcttccg atctatgatc ggttctctgc 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Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 1816 gcctccctcg cgccatcaga gagtgtcagt tgacccttgc ctggcccagt acacctggct 60 ccccgctatc cccagacagc agactcacct gaggagacgg tgaccagggt gccctggccc 120 cagtgctgga agtatgtcga cagagtgtca gttgacctca tgcacagtaa tatgtggctg 180 tgtccacagg gtccatgttg gtcattgtaa ggaccacctg gtttttggag gtgtccttgg 240 tgatggtgag cctgctcttc agagatgggc tgtagcgctt atcatcattc caataaatga 300 gtgcaagcca ctccagggcc tttcctgggg gctgacggat ccagcccaca cccactccac 360 tagtgctgag tgagaaccca gagaaggtgc aggtcagcgt gagggtctgt gtgggtttca 420 ccagcgtagg accagactcc ttcaaggtga tctgggacaa agagtgtcag ttgaccctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 1817 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 1817 gcctccctcg cgccatcaga gagtgtccag catatcttgc ctggcccagt acacctggct 60 ccccgctatc cccagacagc agactcacct gaggagacgg tgaccagggt gccctggccc 120 cagtgctgga agtatgtcga cagagtgtcc agcatattca tgcacagtaa 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Synthetic polynucleotide" <400> 1820 gcctccctcg cgccatcaga gagtgtcgca taactcttgc ctggcccagt acacctggct 60 ccccgctatc cccagacagc agactcacct gaggagacgg tgaccagggt gccctggccc 120 cagtgctgga agtatgtcga cagagtgtcg cataacttca tgcacagtaa tacaaggccg 180 tgtcctcagc tctcagactg ttcatttgca gatacaggga gttcttggcg ttgtctctgg 240 agatggtgaa tcggcccttc acagagtccg catagcctat gctaccacta ttccaactaa 300 tacctgagac ccactccagg cccttccctg gagcttgccg gacccagtgc atggcataat 360 catcaaaggt gaatccagag gctgcacagg agagtctcag ggacctgcca ggctgtacca 420 agcctccccc agactccacc agctgcactt cacactggac agagtgtcgc ataactctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 1821 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 1821 gcctccctcg cgccatcaga gagtgtcata tgctgcttgc ctggcccagt acacctggct 60 ccccgctatc cccagacagc agactcacct gaggagacgg tgaccagggt gccctggccc 120 cagtgctgga agtatgtcga cagagtgtca tatgctgtca acagtaatac acggccgtgt 180 cctcggctct 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Synthetic polynucleotide" <400> 1863 gcctccctcg cgccatcaga gagtgtcacg tgtgtcttgc ctggcccagt acacctggct 60 ccccgctatc cccagacagc agactcacct gaggagacgg tgaccagggt gccctggccc 120 cagtgctgga agtatgtcga cagagtgtca cgtgtgttca cttaaaaatg cgtagttgtg 180 tgttcactgg gcacagagct cagctgtaag aactgtttct tggatctgga tatggactct 240 tgagcagtgg gttgtaattt gtgctccctt cacaacccat gcacctgatc cactcctgtc 300 catcttctag gggcaagcag atacaattct agcaggaaac actggttatg atggggaatc 360 cagagacagt gcaggtgagg agagggtctg caaggagtct caagccagaa gtgtgctgag 420 aaacatagtt gttgatgtta acaggttctg ggcaacacag agagtgtcac gtgtgtctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 1864 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 1864 gcctccctcg cgccatcaga gagtgtctcc gtctacttgc ctggcccagt acacctggct 60 ccccgctatc cccagacagc agactcacct gaggagacgg tgaccagggt gccctggccc 120 cagtgctgga agtatgtcga cagagtgtct ccgtctatca gctctaaaat acatggctat 180 gtgtttgttc 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Synthetic polynucleotide" <400> 1906 gcctccctcg cgccatcaga gagtgtccag tctgtcttgc ctggcccagt acacctggct 60 ccccgctatc cccagacagc agactcacct gaggagacgg tgaccagggt gccctggccc 120 cagtgctgga agtatgtcga cagagtgtcc agtctgttca agtaatacat ggccgtgtcc 180 ttagctttca gactgtccat ttgcagatag agcatgctct tagaattgtc tcggagattg 240 tgaatcggcc cttcacagag tctgcatagt atttctgact tccatcattc cagatatgtg 300 ccactcactc cagccccttc cctggagcct ggcggaccca gctcatgcca tagctactaa 360 aggagaatcc tgaggctgca caggagagtc tcagggaccc cccaggctgg accaagcctc 420 ccccagactc caccagctgc acctcacact ggacacctgc agagtgtcca gtctgtctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 1907 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 1907 gcctccctcg cgccatcaga gagtgtcaac gcgtacttgc ctggcccagt acacctggct 60 ccccgctatc cccagacagc agactcacct gaggagacgg tgaccagggt gccctggccc 120 cagtgctgga agtatgtcga cagagtgtca acgcgtatca gtacagtaat agatggccgt 180 gtactcggtt 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<400> 1910 gcctccctcg cgccatcaga gagtgtctta acgtccttgc ctggcccagt acacctggct 60 ccccgctatc cccagacagc agactcacct gaggagacgg tgaccagggt gccctggccc 120 cagtgctgga agtatgtcga cagagtgtct taacgtctca acagtaatac acggtcatgt 180 cctcagctct caggctgttc acttgcagat agagggagtt cttggcattg tctctggaga 240 tggtcaatcg gcccttcaca gagtctacat agtatttctc acttccgtca cactttatgt 300 cggccaccca ctccagcccc ttctccggag cctggcagac ccagtgcatc caggagctac 360 tgaaggtgaa tccagaggct gcacaggaga gtctcaggga ccctccaggc tgtaccaagc 420 ctcacccaga ctccaccagc tgcacctcac actggacacc agagtgtctt aacgtcctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 1911 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 1911 gcctccctcg cgccatcaga gagtgtcagc aacctcttgc ctggcccagt acacctggct 60 ccccgctatc cccagacagc agactcacct gaggagacgg tgaccagggt gccctggccc 120 cagtgctgga agtatgtcga cagagtgtca gcaaccttca catacagtaa tacacggccg 180 tgccctctgc tctcagactg ttcatttgca 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<220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 1972 gcctccctcg cgccatcagg ttccgaacgc ttaattggcc tggtgcctgg acagagaaga 60 ctgggagggg gctgcagtgg gactcacctg aggagacagt gaccagggtg ccacggcccc 120 agagatcgaa gtaccgtcga cgttccgaac gcttaattca acagtaatac acggccgtgt 180 ccgcggcagt cacagagctc agcttcaggg agaactggtt cttagacgtg tctactgata 240 tggtaactcg actcttgagg gacgggttgt agtaggtgct cccactgtaa tagatgtacc 300 caatccactc caggcccttc cctgggtgct ggcggatcca gctccagtag taaccaccac 360 tgctgatgga gccaccagag acagtacagg tgagggacag ggtctgtgaa ggcttcacca 420 gtcctgggcc cgactcctgc agctgcacct ggggcaggac gttccgaacg cttaatctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 1973 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 1973 gcctccctcg cgccatcagg ttccgaatgg ttatctggcc tggtgcctgg acagagaaga 60 ctgggagggg gctgcagtgg gactcacctg aggagacagt gaccagggtg ccacggcccc 120 agagatcgaa 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/note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 1976 gcctccctcg cgccatcagg ttccgaaacg tactctggcc tggtgcctgg acagagaaga 60 ctgggagggg gctgcagtgg gactcacctg aggagacagt gaccagggtg ccacggcccc 120 agagatcgaa gtaccgtcga cgttccgaaa cgtactctca acagtaatac acggccgtgt 180 ccgcagcggt cacagagctc agcttcaggg agaactggtt cttggacgtg tctactgata 240 tggtgactcg actcttgagg gaggggttgt agttggtgct cccactgtaa tagatatacc 300 caatccactc cagtcccttc cctgggggct gccggatcca gctccagtag taaccaccac 360 tgctgacgga gccaccagag acagtgcagg tgagggacag ggtctccgaa ggcttcacca 420 gtcctgggcc cgactcctgc agctgcacct gggacaggac gttccgaaac gtactcctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 1977 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 1977 gcctccctcg cgccatcagg ttccgaatga tgcgatggcc tggtgcctgg acagagaaga 60 ctgggagggg gctgcagtgg gactcacctg aggagacagt gaccagggtg ccacggcccc 120 agagatcgaa gtaccgtcga cgttccgaat 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cctgagaatt catacttgat cactcactgt 300 tggcacccac acctatccct gttgtgaagc gtgctggacc aagctcatgc tgtaaccagt 360 aaaggtgaaa ccagaggctt tgcaggagag tctcaccact gggctgtaaa ttttttcccc 420 ctctgactcc atcagtaaac ttcacacagg acttccgtga gttccgaata gacggactga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 2002 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 2002 gcctccctcg cgccatcagg ttccgaagag cgatatggcc tggtgcctgg acagagaaga 60 ctgggagggg gctgcagtgg gactcacctg aggagacagt gaccagggtg ccacggcccc 120 agagatcgaa gtaccgtcga cgttccgaag agcgatatca agtaatacac tgcctactcc 180 tcagctttcc agtagataat tttaagggag attgtgatgt taagtgttgt ccccaggaac 240 tgtgaatctt ctttgtgctg gagcagagca ccactgagaa cttccacttg ggtcactcat 300 ggctaccacc cactccagcc cctctcctcc agccatcagg gcccaataaa tgctgcagtc 360 agtgaaggtg aatcttgatg ctttgcagaa gaagctaaga gaatagccag gctattttgc 420 caaagacaaa aatatagatc cagtaaacct ttgtggtttt gttccgaaga gcgatactga 480 gcgggctggc 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ggatccagga aacagaatgt tcagaaattg 360 aatgtgcata ggcggcatag gtgaggctga gcatgaccaa ggggaccact acttcttcct 420 cccattgcac aaggtggtcc tcactgtgaa cccctgagaa gttccgaaca ctagctctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 2014 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 2014 gcctccctcg cgccatcagg ttccgaaggt caacttggcc tggtgcctgg acagagaaga 60 ctgggagggg gctgcagtgg gactcacctg aggagacagt gaccagggtg ccacggcccc 120 agagatcgaa gtaccgtcga cgttccgaag gtcaacttca gcacagtagt acacatctat 180 gtcctcagat ctctgactgc tcagctccat gtaggctgtg ctcgtggacg tgtccctggt 240 catggtgact ctgccctgaa acttctgtgc atagcctgtg ttaccattgc cagagtagct 300 ccctaccatc cattcaaacc cttatccagg ggcctgtcac acacagtgaa tgtcgtagct 360 ggcgaaggtg tatccagagc tttgcaggag accttcactg aggccatgga cgctggcaac 420 aggagagtca tcagaagctg ggtgagtcat ataatcagga gttccgaagg tcaactctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 2015 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 2015 gcctccctcg cgccatcagg ttccgaatac gtacgtggcc tggtgcctgg acagagaaga 60 ctgggagggg gctgcagtgg gactcacctg aggagacagt gaccagggtg ccacggcccc 120 agagatcgaa gtaccgtcga cgttccgaat acgtacgtca acaggaatac acgaccatgt 180 cttcagatct caggctgctc agctccatgt aggctgtgct cacggacctg tcactggtaa 240 tggtgactct gccccggaac ttctgtgcgt agtgtgtgtt atcattgtaa gggttgatgc 300 atcccaacca ctatgccctt gtccagggcc ctgtcgcacc cactgtgtaa agtatttggt 360 gaaggtgtat ctggaagcct ggccaggaga ccttcactga ggacgcaggc ttcttcacct 420 cagccccagg ctgcaacagc tgaacctggg aatggacatc gttccgaata cgtacgctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 2016 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 2016 gcctccctcg cgccatcagg ttccgaaatg acacctggcc tggtgcctgg acagagaaga 60 ctgggagggg gctgcagtgg gactcacctg aggagacagt gaccagggtg ccacggcccc 120 agagatcgaa 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/note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 2019 gcctccctcg cgccatcagg ttccgaaagt tatgctggcc tggtgcctgg acagagaaga 60 ctgggagggg gctgcagtgg gactcacctg aggagacagt gaccagggtg ccacggcccc 120 agagatcgaa gtaccgtcga cgttccgaaa gttatgctca tgcacagtaa tgtgtggctg 180 tgtccacaat gtccatgttg atcactgtta gaaccacttc attcttggag gtgtccttgg 240 agataatgag cctactcttc agagatgggc tgtagtattt attatcattc taataaatgt 300 gtgcaagcca ctccagggcc tttgctgagg gctgacagat ctaacccaca cccattccag 360 aagtgctgag tgagaaccca gagaaggtgc aggtcagcat gagggtctgt gtgggtttca 420 ccagtgcagg accagactcc ttcaaggtga cctgggataa gttccgaaag ttatgcctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 2020 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 2020 gcctccctcg cgccatcagg ttccgaaagg tctcatggcc tggtgcctgg acagagaaga 60 ctgggagggg gctgcagtgg gactcacctg aggagacagt gaccagggtg ccacggcccc 120 agagatcgaa gtaccgtcga cgttccgaaa 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<400> 2031 gcctccctcg cgccatcagg ttccgaaaac gcgtatggcc tggtgcctgg acagagaaga 60 ctgggagggg gctgcagtgg gactcacctg aggagacagt gaccagggtg ccacggcccc 120 agagatcgaa gtaccgtcga cgttccgaaa acgcgtatca gtacagtaat agatggccgt 180 gtactcggtt ttcagggtat tcacttgcag atacagtgtg ttctttgaat catctcttga 240 gatggtgaac ctgcctttca cagatgcagc gcattctgtc gtgtaactgt tacgtttggt 300 tctaatacgg ccaacccact ccagcccttt cccagaagcc tggcggatcc agtgcattca 360 gaagtcactg aaggtgaatc tagaagctgc aaatgagagt ctcggggacc cacccaggct 420 gtaccaagcc tcccccagac tccaccagct gcgcctcacg gttccgaaaa cgcgtactga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 2032 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 2032 gcctccctcg cgccatcagg ttccgaagta gttcgtggcc tggtgcctgg acagagaaga 60 ctgggagggg gctgcagtgg gactcacctg aggagacagt gaccagggtg ccacggcccc 120 agagatcgaa gtaccgtcga cgttccgaag tagttcgtca acaataatac acagccatgt 180 cctcagctat caggctgttc atttgaagat 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/note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 2054 gcctccctcg cgccatcagc gttacttacc tcttgccagg acagaggacg ctgggcccag 60 agaaaggagg cagaaggaaa gccatcttac ctgaagagac ggtgaccatt gtcccttggc 120 cccagatatc aaaaggtcga ccgttactta cctcttgtca acagtaatac acagccatgt 180 cctcagatct caggctgctc agctccatgt aggctgtgct cgcggatgtg tccctggtaa 240 tggtgactct gccctggaac tcctgtgaat attttgtgtt accattgcca gcgttgctcc 300 atcccatcca ctcaagcctt tgtccggggg cctggcgcac ccaatgcata gcatagctag 360 tgaaggtgta tccagaagcc ttgcaggaaa ccttcactga ggccccaggc ttcttcacct 420 cagccccaga ctgcaccagc tgaacctggg agtggacacc cgttacttac ctcttgctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 2055 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 2055 gcctccctcg cgccatcagc gttacttctg attctccagg acagaggacg ctgggcccag 60 agaaaggagg cagaaggaaa gccatcttac ctgaagagac ggtgaccatt gtcccttggc 120 cccagatatc aaaaggtcga ccgttacttc 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Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 2058 gcctccctcg cgccatcagc gttacttgta gcagtccagg acagaggacg ctgggcccag 60 agaaaggagg cagaaggaaa gccatcttac ctgaagagac ggtgaccatt gtcccttggc 120 cccagatatc aaaaggtcga ccgttacttg tagcagttca acagtaatac atggctgtgt 180 cctcagatct caggctgctc agctccatgt aggctgtgct catagacctg tccctggtaa 240 tggtgactct gtcctggaat ttctgtgcgt agttggtgtt accattgaaa ggtgtgatcc 300 atcccatcca ctcaagcgct tgtccggggg cctgtcgcac ccagtgcagg tagcggtagg 360 tgaaggtgta tccggaagcc ttgcaggaaa ccttcactga ggacccagtc ttcttcacct 420 cagccccaga ctgcaccagc tgcatctggg agtaggcatc cgttacttgt agcagtctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 2059 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 2059 gcctccctcg cgccatcagc gttacttatc ttcgtccagg acagaggacg ctgggcccag 60 agaaaggagg cagaaggaaa gccatcttac ctgaagagac ggtgaccatt gtcccttggc 120 cccagatatc aaaaggtcga ccgttactta tcttcgttca acagtaatac 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/note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 2097 gcctccctcg cgccatcagc gttactttgg ttatcccagg acagaggacg ctgggcccag 60 agaaaggagg cagaaggaaa gccatcttac ctgaagagac ggtgaccatt gtcccttggc 120 cccagatatc aaaaggtcga ccgttacttt ggttatctca acagtaatac acagccgtgt 180 ccgcggcggt cacagagctc agcttcaggg agaactggtt cttggacgtg tctactgata 240 tggtgactcg actcttgagg gacgggttgt agttggtgct tccactatga ttgatttccc 300 caatccactc cagccccttc cctgggggct ggcggatcca gctccagtag taaccactga 360 aggacccacc atagacagcg caggtgaggg acagggtctc cgaaggcttc aacagtcctg 420 cgccccactg ctgtagctgc acctgggaca ggacccctgt cgttactttg gttatcctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 2098 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 2098 gcctccctcg cgccatcagc gttacttgga ttgctccagg acagaggacg ctgggcccag 60 agaaaggagg cagaaggaaa gccatcttac ctgaagagac ggtgaccatt gtcccttggc 120 cccagatatc aaaaggtcga ccgttacttg 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Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 2101 gcctccctcg cgccatcagc gttactttga tgcgaccagg acagaggacg ctgggcccag 60 agaaaggagg cagaaggaaa gccatcttac ctgaagagac ggtgaccatt gtcccttggc 120 cccagatatc aaaaggtcga ccgttacttt gatgcgatca acagtaatac acggccgtgt 180 ctgcggcggt cacagagctc agcttcaggg agaactggtt cttggacgtg tctactgata 240 tggtgactcg actcttgagg gacgggttgt agtaggtgct cccactatga tagatactcc 300 caatccactc cagccccttc cctgggggct gccggatcca gccccagtag taaccactgc 360 tgatggagta accagagaca gcgcaggtga gggacagggt ctccgaaggc ttcaccagtc 420 ctgggcccga ctcctgcagc tgcacctggg acaggacccc cgttactttg atgcgactga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 2102 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 2102 gcctccctcg cgccatcagc gttacttatt aagcgccagg acagaggacg ctgggcccag 60 agaaaggagg cagaaggaaa gccatcttac ctgaagagac ggtgaccatt gtcccttggc 120 cccagatatc aaaaggtcga ccgttactta ttaagcgtca acagtaatac 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/note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 2140 gcctccctcg cgccatcagc gttacttatg acaccccagg acagaggacg ctgggcccag 60 agaaaggagg cagaaggaaa gccatcttac ctgaagagac ggtgaccatt gtcccttggc 120 cccagatatc aaaaggtcga ccgttactta tgacacctca cacagtaata catggccgtg 180 tcttcagatc tcaggctgct cagctccatg taggctgtgc tcgtggatgt gtccctggtc 240 atggtgactc tgccctggaa cttctctgcg tagcttatgc tgccatcact agggcacatc 300 cttcccatcc actcaagccc ttgtgcatgg gcctggcgca cctagtgcat agagtaactg 360 gtgaaggtag gtgtatccac aagtcttgca ggagactttc actgatgccc cagccttctt 420 catctcatcc ccagactgca ccagctgcac ctgggactgg cgttacttat gacaccctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 2141 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 2141 gcctccctcg cgccatcagc gttacttctt cacgaccagg acagaggacg ctgggcccag 60 agaaaggagg cagaaggaaa gccatcttac ctgaagagac ggtgaccatt gtcccttggc 120 cccagatatc aaaaggtcga ccgttacttc 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Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 2144 gcctccctcg cgccatcagc gttacttagg tctcaccagg acagaggacg ctgggcccag 60 agaaaggagg cagaaggaaa gccatcttac ctgaagagac ggtgaccatt gtcccttggc 120 cccagatatc aaaaggtcga ccgttactta ggtctcatca cagagtcata tgcagctgca 180 tcctctgccc tcagtctgtt catttgcaga tacagtgagt ttttggtatt gtctctggaa 240 atggtgaatc ggcccttcac agagtctgcg tagtacatgg tactaccact accactaata 300 actgggaccc actgcagacc cttccctgga gcctggggga cccagtgcgt gctatggcta 360 ctgaaggtga atccagaggc tgcacaggag agtctcaggg acacccaggc tttgtcaagt 420 ttgctccaga ctctaccagc tgcatctcac actggacacc cgttacttag gtctcactga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 2145 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 2145 gcctccctcg cgccatcagc gttacttgtc atagtccagg acagaggacg ctgggcccag 60 agaaaggagg cagaaggaaa gccatcttac ctgaagagac ggtgaccatt gtcccttggc 120 cccagatatc aaaaggtcga ccgttacttg tcatagttca cacagtaata 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<400> 2226 gcctccctcg cgccatcagt aggagacatt aagcgcagaa atgcagcaaa acccttcaga 60 gttaaagcag gagagaggtt gtgaggactc acctgaggag acggtgacca gggttccctg 120 gccccagtag tcaaagtcga ctaggagaca ttaagcgtca acagtaatac atggcggtgt 180 ccgaggcctt caggctgctc cactgcaggt aggcggtgct gatggacttg tcggctgaga 240 tggtgacctg gccttggaag gacgggctgt atctggtatc agagtcacca ggatagatga 300 tccccatcca ctccaggcct ttcccgggca tctggcgcac ccagccgatc cagtagctgg 360 taaagctgta tccagaaccc ttacaggaga tcttcagaga ctccccgggc tttttcacct 420 ctgctccaga ctgcaccagc tgcacctcgg cacagactcc taggagacat taagcgctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 2227 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 2227 gcctccctcg cgccatcagt aggagacagc aatcccagaa atgcagcaaa acccttcaga 60 gttaaagcag gagagaggtt gtgaggactc acctgaggag acggtgacca gggttccctg 120 gccccagtag tcaaagtcga ctaggagaca gcaatcctca acagtaatac atggcggtgt 180 ccgaggcctt caggctgctc cactgcaggt 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Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 2249 gcctccctcg cgccatcagt aggagactag acggacagaa atgcagcaaa acccttcaga 60 gttaaagcag gagagaggtt gtgaggactc acctgaggag acggtgacca gggttccctg 120 gccccagtag tcaaagtcga ctaggagact agacggatca agtaatacat gaccttgtcc 180 ttggctttca gattggtcat tgtaaggcag actgcactta aaagggtgtt gcttgagatt 240 gttaatttat ttgtactcat ggaaagtaac cctgagaatt catacttgat cactcactgt 300 tggcacccac acctatccct gttgtgaagc gtgctggacc aagctcatgc tgtaaccagt 360 aaaggtgaaa ccagaggctt tgcaggagag tctcaccact gggctgtaaa ttttttcccc 420 ctctgactcc atcagtaaac ttcacacagg acttccgtga taggagacta gacggactga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 2250 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 2250 gcctccctcg cgccatcagt aggagacgag cgatacagaa atgcagcaaa acccttcaga 60 gttaaagcag gagagaggtt gtgaggactc acctgaggag acggtgacca 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<220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 2253 gcctccctcg cgccatcagt aggagacaac tgccacagaa atgcagcaaa acccttcaga 60 gttaaagcag gagagaggtt gtgaggactc acctgaggag acggtgacca gggttccctg 120 gccccagtag tcaaagtcga ctaggagaca actgccatca ctgtaatata cggccttgcc 180 cttggctttc aggttggtcc ttgtaaggta gactgcactt gaaagggtgt cacttgggaa 240 tgttgattta tctgtactca tggagagtaa cccttagaac tcccatatga tctctcactg 300 ttgctaccca caccaattcc tgttgtgaag cgtgctggac caagctcatg ctgcacccag 360 taaacccgaa accagaggct ttgcaggaca gtctcagtga actgctgggc tgttaaattt 420 ttctccttct gactccatca gtaaacatca cacaggactt taggagacaa ctgccactga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 2254 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 2254 gcctccctcg cgccatcagt aggagacttg gactgcagaa atgcagcaaa acccttcaga 60 gttaaagcag gagagaggtt gtgaggactc acctgaggag acggtgacca gggttccctg 120 gccccagtag 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/note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 2257 gcctccctcg cgccatcagt aggagacacg aagatcagaa atgcagcaaa acccttcaga 60 gttaaagcag gagagaggtt gtgaggactc acctgaggag acggtgacca gggttccctg 120 gccccagtag tcaaagtcga ctaggagaca cgaagattca cagtaataca ctgcctaccc 180 ctgtgagagc cccctcagct tccaagtaga ttattttaag ggagactgtg ctggtaattg 240 gtgtccctgg gaattgtgaa tcttcattat gctgatgcag aatatcactg agaacttcca 300 cttgaatcaa tcactgttac cacccactcc agcctctgtc ccccagccat ctgggctcaa 360 tttatgctgt agtcagtgaa ggtgaatctt gatgctttgc aaaagaggct aagagaacag 420 ccaggctgtt ttgccaaaga taaaaatata gatccagtaa taggagacac gaagatctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 2258 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 2258 gcctccctcg cgccatcagt aggagacact gtggacagaa atgcagcaaa acccttcaga 60 gttaaagcag gagagaggtt gtgaggactc acctgaggag acggtgacca gggttccctg 120 gccccagtag tcaaagtcga ctaggagaca 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Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 2292 gcctccctcg cgccatcagt aggagacgca attcgcagaa atgcagcaaa acccttcaga 60 gttaaagcag gagagaggtt gtgaggactc acctgaggag acggtgacca gggttccctg 120 gccccagtag tcaaagtcga ctaggagacg caattcgtca catacagtaa cacacagctg 180 tgccctctgc tctcagactg ttcatttgca aatacagtga gttcttggca ttttctttgg 240 agacggtgaa tctgctcgtc acagattgtg cataacatat ctgacttcca tcacactgta 300 tatctactac tcactccagc cccttccctg gagcctggga aaccgagctc attcagtagc 360 tactgaaggt taatccagag gctgcacagg agagtctcag ggaacccagg ttgtcttggg 420 tcctctccag actccaccag ctgtacctca cactggacac taggagacgc aattcgctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 2293 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 2293 gcctccctcg cgccatcagt aggagactga gcgaacagaa atgcagcaaa acccttcaga 60 gttaaagcag gagagaggtt gtgaggactc acctgaggag acggtgacca 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Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 2335 gcctccctcg cgccatcagg acactctgac taagactggc aagctgagtc tccctaagtg 60 gactcagaga gggggtggtg aggactcacc tgaggagacg gtgaccaggg ttccctggcc 120 ccaggggtcg aaccagtcga cgacactctg actaagatca acagtaatac acggccgtgt 180 cctcggtttt caggctgttc atttgcagat acagtgagtt ctttgaatca tctcttgaga 240 tggtgaatct gcctttcaca gacgcggcgt attctgtggt gtaactgtta gctttgtttc 300 tagtacggcc aacccactcc agccccttcc ctggagcctg gcggacccag tccatgtagt 360 ggtcactgaa ggtgaatcca gaggctgcac aggagagtct cagggaccct ccaggctgga 420 ccaagcctcc cccagactcc accagctgca cctcacactg gacactctga ctaagactga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 2336 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 2336 gcctccctcg cgccatcagg acactctagg ttgctctggc aagctgagtc tccctaagtg 60 gactcagaga gggggtggtg aggactcacc tgaggagacg gtgaccaggg ttccctggcc 120 ccaggggtcg aaccagtcga cgacactcta ggttgcttca acagtaatac 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Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 2378 gcctccctcg cgccatcagg acactctttg gactgctggc aagctgagtc tccctaagtg 60 gactcagaga gggggtggtg aggactcacc tgaggagacg gtgaccaggg ttccctggcc 120 ccaggggtcg aaccagtcga cgacactctt tggactgtca agtaatacac agacttgtct 180 tgggctctca gttttattat cttaaaagag aatcttctga acagtgtctc tgaggactgt 240 taatcttctt tgtactgaag gcgagtccca ttgagaactt ccacttgaat tactgttatc 300 tccctcacca acacttgcca tgaatcctgc tggaccaaac ttgttctttt ttcagtgaat 360 ccaggggctt tgcagaacag tctgagaatt cttggtctgt agtattttcc tgtctgactc 420 cactagttaa cttcacagag gacttctgca cacacagagg gacactcttt ggactgctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 2379 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 2379 gcctccctcg cgccatcagg acactcttcg gtactctggc aagctgagtc tccctaagtg 60 gactcagaga gggggtggtg aggactcacc tgaggagacg gtgaccaggg ttccctggcc 120 ccaggggtcg aaccagtcga cgacactctt cggtacttca cagtaataaa 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Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 2421 gcctccctcg cgccatcagg acactctcta gtgaactggc aagctgagtc tccctaagtg 60 gactcagaga gggggtggtg aggactcacc tgaggagacg gtgaccaggg ttccctggcc 120 ccaggggtcg aaccagtcga cgacactctc tagtgaatca gcacgtgtcc tcagccttta 180 ggctgctgat atgaagatat gccatgctga cggaggtgtc catggagaag acaaaccgtc 240 ctgtgaagcc ctgggcatac gttaggttcc cagtgttggt gttgatccat cccatttcct 300 caagcccttg tccatgggcc tgtcataccc agctgatagc atagcttgtg aaggtgtatc 360 cagaagcctt gcaggaaacc ttcaatgagg ctccaggctt cttcacctca ggcccagact 420 gcaccagctg cacctgtgag tggacacctg tggagaggag gacactctct agtgaactga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 2422 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 2422 gcctccctcg cgccatcagg acactctacg ttcacctggc aagctgagtc tccctaagtg 60 gactcagaga gggggtggtg aggactcacc tgaggagacg gtgaccaggg ttccctggcc 120 ccaggggtcg aaccagtcga cgacactcta cgttcactca acagtaatac 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<220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 2487 gcctccctcg cgccatcagt tcggaactca gatgcggcag tagcagaaaa caaaggccct 60 agagtggcca ttcttacctg aggagacggt gaccgtggtc cctttgcccc agacgtccat 120 gtagtagtag tagtagtcga cttcggaact cagatgctca tgaaagaaga attcatgtgc 180 agacacatct gcttgtctga agatatagtg catgtgggaa catgtgggct tgtctgaatt 240 catgataagt gggctggaat tcatcctcca ctcatcacgt atgcacctga cccactcctg 300 tgctttccat ccagtgccta caggaagcac tgattgtgac agagaatcca gaggcagcac 360 aggtgagtga gggggtttgc aagggcttca ccaggctgat aattgactga gaaaaacagt 420 tgttagcatg cacaagttct ggatgataca ttggaaaccc ttcggaactc agatgcctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 2488 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 2488 gcctccctcg cgccatcagt tcggaacgtg tagcaggcag tagcagaaaa caaaggccct 60 agagtggcca ttcttacctg aggagacggt gaccgtggtc cctttgcccc agacgtccat 120 gtagtagtag 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/note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 2491 gcctccctcg cgccatcagt tcggaacgtg tctacggcag tagcagaaaa caaaggccct 60 agagtggcca ttcttacctg aggagacggt gaccgtggtc cctttgcccc agacgtccat 120 gtagtagtag tagtagtcga cttcggaacg tgtctactca agtaatacaa ggttgtggca 180 ttgttggtca cagaactcag ctaaaagaaa atttggttct tggacgtgga tctggagatg 240 gtgactgagc tcatgaggag tgggttagaa tttgtgctcc ctcgtgacct atgccctgat 300 ccactccctt gactgaggac tggcggatcc agctccagca ggaagcacta gttgtgatgg 360 agaatccaga gacagcacag gtgagggagg gggtctgtga gggcctcacc aggccaataa 420 atgaccatga aacacagtgg ttggtgtgca tggcttctgg ttcggaacgt gtctacctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 2492 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 2492 gcctccctcg cgccatcagt tcggaacgta cagtgggcag tagcagaaaa caaaggccct 60 agagtggcca ttcttacctg aggagacggt gaccgtggtc cctttgcccc agacgtccat 120 gtagtagtag tagtagtcga cttcggaacg 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<220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 2530 gcctccctcg cgccatcagt tcggaactta acgtcggcag tagcagaaaa caaaggccct 60 agagtggcca ttcttacctg aggagacggt gaccgtggtc cctttgcccc agacgtccat 120 gtagtagtag tagtagtcga cttcggaact taacgtctca acagtaatac acggtcatgt 180 cctcagctct caggctgttc acttgcagat agagggagtt cttggcattg tctctggaga 240 tggtcaatcg gcccttcaca gagtctacat agtatttctc acttccgtca cactttatgt 300 cggccaccca ctccagcccc ttctccggag cctggcagac ccagtgcatc caggagctac 360 tgaaggtgaa tccagaggct gcacaggaga gtctcaggga ccctccaggc tgtaccaagc 420 ctcacccaga ctccaccagc tgcacctcac actggacacc ttcggaactt aacgtcctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 2531 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 2531 gcctccctcg cgccatcagt tcggaacagc aacctggcag tagcagaaaa caaaggccct 60 agagtggcca ttcttacctg aggagacggt gaccgtggtc cctttgcccc agacgtccat 120 gtagtagtag 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/note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 2534 gcctccctcg cgccatcagt tcggaactac cggaaggcag tagcagaaaa caaaggccct 60 agagtggcca ttcttacctg aggagacggt gaccgtggtc cctttgcccc agacgtccat 120 gtagtagtag tagtagtcga cttcggaact accggaatca acagtagtac acaactgtgc 180 cctcggctct caggctgttc atttgcagag acagtgaatt ctgggcattg tctctggaga 240 tggtgaatcg gcccttcaca gagtctgtgt agagtacggt atcaccactt gtactaataa 300 ctgagaccca ctacaaaccc tttcttggag cctggcggac ccagtgcata gcagagctac 360 tgaaggtgaa tccagaggct gcacaggaga gtctcaggga ccccccaggc tggaccaagc 420 cttccccaga ctccaccagc tgcacctcac actggacacc ttcggaacta ccggaactga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 2535 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 2535 gcctccctcg cgccatcagt tcggaaccga attgcggcag tagcagaaaa caaaggccct 60 agagtggcca ttcttacctg aggagacggt gaccgtggtc cctttgcccc agacgtccat 120 gtagtagtag tagtagtcga cttcggaacc 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Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 2569 gcctccctcg cgccatcaga agtaacgcac atggatcagc tcagccaaaa ccctgcggct 60 ggtagggggc ctgtggggct gggggctgat gtggctgcgg tctccagggc gggtcgggtc 120 caggggcccc cagcagtcga caagtaacgc acatggatca acagtgatac aaggccgtgt 180 cctcggctct cagactgttc atttgcagat acagggagtt cttggcgttg tctctggaga 240 tggtgaatcg gcccttcaca gagtctgcat aacctgtgct accaccattc caattaatac 300 cagagaccca ctccagcccc ttccctggag cttggcggac ccagctcatg ccataatcat 360 caaaggtgaa tccagaggct gcacaggaga gtctcaggga ccccccaggc cgtaccacac 420 ctcccccaga ctccaccagc tgcacctcac actggacacc aagtaacgca catggactga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 2570 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 2570 gcctccctcg cgccatcaga agtaacgttg accattcagc tcagccaaaa ccctgcggct 60 ggtagggggc ctgtggggct gggggctgat gtggctgcgg tctccagggc gggtcgggtc 120 caggggcccc cagcagtcga caagtaacgt tgaccattca acagtaatac 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Synthetic polynucleotide" <400> 2573 gcctccctcg cgccatcaga agtaacgcaa gtcactcagc tcagccaaaa ccctgcggct 60 ggtagggggc ctgtggggct gggggctgat gtggctgcgg tctccagggc gggtcgggtc 120 caggggcccc cagcagtcga caagtaacgc aagtcactca acagtaatac acagccgtgt 180 cctcagctct caggctgttc atttgcagat acagcgtgtt cttggaattg tctctggaga 240 tggtgaatcg gcccttcacg gagtctgcat agtatttatt acttccatca tatgatataa 300 ctgccaccca ctccagcccc ttgcctggag cctggcggac ccagtgcatg ccatagctac 360 tgaaggtgaa tccagaggct gcacaggaga gtctcaggga cctcccaggc tggaccacgc 420 ctcccccaga ctccaccagc tgcacctgac actggacacc aagtaacgca agtcacctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 2574 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 2574 gcctccctcg cgccatcaga agtaacgctg caatctcagc tcagccaaaa ccctgcggct 60 ggtagggggc ctgtggggct gggggctgat gtggctgcgg tctccagggc gggtcgggtc 120 caggggcccc cagcagtcga caagtaacgc tgcaatctca acagtaatac acagccgtgt 180 cctcggctct 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Synthetic polynucleotide" <400> 2616 gcctccctcg cgccatcaga agtaacggta cagtgtcagc tcagccaaaa ccctgcggct 60 ggtagggggc ctgtggggct gggggctgat gtggctgcgg tctccagggc gggtcgggtc 120 caggggcccc cagcagtcga caagtaacgg tacagtgtca taaaaataca tggctgtgtg 180 cttgtgactc acttagctcg gctgtaggaa gaactgcttt ttggacatgg atctggagat 240 ggtgactgga ctcttgagga gtgggttgga atgtgcactc cctcatgacc tgtgcactgg 300 attcactcca gtcccttcct ggggggttta tgaatgcagc tacagcagga agcactggtt 360 gtgatgggga atccagagac agcacaggtg agggagaggg tctgtgaggg cttcaccagg 420 ccaagtgggc actgagaaac acagttgttg gcatgcacag aagtaacggt acagtgctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 2617 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 2617 gcctccctcg cgccatcaga agtaacggga tcatctcagc tcagccaaaa ccctgcggct 60 ggtagggggc ctgtggggct gggggctgat gtggctgcgg tctccagggc gggtcgggtc 120 caggggcccc cagcagtcga caagtaacgg gatcatctca tttaaaacat ggctgtgagc 180 ttgttgctca 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Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 2655 gcctccctcg cgccatcaga agtaacgagc aaccttcagc tcagccaaaa ccctgcggct 60 ggtagggggc ctgtggggct gggggctgat gtggctgcgg tctccagggc gggtcgggtc 120 caggggcccc cagcagtcga caagtaacga gcaaccttca catacagtaa tacacggccg 180 tgccctctgc tctcagactg ttcatttgca aacagagtga gttcttggca ttttctttgg 240 agatggtgaa tctgctcttc acagattgtg cataacatag ctgacttcta tcctactata 300 tatctactac tcactccagc cccttccctg gagcctggga atctgagctc attcagtagc 360 tactgaaggt taatccagag tctgcacagg agagtctcag ggatccccca agttgtcttt 420 ggttttcttc agactccacc agctgtacct cacactggac aagtaacgag caacctctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 2656 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 2656 gcctccctcg cgccatcaga agtaacgttc tcgagtcagc tcagccaaaa ccctgcggct 60 ggtagggggc ctgtggggct gggggctgat gtggctgcgg tctccagggc gggtcgggtc 120 caggggcccc cagcagtcga caagtaacgt tctcgagtca acagtaatac 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Synthetic polynucleotide" <400> 2659 gcctccctcg cgccatcaga agtaacgcga attgctcagc tcagccaaaa ccctgcggct 60 ggtagggggc ctgtggggct gggggctgat gtggctgcgg tctccagggc gggtcgggtc 120 caggggcccc cagcagtcga caagtaacgc gaattgctca tgtacagcca tgcatggtca 180 tgtcctcagc tctcagactg ttcgtttgga gatacggtga gttcttagca ttgtctttgg 240 agatggtgaa tctgcccttc acagagtctg catggtatat ctgacttcca tcatatttta 300 catctattac tccctccagc cccttcccta gagtctcatt gacccagctc attcagtagc 360 tactgaaggt gaatccagag gctacacagg agagtctcag gaacttccca agttgtctca 420 ggccctctat ggactctatc agctccacct cacactgaac aagtaacgcg aattgcctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 2660 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 2660 gcctccctcg cgccatcaga agtaacgttc gctcatcagc tcagccaaaa ccctgcggct 60 ggtagggggc ctgtggggct gggggctgat gtggctgcgg tctccagggc gggtcgggtc 120 caggggcccc cagcagtcga caagtaacgt tcgctcatca gtatagtaat acacggccgt 180 gtcctcggtt 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<220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 2725 gcctccctcg cgccatcagg tctcctatga ccttgccagc cacacagacc cccgggctga 60 gacccaggca gggaggggtg acgttcccag ggagacggtg gccgggctgc cctggcccca 120 gtgctccaag cacttgtcga cgtctcctat gaccttgtca acagtaatac acggcagtgt 180 cctcagcctt taggctgcag atctgcagat atgccgtgct gacagaggtg tccaaggaga 240 agacaaaccg tcctgtgaag ccctgggcat acgttgggtt cccagtgttg gtgttgatcc 300 atcccatcca ctcaagccct tgtccagggg cctgtcgcac ccaattcata gcatagctag 360 tgaaggtgta tccagaagcc ttgcaggaaa ccttcactga ggccccaggc ttcttcaact 420 cagacccaga ttgcaccagc tgcacctggg agtgggcacc gtctcctatg accttgctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 2726 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 2726 gcctccctcg cgccatcagg tctcctacaa ggtcaccagc cacacagacc cccgggctga 60 gacccaggca gggaggggtg acgttcccag ggagacggtg gccgggctgc cctggcccca 120 gtgctccaag 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/note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 2729 gcctccctcg cgccatcagg tctcctacgc caataccagc cacacagacc cccgggctga 60 gacccaggca gggaggggtg acgttcccag ggagacggtg gccgggctgc cctggcccca 120 gtgctccaag cacttgtcga cgtctcctac gccaatatca ataaaaatca tggttgtgta 180 ctccttgtta aggtagctca gctgtaggag aaactgtttt ttggatgtgg atctggagat 240 ggtgactgga ctcttgagga gtgggttgga ttgtgcactc cctcatgacc tgtgcacctg 300 attcgctcca gtcccttccc cggggggtga cggatccagc tccagcagga agcactggtt 360 gtaatggaga agcagagatg ccacaggcca gggggaggat ctgtgagggc ttcaccaggc 420 caggagtgca ccgagaatca cagttgtcgg catgcacagg gtctcctacg ccaatactga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 2730 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 2730 gcctccctcg cgccatcagg tctcctatca agcctccagc cacacagacc cccgggctga 60 gacccaggca gggaggggtg acgttcccag ggagacggtg gccgggctgc cctggcccca 120 gtgctccaag cacttgtcga cgtctcctat 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/note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 2807 gcctccctcg cgccatcagg tagacaccaa gaggtcctgc ccttctcatg gaaccctctg 60 ctggcctccc acgtacccca cattctggcc tgacccctca gaagccagac cactgtcggc 120 ctgggaagtc caactgtcga cgtagacacc aagaggttca acagtaatac acggccgtgt 180 cctcagatct caggctgctc agctccatgt aggctgtgtc tgtagacgtg tccgcggtta 240 tggtgactct gccctggaac ttctctgcgt atattgtttc accatcttca ggatcaacaa 300 gtcccatcca ctcaagccct tttccagggg cctgttgcac ccagtgcatg tagtagtcgg 360 tgaaggtgta tccagaaacc ttgcaggaga ttttcactgt agccccaggc ttcttcacct 420 cagccccaga ctgtaccagc tggacctcgg cgtgggtgcc gtagacacca agaggtctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 2808 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 2808 gcctccctcg cgccatcagg tagacacagt tgacccctgc ccttctcatg gaaccctctg 60 ctggcctccc acgtacccca cattctggcc tgacccctca gaagccagac cactgtcggc 120 ctgggaagtc caactgtcga cgtagacaca 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Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 2811 gcctccctcg cgccatcagg tagacacgtc cattccctgc ccttctcatg gaaccctctg 60 ctggcctccc acgtacccca cattctggcc tgacccctca gaagccagac cactgtcggc 120 ctgggaagtc caactgtcga cgtagacacg tccattctca acagtaatac acagccgtgt 180 cctcggctct caggctgttc atttgcagat acagtgagtt cttggcgttg tctctggaga 240 tggtgaatcg gcccttcaca gagtccacat agtatttctc acttccatct tgctttatgt 300 tggccaccca ctccagcccc ttccctggag cctggcggac ccagctcatc caatagctac 360 taaaggtgaa tccagaggct gcacaggaga gtctcaggga ccccccaggc tggaccaagc 420 ctcccccaga ctccaccagc tgcacctcac actggacacc gtagacacgt ccattcctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 2812 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 2812 gcctccctcg cgccatcagg tagacacgca taactcctgc ccttctcatg gaaccctctg 60 ctggcctccc acgtacccca cattctggcc tgacccctca gaagccagac cactgtcggc 120 ctgggaagtc caactgtcga cgtagacacg cataacttca tgcacagtaa 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/note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 2850 gcctccctcg cgccatcagg tagacaccaa ggtcacctgc ccttctcatg gaaccctctg 60 ctggcctccc acgtacccca cattctggcc tgacccctca gaagccagac cactgtcggc 120 ctgggaagtc caactgtcga cgtagacacc aaggtcatca acagtaatac atggccatgt 180 cctcagcctt taggctgctg atctgcaggt atgctgtgct ggcagaggtg tccatggaga 240 agacaaaccg tcctgtgaag ccctgggcat atgttgggtt cccagtgtag gtgttgaacc 300 atcccatcca ctcaagccct tgtccagggg cctgtggcac ccaattcata ccataggtgg 360 tgaaactgta accagaagcc ttgcaggaga ccttcactga ggccccaggc tgcttcacct 420 catggccaga ctgcaccagc tgcacctggg agtaggtacc gtagacacca aggtcactga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 2851 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 2851 gcctccctcg cgccatcagg tagacaccac tgtaccctgc ccttctcatg gaaccctctg 60 ctggcctccc acgtacccca cattctggcc tgacccctca gaagccagac cactgtcggc 120 ctgggaagtc caactgtcga cgtagacacc 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Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 2854 gcctccctcg cgccatcagg tagacactca agcctcctgc ccttctcatg gaaccctctg 60 ctggcctccc acgtacccca cattctggcc tgacccctca gaagccagac cactgtcggc 120 ctgggaagtc caactgtcga cgtagacact caagccttca cagtaatact cagccgtgtc 180 ctaggtggtc atggagctga gcttcacaga gaactggctc ttggttgagt cactgttgat 240 ggggacatgg acctgggtgg agggtgcatg atgtgtattc cttgatgatc cagtctagta 300 actgtgcccc agccattcca gcctgttgcc cacgggatgg tggattcatc tcaaataata 360 tccatggtaa aaaaaagaat ccagacacag cacaggcaga gggcagtgtc tgagggcctc 420 atgggtcctg gacctgactc ctgcagctgc acctgggaca gtagacactc aagcctctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 2855 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 2855 gcctccctcg cgccatcagg tagacacacg tgtgtcctgc ccttctcatg gaaccctctg 60 ctggcctccc acgtacccca cattctggcc tgacccctca gaagccagac cactgtcggc 120 ctgggaagtc caactgtcga cgtagacaca cgtgtgttca cttaaaaatg 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Synthetic polynucleotide" <400> 2858 gcctccctcg cgccatcagg tagacactat cgctccctgc ccttctcatg gaaccctctg 60 ctggcctccc acgtacccca cattctggcc tgacccctca gaagccagac cactgtcggc 120 ctgggaagtc caactgtcga cgtagacact atcgctctca gctctaaaat acatggctat 180 gtgtttgttg ctcacatagt tcacctgtaa gaagaagtac tttttggaca tggatctgga 240 gatggtgact ggactcttga gaagagggga gtaatctgtg ctccctccat gacctatgca 300 cccgatccac tccagtacct cccatggggg cgctgatgga tgcagctcca gaaggaaaca 360 ctggttgtga tggagaatgc agagatggca caggtgaggg agaggttctg tgaaggcttc 420 accaggccaa gagtgcaccg agaaatacag ttgttggcag gtagacacta tcgctcctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 2859 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 2859 gcctccctcg cgccatcagg tagacactca gatgccctgc ccttctcatg gaaccctctg 60 ctggcctccc acgtacccca cattctggcc tgacccctca gaagccagac cactgtcggc 120 ctgggaagtc caactgtcga cgtagacact cagatgctca tgaaagaaga attcatgtgc 180 agacacatct 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/note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 2893 gcctccctcg cgccatcagg tagacacatg gtcaacctgc ccttctcatg gaaccctctg 60 ctggcctccc acgtacccca cattctggcc tgacccctca gaagccagac cactgtcggc 120 ctgggaagtc caactgtcga cgtagacaca tggtcaatca catacagtaa cacacagctg 180 tgcccgctgc tctcagactg ttcattagca aatacagtga gttcttggca ttttctttgg 240 agatggtgaa tttgctcttc aaagattatg cataacatat ctgacttcca tcacactgta 300 tatctactac tcactccagc cccttccctg gagcctggga aaccgagttc cttcagtagc 360 tactgaaggt taatccagag tctgcacagg agagtctcag ggatccccca ggttgtcttg 420 ggtcctctcc ggactccacg agctgtacct ctcactagac gtagacacat ggtcaactga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 2894 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 2894 gcctccctcg cgccatcagg tagacacgat ggcttcctgc ccttctcatg gaaccctctg 60 ctggcctccc acgtacccca cattctggcc tgacccctca gaagccagac cactgtcggc 120 ctgggaagtc caactgtcga cgtagacacg 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Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 2897 gcctccctcg cgccatcagg tagacactcg tcgatcctgc ccttctcatg gaaccctctg 60 ctggcctccc acgtacccca cattctggcc tgacccctca gaagccagac cactgtcggc 120 ctgggaagtc caactgtcga cgtagacact cgtcgattca acacagccga gtcctcatct 180 ctcagactgt tcatttgcaa gtacagcatg ttcttgccat tgtctctaga gatggtgaat 240 ctacccttca gtgtctgcat agtataggct accaccacta gcactaatgt atgagaccca 300 ttccagcccc tttcttgaag cccggtgggc ccagttcatg tcattgcttc tcaagatgaa 360 tccgcaggct gcacatgaga gtctcaggac acccccaacc ccaccacagc tgtaccaagt 420 ctcccccaga ctctaccagc tgcacctcat actgcacacc gtagacactc gtcgatctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 2898 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 2898 gcctccctcg cgccatcagg tagacaccag tctgtcctgc ccttctcatg gaaccctctg 60 ctggcctccc acgtacccca cattctggcc tgacccctca gaagccagac cactgtcggc 120 ctgggaagtc caactgtcga cgtagacacc agtctgttca agtaatacat 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Synthetic polynucleotide" <400> 3078 gtcccaggtg cagctgcagg agtcaggtcc aggacccatg aggccctcag acactgccct 60 ctgcctgtgc tgtgtctgga ttcttttttt taccatggat attatttgag atgaatccac 120 catcccgtgg gcaacaggct ggaatggctg gggcacagtt actagactgg atcatcaagg 180 aatacacatc atgcaccctc cacccaggtc catgtcccca tcaacagtga ctcaaccaag 240 agccagttct ctgtgaagct cagctccatg accacctagg acacggctga gtattactgt 300 <210> 3079 <211> 300 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 3079 tgtgttgccc agaacctgtt aacatcaaca actatgtttc tcagcacact tctggcttga 60 gactccttgc agaccctctc ctcacctgca ctgtctctgg attccccatc ataaccagtg 120 tttcctgcta gaattgtatc tgcttgcccc tagaagatgg acaggagtgg atcaggtgca 180 tgggttgtga agggagcaca aattacaacc cactgctcaa gagtccatat ccagatccaa 240 gaaacagttc ttacagctga gctctgtgcc cagtgaacac acaactacgc atttttaagc 300 <210> 3080 <211> 300 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of 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Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 3108 tctcaggggt tcacagtgag gaccaccttg tgcaatggga ggaagaagta gtggtcccct 60 tggtcatgct cagcctcacc tatgccgcct atgcacattc aatttctgaa cattctgttt 120 cctggatcca ccatctccca tcaaaaggtc ttcagtgtgt tggtgtgata tgggttaagg 180 gaaacactaa gccccaacct tcagggcaga gctagcatct ccagaaacac atagtaaaaa 240 acaagaaaac ttacagctga gaagtgtgat ggctggggat gcaggcgtgt attactgtgc 300 <210> 3109 <211> 300 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 3109 tcctgattat atgactcacc cagcttctga tgactctcct gttgccagcg tccatggcct 60 cagtgaaggt ctcctgcaaa gctctggata caccttcgcc agctacgaca ttcactgtgt 120 gtgacaggcc cctggataag ggtttgaatg gatggtaggg agctactctg gcaatggtaa 180 cacaggctat gcacagaagt ttcagggcag agtcaccatg accagggaca cgtccacgag 240 cacagcctac atggagctga gcagtcagag atctgaggac atagatgtgt actactgtgc 300 <210> 3110 <211> 300 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 3110 tgtccattcc caggttcagc tgttgcagcc tggggctgag gtgaagaagc ctgcgtcctc 60 agtgaaggtc tcctggccag gcttccagat acaccttcac caaatacttt acacagtggg 120 tgcgacaggg ccctggacaa gggcatagtg gttgggatgc atcaaccctt acaatgataa 180 cacacactac gcacagaagt tccggggcag agtcaccatt accagtgaca ggtccgtgag 240 cacagcctac atggagctga gcagcctgag atctgaagac atggtcgtgt attcctgtgt 300 <210> 3111 <211> 300 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 3111 cagtcccagg tgcagctggt gcagtctggg gatgagatga agaaggctgg ggcatcagtg 60 aaagtctcct gcaagacttg tggatacacc taccttcacc agttactcta tgcactaggt 120 gcgccaggcc catgcacaag ggcttgagtg gatgggaagg atgtgcccta gtgatggcag 180 cataagctac gcagagaagt tccagggcag agtcaccatg accagggaca catccacgag 240 cacagcctac atggagctga gcagcctgag atctgaagac acggccatgt attactgtgg 300 <210> 3112 <211> 300 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 3112 tgtctgctcc caggtgcagc tggggcagtc tgaggctgag gtaaagaagc ctggggcctc 60 agtgaaggtc tcctgcaagg cttccggata caccttcact tgctgctcct tgcactggtt 120 gcaacaggcc cctggacaag ggcttgaaag gatgagatgg atcacacttt acaatggtaa 180 caccaactat gcaaagaagt tccagggcag agtcaccatt accagggaca tgtccctgag 240 gacagcctac atagagctga gcagcctgag atctgaggac tcggctgtgt attactgggc 300 <210> 3113 <211> 300 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 3113 gtgtccattc ccaggttcag ctgttgcagc ctggggctga ggtgaagaag cctgggtcct 60 cagtgaaggt ctcctgccag gcttccagat acaccttcac caaatacttt acacggtggg 120 tgtgacaaag ccctggacaa gggcatagtg gatgggatga atcaaccctt acaatgataa 180 cacacactat gcacagacgt tctggggcag agtcaccatt accagtgaca ggtccatgag 240 cacagcctac atggagctga gcagcctgag atctgaagac atggtcgtgt attactgtgt 300 <210> 3114 <211> 300 <212> DNA 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Synthetic polynucleotide" <400> 3192 gccttgccag cccgctcagc agctcttgta cagtgttcct ttgcaggtcc cttggacaca 60 gctgtttccc agactccaaa atacctggtc acacagatgg gaaacgacaa gtccattaaa 120 tgtgaacaaa atctgggcca tgatactatg tattggtata aacaggactc taagaaattt 180 ctgaagataa tgtttagcta caataataag gagctcatta taaatgaaac agttccaaat 240 cgcttctcac ctaaatctcc agacaaagct cacttaaatc ttcacatcaa ttccctggag 300 cttggtgact ctgctgtgta tttctgtgcc agcagtgaca gctcttgtac agtggtcgac 360 aaaacattca gtacttcggc gccgggaccc ggctctcagt gctgggtaag ctggggccgc 420 cgggggaccg gggacgagac tgcgctcggg tttttgtgcg cagctcttgt acagtgctga 480 tggcgcgagg gaggc 495 <210> 3193 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 3193 gccttgccag cccgctcagc agctcttgga tcatcttcct ttgcaggtcc cttggacaca 60 gctgtttccc agactccaaa atacctggtc acacagatgg gaaacgacaa gtccattaaa 120 tgtgaacaaa atctgggcca tgatactatg tattggtata aacaggactc taagaaattt 180 ctgaagataa 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Synthetic polynucleotide" <400> 3235 gccttgccag cccgctcaga actgccagac actcttcccc ccacagtccc catggaaacg 60 ggagttacgc agacaccaag acacctggtc atgggaatga caaataagaa gtctttgaaa 120 tgtgaacaac atctgggtca taacgctatg tattggtaca agcaaagtgc taagaagcca 180 ctggagctca tgtttgtcta cagtcttgaa gaacgggttg aaaacaacag tgtgccaagt 240 cgcttctcac ctgaatgccc caacagctct cacttattcc ttcacctaca caccctgcag 300 ccagaagact cggccctgta tctctgcgcc agcagtgaaa ctgccagaca ctctgtcgac 360 actgaagctt tctttggaca aggcaccaga ctcacagttg taggtaagac atttttcagg 420 ttcttttgca gatccgtcac agggaaaagt gggtccacag aactgccaga cactctctga 480 tggcgcgagg gaggc 495 <210> 3236 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 3236 gccttgccag cccgctcaga actgccattc ggaactcccc ccacagtccc catggaaacg 60 ggagttacgc agacaccaag acacctggtc atgggaatga caaataagaa gtctttgaaa 120 tgtgaacaac atctgggtca taacgctatg tattggtaca agcaaagtgc taagaagcca 180 ctggagctca 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Synthetic polynucleotide" <400> 3278 gccttgccag cccgctcagc actgtacaga gtgtcctttt cccacaggcc cagtggaggc 60 tggagtcacc caaagtccca cacacctgat caaaacgaga ggacagcaag tgactctgag 120 atgctctcct atctctgggc acagcagtgt gtcctggtac caacaggccc cgggtcaggg 180 gccccagttt atctttgaat atgctaatga gttaaggaga tcagaaggaa acttccctaa 240 tcgattctca gggcgccagt tccatgactg ttgctctgag atgaatgtga gtgccttgga 300 gctgggggac tcggccctgt atctctgtgc cagaatgaca ctgtacagag tgtcgtcgac 360 atcagcccca gcattttggt gatgggactc gactctccat cctaggtaag ttgcagaatc 420 agggtggtat ggccattgtc ccttgaaggc agagttctct cactgtacag agtgtcctga 480 tggcgcgagg gaggc 495 <210> 3279 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 3279 gccttgccag cccgctcagc actgtacgtt ccgaactttt cccacaggcc cagtggaggc 60 tggagtcacc caaagtccca cacacctgat caaaacgaga ggacagcaag tgactctgag 120 atgctctcct atctctgggc acagcagtgt gtcctggtac caacaggccc cgggtcaggg 180 gccccagttt 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Synthetic polynucleotide" <400> 3321 gccttgccag cccgctcagt caagcctgtg tctacctttt cccacaggct tagtggacgc 60 tggagtcacc caaagtccca cacacctgat caaaacgaga ggacagcaag tgactctgag 120 atgctctcct aagtctgggc atgacactgt gtcctggtac caacaggccc tgggtcaggg 180 gccccagttt atctttcagt attatgagga ggaagagaga cagagaggca acttccctga 240 tcgattctca ggtcaccagt tccctaacta tagctctgag ctgaatgtga acgccttgtt 300 gctgggggac tcggccctct atctctgtgc cagcatgatc aagcctgtgt ctacgtcgac 360 agatacgcag tattttggcc caggcacccg gctgacagtg ctcggtaagc gggggctccc 420 gctgaagccc cggaactggg gagggggcgc cccgggacgc tcaagcctgt gtctacctga 480 tggcgcgagg gaggc 495 <210> 3322 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 3322 gccttgccag cccgctcagt caagcctgta cagtgctttt cccacaggct tagtggacgc 60 tggagtcacc caaagtccca cacacctgat caaaacgaga ggacagcaag tgactctgag 120 atgctctcct aagtctgggc atgacactgt gtcctggtac caacaggccc tgggtcaggg 180 gccccagttt 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Synthetic polynucleotide" <400> 3364 gccttgccag cccgctcaga agagctgagg cttgacttct ctgcaggtcc agtgaatgct 60 ggtgtcactc agaccccaaa attccaggtc ctgaagacag gacagagcat gacactgcag 120 tgtgcccagg atatgaacca taactccatg tactggtatc gacaagaccc aggcatggga 180 ctgaggctga tttattactc agcttctgag ggtaccactg acaaaggaga agtccccaat 240 ggctacaatg tctccagatt aaacaaacgg gagttctcgc tcaggctgga gtcggctgct 300 ccctcccaga catctgtgta cttctgtgcc agcagtgaaa gagctgaggc ttgagtcgac 360 acgagcagta cttcgggccg ggcaccaggc tcacggtcac aggtgagatt cgggcgtctc 420 cccaccttcc agcccctcgg tccccggagt cggagggtgg aagagctgag gcttgactga 480 tggcgcgagg gaggc 495 <210> 3365 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 3365 gccttgccag cccgctcagt cagatgcgac actctcttct ctgcaggtcc agtgaatgct 60 ggtgtcactc agaccccaaa attccgggtc ctgaagacag gacagagcat gacactgctg 120 tgtgcccagg atatgaacca tgaatacatg tactggtatc gacaagaccc aggcatgggg 180 ctgaggctga 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<400> 3368 gccttgccag cccgctcagt cagatgcgtc tcctacttct ctgcaggtcc agtgaatgct 60 ggtgtcactc agaccccaaa attccgggtc ctgaagacag gacagagcat gacactgctg 120 tgtgcccagg atatgaacca tgaatacatg tactggtatc gacaagaccc aggcatgggg 180 ctgaggctga ttcattactc agttggtgag ggtacaactg ccaaaggaga ggtccctgat 240 ggctacaatg tctccagatt aaaaaaacag aatttcctgc tggggttgga gtcggctgct 300 ccctcccaaa catctgtgta cttctgtgcc agcagtgatc agatgcgtct cctagtcgac 360 aatgaaaaac tgttttttgg cagtggaacc cagctctctg tcttgggtat gtaaaagact 420 tctttcggga tagtgtatca taaggtcgga gttccaggag tcagatgcgt ctcctactga 480 tggcgcgagg gaggc 495 <210> 3369 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 3369 gccttgccag cccgctcagt cagatgcaga gtgtccttct ctgcaggtcc agtgaatgct 60 ggtgtcactc agaccccaaa attccgggtc ctgaagacag gacagagcat gacactgctg 120 tgtgcccagg atatgaacca tgaatacatg tactggtatc gacaagaccc aggcatgggg 180 ctgaggctga ttcattactc agttggtgag 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Synthetic polynucleotide" <400> 3407 gccttgccag cccgctcagc agtccaagtc tcctacttct ctgcaggtcc agtgaatgct 60 ggtgtcactc agaccccaaa attccgcatc ctgaagatag gacagagcat gacactgcag 120 tgtacccagg atatgaacca taactacatg tactggtatc gacaagaccc aggcatgggg 180 ctgaagctga tttattattc agttggtgct ggtatcactg ataaaggaga agtcccgaat 240 ggctacaacg tctccagatc aaccacagag gatttcccgc tcaggctgga gttggctgct 300 ccctcccaga catctgtgta cttctgtgcc agcagtgaca gtccaagtct cctagtcgac 360 aatgaaaaac tgttttttgg cagtggaacc cagctctctg tcttgggtat gtaaaagact 420 tctttcggga tagtgtatca taaggtcgga gttccaggag cagtccaagt ctcctactga 480 tggcgcgagg gaggc 495 <210> 3408 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 3408 gccttgccag cccgctcagc agtccaaaga gtgtccttct ctgcaggtcc agtgaatgct 60 ggtgtcactc agaccccaaa attccgcatc ctgaagatag gacagagcat gacactgcag 120 tgtacccagg atatgaacca taactacatg tactggtatc gacaagaccc aggcatgggg 180 ctgaagctga 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catgacactg 120 cagtgtgccc aggatatgaa ccatggatac atgtcctggt atcgacaaga cccaggcatg 180 gggctgagac tgatttacta ctcagctgct gctggtacta ctgacaaaga agtccccaat 240 ggctacaatg tctctagatt aaacacagag gatttcccac tcaggctggt gtcggctgct 300 ccctcccaga catctgtgta cttgtgtgcc agcagtgaag taccgagttc cgaagtcgac 360 ataattcacc cctccacttt gggaacggga ccaggctcac tgtgacaggt atgggggctc 420 cactcttgac tcgggggtgc ctgggtttga ctgcaatgat agtaccgagt tccgaactga 480 tggcgcgagg gaggc 495 <210> 3436 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 3436 gccttgccag cccgctcaga gtaccgacgt tacttgttct tctctgcagg tcccgtgaat 60 gctggtgtca ctcagacccc aaaattccac atcctgaaga caggacagag catgacactg 120 cagtgtgccc aggatatgaa ccatggatac atgtcctggt atcgacaaga cccaggcatg 180 gggctgagac tgatttacta ctcagctgct gctggtacta ctgacaaaga agtccccaat 240 ggctacaatg tctctagatt aaacacagag gatttcccac tcaggctggt gtcggctgct 300 ccctcccaga catctgtgta cttgtgtgcc 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catcgtcgac 360 gagacccagt acttcgggcc aggcacgcgg ctcctggtgc tcggtgagcg cgggctgctg 420 gggcgcgggc gcgggcggct tgggtctggt ttttgcgggg agtaccgagg atcatcctga 480 tggcgcgagg gaggc 495 <210> 3441 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 3441 gccttgccag cccgctcaga gtaccgatat tggcggttct tctctgcagg tcccgtgaat 60 gctggtgtca ctcagacccc aaaattccac atcctgaaga caggacagag catgacactg 120 cagtgtgccc aggatatgaa ccatggatac atgtcctggt atcgacaaga cccaggcatg 180 gggctgagac tgatttacta ctcagctgct gctggtacta ctgacaaaga agtccccaat 240 ggctacaatg tctctagatt aaacacagag gatttcccac tcaggctggt gtcggctgct 300 ccctcccaga catctgtgta cttgtgtgcc agcagtgaag taccgatatt ggcggtcgac 360 gggccaacgt cctgactttc ggggccggca gcaggctgac cgtgctgggt gagttttcgc 420 gggaccaccc gggcggcggg attcaggtgg aaggcggcgg agtaccgata ttggcgctga 480 tggcgcgagg gaggc 495 <210> 3442 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> 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Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 3446 gccttgccag cccgctcaga tccatgggtc tcctacttct ctgcaggtcc agtgaatgct 60 ggtgtcactc agaccccaaa attccacatc ctgaagacag gacagagcat gacactgcag 120 tgtgcccagg atatgaacca tggatacttg tcctggtatc gacaagaccc aggcatgggg 180 ctgaggcgca ttcattactc agttgctgct ggtatcactg acaaaggaga agtccccgat 240 ggctacaatg tatccagatc aaacacagag gatttcccgc tcaggctgga gtcagctgct 300 ccctcccaga catctgtata cttctgtgcc agcagtgaat ccatgggtct cctagtcgac 360 aatgaaaaac tgttttttgg cagtggaacc cagctctctg tcttgggtat gtaaaagact 420 tctttcggga tagtgtatca taaggtcgga gttccaggag atccatgggt ctcctactga 480 tggcgcgagg gaggc 495 <210> 3447 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 3447 gccttgccag cccgctcaga tccatggaga gtgtccttct ctgcaggtcc agtgaatgct 60 ggtgtcactc agaccccaaa attccacatc ctgaagacag gacagagcat gacactgcag 120 tgtgcccagg atatgaacca tggatacttg tcctggtatc gacaagaccc 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Synthetic polynucleotide" <400> 3450 gccttgccag cccgctcaga tccatggtag gagaccttct ctgcaggtcc agtgaatgct 60 ggtgtcactc agaccccaaa attccacatc ctgaagacag gacagagcat gacactgcag 120 tgtgcccagg atatgaacca tggatacttg tcctggtatc gacaagaccc aggcatgggg 180 ctgaggcgca ttcattactc agttgctgct ggtatcactg acaaaggaga agtccccgat 240 ggctacaatg tatccagatc aaacacagag gatttcccgc tcaggctgga gtcagctgct 300 ccctcccaga catctgtata cttctgtgcc agcagtgaat ccatggtagg agacgtcgac 360 accggggagc tgttttttgg agaaggctct aggctgaccg tactgggtaa ggaggcggtt 420 ggggctccgg agagctccga gagggcggga tgggcagagg atccatggta ggagacctga 480 tggcgcgagg gaggc 495 <210> 3451 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 3451 gccttgccag cccgctcaga tccatgggtg tctaccttct ctgcaggtcc agtgaatgct 60 ggtgtcactc agaccccaaa attccacatc ctgaagacag gacagagcat gacactgcag 120 tgtgcccagg atatgaacca tggatacttg tcctggtatc gacaagaccc aggcatgggg 180 ctgaggcgca 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<211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 3473 gccttgccag cccgctcaga tcttcgtaga gtgtcctcca cagatcacac aggagctgga 60 gtctcccagt cccccagtaa caaggtcaca gagaagggaa aggatgtaga gctcaggtgt 120 gatccaattt caggtcatac tgccctttac tggtaccgac agagcctggg gcagggcctg 180 gagtttttaa tttacttcca aggcaacagt gcaccagaca aatcagggct gcccagtgat 240 cgcttctctg cagagaggac tgggggatcc gtctccactc tgacgatcca gcgcacacag 300 caggaggact cggccgtgta tctctgtgcc agcagtgaat cttcgtagag tgtcgtcgac 360 atcagcccca gcattttggt gatgggactc gactctccat cctaggtaag ttgcagaatc 420 agggtggtat ggccattgtc ccttgaaggc agagttctct atcttcgtag agtgtcctga 480 tggcgcgagg gaggc 495 <210> 3474 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 3474 gccttgccag cccgctcaga tcttcgtgtt ccgaactcca cagatcacac aggagctgga 60 gtctcccagt cccccagtaa caaggtcaca 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/note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 3485 gccttgccag cccgctcagt ccacagtgtc tcctactccg cagatcacac aggtgctgga 60 gtctcccaga cccccagtaa caaggtcaca gagaagggaa aatatgtaga gctcaggtgt 120 gatccaattt caggtcatac tgccctttac tggtaccgac aaagcctggg gcagggccca 180 gagtttctaa tttacttcca aggcacgggt gcggcagatg actcagggct gcccaacgat 240 cggttctttg cagtcaggcc tgagggatcc gtctctactc tgaagatcca gcgcacagag 300 cggggggact cagccgtgta tctctgtgcc agcagtgatc cacagtgtct cctagtcgac 360 aatgaaaaac tgttttttgg cagtggaacc cagctctctg tcttgggtat gtaaaagact 420 tctttcggga tagtgtatca taaggtcgga gttccaggag tccacagtgt ctcctactga 480 tggcgcgagg gaggc 495 <210> 3486 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 3486 gccttgccag cccgctcagt ccacagtaga gtgtcctccg cagatcacac aggtgctgga 60 gtctcccaga cccccagtaa caaggtcaca gagaagggaa aatatgtaga gctcaggtgt 120 gatccaattt caggtcatac tgccctttac 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Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 3489 gccttgccag cccgctcagt ccacagttag gagacctccg cagatcacac aggtgctgga 60 gtctcccaga cccccagtaa caaggtcaca gagaagggaa aatatgtaga gctcaggtgt 120 gatccaattt caggtcatac tgccctttac tggtaccgac aaagcctggg gcagggccca 180 gagtttctaa tttacttcca aggcacgggt gcggcagatg actcagggct gcccaacgat 240 cggttctttg cagtcaggcc tgagggatcc gtctctactc tgaagatcca gcgcacagag 300 cggggggact cagccgtgta tctctgtgcc agcagtgatc cacagttagg agacgtcgac 360 accggggagc tgttttttgg agaaggctct aggctgaccg tactgggtaa ggaggcggtt 420 ggggctccgg agagctccga gagggcggga tgggcagagg tccacagtta ggagacctga 480 tggcgcgagg gaggc 495 <210> 3490 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 3490 gccttgccag cccgctcagt ccacagtgtg tctacctccg cagatcacac aggtgctgga 60 gtctcccaga cccccagtaa caaggtcaca gagaagggaa aatatgtaga gctcaggtgt 120 gatccaattt caggtcatac tgccctttac tggtaccgac aaagcctggg 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Synthetic polynucleotide" <400> 3493 gccttgccag cccgctcagt ccacagttat tggcgctccg cagatcacac aggtgctgga 60 gtctcccaga cccccagtaa caaggtcaca gagaagggaa aatatgtaga gctcaggtgt 120 gatccaattt caggtcatac tgccctttac tggtaccgac aaagcctggg gcagggccca 180 gagtttctaa tttacttcca aggcacgggt gcggcagatg actcagggct gcccaacgat 240 cggttctttg cagtcaggcc tgagggatcc gtctctactc tgaagatcca gcgcacagag 300 cggggggact cagccgtgta tctctgtgcc agcagtgatc cacagttatt ggcggtcgac 360 gggccaacgt cctgactttc ggggccggca gcaggctgac cgtgctgggt gagttttcgc 420 gggaccaccc gggcggcggg attcaggtgg aaggcggcgg tccacagtta ttggcgctga 480 tggcgcgagg gaggc 495 <210> 3494 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 3494 gccttgccag cccgctcagt ccacagtagg cttgactccg cagatcacac aggtgctgga 60 gtctcccaga cccccagtaa caaggtcaca gagaagggaa aatatgtaga gctcaggtgt 120 gatccaattt caggtcatac tgccctttac tggtaccgac aaagcctggg gcagggccca 180 gagtttctaa 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<400> 3497 gccttgccag cccgctcaga tgacaccaag taacgttcca cagatcacac aggtgctgga 60 gtctcccagt ccccaaggta caaagtcgca aagaggggac gggatgtagc tctcaggtgt 120 gattcaattt cgggtcatgt aaccctttat tggtaccgac agaccctggg gcagggctca 180 gaggttctga cttactccca gagtgatgct caacgagaca aatcagggcg gcccagtggt 240 cggttctctg cagagaggcc tgagagatcc gtctccactc tgaagatcca gcgcacagag 300 cagggggact cagctgtgta tctctgtgcc agcagtgaat gacaccaagt aacggtcgac 360 gaaacaccat atattttgga gagggaagtt ggctcactgt tgtaggtgag taagtcaagg 420 ctggacagct gggaacttgc aaaaaggggc tggaatccag atgacaccaa gtaacgctga 480 tggcgcgagg gaggc 495 <210> 3498 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 3498 gccttgccag cccgctcaga tgacaccgtc tcctattcca cagatcacac aggtgctgga 60 gtctcccagt ccccaaggta caaagtcgca aagaggggac gggatgtagc tctcaggtgt 120 gattcaattt cgggtcatgt aaccctttat tggtaccgac agaccctggg gcagggctca 180 gaggttctga cttactccca gagtgatgct 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Synthetic polynucleotide" <400> 3536 gccttgccag cccgctcagt aaccaagaag taacgttcca cagatcacac aggtgctgga 60 gtctcccagt ctcccaggta caaagtcaca aagaggggac aggatgtaac tctcaggtgt 120 gatccaattt cgagtcatgc aaccctttat tggtatcaac aggccctggg gcagggccca 180 gagtttctga cttacttcaa ttatgaagct caaccagaca aatcagggct gcccagtgat 240 cggttctctg cagagaggcc tgagggatcc atctccactc tgacgattca gcgcacagag 300 cagcgggact cagccatgta tcgctgtgcc agcagtgata accaagaagt aacggtcgac 360 gaaacaccat atattttgga gagggaagtt ggctcactgt tgtaggtgag taagtcaagg 420 ctggacagct gggaacttgc aaaaaggggc tggaatccag taaccaagaa gtaacgctga 480 tggcgcgagg gaggc 495 <210> 3537 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 3537 gccttgccag cccgctcagt aaccaaggtc tcctattcca cagatcacac aggtgctgga 60 gtctcccagt ctcccaggta caaagtcaca aagaggggac aggatgtaac tctcaggtgt 120 gatccaattt cgagtcatgc aaccctttat tggtatcaac aggccctggg gcagggccca 180 gagtttctga 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Synthetic polynucleotide" <400> 3579 gccttgccag cccgctcaga gttgacccgt tacttctgcc tgcctctccc acagccccca 60 tggaggcagg gatcagccag ataccaagat atcacagaca cacagggaaa aagatcatcc 120 tgaaatttgc tcagattagg aaccattatt cagtgttctg ttatcaataa gaccaagaat 180 aggggctgag gctgatccat tattcaggta gtattggcag catgaccaaa ggcggtgcca 240 aggaagggta caatgtctct ggaaacaaac tcaagcattt tccctcaacc ctggagtcta 300 ctagcaccag ccagacctct gtacctctgt ggcagtgaag ttgacccgtt acttgtcgac 360 acaatgagca gttcttcggg ccagggacac ggctcaccgt gctaggtaag aagggggctc 420 caggtgggag agagggtgag cagcccagcc tgcacgaccc agttgacccg ttacttctga 480 tggcgcgagg gaggc 495 <210> 3580 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 3580 gccttgccag cccgctcaga gttgacctag gagacctgcc tgcctctccc acagccccca 60 tggaggcagg gatcagccag ataccaagat atcacagaca cacagggaaa aagatcatcc 120 tgaaatttgc tcagattagg aaccattatt cagtgttctg ttatcaataa gaccaagaat 180 aggggctgag 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Synthetic polynucleotide" <400> 3622 gccttgccag cccgctcagc catggatgga tcatcctcta ttacaggaca cagggatgct 60 gaaatcaccc agagcccaag acacaagatc acagagacag gaaggcaggt gaccttggcg 120 tgtcaccaga cttggaacca caacaatatg ttctggtatc gacaagacct gggacatggg 180 ctgaggctga tccattactc atatggtgtt caagacacta acaaaggaga agtctcagat 240 ggctacagtg tctctagatc aaacacagag gacctccccc tcactctgga gtctgctgcc 300 tcctcccaga catctgtata tttctgcgcc agcagtgacc atggatggat catcgtcgac 360 gagacccagt acttcgggcc aggcacgcgg ctcctggtgc tcggtgagcg cgggctgctg 420 gggcgcgggc gcgggcggct tgggtctggt ttttgcgggg ccatggatgg atcatcctga 480 tggcgcgagg gaggc 495 <210> 3623 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 3623 gccttgccag cccgctcagc catggattat tggcgctcta ttacaggaca cagggatgct 60 gaaatcaccc agagcccaag acacaagatc acagagacag gaaggcaggt gaccttggcg 120 tgtcaccaga cttggaacca caacaatatg ttctggtatc gacaagacct gggacatggg 180 ctgaggctga 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Synthetic polynucleotide" <400> 3665 gccttgccag cccgctcagg gtgtcatttc ggaaccttct cagaactcac agaagctgga 60 gttgcccagt ctcccagata taagattata gagaaaaggc agagtgtggc tttttggtgc 120 aatcctatat ctggccatgc taccctttac tggtaccagc agatcctggg acagggccca 180 aagcttctga ttcagtttca gaataacggt gtagtggatg attcacagtt gcctaaggat 240 cgattttctg cagagaggct caaaggagta gactccactc tcaagatcca gcctgcaaag 300 cttgaggact cggccgtgta tctctgtgcc agcagtgagg tgtcatttcg gaacgtcgac 360 tatggctaca ccttcggttc ggggaccagg ttaaccgttg taggtaaggc tgggggtctc 420 taggaggggt gcgatgaggg aggactctgt cctgggaaat ggtgtcattt cggaacctga 480 tggcgcgagg gaggc 495 <210> 3666 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 3666 gccttgccag cccgctcagg gtgtcataag taacgcttct cagaactcac agaagctgga 60 gttgcccagt ctcccagata taagattata gagaaaaggc agagtgtggc tttttggtgc 120 aatcctatat ctggccatgc taccctttac tggtaccagc agatcctggg acagggccca 180 aagcttctga 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<211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 3688 gccttgccag cccgctcagt cgtgaagtat tggcgcccca cagaactcat agaagctgga 60 gtggttcagt ctcccagata taagattata gagaaaaaac agcctgtggc tttttggtgc 120 aatcctattt ctggccacaa taccctttac tggtacctgc agaacttggg acagggcccg 180 gagcttctga ttcgatatga gaatgaggaa gcagtagacg attcacagtt gcctaaggat 240 cgattttctg cagagaggct caaaggagta gactccactc tcaagatcca gcctgcagag 300 cttggggact cggccgtgta tctctgtgcc agcagtgatc gtgaagtatt ggcggtcgac 360 gggccaacgt cctgactttc ggggccggca gcaggctgac cgtgctgggt gagttttcgc 420 gggaccaccc gggcggcggg attcaggtgg aaggcggcgg tcgtgaagta ttggcgctga 480 tggcgcgagg gaggc 495 <210> 3689 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 3689 gccttgccag cccgctcagt cgtgaagagg cttgacccca cagaactcat agaagctgga 60 gtggttcagt ctcccagata taagattata 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Synthetic polynucleotide" <400> 3708 gccttgccag cccgctcagc ttggttagtt ccgaatttta tagcatgcac agatgctggc 60 attatccagt cacccaagca tgaggtgaca gaaatgggac aaacagtgac tctgagatgt 120 gagccaattt ttggccacaa tttccttttc tggtacagag ataccttcgt gcagggactg 180 gaattgctga gttacttccg gagctgatct attatagata atgcaggtat gcccacagag 240 cgattctcag ctgagaggcc tgatggatca ttctctactc tgaagatcca gcctgcagag 300 cagggggact cggccgtgta tgtctgtgca agtcgtgact tggttagttc cgaagtcgac 360 ataattcacc cctccacttt gggaacggga ccaggctcac tgtgacaggt atgggggctc 420 cactcttgac tcgggggtgc ctgggtttga ctgcaatgat cttggttagt tccgaactga 480 tggcgcgagg gaggc 495 <210> 3709 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 3709 gccttgccag cccgctcagc ttggttacgt tactttttta tagcatgcac agatgctggc 60 attatccagt cacccaagca tgaggtgaca gaaatgggac aaacagtgac tctgagatgt 120 gagccaattt ttggccacaa tttccttttc tggtacagag ataccttcgt gcagggactg 180 gaattgctga 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Synthetic polynucleotide" <400> 3751 gccttgccag cccgctcagg gtcaactgta cagtgtttca cagagcttat agatgctaga 60 gtcacccaga caccaaggca caaggtgaca gagatgggac aagaagtaac aatgagatgt 120 cagccaattt taggccacaa tactgttttc tggtacagac agaccatgat gcaaggactg 180 gagttgctgg cttacttccg caaccgggct cctctagatg attcggggat gccgaaggat 240 cgattctcag cagagatgcc tgatgcaact ttagccactc tgaagatcca gccctcagaa 300 cccagggact cagctgtgta tttttgtgct agtggtgagg tcaactgtac agtggtcgac 360 aaaacattca gtacttcggc gccgggaccc ggctctcagt gctgggtaag ctggggccgc 420 cgggggaccg gggacgagac tgcgctcggg tttttgtgcg ggtcaactgt acagtgctga 480 tggcgcgagg gaggc 495 <210> 3752 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 3752 gccttgccag cccgctcagg gtcaactgga tcatctttca cagagcttat agatgctaga 60 gtcacccaga caccaaggca caaggtgaca gagatgggac aagaagtaac aatgagatgt 120 cagccaattt taggccacaa tactgttttc tggtacagac agaccatgat gcaaggactg 180 gagttgctgg 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Synthetic polynucleotide" <400> 3794 gccttgccag cccgctcagt gagacctgac actctcttta caggttctcc tggtgaagaa 60 gtcgcccaga ctccaaaaca tcttgtcaga ggggaaggac agaaagcaaa attatattgt 120 gccccaataa aaggacacag ttatgttttt tggtaccaac aggtcctgaa aaacgagttc 180 aagttcttga tttccttcca gaatgaaaat gtctttgatg aaacaggtat gcccaaggaa 240 agattttcag ctaagtgcct cccaaattca ccctgtagcc ttgagatcca ggctacgaag 300 cttgaggatt cagcagtgta tttttgtgcc agcagtgatg agacctgaca ctctgtcgac 360 actgaagctt tctttggaca aggcaccaga ctcacagttg taggtaagac atttttcagg 420 ttcttttgca gatccgtcac agggaaaagt gggtccacag tgagacctga cactctctga 480 tggcgcgagg gaggc 495 <210> 3795 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 3795 gccttgccag cccgctcagt gagacctttc ggaaccttta caggttctcc tggtgaagaa 60 gtcgcccaga ctccaaaaca tcttgtcaga ggggaaggac agaaagcaaa attatattgt 120 gccccaataa aaggacacag ttatgttttt tggtaccaac aggtcctgaa aaacgagttc 180 aagttcttga 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ccatcccgca 300 gagccgaggg actcagccgt gtatctctac agtagtgaga atggacgtgt ctacgtcgac 360 agatacgcag tattttggcc caggcacccg gctgacagtg ctcggtaagc gggggctccc 420 gctgaagccc cggaactggg gagggggcgc cccgggacgc gaatggacgt gtctacctga 480 tggcgcgagg gaggc 495 <210> 3816 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 3816 gccttgccag cccgctcagg aatggacgta cagtgttctt ccacaggaca ctcggagcct 60 ggagtcagcc agacccccag acacaaggtc accaacatgg gacaggaggt gattctgagg 120 tgcgatccat cttctggtca catgtttgtt cactggtacc gacagaatct gaggcaagaa 180 atgaagttgc tgatttcctt ccagtaccaa aacattgcag ttgattcagg gatgcccaag 240 gaacgattca cagctgaaag acctaacgga acgtcttcca cgctgaagat ccatcccgca 300 gagccgaggg actcagccgt gtatctctac agtagtgaga atggacgtac agtggtcgac 360 aaaacattca gtacttcggc gccgggaccc ggctctcagt gctgggtaag ctggggccgc 420 cgggggaccg gggacgagac tgcgctcggg tttttgtgcg gaatggacgt acagtgctga 480 tggcgcgagg gaggc 495 <210> 3817 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 3817 gccttgccag cccgctcagg aatggacgga tcatcttctt ccacaggaca ctcggagcct 60 ggagtcagcc agacccccag acacaaggtc accaacatgg gacaggaggt gattctgagg 120 tgcgatccat cttctggtca catgtttgtt cactggtacc gacagaatct gaggcaagaa 180 atgaagttgc tgatttcctt ccagtaccaa aacattgcag ttgattcagg gatgcccaag 240 gaacgattca cagctgaaag acctaacgga acgtcttcca cgctgaagat ccatcccgca 300 gagccgaggg actcagccgt gtatctctac agtagtgaga atggacggat catcgtcgac 360 gagacccagt acttcgggcc aggcacgcgg ctcctggtgc tcggtgagcg cgggctgctg 420 gggcgcgggc gcgggcggct tgggtctggt ttttgcgggg gaatggacgg atcatcctga 480 tggcgcgagg gaggc 495 <210> 3818 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 3818 gccttgccag cccgctcagg aatggactat tggcgttctt ccacaggaca ctcggagcct 60 ggagtcagcc agacccccag acacaaggtc 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/note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 3829 gccttgccag cccgctcaga gttatgcgta cagtgcctct gaggtctctc aaatgccggc 60 gtcatgcaga acccaagaca cctggtcagg aggaggggac aggaggcaag actgagatgc 120 agcccaatga aaggacacag tcatgtttac tggtatcggc agctcccaga ggaaggtctg 180 aaattcatgg tttatctcca gaaagaaaat atcatagatg agtcaggaat gccaaaggaa 240 cgattttctg ctgaatttcc caaagagggc cccagcatcc tgaggatcca gcaggtagtg 300 cgaggagatt cggcagctta tttctgtgcc agctctgaag ttatgcgtac agtggtcgac 360 aaaacattca gtacttcggc gccgggaccc ggctctcagt gctgggtaag ctggggccgc 420 cgggggaccg gggacgagac tgcgctcggg tttttgtgcg agttatgcgt acagtgctga 480 tggcgcgagg gaggc 495 <210> 3830 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 3830 gccttgccag cccgctcaga gttatgcgga tcatccctct gaggtctctc aaatgccggc 60 gtcatgcaga acccaagaca cctggtcagg aggaggggac aggaggcaag actgagatgc 120 agcccaatga aaggacacag tcatgtttac 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Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 3833 gccttgccag cccgctcagc agcatatgac actctttctt ttccagacac cgtggatggt 60 ggaatcactc agtccccaaa gtacctgttc agaaaggaag gacagaatgt gaccctgagt 120 tgtgaacaga atttgaacca cgatgccatg tactggtacc gacaggaccc agggcaaggg 180 ctgagattga tctactactc acagatagta aatgactttc agaaaggaga tatagctgaa 240 gggtacagcg tctctcggga gaagaaggaa tcctttcctc tcactgtgac atcggcccaa 300 aagaacccga cagctttcta tctctgtgcc agtagtgaca gcatatgaca ctctgtcgac 360 actgaagctt tctttggaca aggcaccaga ctcacagttg taggtaagac atttttcagg 420 ttcttttgca gatccgtcac agggaaaagt gggtccacag cagcatatga cactctctga 480 tggcgcgagg gaggc 495 <210> 3834 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 3834 gccttgccag cccgctcagc agcatatttc ggaacttctt ttccagacac cgtggatggt 60 ggaatcactc agtccccaaa gtacctgttc agaaaggaag gacagaatgt gaccctgagt 120 tgtgaacaga atttgaacca cgatgccatg tactggtacc gacaggaccc 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Synthetic polynucleotide" <400> 3837 gccttgccag cccgctcagc agcatataga gtgtcttctt ttccagacac cgtggatggt 60 ggaatcactc agtccccaaa gtacctgttc agaaaggaag gacagaatgt gaccctgagt 120 tgtgaacaga atttgaacca cgatgccatg tactggtacc gacaggaccc agggcaaggg 180 ctgagattga tctactactc acagatagta aatgactttc agaaaggaga tatagctgaa 240 gggtacagcg tctctcggga gaagaaggaa tcctttcctc tcactgtgac atcggcccaa 300 aagaacccga cagctttcta tctctgtgcc agtagtgaca gcatatagag tgtcgtcgac 360 atcagcccca gcattttggt gatgggactc gactctccat cctaggtaag ttgcagaatc 420 agggtggtat ggccattgtc ccttgaaggc agagttctct cagcatatag agtgtcctga 480 tggcgcgagg gaggc 495 <210> 3838 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 3838 gccttgccag cccgctcagc agcatatgtt ccgaattctt ttccagacac cgtggatggt 60 ggaatcactc agtccccaaa gtacctgttc agaaaggaag gacagaatgt gaccctgagt 120 tgtgaacaga atttgaacca cgatgccatg tactggtacc gacaggaccc agggcaaggg 180 ctgagattga 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Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 3876 gccttgccag cccgctcagg tccattcaga gtgtcttgtc tcttggaccc ttggatgctg 60 acatctatca gatgccattc cagctcactg gggctggatg ggatgtgact ctggagtgga 120 aacggaattt gagacacaat gacatgtact gctactggta ctggcaggac ccaaagcaaa 180 atctgagact gatctattac tcaagggttg aaaaggatat tcagagagga gatctaactg 240 aaggctacgt gtctgccaag aggagaaggg gctatttctt ctcagggtga agttggccca 300 caccagccaa acagctttgt acttctgtcc tgggatgagt ccattcagag tgtcgtcgac 360 atcagcccca gcattttggt gatgggactc gactctccat cctaggtaag ttgcagaatc 420 agggtggtat ggccattgtc ccttgaaggc agagttctct gtccattcag agtgtcctga 480 tggcgcgagg gaggc 495 <210> 3877 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 3877 gccttgccag cccgctcagg tccattcgtt ccgaattgtc tcttggaccc ttggatgctg 60 acatctatca gatgccattc cagctcactg gggctggatg ggatgtgact ctggagtgga 120 aacggaattt gagacacaat gacatgtact gctactggta ctggcaggac 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Synthetic polynucleotide" <400> 3880 gccttgccag cccgctcagg tccattcgtg tctacttgtc tcttggaccc ttggatgctg 60 acatctatca gatgccattc cagctcactg gggctggatg ggatgtgact ctggagtgga 120 aacggaattt gagacacaat gacatgtact gctactggta ctggcaggac ccaaagcaaa 180 atctgagact gatctattac tcaagggttg aaaaggatat tcagagagga gatctaactg 240 aaggctacgt gtctgccaag aggagaaggg gctatttctt ctcagggtga agttggccca 300 caccagccaa acagctttgt acttctgtcc tgggatgagt ccattcgtgt ctacgtcgac 360 agatacgcag tattttggcc caggcacccg gctgacagtg ctcggtaagc gggggctccc 420 gctgaagccc cggaactggg gagggggcgc cccgggacgc gtccattcgt gtctacctga 480 tggcgcgagg gaggc 495 <210> 3881 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 3881 gccttgccag cccgctcagg tccattcgta cagtgttgtc tcttggaccc ttggatgctg 60 acatctatca gatgccattc cagctcactg gggctggatg ggatgtgact ctggagtgga 120 aacggaattt gagacacaat gacatgtact gctactggta ctggcaggac ccaaagcaaa 180 atctgagact 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Synthetic polynucleotide" <400> 3923 gccttgccag cccgctcaga tggtcaaagg cttgatcttc ccataggcct catggaagct 60 gacatctacc agaccccaag ataccttgtt atagggacag gaaagaagat cactctggaa 120 tgttctcaaa ccatgggcca tgacaaaatg tactggtatc aacaagatcc aggaatggaa 180 ctacacctca tccactattc ctatggagtt aattccacag agaagggaga tctttcctct 240 gagtcaacag tctccagaat aaggacggag cattttcccc tgaccctgga gtctgccagg 300 ccctcacata cctctcagta cctctgtgcc agcagtgaat ggtcaaaggc ttgagtcgac 360 acgagcagta cttcgggccg ggcaccaggc tcacggtcac aggtgagatt cgggcgtctc 420 cccaccttcc agcccctcgg tccccggagt cggagggtgg atggtcaaag gcttgactga 480 tggcgcgagg gaggc 495 <210> 3924 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 3924 gccttgccag cccgctcagc aagtcacgac actctccccc caacaggcct caaggatgct 60 gtagttacac aattcccaag acacagaatc attgggacag gaaaggaatt cattctacag 120 tgttcccaga atatgaatca tgttacaatg tactggtatc gacaggaccc aggacttgga 180 ctgaagctgg 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Synthetic polynucleotide" <400> 3966 gccttgccag cccgctcagg tcatagtgtc tcctaactag gctctgtgtt cagtgctgtc 60 atctctcaaa agccaagcag ggatatctgt caacgtggaa cctccctgac gatccagtgt 120 caagtcgata gccaagtcac catgatgttc tggtaccgtc agcaacctgg acagagcctg 180 acactgatcg caactgcaaa tcagggctct gaggccacat atgagagtgg atttgtcatt 240 gacaagtttc ccatcagccg cccaaaccta acattctcaa ctctgactgt gagcaacatg 300 agccctgaag acagcagcat atatctctgc agcgttgagt catagtgtct cctagtcgac 360 aatgaaaaac tgttttttgg cagtggaacc cagctctctg tcttgggtat gtaaaagact 420 tctttcggga tagtgtatca taaggtcgga gttccaggag gtcatagtgt ctcctactga 480 tggcgcgagg gaggc 495 <210> 3967 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 3967 gccttgccag cccgctcagg tcatagtaga gtgtcactag gctctgtgtt cagtgctgtc 60 atctctcaaa agccaagcag ggatatctgt caacgtggaa cctccctgac gatccagtgt 120 caagtcgata gccaagtcac catgatgttc tggtaccgtc agcaacctgg acagagcctg 180 acactgatcg 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Synthetic polynucleotide" <400> 4009 gccttgccag cccgctcagg tgacttgtag gagaccagac cctgagatga ggcaggaaag 60 ttgtatcgga atgttttcag actatcaacc agaccaaacg ttctggaatc cataagatcc 120 agggctgggg ataaatttaa tctattaatt attcttctga agttggcagc tttgaaaaag 180 atgccctgag tcagcatagt cattctaacc aaaaagaaaa aagggaaaaa ataatcatct 240 ttcccaaccc ttaaatcgtc cagcactaac cagactctga gaccctctgc agcagcagcc 300 tatcagtgca gccacatcct ctctgagcgg atatgtgagt gacttgtagg agacgtcgac 360 accggggagc tgttttttgg agaaggctct aggctgaccg tactgggtaa ggaggcggtt 420 ggggctccgg agagctccga gagggcggga tgggcagagg gtgacttgta ggagacctga 480 tggcgcgagg gaggc 495 <210> 4010 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 4010 gccttgccag cccgctcagg tgacttggtg tctaccagac cctgagatga ggcaggaaag 60 ttgtatcgga atgttttcag actatcaacc agaccaaacg ttctggaatc cataagatcc 120 agggctgggg ataaatttaa tctattaatt attcttctga agttggcagc tttgaaaaag 180 atgccctgag 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Synthetic polynucleotide" <400> 4052 gccttgccag cccgctcaga cgtactctat agttcgcagg tcacctagag caacctcaaa 60 tttccagtac taaaacgctg tcaaaaacag cccgcctgga atgtgtggtg tctggaataa 120 caatttctgc aacatctgta tattggtatc gagagagacc tggtgaagtc atacagttcc 180 tggtgtccat ttcatatgac ggcactgtca gaaaggaatc cggcattccg tcaggcaaat 240 ttgaggtgga taggatacct gaaacgtcta catccactct caccattcac aatgtagaga 300 aacaggacat agctacctac tactgtgcct tgtggtgaac gtactctata gttcgtcgac 360 aagagttggg caaaaaaatc aaggtatttg gtcccggaac aaagcttatc attacaggta 420 agttttcttt aaattttgca atgtaaagaa gggatgggag acgtactcta tagttcctga 480 tggcgcgagg gaggc 495 <210> 4053 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 4053 gccttgccag cccgctcagc ttctaagtat agttcttatc aaaagtggag cagttccagc 60 tatccatttc cacggaagtc aagaaaagta ttgacatacc ttgcaagata tcgagcacaa 120 ggtttgaaac agatgtcatt cactggtacc ggcagaaacc aaatcaggct ttggagcacc 180 tgatctatat 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<211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 4075 gccttgccag cccgctcagt acgcgtttgg acatgcagaa atcttccaac ttggaagggg 60 gaacgaagtc agtcacgagg ccgactaggt catctgctga aatcacttgt gaccttactg 120 taataaatgc cttctacatc cactggtacc tacaccagga ggggaaggcc ccacagcgtc 180 ttctgtacta tgacgtctcc aactcaaagg atgtgttgga atcaggactc agtccaggaa 240 agtattatac tcatacaccc aggaggtgga gctggatatt gatactacga aatctaattg 300 aaaatgattc tggggtctat tactgtgcca cctggtgata cgcgtttgga catggtcgac 360 agtgattgga tcaagacgtt tgcaaaaggg actaggctca tagtaacttc gcctggtaag 420 taattttttt tctgttttta ttccagtaat gaaaaactga tacgcgtttg gacatgctga 480 tggcgcgagg gaggc 495 <210> 4076 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 4076 gccttgccag cccgctcagc tcagtgatgg acatgcagaa atcttccaac ttggaaggga 60 gaatgaagtc agtcaccagg ccgactgggt 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/note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 4087 gcctccctcg cgccatcaga gagtgtcctg attctcttgc ctggcccagt acacctggct 60 ccccgctatc cccagacagc agactcacct gaggagacgg tgaccagggt gccctggccc 120 cagtgctgga agtatgtcga cagagtgtcc tgattcttca acagtaatac acggccgtgt 180 cctcagatct caggctgctc agctccatgt aggctgtgct tatggaggtg ttcctggtca 240 tggtgactct gccctggaac ttctgtgcat agcctgtgtt accactgtta gggttcatcc 300 atcccatcca ctcaagccct tgtccagtgg cctgtcgcac ccagttgata tcataactgg 360 tgaaggtgta tccagaagcc ttgcaggaga ccttcactga ggccccaggc ttcttcacct 420 cagccccaga ctgcaccagc tgcacctggg agtgggcacc agagtgtcct gattctctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 4088 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 4088 gcctccctcg cgccatcaga gagtgtcagt accgacttgc ctggcccagt acacctggct 60 ccccgctatc cccagacagc agactcacct gaggagacgg tgaccagggt gccctggccc 120 cagtgctgga agtatgtcga cagagtgtca 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Synthetic polynucleotide" <400> 4095 gcctccctcg cgccatcaga gagtgtccaa gaggtcttgc ctggcccagt acacctggct 60 ccccgctatc cccagacagc agactcacct gaggagacgg tgaccagggt gccctggccc 120 cagtgctgga agtatgtcga cagagtgtcc aagaggttca acagtaatac acggccgtgt 180 cctcagatct caggctgctc agctccatgt aggctgtgtc tgtagacgtg tccgcggtta 240 tggtgactct gccctggaac ttctctgcgt atattgtttc accatcttca ggatcaacaa 300 gtcccatcca ctcaagccct tttccagggg cctgttgcac ccagtgcatg tagtagtcgg 360 tgaaggtgta tccagaaacc ttgcaggaga ttttcactgt agccccaggc ttcttcacct 420 cagccccaga ctgtaccagc tggacctcgg cgtgggtgcc agagtgtcca agaggtctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 4096 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 4096 gcctccctcg cgccatcaga gagtgtcagt tgacccttgc ctggcccagt acacctggct 60 ccccgctatc cccagacagc agactcacct gaggagacgg tgaccagggt gccctggccc 120 cagtgctgga agtatgtcga cagagtgtca gttgacctca tgcacagtaa tatgtggctg 180 tgtccacagg 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<211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 4118 gcctccctcg cgccatcaga gagtgtcgcc attaacttgc ctggcccagt acacctggct 60 ccccgctatc cccagacagc agactcacct gaggagacgg tgaccagggt gccctggccc 120 cagtgctgga agtatgtcga cagagtgtcg ccattaatca acagtaatac acagccgtgt 180 cctcagctct caggctgttc atttgaagat acagcgtgtt cttggaattg tctctggaga 240 tggtgaatcg gcccttcacg gagtctgcgt agtatgtgct accacagcta taaataactg 300 agacccactc cagccccttc cctggagcct ggcggaccca gctcatgtag ttgctactga 360 cggtgaaccc agaggctgca caggagagtc tcagggaccc cccaggctgg atcaagcctc 420 ctccagactc caccagctgc acctcacact ggacacctgc agagtgtcgc cattaactga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 4119 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 4119 gcctccctcg cgccatcaga gagtgtcgac taagacttgc ctggcccagt acacctggct 60 ccccgctatc cccagacagc agactcacct 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Synthetic polynucleotide" <400> 4138 gcctccctcg cgccatcaga gagtgtccaa ggtcacttgc ctggcccagt acacctggct 60 ccccgctatc cccagacagc agactcacct gaggagacgg tgaccagggt gccctggccc 120 cagtgctgga agtatgtcga cagagtgtcc aaggtcatca acagtaatac atggccatgt 180 cctcagcctt taggctgctg atctgcaggt atgctgtgct ggcagaggtg tccatggaga 240 agacaaaccg tcctgtgaag ccctgggcat atgttgggtt cccagtgtag gtgttgaacc 300 atcccatcca ctcaagccct tgtccagggg cctgtggcac ccaattcata ccataggtgg 360 tgaaactgta accagaagcc ttgcaggaga ccttcactga ggccccaggc tgcttcacct 420 catggccaga ctgcaccagc tgcacctggg agtaggtacc agagtgtcca aggtcactga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 4139 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 4139 gcctccctcg cgccatcaga gagtgtccac tgtaccttgc ctggcccagt acacctggct 60 ccccgctatc cccagacagc agactcacct gaggagacgg tgaccagggt gccctggccc 120 cagtgctgga agtatgtcga cagagtgtcc actgtactca gggaatgtgc ggccctgccc 180 ttggccatca 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<400> 4142 gcctccctcg cgccatcaga gagtgtctca agcctcttgc ctggcccagt acacctggct 60 ccccgctatc cccagacagc agactcacct gaggagacgg tgaccagggt gccctggccc 120 cagtgctgga agtatgtcga cagagtgtct caagccttca cagtaatact cagccgtgtc 180 ctaggtggtc atggagctga gcttcacaga gaactggctc ttggttgagt cactgttgat 240 ggggacatgg acctgggtgg agggtgcatg atgtgtattc cttgatgatc cagtctagta 300 actgtgcccc agccattcca gcctgttgcc cacgggatgg tggattcatc tcaaataata 360 tccatggtaa aaaaaagaat ccagacacag cacaggcaga gggcagtgtc tgagggcctc 420 atgggtcctg gacctgactc ctgcagctgc acctgggaca agagtgtctc aagcctctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 4143 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 4143 gcctccctcg cgccatcaga gagtgtcacg tgtgtcttgc ctggcccagt acacctggct 60 ccccgctatc cccagacagc agactcacct gaggagacgg tgaccagggt gccctggccc 120 cagtgctgga agtatgtcga cagagtgtca cgtgtgttca cttaaaaatg cgtagttgtg 180 tgttcactgg gcacagagct cagctgtaag 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<211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 4161 gcctccctcg cgccatcaga gagtgtcaac tgccacttgc ctggcccagt acacctggct 60 ccccgctatc cccagacagc agactcacct gaggagacgg tgaccagggt gccctggccc 120 cagtgctgga agtatgtcga cagagtgtca actgccatca ctgtaatata cggccttgcc 180 cttggctttc aggttggtcc ttgtaaggta gactgcactt gaaagggtgt cacttgggaa 240 tgttgattta tctgtactca tggagagtaa cccttagaac tcccatatga tctctcactg 300 ttgctaccca caccaattcc tgttgtgaag cgtgctggac caagctcatg ctgcacccag 360 taaacccgaa accagaggct ttgcaggaca gtctcagtga actgctgggc tgttaaattt 420 ttctccttct gactccatca gtaaacatca cacaggactt agagtgtcaa ctgccactga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 4162 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 4162 gcctccctcg cgccatcaga gagtgtcttg gactgcttgc ctggcccagt acacctggct 60 ccccgctatc cccagacagc agactcacct 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Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 4177 gcctccctcg cgccatcaga gagtgtcgtc atagtcttgc ctggcccagt acacctggct 60 ccccgctatc cccagacagc agactcacct gaggagacgg tgaccagggt gccctggccc 120 cagtgctgga agtatgtcga cagagtgtcg tcatagttca cacagtaata cacagccatg 180 tcctcgggcc tcaggctgtt catttgctga tacaggaagt tcctggaatt gtctctggag 240 atgatgaatc ggcccttcac agagtctgca tagtgcgtcc tactgccatt ccaactaaca 300 cccgataccc actccagccc ctttcctgga gcctggcgga cccagttcat gtcactgtta 360 ctgaaggtga atccagaggc tgcacaggag agtctcaggg accccccagg ctctaccaag 420 cctcccccag actccaccag ctgcactgtt gtacccaggt agagtgtcgt catagtctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 4178 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 4178 gcctccctcg cgccatcaga gagtgtcgtg acttgcttgc ctggcccagt acacctggct 60 ccccgctatc cccagacagc agactcacct gaggagacgg tgaccagggt gccctggccc 120 cagtgctgga agtatgtcga cagagtgtcg tgacttgtca acagtaatac 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Synthetic polynucleotide" <400> 4181 gcctccctcg cgccatcaga gagtgtcatg gtcaacttgc ctggcccagt acacctggct 60 ccccgctatc cccagacagc agactcacct gaggagacgg tgaccagggt gccctggccc 120 cagtgctgga agtatgtcga cagagtgtca tggtcaatca catacagtaa cacacagctg 180 tgcccgctgc tctcagactg ttcattagca aatacagtga gttcttggca ttttctttgg 240 agatggtgaa tttgctcttc aaagattatg cataacatat ctgacttcca tcacactgta 300 tatctactac tcactccagc cccttccctg gagcctggga aaccgagttc cttcagtagc 360 tactgaaggt taatccagag tctgcacagg agagtctcag ggatccccca ggttgtcttg 420 ggtcctctcc ggactccacg agctgtacct ctcactagac agagtgtcat ggtcaactga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 4182 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 4182 gcctccctcg cgccatcaga gagtgtcgat ggcttcttgc ctggcccagt acacctggct 60 ccccgctatc cccagacagc agactcacct gaggagacgg tgaccagggt gccctggccc 120 cagtgctgga agtatgtcga cagagtgtcg atggctttca tgtatagcca tacacggcca 180 cgtcctcagc 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<400> 4185 gcctccctcg cgccatcaga gagtgtctcg tcgatcttgc ctggcccagt acacctggct 60 ccccgctatc cccagacagc agactcacct gaggagacgg tgaccagggt gccctggccc 120 cagtgctgga agtatgtcga cagagtgtct cgtcgattca acacagccga gtcctcatct 180 ctcagactgt tcatttgcaa gtacagcatg ttcttgccat tgtctctaga gatggtgaat 240 ctacccttca gtgtctgcat agtataggct accaccacta gcactaatgt atgagaccca 300 ttccagcccc tttcttgaag cccggtgggc ccagttcatg tcattgcttc tcaagatgaa 360 tccgcaggct gcacatgaga gtctcaggac acccccaacc ccaccacagc tgtaccaagt 420 ctcccccaga ctctaccagc tgcacctcat actgcacacc agagtgtctc gtcgatctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 4186 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 4186 gcctccctcg cgccatcaga gagtgtccag tctgtcttgc ctggcccagt acacctggct 60 ccccgctatc cccagacagc agactcacct gaggagacgg tgaccagggt gccctggccc 120 cagtgctgga agtatgtcga cagagtgtcc agtctgttca agtaatacat ggccgtgtcc 180 ttagctttca gactgtccat ttgcagatag 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<211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 4204 gcctccctcg cgccatcaga gagtgtcgat aaccacttgc ctggcccagt acacctggct 60 ccccgctatc cccagacagc agactcacct gaggagacgg tgaccagggt gccctggccc 120 cagtgctgga agtatgtcga cagagtgtcg ataaccatca ttagatggtc cctctcacac 180 aataatacat ggcggcgtcc gaggccttca ggctgctcca ctgcaggtag gcggtgctgc 240 tggagctgtc ggctgagatg gtgacgtggc cttggaagga tgggctgtat ctggtatcag 300 agttcccagg atagatgctc cccatccact ccagttcttt cccgggcatc tggcgcaccc 360 agtggatcca gtagctggta aagctgtatc cagaagtctt acaggagatc ctcagagact 420 ccccgggtct tttcacctct gctgcagact gcaacagctg agagtgtcga taaccactga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 4205 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 4205 gcctccctcg cgccatcaga gagtgtccta gtgaacttgc ctggcccagt acacctggct 60 ccccgctatc cccagacagc agactcacct 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/note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 4208 gcctccctcg cgccatcaga gagtgtccat tgagtcttgc ctggcccagt acacctggct 60 ccccgctatc cccagacagc agactcacct gaggagacgg tgaccagggt gccctggccc 120 cagtgctgga agtatgtcga cagagtgtcc attgagttca acacagtaat aaatggctgc 180 atcctcagtc tttaggcagc tagtctgcag atccgccgtg ctgacagagg tgtccatgga 240 gaagacaaac cgtgtgtgaa tctgtgggca tacattgggt tcaccagggt aggatgatcc 300 atcccatcca ctcaagcccc tgtcctgggg tctgtcgtat ccaattcata ccataggtga 360 tgacagttta accagacacc ttgcaggaga ccttcgccga ggccccaggc tgcttcacct 420 caggcccaga ctgcaccagc tgcactcggg agtgggcacc agagtgtcca ttgagtctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 4209 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 4209 gcctccctcg cgccatcagg ttccgaactt ggttatggcc tggtgcctgg acagagaaga 60 ctgggagggg gctgcagtgg gactcacctg aggagacagt gaccagggtg ccacggcccc 120 agagatcgaa gtaccgtcga cgttccgaac 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Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 4212 gcctccctcg cgccatcagg ttccgaaagt accgatggcc tggtgcctgg acagagaaga 60 ctgggagggg gctgcagtgg gactcacctg aggagacagt gaccagggtg ccacggcccc 120 agagatcgaa gtaccgtcga cgttccgaaa gtaccgatca acagtaatac acggccgtgt 180 cgtcagatct caggctcctc agctccatgt aggctgtgct cgtggatgtg tctgtggtca 240 tggtgactct gccctggagc ttctgtgcat agtttgtgtt accattgtaa gcgctgatcc 300 atcccatcca ctcaagccct tgtccagggg cctgtcgcac ccagctgata ccatagctgg 360 taaaggtgta accagaagcc ttgcaggaga ccttcactga ggccccaggc ttcttcacct 420 cagctccaga ctgcaccagc tgaacctggg agtgggcacc gttccgaaag taccgactga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 4213 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 4213 gcctccctcg cgccatcagg ttccgaaatc catggtggcc tggtgcctgg acagagaaga 60 ctgggagggg gctgcagtgg gactcacctg aggagacagt gaccagggtg ccacggcccc 120 agagatcgaa gtaccgtcga cgttccgaaa tccatggtca acagtaatac 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<220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 4247 gcctccctcg cgccatcagg ttccgaatgc agacatggcc tggtgcctgg acagagaaga 60 ctgggagggg gctgcagtgg gactcacctg aggagacagt gaccagggtg ccacggcccc 120 agagatcgaa gtaccgtcga cgttccgaat gcagacatca acagtaatac acagccgtgt 180 cctcagctct caggctgttc atttgaagat gcagcgtgtt cttggaattg tctctggaga 240 tggtgaatct gcccttcctg gagtctgcgt agtatgtgct accaccacta atggatgaga 300 cccactccag acccttccct ggagcctggc ggacccagct catctcattg ctactgacgg 360 tgaatccaga ggctgcacag gagagtctca gggacccccc aggctgtacc aagactcccc 420 gagactccac cagctgcacc tcacactgga cacctgcaaa gttccgaatg cagacactga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 4248 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 4248 gcctccctcg cgccatcagg ttccgaatca ctgagtggcc tggtgcctgg acagagaaga 60 ctgggagggg gctgcagtgg gactcacctg aggagacagt gaccagggtg ccacggcccc 120 agagatcgaa 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/note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 4251 gcctccctcg cgccatcagg ttccgaatcg catcatggcc tggtgcctgg acagagaaga 60 ctgggagggg gctgcagtgg gactcacctg aggagacagt gaccagggtg ccacggcccc 120 agagatcgaa gtaccgtcga cgttccgaat cgcatcatca acagtaatac acggccgtgt 180 ctgcggcagt cacagagctc agcttcaggg agaactggtt cttggacgtg tctactgata 240 tggtaactcg actcttgagg gacgggttgt agtaggtgct cccactgtaa tagatgtacc 300 caatccactc caggcccttc cctgggggct ggcggatcca actccagtag taatcaccac 360 tgctgatgga gccaccagag acagtgcagg tgagggacag ggtctgtgaa ggcttcacca 420 gtcctgggcc cgactcctgc agctgcacct gggacaggac gttccgaatc gcatcactga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 4252 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 4252 gcctccctcg cgccatcagg ttccgaacgc ttaattggcc tggtgcctgg acagagaaga 60 ctgggagggg gctgcagtgg gactcacctg aggagacagt gaccagggtg ccacggcccc 120 agagatcgaa gtaccgtcga cgttccgaac 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gcctggcaaa cccagtgaat ctcatagata 360 ctgaaggtga accaagaggc tgcacaggag agcctcaggg gcccctctca gtgtaccaag 420 tctcccccag actctgtaag ctgggcctca ccctggatac gttccgaacc atggatctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 4289 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 4289 gcctccctcg cgccatcagg ttccgaaacg aagattggcc tggtgcctgg acagagaaga 60 ctgggagggg gctgcagtgg gactcacctg aggagacagt gaccagggtg ccacggcccc 120 agagatcgaa gtaccgtcga cgttccgaaa cgaagattca cagtaataca ctgcctaccc 180 ctgtgagagc cccctcagct tccaagtaga ttattttaag ggagactgtg ctggtaattg 240 gtgtccctgg gaattgtgaa tcttcattat gctgatgcag aatatcactg agaacttcca 300 cttgaatcaa tcactgttac cacccactcc agcctctgtc ccccagccat ctgggctcaa 360 tttatgctgt agtcagtgaa ggtgaatctt gatgctttgc aaaagaggct aagagaacag 420 ccaggctgtt ttgccaaaga taaaaatata gatccagtaa gttccgaaac gaagatctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 4290 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 4290 gcctccctcg cgccatcagg ttccgaaact gtggatggcc tggtgcctgg acagagaaga 60 ctgggagggg gctgcagtgg gactcacctg aggagacagt gaccagggtg ccacggcccc 120 agagatcgaa gtaccgtcga cgttccgaaa ctgtggatca acagtattac acaaccttgt 180 ccttggcttt caggttagtc attgtaaggt agagtgcacg tgaaagggtg tcgctggacc 240 agttaattta tttgtactca tgaagagtaa acctgagcac tcccacttgt tgactcactg 300 ttgccagcca ccacaatccc tgttgtgaag cctgctggac caacctcagg ctgttgccag 360 aaaaggtgaa tccagacgct ttgcaagaaa gtctcagtga accactgggc tgtactacgt 420 ttacccctct gactccacca ctgaacttca tacaggactt gttccgaaac tgtggactga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 4291 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 4291 gcctccctcg cgccatcagg ttccgaaggt gtcattggcc tggtgcctgg acagagaaga 60 ctgggagggg gctgcagtgg gactcacctg aggagacagt gaccagggtg ccacggcccc 120 agagatcgaa gtaccgtcga cgttccgaag gtgtcattca agtaatacat ggccttctcc 180 tcggctctca ggttggtcat tttgagggag actgtgctga caagggtgtc cctgaggatt 240 atgatttttc tttgtattga tggagggtac cactaacaaa ttccacttga atccctcgct 300 tttgcctccc acaccaaccc ctgtcctgaa gcctgctggg ctgagctcat gctagagtca 360 atgaaggtaa attcagaggc tttgtaaaaa aggctctgag aacagttagg ctgtatcatt 420 tctcttccag attccaccag tgaacttctt gtaggactct gttccgaagg tgtcatctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 4292 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 4292 gcctccctcg cgccatcagg ttccgaatcg tgaagtggcc tggtgcctgg acagagaaga 60 ctgggagggg gctgcagtgg gactcacctg aggagacagt gaccagggtg ccacggcccc 120 agagatcgaa gtaccgtcga cgttccgaat cgtgaagtca cagtaataca aggtcttgtc 180 cttggctttc acattggtca ttttaaggta gactgcactt gaaagggtgt tgcttgggac 240 tgttaattta cttgtactca tggagagtaa ccctgataac tcactgttgc cacccacaca 300 aatccctgtc atgaagcctg ctggaccaag ctcatgctgt agccagtaca 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/note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 4294 gcctccctcg cgccatcagg ttccgaaggt caacttggcc tggtgcctgg acagagaaga 60 ctgggagggg gctgcagtgg gactcacctg aggagacagt gaccagggtg ccacggcccc 120 agagatcgaa gtaccgtcga cgttccgaag gtcaacttca gcacagtagt acacatctat 180 gtcctcagat ctctgactgc tcagctccat gtaggctgtg ctcgtggacg tgtccctggt 240 catggtgact ctgccctgaa acttctgtgc atagcctgtg ttaccattgc cagagtagct 300 ccctaccatc cattcaaacc cttatccagg ggcctgtcac acacagtgaa tgtcgtagct 360 ggcgaaggtg tatccagagc tttgcaggag accttcactg aggccatgga cgctggcaac 420 aggagagtca tcagaagctg ggtgagtcat ataatcagga gttccgaagg tcaactctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 4295 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 4295 gcctccctcg cgccatcagg ttccgaatac gtacgtggcc tggtgcctgg acagagaaga 60 ctgggagggg gctgcagtgg gactcacctg aggagacagt gaccagggtg ccacggcccc 120 agagatcgaa gtaccgtcga cgttccgaat 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gtgtatccac aagtcttgca ggagactttc actgatgccc cagccttctt 420 catctcatcc ccagactgca ccagctgcac ctgggactgg gttccgaaat gacaccctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 4297 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 4297 gcctccctcg cgccatcagg ttccgaactt cacgatggcc tggtgcctgg acagagaaga 60 ctgggagggg gctgcagtgg gactcacctg aggagacagt gaccagggtg ccacggcccc 120 agagatcgaa gtaccgtcga cgttccgaac ttcacgatca cccagtaata cacagccgag 180 tcctcagatc tcaggctgct cagctctatg taggctgtcc tcagggacat gtccctggta 240 atggtgactc tgccctggaa cttctttgca tagttggtgt taccattgta aagtgtgatc 300 catctcatcc tttcaagccc ttgtccaggg gcctgttgca accagtgcaa ggagcagcaa 360 gtgaaggtgt atccggaagc cttgcaggag accttcactg aggccccagg cttctttacc 420 tcagcctcag actgccccag ctgcacctgg gagcagacac gttccgaact tcacgactga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 4298 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of 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agtctcaggg acacccaggc tttgtcaagt 420 ttgctccaga ctctaccagc tgcatctcac actggacacc gttccgaaag gtctcactga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 4301 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 4301 gcctccctcg cgccatcagg ttccgaagtc atagttggcc tggtgcctgg acagagaaga 60 ctgggagggg gctgcagtgg gactcacctg aggagacagt gaccagggtg ccacggcccc 120 agagatcgaa gtaccgtcga cgttccgaag tcatagttca cacagtaata cacagccatg 180 tcctcgggcc tcaggctgtt catttgctga tacaggaagt tcctggaatt gtctctggag 240 atgatgaatc ggcccttcac agagtctgca tagtgcgtcc tactgccatt ccaactaaca 300 cccgataccc actccagccc ctttcctgga gcctggcgga cccagttcat gtcactgtta 360 ctgaaggtga atccagaggc tgcacaggag agtctcaggg accccccagg ctctaccaag 420 cctcccccag actccaccag ctgcactgtt gtacccaggt gttccgaagt catagtctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 4302 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: 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Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 4333 gcctccctcg cgccatcagc gttacttctt ggttaccagg acagaggacg ctgggcccag 60 agaaaggagg cagaaggaaa gccatcttac ctgaagagac ggtgaccatt gtcccttggc 120 cccagatatc aaaaggtcga ccgttacttc ttggttatca acagtaatac acggccgtgt 180 cgtcagatct cagcctgctc agctccatgt aggctgtgct gatggacgtg tccctggtca 240 tggtgaccct gccctgaaac ttctgtgcat agtttgtgcc accactgtta gggttgatcc 300 atcccatcca ctcaagccct tgtccagggg cctgtcgcac ccagtgcata tagtagccgg 360 tgaaggtgta tccagaagcc ttgcaggaga ccttcactga ggccccaggc ttcttcacct 420 cagccccaga ctgcaccagc tgcacctggg agtgggctcc cgttacttct tggttactga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 4334 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 4334 gcctccctcg cgccatcagc gttacttacc tcttgccagg acagaggacg ctgggcccag 60 agaaaggagg cagaaggaaa gccatcttac ctgaagagac ggtgaccatt gtcccttggc 120 cccagatatc aaaaggtcga ccgttactta cctcttgtca acagtaatac acagccatgt 180 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gcctccctcg cgccatcagc gttacttagc tagtgccagg acagaggacg ctgggcccag 60 agaaaggagg cagaaggaaa gccatcttac ctgaagagac ggtgaccatt gtcccttggc 120 cccagatatc aaaaggtcga ccgttactta gctagtgtca acagtaatac acggccgtgt 180 cctcagatct caggctgctc agctccatgt aggctgtgct cgtggatttg tccgcggtaa 240 tcgtgactct gccctggaac ttctgtgcgt agtttgctgt accaaagata gggatgatcc 300 ctcccatcca ctcaagccct tgtccagggg cctgtcgcac ccagctgata gcatagctgc 360 tgaaggtgcc tccagaagcc ttgcaggaga ccttcaccga ggacccaggc ttcttcacct 420 cagccccaga ctgcaccagc tgcacctggg actggacacc cgttacttag ctagtgctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 4342 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 4342 gcctccctcg cgccatcagc gttactttaa ccaagccagg acagaggacg ctgggcccag 60 agaaaggagg cagaaggaaa gccatcttac ctgaagagac ggtgaccatt gtcccttggc 120 cccagatatc aaaaggtcga ccgttacttt aaccaagtca atagtaatac acagccatgt 180 cctcagatgt caggctgctc aggtctgtgt aggctgtggt 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Synthetic polynucleotide" <400> 4376 gcctccctcg cgccatcagc gttacttcgc ttaatccagg acagaggacg ctgggcccag 60 agaaaggagg cagaaggaaa gccatcttac ctgaagagac ggtgaccatt gtcccttggc 120 cccagatatc aaaaggtcga ccgttacttc gcttaattca acagtaatac acggccgtgt 180 ccgcggcagt cacagagctc agcttcaggg agaactggtt cttagacgtg tctactgata 240 tggtaactcg actcttgagg gacgggttgt agtaggtgct cccactgtaa tagatgtacc 300 caatccactc caggcccttc cctgggtgct ggcggatcca gctccagtag taaccaccac 360 tgctgatgga gccaccagag acagtacagg tgagggacag ggtctgtgaa ggcttcacca 420 gtcctgggcc cgactcctgc agctgcacct ggggcaggac cgttacttcg cttaatctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 4377 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 4377 gcctccctcg cgccatcagc gttactttgg ttatcccagg acagaggacg ctgggcccag 60 agaaaggagg cagaaggaaa gccatcttac ctgaagagac ggtgaccatt gtcccttggc 120 cccagatatc aaaaggtcga ccgttacttt ggttatctca acagtaatac acagccgtgt 180 ccgcggcggt 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<400> 4380 gcctccctcg cgccatcagc gttacttacg tactcccagg acagaggacg ctgggcccag 60 agaaaggagg cagaaggaaa gccatcttac ctgaagagac ggtgaccatt gtcccttggc 120 cccagatatc aaaaggtcga ccgttactta cgtactctca acagtaatac acggccgtgt 180 ccgcagcggt cacagagctc agcttcaggg agaactggtt cttggacgtg tctactgata 240 tggtgactcg actcttgagg gaggggttgt agttggtgct cccactgtaa tagatatacc 300 caatccactc cagtcccttc cctgggggct gccggatcca gctccagtag taaccaccac 360 tgctgacgga gccaccagag acagtgcagg tgagggacag ggtctccgaa ggcttcacca 420 gtcctgggcc cgactcctgc agctgcacct gggacaggac cgttacttac gtactcctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 4381 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 4381 gcctccctcg cgccatcagc gttactttga tgcgaccagg acagaggacg ctgggcccag 60 agaaaggagg cagaaggaaa gccatcttac ctgaagagac ggtgaccatt gtcccttggc 120 cccagatatc aaaaggtcga ccgttacttt gatgcgatca acagtaatac acggccgtgt 180 ctgcggcggt cacagagctc agcttcaggg 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/note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 4411 gcctccctcg cgccatcagc gttactttcg gtactccagg acagaggacg ctgggcccag 60 agaaaggagg cagaaggaaa gccatcttac ctgaagagac ggtgaccatt gtcccttggc 120 cccagatatc aaaaggtcga ccgttacttt cggtacttca cagtaataaa cggaattttc 180 ctgagctctc aggttaatca tcttaagaga gaatcatctg aaaagcgtgt ctctgaggac 240 tgttaatctt ctttgtactc aaggagagtc ccactgagaa cttccacttg aattactgat 300 gttatcacct acacccaccc ctgtcatgaa gcctgctgga ccaagcttat gctgttttca 360 gtgaaagtga atccacaggg tttccagaaa agtctgagaa ttcttggtct gtagtatttc 420 tctgagagac tccagtaatt aacttcacag gggacctctg cgttactttc ggtactctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 4412 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 4412 gcctccctcg cgccatcagc gttacttcca tggatccagg acagaggacg ctgggcccag 60 agaaaggagg cagaaggaaa gccatcttac ctgaagagac ggtgaccatt gtcccttggc 120 cccagatatc aaaaggtcga ccgttacttc 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Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 4415 gcctccctcg cgccatcagc gttacttggt gtcatccagg acagaggacg ctgggcccag 60 agaaaggagg cagaaggaaa gccatcttac ctgaagagac ggtgaccatt gtcccttggc 120 cccagatatc aaaaggtcga ccgttacttg gtgtcattca agtaatacat ggccttctcc 180 tcggctctca ggttggtcat tttgagggag actgtgctga caagggtgtc cctgaggatt 240 atgatttttc tttgtattga tggagggtac cactaacaaa ttccacttga atccctcgct 300 tttgcctccc acaccaaccc ctgtcctgaa gcctgctggg ctgagctcat gctagagtca 360 atgaaggtaa attcagaggc tttgtaaaaa aggctctgag aacagttagg ctgtatcatt 420 tctcttccag attccaccag tgaacttctt gtaggactct cgttacttgg tgtcatctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 4416 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 4416 gcctccctcg cgccatcagc gttactttcg tgaagccagg acagaggacg ctgggcccag 60 agaaaggagg cagaaggaaa gccatcttac ctgaagagac ggtgaccatt gtcccttggc 120 cccagatatc aaaaggtcga ccgttacttt cgtgaagtca cagtaataca 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Synthetic polynucleotide" <400> 4419 gcctccctcg cgccatcagc gttactttac gtacgccagg acagaggacg ctgggcccag 60 agaaaggagg cagaaggaaa gccatcttac ctgaagagac ggtgaccatt gtcccttggc 120 cccagatatc aaaaggtcga ccgttacttt acgtacgtca acaggaatac acgaccatgt 180 cttcagatct caggctgctc agctccatgt aggctgtgct cacggacctg tcactggtaa 240 tggtgactct gccccggaac ttctgtgcgt agtgtgtgtt atcattgtaa gggttgatgc 300 atcccaacca ctatgccctt gtccagggcc ctgtcgcacc cactgtgtaa agtatttggt 360 gaaggtgtat ctggaagcct ggccaggaga ccttcactga ggacgcaggc ttcttcacct 420 cagccccagg ctgcaacagc tgaacctggg aatggacatc cgttacttta cgtacgctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 4420 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 4420 gcctccctcg cgccatcagc gttacttatg acaccccagg acagaggacg ctgggcccag 60 agaaaggagg cagaaggaaa gccatcttac ctgaagagac ggtgaccatt gtcccttggc 120 cccagatatc aaaaggtcga ccgttactta tgacacctca cacagtaata catggccgtg 180 tcttcagatc 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<400> 4423 gcctccctcg cgccatcagc gttacttagt tatgcccagg acagaggacg ctgggcccag 60 agaaaggagg cagaaggaaa gccatcttac ctgaagagac ggtgaccatt gtcccttggc 120 cccagatatc aaaaggtcga ccgttactta gttatgctca tgcacagtaa tgtgtggctg 180 tgtccacaat gtccatgttg atcactgtta gaaccacttc attcttggag gtgtccttgg 240 agataatgag cctactcttc agagatgggc tgtagtattt attatcattc taataaatgt 300 gtgcaagcca ctccagggcc tttgctgagg gctgacagat ctaacccaca cccattccag 360 aagtgctgag tgagaaccca gagaaggtgc aggtcagcat gagggtctgt gtgggtttca 420 ccagtgcagg accagactcc ttcaaggtga cctgggataa cgttacttag ttatgcctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 4424 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 4424 gcctccctcg cgccatcagc gttacttagg tctcaccagg acagaggacg ctgggcccag 60 agaaaggagg cagaaggaaa gccatcttac ctgaagagac ggtgaccatt gtcccttggc 120 cccagatatc aaaaggtcga ccgttactta ggtctcatca cagagtcata tgcagctgca 180 tcctctgccc tcagtctgtt catttgcaga 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/note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 4485 gcctccctcg cgccatcagt aggagaccct tatagcagaa atgcagcaaa acccttcaga 60 gttaaagcag gagagaggtt gtgaggactc acctgaggag acggtgacca gggttccctg 120 gccccagtag tcaaagtcga ctaggagacc cttatagtca tgcacagtaa tacaaggcgg 180 tgtcctcagt tctcagactg ttcatttgca gatacaggga gtttttgctg ttgtctctgg 240 agatggtgaa tcggcccttc acagagtctg catagtatgt gctaccacca tcccaactaa 300 taagagagac ccactccaga cccttccccg gagcttgacg gacccagtgc atggtataat 360 catcaaaggt gaatccagag gctgcacagg agagtctcag ggacccccca ggctgtacca 420 cgactccccc agactccacc agctgcactt cacactggac taggagaccc ttatagctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 4486 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 4486 gcctccctcg cgccatcagt aggagactac gcgttcagaa atgcagcaaa acccttcaga 60 gttaaagcag gagagaggtt gtgaggactc acctgaggag acggtgacca gggttccctg 120 gccccagtag tcaaagtcga ctaggagact 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<220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 4524 gcctccctcg cgccatcagt aggagacgta cagtgcagaa atgcagcaaa acccttcaga 60 gttaaagcag gagagaggtt gtgaggactc acctgaggag acggtgacca gggttccctg 120 gccccagtag tcaaagtcga ctaggagacg tacagtgtca taaaaataca tggctgtgtg 180 cttgtgactc acttagctcg gctgtaggaa gaactgcttt ttggacatgg atctggagat 240 ggtgactgga ctcttgagga gtgggttgga atgtgcactc cctcatgacc tgtgcactgg 300 attcactcca gtcccttcct ggggggttta tgaatgcagc tacagcagga agcactggtt 360 gtgatgggga atccagagac agcacaggtg agggagaggg tctgtgaggg cttcaccagg 420 ccaagtgggc actgagaaac acagttgttg gcatgcacag taggagacgt acagtgctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 4525 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 4525 gcctccctcg cgccatcagt aggagacgga tcatccagaa atgcagcaaa acccttcaga 60 gttaaagcag gagagaggtt gtgaggactc acctgaggag acggtgacca gggttccctg 120 gccccagtag 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/note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 4528 gcctccctcg cgccatcagt aggagacaca cacgtcagaa atgcagcaaa acccttcaga 60 gttaaagcag gagagaggtt gtgaggactc acctgaggag acggtgacca gggttccctg 120 gccccagtag tcaaagtcga ctaggagaca cacacgttca gcttaaaaat acatggctat 180 gtgcttgttg ctcatgtagc tcagctgtag gaagaactgc ttttttggac acggatctgg 240 ggatggtgac tggacacttg aggagtgggt ggtaatgtgt gctcccttca tgacctatgc 300 acccaatcca ctccattccc ttccctgggg ggctgatgga tccagcttca gcaggaagac 360 ctcgttatca cggggaacac agacacagcg caggtaaggg agagggtctg tgagggcttc 420 accaggccaa gagtgcgctg agaaacacag ttgttggcat taggagacac acacgtctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 4529 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 4529 gcctccctcg cgccatcagt aggagactag acggacagaa atgcagcaaa acccttcaga 60 gttaaagcag gagagaggtt gtgaggactc acctgaggag acggtgacca gggttccctg 120 gccccagtag tcaaagtcga ctaggagact 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Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 4532 gcctccctcg cgccatcagt aggagactgc tacaccagaa atgcagcaaa acccttcaga 60 gttaaagcag gagagaggtt gtgaggactc acctgaggag acggtgacca gggttccctg 120 gccccagtag tcaaagtcga ctaggagact gctacactca agtattacaa ggccttgtcc 180 ttgactttca gtttggtccc tttaaggtag actgcacatg aaaaggtgtc gcttgggact 240 gttaatttat ttgtactcat ggagagtaac tctgagaact cccacttgat cactcactgt 300 ttccacccac accaatccct gtcatgaagc ctgctggacc aagctcatgc tgtagccagt 360 aaaggtgaaa tcagaggctt tgcatgagag tctcagtgaa ccactgggct gtacaatttt 420 cccccctgac tctatcagta aatttcacac aggacttctg taggagactg ctacacctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 4533 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 4533 gcctccctcg cgccatcagt aggagacaac tgccacagaa atgcagcaaa acccttcaga 60 gttaaagcag gagagaggtt gtgaggactc acctgaggag acggtgacca gggttccctg 120 gccccagtag tcaaagtcga ctaggagaca actgccatca ctgtaatata 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Synthetic polynucleotide" <400> 4536 gcctccctcg cgccatcagt aggagaccca tggatcagaa atgcagcaaa acccttcaga 60 gttaaagcag gagagaggtt gtgaggactc acctgaggag acggtgacca gggttccctg 120 gccccagtag tcaaagtcga ctaggagacc catggattca cacagttaaa tgctgccatg 180 ttctgggttc tcaggctgtt catttgcatg tacagcatgt acttggtgtt gtctctggaa 240 gtggtgagtc tgcccctaac atagtctgca ttgtattgat gactttcact acgccatata 300 actgcaaccc attccagccc cttccctgag gcctggcaaa cccagtgaat ctcatagata 360 ctgaaggtga accaagaggc tgcacaggag agcctcaggg gcccctctca gtgtaccaag 420 tctcccccag actctgtaag ctgggcctca ccctggatac taggagaccc atggatctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 4537 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 4537 gcctccctcg cgccatcagt aggagacacg aagatcagaa atgcagcaaa acccttcaga 60 gttaaagcag gagagaggtt gtgaggactc acctgaggag acggtgacca gggttccctg 120 gccccagtag tcaaagtcga ctaggagaca cgaagattca cagtaataca ctgcctaccc 180 ctgtgagagc cccctcagct tccaagtaga ttattttaag ggagactgtg ctggtaattg 240 gtgtccctgg gaattgtgaa tcttcattat gctgatgcag aatatcactg agaacttcca 300 cttgaatcaa tcactgttac cacccactcc agcctctgtc ccccagccat ctgggctcaa 360 tttatgctgt agtcagtgaa ggtgaatctt gatgctttgc aaaagaggct aagagaacag 420 ccaggctgtt ttgccaaaga taaaaatata gatccagtaa taggagacac gaagatctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 4538 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 4538 gcctccctcg cgccatcagt aggagacact gtggacagaa atgcagcaaa acccttcaga 60 gttaaagcag gagagaggtt gtgaggactc acctgaggag acggtgacca gggttccctg 120 gccccagtag tcaaagtcga ctaggagaca ctgtggatca acagtattac acaaccttgt 180 ccttggcttt caggttagtc attgtaaggt agagtgcacg tgaaagggtg tcgctggacc 240 agttaattta tttgtactca tgaagagtaa acctgagcac tcccacttgt tgactcactg 300 ttgccagcca ccacaatccc tgttgtgaag cctgctggac caacctcagg ctgttgccag 360 aaaaggtgaa tccagacgct ttgcaagaaa gtctcagtga accactgggc 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gagagaggtt gtgaggactc acctgaggag acggtgacca gggttccctg 120 gccccagtag tcaaagtcga ctaggagacc atatgcttca agtaatacac agacctatcc 180 tcggctctga cgctgttcat ttgcagatac agtgatttct tggcatcatc tctggagagg 240 gtgaatcgac ccttcacaga gtctgcatag cttgtgctac ctacacaaca actcataaat 300 gagacctact ccagcccttt cccaggagcc tgatggaccc agctcatcca gtacctaata 360 aaggtactaa aggtgaatcc agaggctgca aaagaaagtc tcagggaccc ccaggctata 420 acaagcctcc caaagactcc accagctgca cctcacactg taggagacca tatgctctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 4557 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 4557 gcctccctcg cgccatcagt aggagactcg tcgatcagaa atgcagcaaa acccttcaga 60 gttaaagcag gagagaggtt gtgaggactc acctgaggag acggtgacca gggttccctg 120 gccccagtag tcaaagtcga ctaggagact cgtcgattca acacagccga gtcctcatct 180 ctcagactgt tcatttgcaa gtacagcatg ttcttgccat tgtctctaga gatggtgaat 240 ctacccttca gtgtctgcat agtataggct accaccacta gcactaatgt 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<220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 4567 gcctccctcg cgccatcagt aggagaccga attgccagaa atgcagcaaa acccttcaga 60 gttaaagcag gagagaggtt gtgaggactc acctgaggag acggtgacca gggttccctg 120 gccccagtag tcaaagtcga ctaggagacc gaattgctca tgtacagcca tgcatggtca 180 tgtcctcagc tctcagactg ttcgtttgga gatacggtga gttcttagca ttgtctttgg 240 agatggtgaa tctgcccttc acagagtctg catggtatat ctgacttcca tcatatttta 300 catctattac tccctccagc cccttcccta gagtctcatt gacccagctc attcagtagc 360 tactgaaggt gaatccagag gctacacagg agagtctcag gaacttccca agttgtctca 420 ggccctctat ggactctatc agctccacct cacactgaac taggagaccg aattgcctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 4568 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 4568 gcctccctcg cgccatcagt aggagacttc gctcacagaa atgcagcaaa acccttcaga 60 gttaaagcag gagagaggtt gtgaggactc acctgaggag acggtgacca gggttccctg 120 gccccagtag 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/note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 4571 gcctccctcg cgccatcagt aggagacttc cggtacagaa atgcagcaaa acccttcaga 60 gttaaagcag gagagaggtt gtgaggactc acctgaggag acggtgacca gggttccctg 120 gccccagtag tcaaagtcga ctaggagact tccggtatca cagtaataga cggccatggt 180 gtcagcaatg aaactgttta tttgcagata cagtgagttc ttggtgtttt ctctggagat 240 ggtcaaccgg cccttcacag agtctgagta gtatatgcct ccaccactag cattaatgta 300 agacccactc cagtcccttc cctggagctt ggtccaccta gtgcatgcca tagttactga 360 aagtgtatcc agaggctgca caggagagtc acatggaccc cccaagctgt accaagcctc 420 ccccagactc taccagctac acttcacatt ggacacctgc taggagactt ccggtactga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 4572 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 4572 gcctccctcg cgccatcagt aggagacgca attcgcagaa atgcagcaaa acccttcaga 60 gttaaagcag gagagaggtt gtgaggactc acctgaggag acggtgacca gggttccctg 120 gccccagtag tcaaagtcga ctaggagacg 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Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 4575 gcctccctcg cgccatcagt aggagactgg cgtatcagaa atgcagcaaa acccttcaga 60 gttaaagcag gagagaggtt gtgaggactc acctgaggag acggtgacca gggttccctg 120 gccccagtag tcaaagtcga ctaggagact ggcgtattca ctgcgcccgc cccctccgcc 180 tccctgcggt cacagagctc agcttcaggg aaaactggtt cttggacgtt tctattgaca 240 tggtgactca actcctgagg gacggggtgt agtagctcct cccactataa tagatgtatc 300 caatccattc cagccccttc cctggggact ggcggaccag ctccaccagt taccactgct 360 gatggagtca ccagagacag cgcatgtgag ggacagggtc tccgaagctt caccagtcct 420 gggccccact cctgcagctg cactgggaca ggacccctgt taggagactg gcgtatctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 4576 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 4576 gcctccctcg cgccatcagt aggagacgat aaccacagaa atgcagcaaa acccttcaga 60 gttaaagcag gagagaggtt gtgaggactc acctgaggag acggtgacca gggttccctg 120 gccccagtag tcaaagtcga ctaggagacg ataaccatca ttagatggtc 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<211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 4633 gcctccctcg cgccatcagg acactcttga ccttgctggc aagctgagtc tccctaagtg 60 gactcagaga gggggtggtg aggactcacc tgaggagacg gtgaccaggg ttccctggcc 120 ccaggggtcg aaccagtcga cgacactctt gaccttgtca acagtaatac acggcagtgt 180 cctcagcctt taggctgcag atctgcagat atgccgtgct gacagaggtg tccaaggaga 240 agacaaaccg tcctgtgaag ccctgggcat acgttgggtt cccagtgttg gtgttgatcc 300 atcccatcca ctcaagccct tgtccagggg cctgtcgcac ccaattcata gcatagctag 360 tgaaggtgta tccagaagcc ttgcaggaaa ccttcactga ggccccaggc ttcttcaact 420 cagacccaga ttgcaccagc tgcacctggg agtgggcacc gacactcttg accttgctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 4634 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 4634 gcctccctcg cgccatcagg acactctcaa ggtcactggc aagctgagtc tccctaagtg 60 gactcagaga gggggtggtg aggactcacc 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cgccatcagg acactctacg aagatctggc aagctgagtc tccctaagtg 60 gactcagaga gggggtggtg aggactcacc tgaggagacg gtgaccaggg ttccctggcc 120 ccaggggtcg aaccagtcga cgacactcta cgaagattca cagtaataca ctgcctaccc 180 ctgtgagagc cccctcagct tccaagtaga ttattttaag ggagactgtg ctggtaattg 240 gtgtccctgg gaattgtgaa tcttcattat gctgatgcag aatatcactg agaacttcca 300 cttgaatcaa tcactgttac cacccactcc agcctctgtc ccccagccat ctgggctcaa 360 tttatgctgt agtcagtgaa ggtgaatctt gatgctttgc aaaagaggct aagagaacag 420 ccaggctgtt ttgccaaaga taaaaatata gatccagtaa gacactctac gaagatctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 4662 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 4662 gcctccctcg cgccatcagg acactctact gtggactggc aagctgagtc tccctaagtg 60 gactcagaga gggggtggtg aggactcacc tgaggagacg gtgaccaggg ttccctggcc 120 ccaggggtcg aaccagtcga cgacactcta ctgtggatca acagtattac acaaccttgt 180 ccttggcttt caggttagtc attgtaaggt agagtgcacg tgaaagggtg 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<211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 4676 gcctccctcg cgccatcagg acactctact atgacctggc aagctgagtc tccctaagtg 60 gactcagaga gggggtggtg aggactcacc tgaggagacg gtgaccaggg ttccctggcc 120 ccaggggtcg aaccagtcga cgacactcta ctatgactca tgtacagcca tacacagcca 180 tgtcctcagt tctctgactg ttcatttgca gatacagaga gttcttagca ttgtctttgg 240 agatggagaa tctgcccttc acagagtctg catggtgtat ctgacttcca tcatctttta 300 tatctattac tcactccagc cccttgcctg cagactggtg aactgggctc attcagaagc 360 tactgaaggc gaatctagag gctacacagg agagtctcag gaacttccca ggttgtctca 420 ggtcctctgt gggctctatc agctccacct cacactgaac gacactctac tatgacctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 4677 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 4677 gcctccctcg cgccatcagg acactctatg gtcaactggc aagctgagtc tccctaagtg 60 gactcagaga gggggtggtg aggactcacc 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caggagctac 360 tgaaggtgaa tccagaggct gcacaggaga gtctcaggga ccctccaggc tgtaccaagc 420 ctcacccaga ctccaccagc tgcacctcac actggacacc gacactcttt aacgtcctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 4687 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 4687 gcctccctcg cgccatcagg acactctagc aacctctggc aagctgagtc tccctaagtg 60 gactcagaga gggggtggtg aggactcacc tgaggagacg gtgaccaggg ttccctggcc 120 ccaggggtcg aaccagtcga cgacactcta gcaaccttca catacagtaa tacacggccg 180 tgccctctgc tctcagactg ttcatttgca aacagagtga gttcttggca ttttctttgg 240 agatggtgaa tctgctcttc acagattgtg cataacatag ctgacttcta tcctactata 300 tatctactac tcactccagc cccttccctg gagcctggga atctgagctc attcagtagc 360 tactgaaggt taatccagag tctgcacagg agagtctcag ggatccccca agttgtcttt 420 ggttttcttc agactccacc agctgtacct cacactggac gacactctag caacctctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 4688 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> 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/note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 4719 gcctccctcg cgccatcagt tcggaacgtc cattcggcag tagcagaaaa caaaggccct 60 agagtggcca ttcttacctg aggagacggt gaccgtggtc cctttgcccc agacgtccat 120 gtagtagtag tagtagtcga cttcggaacg tccattctca acagtaatac acagccgtgt 180 cctcggctct caggctgttc atttgcagat acagtgagtt cttggcgttg tctctggaga 240 tggtgaatcg gcccttcaca gagtccacat agtatttctc acttccatct tgctttatgt 300 tggccaccca ctccagcccc ttccctggag cctggcggac ccagctcatc caatagctac 360 taaaggtgaa tccagaggct gcacaggaga gtctcaggga ccccccaggc tggaccaagc 420 ctcccccaga ctccaccagc tgcacctcac actggacacc ttcggaacgt ccattcctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 4720 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 4720 gcctccctcg cgccatcagt tcggaacgca taactggcag tagcagaaaa caaaggccct 60 agagtggcca ttcttacctg aggagacggt gaccgtggtc cctttgcccc agacgtccat 120 gtagtagtag tagtagtcga cttcggaacg 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Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 4723 gcctccctcg cgccatcagt tcggaactga gacctggcag tagcagaaaa caaaggccct 60 agagtggcca ttcttacctg aggagacggt gaccgtggtc cctttgcccc agacgtccat 120 gtagtagtag tagtagtcga cttcggaact gagaccttca acagtaatac acggctgtgt 180 cctcggtttt caggctgttc atttgcagat acagcgtgtt ttttgaatca tctcttgaga 240 tggtgaatct gcctttcacg ggtgcagcgt agtctgttgt cccaccatca gttttgcttt 300 taatacggcc aacccactcc agccccttcc ctggagcctg gcggacccag ctcatccagg 360 cgttactgaa agtgaatcca gaggctgcac aggagagtct aagggacccc ccaggcttta 420 ccaagcctcc cccagactcc accagctgca cctcacactg ttcggaactg agacctctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 4724 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 4724 gcctccctcg cgccatcagt tcggaacgaa tggacggcag tagcagaaaa caaaggccct 60 agagtggcca ttcttacctg aggagacggt gaccgtggtc cctttgcccc agacgtccat 120 gtagtagtag tagtagtcga cttcggaacg aatggactca acagtaatac 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/note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 4762 gcctccctcg cgccatcagt tcggaactca agcctggcag tagcagaaaa caaaggccct 60 agagtggcca ttcttacctg aggagacggt gaccgtggtc cctttgcccc agacgtccat 120 gtagtagtag tagtagtcga cttcggaact caagccttca cagtaatact cagccgtgtc 180 ctaggtggtc atggagctga gcttcacaga gaactggctc ttggttgagt cactgttgat 240 ggggacatgg acctgggtgg agggtgcatg atgtgtattc cttgatgatc cagtctagta 300 actgtgcccc agccattcca gcctgttgcc cacgggatgg tggattcatc tcaaataata 360 tccatggtaa aaaaaagaat ccagacacag cacaggcaga gggcagtgtc tgagggcctc 420 atgggtcctg gacctgactc ctgcagctgc acctgggaca ttcggaactc aagcctctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 4763 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 4763 gcctccctcg cgccatcagt tcggaacacg tgtgtggcag tagcagaaaa caaaggccct 60 agagtggcca ttcttacctg aggagacggt gaccgtggtc cctttgcccc agacgtccat 120 gtagtagtag tagtagtcga cttcggaaca 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/note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 4805 gcctccctcg cgccatcagt tcggaactcg tcgatggcag tagcagaaaa caaaggccct 60 agagtggcca ttcttacctg aggagacggt gaccgtggtc cctttgcccc agacgtccat 120 gtagtagtag tagtagtcga cttcggaact cgtcgattca acacagccga gtcctcatct 180 ctcagactgt tcatttgcaa gtacagcatg ttcttgccat tgtctctaga gatggtgaat 240 ctacccttca gtgtctgcat agtataggct accaccacta gcactaatgt atgagaccca 300 ttccagcccc tttcttgaag cccggtgggc ccagttcatg tcattgcttc tcaagatgaa 360 tccgcaggct gcacatgaga gtctcaggac acccccaacc ccaccacagc tgtaccaagt 420 ctcccccaga ctctaccagc tgcacctcat actgcacacc ttcggaactc gtcgatctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 4806 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 4806 gcctccctcg cgccatcagt tcggaaccag tctgtggcag tagcagaaaa caaaggccct 60 agagtggcca ttcttacctg aggagacggt gaccgtggtc cctttgcccc agacgtccat 120 gtagtagtag tagtagtcga cttcggaacc 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Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 4809 gcctccctcg cgccatcagt tcggaaccga actacggcag tagcagaaaa caaaggccct 60 agagtggcca ttcttacctg aggagacggt gaccgtggtc cctttgcccc agacgtccat 120 gtagtagtag tagtagtcga cttcggaacc gaactactca tgactcaata atacagagcc 180 atattctcag ctctcagact gttcatttgc agatacaacc tgtgcttggc attgtctttg 240 gagatggtga atctgacctt cacagagtct gcatattatg tctgacttcc atcgtacatt 300 atatctacta ctcactgcag cccctttcct ggagcctggc agattcagct gatctagtag 360 ctacagaagg tggattcaga ggatgcacgg cagagtctca ggcacattca gcttgtgcca 420 actctcccca agactccacc atctgcaccc cacactagac ttcggaaccg aactacctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 4810 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 4810 gcctccctcg cgccatcagt tcggaactta acgtcggcag tagcagaaaa caaaggccct 60 agagtggcca ttcttacctg aggagacggt gaccgtggtc cctttgcccc agacgtccat 120 gtagtagtag tagtagtcga cttcggaact taacgtctca acagtaatac 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Synthetic polynucleotide" <400> 4813 gcctccctcg cgccatcagt tcggaacact ctacgggcag tagcagaaaa caaaggccct 60 agagtggcca ttcttacctg aggagacggt gaccgtggtc cctttgcccc agacgtccat 120 gtagtagtag tagtagtcga cttcggaaca ctctacgtca acacagtaat acacagccat 180 gtcgtcggct ctcaggctgt tcatttgcag atacagtgaa ttctgggcat tgtctctaga 240 gatggtgaat cagcccttca cagagtctgt gtagagtacg gtatcaccac ttgtactaat 300 aactgagacc cactccaaac cctttcctgg agcctggtgg acccagtgca tagcagagct 360 actgaaggtg aatccagagg ctgcacagga gagtctcaga gaccctccca gtctttacta 420 agcctccccc agactccacc agctgcacct cacactggac ttcggaacac tctacgctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 4814 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 4814 gcctccctcg cgccatcagt tcggaactac cggaaggcag tagcagaaaa caaaggccct 60 agagtggcca ttcttacctg aggagacggt gaccgtggtc cctttgcccc agacgtccat 120 gtagtagtag tagtagtcga cttcggaact accggaatca acagtagtac acaactgtgc 180 cctcggctct 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Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 4844 gcctccctcg cgccatcaga agtaacggca taacttcagc tcagccaaaa ccctgcggct 60 ggtagggggc ctgtggggct gggggctgat gtggctgcgg tctccagggc gggtcgggtc 120 caggggcccc cagcagtcga caagtaacgg cataacttca tgcacagtaa tacaaggccg 180 tgtcctcagc tctcagactg ttcatttgca gatacaggga gttcttggcg ttgtctctgg 240 agatggtgaa tcggcccttc acagagtccg catagcctat gctaccacta ttccaactaa 300 tacctgagac ccactccagg cccttccctg gagcttgccg gacccagtgc atggcataat 360 catcaaaggt gaatccagag gctgcacagg agagtctcag ggacctgcca ggctgtacca 420 agcctccccc agactccacc agctgcactt cacactggac aagtaacggc ataactctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 4845 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 4845 gcctccctcg cgccatcaga agtaacgata tgctgtcagc tcagccaaaa ccctgcggct 60 ggtagggggc ctgtggggct gggggctgat gtggctgcgg tctccagggc gggtcgggtc 120 caggggcccc cagcagtcga caagtaacga tatgctgtca acagtaatac 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Synthetic polynucleotide" <400> 4848 gcctccctcg cgccatcaga agtaacggaa tggactcagc tcagccaaaa ccctgcggct 60 ggtagggggc ctgtggggct gggggctgat gtggctgcgg tctccagggc gggtcgggtc 120 caggggcccc cagcagtcga caagtaacgg aatggactca acagtaatac acagccatgt 180 cctcggctct ccgtctgttc ttttgcagat acagggagtt cctggaattg tctctggaga 240 tgatgaatcg gcgcttcacg gagtccacat agtgcgtcct actgccattc caactaacac 300 ccgataccca ctccagcccc tttcctggag ccttgcgggc ccagttcatg tcactgttac 360 tgaaggtgaa tccagaggct gcacaggaga gtctcaggga ccccccaggc tgtaccaagc 420 ctcccccaga ctccaccagc tgcacctcac actggacacc aagtaacgga atggacctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 4849 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 4849 gcctccctcg cgccatcaga agtaacgcac atggatcagc tcagccaaaa ccctgcggct 60 ggtagggggc ctgtggggct gggggctgat gtggctgcgg tctccagggc gggtcgggtc 120 caggggcccc cagcagtcga caagtaacgc acatggatca acagtgatac aaggccgtgt 180 cctcggctct 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Synthetic polynucleotide" <400> 4891 gcctccctcg cgccatcaga agtaacgtca gatgctcagc tcagccaaaa ccctgcggct 60 ggtagggggc ctgtggggct gggggctgat gtggctgcgg tctccagggc gggtcgggtc 120 caggggcccc cagcagtcga caagtaacgt cagatgctca tgaaagaaga attcatgtgc 180 agacacatct gcttgtctga agatatagtg catgtgggaa catgtgggct tgtctgaatt 240 catgataagt gggctggaat tcatcctcca ctcatcacgt atgcacctga cccactcctg 300 tgctttccat ccagtgccta caggaagcac tgattgtgac agagaatcca gaggcagcac 360 aggtgagtga gggggtttgc aagggcttca ccaggctgat aattgactga gaaaaacagt 420 tgttagcatg cacaagttct ggatgataca ttggaaaccc aagtaacgtc agatgcctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 4892 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 4892 gcctccctcg cgccatcaga agtaacggtg tagcatcagc tcagccaaaa ccctgcggct 60 ggtagggggc ctgtggggct gggggctgat gtggctgcgg tctccagggc gggtcgggtc 120 caggggcccc cagcagtcga caagtaacgg tgtagcatca acagtaatac aaaccatgtc 180 ctcagatgtc 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Synthetic polynucleotide" <400> 4934 gcctccctcg cgccatcaga agtaacgtta acgtctcagc tcagccaaaa ccctgcggct 60 ggtagggggc ctgtggggct gggggctgat gtggctgcgg tctccagggc gggtcgggtc 120 caggggcccc cagcagtcga caagtaacgt taacgtctca acagtaatac acggtcatgt 180 cctcagctct caggctgttc acttgcagat agagggagtt cttggcattg tctctggaga 240 tggtcaatcg gcccttcaca gagtctacat agtatttctc acttccgtca cactttatgt 300 cggccaccca ctccagcccc ttctccggag cctggcagac ccagtgcatc caggagctac 360 tgaaggtgaa tccagaggct gcacaggaga gtctcaggga ccctccaggc tgtaccaagc 420 ctcacccaga ctccaccagc tgcacctcac actggacacc aagtaacgtt aacgtcctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 4935 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 4935 gcctccctcg cgccatcaga agtaacgagc aaccttcagc tcagccaaaa ccctgcggct 60 ggtagggggc ctgtggggct gggggctgat gtggctgcgg tctccagggc gggtcgggtc 120 caggggcccc cagcagtcga caagtaacga gcaaccttca catacagtaa tacacggccg 180 tgccctctgc 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<400> 4938 gcctccctcg cgccatcaga agtaacgtac cggaatcagc tcagccaaaa ccctgcggct 60 ggtagggggc ctgtggggct gggggctgat gtggctgcgg tctccagggc gggtcgggtc 120 caggggcccc cagcagtcga caagtaacgt accggaatca acagtagtac acaactgtgc 180 cctcggctct caggctgttc atttgcagag acagtgaatt ctgggcattg tctctggaga 240 tggtgaatcg gcccttcaca gagtctgtgt agagtacggt atcaccactt gtactaataa 300 ctgagaccca ctacaaaccc tttcttggag cctggcggac ccagtgcata gcagagctac 360 tgaaggtgaa tccagaggct gcacaggaga gtctcaggga ccccccaggc tggaccaagc 420 cttccccaga ctccaccagc tgcacctcac actggacacc aagtaacgta ccggaactga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 4939 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 4939 gcctccctcg cgccatcaga agtaacgcga attgctcagc tcagccaaaa ccctgcggct 60 ggtagggggc ctgtggggct gggggctgat gtggctgcgg tctccagggc gggtcgggtc 120 caggggcccc cagcagtcga caagtaacgc gaattgctca tgtacagcca tgcatggtca 180 tgtcctcagc tctcagactg ttcgtttgga 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/note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 4961 gcctccctcg cgccatcagg tctcctaagc tagtgccagc cacacagacc cccgggctga 60 gacccaggca gggaggggtg acgttcccag ggagacggtg gccgggctgc cctggcccca 120 gtgctccaag cacttgtcga cgtctcctaa gctagtgtca acagtaatac acggccgtgt 180 cctcagatct caggctgctc agctccatgt aggctgtgct cgtggatttg tccgcggtaa 240 tcgtgactct gccctggaac ttctgtgcgt agtttgctgt accaaagata gggatgatcc 300 ctcccatcca ctcaagccct tgtccagggg cctgtcgcac ccagctgata gcatagctgc 360 tgaaggtgcc tccagaagcc ttgcaggaga ccttcaccga ggacccaggc ttcttcacct 420 cagccccaga ctgcaccagc tgcacctggg actggacacc gtctcctaag ctagtgctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 4962 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 4962 gcctccctcg cgccatcagg tctcctataa ccaagccagc cacacagacc cccgggctga 60 gacccaggca gggaggggtg acgttcccag ggagacggtg gccgggctgc cctggcccca 120 gtgctccaag cacttgtcga cgtctcctat 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<220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 5000 gcctccctcg cgccatcagg tctcctaacg tactcccagc cacacagacc cccgggctga 60 gacccaggca gggaggggtg acgttcccag ggagacggtg gccgggctgc cctggcccca 120 gtgctccaag cacttgtcga cgtctcctaa cgtactctca acagtaatac acggccgtgt 180 ccgcagcggt cacagagctc agcttcaggg agaactggtt cttggacgtg tctactgata 240 tggtgactcg actcttgagg gaggggttgt agttggtgct cccactgtaa tagatatacc 300 caatccactc cagtcccttc cctgggggct gccggatcca gctccagtag taaccaccac 360 tgctgacgga gccaccagag acagtgcagg tgagggacag ggtctccgaa ggcttcacca 420 gtcctgggcc cgactcctgc agctgcacct gggacaggac gtctcctaac gtactcctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 5001 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 5001 gcctccctcg cgccatcagg tctcctatga tgcgaccagc cacacagacc cccgggctga 60 gacccaggca gggaggggtg acgttcccag ggagacggtg gccgggctgc cctggcccca 120 gtgctccaag 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/note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 5004 gcctccctcg cgccatcagg tctcctagct tagtaccagc cacacagacc cccgggctga 60 gacccaggca gggaggggtg acgttcccag ggagacggtg gccgggctgc cctggcccca 120 gtgctccaag cacttgtcga cgtctcctag cttagtatca acagtaatac acagccgtgt 180 cctcgggagt cacagagttc agctgcaggg agaactggtt cttggatgtg tctgggttga 240 tggttattcg acttttcaca gatactgcat aatcattata ccacttggac ctgtagtatg 300 tccttcccag ccactcaagg cctctcgatg gggactgcct gatccagttc caagcagcac 360 tgttgctaga gacactgtcc ccggagatgg cacaggtgag tgagagggtc tgcgagggct 420 tcaccagtcc tggacctgac tgctgcagct gtacctgtga gtctcctagc ttagtactga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 5005 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 5005 gcctccctcg cgccatcagg tctcctatga ccttgccagc cacacagacc cccgggctga 60 gacccaggca gggaggggtg acgttcccag ggagacggtg gccgggctgc cctggcccca 120 gtgctccaag cacttgtcga cgtctcctat 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<220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 5043 gcctccctcg cgccatcagg tctcctaagt tatgcccagc cacacagacc cccgggctga 60 gacccaggca gggaggggtg acgttcccag ggagacggtg gccgggctgc cctggcccca 120 gtgctccaag cacttgtcga cgtctcctaa gttatgctca tgcacagtaa tgtgtggctg 180 tgtccacaat gtccatgttg atcactgtta gaaccacttc attcttggag gtgtccttgg 240 agataatgag cctactcttc agagatgggc tgtagtattt attatcattc taataaatgt 300 gtgcaagcca ctccagggcc tttgctgagg gctgacagat ctaacccaca cccattccag 360 aagtgctgag tgagaaccca gagaaggtgc aggtcagcat gagggtctgt gtgggtttca 420 ccagtgcagg accagactcc ttcaaggtga cctgggataa gtctcctaag ttatgcctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 5044 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 5044 gcctccctcg cgccatcagg tctcctaagg tctcaccagc cacacagacc cccgggctga 60 gacccaggca gggaggggtg acgttcccag ggagacggtg gccgggctgc cctggcccca 120 gtgctccaag 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/note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 5047 gcctccctcg cgccatcagg tctcctagat tgcagccagc cacacagacc cccgggctga 60 gacccaggca gggaggggtg acgttcccag ggagacggtg gccgggctgc cctggcccca 120 gtgctccaag cacttgtcga cgtctcctag attgcagtca acactaatag agggccgtgt 180 cctcggtttt caggctgttc atttgcagat gaagtgtgtt cttggcgtta tctctggagg 240 tattgaatcg gtccttaccg gagtctatga ggtatgtgct acccccatta ggattaactt 300 gtcaaaccaa ctccagccca ttccctggag cctggcggac acagttcatg tagtagctac 360 tgaaggtgaa ttgagaggct gcacaggaga gtctcgggga ccacgcaggc tttgccaagc 420 ctcccccaga ctccaccagc tgcatctcac actggatacc gtctcctaga ttgcagctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 5048 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 5048 gcctccctcg cgccatcagg tctcctaact atgacccagc cacacagacc cccgggctga 60 gacccaggca gggaggggtg acgttcccag ggagacggtg gccgggctgc cctggcccca 120 gtgctccaag cacttgtcga cgtctcctaa 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Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 5086 gcctccctcg cgccatcagg tagacactaa ccaagcctgc ccttctcatg gaaccctctg 60 ctggcctccc acgtacccca cattctggcc tgacccctca gaagccagac cactgtcggc 120 ctgggaagtc caactgtcga cgtagacact aaccaagtca atagtaatac acagccatgt 180 cctcagatgt caggctgctc aggtctgtgt aggctgtggt tgtggacatg tccctggtca 240 tggtgaatct gccctgaaac ttcttggcat agcttgggct accattgcca gggttgatcc 300 atcccatcca ctcaagccct tgtccagggg actgttgcac ccaatgtata ccgtagctgg 360 tgatggtaaa cccagaaaaa ctacaggaga ctttcactga ggccccagac ttcctcacct 420 cagcccaaga ctgcaccagc tggacctggg agtgggcacc gtagacacta accaagctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 5087 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 5087 gcctccctcg cgccatcagg tagacaccaa gaggtcctgc ccttctcatg gaaccctctg 60 ctggcctccc acgtacccca cattctggcc tgacccctca gaagccagac cactgtcggc 120 ctgggaagtc caactgtcga cgtagacacc aagaggttca acagtaatac 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Synthetic polynucleotide" <400> 5090 gcctccctcg cgccatcagg tagacacgca ggattcctgc ccttctcatg gaaccctctg 60 ctggcctccc acgtacccca cattctggcc tgacccctca gaagccagac cactgtcggc 120 ctgggaagtc caactgtcga cgtagacacg caggatttca tgcacaataa tacgtggctg 180 tgtccacagg gtccatgttg gtcattgtaa ggaccacctg gtttttggag gtgtccttgg 240 agatggtgag cctggtcttc agagatgtgc tgtagtattt atcatcatcc caatcaatga 300 gtgcaagcca ctccagggcc ttccctgggg gctgacggat ccagctcaca cacattccac 360 tagtgctgag tgagaaccca gagaaggtgc aggtcagtgt gagggtctgt gtgggtttca 420 ccagcgcagg accagactcc ctcaaggtga cctgggataa gtagacacgc aggattctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 5091 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 5091 gcctccctcg cgccatcagg tagacacgtc cattccctgc ccttctcatg gaaccctctg 60 ctggcctccc acgtacccca cattctggcc tgacccctca gaagccagac cactgtcggc 120 ctgggaagtc caactgtcga cgtagacacg tccattctca acagtaatac acagccgtgt 180 cctcggctct 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<400> 5094 gcctccctcg cgccatcagg tagacacaat cctgccctgc ccttctcatg gaaccctctg 60 ctggcctccc acgtacccca cattctggcc tgacccctca gaagccagac cactgtcggc 120 ctgggaagtc caactgtcga cgtagacaca atcctgctca acagtaatac acagccgtgt 180 ccccggctct caggctgttc atttgaagat acaaggagtt cttggcattt tctctggaga 240 tggtgaatcg gcccttcacg gagcctggat agtatgtgtc accagcagta ccaatagctg 300 agacccactc cagacctttt cctgtagctt ggcggaccca gtgcatgtcg tagctactga 360 aggtgaatcc agaggctgca caggagagtc tcagggaccc cccaggctgt accaagcctc 420 ccccagactc caccagctgc acctcacact ggacacctgc gtagacacaa tcctgcctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 5095 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 5095 gcctccctcg cgccatcagg tagacactga gacctcctgc ccttctcatg gaaccctctg 60 ctggcctccc acgtacccca cattctggcc tgacccctca gaagccagac cactgtcggc 120 ctgggaagtc caactgtcga cgtagacact gagaccttca acagtaatac acggctgtgt 180 cctcggtttt caggctgttc atttgcagat 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/note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 5125 gcctccctcg cgccatcagg tagacactga tgcgacctgc ccttctcatg gaaccctctg 60 ctggcctccc acgtacccca cattctggcc tgacccctca gaagccagac cactgtcggc 120 ctgggaagtc caactgtcga cgtagacact gatgcgatca acagtaatac acggccgtgt 180 ctgcggcggt cacagagctc agcttcaggg agaactggtt cttggacgtg tctactgata 240 tggtgactcg actcttgagg gacgggttgt agtaggtgct cccactatga tagatactcc 300 caatccactc cagccccttc cctgggggct gccggatcca gccccagtag taaccactgc 360 tgatggagta accagagaca gcgcaggtga gggacagggt ctccgaaggc ttcaccagtc 420 ctgggcccga ctcctgcagc tgcacctggg acaggacccc gtagacactg atgcgactga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 5126 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 5126 gcctccctcg cgccatcagg tagacacatt aagcgcctgc ccttctcatg gaaccctctg 60 ctggcctccc acgtacccca cattctggcc tgacccctca gaagccagac cactgtcggc 120 ctgggaagtc caactgtcga cgtagacaca 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Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 5129 gcctccctcg cgccatcagg tagacactga ccttgcctgc ccttctcatg gaaccctctg 60 ctggcctccc acgtacccca cattctggcc tgacccctca gaagccagac cactgtcggc 120 ctgggaagtc caactgtcga cgtagacact gaccttgtca acagtaatac acggcagtgt 180 cctcagcctt taggctgcag atctgcagat atgccgtgct gacagaggtg tccaaggaga 240 agacaaaccg tcctgtgaag ccctgggcat acgttgggtt cccagtgttg gtgttgatcc 300 atcccatcca ctcaagccct tgtccagggg cctgtcgcac ccaattcata gcatagctag 360 tgaaggtgta tccagaagcc ttgcaggaaa ccttcactga ggccccaggc ttcttcaact 420 cagacccaga ttgcaccagc tgcacctggg agtgggcacc gtagacactg accttgctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 5130 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 5130 gcctccctcg cgccatcagg tagacaccaa ggtcacctgc ccttctcatg gaaccctctg 60 ctggcctccc acgtacccca cattctggcc tgacccctca gaagccagac cactgtcggc 120 ctgggaagtc caactgtcga cgtagacacc aaggtcatca acagtaatac 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Synthetic polynucleotide" <400> 5133 gcctccctcg cgccatcagg tagacaccgc caatacctgc ccttctcatg gaaccctctg 60 ctggcctccc acgtacccca cattctggcc tgacccctca gaagccagac cactgtcggc 120 ctgggaagtc caactgtcga cgtagacacc gccaatatca ataaaaatca tggttgtgta 180 ctccttgtta aggtagctca gctgtaggag aaactgtttt ttggatgtgg atctggagat 240 ggtgactgga ctcttgagga gtgggttgga ttgtgcactc cctcatgacc tgtgcacctg 300 attcgctcca gtcccttccc cggggggtga cggatccagc tccagcagga agcactggtt 360 gtaatggaga agcagagatg ccacaggcca gggggaggat ctgtgagggc ttcaccaggc 420 caggagtgca ccgagaatca cagttgtcgg catgcacagg gtagacaccg ccaatactga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 5134 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 5134 gcctccctcg cgccatcagg tagacactca agcctcctgc ccttctcatg gaaccctctg 60 ctggcctccc acgtacccca cattctggcc tgacccctca gaagccagac cactgtcggc 120 ctgggaagtc caactgtcga cgtagacact caagccttca cagtaatact cagccgtgtc 180 ctaggtggtc 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<400> 5137 gcctccctcg cgccatcagg tagacacaag agctgcctgc ccttctcatg gaaccctctg 60 ctggcctccc acgtacccca cattctggcc tgacccctca gaagccagac cactgtcggc 120 ctgggaagtc caactgtcga cgtagacaca agagctgtca ttcaaaatgt gtagttgtgt 180 gttcactggg cacagagctc agctgtaaga actgtttctt ggatctggat atggactctt 240 gagaagtggg atgtaatttt tgctcccttt acaacccatg aacctgatcc actcctgtcc 300 atcttctagg ggcaagcaga tacaattcta gcaggacaca ctggttatga tggggaatcc 360 agagacagtg caggtgaggg agagggtctg tgaggatgtc tcaagccaga agtgcactgg 420 aaaacacagt tgttgatgtt aacagtttct ggacaacacg gtagacacaa gagctgctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 5138 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 5138 gcctccctcg cgccatcagg tagacactat cgctccctgc ccttctcatg gaaccctctg 60 ctggcctccc acgtacccca cattctggcc tgacccctca gaagccagac cactgtcggc 120 ctgggaagtc caactgtcga cgtagacact atcgctctca gctctaaaat acatggctat 180 gtgtttgttg ctcacatagt tcacctgtaa 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/note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 5168 gcctccctcg cgccatcagg tagacacagg tctcacctgc ccttctcatg gaaccctctg 60 ctggcctccc acgtacccca cattctggcc tgacccctca gaagccagac cactgtcggc 120 ctgggaagtc caactgtcga cgtagacaca ggtctcatca cagagtcata tgcagctgca 180 tcctctgccc tcagtctgtt catttgcaga tacagtgagt ttttggtatt gtctctggaa 240 atggtgaatc ggcccttcac agagtctgcg tagtacatgg tactaccact accactaata 300 actgggaccc actgcagacc cttccctgga gcctggggga cccagtgcgt gctatggcta 360 ctgaaggtga atccagaggc tgcacaggag agtctcaggg acacccaggc tttgtcaagt 420 ttgctccaga ctctaccagc tgcatctcac actggacacc gtagacacag gtctcactga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 5169 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 5169 gcctccctcg cgccatcagg tagacacgtc atagtcctgc ccttctcatg gaaccctctg 60 ctggcctccc acgtacccca cattctggcc tgacccctca gaagccagac cactgtcggc 120 ctgggaagtc caactgtcga cgtagacacg 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Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 5172 gcctccctcg cgccatcagg tagacacact atgaccctgc ccttctcatg gaaccctctg 60 ctggcctccc acgtacccca cattctggcc tgacccctca gaagccagac cactgtcggc 120 ctgggaagtc caactgtcga cgtagacaca ctatgactca tgtacagcca tacacagcca 180 tgtcctcagt tctctgactg ttcatttgca gatacagaga gttcttagca ttgtctttgg 240 agatggagaa tctgcccttc acagagtctg catggtgtat ctgacttcca tcatctttta 300 tatctattac tcactccagc cccttgcctg cagactggtg aactgggctc attcagaagc 360 tactgaaggc gaatctagag gctacacagg agagtctcag gaacttccca ggttgtctca 420 ggtcctctgt gggctctatc agctccacct cacactgaac gtagacacac tatgacctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 5173 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 5173 gcctccctcg cgccatcagg tagacacatg gtcaacctgc ccttctcatg gaaccctctg 60 ctggcctccc acgtacccca cattctggcc tgacccctca gaagccagac cactgtcggc 120 ctgggaagtc caactgtcga cgtagacaca tggtcaatca catacagtaa 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Synthetic polynucleotide" <400> 5176 gcctccctcg cgccatcagg tagacaccat atgctcctgc ccttctcatg gaaccctctg 60 ctggcctccc acgtacccca cattctggcc tgacccctca gaagccagac cactgtcggc 120 ctgggaagtc caactgtcga cgtagacacc atatgcttca agtaatacac agacctatcc 180 tcggctctga cgctgttcat ttgcagatac agtgatttct tggcatcatc tctggagagg 240 gtgaatcgac ccttcacaga gtctgcatag cttgtgctac ctacacaaca actcataaat 300 gagacctact ccagcccttt cccaggagcc tgatggaccc agctcatcca gtacctaata 360 aaggtactaa aggtgaatcc agaggctgca aaagaaagtc tcagggaccc ccaggctata 420 acaagcctcc caaagactcc accagctgca cctcacactg gtagacacca tatgctctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 5177 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 5177 gcctccctcg cgccatcagg tagacactcg tcgatcctgc ccttctcatg gaaccctctg 60 ctggcctccc acgtacccca cattctggcc tgacccctca gaagccagac cactgtcggc 120 ctgggaagtc caactgtcga cgtagacact cgtcgattca acacagccga gtcctcatct 180 ctcagactgt 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<400> 5180 gcctccctcg cgccatcagg tagacacgta gttcgcctgc ccttctcatg gaaccctctg 60 ctggcctccc acgtacccca cattctggcc tgacccctca gaagccagac cactgtcggc 120 ctgggaagtc caactgtcga cgtagacacg tagttcgtca acaataatac acagccatgt 180 cctcagctat caggctgttc atttgaagat acaaggactt cttggcgttg tctctggaga 240 tggtgaatcg gcccatcacg gagtctgcat agtatgtatc accaccagta ccaatagctg 300 atacccactc cggacccttc cctggagccc ggcgaaccca gtgcagaaca tagctactga 360 aggcgaatcc agaggctgca caggagggtc tcagggaccc cccaggctgt accaagcctc 420 ccccagactc caccagctga tcctcacact ggacacctgc gtagacacgt agttcgctga 480 gcgggctggc aaggc 495 <210> 5181 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 5181 gcctccctcg cgccatcagg tagacaccga actaccctgc ccttctcatg gaaccctctg 60 ctggcctccc acgtacccca cattctggcc tgacccctca gaagccagac cactgtcggc 120 ctgggaagtc caactgtcga cgtagacacc gaactactca tgactcaata atacagagcc 180 atattctcag ctctcagact gttcatttgc 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of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 5208 gggctggcaa gccacgtttg gtgcacgagt ccacatggga aggactggag tgg 53 <210> 5209 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 5209 gggctggcaa gccacgtttg gtgcactagc ccgcttccat gggctgt 47 <210> 5210 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 5210 gggctggcaa gccacgtttg gtgcagcagg cttcacaaca gggattgtgg tgg 53 <210> 5211 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 5211 gggctggcaa gccacgtttg gtgcagcagg cttcatgaca gggattggtg tgg 53 <210> 5212 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 5212 gggctggcaa gccacgtttg gtgcaggccc atggacaagg gcttgaggaa 50 <210> 5213 <211> 50 <212> DNA <213> 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Synthetic oligonucleotide" <400> 5324 cccccggaca agcgcttgag tgg 23 <210> 5325 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 5325 cccctctctg ggagggaatg gagtgg 26 <210> 5326 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 5326 cccgtgggca acaggctgga atgg 24 <210> 5327 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 5327 ccctcagcaa aggccctgga gtgg 24 <210> 5328 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 5328 ccgcaaggaa gggactggag cga 23 <210> 5329 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 5329 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of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 5355 gcccccatgg gaggtactgg agtgg 25 <210> 5356 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 5356 gcccccggac aaaggcttga gtgg 24 <210> 5357 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 5357 gcccctggac aagggcttga gtgg 24 <210> 5358 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 5358 gcccgggaaa ggcctggagt gg 22 <210> 5359 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 5359 gcctcaggga aggggctgga atgg 24 <210> 5360 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic 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Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 5605 gccttgccag cccgctcaga gtaccgagta cagtgagggt tgagggctgg ggtctcccac 60 gtgttttggg gctaacagcg gaagggagag cactggcaaa ggtgctgggg gtcccctgaa 120 cccgacccgc cctgagaccg cagccacatc agcccccagc cccacaggcc ccctaccagc 180 cgcagggttt ttggctgagc tgagaaccac tgtgctaact agtaccgagt acagtggtcg 240 acatacttcc agcactgggg ccagggcacc ctggtcaccg tctcctcagg tgagtctgct 300 gtctggggat agcggggagc caggtgtact gggccaggca agagtaccga gtacagtgct 360 gatggcgcga gggaggc 377 <210> 5606 <211> 382 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 5606 gccttgccag cccgctcagg acactctgga tcatcgcccc ggtctctgtg ggtgttccgc 60 taactggggc tcccagtgct caccccacaa ctaaagcgag ccccagcctc cagagccccc 120 gaaggagatg ccgcccacaa gcccagcccc catccaggag gccccagagc tcagggcgcc 180 ggggcagatt ctgaacagcc ccgagtcacg gtgggtacaa ctggagacac tctggatcat 240 cgtcgactgc tgggggcccc tggacccgac ccgccctgga gaccgcagcc 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Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 5639 gccttgccag cccgctcagc gttactttat tggcgaaagg aggagcccct tgttcagcac 60 tgggctcaga gtcctctcca agacacccag agtttcagac aaaaaccccc tggaatgcac 120 agtctcagca ggagagccag ccagagccag caagatgggg ctcagtgaca cccgcaggga 180 caggaggatt ttgtgggggc tcgtgtcact gtgaggatat tgtactaatg gtgtatgctc 240 gttactttat tggcggtcga cggtacttcg atctctgggg ccgtggcacc ctggtcactg 300 tctcctcagg tgagtcccac tgcagccccc tcccagtctt ctctgtccag gcaccaggcc 360 acgttacttt attggcgctg atggcgcgag ggaggc 396 <210> 5640 <211> 396 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 5640 gccttgccag cccgctcagt aggagactat tggcgaaagg aggagccccc tatacagcac 60 tgggctcaga gtcctctctg agacaccctg agtttcagac aacaacccgc tggaatgcac 120 agtctcagca ggagaacaga ccaaagccag caaaagggac ctcggtgaca ccagtaggga 180 caggaggatt ttgtgggggc tcgtgtcact gtgaggatat tgtagtggtg gtagctgctt 240 aggagactat tggcggtcga cggtacttcg 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Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 5660 gccttgccag cccgctcagg acactctagg cttgagcccc ggtctctgtg ggtgttccgc 60 taactggggc tcccagtgct caccccacaa ctaaagcgag ccccagcctc cagagccccc 120 gaaggagatg ccgcccacaa gcccagcccc catccaggag gccccagagc tcagggcgcc 180 ggggcagatt ctgaacagcc ccgagtcacg gtgggtacaa ctggagacac tctaggcttg 240 agtcgacaag tgcttggagc actggggcca gggcagcccg gccaccgtct ccctgggaac 300 gtcacccctc cctgcctggg tctcagcccg ggggtctgtg tggctgggac actctaggct 360 tgactgatgg cgcgagggag gc 382 <210> 5661 <211> 382 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 5661 gccttgccag cccgctcagt tcggaacagg cttgaggcct cggtctctgt gggtgttccg 60 ctagctgggg ctcacagtgc tcaccccaca cctaaaacga gccacagcct cagagcccct 120 gaaggagacc ccgcccacaa gcccagcccc cacccaggag gccccagagc acagggcgcc 180 ccgtcggatt ctgaacagcc ccgagtcaca gtgggtataa ctggattcgg aacaggcttg 240 agtcgacaag tgcttggagc actggggcca gggcagcccg 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polynucleotide" <400> 5765 gccttgccag cccgctcagc agtccaacag ctctttgagg tagctggcct ctgtctcgga 60 ccccactcca gacaccagac agaggggcag gccccccaaa accagggttg agggatgatc 120 cgtcaaggca gacaagacca aggggcactg accccagcaa gggaaggctc ccaaacagac 180 gaggaggttt ctgaagctgt ctgtatcaca gtggggtata gcagtggctc agtccaacag 240 ctcttgtcga ctttgactac tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc tcaggtgagt 300 cctcacaacc tctctcctgc tttaactctg aagggttttg ctgcatttct gcagtccaac 360 agctcttctg atggcgcgag ggaggc 386 <210> 5766 <211> 383 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 5766 gccttgccag cccgctcagt acgtacgcag ctcttcagct ggcctctgtc tcggaccccc 60 attccagaca ccagacagag ggacaggccc cccagaacca gtgttgaggg acacccctgt 120 ccagggcagc caagtccaag aggcgcgctg agcccagcaa gggaaggccc ccaaacaaac 180 caggaggttt ctgaagctgt ctgtgtcaca gtcgggtata gcagcgtacg tacgcagctc 240 ttgtcgactt tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca ggtgagtcct 300 cacaacctct 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/note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 5770 gccttgccag cccgctcaga agtaacggag cgataggcct cggtctctgt gggtgttccg 60 ctagctgggg ctcacagtgc tcaccccaca cctaaaatga gccacagcct ccggagcccc 120 cgcagagacc ccgcccacaa gcccagcccc cacccaggag gccccagagc tcagggcgcc 180 ccgtcggatt ccgaacagcc ccgagtcaca gcgggtataa ccggaaagta acggagcgat 240 agtcgactgg ttcgacccct ggggccaggg aaccctggtc accgtctcct caggtgagtc 300 ctcaccaccc cctctctgag tccacttagg gagactcagc ttgccagaag taacggagcg 360 atactgatgg cgcgagggag gc 382 <210> 5771 <211> 382 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 5771 gccttgccag cccgctcagg tctcctagag cgatagtctc tgtgggtgtt ccgctagctg 60 gggcccccag tgctcacccc acacctaaag cgagccccag cctccagagc cccctaagca 120 ttccccgccc agcagcccag cccctgcccc cacccaggag gccccagagc tcagggcgcc 180 tggtcggatt ctgaacagcc ccgagtcaca gtgggtataa ctggagtctc ctagagcgat 240 agtcgactgg ttcgacccct 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Synthetic polynucleotide" <400> 5786 gccttgccag cccgctcagt ccgtctagag cgataagagg cctctccagg gggacactgt 60 gcatgtctgg tccctgagca gccccccatg tccccagtcc tggggggccc cctggcacag 120 ctgtctggac cctctctatt ccctgggaag ctcctcctga cagccccgcc tccagttcca 180 ggtgtggtta ttgtcagggg gtgtcagact gtggtggata cagctatgtc cgtctagagc 240 gatagtcgac tggttcgacc cctggggcca gggaaccctg gtcaccgtct cctcaggtga 300 gtcctcacca ccccctctct gagtccactt agggagactc agcttgccag tccgtctaga 360 gcgatactga tggcgcgagg gaggc 385 <210> 5787 <211> 388 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 5787 gccttgccag cccgctcaga agagctggag cgatagcaga ggcctctcca gggagacact 60 gtgcatgtct ggtacctaag cagcccccca cgtccccagt cctgggggcc cctggctcag 120 ctgtctggac cctccctgtt ccctgggaag ctcctcctga cagccccgcc tccagttcca 180 ggtgtggtta ttgtcaggcg atgtcagact gtggtggata tagtggctac gaagagctgg 240 agcgatagtc gactggttcg acccctgggg ccagggaacc ctggtcaccg tctcctcagg 300 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<213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 5812 gccttgccag cccgctcaga cgtgtgtgca tctgaggagg gtgagtcaga cccacctgcc 60 ctcaatggca ggcggggaag attcagaaag gcctgagatc cccaggacgc agcaccactg 120 tcaatggggg ccccagacgc ctggaccagg gcctgtgtgg gaaaggcctc tggccacact 180 caggggcttt ttgtgaaggg ccctcctgct gtgtgactac ggtggtaacg tgtgtgcatc 240 tgagtcgact actactacta ctacatggac gtctggggca aagggaccac ggtcaccgtc 300 tcctcaggta agaatggcca ctctagggcc tttgttttct gctactgcca cgtgtgtgca 360 tctgactgat ggcgcgaggg aggc 384 <210> 5813 <211> 385 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 5813 gccttgccag cccgctcagt ccgtctagca tctgaagagg cctctccagg gggacactgt 60 gcatgtctgg tccctgagca gccccccatg tccccagtcc tggggggccc cctggcacag 120 ctgtctggac cctctctatt ccctgggaag ctcctcctga cagccccgcc tccagttcca 180 ggtgtggtta ttgtcagggg gtgtcagact gtggtggata 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Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 5820 gccttgccag cccgctcagt acgtacggca tctgacagct ggcctctgtc tcggaccccc 60 attccagaca ccagacagag ggacaggccc cccagaacca gtgttgaggg acacccctgt 120 ccagggcagc caagtccaag aggcgcgctg agcccagcaa gggaaggccc ccaaacaaac 180 caggaggttt ctgaagctgt ctgtgtcaca gtcgggtata gcagcgtacg tacggcatct 240 gagtcgacta ctactactac tacatggacg tctggggcaa agggaccacg gtcaccgtct 300 cctcaggtaa gaatggccac tctagggcct ttgttttctg ctactgccta cgtacggcat 360 ctgactgatg gcgcgaggga ggc 383 <210> 5821 <211> 377 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 5821 gccttgccag cccgctcaga gtaccgagca tctgaagggt tgagggctgg ggtctcccac 60 gtgttttggg gctaacagcg gaagggagag cactggcaaa ggtgctgggg gtcccctgaa 120 cccgacccgc cctgagaccg cagccacatc agcccccagc cccacaggcc ccctaccagc 180 cgcagggttt ttggctgagc tgagaaccac tgtgctaact agtaccgagc atctgagtcg 240 actactacta ctactacatg gacgtctggg gcaaagggac 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ttggcctgag cagcaccagg gccaccctcc 180 caaactccta tcctacagga ataacaaccg gccctcaggg atctcagaga gattatctgc 240 atccaggtca ggaaacacag cctccctgac cattactgga ctccagcctg aggacgaggc 300 tgactattac tgctcagcat gggacagcag cctcatgaat gacaccgaca ctctgtcgac 360 tcttcggaac tgggaccaag gtcaccgtcc taggtaagtg gctctcaacc tttcccagcc 420 tgtctcaccc tctgctgtcc ctggaaaatc tgttttctct atgacaccga cactctctga 480 tggcgcgagg gaggc 495 <210> 5856 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 5856 gccttgccag cccgctcagc ttcacgagac actctcgtgc tgactcagcc gccctctctg 60 tctgcatccc cgggagcaac agccagactc ccctgcaccc tgagcagtga cctcagtgtt 120 ggtggtaaaa acatgttctg gtaccagcag aagccaggga gctctcccag gttattcctg 180 tatcactact cagactcaga caagcagctg ggacctgggg tccccagtcg agtctctggc 240 tccaaggaga cctcaagtaa cacagcgttt ttgctcatct ctgggctcca gcctgaggac 300 gaggccgatt attactgcca ggtgtacgaa agtagtgact tcacgagaca ctctgtcgac 360 tcttcggaac tgggaccaag gtcaccgtcc taggtaagtg gctctcaacc tttcccagcc 420 tgtctcaccc tctgctgtcc ctggaaaatc tgttttctct cttcacgaga cactctctga 480 tggcgcgagg gaggc 495 <210> 5857 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 5857 gccttgccag cccgctcagt aggagacttc ggaacggtcc tgggcccagt ctgtgctgac 60 tcagccaccc tcggtgtctg aagcccccag gcagagggtc accatctcct gttctggaag 120 cagctccaac atcggaaata atgctgtaaa ctggtaccag cagctcccag gaaaggctcc 180 caaactcctc atctattatg atgatctgct gccctcaggg gtctctgacc gattctctgg 240 ctccaagtct ggcacctcag cctccctggc catcagtggg ctccagtctg aggatgaggc 300 tgattattac tgtgcagcat gggatgacag cctgatgata ggagacttcg gaacgtcgac 360 tattcggcgg agggaccaag ctgaccgtcc taggtgagtc tcttctcccc tctccttccc 420 cgctcttggg acaatttctg ctgtttttgt ttgtttctgt taggagactt cggaacctga 480 tggcgcgagg gaggc 495 <210> 5858 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 5858 gccttgccag cccgctcagg tgtctacttc ggaaccctgg gcccagtctg tcgtgacgca 60 gccgccctca gtgtctgggg ccccagggca gagggtcacc atctcctgca ctgggagcag 120 ctccaacatc ggggcaggtt atgatgtaca ctggtaccag cagcttccag gaacagcccc 180 caaactcctc atctatggta acagcaatcg gccctcaggg gtccctgacc gattctctgg 240 ctccaagtct ggcacctcag cctccctggc catcactggg ctccaggctg aggatgaggc 300 tgattattac tgccagtcct atgacagcag cctgatgagt gtctacttcg gaacgtcgac 360 tattcggcgg agggaccaag ctgaccgtcc taggtgagtc tcttctcccc tctccttccc 420 cgctcttggg acaatttctg ctgtttttgt ttgtttctgt gtgtctactt cggaacctga 480 tggcgcgagg gaggc 495 <210> 5859 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 5859 gccttgccag cccgctcagg tacagtgttc ggaacggtcc tgggcccagt ctgtgctgac 60 tcagccaccc tcagcgtctg ggacccccgg gcagagggtc accatctctt gttctggaag 120 cagctccaac atcggaagta atactgtaaa ctggtaccag cagctcccag 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taggtgagtc tcttctcccc tctccttccc 420 cgctcttggg acaatttctg ctgtttttgt ttgtttctgt ggatcatctt cggaacctga 480 tggcgcgagg gaggc 495 <210> 5861 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 5861 gccttgccag cccgctcagt attggcgttc ggaaccctgg gcccagtctg tgctgacgca 60 gccgccctca gtgtctgggg ccccagggca gagggtcacc atctcctgca ctgggagcag 120 ctccaacatt ggggcgggtt atgttgtaca ttggtaccag cagcttccag gaacagcccc 180 caaactcctc atctatggta acagcaatcg gccctcaggg gtccctgacc aattctctgg 240 ctccaagtct ggcacctcag cctccctggc catcactgga ctccagtctg aggatgaggc 300 tgattattac tgcaaagcat gggataacag cctgatgata ttggcgttcg gaacgtcgac 360 tattcggcgg agggaccaag ctgaccgtcc taggtgagtc tcttctcccc tctccttccc 420 cgctcttggg acaatttctg ctgtttttgt ttgtttctgt tattggcgtt cggaacctga 480 tggcgcgagg gaggc 495 <210> 5862 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 5862 gccttgccag cccgctcaga ggcttgattc ggaacggtcc tgggcccagt ctgtgttgac 60 gcagccgccc tcagtgtctg cggccccagg acagaaggtc accatctcct gctctggaag 120 cagctccaac attgggaata attatgtatc ctggtaccag cagctcccag gaacagcccc 180 caaactcctc atttatgaca ataataagcg accctcaggg attcctgacc gattctctgg 240 ctccaagtct ggcacgtcag ccaccctggg catcaccgga ctccagactg gggacgaggc 300 cgattattac tgcggaacat gggatagcag cctgatgaag gcttgattcg gaacgtcgac 360 tattcggcgg agggaccaag ctgaccgtcc taggtgagtc tcttctcccc tctccttccc 420 cgctcttggg acaatttctg ctgtttttgt ttgtttctgt aggcttgatt cggaacctga 480 tggcgcgagg gaggc 495 <210> 5863 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 5863 gccttgccag cccgctcaga cacacgtttc ggaacgtcct gggcccagtc tgccctgact 60 cagcctccct ccgcgtccag gtctcctgga cagtcagtca ccatctcctg cactggaacc 120 agcagtgacg ttggtggtta taactatgtc tcctggtacc aacagcaccc aggcaaagcc 180 cccaaactca tgatttatga ggtcagtaag cggccctcag gggtccctga tcgcttctct 240 ggctccaagt ctggcaacac ggcctccctg accgtctctg ggctccaggc tgaggatgag 300 gctgattatt actgcagctc atatgcaggc agcaatgaac acacgtttcg gaacgtcgac 360 tattcggcgg agggaccaag ctgaccgtcc taggtgagtc tcttctcccc tctccttccc 420 cgctcttggg acaatttctg ctgtttttgt ttgtttctgt acacacgttt cggaacctga 480 tggcgcgagg gaggc 495 <210> 5864 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 5864 gccttgccag cccgctcagt agacggattc ggaacatcct gggctcagtc tgccctgact 60 cagcctcgct cagtgtccgg gtctcctgga cagtcagtca ccatctcctg cactggaacc 120 agcagtgatg ttggtggtta taactatgtc tcctggtacc aacagcaccc aggcaaagcc 180 cccaaactca tgatttatga tgtcagtaag cggccctcag gggtccctga tcgcttctct 240 ggctccaagt ctggcaacac ggcctccctg accatctctg ggctccaggc tgaggatgag 300 gctgattatt actgctgctc atatgcaggc agctatgata gacggattcg gaacgtcgac 360 tattcggcgg agggaccaag ctgaccgtcc taggtgagtc tcttctcccc 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<400> 5866 gccttgccag cccgctcagg agcgatattc ggaacatcct gggctcagtc tgccctgact 60 cagcctccct ccgtgtccgg gtctcctgga cagtcagtca ccatctcctg cactggaacc 120 agcagtgacg ttggtagtta taaccgtgtc tcctggtacc agcagccccc aggcacagcc 180 cccaaactca tgatttatga ggtcagtaat cggccctcag gggtccctga tcgcttctct 240 gggtccaagt ctggcaacac ggcctccctg accacctctg ggctccaggc tgaggacgag 300 gctgattatt actgcagctc atatacaagc agcagtgaga gcgatattcg gaacgtcgac 360 tattcggcgg agggaccaag ctgaccgtcc taggtgagtc tcttctcccc tctccttccc 420 cgctcttggg acaatttctg ctgtttttgt ttgtttctgt gagcgatatt cggaacctga 480 tggcgcgagg gaggc 495 <210> 5867 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 5867 gccttgccag cccgctcagg catctgattc ggaacgtcct gggcccagtc tgccctgact 60 cagcctgcct ccgtgtctgg gtctcctgga cagtcgatca ccatctcctg cactggaacc 120 agcagtgatg ttgggagtta taaccttgtc tcctggtacc aacagcaccc aggcaaagcc 180 cccaaactca tgatttatga gggcagtaag 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cggaacctga 480 tggcgcgagg gaggc 495 <210> 5877 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 5877 gccttgccag cccgctcagt ccgtctattc ggaacttgca ggctctgagg cctcctatga 60 gctgacacag ccaccctcgg tgtcagtgtc cccaggacag acggccagga tcacctgctc 120 tggagatgca ttgccaaagc aatatgctta ttggtaccag cagaagccag gccaggcccc 180 tgtgctggtg atatataaag acagtgagag gccctcaggg atccctgagc gattctctgg 240 ctccagctca gggacaacag tcacgttgac catcagtgga gtccaggcag aagatgaggc 300 tgactattac tgtcaatcag cagacagcag tggtatgatc cgtctattcg gaacgtcgac 360 tattcggcgg agggaccaag ctgaccgtcc taggtgagtc tcttctcccc tctccttccc 420 cgctcttggg acaatttctg ctgtttttgt ttgtttctgt tccgtctatt cggaacctga 480 tggcgcgagg gaggc 495 <210> 5878 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 5878 gccttgccag cccgctcaga agagctgttc ggaacctttt cttgcagtct 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/note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 5897 gccttgccag cccgctcaga ggcttgaaag taacgggtcc tgggcccagt ctgtgttgac 60 gcagccgccc tcagtgtctg cggccccagg acagaaggtc accatctcct gctctggaag 120 cagctccaac attgggaata attatgtatc ctggtaccag cagctcccag gaacagcccc 180 caaactcctc atttatgaca ataataagcg accctcaggg attcctgacc gattctctgg 240 ctccaagtct ggcacgtcag ccaccctggg catcaccgga ctccagactg gggacgaggc 300 cgattattac tgcggaacat gggatagcag cctgatgaag gcttgaaagt aacggtcgac 360 tgttcggcgg agggaccaag ctgaccgtcc taggtgagtc tcttctcccc tctccttccc 420 cgctcttggg acaatttctg ctgtttttgt ttgtttctgt aggcttgaaa gtaacgctga 480 tggcgcgagg gaggc 495 <210> 5898 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 5898 gccttgccag cccgctcaga cacacgtaag taacggtcct gggcccagtc tgccctgact 60 cagcctccct ccgcgtccag gtctcctgga cagtcagtca ccatctcctg cactggaacc 120 agcagtgacg ttggtggtta taactatgtc 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Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 5901 gccttgccag cccgctcagg agcgataaag taacgatcct gggctcagtc tgccctgact 60 cagcctccct ccgtgtccgg gtctcctgga cagtcagtca ccatctcctg cactggaacc 120 agcagtgacg ttggtagtta taaccgtgtc tcctggtacc agcagccccc aggcacagcc 180 cccaaactca tgatttatga ggtcagtaat cggccctcag gggtccctga tcgcttctct 240 gggtccaagt ctggcaacac ggcctccctg accacctctg ggctccaggc tgaggacgag 300 gctgattatt actgcagctc atatacaagc agcagtgaga gcgataaagt aacggtcgac 360 tgttcggcgg agggaccaag ctgaccgtcc taggtgagtc tcttctcccc tctccttccc 420 cgctcttggg acaatttctg ctgtttttgt ttgtttctgt gagcgataaa gtaacgctga 480 tggcgcgagg gaggc 495 <210> 5902 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 5902 gccttgccag cccgctcagg catctgaaag taacggtcct gggcccagtc tgccctgact 60 cagcctgcct ccgtgtctgg gtctcctgga cagtcgatca ccatctcctg cactggaacc 120 agcagtgatg ttgggagtta taaccttgtc tcctggtacc aacagcaccc 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Synthetic polynucleotide" <400> 5905 gccttgccag cccgctcagt tggactgaag taacgttttc ttgcaggttc tgtggcctcc 60 tatgagctga ctcagccact ctcagtgtca gtggccctgg gacaggcggc caggattacc 120 tgtgggggaa acaaccttgg atataaaaat gtgcactggt accagcagaa gccaggccag 180 gcccctgtgc tggtcatcta tagggataac aaccggccct ctgggatccc tgagcgattc 240 tctggctcca actcggggaa cacggccacc ctgaccatca gcagagccca agccggggat 300 gaggctgact attactgtca ggtgtgggac agcagtgatt ggactgaagt aacggtcgac 360 tgttcggcgg agggaccaag ctgaccgtcc taggtgagtc tcttctcccc tctccttccc 420 cgctcttggg acaatttctg ctgtttttgt ttgtttctgt ttggactgaa gtaacgctga 480 tggcgcgagg gaggc 495 <210> 5906 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 5906 gccttgccag cccgctcagg tagacacaag taacgttgca gtctctgagg cctcctatga 60 gctgacacag ccaccctcgg tgtcagtgtc cccaggacaa acggccagga tcacctgctc 120 tggagatgca ttgccaaaaa aatatgctta ttggtaccag cagaagtcag gccaggcccc 180 tgtgctggtc 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<400> 5909 gccttgccag cccgctcagc gccaataaag taacgttgca ggttctgtgg tttcttctga 60 gctgactcag gaccctgctg tgtctgtggc cttgggacag acagtcagga tcacatgcca 120 aggagacagc ctcagaagct attatgcaag ctggtaccag cagaagccag gacaggcccc 180 tgtacttgtc atctatggta aaaacaaccg gccctcaggg atcccagacc gattctctgg 240 ctccagctca ggaaacacag cttccttgac catcactggg gctcaggcgg aagatgaggc 300 tgactattac tgtaactccc gggacagcag tggtatgacg ccaataaagt aacggtcgac 360 tgttcggcgg agggaccaag ctgaccgtcc taggtgagtc tcttctcccc tctccttccc 420 cgctcttggg acaatttctg ctgtttttgt ttgtttctgt cgccaataaa gtaacgctga 480 tggcgcgagg gaggc 495 <210> 5910 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 5910 gccttgccag cccgctcagt caagcctaag taacgttgca ggctctgtga cctcctatgt 60 gctgactcag ccaccctcag tgtcagtggc cccaggaaag acggccagga ttacctgtgg 120 gggaaacaac attggaagta aaagtgtgca ctggtaccag cagaagccag gccaggcccc 180 tgtgctggtc atctattatg atagcgaccg 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cactggaacc 120 agcagtgacg ttggtggtta taactatgtc tcctggtacc aacagcaccc aggcaaagcc 180 cccaaactca tgatttatga ggtcagtaag cggccctcag gggtccctga tcgcttctct 240 ggctccaagt ctggcaacac ggcctccctg accgtctctg ggctccaggc tgaggatgag 300 gctgattatt actgcagctc atatgcaggc agcaatgaac acacgtgtct cctagtcgac 360 tatttggtgg aggaacccag ctgatcattt tagatgagtc tcttcttccc tttctttccc 420 tgccaagttg gtgacaattt tattctgatt tcgatctttg acacacgtgt ctcctactga 480 tggcgcgagg gaggc 495 <210> 5934 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 5934 gccttgccag cccgctcagt agacggagtc tcctaatcct gggctcagtc tgccctgact 60 cagcctcgct cagtgtccgg gtctcctgga cagtcagtca ccatctcctg cactggaacc 120 agcagtgatg ttggtggtta taactatgtc tcctggtacc aacagcaccc aggcaaagcc 180 cccaaactca tgatttatga tgtcagtaag cggccctcag gggtccctga tcgcttctct 240 ggctccaagt ctggcaacac ggcctccctg accatctctg ggctccaggc tgaggatgag 300 gctgattatt actgctgctc atatgcaggc 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Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 5944 gccttgccag cccgctcagc gccaatagtc tcctattgca ggttctgtgg tttcttctga 60 gctgactcag gaccctgctg tgtctgtggc cttgggacag acagtcagga tcacatgcca 120 aggagacagc ctcagaagct attatgcaag ctggtaccag cagaagccag gacaggcccc 180 tgtacttgtc atctatggta aaaacaaccg gccctcaggg atcccagacc gattctctgg 240 ctccagctca ggaaacacag cttccttgac catcactggg gctcaggcgg aagatgaggc 300 tgactattac tgtaactccc gggacagcag tggtatgacg ccaatagtct cctagtcgac 360 tatttggtgg aggaacccag ctgatcattt tagatgagtc tcttcttccc tttctttccc 420 tgccaagttg gtgacaattt tattctgatt tcgatctttg cgccaatagt ctcctactga 480 tggcgcgagg gaggc 495 <210> 5945 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 5945 gccttgccag cccgctcagt caagcctgtc tcctattgca ggctctgtga cctcctatgt 60 gctgactcag ccaccctcag tgtcagtggc cccaggaaag acggccagga ttacctgtgg 120 gggaaacaac attggaagta aaagtgtgca ctggtaccag cagaagccag 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Synthetic polynucleotide" <400> 5948 gccttgccag cccgctcaga agagctggtc tcctactttt cttgcagtct ctgtggcctc 60 ctatgagctg acacagccat cctcagtgtc agtgtctccg ggacagacag ccaggatcac 120 ctgctcagga gatgtactgg caaaaaaata tgctcggtgg ttccagcaga agccaggcca 180 ggcccctgtg ctggtgattt ataaagacag tgagcggccc tcagggatcc ctgagcgatt 240 ctccggctcc agctcaggga ccacagtcac cttgaccatc agcggggccc aggttgagga 300 tgaggctgac tattactgtt actctgcggc tgacatgaaa gagctggtct cctagtcgac 360 tatttggtgg aggaacccag ctgatcattt tagatgagtc tcttcttccc tttctttccc 420 tgccaagttg gtgacaattt tattctgatt tcgatctttg aagagctggt ctcctactga 480 tggcgcgagg gaggc 495 <210> 5949 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 5949 gccttgccag cccgctcagt atcgctcgtc tcctatgctg actcagcccc cgtctgcatc 60 tgccttgctg ggagcctcga tcaagctcac ctgcacccta agcagtgagc acagcaccta 120 caccatcgaa tggtatcaac agagaccagg gaggtccccc cagtatataa tgaaggttaa 180 gagtgatggc 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<400> 5952 gccttgccag cccgctcagt ggcagttgtc tcctatgtgc tgactcagcc accttcctcc 60 tccgcatctc ctggagaatc cgccagactc acctgcacct tgcccagtga catcaatgtt 120 ggtagctaca acatatactg gtaccagcag aagccaggga gccctcccag gtatctcctg 180 tactactact cagactcaga taagggccag ggctctggag tccccagccg cttctctgga 240 tccaaagatg cttcagccaa tacagggatt ttactcatct ccgggctcca gtctgaggat 300 gaggctgact attactgtat gatttggcca agcaatgatg gcagttgtct cctagtcgac 360 tatttggtgg aggaacccag ctgatcattt tagatgagtc tcttcttccc tttctttccc 420 tgccaagttg gtgacaattt tattctgatt tcgatctttg tggcagttgt ctcctactga 480 tggcgcgagg gaggc 495 <210> 5953 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 5953 gccttgccag cccgctcagc agtccaagtc tcctatgtgc tgactcagcc aacctccctc 60 tcagcatctc ctggagcatc agccagattc acctgcacct tgcgcagcgg catcaatgtt 120 ggtacctaca ggatatactg gtaccagcag aatccaggga gtcttccccg gtatctcctg 180 aggtacaaat cagactcaga taagcagcag 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gaggtccccc cagtatataa tgaaggttaa 180 gagtgatggc agccacagca agggggacgg gatccccgat cgcttcatgg gctccagttc 240 tggggctgac cgctacctca ccttctccaa cctccagtct gacgatgagg ctgagtatca 300 ctgtggagag agccacacga ttgatggcca agtcgtgata tcgctcagag tgtcgtcgac 360 tgtttggtga ggggacggag ctgaccgtcc tagatgagtc ttttccccct ccttccctgg 420 tctccccaag gtactgggaa attttctgct gcttttgttc tatcgctcag agtgtcctga 480 tggcgcgagg gaggc 495 <210> 5985 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 5985 gccttgccag cccgctcagt cagatgcaga gtgtcctctc tcccagcctg tgctgactca 60 atcatcctct gcctctgctt ccctgggatc ctcggtcaag ctcacctgca ctctgagcag 120 tgggcacagt agctacatca tcgcatggca tcagcagcag ccagggaagg cccctcggta 180 cttgatgaag cttgaaggta gtggaagcta caacaagggg agcggagttc ctgatcgctt 240 ctcaggctcc agctctgggg ctgaccgcta cctcaccatc tccaacctcc agtttgagga 300 tgaggctgat tattactgtg agacctggga cagtatgatc agatgcagag tgtcgtcgac 360 tgtttggtga 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Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 5987 gccttgccag cccgctcagt ggcagttaga gtgtctgtgc tgactcagcc accttcctcc 60 tccgcatctc ctggagaatc cgccagactc acctgcacct tgcccagtga catcaatgtt 120 ggtagctaca acatatactg gtaccagcag aagccaggga gccctcccag gtatctcctg 180 tactactact cagactcaga taagggccag ggctctggag tccccagccg cttctctgga 240 tccaaagatg cttcagccaa tacagggatt ttactcatct ccgggctcca gtctgaggat 300 gaggctgact attactgtat gatttggcca agcaatgatg gcagttagag tgtcgtcgac 360 tgtttggtga ggggacggag ctgaccgtcc tagatgagtc ttttccccct ccttccctgg 420 tctccccaag gtactgggaa attttctgct gcttttgttc tggcagttag agtgtcctga 480 tggcgcgagg gaggc 495 <210> 5988 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 5988 gccttgccag cccgctcagc agtccaaaga gtgtctgtgc tgactcagcc aacctccctc 60 tcagcatctc ctggagcatc agccagattc acctgcacct tgcgcagcgg catcaatgtt 120 ggtacctaca ggatatactg gtaccagcag aatccaggga gtcttccccg 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Synthetic polynucleotide" <400> 5991 gccttgccag cccgctcaga tccatggaga gtgtcagggt ccaattctca gactgtggtg 60 actcaggagc cctcactgac tgtgtcccca ggagggacag tcactctcac ctgtgcttcc 120 agcactggag cagtcaccag tggttactat ccaaactggt tccagcagaa acctggacaa 180 gcacccaggg cactgattta tagtacaagc aacaaacact cctggacccc tgcccggttc 240 tcaggctccc tccttggggg caaagctgcc ctgacactgt caggtgtgca gcctgaggac 300 gaggctgagt attactgcct gctctactat ggtggtgaat ccatggagag tgtcgtcgac 360 tgtttggtga ggggacggag ctgaccgtcc tagatgagtc ttttccccct ccttccctgg 420 tctccccaag gtactgggaa attttctgct gcttttgttc atccatggag agtgtcctga 480 tggcgcgagg gaggc 495 <210> 5992 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 5992 gccttgccag cccgctcagg tagcagtaga gtgtcagggt ccaattccca ggctgtggtg 60 actcaggagc cctcactgac tgtgtcccca ggagggacag tcactctcac ctgtggctcc 120 agcactggag ctgtcaccag tggtcattat ccctactggt tccagcagaa gcctggccaa 180 gcccccagga cactgattta tgatacaagc aacaaacact cctggacacc tgcccggttc 240 tcaggctccc tccttggggg caaagctgcc ctgacccttt tgggtgcgca gcctgaggat 300 gaggctgagt attactgctt gctctcctat agtggtgagt agcagtagag tgtcgtcgac 360 tgtttggtga ggggacggag ctgaccgtcc tagatgagtc ttttccccct ccttccctgg 420 tctccccaag gtactgggaa attttctgct gcttttgttc gtagcagtag agtgtcctga 480 tggcgcgagg gaggc 495 <210> 5993 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 5993 gccttgccag cccgctcaga tcttcgtaga gtgtcgagtg gattctcaga ctgtggtgac 60 ccaggagcca tcgttctcag tgtcccctgg agggacagtc acactcactt gtggcttgag 120 ctctggctca gtctctacta gttactaccc cagctggtac cagcagaccc caggccaggc 180 tccacgcacg ctcatctaca gcacaaacac tcgctcttct ggggtccctg attgcttctc 240 tggctccatc cttgggaaca aagctgccct caccatcacg ggggcccagg cagatgatga 300 atctgattat tactgtgtgc tgtatatggg tagtgtgaat cttcgtagag tgtcgtcgac 360 tgtttggtga ggggacggag ctgaccgtcc tagatgagtc ttttccccct 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<400> 5995 gccttgccag cccgctcaga tgacaccaga gtgtctgtca gtggtccagg cagggctgac 60 tcagccaccc tcggtctcca agggcttgag acagaccgcc acactcacct gcactgggaa 120 cagcaacaat gttggcaacc aaggagcagc ttggcctgag cagcaccagg gccaccctcc 180 caaactccta tcctacagga ataacaaccg gccctcaggg atctcagaga gattatctgc 240 atccaggtca ggaaacacag cctccctgac cattactgga ctccagcctg aggacgaggc 300 tgactattac tgctcagcat gggacagcag cctcatgaat gacaccagag tgtcgtcgac 360 tgtttggtga ggggacggag ctgaccgtcc tagatgagtc ttttccccct ccttccctgg 420 tctccccaag gtactgggaa attttctgct gcttttgttc atgacaccag agtgtcctga 480 tggcgcgagg gaggc 495 <210> 5996 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 5996 gccttgccag cccgctcagc ttcacgaaga gtgtccgtgc tgactcagcc gccctctctg 60 tctgcatccc cgggagcaac agccagactc ccctgcaccc tgagcagtga cctcagtgtt 120 ggtggtaaaa acatgttctg gtaccagcag aagccaggga gctctcccag gttattcctg 180 tatcactact cagactcaga caagcagctg ggacctgggg tccccagtcg agtctctggc 240 tccaaggaga cctcaagtaa cacagcgttt ttgctcatct ctgggctcca gcctgaggac 300 gaggccgatt attactgcca ggtgtacgaa agtagtgact tcacgaagag tgtcgtcgac 360 tgtttggtga ggggacggag ctgaccgtcc tagatgagtc ttttccccct ccttccctgg 420 tctccccaag gtactgggaa attttctgct gcttttgttc cttcacgaag agtgtcctga 480 tggcgcgagg gaggc 495 <210> 5997 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 5997 gccttgccag cccgctcagt aggagacgtt ccgaaggtcc tgggcccagt ctgtgctgac 60 tcagccaccc tcggtgtctg aagcccccag gcagagggtc accatctcct gttctggaag 120 cagctccaac atcggaaata atgctgtaaa ctggtaccag cagctcccag gaaaggctcc 180 caaactcctc atctattatg atgatctgct gccctcaggg gtctctgacc gattctctgg 240 ctccaagtct ggcacctcag cctccctggc catcagtggg ctccagtctg aggatgaggc 300 tgattattac tgtgcagcat gggatgacag cctgatgata ggagacgttc cgaagtcgac 360 tgttcggcag tggcaccaag gtgaccgtcc tcggtgagtc cccttttcta ttcttttggg 420 tctagggtga 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ccctactggt tccagcagaa gcctggccaa 180 gcccccagga cactgattta tgatacaagc aacaaacact cctggacacc tgcccggttc 240 tcaggctccc tccttggggg caaagctgcc ctgacccttt tgggtgcgca gcctgaggat 300 gaggctgagt attactgctt gctctcctat agtggtgagt agcagtgttc cgaagtcgac 360 tgttcggcag tggcaccaag gtgaccgtcc tcggtgagtc cccttttcta ttcttttggg 420 tctagggtga gatctgggga gacttttctg tcctttctgt gtagcagtgt tccgaactga 480 tggcgcgagg gaggc 495 <210> 6028 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 6028 gccttgccag cccgctcaga tcttcgtgtt ccgaagagtg gattctcaga ctgtggtgac 60 ccaggagcca tcgttctcag tgtcccctgg agggacagtc acactcactt gtggcttgag 120 ctctggctca gtctctacta gttactaccc cagctggtac cagcagaccc caggccaggc 180 tccacgcacg ctcatctaca gcacaaacac tcgctcttct ggggtccctg attgcttctc 240 tggctccatc cttgggaaca aagctgccct caccatcacg ggggcccagg cagatgatga 300 atctgattat tactgtgtgc tgtatatggg tagtgtgaat cttcgtgttc cgaagtcgac 360 tgttcggcag 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Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 6030 gccttgccag cccgctcaga tgacaccgtt ccgaatgtca gtggtccagg cagggctgac 60 tcagccaccc tcggtctcca agggcttgag acagaccgcc acactcacct gcactgggaa 120 cagcaacaat gttggcaacc aaggagcagc ttggcctgag cagcaccagg gccaccctcc 180 caaactccta tcctacagga ataacaaccg gccctcaggg atctcagaga gattatctgc 240 atccaggtca ggaaacacag cctccctgac cattactgga ctccagcctg aggacgaggc 300 tgactattac tgctcagcat gggacagcag cctcatgaat gacaccgttc cgaagtcgac 360 tgttcggcag tggcaccaag gtgaccgtcc tcggtgagtc cccttttcta ttcttttggg 420 tctagggtga gatctgggga gacttttctg tcctttctgt atgacaccgt tccgaactga 480 tggcgcgagg gaggc 495 <210> 6031 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 6031 gccttgccag cccgctcagc ttcacgagtt ccgaacgtgc tgactcagcc gccctctctg 60 tctgcatccc cgggagcaac agccagactc ccctgcaccc tgagcagtga cctcagtgtt 120 ggtggtaaaa acatgttctg gtaccagcag aagccaggga gctctcccag 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Synthetic polynucleotide" <400> 6034 gccttgccag cccgctcagg tacagtgcgt tacttggtcc tgggcccagt ctgtgctgac 60 tcagccaccc tcagcgtctg ggacccccgg gcagagggtc accatctctt gttctggaag 120 cagctccaac atcggaagta atactgtaaa ctggtaccag cagctcccag gaacggcccc 180 caaactcctc atctatagta ataatcagcg gccctcaggg gtccctgacc gattctctgg 240 ctccaagtct ggcacctcag cctccctggc catcagtggg ctccagtctg aggatgaggc 300 tgattattac tgtgcagcat gggatgacag cctgatgagt acagtgcgtt acttgtcgac 360 tgttcggagg aggcacccag ctgaccgtcc tcggtaagtc tccccgcttc tctcctcttt 420 gagatcccaa gttaaacacg gggagttttt ccctttcctg gtacagtgcg ttacttctga 480 tggcgcgagg gaggc 495 <210> 6035 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 6035 gccttgccag cccgctcagg gatcatccgt tacttggtcc tgggcccagt ctgtgctgac 60 tcagccaccc tcagcgtctg ggacccccgg gcagagggtc accatctctt gttctggaag 120 cagctccaac atcggaagta attatgtata ctggtaccag cagctcccag gaacggcccc 180 caaactcctc 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Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 6073 gccttgccag cccgctcagt attggcggac actctccaat ctcaggtgcc agatgtgaca 60 tccagatgac ccagtctcca tcctcactgt ctgcatctgt aggagacaga gtcaccatca 120 cttgtcgggc gagtcagggc attagcaatt atttagcctg gtttcagcag aaaccaggga 180 aagcccctaa gtccctgatc tatgctgcat ccagtttgca aagtggggtc ccatcaaagt 240 tcagcggcag tggatctggg acagatttca ctctcaccat cagcagcctg cagcctgaag 300 attttgcaac ttattactgc caacagtata atagttgata ttggcggaca ctctgtcgac 360 cgttcggcca agggaccaag gtggaaatca aacgtgagta gaatttaaac tttgcttcct 420 cagttgtctg tgtcttctgt tccctgtgtc tatgaagtga tattggcgga cactctctga 480 tggcgcgagg gaggc 495 <210> 6074 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 6074 gccttgccag cccgctcaga ggcttgagac actctccaat ctcaggtgcc aggtgtgaca 60 tccagatgac ccagtctcca tcctccctgt ctgcatctgt aggagacaga gtcaccatca 120 cttgccgggc aagtcagggc attagaaatg atttaggctg gtatcagcag 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Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 6116 gccttgccag cccgctcagt atcgctcttc ggaacccata atcagatacc agggcagaaa 60 cgacactcac gcagtctcca gcattcatgt cagcgactcc aggagacaaa gtcaacatct 120 cctgcaaagc cagccaagac attgatgatg atatgaactg gtaccaacag aaaccaggag 180 aagctgctat tttcattatt caagaagcta ctactctcgt tcctggaatc ccacctcgat 240 tcagtggcag cgggtatgga acagatttta ccctcacaat taataacata gaatctgagg 300 atgctgcata ttacttctgt ctacaacatg ataattgata tcgctcttcg gaacgtcgac 360 acttttggcc aggggaccaa gctggagatc aaacgtaagt acttttttcc actgattctt 420 cactgttgct aattagttta ctttgtgttc ctttgtgtgg tatcgctctt cggaacctga 480 tggcgcgagg gaggc 495 <210> 6117 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 6117 gccttgccag cccgctcagg ttccgaaaag taacgccaat ctcaggtgcc aaatgtgaca 60 tccagatgac ccagtctcct tccaccctgt ctgcatctgt aggagacaga gtcaccatca 120 cttgccgggc cagtcagagt attagtagct ggttggcctg gtatcagcag 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Synthetic polynucleotide" <400> 6120 gccttgccag cccgctcagg tgtctacaag taacgccaat ctcaggtgcc agatgtgaca 60 tccagttgac ccagtctcca tccttcctgt ctgcatctgt aggagacaga gtcaccatca 120 cttgccgggc cagtcagggc attagcagtt atttagcctg gtatcagcaa aaaccaggga 180 aagcccctaa gctcctgatc tatgctgcat ccactttgca aagtggggtc ccatcaaggt 240 tcagcggcag tggatctggg acagaattca ctctcacaat cagcagcctg cagcctgaag 300 attttgcaac ttattactgt caacagctta atagttgagt gtctacaagt aacggtcgac 360 ctttcggccc tgggaccaaa gtggatatca aacgtaagta catctgtctc aattattcgt 420 gagattttag tgccattgta tcatttgtgc aagttttgtg gtgtctacaa gtaacgctga 480 tggcgcgagg gaggc 495 <210> 6121 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 6121 gccttgccag cccgctcagg tacagtgaag taacgccaat ctcaggttcc agatgcgaca 60 tccagatgac ccagtctcca tcttccgtgt ctgcatctgt aggagacaga gtcaccatca 120 cttgtcgggc gagtcagggt attagcagct ggttagcctg gtatcagcag aaaccaggga 180 aagcccctaa 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Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 6159 gccttgccag cccgctcagc actgtacgtc tcctagagga tattgtgatg acccagactc 60 cactctccct gcccgtcacc cctggagagc cggcctccat ctcctgcagg tctagtcaga 120 gcctcttgga tagtgatgat ggaaacacct atttggactg gtacctgcag aagccagggc 180 agtctccaca gctcctgatc tatacgcttt cctatcgggc ctctggagtc ccagacaggt 240 tcagtggcag tgggtcaggc actgatttca cactgaaaat cagcagggtg gaggctgagg 300 atgttggagt ttattactgc atgcaacgta tagagtgaca ctgtacgtct cctagtcgac 360 ctttcggcgg agggaccaag gtggagatca aacgtaagtg cactttccta atgctttttc 420 ttataaggtt ttaaatttgg agcgtttttg tgtttgagat cactgtacgt ctcctactga 480 tggcgcgagg gaggc 495 <210> 6160 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 6160 gccttgccag cccgctcagg atgatccgtc tcctaatctc agataccacc ggagaaattg 60 taatgacaca gtctccagcc accctgtctt tgtctccagg ggaaagagcc accctctcct 120 gcagggccag tcagagtgtt agcagcagct acttatcctg gtaccagcag 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primer" <400> 6241 gggctggcaa gccacgtttg gtgtgaaggc tacgtgtctg ccaagag 47 <210> 6242 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 6242 gggctggcaa gccacgtttg gtgctcatct caatgcccca agaacgc 47 <210> 6243 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 6243 gggctggcaa gccacgtttg gtgagatctc tgatggatac agtgtctctc gaca 54 <210> 6244 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 6244 gggctggcaa gccacgtttg gtgagatctt tcctctgagt caacagtctc cagaata 57 <210> 6245 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 6245 gggctggcaa gccacgtttg gtgcactgaa aaaggagata tctctgaggg gtatcatg 58 <210> 6246 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> 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primer" <400> 6255 ccgggagctg catgtgtcag aggataccca agacagagag ctgggttcc 49 <210> 6256 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 6256 ccgggagctg catgtgtcag aggaacttac ctaggatgga gagtcgagtc cc 52 <210> 6257 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 6257 ccgggagctg catgtgtcag aggctgtcac agtgagcctg gtccc 45 <210> 6258 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 6258 ccgggagctg catgtgtcag aggcacggtg agccgtgtcc c 41 <210> 6259 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 6259 ccgggagctg catgtgtcag aggccagtac ggtcagccta gagcc 45 <210> 6260 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> 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Synthetic primer" <400> 6335 gggctggcaa gccacgtttg gtgccccagg acagatgacc aggatcacct g 51 <210> 6336 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 6336 gggctggcaa gccacgtttg gtgccctagg acagatggcc aggatcacct g 51 <210> 6337 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 6337 gggctggcaa gccacgtttg gtggtgtctg tggacagtca gcaagggtaa cctg 54 <210> 6338 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 6338 gggctggcaa gccacgtttg gtgggccttg ggacagacag tcaggatcac atg 53 <210> 6339 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 6339 gggctggcaa gccacgtttg gtgccccagg aaagacggcc aggattacct g 51 <210> 6340 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial 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of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 6378 ctcagtga 8 <210> 6379 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 6379 gtgtctac 8 <210> 6380 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 6380 agtaccga 8 <210> 6381 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 6381 ttgcctca 8 <210> 6382 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 6382 tcgttagc 8 <210> 6383 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 6383 tggacatg 8 <210> 6384 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> 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Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 6407 tgagacct 8 <210> 6408 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 6408 gatggctt 8 <210> 6409 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 6409 gcatctga 8 <210> 6410 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 6410 gacactct 8 <210> 6411 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 6411 tgctacac 8 <210> 6412 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 6412 tcagcttg 8 <210> 6413 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> 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of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 6467 agataaagga gaagtccccg atggcta 27 <210> 6468 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 6468 gatactgaca aaggagaagt ctcagatggc tatag 35 <210> 6469 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 6469 ctaaggatcg attttctgca gagaggctc 29 <210> 6470 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 6470 ttgattctca gcacagatgc ctgatgt 27 <210> 6471 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 6471 attctcagct gagaggcctg atgg 24 <210> 6472 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 6472 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Sequence: Synthetic primer" <400> 6483 tgaaggctac gtgtctgcca agag 24 <210> 6484 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 6484 ctcatctcaa tgccccaaga acgc 24 <210> 6485 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 6485 agatctctga tggatacagt gtctctcgac a 31 <210> 6486 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 6486 agatctttcc tctgagtcaa cagtctccag aata 34 <210> 6487 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 6487 cactgaaaaa ggagatatct ctgaggggta tcatg 35 <210> 6488 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 6488 gttcctgaag 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of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 6510 cctaagccag gggcagaccc gagt 24 <210> 6511 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 6511 acagtgtcac agagtccatc aaaaacccat gcctgg 36 <210> 6512 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 6512 cactatccac ataagcgagg gacagacccg agt 33 <210> 6513 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 6513 tgccctcgat ggcaggcgga 20 <210> 6514 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 6514 cctcttccag gacagtcctc agtggcatca cag 33 <210> 6515 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 6515 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Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 6531 ctggagagcc ggcctccatc tcttg 25 <210> 6532 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 6532 tcttccttgg agagccatcc tccatttcct g 31 <210> 6533 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 6533 ggacagccgg cctccatctc ctg 23 <210> 6534 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 6534 tggagagccg gcctccatct cctg 24 <210> 6535 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 6535 ataatatttg tacataactt tgtacttcat ctcctg 36 <210> 6536 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 6536 cccctggaaa 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Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 6563 ccacaaggca gaggctcact gtctcctg 28 <210> 6564 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 6564 gtctcctgga cagtcagtca ccatctcctg 30 <210> 6565 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 6565 gtctcctgga cagtcgatca ccatctcctg 30 <210> 6566 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 6566 tcctggacag tcggtcacca tctcctg 27 <210> 6567 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 6567 ctgggacttg gggtaaacag tcaccatctt ctg 33 <210> 6568 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 6568 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ctgcagactc atgaggagtc gccc 24

Claims (46)

1. 포유동물 대상체의 림프계 세포로부터 수득된 생물학적 샘플에서 각각 가변 영역 및 결합 영역을 포함하는 하나 이상의 적응 면역 수용체를 암호화하는 재배열된 핵산 서열을 증폭시키기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트의 증폭 효율을 표준화하기 위한 조성물이며, 각각 증폭 이전에 알려진 농도 및 하기 일반식 (I)의 올리고뉴클레오티드 서열을 갖는 복수개의 합성 주형 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물:
   <일반식 (I)>
   5'-U1-B1-V-B2-R-B3-J-B4-U2-3'
   상기 식에서,
   (a) V는 적응 면역 수용체 가변 (V) 영역 암호화 유전자 서열의 20개 이상 내지 1000개 이하의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열 또는 그의 상보적 서열이고, 각각의 V는 특유의 V-영역 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하며;
   (b) J는 적응 면역 수용체 결합 (J) 영역 암호화 유전자 서열의 15개 이상 내지 600개 이하의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열 또는 그의 상보적 서열이고, 각각의 J는 특유의 J-영역 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하며;
   (c) U1은 부재하거나, 또는
   (i) 제1 범용 어댑터 올리고뉴클레오티드 서열, 및
   (ii) 제1 범용 어댑터 올리고뉴클레오티드 서열에 연결되고 5'에 위치되는 제1 서열분석 플랫폼-특이적 올리고뉴클레오티드 서열
   로부터 선택되는 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하고;
   (d) U2는 부재하거나, 또는
   (i) 제2 범용 어댑터 올리고뉴클레오티드 서열, 및
   (ii) 제2 범용 어댑터 올리고뉴클레오티드 서열에 연결되고 5'에 위치되는 제2 서열분석 플랫폼-특이적 올리고뉴클레오티드 서열
   로부터 선택되는 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하고;
   (e) B1, B2, B3, 및 B4 중 적어도 하나가 존재하고
   B1, B2, B3, 및 B4 각각은,
   (i) 상기 (a)의 특유의 V-영역 올리고뉴클레오티드 서열, 및
   (ii) 상기 (b)의 특유의 J-영역 올리고뉴클레오티드 서열
   을 쌍체 조합으로서 특유하게 동정하는, 3-25개의 인접 뉴클레오티드의 바코드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하고;
   (f) R은 부재하거나, 또는 (a)-(e)에 없는 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는 제한 효소 인식 부위를 포함하고,
   여기서,
   (g) 복수개의 합성 주형 올리고뉴클레오티드는 a개 이상 또는 b개 이상의 수의 특유의 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 a는 대상체에서 특유의 적응 면역 수용체 V 영역-암호화 유전자 절편의 수이고, b는 대상체에서 특유의 적응 면역 수용체 J 영역-암호화 유전자 절편의 수이고,
   상기 복수개의 합성 주형 올리고뉴클레오티드는,
   (1) V 올리고뉴클레오티드 서열이
   서열 번호: 2921-2988에 명기된 바와 같은 TCRB V 서열,
   서열 번호: 3002-3015에 명기된 바와 같은 TCRG V 서열, 및
   서열 번호: 3021-3147에 명기된 바와 같은 IGH V 서열
   로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖고,
   J 올리고뉴클레오티드 서열이
   서열 번호: 2989-3001에 명기된 바와 같은 TCRB J 서열,
   서열 번호: 3016-3020에 명기된 바와 같은 TCRG J 서열, 및
   서열 번호: 3148-3156에 명기된 바와 같은 IGH J 서열
   로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는 것
   인 일반식 (I)의 복수개의 올리고뉴클레오티드 서열;
   (2) 서열 번호: 3157-4014에 명기된 바와 같은 일반식 (I)의 복수개의 올리고뉴클레오티드 서열;
   (3) 서열 번호: 4015-4084에 명기된 바와 같은 일반식 (I)의 복수개의 올리고뉴클레오티드 서열;
   (4) 서열 번호: 4085-5200에 명기된 바와 같은 일반식 (I)의 복수개의 올리고뉴클레오티드 서열;
   (5) 서열 번호: 5579-5821에 명기된 바와 같은 일반식 (I)의 복수개의 올리고뉴클레오티드 서열;
   (6) 서열 번호: 5822-6066에 명기된 바와 같은 일반식 (I)의 복수개의 올리고뉴클레오티드 서열; 및
   (7) 서열 번호: 6067-6191에 명기된 바와 같은 일반식 (I)의 복수개의 올리고뉴클레오티드 서열
   로부터 선택되는 일반식 (I)의 복수개의 서열을 갖는 것이고,
   각각의 특유의 V-영역 올리고뉴클레오티드 서열에 대해 1개 이상의 합성 주형 올리고뉴클레오티드 및 각각의 특유의 J-영역 올리고뉴클레오티드 서열에 대해 1개 이상의 합성 주형 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물.
2. 제1항에 있어서, a가 1 내지 대상체의 포유동물 게놈에서 최대 V 유전자 절편 수의 범위인 조성물.
3. 제1항에 있어서, b가 1 내지 대상체의 포유동물 게놈에서 최대 J 유전자 절편 수의 범위인 조성물.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, a가 1이거나 b가 1인 조성물.
5. 제1항에 있어서,
   복수개의 주형 올리고뉴클레오티드가 (a x b)개 이상의 특유의 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 a는 포유동물 대상체에서 특유의 적응 면역 수용체 V 영역-암호화 유전자 절편의 수이고, b는 포유동물 대상체에서 특유의 적응 면역 수용체 J 영역-암호화 유전자 절편의 수이고,
   V 영역-암호화 유전자 절편과 J 영역-암호화 유전자 절편의 모든 가능한 조합에 대해 1개 이상의 주형 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물.
6. 제1항에 있어서, J가 적응 면역 수용체 J 영역 암호화 유전자 서열의 불변 영역을 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 조성물.
7. 제1항에 있어서, 적응 면역 수용체가 TCRB, TCRG, IGH, IGK, 및 IGL로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
8. 삭제
9. 삭제
10. 제1항에 있어서, V와 B2 사이에 정지 코돈 서열을 추가로 포함하는 조성물.
11. 제1항에 있어서, 복수개의 합성 주형 올리고뉴클레오티드에서 각각의 합성 주형 올리고뉴클레오티드가 등몰량으로 존재하는 것인 조성물.
12. 삭제
13. 제1항에 있어서, V가 적응 면역 수용체 V 영역 암호화 유전자 서열의 20, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 또는 210개 이상 내지 1000, 900, 800, 700, 600 또는 500개 이하의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열 또는 그의 상보적 서열인 조성물.
14. 삭제
15. 제1항에 있어서, J가 적응 면역 수용체 J 영역 암호화 유전자 서열의 15, 16-30, 31-60, 61-90, 91-120, 또는 120-150개 이상 내지 600, 500, 400, 300 또는 200개 이하의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열 또는 그의 상보적 서열인 조성물.
16. 삭제
17. 제1항에 있어서, 각각의 합성 주형 올리고뉴클레오티드의 길이가 200 내지 1000개 범위의 뉴클레오티드인 조성물.
18. 제1항에 있어서, 복수 a'개의 특유의 V-절편 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 복수 b'개의 특유의 J-절편 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하는 하나 이상의 적응 면역 수용체를 암호화하는 재배열된 핵산 분자를 증폭시킬 수 있는 올리고뉴클레오티드 프라이머의 세트를 추가로 포함하고,
    여기서 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머의 세트가 서열 번호: 1631-1643, 서열 번호: 1644-1695, 서열 번호: 1732-1741, 서열 번호: 1742-1745, 서열 번호: 1753-1804, 서열 번호: 5201-5286, 서열 번호: 5287-5293, 서열 번호: 6192-6251, 서열 번호: 6252-6264, 서열 번호: 6265-6279, 서열 번호: 6280-6307, 서열 번호: 6308-6362, 서열 번호: 6363-6367, 및 서열 번호: 6368-6374의 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 조성물.
19. 제18항에 있어서, a'가 1 내지 포유동물 게놈에서 최대 V 유전자 절편 수의 범위이고, b'가 1 내지 포유동물 게놈에서 최대 J 유전자 절편 수의 범위인 조성물.
20. 제19항에 있어서, a'가 a인 조성물.
21. 제19항에 있어서, b'가 b인 조성물.
22. 제18항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트에서 각각의 V-절편 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 각각의 J-절편 올리고뉴클레오티드 프라이머가 복수개의 주형 올리고뉴클레오티드에서 1개 이상의 주형 올리고뉴클레오티드에 특이적으로 혼성화될 수 있는 것인 조성물.
23. 제18항에 있어서, 각각의 V-절편 올리고뉴클레오티드 프라이머가 1개 이상의 적응 면역 수용체 V 영역-암호화 유전자 절편에 상보적인 15개 이상의 인접 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 조성물.
24. 제18항에 있어서, 각각의 J-절편 올리고뉴클레오티드 프라이머가 1개 이상의 적응 면역 수용체 J 영역-암호화 유전자 절편에 상보적인 15개 이상의 인접 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 조성물.
25. 제18항에 있어서,
    각각의 V-절편 올리고뉴클레오티드 프라이머가 특이적으로 혼성화될 수 있는 일반식 (I)의 올리고뉴클레오티드 서열을 갖는 1개 이상의 합성 주형 올리고뉴클레오티드, 및
    각각의 J-절편 올리고뉴클레오티드 프라이머가 특이적으로 혼성화될 수 있는 일반식 (I)의 올리고뉴클레오티드 서열을 갖는 1개 이상의 주형 올리고뉴클레오티드
    를 포함하는 조성물.
26. 포유동물 대상체의 림프계 세포로부터 수득된 재배열된 핵산 분자를 포함하는 생물학적 샘플에서의 하나 이상의 적응 면역 수용체를 암호화하는 재배열된 핵산 분자를 증폭시킬 수 있는 올리고뉴클레오티드 프라이머의 세트의 구성원 중에서 불균일 핵산 증폭능을 측정하는 방법이며,
    (a) 복수개의 합성 주형 올리고뉴클레오티드, 및
    복수 a'개의 특유의 V-절편 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 복수 b'개의 특유의 J-절편 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하는 하나 이상의 적응 면역 수용체를 암호화하는 재배열된 핵산 분자를 증폭시킬 수 있는 올리고뉴클레오티드 프라이머의 세트
    를 포함하는 조성물을 단일의 다중 PCR 반응으로 증폭시켜 복수개의 증폭된 합성 주형 올리고뉴클레오티드를 수득하는 단계;
    (b) 상기 복수개의 증폭된 합성 주형 올리고뉴클레오티드를 서열분석하여 상기 복수개를 포함하는 각각의 특유의 합성 주형 올리고뉴클레오티드에 대해,
    (i) 합성 주형 올리고뉴클레오티드 서열, 및
    (ii) 상기 합성 주형 올리고뉴클레오티드 서열의 발생 빈도
    를 결정하는 단계; 및
    (c) 상기 합성 주형 올리고뉴클레오티드 서열 각각의 발생 빈도를 기대 분포와 비교하는 단계
    를 포함하고,
    여기서 상기 기대 분포는 상기 조성물을 포함하는 상기 복수개의 합성 주형 올리고뉴클레오티드의 예정된 몰비를 기반으로 하고,
    여기서 상기 합성 주형 올리고뉴클레오티드 서열의 상기 발생 빈도와 상기 기대 분포 사이의 편차는 올리고뉴클레오티드 증폭 프라이머의 세트의 구성원 중에서 불균일 핵산 증폭능을 나타내고,
    여기서 상기 합성 주형 올리고뉴클레오티드 각각이 제1항에 정의된 바와 같은 일반식 (I)의 올리고뉴클레오티드 서열을 갖는 것인 방법.
27. 제26항에 있어서, 상기 예정된 몰비가 등몰인 방법.
28. 제27항에 있어서, 상기 기대 분포가 올리고뉴클레오티드 프라이머의 상기 세트에 의해 증폭된 주형 올리고뉴클레오티드의 상기 세트에 관한 균일 증폭 수준을 포함하는 것인 방법.
29. 제26항에 있어서, 각각의 증폭된 합성 주형 핵산 분자의 길이가 70 내지 1000개 범위의 뉴클레오티드인 방법.
30. 제26항에 있어서, 기대 분포에 비해 불균일 증폭능을 나타내는 올리고뉴클레오티드 프라이머의 세트의 각각의 구성원에 대해, 올리고뉴클레오티드 증폭 프라이머의 세트에서 올리고뉴클레오티드 프라이머 구성원의 상대적 표시를 조정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
31. 제30항에 있어서, 상기 조정하는 단계가, 올리고뉴클레오티드 프라이머의 세트에서 상기 구성원의 상대적 표시를 증가시키고, 그로 인해 올리고뉴클레오티드 프라이머의 세트의 구성원 중에서 불균일 핵산 증폭능을 보정하는 것을 포함하는 것인 방법.
32. 제30항에 있어서, 상기 조정하는 단계가, 올리고뉴클레오티드 프라이머의 세트에서 상기 구성원의 상대적 표시를 감소시키고, 그로 인해 올리고뉴클레오티드 프라이머의 세트의 구성원 중에서 불균일 핵산 증폭능을 보정하는 것을 포함하는 것인 방법.
33. 제26항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머가 V-영역 위유전자(pseudogene) 또는 오르폰(orphon)에 또는 J-영역 위유전자 또는 오르폰에 특이적으로 혼성화되지 않는 것인 방법.
34. 제26항에 있어서, 기대 분포에 비해 불균일 증폭능을 나타내는 올리고뉴클레오티드 증폭 프라이머의 세트의 각각의 구성원에 대해, 상기 구성원에 의해 촉진되어 증폭된 주형 핵산 분자의 비례해서 증가 또는 감소된 발생 빈도를 계산하고, 그로 인해 올리고뉴클레오티드 프라이머의 세트의 구성원 중에서 불균일 핵산 증폭능을 보정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
35. 포유동물 대상체의 림프계 세포로부터의 재배열된 핵산 분자를 포함하는 생물학적 샘플에서 각각 가변 (V) 영역 및 결합 (J) 영역을 포함하는 하나의 또는 복수개의 적응 면역 수용체를 암호화하는 복수개의 재배열된 핵산 분자를 정량화하는 방법이며,
    (A) (1) 포유동물 대상체의 림프계 세포를 포함하는 생물학적 샘플로부터 수득된 재배열된 핵산 분자,
    (2) 복수개의 합성 주형 올리고뉴클레오티드, 및
    복수 a'개의 특유의 V-절편 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 복수 b'개의 특유의 J-절편 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하는 하나 이상의 적응 면역 수용체를 암호화하는 재배열된 핵산 분자를 증폭시킬 수 있는 올리고뉴클레오티드 프라이머의 세트
    를 포함하고, 여기서 특유의 올리고뉴클레오티드 서열을 갖는 복수개의 주형 올리고뉴클레오티드 각각의 알려진 수가 존재하는 것인 조성물, 및
    (3) 생물학적 샘플로부터의 하나의 또는 복수개의 적응 면역 수용체를 암호화하는 재배열된 핵산 분자를 증폭시킬 수 있는 올리고뉴클레오티드 증폭 프라이머 세트
    를 포함하는 단일의 다중 중합효소 연쇄 반응 (PCR)으로 재배열된 핵산 분자를 증폭시키는 단계이며,
    여기서의 프라이머 세트는,
    (a) 실질적으로 등몰량의, 각각 독립적으로 적응 면역 수용체 V-영역 폴리펩티드를 암호화하는 1개 이상의 폴리뉴클레오티드에 또는 그의 상보적 서열에 특이적으로 혼성화될 수 있는 복수개의 V-절편 올리고뉴클레오티드 프라이머이며, 여기서 각각의 V-절편 프라이머는 1개 이상의 기능성 적응 면역 수용체 V 영역-암호화 유전자 절편에 상보적인 15개 이상의 인접 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 여기서 복수개의 V-절편 프라이머는 상기 조성물에 존재하는 실질적으로 모든 기능성 적응 면역 수용체 V 영역-암호화 유전자 절편에 특이적으로 혼성화되는 것인 복수개의 V-절편 올리고뉴클레오티드 프라이머, 및
    (b) 실질적으로 등몰량의, 각각 독립적으로 적응 면역 수용체 J-영역 폴리펩티드를 암호화하는 1개 이상의 폴리뉴클레오티드에 또는 그의 상보적 서열에 특이적으로 혼성화될 수 있는 복수개의 J-절편 올리고뉴클레오티드 프라이머이며, 여기서 각각의 J-절편 프라이머는 1개 이상의 기능성 적응 면역 수용체 J 영역-암호화 유전자 절편에 상보적인 15개 이상의 인접 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 여기서 복수개의 J-절편 프라이머는 상기 조성물에 존재하는 실질적으로 모든 기능성 적응 면역 수용체 J 영역-암호화 유전자 절편에 특이적으로 혼성화되는 것인 복수개의 J-절편 올리고뉴클레오티드 프라이머
    를 포함하고,
    여기서, V-절편 및 J-절편 올리고뉴클레오티드 프라이머는 상기 단일의 다중 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에서
    (i) 조성물 중 실질적으로 모든 합성 주형 올리고뉴클레오티드를 증폭시켜서 다수의 증폭된 합성 주형 올리고뉴클레오티드를 생성할 수 있고, 여기서 상기 다수의 증폭된 합성 주형 핵산 분자는 조성물 중 합성 주형 올리고뉴클레오티드의 다양성을 정량화하기에 충분하며,
    (ii) 생물학적 샘플에서의 적응 면역 수용체를 암호화하는 실질적으로 모든 재배열된 핵산 분자를 증폭시켜서 다수의 증폭된 재배열된 DNA 분자를 생성할 수 있고, 여기서 상기 다수의 증폭된 재배열된 핵산 분자는 생물학적 샘플로부터의 DNA 중 재배열된 핵산 분자의 다양성을 정량화하기에 충분하고,
    여기서, 복수개의 증폭된 합성 주형 올리고뉴클레오티드 및 복수개의 증폭된 재배열된 핵산 분자 중 각각의 증폭된 핵산 분자의 길이가 1000개 미만의 뉴클레오티드인 단계;
    (B) 상기 증폭된 합성 주형 올리고뉴클레오티드 및 상기 증폭된 재배열된 핵산 분자를 정량적으로 서열분석하여
    (i) 1개 이상의 올리고뉴클레오티드 바코드 서열을 함유하는 증폭된 합성 주형 올리고뉴클레오티드의 주형 생성물 수, 및
    (ii) 올리고뉴클레오티드 바코드 서열이 결여된 증폭된 재배열된 핵산 분자의 재배열된 생성물 수
    를 정량화하는 단계;
    (C) 상기 (B)(i)의 주형 생성물 수를, 상기 (A)(2)의 특유의 올리고뉴클레오티드 서열을 갖는 복수개의 합성 주형 올리고뉴클레오티드 각각의 알려진 수로 나누어 증폭 인자를 계산하는 단계; 및
    (D) 상기 (B)(ii)의 재배열된 생성물 수를, 상기 (C)에서 계산된 증폭 인자로 나누어 샘플 중의 특유의 적응 면역 수용체 암호화 재배열된 핵산 분자의 수를 정량화하는 단계
    를 포함하고,
    여기서 상기 합성 주형 올리고뉴클레오티드 각각이 제1항에 정의된 바와 같은 일반식 (I)의 올리고뉴클레오티드 서열을 갖는 것인 방법.
36. 제35항에 있어서, 샘플 중의 특유의 적응 면역 수용체 암호화 재배열된 핵산 분자의 상기 정량화된 수가 샘플 중의 특유의 B 세포 또는 특유의 T 세포 게놈 주형의 수인 방법.
37. 다중 PCR 검정에서의 평균 증폭 인자를 계산하는 방법이며,
    포유동물 대상체의 림프계 세포로부터 분리된, 재배열된 핵산 분자를 포함하는 샘플을 제공하는 단계;
    상기 샘플을
    복수개의 합성 주형 올리고뉴클레오티드, 및
    복수 a'개의 특유의 V-절편 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 복수 b'개의 특유의 J-절편 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하는 하나 이상의 적응 면역 수용체를 암호화하는 재배열된 핵산 분자를 증폭시킬 수 있는 올리고뉴클레오티드 프라이머의 세트
    를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계;
    단일의 다중 PCR 반응으로 상기 복수개의 V-절편 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 상기 복수개의 J-절편 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 복수개의 합성 주형 올리고뉴클레오티드 및 재배열된 핵산 분자를 증폭시켜 복수개의 증폭된 합성 주형 올리고뉴클레오티드 및 복수개의 증폭된 재배열된 핵산 분자를 수득하는 단계;
    상기 복수개의 증폭된 합성 주형 올리고뉴클레오티드를 서열분석하여 상기 복수개를 포함하는 각각의 특유의 합성 주형 올리고뉴클레오티드에 대해,
    (i) 합성 주형 올리고뉴클레오티드 서열, 및
    (ii) 상기 합성 주형 올리고뉴클레오티드 서열의 발생 빈도
    를 결정하는 단계; 및
    상기 복수개의 증폭된 합성 주형 올리고뉴클레오티드 각각의 평균 카피수 및 상기 합성 주형 올리고뉴클레오티드의 상기 알려진 양을 기반으로, 상기 단일의 다중 PCR 반응에 대한 상기 평균 증폭 인자를 결정하는 단계
    를 포함하고,
    여기서 상기 합성 주형 올리고뉴클레오티드 각각이 제1항에 정의된 바와 같은 일반식 (I)의 올리고뉴클레오티드 서열을 갖는 것인 방법.
38. 제37항에 있어서,
    상기 복수개의 증폭된 재배열된 핵산 분자를 서열분석하여 상기 복수개를 포함하는 각각의 특유의 재배열된 핵산 분자에 대해,
    (i) 재배열된 핵산 분자 서열, 및
    (ii) 상기 재배열된 핵산 분자 서열의 발생 수
    를 결정하는 단계; 및
    상기 단일의 다중 PCR 반응에 대한 평균 증폭 인자 및 상기 재배열된 핵산 분자의 상기 발생 수를 기반으로 상기 샘플 중의 림프계 세포의 수를 결정하는 단계
    를 추가로 포함하는 방법.
39. 제38항에 있어서, 상기 샘플 중의 림프계 세포의 수를 결정하는 단계가, 상기 증폭된 재배열된 핵산 서열 각각의 발생 수의 합계를 산출하고 상기 합계를 상기 평균 증폭 인자로 나누는 것을 포함하는 것인 방법.
40. 제37항에 있어서, 상기 알려진 양이 상기 주형 올리고뉴클레오티드 각각의 1개의 카피인 방법.
41. 제40항에 있어서, 100 < a <500인 방법.
42. 제40항에 있어서, 100 < b <500인 방법.
43. 포유동물 대상체의 림프계 세포로부터 수득된 재배열된 핵산 분자를 포함하는 생물학적 샘플에서의 하나의 또는 복수개의 적응 면역 수용체를 암호화하는 재배열된 핵산 분자를 정량화하기 위해 단일의 다중 PCR 증폭 반응에서 증폭 바이어스를 보정하는 방법이며,
    (a) 상기 샘플을
    복수개의 합성 주형 올리고뉴클레오티드, 및
    복수 a'개의 특유의 V-절편 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 복수 b'개의 특유의 J-절편 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하는 하나 이상의 적응 면역 수용체를 암호화하는 재배열된 핵산 분자를 증폭시킬 수 있는 올리고뉴클레오티드 프라이머의 세트
    를 포함하는 조성물과 접촉시켜 주형-스파이킹된 샘플을 생성시키는 단계이며, 여기서의 상기 합성 주형 올리고뉴클레오티드 및 상기 재배열된 핵산 분자는 상응하는 V 및 J 영역 서열을 포함하는 것인 단계;
    (b) 상기 주형-스파이킹된 샘플을 상기 V-절편 및 J-절편 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하는 올리고뉴클레오티드 프라이머의 상기 세트를 사용하여 상기 단일의 다중 PCR 반응으로 증폭시켜 복수개의 증폭된 합성 주형 올리고뉴클레오티드, 및 복수개의 적응 면역 수용체를 암호화하는 복수개의 증폭된 재배열된 핵산 분자를 수득하는 단계;
    (c) 상기 복수개의 증폭된 합성 주형 올리고뉴클레오티드를 서열분석하여 상기 복수개를 포함하는 각각의 특유의 주형 올리고뉴클레오티드에 대해,
    (i) 합성 주형 올리고뉴클레오티드 서열, 및
    (ii) 상기 합성 주형 올리고뉴클레오티드 서열의 발생 빈도
    를 결정하는 단계;
    (d) 하나의 또는 복수개의 적응 면역 수용체를 암호화하는 상기 복수개의 증폭된 재배열된 핵산 분자를 서열분석하여 상기 복수개를 포함하는 상기 복수개의 적응 면역 수용체를 암호화하는 각각의 특유의 재배열된 핵산 분자에 대해,
    (i) 재배열된 핵산 분자 서열, 및
    (ii) 상기 재배열된 핵산 분자 서열의 발생 빈도
    를 결정하는 단계;
    (e) 상기 합성 주형 올리고뉴클레오티드 서열의 상기 발생 빈도를 기대 분포와 비교하는 단계이며,
    여기서 상기 기대 분포는 상기 조성물을 포함하는 상기 복수개의 합성 주형 올리고뉴클레오티드의 예정된 몰비를 기반으로 하고,
    여기서 상기 합성 주형 올리고뉴클레오티드 서열의 상기 발생 빈도와 상기 기대 분포 사이의 편차는 올리고뉴클레오티드 프라이머의 세트의 구성원 중에서 불균일 핵산 증폭능을 나타내는 것인 단계;
    (f) 상기 나타낸 불균일 핵산 증폭능을 갖는 올리고뉴클레오티드 프라이머의 세트의 상기 구성원에 의해 증폭된 합성 주형 올리고뉴클레오티드 서열 및 재배열된 핵산 분자 서열의 세트에 대한 보정값의 세트를 산출하는 단계이며, 여기서의 보정값의 상기 세트는 상기 다중 PCR 반응에서 증폭 바이어스를 보정하는 것인 단계; 및
    (g) 임의로, 보정값의 상기 세트를 상기 재배열된 핵산 분자 서열의 상기 발생 빈도에 적용하여 상기 다중 PCR 반응에서 증폭 바이어스를 보정하는 단계
    를 포함하고,
    여기서 상기 합성 주형 올리고뉴클레오티드 각각이 제1항에 정의된 바와 같은 일반식 (I)의 올리고뉴클레오티드 서열을 갖는 것인 방법.
44. 제18항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른, 상기 복수개의 합성 주형 올리고뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드 프라이머의 상기 세트를 포함하는 조성물을 포함하는 시약; 및
    포유동물 대상체의 림프계 세포로부터의 재배열된 핵산 분자를 포함하는 생물학적 샘플에서의 하나 이상의 적응 면역 수용체를 암호화하는 재배열된 핵산 분자를 증폭시킬 수 있는 올리고뉴클레오티드 프라이머의 세트의 구성원 중에서 불균일 핵산 증폭능을 측정하기 위한 사용 설명서
    를 포함하는 키트.
45. 제44항에 있어서, 불균일 핵산 증폭능을 갖는 올리고뉴클레오티드 프라이머의 세트의 하나 이상의 구성원을 보정하기 위한 사용 설명서를 추가로 포함하는 키트.
46. 제44항에 있어서, 샘플 중의 특유의 적응 면역 수용체 암호화 재배열된 핵산 분자의 수를 정량화하기 위한 사용 설명서를 추가로 포함하는 키트.
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    

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