CN102112624A - 用于对细胞进行空间分割以及筛选的组合物以及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种方法，用以在单独的微型反应器中从变体细胞的文库中对特定的成员进行分离，其中对由所述的细胞分泌出的生物分子所具有的表型进行评价，所述的评价是以多种参数为基础的，包括底物特异性以及动力学有效性。

Description

用于对细胞进行空间分割以及筛选的组合物以及方法
发明领域
本发明提供了一种方法，用以在单独的微型反应器中从变体细胞的文库中对特定的成员进行分离，其中对由所述的细胞编码得到的生物分子所具有的表型进行评价，所述的评价是以多种参数为基础的，包括底物特异性以及动力学有效性。
发明背景
酶越来越多的被用来作为催化剂用于工业，农业，医药产业以及科学研究中。由于它们所具有的底物特异性，化学选择性以及环境兼容性，酶在诸如下述的应用中提供了优势：手性纯化的医药品的合成，纺织品的加工，食品的加工，医学的诊断以及治疗，生物转化以及生物治理。在对高分子量聚合物进行修饰的方面，酶相较于传统的化学加工而言所具有的优越性已经被得以证实。
对生物分子的遗传变体的文库所进行的评价，需要同时对所生成的所述生物分子所具有的表型进行鉴定并且使所述的生物分子与编码所述生物分子的文库成员所具有的基因型相互关联起来，其目的在于对存在于所述文库中的具有期望的性质的具体成员进行识别，其中所述的生物分子例如是酶。通过这种方式，对期望的变体进行筛选并且对其进行进一步的评价。定向进化已经被证实在下述情形中是格外成功的：其中酶所具有的功能与细胞的存活有直接的联系，即，对一种重要的活性进行的恢复，其中所述的活性已经从另外一种野生型细胞中被删除了。然而，当在所述的酶是糖基转移酶(GTase)以及其他的转移酶的情形中时，这些本身不能够提供一种可供筛选的表型的酶的进化要困难的多。尽管用以对这种类型的酶进行进化的筛选策略确实存在，包括化学互补，噬菌体展示以及细菌细胞表面展示，当前的方法不能够提供一种容易得到的或者被归纳的策略，用以对多种多样的酶进行工程化处理。伴随着对新的生物分子的需求的增长，对于新的策略存在迫切的需求，其中所述的策略被用来对酶进行工程化处理，所述的酶具有改善的活性以及新的催化功能。
发明内容
本发明提供了一种方法，用以在单独的微型反应器中从变体细胞的文库中对特定的成员进行分离，其中对由所述的细胞编码得到的生物分子所具有的表型或者活性进行评价，所述的评价是以多种参数为基础的，包括底物特异性以及动力学有效性。
在一个方面，本发明涉及到用以对分泌产物的文库进行筛选的组合物以及方法，所述的筛选针对的是新的表型，包括具有改善的催化性质的酶或者改变的底物特异性的酶，其中使用了微孔，用以对生成所述酶的细胞进行空间上的分割。
在另外一个方面，本发明提供了用以在溶液相中实现生物分子的筛选的方法，例如，定向进化的生物分子的筛选，所述的方法包括：使一种细胞文库沉积在一种微型装置之上，其中在所述的微型装置中含有多个孔，所述的孔能够对存在于溶液中的所述细胞进行空间上的分割。所述的细胞以大约每孔一个细胞的水平分布，并且大量的细胞在所述的溶液中分泌出至少一种生物分子的变体。将这些被分泌出来的生物分子的变体与至少一种光学信号底物进行接触，每一种代表着一种期望的生物分子表型或者活性；并且以多种参数为基础，对由所述的细胞编码得到的所述生物分子所具有的表型进行评价。在一些情形中，所述的“光学信号底物”是一个或者多个单元的综合体，例如，一种抗体或者其他的特异性配体或者小分子标签，它们与一种可探测性的标记物发生了直接的共轭。例如，在一个两种要素的反应中(例如，通过一种转移酶催化的X+Y)，第一种要素，“Y”，受到一种抗体或者其他配体的捕获，其中所述的抗体或者其他配体被固定在一个表面例如一个培养板之上，并且利用一种光学底物对所述的第二种要素，“X”，进行探测，其中所述的光学底物例如是一种经过带有荧光素标签的抗体。在此之后，将分泌出一种期望的生物分子变体的所述细胞从所述的微型装置中分离出来。
任选的，通过下述方式对所述的表型进行评价：对一种或者多种光学信号随时间的变化进行探测，其中所述的光学信号是由存在于所述的细胞文库之中的一种或者多种光学信号底物产生的，其中这样的变化代表着所述的生物分子的变体所具有的期望的生物分子表型或者活性。本发明利用了各种不同的显色底物，荧光底物，发光底物以及荧光共振能量转移(FRET)底物，用以对生物学活性进行测量。许多供体/受体荧光共振能量转移(FRET)对是可以通过商业购买获得的。它们包括，但不局限于：5-羧基四甲基若丹明(TAMRA)/QSY-7(二芳基若丹明的衍生物)；尸胺/曙红；色氨酸/尸胺；荧光黄/德州粉红(若丹明)；萘/尸胺；尸胺/十八烷基若丹明(ODR)；硼-二吡咯亚甲基(BODIPY)/硼-二吡咯亚甲基(BODIPY)；铽/若丹明；尸胺/异硫氰酸荧光素(FITC)；嵌二萘(Pyrene)/香豆素；5-(2-碘乙酰基氨基乙基)氨基萘-1-磺酸(IAEDANS)/IAFBPE/Cy5；以及铕/Cy5。优选的，所述的光学信号是一种荧光信号。在一个方面，在所述的微型装置中以实时的方式或者近似于实时的方式对所述的生物分子的表型或者活性进行监测，其中所述的监测是以所述的荧光信号所具有的强度所发生的变化为基础的。
本发明提供的所述的生物分子是从由下述物质所组成的组中筛选出来的：分泌得到的分子，肽，多肽，酶例如蛋白酶，氧化还原酶，转移酶，水解酶，氢化酶，裂解酶，异构酶，连接酶，聚合酶，以及抗体，细胞因子，趋化因子，核酸，代谢产物，小分子(小于1千道尔顿)以及合成分子。例如，所述的生物分子所具有的分子量超过大约100道尔顿(Da)并且小于大约100000道尔顿。或者可供选择的，所述的生物分子所具有的分子量超过大约600道尔顿并且小于大约30000道尔顿；超过大约800道尔顿并且小于大约10000道尔顿；或者超过大约900道尔顿并且小于大约1000道尔顿。
在一种方法中，通过下述方式对所述的酶生物分子所具有的活性进行评价：对所述的酶或者其他的生物分子发挥作用的所述两种或者多种要素的端点处进行探测。例如，所述的酶将所述的要素连接在一起(例如，连接酶)或者对所述的要素进行分离(例如，裂解酶)。正如上文中所描述的，探测是通过使用荧光共振能量转移(FRET)对或者一种基于捕获的检测来实现的，在所述的检测中第一种要素是经过生物素化的(并且利用一种基于亲和素的试剂对其进行了捕获)并且第二种要素被利用一种荧光素标签进行了标记。所述的要素(底物)在结合方面的增加或者减少反映出了所述的酶所具有的改变的结合特异性/活性。
本发明提供了对所述的生物分子所具有的表型进行的评价，其中所述的生物分子是由所述的细胞编码得到的，所述的评价是以多种参数为基础的，其中所述的参数选自由下述的参数所组成的组中：催化速率，反应特异性，动力学有效性，以及底物的结合亲和性。在另外一个方面，对速率或者底物耐受性，以及pH或者温度耐受性进行了评价。优选的，所述的参数是以平行的方式被进行评价的。
本发明提供了对生物分子所进行的筛选，其中所述的生物分子是由细胞进行分泌的。在一个方面，所述的细胞是真核细胞。优选的，所述的真核细胞是酵母细胞。或者可供选择的，所述的细胞是原核细胞。
本发明同样提供了一种微型装置，所述的微型装置中含有能够对存在于溶液中的所述细胞进行空间上的分割的孔，例如，在每一个孔内仅仅含有一个单一的细胞。优选的，所述的孔所具有的直径在大约10至大约100微米之间，例如，直径为10微米，20微米，30微米，50微米，或者75微米。
在一个方面，本发明提供了一种将细胞从所述的微型装置中进行的分离，其中所述的细胞能够分泌出一种期望的生物分子变体。优选的，通过利用玻璃毛细管的显微操作技术对所述的细胞进行分离。任选的，本发明提供了对所述的期望的生物分子进行的随机突变，用以进行进一步的筛选。用于进行随机突变的适合的技术包括错配聚合酶链式反应(PCR)，密码子盒式突变，脱氧核糖核酸(DNA)改组，交错延伸方法(StEP)，化学突变以及增变株的使用。或者可供选择的，对所述的生物分子进行测序，用以识别所述的生物分子。
被进行查看的生物分子包括酶。例如，所述的生物分子是一种突变的糖基转移酶(GTase)，碳水化合物加工酶，碳水化合物结合酶，糖苷酶，或者是一种结合有碳水化合物的外源凝集素亲和性蛋白质。优选的，所述的糖基转移酶能够与化学合成作用进行竞争，用于进行复杂的碳水化合物的快速以及大规模的生产。或者可供选择的，所述的生物分子是细胞因子，趋化因子，抗体，或者其他分泌得到的细胞代谢产物。
在另外一个方面，本发明提供了已有的糖基转移酶的定向进化，从而对具有改变的底物选择性的更有潜力的催化剂进行识别。更为具体的，本发明提供了对突变的糖基转移酶的识别，其中所述的糖基转移酶能够与化学合成作用进行竞争，用于对糖共轭物进行快速以及大规模的生产，其中所述的糖共轭物是用于治疗目的的，包括基于碳水化合物的癌症疫苗以及含有碳水化合物的抗生素。
本发明所具有的其他特征以及优点将通过下述对于其优选实施方式的说明并且通过所述的权利要求而变得显而易见。在本发明中引用的全部参考文献均被引入作为参考。
附图说明
附图1是一种方法的示意图，其中所述的方法被用来对具有新的功能或者改进的功能的酶进行识别。酵母细胞在所述的微型反应器内分泌目标蛋白质。由于每一个细胞被容纳在其特有的孔内，每一个孔对应着一个单一的文库成员。经过本发明所述的筛选之后，所述的细胞被得以回收并且被用在下一轮的筛选中或者被用来进行所述编码蛋白质的识别。
附图2是一个示意图，是对粘液素类型的氧-连接的多糖进行的描述。
附图3是一个示意图，是对底物进行的描述，其中所述的底物被用来进行烟草蚀刻病毒(TEV)的蛋白酶催化活性的探测，所述的底物含有一个二吡咯亚甲基二氟化硼(BODIPY)荧光团(F)以及一个四甲基若丹明(TAMRA)猝光剂(Q)。
附图4是一个示意图，表示的是用来进行多肽N-乙酰基-α-半乳糖基氨基转移酶(ppGalNAcTase)-T1的催化活性的探测的底物。
附图5是一系列的图表；(A)是一个示意图，是对一种范例性的抗肿瘤疫苗进行的描述；(B)是一个示意图，表示的是一种范例性的抗寄生虫疫苗；(C)是一个示意图，是对一种范例性的抗微生物疫苗进行的描述；并且(D)是一个示意图，是对一种范例性的抗微生物试剂进行的描述。
附图6是一个图表，所述的图表表示出的是对下述的糖基转移酶所进行的结构的比较：BTG，MurG，以及GtfB。
附图7是一个示意图，表示的是用于酶工程学以及催化剂发展的定向进化。
附图8A是一个示意图，描述的是一种使蛋白质与分泌蛋白质的所述细胞相互关联的方法，在所述的方法中，底物/产物被捕获至与其发生接触的玻璃表面之上；(B)是一个装置的照片，在所述的装置中含有直径在50至100微米之间的孔；(C)是一个蛋白质微阵列的显微镜照片，所述的蛋白质微阵列是分泌产物的蛋白质微阵列，其中所述的分泌产物来自于巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)细胞；并且(D)是存在于微孔之中的巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)细胞的显微镜照片。
附图9是一个标准曲线的显微镜照片，用于对不同的细胞类型之间的蛋白质分泌水平进行比较，其中所述的细胞类型例如是，杂种细胞，巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)，以及分泌细胞因子的外周血单核细胞(PBMC)。
附图10是一系列的显微镜照片，证实的是使用一种显微操作器进行的细胞回收。
附图11是一个图表，表示的是一种用以探测微孔中的酶的转换的方法，其中所述的方法是经由一种胰岛素断裂检测来实现的。
附图12是一系列的显微镜照片，证实的是在微孔内利用10微克/毫升的异硫氰基荧光素(FTC)-酪蛋白对增加浓度(0.05微克/毫升，0.5微克/毫升，以及5微克/毫升)的胰岛素进行1小时的培养之后所得到的荧光信号的强度。
附图13是一系列的显微镜照片，描述的是在微孔内利用10微克/毫升的异硫氰基荧光素(FTC)-酪蛋白对0.5微克/毫升的胰岛素进行1小时以及18小时的培养之后所得到的荧光信号的强度。
附图14是一个图表，表示的是一种用以探测微孔中的酶的转化的方法，其中所述的方法是经由一种人鼻病毒-3C(HRV-3C)蛋白酶检测来实现的。
附图15是一系列的显微镜照片，表示的是在室温(RT)条件下，在100微克/毫升的荧光共振能量转移(FRET)肽的培养之后，所述的人鼻病毒-3C(HRV-3C)蛋白酶检测所得到的结果，其中所述的培养是在含有培养基(YPD培养基)的1倍的反应缓冲液中进行的。
具体实施方式
由于酶所具有的底物特异性，化学选择性以及环境兼容性，它们在诸如下述方面的应用中提供了优势：手性纯化的医药品的合成方面，其中所述的医药品被用来进行医学诊断以及治疗。的确，这样的酶可以被利用在所述的寡糖以及糖共轭物的合成之中，其中所述的寡糖以及糖共轭物具有多种多样的医学应用，包括抗肿瘤疫苗(作用于，例如，神经节苷脂(GM3)，一种与恶性黑素瘤相关的鞘糖脂)抗寄生虫疫苗(作用于，例如，疟疾糖基磷脂酰环己六醇(糖基磷脂酰肌醇锚定区))，抗微生物疫苗(作用于，例如，荚膜多糖抗原流行性感冒嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)血清型b(HIB))，以及其他的抗微生物试剂。范例性的抗肿瘤疫苗，抗寄生虫疫苗，抗微生物疫苗，以及抗微生物试剂分别在附图5A-5D中进行了表示。糖基化的生物分子的使用不仅仅需要在结构与功能之间的相互关系方面的深入知识，同样需要获取用于大规模的临床使用的精确的结构。
尽管许多野生型的酶(即，那些氨基酸序列与在天然存在的有机体中发现的氨基酸序列相同的酶)可以在不进行任何修饰的条件下被进行使用，在许多情形中一种酶所具有的物理性质或者它的化学活性不能够与一种期望的应用相兼容。可能是令人期望的新的物理性质可能包括，例如，热稳定性，对非水性溶剂、盐类、金属、抑制剂、蛋白酶、极端pH值的抗性以及类似的性质。降低酶的大小，废除其对于辅助因子或者其他蛋白质的依赖，改善其在所述的宿主菌株中的表达以及其他类似的变化对于一种特定的应用而言同样可能是令人期望的。改进的化学活性可能包括，例如，增加的催化速率，底物亲和性以及特异性，区域选择性，对映选择性，降低的产物抑制作用，或者一种改变的pH活性曲线。除此之外，对一种或者多种酶所具有的作为一种代谢途径的一部分而共同发挥功效的性质进行改变同样可能是令人期望的。
伴随着对于具有改善的活性以及新的催化功能的酶的需求的增长，已经研发出新的方法，用以从一种蛋白质变体的池中对一种期望的催化剂进行分离。定向进化已经被证实在下述情形中是格外成功的：其中酶所具有的功能与细胞的存活有直接的联系，即，对一种重要的活性进行的恢复，其中所述的活性已经从另外一种野生型细胞中被删除了。然而，当在所述的酶是糖基转移酶(GTase)以及其他的转移酶的情形中时，这些本身不能够提供一种可供筛选的表型的酶的进化要困难的多。在这里所描述的本发明之前，没有方法能够提供一种容易得到的或者被归纳的策略，用于对多种多样的酶进行工程化处理。
所述的经过分离的生物分子是经过纯化的天然存在的、合成制造的、或者重组的化合物，例如，多肽，核酸，小分子，或者其他的试剂。纯化的化合物为具有至少60％重量(干重)的目标化合物的化合物。优选的，所述的制品具有至少75％、更优选的至少90％、并且最为优选的至少99％重量的目标化合物。可以通过任何适宜的标准方法对纯度进行测量，所述的方法例如是，通过柱层析法，聚丙烯酰胺凝胶电泳法，或者高效液相色谱(HPLC)分析。“纯化的”或者“本质上纯化的”意味着一种生物分子或者所述生物分子的生物学活性部分中本质上不含有来源于所述的细胞或者组织来源的细胞物质或者其他的污染性大分子，其中所述的污染性大分子例如是多糖，核酸，或者蛋白质，所述的细胞或者组织来源指的是获得所述的生物分子的细胞或者组织。所述的术语“本质上纯化的”同样包括这样的一种生物分子，在所述的生物分子中本质上不含有化学前体或者化学合成时的其他化学试剂。所述的语言“本质上不含有细胞物质”包括这样的生物分子制品，所述的生物分子制品是与所述细胞的细胞组分分离的，其中所述的生物分子是从所述的细胞中分离出来的。
用于酶工程学以及催化剂研发的定向进化
在附图7中表示出的是用于酶工程学以及催化剂研发的定向进化发明的示意图。本发明提供了通过一种已有的酶骨架突变/生成新的活性的能力，这种能力是通过重复轮回的突变以及筛选来实现的。正如将在下文中详细描述的，存在许多技术用于对所期望的生物分子进行随机的突变，用于进一步的筛选。同样存在许多合适的方法用于进行筛选。本领域技术人员将能够理解，可以根据所述的生物分子所能够获得的结构信息的量来选择一种具体的技术，其中所述的生物分子例如是一种目标蛋白质。当选择了一种单独的技术时，在维持高通量的同时，对存在于基因型以及表型之间的联系进行维持，是至关重要的。
筛选策略
在这里所描述的发明提供了一种可自动化的、高通量的方法，用以对一种细胞编码得到的生物分子所具有的表型进行评价，其中所述的评价是以多种参数为基础的，所述的参数包括底物特异性以及动力学有效性。这种一般性的策略允许使用天然底物或者具有最低的混乱程度的底物对多种多样的酶进行体外筛选。所述的目标酶是通过所述的细胞机构制造得到的。或者可供选择的，本发明同样提供了在溶液中对其他分泌得到的生物分子所进行的筛选，所述的筛选针对的是一种期望的表型，其中所述的生物分子包括细胞因子，趋化因子，抗体，以及代谢产物。
对生物分子的遗传变体的文库所进行的评价，需要同时对所生成的所述生物分子所具有的表型进行鉴定并且使所述的生物分子与编码所述生物分子的文库成员所具有的基因型相互关联起来，其目的在于对存在于所述文库中的具有期望的性质(催化速率，反应特异性，底物结合亲和性)的具体成员进行识别，其中所述的生物分子例如是酶。通过这种方式，对期望的变体进行筛选并且对其进行进一步的评价。对所述的生物分子所具有的表型与生成其的所述细胞所具有的基因型之间进行的相互关联是具有挑战性的。本发明提供了一种方法，用以在单独的微型反应器内从变体细胞的文库中对特定的成员进行分离，其中对由所述的细胞分泌出的生物分子所具有的表型进行评价，所述的评价是以多种参数为基础的，包括底物特异性以及动力学有效性。对所述的文库成员所进行的空间分割允许对每一种进行平行的评价，并且从所述的微型反应器中对表现出期望特征的成员进行后续的回收，用于进行进一步的分析。这种技术的一种重要的应用在于对多种多样的酶进行的定向进化，其中所述的酶被用来进行生物分子的体外构建。一个例子是一种用于对变异的糖基转移酶进行识别的方法，其中所述的糖基转移酶利用完全的化学控制将糖从活化的供体分子转移到适宜的受体中去。这样的酶能够与化学合成方法进行竞争，用来进行复杂的碳水化合物的快速并且大规模的生产。
当对来自于一个酶的变体文库中的酶进行进化时，一种用以将一种令人期望的表型与基因型进行联系的简单策略是必要的。对存在于各个间隔内的文库成员所进行的空间分割允许对具有独特性质的所述变体进行识别，而不需要进行底物的吸收或者表面的吸附。
出于那样的原因，在这里所描述的本发明使用微制造的小室对细胞文库进行分离，其中所述的细胞例如是酵母细胞，所述的细胞中的每一个均分泌一种目标蛋白质的变异版本(附图1)。通过软光刻法以及复制成形来制造所述的可模压的厚板，其中所述的厚板是利用聚二甲基硅氧烷制成的并且是一种具有生物兼容性的材料，所述的材料是无毒的并且是具有气体渗透性的。一些材料所具有的硬度将不允许其进行共形接触，并且因此将所述的微孔密封在底物之上，用来以平行的方式对生成的所述抗体所具有的特异性进行测试，其中所述的材料例如是聚苯乙烯。然而，聚二甲基硅氧烷(PDMS)是一种适合用于这种技术的材料，因为它没有毒性，它是具有气体渗透性的，并且它可以轻易的被压缩从而形成一种紧密的，但是具有可逆性的，与一种刚性底物所形成的密封。这样的一种密封能够延缓或者防止存在于所述的可模压的厚板之中的任何的液体和/或细胞发生渗漏或者漏出。
被限制在微孔内并且利用载玻片进行密封的细胞(这样一来可以利用的总体的介质被限定到所述的微孔所具有的体积)被粗略的以每个孔中一个细胞的水平分配在一种装置中，其中在所述的装置中含有直径为50微米的孔。附图8C描述的是一种来自于单个的巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)细胞的蛋白质微阵列，而附图8D表示出的是能够分泌出在8C中的所述蛋白质微阵列的细胞。使表达一种人类Fc的巴斯德毕赤酵母细胞在YPD培养基上进行过夜生长。之后将细胞粗略的以每孔一个细胞的水平装载于一个聚二甲基硅氧烷(PDMS)微型装置中，其中在所述的微型装置中含有50微米的孔。将所述的微型装置与一个载玻片进行接触，其中所述的载玻片经过了山羊抗人类Fc抗体的预处理，用以对所分泌的Fc进行捕获。上述经过分泌的蛋白质在90分钟的时间内被捕获并且使用一种Cy5共轭的山羊抗人类免疫球蛋白H+免疫球蛋白L抗体对上述得到的阵列进行读取。利用一种作用于酵母细胞表面的荧光素染料对存在于所述的微孔之中的所述巴斯德毕赤酵母细胞进行成像。附图9表示出的是与其他的细胞类型相比较而言巴斯德毕赤酵母所分泌的蛋白质水平如何，其中所述的其他的细胞类型例如是杂种细胞，以及分泌细胞因子的外周血单核细胞(PBMC)。使用经过纯化的人类Fc生成这种标准曲线，并且将观察到的所述的强度数值用来对所述分泌物的确定的浓度进行指定，其中所述的分泌物是从各个细胞中捕获得到的。在巴斯德毕赤酵母细胞中观察到的被分泌蛋白质所具有的剂量大大超出了所述检测的探测极限并且应当在微孔中提供了足够的浓度水平，用以进行所述补充的酶底物的转换。这些试验证实了探测分泌产物的能力，其中所述的分泌产物来自于各个酵母细胞。同样可以参见，Love等人于2006年在Nat.Biotechnol《自然生物技术》24(6)：703-707中发表的文章；WO 2007/035633。
在一种特定的实施例中，利用酶底物对一种被隔离的酵母细胞文库进行查看，其中在发生成功的酶的转换时所述的酶底物能够产生一种荧光信号。由于所述的信号所具有的强度与产物的形成直接相关，除了底物特异性之外，对文库成员直接进行酶动力学方面的比较，其中所述的比较是经由实时荧光性监测的方式来实现的。使用显微操作技术对来自于荧光性孔内的克隆物进行回收并且将其用于下一轮的进化以及筛选之中。在附图10中表示出的是使用一种显微操作器进行的细胞的回收。经过利用一种显微操作器进行的回收之后，酵母的存活能力为40-60％。
用于对酶进行改进的突变技术
能够编码氨基酸的变化的突变可以被有效的用来生成新的酶活性。可以使用本领域技术人员已知的任何方法来获得所述的基因，例如，通过从一种给定的有机体的基因组文库中进行克隆物的分离的方法，通过对基因组脱氧核糖核酸(DNA)或者信使核糖核酸(mRNA)的来源进行聚合酶链式反应(PCR)扩增的方法，或者通过来自于一种表达克隆物文库的方法，其中所述的克隆物来自于一种DNA的异源混合物，所述的DNA异源混合物来自于未经过培养的环境微生物(参见美国专利No.5958672)。对于本领域技术人员而言，存在许多种熟知的方法，用以对编码所述酶以及其他的非催化性蛋白质以及肽的基因进行突变。这些方法同时包括有理数的(rational)技术(例如，通过定点突变来生成点突变体或者点突变组)以及随机的技术(例如，随机突变，组合突变以及重组)。一种有理数的设计，被称为蛋白质自动化设计，利用一种运算法则对可能实现一种期望的折叠的蛋白质序列进行客观的预测。
一种类型的技术是那些依赖于点突变的技术，例如，错配聚合酶链式反应以及寡核苷酸定向突变(参见Cadwell以及Joyce于1992年在PCR Methods Applic.《聚合酶链式反应的方法以及应用》2：28-33中发表的文章；Kegler-Ebo DM等人于1994年在Nuc Acids Res《核酸研究》22(9)：1593-1599中发表的文章)。这些方法导致了一种酶文库的生成，在所述的酶文库中含有这样的成员，所述的成员在一种给定的蛋白质中的一个具体位置上具有20种不同的氨基酸中的任意一种。
随机方法包括，例如，化学突变(参见Singer以及Kusmierek于1982年在Annu Rev Biochem《生物化学年度回顾》51：655-93中发表的文章)，递归集成突变(参见Arkin以及Youvan于1992年在Proc Natl Acad Sci USA《美国科学院院刊》89(16)：7811-5中发表的文章；Delagrave等人于1993年在Protein Eng《蛋白质工程》6(3)：327-31中发表的文章)，指数集成突变(参见Delagrave以及Youvan于1993年在Biotechnology《生物技术》11(13)：1548-52中发表的文章)，顺序随机突变(参见Chen以及Arnold于1991年在Biotechnology《生物技术》9(11)：1073-7中发表的文章；Chen以及Arnold于1993年在Proc Natl Acad Sci USA《美国科学院院刊》90(12)：5618-22中发表的文章)，DNA改组(参见Stemmer于1994年在Proc Natl Acad Sci USA《美国科学院院刊》91(22)：10747-51中发表的文章；Stemmer于1994年在Nature《自然》370(6488)：389-91中发表的文章)以及类似的方法。重组是一种有效的随机突变技术，其中DNA发生分解并且在新的组合中进行了重新的结合。DNA改组，是已知的最佳重组方法，允许在多个需要被组合的基因中形成有效的突变(参见Stemmer WPC等人于1994年在Nature《自然》370：389-391中发表的文章)。交错延伸方法(StEP)是一种简单并且有效的方法，用以对多核苷酸序列进行体外的突变以及重组(参见Zhao H等人于1998年在Nature Biotechnol《自然生物技术》16：258-261中发表的文章)。其他的突变技术包括化学突变以及所述的增变株的使用(参见Lai Y等人于2004年在Biotech Bioeng《生物技术与生物工程》86：622-627中发表的文章；Coia G等人于1997年在Gene《基因》201：203-209中发表的文章)。这些技术可以被进行单独的使用或者组合的使用，用以制造突变体。
将表达所期望的酶或者蛋白质的DNA从所述的表达文库中分离出来并且对其进行测序。通过对所述的突变步骤以及筛选步骤的重复，新的酶以及其他的蛋白质被人工的建立起来。这种重复的过程被认为是定向进化。所述的目标基因不必要在质粒上被进行表达。在一个方面，经过在所述的宿主染色体内的整合之后，它们被进行表达，或者作为一种基因的染色体拷贝的突变结果而使它们进行表达。在另外一个方面，在不存在突变的情况下建立高复杂性的表达文库。这可以通过对来自于一种来源的DNA进行克隆以及表达的方式来完成，其中在所述的来源中已经含有大量不同的序列，所述的DNA例如是高异源性的基因组DNA，其来自于环境微生物的混合物。
表达文库的活性筛选
在本发明中描述的所述方法允许对所述的生物分子进行功能方面的检测。在一个方面，对于所期望的生物学活性的筛选是通过使用核酸适配体来实现的，其中所述的核酸适配体即，能够与一种特异性的靶向分子进行结合的寡核酸或者肽分子。在另外一个方面，对于所期望的生物学活性的筛选是通过使用一种溶液相的基于荧光共振能量转移(FRET)的检测来实现的，所述的检测是利用荧光团性质的底物在所述的微型装置的微孔内进行的。在另外一个方面，生物学活性是经由固体支撑的荧光性(或者荧光共振能量转移)来进行检测的，其中使用抗体将底物/产物捕获在与其发生接触的所述的玻璃表面之上。优选的，一种或者多种所述的底物是荧光性的。在另外一个方面，对于所期望的生物学活性的筛选是经由固体支撑的亲和性捕获来实现的，其中一种或者多种底物被进行了进一步的衍生，其中所述的衍生是使用一种化学反应或者酶反应(即，“点击化学”，转肽酶标签，BirA生物素化，等等)利用一种荧光团来实现的。或者可供选择的，使用一种固体支撑的基于抗体的荧光性读数器对所述的生物分子所具有的功能进行检测，其中两种底物均具有亲和性标签，并且在一种夹心酶联免疫吸附检测(ELISA)形式中对所述的产物进行探测。优选的，所述的二级抗体与一种荧光团发生了共轭。
在一个方面，对所期望的生物学活性所进行的筛选是通过下述方式来完成的：将表达所述酶的所述宿主细胞与一种显色性化合物或者荧光性化合物进行接触，并且对在所述的细胞内或者在它们周围所发生的颜色的生成进行监测，其中所述的显色性化合物或者荧光性化合物是适合用于所述的酶反应之中的。在美国专利No.5914245描述的所述固相检测中，这些化合物被称为光学信号底物，因为当它们与活化的酶或者与一种所述酶反应中的产物发生接触时，能够在吸光率、反射比、荧光性或者发光性方面产生一种可以测量的变化。
本发明提供了各种不同的显色性、荧光性、发光性以及荧光共振能量转移(FRET)底物，用以对生物学活性进行测量。通常情况下，荧光团能够在一种波长条件下吸收电磁能量并且在另外一种波长条件下放射出电磁能量。代表性的荧光团包括，但不局限于，1，5 5-(2-碘乙酰基氨基乙基)氨基萘-1-磺酸；1，8-ANS；4-甲基伞形酮；5-羧基-2，7-二氯荧光素；5-羧基荧光素(5-FAM)；5-羧基萘基荧光素；5-羧基四甲基若丹明(5-TAMRA)；5-FAM(5-羧基荧光素)；5-HAT(羟色胺)；5-羟色胺(HAT)；5-ROX(羧基-X-若丹明)；5-TAMRA(5-羧基四甲基若丹明)；6-羧基若丹明6G；6-CR 6G；6-JOE；7-氨基-4-甲基香豆素；7-氨基放线菌素D(7-AAD)；7-羟基-4-甲基香豆素；9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶；ABQ；酸性品红；ACMA(9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶)；吖啶橙；吖啶红；吖啶黄；叮啶黄；Acriflavin Feulgen SITSA；水母素(发光蛋白质)；AFP-自动荧光蛋白-(Quantum Biotechnologies)参见sgGFP(超级发光绿色荧光蛋白)，sgBFP(超级发光蓝色荧光蛋白)；Alexa Fluor 350.TM.；Alexa Fluor 430.TM.；Alexa Fluor 488.TM.；Alexa Fluor 532.TM.；Alexa Fluor 546.TM.；Alexa Fluor 568.TM.；Alexa Fluor 594.TM.；Alexa Fluor 633.TM.；Alexa Fluor 647.TM.；Alexa Fluor 660.TM.；Alexa Fluor 680.TM.；茜素氨羧络合剂；茜素红；别藻蓝蛋白(APC)；AMC，AMCA-S；AMCA(氨基甲基香豆素)；氨基甲基香豆素-X；氨基放线菌素D；氨基香豆素；氨基甲基香豆素(AMCA)；Anilin Blue；anthrocyl stearate；APC(别藻蓝蛋白)；别藻蓝蛋白-Cy7；APTRA-BTC；APTS；阳离子艳红4G；碱性橙R；还原红6B；阳离子黄7GLL；阿的平；ATTO-TAG.TM.CBQCA；ATTO-TAG.TM.FQ；金胺；Aurophosphine G；Aurophosphine；BAO 9(双氨基苯基恶二唑)；BCECF(高pH)；BCECF(低pH)；硫酸黄连素；β-内酰胺酶；BFP蓝色荧光蛋白转换的绿色荧光蛋白(GFP)(Y66H)；蓝色荧光蛋白；蓝色荧光蛋白/绿色荧光蛋白荧光共振能量转移(BFP/GFP FRET)；Bimane；二苯甲酰胺；二苯甲亚酰胺(赫斯特荧光染料)(Hoechst)；bis-BTC；布兰科福尔荧光增白剂FFG；布兰科福尔荧光增白剂SV；BOBO.TM.-1；BOBO.TM.-3；氟硼荧492/515；氟硼荧493/503；氟硼荧500/510；氟硼荧505/515；氟硼荧530/10；氟硼荧542/563；氟硼荧18/568；氟硼荧564/517；氟硼荧576/589；氟硼荧581/591；氟硼荧630/650-X；氟硼荧665/676；氟硼荧FI；氟硼荧FI ATP；氟硼荧FI-神经鞘氨醇；氟硼荧R6G SE；氟硼荧TMR；氟硼荧TMR-X共轭物；氟硼荧TMR-X，SE；氟硼荧TR；氟硼荧TR ATP；氟硼荧TR-X SE；BO-PRO.TM.-1；BO-PRO.TM.-3；Brilliant Sulphoflavin FF；BTC；BTC-5N；钙黄绿素；钙黄绿素蓝；钙红TM.；钙绿；钙绿-1 Ca.sup.2+染料；钙绿-2 Ca.sup.2+；钙绿-5NCa.sup.2+；钙绿-C18 Ca.sup.2+；钙橙；Calcofluor White；羧基-X-若丹明(5-ROX)；Cascade Blue.TM.；Cascade Yellow；儿茶酚胺；CCF2(GeneBlazer)；CFDA；CFP-青色荧光蛋白；青色荧光蛋白/黄色荧光蛋白荧光共振能量转移(CFP/YFP FRET)；叶绿素；色霉素A；色霉素A；CL-NERF；CMFDA；腔肠素；腔肠素cp；腔肠素f；腔肠素fcp；腔肠素h；腔肠素hcp；腔肠素ip；腔肠素n；腔肠素O；香豆素鬼笔菌；C-藻青素；CPM甲基香豆素；CTC；CTC氰基甲；Cy2.TM.；Cy3.18.；Cy3.5.TM.；Cy3.TM.；Cy5.18；Cy5.5.TM.；Cy5.TM.；Cy7.TM.；青绿色荧光蛋白；环状AMP荧光传感器(FiCRhR)；Dabcyl；丹磺酰；丹磺酰胺；丹磺酰尸胺；丹磺酰氯；丹磺酰基DHPE；丹磺酰氟；4’，6-联脒基-2-苯基吲哚(DAPI)；Dapoxy1；Dapoxy 2；Dapoxy1 3’DCFDA；DCFH(二氯二氢荧光素双乙酸盐)；DDAO；DHR(二氢若丹明123)；Di-4-ANEPPS；Di-8-ANEPPS(无比例)；DiA(4-Di-16-ASP)；二氯二氢荧光素双乙酸盐(DCFH)；吲哚一羰菁染料(DiD)-亲脂性示踪剂；吲哚一羰菁染料(DiIC18(5))；DIDS；二氢若丹明123(DHR)；Dil(DilC18(3))；二硝基苯酚；DiO(DiOC18(3))；吲哚三羰花青(DiR)；吲哚三羰花青(DiR)(DiIC18(7))；DM-NEFR(高pH)；2，4-二硝基苯酚(DNP)；多巴胺；DsRed；DTAF；DY-630-NHS；DY-635-NHS；增强型蓝色荧光蛋白(EBFP)；增强型青色荧光蛋白(ECFP)；增强型绿色荧光蛋白(EGFP)；ELF 97；曙红；赤藓红；赤藓红ITC；溴化乙锭；溴乙啡锭二聚体-1(EthD-1)；吖啶橙；EukoLight；三氯化铕；增强型黄色荧光蛋白(EYFP)；固蓝；FDA；Feulgen(碱性副品红)；FIF(甲醛化作用诱导的荧光素)；异硫氰基荧光素(FITC)；Flazo Orange；Fluo-3；Fluo-4；荧光素(异硫氰基荧光素)；二乙酸荧光素；荧光翡翠绿；荧光金(羟芪巴脒)；红色荧光金；FluorX；FM 1-43.TM.；FM 4-46；Fura Red.TM.(高pH)；Fura Red.TM./Fluo-3；Fura-2；Fura-2/BCECF；Genacryl Pink 3G；Genacryl Yellow 5GF；GeneBlazer(CCF2)；绿色荧光蛋白(S65T)；红色转换的绿色荧光蛋白(rsGFP)；绿色荧光蛋白野生型；非紫外线(UV)激发(野生型绿色荧光蛋白)；绿色荧光蛋白野生型；紫外线激发(野生型绿色荧光蛋白)；GFPuv；Gloxalic Acid；粒蓝；血卟啉；赫斯特荧光染料33258；赫斯特荧光染料33342；赫斯特荧光染料34580；HPTS；羟基香豆素；羟芪巴脒(荧光金)；羟色胺；吲哚-1，高钙；吲哚-1，低钙；吲哚一羰菁染料(DiD)；Intrawhite Cf；JC-1；JO-JO-1；JO-RPO-1；LaserPro；Laurodan；LDS 751(DNA)；LDS 751(RNA)；雷可福荧光增白剂PAF；雷可福荧光增白剂SF；雷可福荧光增白剂WS；丽丝胺若丹明；丽丝胺若丹明B；钙黄绿素/溴乙啡锭二聚体；LOLO-1；LO-PRO-1；Lucifer Yellow；溶酶体示踪剂蓝色荧光探针；溶酶体示踪剂蓝白色荧光探针；溶酶体示踪剂绿色荧光探针；溶酶体示踪剂红色荧光探针；溶酶体示踪剂黄色荧光探针；溶酶体传感器蓝色荧光探针；溶酶体传感器绿色荧光探针；溶酶体黄色/蓝色荧光探针；Mag Green；苏丹红(根皮红B)；Mag-Fura Red；Mag-Fura-2；Mag-Fura-5；Mag-Indo-1；镁绿；镁橙；孔雀绿；海蓝；Maxilon Brilliant Flavin 10 GFF；Maxilon Brilliant Flavin 8 GFF；Merocyanin；甲氧基香豆素；Mitotracker Green M；Mitotracker Orange；Mitotracker Red；光辉霉素；单溴二胺；单溴二胺(mBBr-GSH)；单氯二胺；MPS(甲基绿派若宁均二苯代乙烯)；NBD；NBD Amine；尼罗红；Nitrobenzoxadidole；去甲肾上腺素；核快红；核黄；Nylosan Brilliant lavin E8G；俄勒冈州绿；俄勒冈州绿488-X；俄勒冈州绿TM.；俄勒冈州绿TM.488；俄勒冈州绿TM.500；俄勒冈州绿TM.514；海水蓝；碱性副品红(Feulgen)；PBFI；PE-Cy5；PE-Cy7；PerCP；PerCP-Cy5.5；PE-德州粉红【红613】；根皮红B(苏丹红)；Phorwite AR；Phorwite BKL；Phorwite Rev；Phorwite RPA；磷化氢3R；光致抗蚀剂；藻红蛋白B【PE】；藻红蛋白R【PE】；PKH26(Sigma)；PKH67；PMIA；Pontochrome Blue Black；POPO-1；POPO-3；PO-PRO-1；PO-PRO-3；樱草黄；活性黄；碘化丙啶(PI)；PyMPO；芘；派若宁；派若宁B；Pyrozal Brilliant Flavin 7GF；QSY 7；喹丫咽氮碱；红613【PE-德州粉红】；试卤灵；RH 414；若丹明-2；若丹明；若丹明110；若丹明123；若丹明5GLD；若丹明6G；若丹明B；若丹明B 200；若丹明B extra；若丹明BB；若丹明BG；若丹明绿；若丹明Phallicidine；若丹明Phalloidine；若丹明红；若丹明WT；孟加拉红；R-藻青素；R-藻红蛋白(PE)；红色转换的绿色荧光蛋白(rsGFP)；S65A；S65C；S65L；S65T；蓝宝石绿色荧光蛋白；SBFI；羟色胺；Sevron Brilliant Red 2B；Sevron Brilliant Red 4G；Sevron Brilliant Red B；Sevron Orange；Sevron Yellow L；超级发光的蓝色荧光蛋白.TM.；sgBFP.TM.(超级发光的蓝色荧光蛋白)；超级发光的绿色荧光蛋白.TM.；sgGFP.TM.(超级发光的绿色荧光蛋白)；SITS；SITS(樱草黄)；SITS(均二苯代乙烯异硫代硫酸)；SNAFL钙黄绿素；SNAFL-1；SNAFL-2；SNARF钙黄绿素；SNARF1；钠绿；光谱淡绿；光谱绿；光谱橙；光谱红；SPQ(6-甲氧基-N-(3-硫丙基)喹啉)；均二苯代乙烯；磺酰基若丹明B can C；磺酰基若丹明Extra；SYTO11；SYTO12；SYTO13；SYTO14；SYTO15；SYTO16；SYTO17；SYTO18；SYTO20；SYTO21；SYTO22；SYTO23；SYTO24；SYTO25；SYTO40；SYTO41；SYTO42；SYTO43；SYTO44；SYTO45；SYTO59；SYTO60；SYTO61；SYTO62；SYTO63；SYTO64；SYTO80；SYTO81；SYTO82；SYTO83；SYTO84；SYTO85；SYTOX蓝；SYTOX绿；SYTOX橙；四环素；四甲基若丹明(TRITC)；德州粉红.TM.；德州粉红-X.TM.共轭物；Thiadicarbocyanine(DiSC3)；噻嗪红R；噻嗪橙；硫代香豆素5；硫代香豆素S；硫代香豆素TCN；Thiolyte；ThioZole Orange；Tinopol CBS(Calcofluor White)；TMR；TO-PRO-1；TO-PRO-3；TO-PRO-5；TOTO-1；TOTO-3；TriColor(PE-Cy5)；TRITC四甲基若丹明硫氰酸盐；不退色蓝；不退色红；Ultralite；UranineB；Uvitex SFC；野生型绿色荧光蛋白；WW 781；X-若丹明；XRITC；二甲苯橙；Y66F；Y66H；Y66W；黄绿色荧光蛋白；黄色荧光蛋白；YO-PRO-1；YO-PRO-3；YOYO-1；YOYO-3；Sybr Green，噻唑橙(内在的螯合染料)，半导体纳米粒子例如量子点，或者被囚禁的荧光团(其可以利用光或者其他的电磁能量来源而被活化)或者是它们的组合。
很多各种不同的适宜的供体(D)以及受体(A)荧光团是可以通过商业购买获得的，这些供体以及受体荧光团是适合被用在荧光共振能量转移(FRET)中的。对于所述的探针对所进行的选择受到下述因素的影响：系统的约束，以及在所期望的应用中所使用到的肽所具有的长度以及序列。所述的肽所具有的长度以及序列将能够对用于进行所述探针的连接的标记位点产生影响。存在于所述的连接位点之间的距离将能够对所述的供体/受体对的选择产生影响，这归因于所述的荧光共振能量转移(FRET)所具有的距离依赖性。许多供体/受体对是可以通过商业购买获得的。这些包括，但不局限于，5-羧基四甲基若丹明(TAMRA)/QSY-7(二芳基若丹明的衍生物)；尸胺/曙红；色氨酸/尸胺；荧光素/德州粉红(若丹明)；萘/尸胺；尸胺/十八烷基若丹明(ODR)；硼-二吡咯亚甲基(BODIPY)/硼-二吡咯亚甲基(BODIPY)；铽/若丹明；尸胺/异硫氰酸荧光素(FITC)；嵌二萘(Pyrene)/香豆素；5-(2-碘乙酰基氨基乙基)氨基萘-1-磺酸(IAEDANS)/IAFBPE/Cy5；以及铕/Cy5。生物素或者其他的小亲和性标签被用来进行所述蛋白质的探测，其中所述的探测是经由抗-抗生物素抗体或者带有亲和素/链霉亲和素标签的探测剂来实现的，其中所述的探测剂例如是辣根过氧化物酶或者是一种荧光染料。
在一个方面，指示剂化合物被用来对一种酶反应中的一个或者多个产物进行探测，其中所述的探测是通过与所述的产物发生直接的或者间接的相互作用来实现的。任选的，这些指示剂化合物是作为所述的光学信号底物溶液中的一部分而被包含在内的。例如，美国专利No.5914245中描述了一种脂肪酶检测，所述的检测能够对脂肪酸与所述的荧光性染料若丹明B之间的相互作用进行探测。可以利用指示剂化合物的其他检测包括那样的一些检测：在其中有质子的生成的检测，或者在一种酶反应的过程中会发生跨膜的质子、电子或者离子转移的检测。可以通过在所述的底物溶液中容纳各种不同的染料的方式对这些活性进行探测。异硫氰酸荧光素(FITC)是一种荧光素衍生物，其被用于很多范围的应用之中，包括流式细胞术。被用来对pH的变化进行监测的范例性的荧光性指示剂染料包括荧光素以及半萘酚罗丹荧以及它们在6-9的pH范围内的衍生物以及LysoSensor，Oregon Green以及对甲氨基酚(Rhodol)以及它们在3-7的pH范围内的衍生物。这些荧光性的pH指示剂可以从Molecular Probes(Eugene，Oreg.)处获得。显色团染料包括百里酚蓝(Thymol Blue)(大约在1.2-2.8以及8.0-0.6的pH范围内是有效的)，甲基红(Methyl Red)(pH 4.2-6.2)，溴百里酚蓝(Bromothymol Blue)(pH 6.0-7.6)以及酚红(Phenol Red)(pH 6.8-8.2)，其中所述的显色团染料所具有的最大吸收波长的变化是pH的函数。当所述的pH变为更强的碱性时，酚酞(pH 8.2-10.0)由无色转变为粉红色。这些比色性的pH指示剂可以从Sigma-Aldrich(St.Louis，Mo.)处获得。在酶学中存在许多使用pH指示剂来探测酶活性的例子(参见Lowry等人于1951年在J Biol Chem《生物化学杂志》193：265-275中发表的文章；Khalifah于1971年在J Biol Chem《生物化学杂志》246(8)：2561-73中发表的文章)。指示剂已经被用来对存在于溶液之中的各种不同的水解酶所具有的活性进行检测，其中所述的指示剂例如是百里酚蓝以及酚红(参见Moris-Varas等人于1999年在Bioorg Med Chem《生物有机化学与药物化学》(10)：2183-8中发表的文章)。
粘液素类型的氧-连接的糖基化作用
在高等的真核细胞中存在的氧-连接的糖基化作用的最为丰富的形式被认为是“粘液素类型”(参见Hang H以及Bertozzi C于2005年在Bioorg Med Chem《生物有机化学与药物化学》13(17)：5021-5034中发表的文章)。在粘液素的生物合成中的第一个步骤是α-N-乙酰基氨基半乳糖胺(GalNAc)在丝氨酸或者苏氨酸侧链的羟基基团上的加成作用从而形成了所述的Tn-抗原；这种转移是通过所述的多肽N-乙酰基-α-半乳糖基氨基转移酶(ppGalNAcTase)来完成的(参见Ten Hagen等人于2003年在Glycobiol 13(1)：1R-16R中发表的文章)。所述的Tn-抗原进一步的通过下游的糖基转移酶被进行了精细加工从而生成了各种不同的粘液素类型的结构(附图2)。到目前为止，已经识别出超过150种含有粘液素类型的糖基化作用的糖蛋白，它们中有许多都参与了疾病的恶化(参见Hang于2005年发表的文章)。一种这样的例子是粘蛋白1(MUC1)，一种已经被识别为肿瘤抗原的糖蛋白，这是因为它在癌症上皮细胞内发生的增加的表达，所述的糖蛋白同时促进了癌细胞的粘附作用以及肿瘤的入侵作用(参见Yu等人于2007年在J Biol Chem《生物化学杂志》282(1)：773-781中发表的文章；Kohlgraf等人于2003年在Cancer Res《癌症研究》63(16)：5011-5020中发表的文章)。与癌症有关的粘液素具有高度的免疫原性并且可以被用来作为免疫治疗的靶向(参见Hanisch以及Ninkovic于2006年在Curr Prot Pep Sic《蛋白质与肽科学的当前研究进展》7：307中发表的文章；Tarp以及Clausen在Press Biochem Biophys Acta中发表的文章)。
同源性的粘液素类型的氧-连接的糖肽以及糖蛋白的合成
所述的碳水化合物疫苗的研发需要获取大量的同源性的糖肽以及糖蛋白(参见Grogan等人于2002年在Annu Rev Biochem《生物化学年度回顾》71：593-634中发表的文章)。然而，对天然糖蛋白或者重组糖蛋白所进行的分离仅仅能够生成有限剂量的异源性的糖型结构，它们中的每一种能够表现出不同的生物学性质(参见Freire等人于2006年在Glycobiol 16(11)：1150中发表的文章)。糖共轭物的化学合成提供了同源性的底物，这是经由固相的肽合成(SPPS)来实现的，其中使用到一种被进行了适宜保护的糖基氨基酸构建模块(参见Marcaurelle以及Bertozzi于2002年在Glycobiol，12(6)：69R-77R中发表的文章)。天然的化学连接以及表达的蛋白质连接同样可以被用来建立糖位点，特别是在较大的肽并且甚至是蛋白质中(参见Muir TW于2003年在Annu Rev Biochem《生物化学年度回顾》72：249-289中发表的文章)。在这里进行描述的本发明之前，完成这些合成方法仍然需要一位经过特别训练的药剂师。本发明提供了酶的生成，其中所述的酶能够以一种制备型的比例进行有效的糖共轭物的合成，这对于针对它们的研究提供了很大的帮助，其中所述的研究是出于治疗目的的研究。
糖基转移酶的进化，用于进行所述的含有碳水化合物的天然产物的合成
对糖蛋白以及糖脂所进行的识别导致了对它们作为免疫治疗靶向的研究，其中所述的糖蛋白以及糖脂在所述的癌症细胞的表面上发生了过表达(参见Slovin等人于2005年在Immunol Cell Biol《免疫学与细胞生物学》83(4)：418中发表的文章)。由于与肿瘤有关的碳水化合物抗原通常情况下是以低水平以及各种不同的糖型结构来表达的，对具有充足剂量的离散的糖共轭物所进行的分离是困难的，其中所述的糖共轭物被用来研发基于碳水化合物的抗癌症疫苗。在这里所描述的本发明之前，随着所述的自动化装配技术的出现，用于所述的碳水化合物的化学合成的一般性方法已经得到了改进(参见Plante等人于2003年在Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry《碳水化合物化学与生物化学进展》第58卷，第35-54页中发表的文章)，但是仍然需要专门的医师来完成所述的大规模的保护基团的操作，这种操作是实现立体化学控制以及供体/受体兼容性的必要元素。所述的糖共轭物的化学合成所具有的其他缺点包括：在生成能够满足临床需求的大规模剂量时所具有的困难以及在对所述经过合成的材料进行纯化方面所具有的困难。
自然条件有效的进行了含有碳水化合物的化合物的制备，其中使用的是糖基转移酶(GTase)将糖从活化的供体分子(例如，UDP糖)向所述的适宜的受体(例如，蛋白质/肽，脂质，其他的糖类以及天然产物糖苷配基——聚酮类以及大环内酯类)进行了转移，这种转移作用是具有绝对的化学控制/立体化学性质的。下述的糖基转移酶使用三种不同的供体对多种多样的受体进行了糖基化作用，其中所述的供体中具有非常类似的折叠：GtfB-葡萄糖向万古霉素聚酮类中的转移，BTG β-糖基转移酶，以及MurG-GlcNAc在细胞壁生物合成中的转移。
尽管大多数的糖基转移酶具有高度的底物选择性，相对较少的结构基序被用来对很宽范围的糖基化受体进行糖基化作用(参见Hu Y以及Walker S于2002年在Chem Biol《生物化学》9：1287-1296中发表的文章)。本发明提供了对已有酶的定向进化，用以对具有改变的底物选择性的更加有潜力的催化剂进行识别。更为具体的，本发明提供了对突变的糖基转移酶所进行的识别，其中所述的糖基转移酶能够与化学合成作用进行竞争，用以对用于治疗目的的糖共轭物进行快速并且大规模的生产，其中所述的用于治疗目的的糖共轭物包括基于碳水化合物的癌症疫苗。
经过工程化处理的糖基转移酶具有巨大的潜力可以被用于进行生物学有关的糖共轭物的合成，所述的合成可以通过下述方式中的任何一种来实现：对天然的糖基化作用所具有的催化有效性进行的改进，或者导入非天然的糖残基(参见Hancock等人于2006年在Curr Opin Chem Biol《生物化学的当前观点》10(5)：509-519中发表的文章)。然而，在这里所描述的本发明之前，在通过定向进化对糖基转移酶进行工程化处理的方面进行了较少的尝试，这在很大程度上归因于用于对突变体进行筛选以及选择的方法的缺乏，其中所述的筛选以及选择的方法是以糖基转移酶所具有的活性为基础的。近来的例子包括对唾液酸转移酶(参见Lairson等人于2006年在Nat.Chem.Biol.《天然生物化学》2(12)：724-728中发表的文章)以及葡萄糖转移酶(参见Williams等人于2007年在Nat.Chem.Biol.《天然生物化学》3(10)：657-662中发表的文章)的工程化处理，但是在这些情况下所使用到的所述的筛选方法所具有的一般性是不清楚的。所述的第一种方法需要通过有能力的克隆物对荧光性底物进行吸收，从而通过流式细胞术对它们进行分选，而所述的第二种方法利用所述的荧光性分子本身作为所述的聚酮类受体。在这里所描述的本发明提供了一种一般性的策略，所述的策略允许使用天然底物或者具有最低的混乱程度的底物对多种多样的酶进行体外的筛选。
M13噬菌体展示是一种方便的策略，用以在对酶的工程化处理以及筛选中对表型与基因型进行联系，其中所述的酶不能够提供基于细胞的表型(参见Hoess R于2001年在Chem Rev《化学回顾》101：3205-3218中发表的文章)在噬菌体展示的酶的进化中，将酶以及底物以最接近的方式结合在所述的噬菌体表面之上，从而通过对所述产物的亲和性捕获而达到所述文库的去卷积作用。近来，已经研发出一种化学的直接方法，用以将所述的底物连接到所述的噬菌体表面上，其中使用到了硒代半胱氨酸残基(参见Love等人于2006年在Chembiochem《化学与生物化学》7(5)：753-756中发表的文章)。在那项研究中，所述的细菌性的糖基转移酶MurG以活化的形式在噬菌体上进行了表达；然而，一种MurG的成功进化并未取得成功，这归因于所述的结合噬菌体的酶没有能力对结合噬菌体的底物进行利用。在本发明中提供的所述新技术将所述的方法扩展至真核生物的酶，并且提供了经过改进的方法，用以对突变的糖基转移酶的文库进行筛选。
在本发明中描述的所述方法所具有的一项优点是：既不用对所述的酶进行检测，所述的底物也不需要被连接在任何类型的固体支撑物之上，其中所述的底物是针对那些酶而言的底物，所述的固体支撑物例如是一种固体表面，另外一个细胞，等等。而且，本发明中所述的方法是利用经过分泌的生物分子在溶液中完成的。本发明提供了对生物分子的筛选，其中所述的生物分子是由单独的细胞进行分泌的，而不是从小菌落中进行分泌的，其中小菌落指的是细胞团。除此之外，可以通过利用玻璃毛细管的显微操作技术从所述的装置中对分泌活性克隆物的细胞进行回收，并且随后可以对其进行随机突变用以进行进一步的筛选，或者对其进行测序用以对所编码的酶进行识别。
在本发明中描述的所述方法所具有的另外一个区别性的特征在于：在所述的筛选过程中，对每一个文库成员所具有的多重特征进行评价。不同于在噬菌体上进行的表面展示方法，可以对存在于所述的微型反应器内的细菌细胞或者酵母、所述的酶转换的速率进行实施的监测，这种监测是以发生在所测量到的荧光强度上的变化为基础的。使用两种底物来进行的竞争性检测允许在所述的筛选过程中对底物的特异性或者选择性进行直接的监测，其中所述的两种底物被利用不同的荧光团进行了修饰。与已有的技术相比，这些测量方法能够提供更大程度的克隆物的多样性，其中所述的克隆物是被识别并且筛选出来用于下一轮中的克隆物。
应用
生物催化作用是用以进行大批量的化学制剂、医药品以及食品成分的合成的一种重要工具。然而，这种应用的数量以及多样性受到了局限，这可能归因于存在于酶的稳定性、催化性质中的限制，即，转换率，以及底物的范围。一种生物催化剂的工具试剂盒的取得将能够帮助行业克服当前的局限并且能够实现许多新的应用，从一步的酶转化到多步的微生物合成，这是经由代谢途径的工程学来实现的。
对所述的含有碳水化合物的天然产物的生物合成是行业内格外感兴趣的，因为通过传统的方式对它们进行合成时需要冗长的保护基团的操作技术以及在糖基化供体/受体兼容性方面的研究。来自于糖蛋白或者糖脂构建体的治疗性的疫苗是用于进行癌症的免疫治疗的一种有前途的方式，其中所述的糖蛋白或者糖脂构建体在所述的恶性细胞的表面上发生了过表达。
新的大环内酯类抗生素的合成
具有抗生素抗性的细菌感染的增加的发生率预示着对改进的构建体的需求，其中所述的构建体用来对感染有肠球菌的患者进行治疗。许多大环内酯类以及聚酮类抗生素中含有碳水化合物，这些碳水化合物能够参与对一种细胞靶向的识别并且因此对于活性而言是必不可少的(参见Walsh C于2003年发表的Antibiotics：Actions，origins，resistance《抗生素的作用，来源，抗性》第1版；美国微生物学会出版社(Americal Society for Microbiology Press)：华盛顿)。在所述的糖取代基上及其周围对已有的糖肽类抗生素所进行的修饰已经引发了新的治疗剂的临床试验，其中所述的治疗剂包括奥利万星(oritavancin)，所述的糖肽类抗生素例如是万古霉素以及替考拉宁(参见Dong等人于2002年在J Am Chem Soc《美国化学学会杂志》124：9064-9065中发表的文章)。糖基转移酶的适应作用将为针对治疗试剂的研究提供新的材料，其中所述的糖基转移酶作为催化剂被用于多种多样的碳水化合物与天然产物聚酮类、蛋白质以及脂质的连接反应之中。在本发明中提供的所述方法能够对酶进行识别，其中所述的酶能够有效的对一定范围的底物进行糖基化处理并且继续进行所述催化剂的生成，其中所述的催化剂能够与化学合成反应进行竞争，用以对糖共轭物进行快速并且大规模的生产。
实施例1.一种新技术的形成，所述的技术被用来对具有改 进的催化活性或者改变的底物特异性的突变的酶文库进行筛选
下面的试验是由下述的内容组成的：(1)对一种技术进行的描述，所述的技术用于对一种酵母细胞文库进行空间分割，其中所述的酵母细胞能够分泌一种目标酶，以及(2)对来自于一种灭活变体中的细胞进行富集，用以确定所述的技术所具有的敏感性，其中所述的细胞能够表达一种活化的蛋白酶。简要的说，将一种酵母细胞文库装载于具有50微米的直径的微孔内，其中所述的酵母细胞能够分泌出一种目标蛋白质，这样一来每一个孔中平均含有一个文库成员。利用酶底物以平行的方式对存在于所述的装置中的每一个间隔进行查看；成功的酶转换会产生一种荧光性的信号。利用一种蛋白酶对所述的技术所具有的可行性进行证明。
孔的微制造阵列已经被用在多种多样的生物学应用之中。已经证实微孔能够被有效的用来在所述的单一分子的水平上对酶学进行研究，并且具有50-100微米的直径的孔已经被用来对细胞进行分离，用以对在一种表面上捕获到的分泌产物进行筛选(参见Rondelez等人于2005年在Nat Biotechnol《自然生物技术》23(3)：361-365中发表的文章；Love等人于2006年在Nat Biotechnol《自然生物技术》24(6)：703-707中发表的文章)。属于后面那种类型的微型装置在一种通常的显微镜载玻片尺寸(1”x 3”)的脚本中含有大约100000个孔，这使得在一台光学显微镜上在一天的时间内使用10个这样的装置对具有适度大小的文库(106个成员)进行筛选是可能的。
表达宿主的筛选
本发明提供了对由细胞分泌的生物分子的筛选。在一个方面，所述的细胞是原核细胞。或者可供选择的，所述的细胞是真核细胞。优选的，所述的真核细胞是酵母细胞。一种范例性的酵母细胞包括巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。能够分泌出质粒编码的蛋白质的酵母细胞被用来进行所述酶的表达，其中所述的酶被用来通过本发明中所述的方法来进行进化。真核生物的表达宿主，例如酵母，在所述的多种多样的酶的进化方面提供了超越细菌性表达的优点，其中所述的酶包括多肽N-乙酰基-α-半乳糖基氨基转移酶(ppGalNAcTase)，因为它们含有进行适宜的蛋白质折叠、分泌以及翻译后的修饰所必需的机构。对于使用微型装置所进行的空间分割而言，酵母同样具有一种理想的大小(大约5-10微米的直径)，所述的空间分割是以每孔一个细胞的比例进行的，其中每一个孔具有50微米的直径。除此之外，酵母快速的发生分裂，使得在几小时内对一种文库成员所具有的基因型进行鉴定成为可能，其中所述的文库成员来自于一个单独的细胞。
酵母细胞所具有的分泌被编码的酶的能力相对于细胞周期而存在变化；在所述的萌芽过程中，酵母在蛋白质的分泌方面最为有效。在一个方面，通过使用酵母的表面展示对所述酵母在分泌方面存在的大程度的变化进行规避，或者对所述酵母无法分泌一种特定的目标蛋白质的能力进行规避。酵母的表面展示已经被有效的用在多种多样的抗体的进化反应中，并且几种活化的酶之前已经被展示在所述酵母的表面之上(参见Gai以及Wittrup于2007年在Current Opinion in Structural Biology《结构生物学的当前观点》17(4)：467-473中发表的文章)。
利用一种模型酶对所述的技术进行的校验
首先利用所述的3C类型的半胱氨酸蛋白酶对上述发明的酶的筛选策略所具有的可行性进行测试，其中所述的半胱氨酸蛋白酶来自于烟草蚀刻病毒(TEV)(参见Malcolm B于1995年在Protein Sci《蛋白质科学》4(8)：1439-1445中发表的文章)。在烟草蚀刻病毒(TEV)中的残基151上的催化性的半胱氨酸上发生的突变产生了一种催化性质灭活的变体，其中所述的突变从半胱氨酸变为了丙氨酸(参见Phan等人于2002年在J Biol Chem 《生物化学杂志》277(52)：50564-50572中发表的文章)。以各种不同的比例(1∶10000，1∶100，1∶10)将含有所述基因的载体进行混合，其中所述的基因是烟草蚀刻病毒(TEV)蛋白酶的天然物种以及突变物种的基因，并且所述的载体混合物被用来建立一种模型文库，用于进行所述的催化活性物种的富集。按照上文中所概述的内容将利用所述的载体混合物进行转化的酵母细胞分割在孔内(附图1)。使用对烟草蚀刻病毒(TEV)蛋白酶而言的最适宜的识别位点(ENLYFQG；序列识别号：1)对所述的检测所具有的敏感度进行确定，将其作为一种荧光共振能量转移(FRET)底物的一部分(选项1；附图3)(参见Malcolm于1995年发表的文章；Behlke等人于2005年在Integrated DNA Technologies《综合DNA技术》中发表的文章Fluorescence and fluorescence applications《荧光性以及荧光性的应用》)。在所述的谷氨酸以及甘氨酸残基之间发生的肽的断裂破坏了所述的分子内的荧光共振能量转移(FRET)的淬火并且生成了一种荧光信号。
催化活性以及底物特异性的进化
经过了克隆物的成功富集之后，开始进行用于所述的烟草蚀刻病毒(TEV)蛋白酶的定向进化的模型试验，其中所述的克隆物能够表达活性催化剂。为了对所述的筛选能力进行进一步的证明，使用错配PCR(聚合酶链式反应)对所述的灭活的C151A突变体进行随机突变，用以恢复成为具有催化能力的变体，其中所述的筛选是以所述的催化活性为基础的。尽管活性将可能被得以重建，利用改变的变异作用对有能力的变体进行识别是可能的，其中所述活性的重建是发生在残基151上的所述变异作用的直接逆转的结果。由于所具有的对酶的动力学进行筛选的能力是可以预期的，对具有增强的催化活性的克隆物进行识别是可能的，其中所述的增强是相较于野生型烟草蚀刻病毒(TEV)蛋白酶而言的。最终，可以对一种变体文库进行检查，其中所述的变体文库是通过所述的野生型烟草蚀刻病毒(TEV)蛋白酶的突变作用而构建的，所述的突变作用被用来进行一种非天然底物的断裂(选项2(2，X为丙氨酸)附图3)。经过每一轮的筛选之后，通过利用一种玻璃毛细管的显微操作技术将分泌活性克隆物的细胞从所述的装置中回收。经过回收的克隆物将可以被进行随机突变用以进行进一步的筛选，或者被进行测序，用以对所编码的酶进行识别。
实施例2.一种具有改进的催化活性的突变的糖基转移酶的 进化
下面的试验是由多肽N-乙酰基-α-半乳糖基氨基转移酶(ppGalNAcTase)突变体的进化所构成的，其中所述的多肽N-乙酰基-α-半乳糖基氨基转移酶(ppGalNAcTase)具有增强的催化有效性以及改变的底物特异性。微型装置被用来对多肽N-乙酰基-α-半乳糖基氨基转移酶-T1(ppGalNAcTase-T1)突变体进行筛选，其中所述的突变体具有改进的催化有效性。多肽N-乙酰基-α-半乳糖基氨基转移酶(ppGalNAcTase)负责进行所述的α-N-乙酰基氨基半乳糖胺(alpha-GalNAc)向丝氨酸/苏氨酸残基的转移，从而形成了所述的Tn-抗原，一种与肿瘤有关的碳水化合物表位。在这项筛选中被识别出来的突变体被用来进行所述的Tn-抗原的体外合成。
一种鼠科动物多肽N-乙酰基-α-半乳糖基氨基转移酶-T1(ppGalNAcTase-T1)的新近的晶体结构表明，这种蛋白质能够发生折叠从而形成独特的催化结构域以及外源凝集素结构域(参见Fritz等人于2004年在Proc Natl Acad Sci《美国科学院院刊》101(43)：15307-15312中发表的文章)。错配聚合酶链式反应(PCR)被用来建立多肽N-乙酰基-α-半乳糖基氨基转移酶-T1(ppGalNAcTase-T1)的随机文库，其中所述的多肽N-乙酰基-α-半乳糖基氨基转移酶-T1(ppGalNAcTase-T1)在其催化结构域内发生了突变。按照之前所描述的对一种转化体的文库进行空间上的分割并且使用荧光性的底物对其进行筛选(附图4)。
荧光性的多肽N-乙酰基-α-半乳糖基氨基转移酶(ppGalNAcTase)底物的设计以及合成
一种经过荧光素修饰的UDP-糖类供体连同一种经过5-羧基四甲基若丹明(TAMRA)修饰的肽受体一同，允许在经过糖基化作用之后在580纳米下进行产物的探测，这种探测归因于存在于所述的两种荧光团之间的荧光共振能量转移(FRET)(参见Behlke于2005年发表的文章)。根据关于多肽N-乙酰基-α-半乳糖基氨基转移酶-T1(ppGalNAcTase-T1)以及其他被保留的糖基转移酶所具有的UDP-糖类结合袋的结构信息，按照先前针对UDP-N-乙酰基葡萄糖胺(GlcNAc)所进行的报道对一种UDP-N-乙酰基氨基半乳糖胺(GalNAc)底物(3)进行合成，其中所述的底物在C-2处承载有荧光素(参见Fritz于2004年发表的文章；Patenaude于2002年发表的文章；Helm等人于2003年在J Am Chem Soc《美国化学学会杂志》125：11168-11169中发表的文章)。使用可以商业购买获得的试剂，利用一种C-末端5-羧基四甲基若丹明(TAMRA)对含有一种最优化的底物序列(GAGAFFPTPGPAGAGK；序列识别号：2)的受体肽4进行合成，其中所述的序列用于通过多肽N-乙酰基-α-半乳糖基氨基转移酶-T1(ppGalNAcTase-T1)而进行糖基化作用(参见Gerken等人于2006年在J Biol Chem《生物化学杂志》281(43)：32403-32416中发表的文章)。
回收克隆物所具有的活性的确认
经过足够轮的文库筛选以及扩增之后(通常情况下为4-6轮)，通过利用一种毛细玻璃管的显微操作技术将分泌活性克隆物的细胞从所述的装置中回收出来，并且随后对其进行随机突变用以进行进一步的筛选，或者对其进行测序用以对所编码的酶进行识别。利用天然、未经修饰的UDP-N-乙酰基氨基半乳糖胺(GalNAc)以及肽底物对所编码的酶进行测试，用以识别出那些最能够进行所述Tn-抗原的体外合成的酶。具有这种能力的文库成员被用来对Tn-抗原进行大量的合成，用以进行进一步的研究，其中所述的研究针对的是所述抗原所具有的免疫学性质以及在研发抗癌症疫苗方面所具有的可能的用途。
经过分泌的酶或者在表面展示的酶可能不能够对含有大体积荧光团的合成底物进行利用，其中所述的大体积荧光团是被导入用以对酶的功能进行检测的。在一个方面，存在于每一种底物之中的所述荧光团所具有的位置是存在变化的，直至获得了一种可以接受的版本，其中所述的底物特别是所述的经过修饰的UDP-N-乙酰基氨基半乳糖胺(GalNAc)。或者可供选择的，经过叠氮官能团化的UDP糖类被常规性的用来进行体内的糖基化作用的研究；所述的叠氮基团是一种有效的化学标签，用于进行进一步的衍生化以及底物的探测(参见Campbell等人于2007年在Molecular Biosystems《分子生物系统》3(3)：187-194中发表的文章)。在另外一个方面，所述的多肽N-乙酰基-α-半乳糖基氨基转移酶(ppGalNAcTase)受体肽是利用生物素进行修饰的，从而允许在一种夹心类型的检测中利用一种外源凝集素或者抗体对发生耦合的产物进行捕获以及随后的探测。在一个方面，所述的生物素标签被用在亲和色谱法中，其中在所述的亲和色谱法中一同使用了一种结合有亲和素(也可以是链霉亲和素以及中性亲和素)的柱，其中所述的亲和素是生物素的天然螯合剂。或者可供选择的，这种标签被用在所述蛋白质的探测中，其中所述的探测是经由抗生物素抗体或者带有亲和素/链霉亲和素标签的探测剂来实现的，其中所述的探测剂例如是辣根过氧化物酶或者是一种荧光染料。
具有改变的底物优先性的突变的多肽N-乙酰基-α-半乳糖基氨基转移酶(ppGalNAcTase)的进化
对一种被保留的糖基转移酶所进行的结构研究已经表明，所述酶所具有的具体残基与存在于所述的UDP糖类供体(C-3以及C-4)中的半族所发生的接触能够增强UDP-N-乙酰基氨基半乳糖胺(GalNAc)所具有的特异性，这种特异性的增强是相对于UDP-N-乙酰基葡萄糖胺(GlcNAc)而言的，其中所述的被保留的糖基转移酶与多肽N-乙酰基-α-半乳糖基氨基转移酶-T1(ppGalNAcTase-T1)是高度相关的(参见Patenaude等人于2002年在Nat Struct Biol《天然结构生物学》9(9)：685-690中发表的文章；Fritz等人于2006年在J Biol Chem《生物化学杂志》281(13)：8613-8619中发表的文章)。如上所述的利用一种经过荧光素修饰的UDP-N-乙酰基葡萄糖胺(GlcNAc)供体对所述的突变的T 1变体文库所进行的筛选产生了这样的克隆物，所述的克隆物能够对这种非天然的底物进行转移，并且增加了对于所述的糖基转移酶所具有的活性位点特异性的理解。
向其他的粘液素类型的糖共轭物的合成的扩展
通过对唾液酸基转移酶ST6GalNAc-1进行的突变对上文中所描述的合成进行扩展，用以制备所述的唾液酸基Tn-抗原(附图2)，其中使用到所述的体外合成的Tn-抗原作为底物。酶的研发使得能够对这种类型的糖共轭物进行生物学的研究，其中所述的酶被用来进行各种不同的粘液素类型的核心结构的体外合成，所述的糖共轭物被牵涉在各种不同的疾病之中。
实施例3.发生在微孔中的酶的转换——胰岛素断裂检测
下述的试验证实了在一种不含有细胞的微孔系统内对酶活性所进行的探测。在附图11中用图表表示出的是一种用于在微孔内对酶的转换进行探测的方法，其中所述的探测是经由一种胰岛素断裂检测来实现的。在微孔内，利用10微克/毫升的异硫氰基荧光素-酪蛋白(FTC-casein)对增加浓度的(0.05微克/毫升，0.5微克/毫升，以及5微克/毫升)胰岛素进行1小时的培养。正如附图12中所表示出的，所观察到的荧光性信号所具有的强度取决于存在于所述的微孔之中的所述胰岛素具有的浓度。在一项单独的试验中，在微孔内利用10微克/毫升的异硫氰基荧光素-酪蛋白(FTC-casein)对0.5微克/毫升的胰岛素进行培养，并且在1小时以及18小时时拍摄显微镜照片。正如附图13中所表示出的，所观察到的荧光性信号所具有的强度取决于所述的培养时间。微孔之前已经被用来对在微孔内分离的酶进行研究。参见，JP2004309405A1；以及Rondelez等人于2005年在Nat Biotechnol《自然生物技术》23(3)：361-365中发表的文章。
实施例4.发生在微孔中的分泌的酶的转换——人鼻病毒-3C (HRV-3C)蛋白酶检测
下述试验证明了一种酶对一种肽底物所进行的断裂，从而利用一种明亮的荧光性信号对含有活性酶的细胞进行识别，其中所述的酶即为由存在于本发明中所述的微型装置中的单独的巴斯德毕赤酵母(酵母)细胞分泌得到的蛋白酶，所述的肽底物上带有一种荧光共振能量转移(FRET)报告基因对。具体的，巴斯德毕赤酵母经过了遗传工程化处理，从而分泌出人类鼻病毒3C蛋白酶(HRV-3CP)，所述的蛋白酶能够切断一种肽底物的序列(EDANS-A-L-E-V-L-F-Q/G-P-K-DABCYL；序列识别号：3)。在附图14中用图表表示的是一种用以对存在于微孔中的酶的转换进行探测的方法，其中所述的探测是经由人鼻病毒-3C蛋白酶(HRV-3CP)检测来实现的。将能够分泌所述的人鼻病毒-3C蛋白酶(HRV-3CP)酶的巴斯德毕赤酵母装载于所述的微型装置之中。在存在有所述的荧光共振能量转移(FRET)肽底物(EDANS-A-L-E-V-L-F-Q/G-P-K-DABCYL；序列识别号：3)的条件下，在所述的微型装置中对所述的细胞进行18小时的培养，其中所述的肽底物是以100微克/毫升的水平在YPD中提供的，在所述的YPD中补充有50毫摩的Tris，pH为7.0，150毫摩的氯化钠，以及1毫摩的乙二胺四乙酸(EDTA)。所述被分泌的酶成功的切断了所述的底物，生成了一种荧光性的信号。存在于所述的附图15的左侧小组中的箭头指向的是存在于孔中的细胞，所述的细胞对应于在所述的附图15的右侧小组中很好的观察到的明亮的荧光。

Claims (16)

1.一种用以实现溶液相的生物分子的筛选的方法，包括：
将一种细胞文库沉积在一种微型装置之上，其中在所述的微型装置中含有能够对存在于溶液之中的所述细胞进行空间上的分割的孔，其中所述的细胞以大约每孔一个细胞的水平被进行了分配，其中大量的细胞能够在所述的溶液中分泌至少一种生物分子的变体；
将所述的经过分泌的生物分子变体与至少一种光学信号底物进行接触，每一种代表着一种期望的生物分子的表型或者活性；
以多种参数为基础，对由所述的细胞编码的所述生物分子所具有的表型进行评价，并且
将所述的细胞从所述的微型装置中分离出来，其中所述的细胞分泌出一种期望的生物分子变体。
2.根据权利要求1中所述的方法，其中通过下述方式对所述的表型进行评价：对一种或者多种光学信号随时间的变化进行探测，其中所述的光学信号是由存在于所述的细胞文库之中的一种或者多种光学信号底物产生的，其中这样的变化代表着所述的生物分子的变体所具有的期望的生物分子表型或者活性。
3.根据权利要求2中所述的方法，其中所述的光学信号是一种荧光性的信号。
4.根据权利要求3中所述的方法，其中在所述的微型装置中以实时的方式或者近似于实时的方式对所述的生物分子的表型或者活性进行监测，其中所述的监测是以所述的荧光性信号所具有的强度所发生的变化为基础的。
5.根据权利要求1中所述的方法，其中所述的生物分子选自由下述所组成的组中：肽，多肽，蛋白酶，氧化还原酶，转移酶，水解酶，裂解酶，异构酶，连接酶，酶，抗体，细胞因子，趋化因子，核酸，代谢产物，小分子(小于1千道尔顿)以及合成分子。
6.根据权利要求5中所述的方法，其中所述的生物分子所具有的分子量超过大约600道尔顿并且小于大约100000道尔顿。
7.根据权利要求1中所述的方法，其中所述的参数选自由下述参数所组成的组中：催化速率，反应的特异性，动力学有效性，以及底物的结合亲和性。
8.根据权利要求7中所述的方法，其中所述的参数是以平行的方式被进行评价的。
9.根据权利要求1中所述的方法，其中所述的细胞是真核细胞。
10.根据权利要求9中所述的方法，其中所述的真核细胞是酵母细胞。
11.根据权利要求1中所述的方法，其中所述的细胞具有存在于大约10微米至100微米之间的直径。
12.根据权利要求1中所述的方法，其中通过利用一种玻璃毛细管的显微操作技术对所述的细胞进行分离。
13.根据权利要求12中所述的方法，其中进一步的包括对所述的生物分子进行随机突变的步骤。
14.根据权利要求12中所述的方法，其中进一步的包括对所述的生物分子进行测序的步骤。
15.根据权利要求1中所述的方法，其中所述的生物分子是一种突变的糖基转移酶(GTase)或者是一种糖苷酶。
16.根据权利要求15中所述的方法，其中所述的糖基转移酶能够与化学合成方法进行竞争，用以对复杂的碳水化合物进行快速并且大规模的生产。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105740509A (zh) * 2016-01-22 2016-07-06 河北工业大学 一种考虑脱硼的分流部分二级卷式膜元件反渗透海水淡化系统优化方法
CN109155149A (zh) * 2016-03-29 2019-01-04 瑞泽恩制药公司 遗传变体-表型分析系统和使用方法

Families Citing this family (52)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8748103B2 (en) 2008-11-07 2014-06-10 Sequenta, Inc. Monitoring health and disease status using clonotype profiles
EP2719774B8 (en) 2008-11-07 2020-04-22 Adaptive Biotechnologies Corporation Methods of monitoring conditions by sequence analysis
US9365901B2 (en) 2008-11-07 2016-06-14 Adaptive Biotechnologies Corp. Monitoring immunoglobulin heavy chain evolution in B-cell acute lymphoblastic leukemia
US9528160B2 (en) 2008-11-07 2016-12-27 Adaptive Biotechnolgies Corp. Rare clonotypes and uses thereof
US8628927B2 (en) 2008-11-07 2014-01-14 Sequenta, Inc. Monitoring health and disease status using clonotype profiles
US8691510B2 (en) 2008-11-07 2014-04-08 Sequenta, Inc. Sequence analysis of complex amplicons
US9506119B2 (en) 2008-11-07 2016-11-29 Adaptive Biotechnologies Corp. Method of sequence determination using sequence tags
CA2745437C (en) 2008-12-04 2015-10-20 Massachusetts Institute Of Technology Method for diagnosing allergic reactions
US9404924B2 (en) 2008-12-04 2016-08-02 Massachusetts Institute Of Technology Method of performing one-step, single cell RT-PCR
DK2387627T3 (en) 2009-01-15 2016-07-04 Adaptive Biotechnologies Corp Adaptive immunity profiling and methods for producing monoclonal antibodies
US9244071B2 (en) 2009-01-21 2016-01-26 Massachusetts Institute Of Technology Compositions and methods for assessing cytotoxicity of single cells
JP2012531202A (ja) 2009-06-25 2012-12-10 フレッド ハチンソン キャンサー リサーチ センター 適応免疫を測定する方法
US9043160B1 (en) 2009-11-09 2015-05-26 Sequenta, Inc. Method of determining clonotypes and clonotype profiles
US10087408B2 (en) 2010-07-07 2018-10-02 The University Of British Columbia System and method for microfluidic cell culture
US20130115606A1 (en) 2010-07-07 2013-05-09 The University Of British Columbia System and method for microfluidic cell culture
US10385475B2 (en) 2011-09-12 2019-08-20 Adaptive Biotechnologies Corp. Random array sequencing of low-complexity libraries
EP2768982A4 (en) 2011-10-21 2015-06-03 Adaptive Biotechnologies Corp QUANTIFICATION OF ADAPTIVE IMMUNOCELL GENOMES IN A COMPLEX MIX OF CELLS
US9824179B2 (en) 2011-12-09 2017-11-21 Adaptive Biotechnologies Corp. Diagnosis of lymphoid malignancies and minimal residual disease detection
US9499865B2 (en) 2011-12-13 2016-11-22 Adaptive Biotechnologies Corp. Detection and measurement of tissue-infiltrating lymphocytes
WO2013134162A2 (en) 2012-03-05 2013-09-12 Sequenta, Inc. Determining paired immune receptor chains from frequency matched subunits
BR112014027309A2 (pt) 2012-05-08 2017-07-11 Adaptive Biotechnologies Corp composições e métodos para medir e calibrar a tendên-cia de amplificação em reações de pcr multiplexadas
AU2013327423B2 (en) 2012-10-01 2017-06-22 Adaptive Biotechnologies Corporation Immunocompetence assessment by adaptive immune receptor diversity and clonality characterization
WO2015160439A2 (en) 2014-04-17 2015-10-22 Adaptive Biotechnologies Corporation Quantification of adaptive immune cell genomes in a complex mixture of cells
GB2511761A (en) 2013-03-11 2014-09-17 Cancer Rec Tech Ltd Methods for detecting molecules in a sample
US9708657B2 (en) 2013-07-01 2017-07-18 Adaptive Biotechnologies Corp. Method for generating clonotype profiles using sequence tags
CA2941612A1 (en) 2014-03-05 2015-09-11 Adaptive Biotechnologies Corporation Methods using randomer-containing synthetic molecules
JP6366053B2 (ja) * 2014-03-31 2018-08-01 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 標準試料製造方法
US10066265B2 (en) 2014-04-01 2018-09-04 Adaptive Biotechnologies Corp. Determining antigen-specific t-cells
US11390921B2 (en) 2014-04-01 2022-07-19 Adaptive Biotechnologies Corporation Determining WT-1 specific T cells and WT-1 specific T cell receptors (TCRs)
CA2966201A1 (en) 2014-10-29 2016-05-06 Adaptive Biotechnologies Corp. Highly-multiplexed simultaneous detection of nucleic acids encoding paired adaptive immune receptor heterodimers from many samples
US10246701B2 (en) 2014-11-14 2019-04-02 Adaptive Biotechnologies Corp. Multiplexed digital quantitation of rearranged lymphoid receptors in a complex mixture
AU2015353581A1 (en) 2014-11-25 2017-06-15 Adaptive Biotechnologies Corporation Characterization of adaptive immune response to vaccination or infection using immune repertoire sequencing
CN107407638B (zh) 2014-12-03 2021-01-12 伊索普莱西斯公司 细胞分泌特征的分析和筛选
CA2976580A1 (en) 2015-02-24 2016-09-01 Adaptive Biotechnologies Corp. Methods for diagnosing infectious disease and determining hla status using immune repertoire sequencing
WO2016149639A1 (en) 2015-03-19 2016-09-22 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Devices and methods for high-throughput single cell and biomolecule analysis and retrieval in a microfluidic chip
WO2016161273A1 (en) 2015-04-01 2016-10-06 Adaptive Biotechnologies Corp. Method of identifying human compatible t cell receptors specific for an antigenic target
US10677793B2 (en) * 2015-04-21 2020-06-09 General Automation Lab Technologies Inc. High resolution systems, kits, apparatus, and methods using lateral flow for high throughput microbiology applications
WO2017124101A2 (en) 2016-01-15 2017-07-20 The Broad Institute Inc. Semi-permeable arrays for analyzing biological systems and methods of using same
US10428325B1 (en) 2016-09-21 2019-10-01 Adaptive Biotechnologies Corporation Identification of antigen-specific B cell receptors
EP3532600A4 (en) * 2016-10-19 2020-09-16 General Automation LAB Technologies Inc. HIGH RESOLUTION SYSTEMS, KITS, DEVICES AND METHODS FOR SCREENING MICRO-ORGANISMS AND OTHER HIGH-PERFORMANCE MICROBIOLOGICAL APPLICATIONS
CN110199196B (zh) 2016-11-11 2022-09-30 伊索普莱克西斯公司 用于单细胞的同时基因组，转录本和蛋白质组分析的组合物和方法
US11525783B2 (en) 2016-11-22 2022-12-13 IsoPlexis Corporation Systems, devices and methods for cell capture and methods of manufacture thereof
JP7356351B2 (ja) 2016-12-12 2023-10-04 エクセラ・バイオサイエンシーズ・インコーポレイテッド マイクロキャピラリーアレイを使用したスクリーニングのための方法およびシステム
US11085039B2 (en) 2016-12-12 2021-08-10 xCella Biosciences, Inc. Methods and systems for screening using microcapillary arrays
CA3048904A1 (en) 2016-12-30 2018-07-05 xCella Biosciences, Inc. Multi-stage sample recovery system
US11254980B1 (en) 2017-11-29 2022-02-22 Adaptive Biotechnologies Corporation Methods of profiling targeted polynucleotides while mitigating sequencing depth requirements
JP2021505157A (ja) 2017-12-07 2021-02-18 マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー 単一細胞分析
JP7351290B2 (ja) * 2018-03-12 2023-09-27 ソニーグループ株式会社 細胞評価装置及び細胞評価システム
SG11202105441WA (en) 2018-12-13 2021-06-29 Dna Script Direct oligonucleotide synthesis on cells and biomolecules
CN111041025B (zh) 2019-12-17 2021-06-18 深圳市瑞吉生物科技有限公司 基于结合N-乙酰半乳糖胺多肽的mRNA靶向分子及其制备方法
CN111744019B (zh) 2020-07-01 2023-08-04 深圳瑞吉生物科技有限公司 基于甘露糖的mRNA靶向递送系统及其应用
WO2023133566A1 (en) * 2022-01-07 2023-07-13 The Regents Of The University Of California Systems and methods for particle mapping

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL68507A (en) * 1982-05-10 1986-01-31 Univ Bar Ilan System and methods for cell selection
US6171820B1 (en) * 1995-12-07 2001-01-09 Diversa Corporation Saturation mutagenesis in directed evolution
US6410252B1 (en) * 1995-12-22 2002-06-25 Case Western Reserve University Methods for measuring T cell cytokines
US6210910B1 (en) * 1998-03-02 2001-04-03 Trustees Of Tufts College Optical fiber biosensor array comprising cell populations confined to microcavities
US5914245A (en) 1998-04-20 1999-06-22 Kairos Scientific Inc. Solid phase enzyme kinetics screening in microcolonies
US6576478B1 (en) * 1998-07-14 2003-06-10 Zyomyx, Inc. Microdevices for high-throughput screening of biomolecules
EP1292699A1 (en) * 2000-04-05 2003-03-19 California Institute Of Technology Screening method for the discovery and directed evolution of oxygenase enzymes
JP2005253412A (ja) * 2004-03-15 2005-09-22 Masayasu Suzuki マイクロウェルアレイチップ、その製造方法及び被検体の活性検定方法
WO2007035633A2 (en) * 2005-09-16 2007-03-29 President & Fellows Of Harvard College Screening assays and methods
US7995202B2 (en) * 2006-02-13 2011-08-09 Pacific Biosciences Of California, Inc. Methods and systems for simultaneous real-time monitoring of optical signals from multiple sources

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GAVIN J WILLIAMS: "A high-throughput fluorescence-based glycosyltransferase screen and its application in directed evolution", 《NATURE PROTOCOLS》 *
J CHRISTOPHER LOVE等: "A microengraving method for rapid selection of single cells producing antigen-specific antibodies", 《NATURE BIOTECHNOLOGY》 *
TAKESHI FUKUDA,等: "Development of High-Throughput Screening System by Single-Cell Reaction Using Microchamber Array Chip", 《JOURNAL OF BIOSCIENCE AND BIOENGINEERING》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105740509A (zh) * 2016-01-22 2016-07-06 河北工业大学 一种考虑脱硼的分流部分二级卷式膜元件反渗透海水淡化系统优化方法
CN109155149A (zh) * 2016-03-29 2019-01-04 瑞泽恩制药公司 遗传变体-表型分析系统和使用方法

Also Published As

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US20180335419A1 (en) 2018-11-22

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