CN110199196B - 用于单细胞的同时基因组,转录本和蛋白质组分析的组合物和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了用于对单细胞的一种或多种细胞内靶进行多重分析的组合物和方法。本公开的示例性组合物包含表面,所述表面包含与其可操作地连接的多种捕获剂,其中每种捕获剂特异性结合不同的细胞内靶,并且其中所述多种捕获剂形成重复图案;包括多个室的基体,其中所述基体可释放地与所述表面连接,并且其中所述多个室中的每个室包括所述表面的所述多种捕获剂的重复图案的至少一个重复;包含细胞裂解组合物的涂敷组合物;和包含官能化组分和延伸组分的连接体组合物。
Description
【相关申请】
本申请要求2016年11月11日提交的临时申请USSN 62/421,031和2017年8月11日提交的USSN 62/544,521的权益,其内容各自通过引用整体并入本文。
【技术领域】
本公开内容涉及分子生物学,更具体地,涉及用于在单细胞内多重分析细胞内蛋白质组分,相互作用和信号传导的组合物和方法。
【背景技术】
本领域对于用于以同时捕获和分析数百个细胞内组分(包括平行的数千个细胞中的每一个的DNA,RNA,代谢物和蛋白质水平)的高通量形式多重分析单细胞内细胞内蛋白质相互作用和信号传导,以及在细胞内阻断的分泌蛋白质信号的组合物和方法已经存在长期但未满足的需求。本公开提供了解决这些长期但未满足的需求的系统和方法。
【发明概述】
本公开的系统提供了用于以可以同时平行分析多个数千个细胞中的每个细胞的数百个细胞内组分的高通量形式在单细胞内多重分析细胞内蛋白质相互作用和信号传导的组合物和方法。在某些实施方式中,本公开内容提供了用于控释释放裂解组合物的组合物,其在与细胞接触时破坏细胞膜并使细胞的细胞内组分暴露于重复捕获剂模式的单一重复。本发明的捕获剂特异性结合细胞的至少一种细胞内组分以形成至少一种复合物。至少一种复合物(包含捕获剂和细胞内组分)的可视化可以指示或证明细胞内的蛋白质表达,蛋白质调节,蛋白质-蛋白质相互作用,蛋白质活化和/或蛋白质信号传导事件。
本公开内容提供了一种组合物,其包含:表面,所述表面包含与其可操作地连接的多种捕获剂,其中每种捕获剂特异性结合不同的细胞内靶,并且其中所述多种捕获剂形成重复图案;包括多个室的基体,其中所述基体可释放地与所述表面连接,并且其中所述多个室中的每个室包括所述表面的所述多种捕获剂的重复图案的至少一个重复;包含细胞裂解组合物的涂敷组合物;和包含官能化组分和延伸组分的连接体组合物。
本公开提供了一种组合物,其包含:珠,其包含与其可操作地连接的多种捕获剂,其中每种捕获剂特异性结合不同的细胞内靶;包括多个室的基体,其中所述基体可释放地与所述表面耦合,并且其中所述多个室中的每个室包括至少一个珠;包含细胞裂解组合物的涂敷组合物;和包含官能化组分和延伸组分的连接体组合物。在某些实施例中,多个室中的每个室包括单个珠。
在本公开的组合物的某些实施方式中,多种捕获剂包含2~200种不同的捕获剂。在某些实施方式中,多种捕获剂包含2~100种不同的捕获剂。在某些实施方式中,多种捕获剂包含2~50种不同的捕获剂。在某些实施方式中,多种捕获剂包含2~25种不同的捕获剂。
在本公开的组合物的某些实施方式中,所述多个室包含2~20,000个室。在某些实施方式中,所述多个室包含2~12,000个室。在某些实施方式中,所述多个室包含2~10,000个室。在某些实施例中,多个室包括2~5,000个室。在某些实施例中,多个室包括2~2,500个室。在某些实施方式中,所述多个室包含2~1,000个室。在某些实施例中,多个室包括2~500个室。
在本公开的组合物的某些实施方式中,多个室中的每个室具有相同的形状。在本公开的组合物的某些实施方式中,所述多个室中的每个室在至少一个尺寸上具有相等的值。在某些实施例中,多个室中的每个室在每个尺寸上具有相等的值。在本公开的组合物的某些实施方式中,所述多个室中的至少一个室或每个室是圆形的。在某些实施例中,至少一个室或多个室中的每个室具有至少10μm的直径。在某些实施方式中,所述多个室中的至少一个室或每个室具有至少50μm的直径。在某些实施例中,至少一个室或多个室中的每个室具有至少100μm的直径。在某些实施例中,至少一个室或多个室中的每个室具有至少10μm的深度。在某些实施例中,多个室中的至少一个室或每个室具有至少50μm的深度。在某些实施例中,至少一个室或多个室中的每个室具有至少100μm的深度。在本公开的组合物的某些实施方式中,所述多个室中的至少一个室或每个室是矩形的。在某些实施例中,至少一个室或多个室中的每个室具有至少10μm的第一侧的长度。在某些实施例中,至少一个室或多个室中的每个室具有至少50μm的第一侧的长度。在某些实施例中,至少一个室或多个室中的每个室具有至少100μm的第一侧的长度。在某些实施例中,至少一个室或多个室中的每个室具有至少10μm的第二侧的长度。在某些实施例中,至少一个室或多个室中的每个室具有至少50μm的第二侧的长度。在某些实施例中,至少一个室或多个室中的每个室具有至少100μm的第二侧的长度。在某些实施例中,至少一个室或多个室中的每个室具有至少10μm的深度。在某些实施例中,多个室中的至少一个室或每个室具有至少50μm的深度。在某些实施例中,至少一个室或多个室中的每个室具有至少100μm的深度。
在本公开的组合物的某些实施方式中,所述多个室中的每个室在至少一个尺寸上具有相等的值。在某些实施例中,多个室中的每个室在每个尺寸上具有相等的值。
在本公开的组合物的某些实施方式中,所述多个室中的至少一个室或每个室是圆形的。在某些实施例中,至少一个室或多个室中的每个室具有至少10μm的直径。在某些实施方式中,所述多个室中的至少一个室或每个室具有至少50μm的直径。在某些实施例中,至少一个室或多个室中的每个室具有至少100μm的直径。在某些实施例中,至少一个室或多个室中的每个室具有至少10μm的深度。在某些实施例中,多个室中的至少一个室或每个室具有至少50μm的深度。在某些实施例中,至少一个室或多个室中的每个室具有至少100μm的深度。
在本公开的组合物的某些实施方式中,所述多个室中的至少一个室或每个室是矩形的。在某些实施例中,至少一个室或多个室中的每个室具有至少10μm的第一侧的长度。在某些实施例中,至少一个室或多个室中的每个室具有至少50μm的第一侧的长度。在某些实施例中,至少一个室或多个室中的每个室具有至少100μm的第一侧的长度。在某些实施例中,至少一个室或多个室中的每个室具有至少10μm的第二侧的长度。在某些实施例中,至少一个室或多个室中的每个室具有至少50μm的第二侧的长度。在某些实施例中,至少一个室或多个室中的每个室具有至少100μm的第二侧的长度。在某些实施例中,至少一个室或多个室中的每个室具有至少10μm的深度。在某些实施例中,多个室中的至少一个室或每个室具有至少50μm的深度。在某些实施例中,至少一个室或多个室中的每个室具有至少100μm的深度。
在本公开的组合物的某些实施方式中,基体包含聚合物。在某些实施方式中,基体具有氧化表面。
在本公开的组合物的某些实施方式中,基体包含聚合物。在某些实施方式中,基体具有氧化表面。在某些实施方式中,聚合物包含聚二甲基硅氧烷(PDMS)。在某些实施方式中,PDMS基体由PDMS预聚物与表面活性剂混合形成,然后通过注塑制备,并且任选地,表面活性剂包含Triton-X-100。
在本公开的组合物的某些实施方式中,表面包含玻璃。
在本公开的组合物的某些实施方式中,所述多种捕获剂中的至少一种捕获剂包含寡核苷酸,适体,抗体,抗体的功能片段或抗体模拟物。
在本公开的组合物的某些实施方式中,所述多种捕获剂中的至少一种捕获剂包含抗体。在某些实施方式中,多种捕获剂中的每种捕获剂包含抗体。
在本公开的组合物的某些实施方式中,涂敷组合物还包含交联组合物。在某些实施方式中,交联组合物包含生物相容性聚合物。例如,生物相容性聚合物可包含聚(乙烯醇)(PVA)。在某些实施方式中,交联组合物包含聚(乙烯醇)(PVA)。在某些实施方式中,交联组合物包含3%v/v PVA。在某些实施方式中,交联组合物还包含戊二醛组合物和盐酸(HCl)组合物。在某些实施方式中,戊二醛组合物包含0.1%戊二醛。在某些实施方式中,HCl组合物包含10%HCl。在某些实施方式中,交联组合物还包含戊二醛组合物,其包含0.1%戊二醛和包含10%HCl的盐酸(HCl)组合物。
在本公开的组合物的某些实施方式中,细胞裂解组合物包含去污剂。例如,洗涤剂可包含Triton-X-100。在某些实施方式中,细胞裂解组合物包含Triton-X-100。在某些实施方式中,细胞裂解组合物包含0.2%Triton-X-100。
在本公开的组合物的某些实施方式中,涂敷组合物包含含有3%v/v PVA的交联组合物和含有0.2%Triton-X-100的细胞裂解组合物。在某些实施方式中,交联组合物还包含戊二醛组合物,其包含0.1%戊二醛和包含10%HCl的盐酸(HCl)组合物。
在本公开的组合物的某些实施方式中,涂敷组合物包含裂解组合物,信号传导剂和至少一种交联组合物。交联组合物可以优化用于裂解组合物的控制释放,单独或与信号传导剂组合。例如,本公开的涂敷组合物可包含信号传导剂,其激活,抑制或改变室中细胞的信号传导途径。本公开内容的裂解组合物可包含信号传导剂,其激活,抑制或改变室中细胞的信号传导途径。例如,在本公开的涂敷组合物中,裂解组合物可以与第一交联组合物组合,并且信号传导剂可以与第二交联组合物组合,其中第一和第二交联组合物是相同的或者是独特配制的而用于在不同的时间和/或不同的速率释放裂解组合物或信号传导剂。在本公开的涂敷组合物的某些实施方式中,将裂解组合物与第一交联组合物组合,并将信号传导剂与第二交联组合物组合,其中将第一交联组合物添加到基体而作为直接接触基体的底层,且将第二交联组合物添加到第一交联组合物的顶部而作为不直接接触基体的顶层。在接触细胞悬浮液后,涂敷组合物的顶层(即第二交联组合物)可在涂敷组合物的底层(即第一交联组合物)降解或释放裂解组合物之前降解或释放信号传导剂。该分层涂覆组合物的结果是细胞与信号传导剂的顺序接触,然后细胞与裂解组合物接触。不需要移动部件或多个通道,本公开的组合物可用于首先影响细胞信号传导,然后裂解细胞以暴露细胞内组分用于立即分析。
本公开的示例性信号传导剂包括但不限于细胞表面和跨膜受体的配体,抗原,生长因子(神经生长因子(NGF),表皮生长因子(EGF),血小板衍生生长因子(PDGF),白细胞介素-2,促红细胞生成素),细胞因子(趋化因子,干扰素,白细胞介素,淋巴因子和肿瘤坏死因子,白细胞介素-1(IL-1),白细胞介素-2(IL-2),白细胞介素-4(IL-4),白细胞介素-7(IL-7),白细胞介素-9(IL-9),白细胞介素-15(IL-15),白细胞介素-21(IL-21),白细胞介素-10(IL-10),白细胞介素-17(IL-17),白细胞介素-18(IL-18),白细胞介素-19(IL-19),白细胞介素-20(IL-20),白细胞介素-22(IL-22),白细胞介素-24(IL-24),白细胞介素-26(IL-26),干扰素(IFN)I-III型,干扰素-α(IFN-α),干扰素-β(IFN-β),干扰素-ε(IFN-ε),干扰素-κ(IFN-κ),干扰素-δ(IFN-δ),干扰素-τ(IFN-τ),干扰素-ω(IFN-ω),干扰素-ζ(IFN-ζ),干扰素-γ(IFN-γ),干扰素-λ(IFN-λ),转化生长因子β1(TGF-β1),转化生长因子β2(TGF-β2)和转化生长因子β3(TGF-β3))激素(包括但不限于甲状腺激素,维生素D3,维甲酸,睾酮,雌激素,黄体酮,皮质类固醇,蜕皮激素,胰岛素,胰高血糖素,生长激素,卵泡刺激素(FSH),催乳素),脂质(前列腺素,前列环素,血栓素和白三烯),多肽(胰岛素,胰高血糖素,生长激素,卵泡刺激素(FSH),催乳素,P物质,催产素,血管加压素,脑啡肽,β-内啡肽,神经生长因子(NGF),表皮生长因子(EGF),血小板衍生生长因子(PDGF),白细胞介素-2,促红细胞生成素),疼痛肽(神经激肽A,谷氨酸,P物质,类固醇,生理应激物(肾上腺素,去甲肾上腺素,皮质醇,促肾上腺皮质激素,促肾上腺皮质激素释放激素,血清素,神经肽Y),神经递质(乙酰胆碱,多巴胺,肾上腺素(肾上腺素),血清素,组胺,谷氨酸,甘氨酸,γ-氨基丁酸(GABA),P物质,催产素,加压素,脑啡肽,β-内啡肽),小分子,离子(钙,钾,和钠)气体颗粒(包括但不限于一氧化氮,一氧化碳,二氧化碳和氧气(O2)),合成配体,细胞表面和跨膜受体的合成激动剂,细胞表面和跨膜受体的合成拮抗剂,以及竞争性细胞表面和跨膜受体的配体(可逆和不可逆)。
在本公开的组合物的某些实施方式中,组合物包含水。
在本公开的组合物的某些实施方式中,组合物不包含水。
在本公开的组合物的某些实施方式中,接头组合物在室温下至少1周不降解。在某些实施方式中,接头组合物在室温下至少1个月不降解。在某些实施方式中,接头组合物在室温下至少6个月不降解。在某些实施方式中,接头组合物在室温下至少1年不降解。在某些实施方式中,接头组合物在从高于冷冻到低于沸腾的温度范围内(根据高度根据需要调节)“保存稳定”一段时间,从制造结束延伸到消费者使用。本发明的组合物可暂时密封一段时间,从制造结束延伸至消费者使用。只要本公开的组合物未被污染,打开(表面和基体在使用前彼此分离),未密封,煮沸,冷冻和/或破碎,本发明的组合物可在一段时间内保持稳定和有效。从制造结束延伸到消费者使用的时间,可以是至少1小时,2小时,3小时,4小时,5小时,6小时,7小时,8小时,9小时,10小时,11小时,12小时,13小时,14小时,15小时,16小时,17小时,18小时,19小时,20小时,21小时,22小时,23小时,24小时或其间的任何小时增量。只要本公开的组合物未被污染,打开(表面和基体在使用前彼此分离),未密封,煮沸,冷冻和/或破碎,本公开的组合物可在一段时间内保持稳定和有效从制造结束延伸到消费者使用的时间,可以是至少1天,2天,3天,4天,5天,6天,7天,8天,9天,10天,11天,12天,13天,14天,15天,16天,17天,18天,19天,20天,21天,22天,23天,24天,25天,26天,27天,28天,29天,30天或之间的每日增量。只要本公开的组合物未被污染,打开(表面和基体在使用前彼此分离),未密封,煮沸,冷冻和/或破碎,本公开的组合物可在一段时间内保持稳定和有效从制造结束延伸到消费者使用的时间,可能是至少1周,2周,3周,4周,5周,6周,7周,8周,9周,10周,11周,12周或其间的任何每周增量。只要本公开的组合物未被污染,打开(表面和基体在使用前彼此分离),未密封,煮沸,冷冻和/或破碎,本公开的组合物可在一段时间内保持稳定和有效从制造结束到消费者使用的时间,可能是至少1个月,2个月,3个月,4个月,5个月,6个月,7个月,8个月,9个月,10个月,11月,12个月或任何月度增量。只要本公开的组合物未被污染,打开(表面和基体在使用前彼此分离),未密封,煮沸,冷冻和/或破碎,本公开的组合物可在一段时间内保持稳定和有效从制造结束延伸到消费者使用的时间,其可以是至少1年,2年,3年,4年,5年,6年或其间的任何年增量。
接头组分包含官能化组分和延伸组分。在本公开的组合物的某些实施方式中,在与基体接触时,官能化组分将至少一个官能团共价键合到基体的表面上。在某些实施例中,表面包括多个室中的每个室的内表面。在某些实施例中,表面包括多个室中的每个室的每个内表面。
接头组分包含官能化组分和延伸组分。在本公开的组合物的某些实施方式中,在与基体接触时,官能化组分将至少一个官能团共价键合到基体的表面上。在某些实施方式中,至少一种官能团是硅烷基团。在某些实施方式中,官能化组分包含有机官能烷氧基硅烷。例如,有机官能烷氧基硅烷可包含氨基硅烷。在某些实施方式中,官能化组分包含氨基硅烷。例如,氨基硅烷可包含(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(APTES)。在某些实施方式中,官能化组分包含(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(APTES)。在某些实施方式中,官能化组分包含1%APTES。
接头组分包含官能化组分和延伸组分。在本公开的组合物的某些实施方式中,延伸组分包含在第一末端共价结合官能化组分的有机聚合物。在某些实施方式中,有机聚合物在第二末端包含醛。在某些实施方式中,延伸组分与交联组合物结合。在某些实施方式中,延伸组分包含戊二醛。在某些实施方式中,延伸组分包含1%戊二醛。
在本公开的组合物的某些实施方式中,重复图案包含多条平行线。在本公开的组合物的某些实施方式中,重复图案包含多个点。在多种捕获剂的重复图案的每个实施方式中,模式的每个重复包含至少一种不同的捕获剂。例如,并且通过举例说明,如果多种捕获剂包含分别特异性结合细胞内靶“a”,“b”和“c”的“A”,“B”和“C”,则每个重复多种捕获剂的重复图案包括至少一个“A”,至少一个“B”和至少一个“C”。
在本公开的组合物的某些实施方式中,细胞内靶是DNA分子,RNA分子,肽,多肽,蛋白质,蛋白质复合物,通道,细胞器,脂质,寡糖,细胞骨架元件。或者,或另外,细胞内靶可以是癌基因的转录物,癌蛋白,肿瘤抑制基因的转录物,肿瘤抑制蛋白,癌基因的调节物,癌蛋白的调节物或肿瘤抑制基因的调节物。或者,或另外,细胞内靶可以是受体,酶,转录因子或生长因子。或者,或另外,细胞内靶是磷酸化受体或磷酸化酶。在某些实施方式中,酶是激酶。
在本公开的组合物的某些实施方式中,细胞内靶是DNA分子,RNA分子,肽,多肽,蛋白质,蛋白质复合物,通道,细胞器,脂质,寡糖,细胞骨架元件。在某些实施方式中,细胞内靶包括癌基因的转录物,癌蛋白,肿瘤抑制基因的转录物,肿瘤抑制蛋白,癌基因的调节物,癌蛋白的调节物或肿瘤抑制基因的调节物。在某些实施方式中,细胞内靶包含受体,酶,转录因子或生长因子。在某些实施方式中,细胞内靶包含磷酸化受体或磷酸化酶。在某些实施方式中,酶是激酶。
在本公开的组合物的某些实施方式中,包括其中至少一个室包含珠的那些,所述多个室中的至少一个室还包含官能化带。在本公开的组合物的某些实施方式中,包括其中至少一个室包含珠的那些,所述多个室中的每个室还包含官能化带。
在本公开的组合物的某些实施方式中,官能化带捕获珠。在某些实施方式中,官能化带捕获至少一个珠。在某些实施方式中,官能化带捕获至多一个珠。在某些实施方式中,官能化带仅捕获单个珠。
在本公开的组合物的某些实施方式中,包括其中至少一个室包含珠的那些,官能化的条带捕获细胞。在某些实施方式中,官能化带捕获至少一个细胞。在某些实施方式中,官能化带捕获至多一个细胞。在某些实施方式中,官能化带仅捕获单细胞。
在本公开的组合物的某些实施方式中,官能化带捕获一个珠和一个细胞。在某些实施方式中,官能化带捕获至多一个珠和至多一个细胞。
在本公开的组合物的某些实施方式中,所述多个室中的至少一个室具有一个或多个尺寸,所述一个或多个尺寸防止第二珠进入所述室或接触所述官能化带。在本公开的组合物的某些实施方式中,多个室中的每个室具有一个或多个尺寸,其防止第二珠进入室或接触官能化带。在某些实施例中,室的一个或多个尺寸大于第一珠的任何尺寸,从而允许第一珠进入室或接触官能化带。在某些实施例中,室的一个或多个尺寸小于第一珠的任何尺寸和第二珠的任何尺寸的总和,从而防止第二珠进入室或接触官能化带。在某些实施方式中,室的一个或多个尺寸是直径,并且其中直径是或约是50μm。在某些实施方式中,第一珠的直径为30~40μm,包括端点,从而允许第一珠进入室或接触官能化带。在某些实施方式中,第一珠的直径和第二珠的直径之和为60~80μm,从而防止第二珠进入室或接触官能化的条带。
在本公开的组合物的某些实施方式中,包括其中至少一个室包含珠的那些,官能化带的宽度是10μm或约是10μm。
在本公开的组合物的某些实施方式中,包括其中至少一个室包含珠的那些,根据包括以下步骤的方法制备包含官能化带的室:使所述室的至少一个表面与涂敷组合物接触产生至少一个涂覆表面,钝化室的至少一个涂覆表面以产生至少一个钝化表面;用光掩模掩蔽所述至少一个钝化表面的一部分,其中所述光掩模包括图案,以产生至少一个掩蔽的表面;将至少一个掩蔽的表面暴露于UV光;将捕获抗体组合物沉积在室的至少一个掩蔽的表面上以产生至少一个官能化表面,使珠组合物与室接触,其中至少一个官能化表面捕获珠,将细胞裂解组合物引入室,并将细胞引入室。在某些实施方式中,根据进一步包括以下步骤的方法制备包含官能化带的室:从室移除珠。在某些实施方式中,根据进一步包括以下步骤的方法制备包含官能化带的室:在室中沉积链霉亲和素组合物,其中在沉积捕获抗体组合物后将链霉亲和素组合物沉积在室中,并且其中链霉亲和素组合物在将珠引入室之前,沉积在室中。
在本公开的组合物的某些实施方式中,包括其中至少一个室包含珠的那些,涂敷组合物包含PVA-SbQ组合物。
在本公开的组合物的某些实施方式中,包括其中至少一个室包含珠的那些,抗体组合物包含捕获抗体。
在本公开内容的组合物的某些实施方式中,包括其中至少一个室包含珠的那些,在沉积抗体组合物之前,根据包括以下步骤的方法制备至少一个掩蔽的表面:使至少一个掩蔽的表面与接头组合物接触。在某些实施方式中,接头组合物包含延伸组分。在某些实施方式中,延伸组分包含APTES组合物。在某些实施方式中,接头组合物包含官能化组分。在某些实施方式中,官能化组分包含蛋白G组合物。
在本公开的组合物的某些实施方式中,包括其中至少一个室包含珠的那些,根据包括以下步骤的方法制备包含官能化带的室:钝化室的至少一个表面;用光掩模掩蔽所述至少一个钝化表面的一部分,其中所述光掩模包括图案,以产生至少一个掩蔽的表面;将至少一个掩蔽的表面暴露于UV光;将捕获抗体组合物沉积在室中;并将细胞引入室。在某些实施方式中,钝化步骤包括:使室的至少一个表面与氧等离子体接触以产生至少一个官能化表面;使所述至少一个官能化表面与预处理组合物接触以产生预处理表面,并使所述至少一个预处理表面与生物素组合物接触。在某些实施方式中,预处理组合物包含N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基磺基琥珀酰亚胺钠盐(磺基-NHS)。在某些实施方式中,预处理组合物还包含含有0.05M MES和0.5M NaCl的缓冲液。在某些实施方式中,生物素组合物包含PLL(20)-g[3.5]-PEG(2):聚-L-赖氨酸-g-聚(乙二醇)-生物素(PLL-g-PEG-生物素)。在某些实施方式中,生物素组合物还包含HEPES缓冲液。在某些实施方式中,预处理组合物包含11.5mg/ml的N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC),19.2mg/ml的N-羟基磺基琥珀酰亚胺钠盐(Sulfo-NHS)和包含0.05M MES的缓冲液和0.5M NaCl缓冲液。在某些实施方式中,生物素组合物包含0.5mg/ml的PLL(20)-g[3.5]-PEG(2):聚-L-赖氨酸-g-聚(乙二醇)-生物素(PLL-g-PEG-生物素)和10mM HEPES缓冲液。在某些实施方式中,钝化步骤包括:使室的至少一个表面与氧等离子体接触以产生至少一个官能化表面;使所述至少一个官能化表面与预处理组合物接触15分钟以产生预处理表面,并使所述至少一个预处理表面与生物素组合物接触至少3小时。
在本公开的组合物的某些实施方式中,包括其中至少一个室包含珠的那些,珠包含含有生物素化的寡核苷酸的组合物。
在本公开的组合物的某些实施方式中,包括其中至少一个室包含珠的那些,细胞组合物包含RNA酶抑制剂溶液。
在本公开的组合物的某些实施方式中,包括其中至少一个室包含珠的那些,珠组合物包含珠和编码条形码的核酸序列,其中条形码包含编码条形码的序列和编码条形码柄的序列。在某些实施方式中,编码条形码的核酸序列还包含下列中的一种或多种:编码PCR柄的序列,编码唯一分子标识符(UMI)的序列,编码模板转换寡核苷酸(TSO)柄的序列和编码TSO杂交位点的序列。在某些实施方式中,编码条形码的核酸序列还包含编码PCR柄的序列,编码唯一分子标识符(UMI)的序列,编码模板转换寡核苷酸(TSO)柄的序列和编码TSO杂交位点的序列。在某些实施方式中,编码条形码的核酸序列从5'到3'包含:编码PCR柄的序列,编码条形码的序列,编码条形码柄的序列,编码唯一分子标识符(UMI)的序列,编码模板转换寡核苷酸(TSO)柄的序列和编码TSO杂交位点的序列。在某些实施方式中,编码TSO杂交位点的序列包含多聚鸟嘌呤(polyG)序列。在某些实施方式中,编码TSO杂交位点的序列由多聚鸟嘌呤(polyG)序列组成。
在本公开的组合物的某些实施方式中,包括其中至少一个室包含珠的那些,珠组合物的每个珠包含唯一的条形码。在某些实施例中,每个室的每个珠包括唯一的条形码。在某些实施例中,多个室中的每个珠包括唯一的条形码。在某些实施方式中,珠基体可以与作为底物的载玻片互换,利用位于室上方的相同载玻片来捕获mRNA以及蛋白质。
在本公开的组合物的某些实施方式中,包括其中至少一个室包含珠的那些,编码条形码的序列包含12个核苷酸。在某些实施方式中,编码条形码的序列由12个核苷酸组成。
在本公开的组合物的某些实施方式中,包括其中至少一个室包含珠的那些,编码条形码的序列包含至少一个修饰的核苷酸。在某些实施方式中,修饰的核苷酸包含标记。在某些实施方式中,标记包含荧光团或发色团。在某些实施方式中,标记是荧光标记。在某些实施方式中,编码条形码的序列的每个核苷酸包含标记。在某些实施方式中,每个腺嘌呤包含第一标记,其中每个胞嘧啶包含第二标记,每个鸟嘌呤包含第三标记,并且每个胸腺嘧啶包含第四标记。在某些实施方式中,第一标记,第二标记,第三标记和第四标记是不同的标记。在某些实施方式中,第一标记,第二标记,第三标记和第四标记是光谱可区分的荧光标记。
在本公开的组合物的某些实施方式中,包括其中至少一个室包含珠的那些,该组合物还包含模板转换寡核苷酸(TSO)。在某些实施方式中,TSO包含与编码UMI的序列互补的序列,与编码TSO柄的序列互补的序列,与编码TSO杂交位点的序列的编码序列互补的序列,和与细胞内靶RNA互补的序列。在某些实施方式中,细胞内靶RNA是mRNA。在某些实施方式中,与编码TSO的TSO杂交位点的序列的编码序列互补的序列与编码条形码的核酸的TSO杂交位点的编码序列杂交。
在本公开的组合物的某些实施方式中,包括其中至少一个室包含珠的那些,组合物还包含细胞内靶RNA。在某些实施方式中,细胞内靶RNA与TSO杂交。
在本公开的组合物的某些实施方式中,包括其中至少一个室包含珠的那些,组合物还包含正向引物和反向引物,其中正向引物包含与编码PCR柄的序列互补的序列,并且其中第二引物包含与细胞内靶RNA序列互补的序列。在某些实施方式中,反向引物还包含引物特异性识别序列。
在本公开的组合物的某些实施方式中,包括其中至少一个室包含珠的那些,细胞内靶RNA编码T细胞受体(TCR)的组分。在某些实施方式中,细胞内靶RNA编码TCR的α-链(TCRα)。在某些实施方式中,细胞内靶RNA编码TCR的β-链(TCRβ)。
在本公开的组合物的某些实施方式中,包括其中至少一个室包含珠的那些,细胞内靶RNA编码非天然存在的RNA或mRNA。在某些实施方式中,非天然存在的RNA或mRNA包含合成的,修饰的,重组的或嵌合的序列。在某些实施方式中,当与野生型形式的序列比较时,非天然存在的RNA或mRNA包含突变。在某些实施方式中,突变包括取代,插入,缺失,倒位或转座。在某些实施方式中,非天然存在的RNA或mRNA编码TCR的组分。在某些实施方式中,细胞内靶RNA编码TCR的α-链(TCRα)。在某些实施方式中,细胞内靶RNA编码TCR的β-链(TCRβ)。
在本公开的组合物的某些实施方式中,包括其中至少一个室包含珠的那些,细胞内靶RNA编码非天然存在的RNA或mRNA。在某些实施方式中,非天然存在的RNA或mRNA包含合成的,修饰的,重组的或嵌合的序列。在某些实施方式中,当与野生型形式的序列比较时,非天然存在的RNA或mRNA包含突变。在某些实施方式中,突变包括取代,插入,缺失,倒位或转座。在某些实施方式中,非天然存在的RNA或mRNA编码融合蛋白。在某些实施方式中,非天然存在的RNA或mRNA编码嵌合抗原受体(CAR)。在某些实施方式中,CAR从修饰的细胞中释放。在某些实施方式中,修饰的细胞是修饰的T细胞。
本公开提供了用于对单细胞的一种或多种细胞内靶进行多重分析的方法,包括在足以引起细胞裂解的条件下使生物样品和本公开的组合物接触以在基体的多个室的每个室内产生细胞裂解物,其中多个室中的每个室包括生物样品的单细胞,其中生物样品包括多个细胞和流体,并且其中在多个室的每个室内,生物样品在与表面流体连通;将多个室的每个室内的细胞裂解物温育足够的时间以允许多种捕获剂中的至少一种捕获剂特异性结合至少一种细胞内靶以产生捕获剂:靶复合物;并且使至少一种捕获剂:靶复合物可视化以在多重分析中鉴定单细胞的一种或多种细胞内靶。
本公开内容提供了用于对单细胞的一种或多种细胞内靶进行多重分析的方法,包括在足以引起细胞裂解的条件下使生物样品和本公开的组合物接触以在基体的多个室的每个室内产生细胞裂解物,其中多个室中的每个室包括生物样品的单个单元,其中生物样品包括多个单元和流体,其中在多个室的每个室内,生物样品处于流体中与珠连通,并且其中珠包含多种捕获剂以特异性结合至少一种细胞内靶以产生捕获剂:靶复合物;将多个室的每个室内的细胞裂解物温育足够的时间以允许多种捕获剂中的至少一种捕获剂特异性结合至少一种细胞内靶以产生捕获剂:靶复合物;使至少一种捕获剂:靶复合物可视化或对至少一种捕获剂:靶复合物的靶进行测序,以在多重分析中鉴定单细胞的一种或多种细胞内靶。在某些实施方式中,该方法包括使至少一种捕获剂:靶复合物可视化并对至少一种捕获剂:靶复合物的靶进行测序,以在多重分析中鉴定单细胞的一种或多种细胞内靶。
在本公开内容的方法的某些实施方式中,包括用于对单细胞的一种或多种细胞内靶进行多重分析的方法,该方法包括使至少一种捕获剂:靶复合物可视化或对至少一种捕获剂:靶复合物的靶进行测序,用于在多重分析中鉴定单细胞的一种或多种细胞内靶。
在本公开方法的某些实施方式中,包括用于对单细胞的一种或多种细胞内靶进行多重分析的方法,该方法包括对至少一种捕获剂:靶复合物的靶进行测序,以在多重分析中鉴定单细胞的一种或多种细胞内靶。
在本公开方法的某些实施方式中,包括用于对单细胞的一种或多种细胞内靶进行多重分析的方法,该方法包括对至少一种捕获剂:靶复合物的靶进行测序,以在多重分析中鉴定单细胞的一种或多种细胞内靶。
在本公开方法的某些实施方式中,包括用于对单细胞的一种或多种细胞内靶进行多重分析的方法,所述珠组合物包含珠和编码条形码的核酸序列,其中所述条形码包含编码条形码的序列和编码条形码柄的序列,并且其中该方法包括通过合成cDNA条形码序列对条形码进行测序。在某些实施方式中,合成条形码包括在足以进行杂交和cDNA合成的条件下接触编码条形码柄的序列,包含与编码条形码柄的序列的一部分互补的序列的引物和聚合酶,其中所述接触产生cDNA条形码序列。在某些实施方式中,测序步骤在室中进行。在某些实施方式中,编码条形码的核酸序列还包含下列中的一种或多种:编码PCR柄的序列,编码唯一分子标识符(UMI)的序列,编码模板转换寡核苷酸(TSO)柄的序列和编码TSO杂交位点的序列。在某些实施方式中,编码条形码的核酸序列还包含编码PCR柄的序列,编码唯一分子标识符(UMI)的序列,编码模板转换寡核苷酸(TSO)柄的序列和编码TSO杂交位点的序列。在某些实施方式中,编码条形码的核酸序列从5'到3'包含:编码PCR柄的序列,编码条形码的序列,编码条形码柄的序列,编码唯一分子标识符(UMI)的序列,编码模板转换寡核苷酸(TSO)柄的序列和编码TSO杂交位点的序列。在某些实施方式中,编码TSO杂交位点的序列包含多聚鸟嘌呤(polyG)序列。在某些实施方式中,编码TSO杂交位点的序列由多聚鸟嘌呤(polyG)序列组成。在某些实施方式中,珠组合物的每个珠包含唯一的条形码。在某些实施例中,每个室的每个珠包括唯一的条形码。在某些实施例中,多个室中的每个珠包括唯一的条形码。在某些实施方式中,编码条形码的序列包含12个核苷酸。
在本公开内容的方法的某些实施方式中,包括用于对单细胞的一种或多种细胞内靶进行多重分析的方法,编码条形码的序列由12个核苷酸组成。在某些实施方式中,足以进行杂交和cDNA合成的条件包括多种脱氧核苷酸(dNTP)。在某些实施方式中,所述多种脱氧核苷酸(dNTP)中的至少一种dNTP包含修饰。在某些实施方式中,多种脱氧核苷酸(dNTP)中的每种dNTP包含修饰。在某些实施方式中,修饰包括标记。在某些实施方式中,标记包含荧光团或发色团。在某些实施方式中,标记是荧光标记。在某些实施方式中,每个腺嘌呤包含第一标记,其中每个胞嘧啶包含第二标记,每个鸟嘌呤包含第三标记,并且每个胸腺嘧啶包含第四标记。在某些实施方式中,第一标记,第二标记,第三标记和第四标记是不同的标记。在某些实施方式中,第一标记,第二标记,第三标记和第四标记是光谱可区分的荧光标记。
本公开内容提供了根据本公开内容的方法产生的cDNA条形码序列。
本公开提供了包含本公开的cDNA条形码序列的组合物。
在本公开方法的某些实施方式中,包括用于对单细胞的一种或多种细胞内靶进行多重分析的方法,该方法还包括在足以TSO与编码条形码的核酸的一部分杂交而产生核酸/TSO双链体的条件下使编码珠的条形码的核酸序列和TSO接触。在某些实施方式中,TSO包含与编码UMI的序列互补的序列,与编码TSO柄的序列互补的序列,与编码TSO杂交位点的序列的编码序列互补的序列,和与细胞内靶RNA互补的序列。在某些实施方式中,细胞内靶RNA是mRNA。在某些实施方式中,与编码TSO的TSO杂交位点的序列互补的序列与编码条形码的核酸的TSO杂交位点的编码序列杂交。在某些实施方式中,TSO与细胞内靶RNA杂交以形成核酸:TSO:细胞内靶RNA三链体。
在本公开方法的某些实施方式中,包括用于对单细胞的一种或多种细胞内靶进行多重分析的方法,该方法还包括在足以进行杂交和扩增的条件下使核酸:TSO:细胞内靶RNA三链体,正向引物,反向引物,和聚合酶接触,其中正向引物包含与编码条形码的核酸的PCR柄的序列互补的序列,并且其中所述第二引物包含与细胞内靶RNA序列互补而产生扩增产物的序列。在某些实施方式中,扩增产物包含编码条形码的序列,编码条形码柄的序列,编码UMI的序列,编码TSO柄的序列,编码TSO杂交位点的序列和编码细胞内靶RNA的序列。
在本公开方法的某些实施方式中,包括用于对单细胞的一种或多种细胞内靶进行多重分析的方法,该方法还包括在足以进行杂交和扩增的条件下使扩增产物与第二正向引物,第二反向引物和聚合酶接触,其中第二正向引物包含与编码扩增产物的PCR柄的序列互补的序列,并且其中第二反向引物包含与扩增产物的细胞内靶RNA的序列互补而产生第一测序产品的序列。在某些实施方式中,第二反向引物还包含引物特异性识别序列。
在本公开内容的方法的某些实施方式中,包括用于对单细胞的一种或多种细胞内靶进行多重分析的方法,细胞内靶RNA编码T细胞受体(TCR)的组分。在某些实施方式中,细胞内靶RNA编码TCR的α-链(TCRα)。在某些实施方式中,细胞内靶RNA编码TCR的β-链(TCRβ)。
在本公开内容的方法的某些实施方式中,包括用于对单细胞的一种或多种细胞内靶进行多重分析的方法,细胞内靶RNA编码非天然存在的RNA或mRNA。在某些实施方式中,非天然存在的RNA或mRNA包含合成的,修饰的,重组的或嵌合的序列。在某些实施方式中,当与野生型形式的序列比较时,非天然存在的RNA或mRNA包含突变。在某些实施方式中,突变包括取代,插入,缺失,倒位或转座。在某些实施方式中,非天然存在的RNA或mRNA编码TCR的组分。在某些实施方式中,细胞内靶RNA编码TCR的α-链(TCRα)。在某些实施方式中,细胞内靶RNA编码TCR的β-链(TCRβ)。
在本公开内容的方法的某些实施方式中,包括用于对单细胞的一种或多种细胞内靶进行多重分析的方法,细胞内靶RNA编码非天然存在的RNA或mRNA。在某些实施方式中,非天然存在的RNA或mRNA包含合成的,修饰的,重组的或嵌合的序列。在某些实施方式中,当与野生型形式的序列比较时,非天然存在的RNA或mRNA包含突变。在某些实施方式中,突变包括取代,插入,缺失,倒位或转座。在某些实施方式中,非天然存在的RNA或mRNA编码融合蛋白。在某些实施方式中,非天然存在的RNA或mRNA编码嵌合抗原受体(CAR)。在某些实施方式中,CAR从修饰的细胞中释放。在某些实施方式中,修饰的细胞是修饰的T细胞。
在本公开方法的某些实施方式中,单细胞是健康细胞。在某些实施方式中,单细胞是被遗传修饰的。
在本公开方法的某些实施方式中,单细胞不是健康细胞。在某些实施方式中,从感染或患病组织中分离,纯化或衍生单细胞。在某些实施方式中,从感染或患病的组织或液体中分离,纯化或衍生单细胞。在某些实施方式中,单细胞含有遗传或表观遗传标记,其是不希望的健康状况,疾病或病症的致病,预测或相关。在某些实施方式中,与不存在遗传或表观遗传标记的风险相比,单细胞含有遗传或表观遗传标记,其是致病,预测或与显着增加的发生不良健康状况,疾病或病症的风险相关联的。在某些实施方式中,单细胞是被遗传修饰的。
在本公开方法的某些实施方式中,单细胞是肿瘤细胞。在某些实施方式中,肿瘤细胞是良性的。在某些实施方式中,肿瘤细胞是恶性的。在某些实施方式中,肿瘤细胞是癌细胞。在某些实施方式中,单细胞是恶性细胞。在某些实施方式中,单细胞是癌细胞。本公开的癌细胞可以从身体的任何组织分离,纯化,衍生和/或培养,包括但不限于实体组织或生物流体。
在本公开方法的某些实施方式中,单细胞是神经元细胞。例如,单细胞可以是神经元,神经前体,神经干细胞或能够分化成神经细胞的细胞。在某些实施方式中,神经元细胞可以从中枢神经系统的组织或液体中分离,纯化或衍生。在某些实施方式中,神经元细胞可以从外周神经系统的组织或液体中分离,纯化或衍生。在某些实施方式中,单细胞是被遗传修饰的。
在本公开方法的某些实施方式中,单细胞是神经胶质细胞。在某些实施方式中,神经胶质细胞可以支持神经元细胞(例如神经胶质细胞,放射状神经胶质细胞,星形胶质细胞,少突胶质细胞,小神经胶质细胞,室管膜细胞,施万细胞或卫星细胞)。在某些实施方式中,神经胶质细胞可以从中枢神经系统的组织或液体中分离,纯化或衍生。在某些实施方式中,神经胶质细胞可以从外周神经系统的组织或液体中分离,纯化或衍生。在某些实施方式中,神经胶质细胞可以维持神经元细胞的稳态。在某些实施方式中,神经胶质细胞可以在轴突周围产生,形成和/或维持髓鞘(myelin)或髓鞘(myelin sheath)。在某些实施方式中,神经胶质细胞可以从突触间隙清除一种或多种信号分子。在某些实施方式中,神经胶质细胞可以为神经元细胞或局部微环境提供一种或多种支持因子或生长因子。在某些实施方式中,神经胶质细胞可以促进从神经元细胞附近的细胞间隙中去除废物。在某些实施方式中,单细胞是被遗传修饰的。
在本公开方法的某些实施方式中,单细胞是免疫细胞。在某些实施方式中,单细胞是B淋巴细胞。在某些实施方式中,单细胞是白细胞。示例性白细胞包括但不限于吞噬细胞(巨噬细胞,嗜中性粒细胞和树突细胞),淋巴样细胞(例如淋巴细胞),肥大细胞,嗜酸性粒细胞,嗜碱性粒细胞和天然杀伤细胞。在某些实施方式中,单细胞是淋巴细胞。在某些实施方式中,单细胞是T淋巴细胞或B淋巴细胞。在某些实施方式中,单细胞是T淋巴细胞。在某些实施方式中,单细胞是被遗传修饰的。
在本公开方法的某些实施方式中,单细胞是细菌。示例性细菌可以是任何物种。可以从生物膜中分离,纯化,衍生或培养示例性细菌。示例性细菌可与宿主具有互惠或共生关联。示例性细菌可与宿主具有致病性关联。在某些实施方式中,宿主是脊椎动物。在某些实施方式中,宿主是哺乳动物。在某些实施方式中,宿主是人。在某些实施方式中,单细胞是被遗传修饰的。
在本公开方法的某些实施方式中,单细胞是古细菌。示例性的古细菌可以是任何物种。示例性的古细菌可以从多个古细菌或古细菌群中分离,纯化,衍生或培养。在某些实施方式中,单细胞是被遗传修饰的。
在本公开方法的某些实施方式中,单细胞是酵母细胞。示例性酵母细胞可以是任何物种。可以从多个或多个酵母细胞中分离,纯化,衍生或培养示例性酵母细胞。在某些实施方式中,单细胞是被遗传修饰的。
在本公开方法的某些实施方式中,单细胞是藻类。示例性藻类可以是任何物种。可以从多个藻类群体中分离,纯化,衍生或培养示例性藻类。在某些实施方式中,单细胞是被遗传修饰的。
在本公开方法的某些实施方式中,单细胞是被遗传修饰的。在某些实施方式中,对单细胞进行遗传修饰以用作治疗本公开内容的疾病或病症的细胞疗法。
在本公开的方法的某些实施方式中,生物样品包含任何体液。在某些实施方式中,生物样品包括血液,脑脊液(CSF),淋巴液,胸腔积液,尿液或唾液。在某些实施方式中,生物样品获自单个受试者或供体。在某些实施方式中,生物样品获自至少一个受试者或供体。在某些实施方式中,生物样品获自一个或多个受试者或供体。在某些实施方式中,生物样品获自多个受试者或供体。
在本公开内容的方法的某些实施方式中,生物样品包含细胞培养基。在某些实施方式中,生物样品包含从受试者获得的活组织检查并保持为原代培养物。在某些实施方式中,生物样品包含从受试者获得的活组织检查并保持为永生化培养物。
在本公开的方法的某些实施方式中,生物样品包括组织样品或组织活检。在某些实施方式中,组织样品或组织活检可从脊椎动物体的任何组织获得。在某些实施方式中,组织样品或组织活检可从哺乳动物体的任何组织获得。在某些实施方式中,组织样品或组织活检是从人体的任何组织获得的。在某些实施方式中,组织样品或组织活检获自任何器官,包括从体内提取的那些器官以及体外合成的任何器官。在某些实施方式中,组织样品或组织活检获自体外合成的任何组织(例如,在体外生长或打印)。
在本公开的方法的某些实施方式中,生物样品包括体液或液体活组织检查。在某些实施方式中,体液或流体活组织检查获自脊椎动物体的任何流体。在某些实施方式中,体液或流体活组织检查获自哺乳动物体的任何流体。在某些实施方式中,体液或流体活组织检查获自人体的任何流体。在某些实施方式中,体液或流体活组织检查获自任何流体,包括从身体提取的那些流体以及体外合成的任何流体。
在本公开方法的某些实施方式中,受试者是健康的。
在本公开方法的某些实施方式中,受试者不健康。在某些实施方式中,受试者患有感染,疾病或病症。在某些实施方式中,受试者患有感染或患病的组织或液体。在某些实施方式中,受试者具有遗传或表观遗传标记,其是不希望的健康状况,疾病或病症的致病,预测或相关。在某些实施方式中,与不存在遗传或表观遗传标记的风险相比,受试者具有致病,预测或与显着增加的发生不良健康状况,疾病或病症的风险相关的遗传或表观遗传标记。在受试者不是人胚胎的某些实施方式中,受试者可包含一种或多种遗传修饰的细胞。
在本公开方法的某些实施方式中,受试者患有肿瘤。在某些实施方式中,肿瘤细胞是良性的。在某些实施方式中,肿瘤细胞是恶性的。在某些实施方式中,肿瘤细胞是癌细胞。在某些实施方式中,受试者患有癌症。在某些实施方式中,受试者患有至少一种癌症。在某些实施方式中,受试者患有一种或多种癌症。在某些实施方式中,受试者具有侵袭性形式的癌症。在某些实施方式中,受试者患有罕见癌症或罕见形式的癌症(例如由年龄,性别,遗传和/或表观遗传倾向,暴露于风险因素和/或家族史定义的影响小于10%,5%,2%,1%或它们之间的任何的任何百分比的癌症或癌症形式)。在某些实施方式中,受试者患有转移性癌症。本公开的受试者可具有位于或衍生自身体的任何组织的肿瘤或癌细胞,包括但不限于实体组织或生物流体。
在本公开方法的某些实施方式中,受试者患有癌症。癌症可能是肾上腺皮质癌,艾滋病相关癌症,艾滋病相关淋巴瘤,肛门癌,肛门直肠癌,肛管癌,阑尾癌,儿童小脑星形细胞瘤,儿童脑星形细胞瘤,基底细胞癌,皮肤癌(非黑色素瘤),胆道癌,肝外胆管癌,肝内胆管癌,膀胱癌,膀胱癌,骨关节癌,骨肉瘤和恶性纤维组织细胞瘤,脑癌,脑瘤,脑干胶质瘤,小脑星形细胞瘤,脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤,室管膜瘤,成神经管细胞瘤,幕上原始神经外胚层肿瘤,视觉通路和下丘脑胶质瘤,乳腺癌,支气管腺瘤/类癌,类癌,胃肠道,神经系统癌,神经系统淋巴瘤,中枢神经系统癌,中枢神经系统淋巴瘤,宫颈癌,儿童癌症,慢性淋巴细胞白血病,慢性粒细胞白血病,慢性骨髓组织增生性病症,结肠癌,结直肠癌,皮肤T细胞淋巴瘤,淋巴肿瘤,蕈样真菌病,Seziary综合征,子宫内膜癌,食管癌,颅外生殖细胞肿瘤,性腺外生殖细胞肿瘤,肝外胆管癌,眼癌,眼内黑色素瘤,视网膜母细胞瘤,胆囊癌,胃(胃)癌,胃肠道类癌,胃肠道间质瘤(GIST),生殖细胞肿瘤,卵巢生殖细胞瘤,妊娠滋养细胞肿瘤胶质瘤,头颈癌,肝细胞癌(肝癌),霍奇金淋巴瘤,下咽癌,眼内黑色素瘤,眼癌,胰岛细胞瘤(内分泌胰腺),卡波西肉瘤,肾癌,肾癌,肾癌,喉癌,急性淋巴细胞白血病,急性髓性白血病,慢性淋巴细胞白血病,慢性粒细胞白血病,毛茸茸细胞白血病,唇癌和口腔癌,肝癌,肺癌,非小细胞肺癌,小细胞瘤癌症,艾滋病相关淋巴瘤,非霍奇金淋巴瘤,原发性中枢神经系统淋巴瘤,Waldenstram巨球蛋白血症,成神经管细胞瘤,黑色素瘤,眼内(黑色素),merkel细胞癌,间皮瘤恶性,间皮瘤,转移性鳞状颈癌,口腔癌,癌症舌,多发性内分泌肿瘤综合征,蕈样肉芽肿,骨髓增生异常综合征,骨髓增生异常/骨髓增生性疾病,慢性髓细胞性白血病,急性骨髓性白血病,多发性骨髓瘤,慢性骨髓增生性病症,鼻咽癌,神经母细胞瘤,口腔癌,口腔癌,口咽癌,卵巢癌,卵巢上皮癌,卵巢低恶性潜能肿瘤,胰腺癌,胰岛细胞胰腺癌,鼻窦和鼻腔癌,甲状旁腺癌,阴茎癌,咽癌,嗜铬细胞瘤,松质母细胞瘤和幕上原始神经外胚层肿瘤,垂体瘤,血浆细胞肿瘤/多发性白带骨髓瘤,胸膜肺母细胞瘤,前列腺癌,直肠癌,肾盂和输尿管,移行细胞癌,视网膜母细胞瘤,横纹肌肉瘤,唾液腺癌,尤文家族肉瘤,卡波西肉瘤,软组织肉瘤,子宫癌,子宫肉瘤,皮肤癌(非黑色素瘤),皮肤癌(黑色素瘤),merkel细胞皮肤癌,小肠癌,软组织肉瘤,鳞状细胞癌,胃癌(胃癌),幕上原始神经外胚层肿瘤,睾丸癌,咽喉癌,胸腺瘤,胸腺瘤和胸腺癌,甲状腺癌,肾盂和输尿管移行细胞癌及其他泌尿器官,妊娠滋养细胞肿瘤,尿道癌,子宫内膜癌,子宫肉瘤,子宫体癌,阴道癌,外阴癌和/或Wilm氏肿瘤。
在本公开方法的某些实施方式中,受试者患有感染。在某些实施方式中,感染是细菌。在某些实施方式中,感染是病毒。在某些实施方式中,感染是真菌。在某些实施方式中,感染是微生物。本公开的感染病原体可以是任何物种。
在本公开方法的某些实施方式中,受试者患有免疫病症。在本公开方法的某些实施方式中,受试者患有免疫缺陷病症。在某些实施方式中,受试者患有原发性或先天性免疫缺陷病。示例性的原发性或先天性免疫缺陷病包括但不限于共济失调-毛细血管扩张症,Chediak-Higashi综合征,联合免疫缺陷病,补体缺乏症,DiGeorge综合征,低丙种球蛋白血症,工作综合征,白细胞粘附缺陷,全血球蛋白血症,布鲁顿病,先天性丙种球蛋白血症,选择性缺乏IgA和Wiskott-Aldrich综合征。在某些实施方式中,受试者患有继发性或获得性免疫缺陷病症。示例性的继发性或获得性免疫缺陷病症包括但不限于由于感染(例如HIV和AIDS)导致的免疫系统减弱,免疫系统的癌症(例如白血病),血浆癌症细胞(例如多发性骨髓瘤),免疫复合物疾病(例如病毒性肝炎),严重烧伤,药物治疗(例如化疗和放射),暴露于辐射或有毒化学品,以及营养不良。
在本公开方法的某些实施方式中,受试者患有自身免疫疾病。在某些实施方式中,该病症是先天性的。在某些实施方式中,该病症具有遗传和/或表观遗传原因。示例性自身免疫疾病包括但不限于斑秃,自身免疫性溶血性贫血,自身免疫性肝炎,皮肌炎,糖尿病(1型),某些形式的幼年特发性关节炎,肾小球肾炎,格雷夫斯病,格林-巴利综合征,特发性血小板减少性紫癜,重症肌无力,某些形式的心肌炎,多发性硬化,天疱疮/类天疱疮,恶性贫血,结节性多动脉炎,多发性肌炎,原发性胆汁性肝硬化,牛皮癣,类风湿性关节炎,硬皮病/系统性硬化症,综合征,系统性红斑狼疮,某些形式的甲状腺炎,某些形式的葡萄膜炎,白癜风和肉芽肿伴多血管炎(Wegener氏)。
在本公开方法的某些实施方式中,受试者患有炎性病症。在某些实施方式中,该病症是先天性的。在某些实施方式中,该病症具有遗传和/或表观遗传原因。示例性炎性病症包括但不限于由长期氧化应激,阿尔茨海默氏病,强直性脊柱炎,关节炎(骨关节炎,类风湿性关节炎(RA),银屑病关节炎),哮喘,动脉粥样硬化,克罗恩病,结肠炎引起的疾病,皮炎,憩室炎,纤维肌痛,肝炎,肠易激综合征(IBS),系统性红斑狼疮(SLE),肾炎,帕金森病和溃疡性结肠炎。
在本公开方法的某些实施方式中,受试者患有神经障碍。在某些实施方式中,该病症是先天性的。在某些实施方式中,该病症具有遗传和/或表观遗传原因。在某些实施方式中,神经障碍影响中枢神经系统。在某些实施方式中,神经障碍影响外周神经系统。在某些实施方式中,神经障碍影响自主神经系统。在某些实施方式中,神经障碍影响交感神经系统。在某些实施方式中,神经障碍影响副交感神经系统。在某些实施方式中,神经障碍是先天性的。在某些实施方式中,神经障碍是进行性的。在某些实施方式中,神经障碍是退行性的。在某些实施方式中,神经障碍影响老年人(例如,至少70岁,80岁,90岁,100岁或其间的任何年龄的成年人)。在某些实施方式中,神经障碍影响自愿或不自主运动。在某些实施方式中,神经障碍影响一种或多种感官,包括但不限于视觉,听觉,嗅觉,触觉和味觉。在某些实施方式中,神经障碍影响语言处理,包括但不限于语言理解,构思和交流(口头和/或书面)。在某些实施方式中,神经障碍影响记忆。在某些实施方式中,神经障碍影响疼痛信号的通信和控制。在某些实施方式中,神经障碍影响心脏和/或脉管系统的肌肉的运动和/或协调。在某些实施方式中,神经障碍影响睡眠。示例性神经疾病包括但不限于阿尔茨海默病,帕金森病,肌萎缩侧索硬化症(ALS),自主神经功能障碍,共济失调,痴呆,神经病,麻痹,亨廷顿病,癫痫,偏头痛,运动神经元疾病,多发性硬化,肌肉营养不良,发作性睡病,神经变性和创伤性损伤(脑和/或脊髓)。在某些实施方式中,神经障碍继发于医学治疗,另一种医学病症或创伤性损伤(例如脑震荡)。
在本公开方法的某些实施方式中,受试者患有代谢病症。在某些实施方式中,该病症是先天性的。在某些实施方式中,该病症具有遗传和/或表观遗传原因。在某些实施方式中,所述病症是获得性的或继发于另一种医学病症。本公开的示例性代谢病症包括但不限于酸碱失衡病,代谢性脑病,钙代谢病,DNA修复缺陷病,葡萄糖代谢病,高乳酸血症,铁代谢病,脂质代谢病,吸收不良综合征,代谢综合征X,线粒体疾病,磷代谢紊乱,卟啉症和蛋白质稳态缺乏症。
在本公开方法的某些实施方式中,受试者患有退行性疾病。本公开的示例性退行性病症增加对细胞,组织和器官的损害。通常这种损伤会累积,导致一种或多种症状的严重程度随着时间的推移而增加。
在本公开方法的某些实施方式中,受试者患有进行性疾病。本公开的示例性进行性病症作为时间的函数的严重性增加。严重程度包括症状的质量和数量以及疾病的物理传播。疾病严重程度的增加还可能包括越来越不利的预后。
在本公开方法的某些实施方式中,受试者具有与疾病或病症相关的基因突变和/或表观遗传修饰。基因突变和/或表观遗传修饰可以是疾病或病症的生物标志物。基因突变和/或表观遗传修饰可以与疾病或病症的发生增加或减少相关。基因突变和/或表观遗传修饰可以预测疾病或病症的发生增加或减少。基因突变和/或表观遗传修饰可能是疾病或病症发生率增加或减少的原因。
在本公开内容的方法的某些实施方式中,可视化包括使至少一种捕获剂:靶复合物与标记的第二抗体接触,所述第二抗体结合捕获剂并检测标记的第二抗体。在可视化步骤的某些实施方式中,标记的第二抗体包含荧光,金或银标记。在某些实施方式中,可视化包括使第一捕获剂:靶复合物与结合第一捕获剂的第一标记的第二抗体接触,使第二捕获剂:靶复合物与结合第二捕获剂的第二标记的第二抗体接触,和检测第一标记的第二抗体和第二标记的第二抗体,其中第一标记的第二抗体和第二标记的第二抗体各自包含不同的标记。
在本公开内容的方法的某些实施方式中,该方法还包括定量至少一种细胞内靶。在某些实施方式中,定量步骤包括测量标记的第二抗体的强度和/或密度。在某些实施方式中,细胞内靶是磷蛋白。
【附图简述】
该专利或申请文件包含至少一幅彩色附图。具有彩色附图的本专利或专利申请公开的副本将在请求和支付必要费用后由主管局提供。
图1A是涂覆组合物的基体并在基体的室内溶解单细胞的方法的示意图。该过程开始于(1)制备用于表面官能化的微室。(2)APTES然后在室上涂覆戊二醛以将涂层连接到PDMS微室。(3)制备裂解组合物和/或信号传导剂负载的PVA溶液并加载到微室上。(4)PVA膜通过旋涂将裂解组合物和/或信号传导剂固定在PDMS室上。(5)加载细胞悬浮液,并且包含多种捕获剂的表面附着用于蛋白质捕获。
图1B是描绘本发明的基体的照片,其包括含有异硫氰酸荧光素(FITC)的涂敷组合物,以使微室上的涂敷组合物可视化。拍摄横截面图像,显示微室上的PVA涂层。
图1C是描绘超载细胞的本公开的基体的微室的照片,以在T=0和T=30分钟时完全说明微室内的细胞裂解(此时几乎所有细胞都被完全裂解)。
图1D是描绘随时间的总裂解优化的图。选择最佳裂解(顶部线,橙色),30分钟后显示70%裂解。
图2是信号传导途径的示意图,其中涉及开发用于研究EGFR信号传导途径的14重抗体组的组分。本公开内容的组合物使用的高度多重化的面板沿着多个信号转导途径监测关键的细胞内蛋白质。可以在几天内检测信号传导(药物)有效性和通过非遗传(适应性)机制的抗性,从而允许对例如胶质母细胞瘤(GBM)患者中的组合治疗策略的设计进行临床可操作的见解。通过在空间上添加更多抗体(本公开的组合物的捕获剂的重复图案的每个重复更多的抗体)和光谱(更广泛的标记的第二抗体或更灵敏的检测方法),可以扩展所呈现的组。
图3是描绘PDMS/PVA结合化学和本公开的APTES/GA接头的制备的示意图。(1)在氧等离子体处理之前,用甲醇清洗0.1%Triton X-100PDMS微室。氧等离子体用于改性PDMS表面以引入主要是APTES官能化所需的硅烷醇基(SiOH)的极性官能团。(2)然后用1%APTES的丙酮溶液涂覆室10分钟,使PDMS表面硅烷化并提供用于戊二醛键合的胺基。将样品在80℃下烘烤30分钟以促进缩合和硅氧烷键形成。(3)APTES改性的PDMS涂有1%戊二醛溶液,用于产生PVA键合所需的醛基。(4)戊二醛官能化表面允许PVA涂层和PDMS之间的共价键合。
图4是描绘根据本公开内容的方法的控释化学品和用于单细胞裂解的制剂的实例的示意图。(4)将涂敷溶液(PVA,Triton X-100,HCl和游离戊二醛)移液到戊二醛官能化表面上,在PDMS表面上形成PVA水凝胶。(5)通过旋涂除去液体,在PDMS的表面上留下薄的PVA薄膜。现在交联的PVA薄膜与PDMS表面共价键合,使薄膜与薄膜固定。(6)将细胞加载到涂覆的PDMS室中,并用包含捕获剂的重复图案的表面封闭(在该实施例中,其为抗体)。细胞悬浮液中的液体扩散到水凝胶中,使其膨胀并缓慢释放Triton X-100进入微室,在30分钟内裂解细胞。
图5A是散点图,显示了通过本公开的涂敷组合物释放的受控裂解组合物和/或信号传导剂产生的单细胞裂解后的总蛋白质捕获。利用每个细胞的蛋白质强度,可以引发蛋白质与蛋白质的相关性以确定信号协调。
图5B是显示如何通过检测次级途径的激活来评估适应性抗性以靶向抑制剂的图。该数据可用于选择和优化用于例如胶质母细胞瘤中的靶向治疗的药物组合。
图6A-C是显示使用包含U87成胶质细胞瘤肿瘤细胞的本公开的组合物的分析的样品与样品一致性的一系列图。图6A显示总蛋白质捕获的批间变异系数(CV)为21%,其符合单细胞装置的当前制药标准(CV<25~30%)。图6B显示了蛋白质-蛋白质相关性的一致分析,所有蛋白质和所有样品之间的精确度>75%。图6C显示未刺激的EGF和EGF/厄洛替尼处理的U87细胞的一致和差异分析。
图7是描绘本发明的涂敷组合物的开发的一系列示意图。尽管亲水性交联组合物(例如PVA)与基于PDMS的基体的分离对于受控裂解组合物和/或信号传导剂释放是期望的,但是接头组合物,包括接头组合物的官能化组分(在该实施例中,APTES)当涂敷组合物或预期的泡孔组合物是含水的(含水)时,可以优化以抵抗水解。尽管APTES在该实施例中提供了足够的密封,但本公开提供了接头组合物,包括在这些条件下不会发生水解的接头组合物的官能化组分。
图8是描绘本发明的涂敷组合物的开发的一系列示意图。除了优化接头组合物(包括接头组合物的官能化组分以在水存在下抵抗水解)之外,该系列图还显示了在更长的时间段内增加接头组合物稳定性的替代方法。显示的替代方法包括但不限于从PDMS底物去除低分子量(LMW)物质,在官能化组分的分子之间引入键(在该实施例中为APTES)以最小化LMW物质的扩散并产生更多均匀涂敷,向PDMS基体中添加表面活性剂以减少交联组合物与PDMS基体之间的排斥,并在真空下用干燥剂储存包含涂敷组合物的基体,以最小化或防止官能化组分的降解(在该实施例中,通过痕量水水解APTES)。
图9是比较使用冷冻和超声处理的组合以将涂敷组合物施加到基体上的基体之间的信号配位和包含包含Triton-X-100负载的PVA的涂敷组合物的基体的一对示意图。如图所示,使用包含包括Triton-X-100负载的PVA(控释方法)的涂敷组合物的基体的信号配位优于替代方案。
图10是提供使用控释方法的平均蛋白质捕获的测定间可变性的数据的表。如数据所示,批间变异性低,平均变异性为21%。
图11是描绘裂解组合物优化的照片和图表。图11A是在两小时内进行的时间推移摄影的静止照片,用于视觉确认细胞裂解。图11B是显示对包含3%PVA,0.2%Triton-X-100,0.2%戊二醛和10%HCl的涂敷组合物的该数据的定量分析的图,所述涂敷组合物施加到预涂有戊二醛的PDMS基体上。PDMS基体上的顶线(0.1%戊二醛涂层)表现优于(0.1%GA涂层,下一线向下,蓝色;0.25%GA涂层,第二线向下,紫色;和1.0%GA涂层,底线,红色)。虽然所有浓度的戊二醛诱导细胞裂解,但PDMS底物上的0.1%戊二醛预涂层表现最佳。
图12是总结基体预涂层和用戊二醛预涂覆的PDMS基体和涂敷组合物的涂敷组合物的优化表,所述涂敷组合物包括含有Triton-X-100的裂解组合物和包含PVA的交联组合物。
图13是描绘本公开的示例性组合物的示意图。
图14是描绘制备本发明的涂敷组合物的示例性方法的一系列示意图。在步骤1中,将裂解组合物和交联组合物组合以形成多个微珠。在该具体实例中,交联组合物包含PVA。在步骤2中,将涂敷组合物和细胞悬浮液(包含解离的单细胞)合并。将来自步骤2的包含单细胞和多个微珠的组合物的等分试样引入基体的至少一个室中(并且优选地,重复该步骤直至每个室包含单细胞和多个微珠。步骤2的组合物已经分布在基体的室中,可释放地连接到基体上的表面与基体接触。在步骤3中,微珠以受控的方式将裂解组合物释放到室中,引发裂解。在步骤4中,微珠释放了大部分裂解组合物并且细胞裂解完成。室中单细胞的细胞内组分被释放到周围液体中,这些组分遇到并特异性地结合到表面的捕获剂。
图15A-L是一系列示意图,描绘了用于单珠,单细胞捕获的测序方案。A.将可UV交联的PVA旋涂在微室表面上。B.使用负光掩模,PVA在微室表面上交联形成PVA水凝胶,除了未暴露于UV光的10μM条带。C.暴露的PDMS用胺基/戊二醛官能化以用于抗体固定。D.将丙烯酰胺-链霉亲和素旋涂在表面上。E.利用正光掩模固定到带中。F.生物素化的seq-孔珠与链霉亲和素官能化表面结合。最终消耗品由每个微室的1个珠和1个细胞组成。G.将水凝胶涂覆的PDMS微室在3%SDS中浸泡1小时。在此期间,裂解剂SDS被水凝胶吸收。温育后,用dH2O冲洗微室,然后用压缩空气干燥。H.将细胞以适当的浓度重悬于RNA酶抑制剂溶液中,并移液到微室PDMS的表面上。在洗掉多余的细胞之前,允许细胞与捕获抗体结合。I.一旦细胞被加载,通过添加抗体载玻片密封微室,并从水凝胶中缓慢释放SDS。J.裂解后,mRNA转录物与捕获珠上寡核苷酸的poly-T区杂交。K.温育后,将微室PDMS开封,并将珠从微室中洗掉。将珠收集在flacon管中并在进一步处理之前洗涤。L.通过模板转换PCR从珠产生cDNA文库。然后扩增cDNA文库并为NGS编制索引。
图16A-E是描绘单细胞捕获的一系列示意图。A.用ECD/NHS处理PDMS后,将PLL-g-生物素旋涂到微室表面上。B.使用负光掩模,除了未暴露于UV光的10μM条带外,从PDMS表面除去PLL-g-PEG-生物素。C.生物素化区域通过中性亲和素/蛋白质-G-生物素用细胞捕获抗体官能化。D.将细胞悬浮液移液到PDMS表面上,通过每个微室中的抗体带捕获单细胞,并从微室上冲洗掉多余的细胞。E.微室是用抗体载玻片密封并温育16小时以捕获分泌的细胞因子。
图17A-F是一系列示意图,描绘了用尺寸排阻孔进行单珠,单细胞捕获的测序方案。A.将UV可交联PVA旋涂到微室表面上。B.使用负光掩模,PVA在微室表面上交联形成PVA水凝胶,除了未暴露于UV光的10μM条带。C.暴露的PDMS用胺基/戊二醛官能化以用于抗体固定。D.将Seq-孔珠加入微量瓶中并被截留在排除孔中并冲洗掉过量的珠。E.将细胞悬浮液移液到PDMS表面上,在每个微室中的细胞捕获器中捕获单细胞,并冲洗掉多余的细胞。F.用抗体载玻片密封微室,裂解细胞释放mRNA。3小时后,mRNA转录物与Drop-Seq珠杂交。从PDMS移除载玻片并移除珠以进行芯片外测序。
图18A-E是描绘光刻显影和抗体固定化学的一系列照片。A.正掩模光刻:PDMS微室用PLL-g-PEG涂覆。利用接触光刻法,PLL-g-PEG通过UV光刻降解,在室内留下由FITC-BSA可视化的离散带。B.负掩模光刻。PDMS微室用PLL-g-PEG-生物素包被。利用接触光刻,PLL-g-PEG-生物素通过UV光刻降解,在通过链霉亲和素-Alexa Fluor 647可视化的室内留下离散的生物素带。C.选择性抗体沉积。CD8抗体条带成功沉积在PDMS表面微室上(用抗-fabAlexa Fluor 647验证)。D.结合化学。选择性CD8a抗体沉积在非UV暴露(左)和UV暴露区域(右)。E.单个CD8+T细胞的5×显微镜图像,所述细胞用亮紫罗兰色膜染色,被抗CD8a抗体条带捕获。
图19A-C是一系列照片,描绘了针对单细胞裂解和表面官能化而优化的可光交联聚合物(SbQ-PVA)的验证。A.将薄的PVA水凝胶涂层UV交联到PDMS微室的表面并装载裂解缓冲液。细胞用亮紫色细胞染色剂染色并加载到微室PDMS上。拍摄5×时间推移图像,证明在10分钟后完成细胞裂解。B.通过同时的蛋白质和测序捕获组合物方案测试水凝胶涂覆的微室,并且能够成功捕获细胞内磷蛋白。C.可UV固化的水凝胶通过利用负光掩模实现区域特异性抗体沉积。暴露的PDMS区域(未被水凝胶覆盖)用由(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(APTES)/戊二醛PDMS表面修饰结合的抗-CD8a抗体官能化。
图20是生物分析仪数据的图,显示了cDNA文库涂片,其中大部分片段在200和1000bp之间。数据证明本公开内容的组合物和方法的下列能力:(i)将来自裂解细胞的RNA与芯片上的珠结合,(ii)有效地从芯片中回收珠,和(iii)以有效产生单细胞的方式处理回收的珠用于测序的cDNA文库。
图21是描绘本公开的示例性蛋白质组/转录组可消耗装置的一系列示意图。在该实施方式中,在每个微室的末端捕获珠在特定尺寸的孔中,每个室仅允许一个寡-dT珠。表面涂有水凝胶,用于控制裂解缓冲液释放,用于单细胞裂解。还可以结合单细胞捕获器以定位更接近珠的细胞捕获。
图22A-B是描绘用于消耗品制备(A)和消耗品使用(B)的示例性完整测序方案的一对示意图。总之,捕获寡-dT珠并将其固定在PDMS微室上。在芯片上鉴定珠条形码,荧光显微镜连接微室(用于单细胞和蛋白质捕获)与寡-dT珠(用于mRNA捕获和下游测序)。微室涂有载药水凝胶,可以进行单细胞裂解。对于一般工作流程,将细胞加载到测序耗材上并密封到具有条形码识别珠的微室中。裂解细胞,捕获mRNA和蛋白质。消耗品未开封,其中提取珠用于芯片外测序并且使用标准ELISA方案分析蛋白质数据。最终数据转录组和蛋白质组学数据与分析程序相关联,该程序能够分离单细胞数据,转录组信息和数据点,以及蛋白质组信息和数据点,用于同时分析DNA,RNA和来自个体细胞的蛋白质组。
图23是描绘片上定序过程的示例性实施例的一系列示意图。将序列柄添加到寡-dT珠中以允许细胞条形码识别。珠装入微室。细胞条形码在芯片上测序,荧光标记将珠细胞条形码连接到特定的室。
图24是用于珠识别过程的一系列示例性原始图像。流动AF568和AF647标记的标记物以鉴定细胞条形码序列的T和G核苷酸。
图25是描绘珠化学和mRNA捕获的示例性实施方式的一系列示意图。从测序柄对细胞条形码进行测序以进行芯片珠鉴定。从寡-dT珠中除去引物和荧光标记。从孔中的mRNA合成cDNA,并使用珠上的模板转换寡核苷酸捕获cDNA。
图26是描绘TCR特异性扩增的示例性实施方式的一系列示意图。使用TCR特异性引物选择性扩增由寡-dT珠捕获的cDNA。最终的库被送到MiSeq进行测序。
图27是一系列示意图,描绘了来自扩增的cDNA的标记计数的示例性实施方式。扩增全长cDNA用于标记计数。使用HiSeq,NovaSeq或MiSeq对最终文库进行测序。
【发明详述】
本公开内容提供了用于以高通量形式在单细胞内多重分析细胞内蛋白质相互作用和信号传导的组合物和方法,其可以同时平行分析数千个细胞中的每一个的数百种细胞内组分。在某些实施方式中,本公开内容提供了用于控释释放裂解组合物的组合物,其在与细胞接触时破坏细胞膜并使细胞的细胞内组分暴露于重复捕获剂模式的单一重复。本发明的捕获剂特异性结合细胞的至少一种细胞内组分以形成至少一种复合物。至少一种复合物(包含捕获剂和细胞内组分)的可视化可以指示或证明细胞内的蛋白质表达,蛋白质调节,蛋白质-蛋白质相互作用,蛋白质活化和/或蛋白质信号传导事件。
【细胞内组分及其相互作用】
尽管信号转导抑制剂可以为癌症患者提供临床益处,但是从癌基因发出的信号通量通常通过多种途径分布,这可能是大多数此类抑制剂失败的潜在基础。测量通过多个途径的信号通量,例如,响应于使用本公开的组合物和方法的信号转导抑制剂,揭示了有助于治疗抗性的网络相互作用,并且不能通过分离单独的途径来预测。尽管该说明性实施例描述了致癌途径,但是相同的原理适用于导致本公开内容的疾病或病症的发展的几乎每种细胞过程。细胞结果很少是单一信号通路的结果,而是多种通路之间的相互作用。
本公开的组合物和方法被设计为适应体内微环境的细胞和分子复杂性,包括例如实体肿瘤微环境,通过使用高度多重反应来鉴定单细胞内的细胞内组分和信号传导事件。同时,在相同条件下对数千个单细胞进行相同的分析。因此,本公开内容的组合物和方法提供详述的分析,其概括了细胞内和体内微环境的复杂性,同时在单个实验中提供足够的统计学能力以得出显着的结论。
【控制释放】
本公开的涂敷组合物包含受控的裂解组合物和/或信号传导剂释放技术。所述室包含涂敷组合物,所述涂敷组合物包含裂解组合物,并且任选地包含交联组合物。所述室包含涂敷组合物,所述涂敷组合物包含裂解组合物和信号传导剂,并且任选地包含至少一种交联组合物。在某些实施方式中,本发明的组合物,交联组合物包含生物相容性聚合物,例如PVA(聚(乙烯醇)。例如,生物相容性聚合物如PVA可以装载裂解组合物(例如,包含TritonX-100的组合物)。在将所需的细胞组合物(优选细胞悬浮液)引入组合物的室中后,交联剂(例如,PVA)与细胞组合物的液体接触并膨胀以将裂解组合物以受控方式释放到室(见图2B)。
可以优化交联组合物以在限定的时间段内控制裂解组合物的释放。例如,交联组合物可以优化用于在至少1秒,2秒,3秒,4秒,5秒,6秒,7秒,8秒,9秒,10秒,15秒,20秒,25秒,30秒,35秒,40秒,45秒,50秒,55秒,60秒或其间的任意秒的时间段内控制释放裂解组合物。可以优化交联组合物以在至少1分钟,2分钟,3分钟,4分钟,5分钟,6分钟,7分钟,8分钟,9分钟,10分钟,15分钟,20分钟,25分钟,30分钟,35分钟,40分钟,45分钟,50分钟,55分钟,60分钟或其间的任何分钟的时间段内控制释放裂解组合物。可以优化交联组合物以在至少1小时,2小时,3小时,4小时,5小时,6小时,7小时,8小时,9小时,10小时,11小时,12小时,13小时,14小时,15小时,16小时,17小时,18小时,19小时,20小时,21小时,22小时,23小时,24小时或任何一小时的增量之间的时间段内控制释放裂解组合物。
可以通过改变交联组合物的一种或多种组分的识别和/或浓度来优化交联组合物以控制裂解组合物的释放。例如,交联组合物和/或生物相容性聚合物可包含任何单体单元,并可包含任何数量的单体(任何分子量的聚合物)。交联组合物和/或生物相容性聚合物可包含任何浓度的聚合物分子。交联组合物和/或生物相容性聚合物可以交联到不同的离子,形成松散基质或致密基质,其可以分别增加或减少裂解组合物从交联组合物中逸出。
可以通过改变裂解组合物的释放机制来优化交联组合物以控制裂解组合物的释放。例如,交联组合物和/或生物相容性聚合物可在细胞组合物存在下降解,但在不存在细胞组合物时不降解。在这种情况下,当本发明的交联组合物与细胞组合物接触时,交联组合物的受控降解导致裂解组合物释放到室中。
交联组合物可以优化用于裂解组合物单独或与信号传导剂组合的控制释放。例如,本公开的涂敷组合物可包含信号传导剂,其激活,抑制或改变室中细胞的信号传导途径。本公开内容的裂解组合物可包含信号传导剂,其激活,抑制或改变室中细胞的信号传导途径。例如,在本公开的涂敷组合物中,裂解组合物可以与第一交联组合物组合,并且信号传导剂可以与第二交联组合物组合,其中第一和第二交联组合物是相同的或者是独特配制的,用于在不同的时间和/或不同的速率释放裂解组合物或信号传导剂。在本公开的涂敷组合物的某些实施方式中,将裂解组合物与第一交联组合物组合,并将信号传导剂与第二交联组合物组合,其中将第一交联组合物添加到基体而作为直接接触基体的底层,将第二交联组合物添加到第一交联组合物的顶部而作为不直接接触基体的顶层。在接触细胞悬浮液后,涂敷组合物的顶层(即第二交联组合物)可在涂敷组合物的底层(即第一交联组合物)降解或释放裂解组合物之前降解或释放信号传导剂。该分层涂覆组合物的结果是细胞与信号传导剂的顺序接触,然后细胞与裂解组合物接触。不需要移动部件或多个通道,本公开的组合物可用于首先影响细胞信号传导,然后裂解细胞以暴露用于立即分析的细胞内组分。
作为使用本公开的信号传导剂的实例,本公开的涂敷组合物可包含刺激室中的T细胞的抗原(作为信号传导剂)。在细胞组合物与涂敷组合物接触后,交联组合物可以膨胀和/或降解以依次或同时释放抗原和裂解组合物,以最终刺激和裂解T细胞,暴露介导该T细胞的活化的抗原受体的下游的细胞内组分和信号传导途径。
在某些优选的实施方式中,本发明的涂敷组合物在30分钟内被优化用于完全单细胞裂解,以允许使用者有足够的时间对单细胞室成像并快速裂解细胞以便以可重复和可扩展的方式捕获相关生物学。包含优化用于裂解组合物的控制释放和在30分钟内完全细胞裂解的涂敷组合物的本公开的组合物可以进一步包含多种捕获剂,用于检测例如每个单细胞90个不同的细胞内蛋白质和至少2500个室内容纳至少2500个单细胞(每个室中有一个细胞)。
【消耗品成分】
本发明的组合物和方法可以在台面上使用,而无需计算机或机器人控制多重反应。本发明的方法包括将细胞组合物引入基体中,使得单细胞或限定数量的细胞被引入多个室的每个室中,并允许存在于每个室中的涂敷组合物释放裂解组合物而裂解细胞并将每个细胞的细胞内组分暴露于表面上的捕获剂。一旦细胞内组分与捕获剂形成复合物,就可以除去表面并使其可视化。可以使用例如荧光信号检测器进行细胞内特征的可视化(即,在单细胞内形成的细胞内组分和捕获剂之间形成的复合物的总数,其指示涉及任何特定细胞过程的那些细胞内组分和途径)。因此,一旦将细胞组合物引入基体的室中,这可以手动完成,本发明的方法可以在没有另外的其他“移动部件”的情况下完成。尽管可以从基体上除去表面以显现与捕获剂结合的细胞内组分的复合物,但不需要该步骤。例如,如果表面是透明的,则捕获剂可以通过表面可视化。
本发明的组合物和方法可用于同时检测单细胞的数百种细胞内组分,同时对数千个单细胞进行并行的多重分析。此外,可以在单个实验中同时进行数千个复杂细胞内特征中的每一种的可视化。
本发明的组合物和方法可以购买,储存而不降解组合物,根据本公开的方法使用,并丢弃。因此,本公开的组合物是可消耗的组合物。此外,因为本公开的组合物不需要计算机控制或机器操作用于多重反应,所以可以使用本公开的组合物而不考虑组合物对任何用户现有系统的适应性。因此,本公开的可消耗组合物不仅比现有技术更有效,而且操作成本更低。
【成分】
本公开内容提供了用于从单细胞多重检测多种化合物的组合物,其包含阵列,所述阵列包含多个室和多种捕获剂。优选的捕获剂包括抗体,然而,捕获剂可包括特异性结合本公开的细胞内组分的任何可检测的实体。例如,可检测实体可包括可检测标记。可检测标记可包括但不限于荧光标记。
本发明的组合物包含多个单独的室,优选地以均匀的排列。在某些实施方式中,所述多个单独室中的至少一些具有大于50μm的长度,并且任选地,可以配置为包含亚纳升体积的内容物中的分离的单细胞。
本公开内容的组合物的表面可包含多种固定的捕获剂,每种固定的捕获剂能够特异性结合本公开的多种靶细胞内组分之一。优选地,固定的捕获剂以可重复的图案附着到表面,其中图案的每个重复与多个室的室对齐。
本公开的组合物的基体和表面被偶联以形成多个封闭的界面,每个封闭的界面包括室和多种捕获剂的重复图案的至少一个重复,使得每个室的内容物是可接近的图案化的多种捕获剂的至少一个重复的每种捕获剂。
基体的室可呈现任何形状并且可具有任何尺寸,然而,在本公开的某些实施例中,基体包括至少1、2、5、10、15、20、25、50、100、150、500,1000、1500、2000个或它们之间的任何整数个室。每个室的深度/高度可以在1μm和2000μm之间,直径在1μm和2000μm之间,宽度在1μm和2000μm之间和/或长度在1μm和2000μm之间。基体的任何两个室之间的距离可以在1μm和2000μm之间。
在某些实施方式中,至少一个室是高纵横比的矩形孔,其长度为约1~2mm,深度为约5~50μm。
在某些实施方式中,每个室是矩形的,长度为约10~2000μm,宽度为约10~100μm,深度为约10~100μm。
在某些实施方式中,多种捕获剂可包含3~500种不同的捕获剂,从而允许检测单细胞的3~500种不同的细胞内组分。在某些实施方式中,多种捕获剂可包含3种不同的捕获剂,从而允许检测单细胞的3种不同的细胞内组分。在某些实施方式中,多种捕获剂可包含10种不同的捕获剂,从而允许检测单细胞的10种不同的细胞内组分。在某些实施方式中,多种捕获剂可包含50种不同的捕获剂,从而允许检测单细胞的50种不同的细胞内组分。在某些实施方式中,多种捕获剂可包含100种不同的捕获剂,从而允许检测单细胞的100种不同的细胞内组分。在某些实施方式中,多种捕获剂可包含150种不同的捕获剂,从而允许检测单细胞的150种不同的细胞内组分。在某些实施方式中,多种捕获剂可包含200种不同的捕获剂,从而允许检测单细胞的200种不同的细胞内组分。在某些实施方式中,多种捕获剂可包含250种不同的捕获剂,从而允许检测单细胞的250种不同的细胞内组分。在某些实施方式中,多种捕获剂可包含300种不同的捕获剂,从而允许检测单细胞的300种不同的细胞内组分。在某些实施方式中,多种捕获剂可包含350种不同的捕获剂,从而允许检测单细胞的350种不同的细胞内组分。在某些实施方式中,多种捕获剂可包含400种不同的捕获剂,从而允许检测单细胞的400种不同的细胞内组分。在某些实施方式中,多种捕获剂可包含450种不同的捕获剂,从而允许检测单细胞的450种不同的细胞内组分。在某些实施方式中,多种捕获剂可包含500种不同的捕获剂,从而允许检测单细胞的500种不同的细胞内组分。
在某些实施方式中,基体包含约200个室/cm2~约20,000个室/cm2的密度。
【多元分析和发现平台】
本公开提供了定量的多组学测定法,其能够捕获细胞内信号传导蛋白,细胞内细胞因子蛋白(来自例如单一癌症和免疫细胞),结合mRNA转录物,转录组的组分和全基因组的组分,使用“同时蛋白质和测序捕获”装置(或组合物)从单个癌细胞中获得。
在本公开内容的同时蛋白质和测序捕获组合物的一些实施方式中,在约2纳升体积的微室中分离单细胞和单个珠,所述微室包含用于捕获和检测一组蛋白质的抗体阵列。同时的蛋白质和测序捕获组合物设计允许裂解每个个体捕获的细胞。本发明的示例性同时蛋白质和测序捕获组合物可以对每个芯片具有约2500个单细胞的重要组(多达90种不同的磷蛋白)进行分析,用于样品细胞群的统计学代表性分析。可以将珠切割并从芯片上移除以进行进一步处理。或者,可以将珠保持在芯片上以进行进一步处理。
本发明的同时蛋白质和测序捕获组合物提供了新的多组学平台,其能够同时检测单细胞的转录组的细胞内磷蛋白和组分,并且许多单细胞分析平行进行。本公开的多组学平台为用户提供了一种手段,用于发现细胞群(包括例如癌细胞)中的信号通量的新的相关性和方法,其无法由这些方法中的任何一种个别地发现(例如,或者分别对细胞内磷蛋白进行分析或分析转录组的成分)。
本公开内容的组合物和方法,包括本文所述的同时蛋白质和测序捕获组合物,将受控药物释放技术结合到本公开的微室中。在一些实施方式中,PDMS微室用生物相容性聚合物(例如,聚(乙烯醇)或PVA)涂敷,其装载有裂解缓冲液(SDS)。在一些实施方式中,通过与沉积在每个微室中的官能化带上的细胞捕获抗体结合,每个微室捕获单细胞。在一些实施方式中,该官能化带的宽度为10μm,这允许每个室仅捕获一个细胞。在一些实施方式中,PDMS微流体芯片(例如本公开的同时蛋白质和测序捕获组合物)促进细胞以单细胞特异性方式裂解。可以优化芯片上或芯片的微室上或内的涂层,以允许在10分钟内完成单细胞裂解。在10分钟内完成单细胞裂解,使用户有足够的时间对单细胞微室进行成像,并以足够的速度裂解细胞,以可重复和可扩展的方式捕获相关的生物学。
本发明的每个微室设计成通过例如以下两种方法之一捕获每个微室的一个测序珠:(i)每个微室包含官能化的链霉亲和素条带,用于通过生物素化的寡核苷酸捕获每个微室的一个测序珠。由于官能化链霉亲和素条带(10μM)的大小,每个室仅结合一个珠。如果需要,可以裂解生物素部分,以便可以在芯片外进行珠处理。(ii)每个室具有沉积在官能化带上的捕获抗体以及尺寸排阻孔,从而每孔捕获一个细胞和一个珠。在一些实施方式中,测序珠的尺寸范围可以在30和40μm之间,因此,微室上的尺寸排除孔具有50μm或约50μm的直径,从而允许每个孔仅适合一个珠。
【定义】
除非另外定义,否则与本公开相关使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外,除非上下文另有要求,否则单数术语应包括复数,复数术语应包括单数。通常,与本文所述的细胞和组织培养,分子生物学和蛋白质和寡核苷酸或多核苷酸化学和杂交相关的术语和技术是本领域公知和常用的那些。标准技术用于重组DNA,寡核苷酸合成和组织培养和转化(例如,电穿孔,脂质转染)。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书进行或如本领域通常实现的或如本文所述进行。除非特别相反地指出,否则本发明的实践将采用本领域技术范围内的病毒学,免疫学,微生物学,分子生物学和重组DNA技术的常规方法,其中许多方法在下文中为了说明的目的而描述。这些技术在文献中有充分说明。参见,例如,Sambrook,et al.Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2ndEdition,1989);Maniatis et al.Molecular Cloning:A Laboratory Manual(1982);DNACloning:APractical Approach,vol.I&II(D.Glover,ed.);Oligonucleotide Synthesis(N.Gait,ed.,1984);Nucleic Acid Hybridization(B.Hames&S.Higgins,eds.,1985);Transcription and Translation(B.Hames&S.Higgins,eds.,1984);Animal CellCulture(R.Freshney,ed.,1986);Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning(1984)。
以下定义有助于理解本发明:
如本文所用的术语“抗体”(Ab)包括单克隆抗体,多克隆抗体,多特异性抗体(例如,双特异性抗体)和抗体片段,只要它们表现出所需的生物学活性即可。术语“免疫球蛋白”(Ig)与本文的“抗体”可互换使用。
“分离的抗体”是已经从其天然环境的组分中分离和/或回收的抗体。其天然环境的污染组分是会干扰抗体的诊断或治疗用途的材料,并且可包括酶,激素和其他蛋白质或非蛋白质溶质。在优选的实施方式中,将抗体纯化至:(1)通过Lowry法测定的抗体的大于95重量%,最优选大于99重量%;(2)通过使用旋转杯测序仪足以获得N-末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度;或者(3)使用考马斯蓝或优选银染色在还原或非还原条件下通过SDS-PAGE是均一性。分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体,因为抗体的天然环境的至少一种成分将不存在。然而,通常,通过至少一个纯化步骤制备分离的抗体。
本公开的捕获剂可包含一种或多种单克隆抗体。如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体,即除了可能以少量存在的可能的天然发生的突变之外,构成群体的各个抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异性的,针对单个抗原位点。此外,与包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反,每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除了它们的特异性之外,单克隆抗体的优点还在于它们可以被其他抗体未污染地合成。
本文考虑的单克隆抗体包括“嵌合”抗体,其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源,而其余部分所述链与衍生自另一物种或属于另一抗体类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源,以及这些抗体的片段,只要它们表现出所需的生物活性即可。本文主要感兴趣的嵌合抗体包括具有一个或多个人抗原结合序列(例如CDR)并含有一个或多个衍生自非人抗体的序列的抗体,例如FR或C区序列。另外,本文主要感兴趣的嵌合抗体包括包含一个抗体类别或亚类的人可变结构域抗原结合序列和另一个序列的嵌合抗体,例如衍生自另一抗体类别或亚类的FR或C区序列。本文感兴趣的嵌合抗体还包括含有与本文所述相关的可变结构域抗原结合序列或衍生自不同物种的那些,例如非人灵长类动物(例如,旧大陆猴,猿等)。嵌合抗体还包括灵长类化和人源化抗体。
本公开的捕获剂可包含人源化抗体。“人源化抗体”通常被认为是具有从非人源引入的一个或多个氨基酸残基的人抗体。这些非人氨基酸残基通常称为“输入”残基,其通常取自“进口”可变结构域。传统上通过用导入的高变区序列取代人抗体的相应序列来进行人源化。因此,这种“人源化”抗体是嵌合抗体,其中基本上少于完整的人可变结构域已经被来自非人物种的相应序列取代。
“人抗体”是仅含有存在于人天然产生的抗体中的序列的抗体。然而,如本文所用,人抗体可包含在天然存在的人抗体中未发现的残基或修饰,包括本文所述的那些修饰和变体序列。这些通常用于进一步改善或增强抗体性能。
本公开的捕获剂可包含完整抗体。“完整”抗体是包含抗原结合位点以及CL和至少重链恒定结构域CH1,CH2和CH3的抗体。恒定结构域可以是天然序列恒定结构域(例如,人天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。优选地,完整抗体具有一种或多种效应子功能。
本公开的捕获剂可包含抗体片段。“抗体片段”包含完整抗体的一部分,优选完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab,Fab',F(ab')2和Fv片段;双抗体;线性抗体;单链抗体分子;和由抗体片段形成的多特异性抗体。
本公开的捕获剂可包含抗体的功能片段或类似物。短语抗体的“功能片段或类似物”是具有与全长抗体相同的定性生物学活性的化合物。例如,抗IgE抗体的功能片段或类似物是能够以这样的方式结合IgE免疫球蛋白的抗体,以便防止或基本上降低这种分子具有结合高亲和力受体FcεRI的能力的能力。
木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段,称为“Fab”片段,和残留的“Fc”片段,这一名称反映了容易结晶的能力。Fab片段由整个L链以及H链的可变区结构域(VH)和一条重链(CH1)的第一恒定结构域组成。每个Fab片段就抗原结合而言是单价的,即它具有单个抗原结合位点。胃蛋白酶处理抗体产生单个大的F(ab')2片段,其大致对应于具有二价抗原结合活性的两个二硫键连接的Fab片段,并且仍然能够交联抗原。Fab'片段与Fab片段的不同之处在于在CH1结构域的羧基末端具有额外的少数残基,包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab'-SH是本文中Fab'的名称,其中恒定结构域的半胱氨酸残基带有游离巯基。F(ab')2抗体片段最初是作为Fab'片段对产生的,它们之间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其他化学偶联也是已知的。
“Fc”片段包含通过二硫化物保持在一起的两条H链的羧基末端部分。抗体的效应子功能由Fc区中的序列确定,该区域也是在某些类型的细胞上发现的Fc受体(FcR)识别的部分。
“Fv”是含有完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。该片段由紧密,非共价结合的一个重链和一个轻链可变区结构域的二聚体组成。从这两个结构域的折叠中发出六个高变环(每个来自H和L链的三个环),其贡献用于抗原结合的氨基酸残基并赋予抗体抗原结合特异性。然而,即使单个可变结构域(或仅包含三个对抗原特异的CDR的Fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力,尽管其亲和力低于整个结合位点。
本公开的捕获剂可包含单链抗体(也称为scFv)。“单链Fv”也缩写为“sFv”或“scFv”是包含连接成单一多肽链的VH和VL抗体结构域的抗体片段。优选地,sFv多肽还包含VH和VL结构域之间的多肽接头,其使sFv能够形成用于抗原结合的所需结构。关于sFv的综述,参见Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg and Moore eds.,Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994);Borrebaeck1995,见下。
本公开的捕获剂可包含双抗体。术语“双抗体”是指通过构建具有VH和VL结构域之间的短接头(约5~10个残基)的sFv片段(参见前段)制备的小抗体片段,使得实现V结构域的链间但不是链内配对,产生二价片段,即具有两个抗原结合位点的片段。双特异性双抗体是两个“交叉”sFv片段的异二聚体,其中两种抗体的VH和VL结构域存在于不同的多肽链上。双抗体更全面地描述于例如EP 404,097;WO93/11161;和Hollinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)。
本公开的捕获剂可包含双特异性抗体。在某些实施方式中,本发明的抗体是双特异性或多特异性的。双特异性抗体是对至少两种不同表位具有结合特异性的抗体。示例性双特异性抗体可以结合单个抗原的两个不同表位。其他此类抗体可以将第一抗原结合位点与第第二抗体原的结合位点组合。
制备双特异性抗体的方法是本领域已知的。全长双特异性抗体的传统生产基于两个免疫球蛋白重链-轻链对的共表达,其中两个链具有不同的特异性。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分类,这些杂交瘤(细胞杂交瘤)产生十种不同抗体分子的潜在混合物,其中只有一种具有正确的双特异性结构。通常通过亲和层析步骤进行的正确分子的纯化相当麻烦,并且产物收率低。
根据不同的方法,将具有所需结合特异性的抗体可变结构域(抗体-抗原结合位点)与免疫球蛋白恒定结构域序列融合。优选地,融合体具有Ig重链恒定结构域,其包含至少部分铰链,CH2和CH3区域。优选具有包含轻链键合所需位点的第一重链恒定区(CH1)存在于至少一种融合体中。将编码免疫球蛋白重链融合体和免疫球蛋白轻链(如果需要)的DNA插入单独的表达载体中,并共转染到合适的宿主细胞中。当在构建体中使用的三条多肽链的不等比例提供所需双特异性抗体的最佳产率时,这在调节实施方式中三种多肽片段的相互比例方面提供了更大的灵活性。然而,当以相等比例表达至少两条多肽链导致高产率或当比率对期望的链组合的产量没有显着影响时,可以将两条或所有三条多肽链的编码序列插入单一表达载体中。
如本文所用,如果抗体与抗原以可检测水平反应,优选具有大于或等于约104M-1,或大于或等于约105M-1,大于或等于约106M-1,大于或等于约107M-1,或大于或等于108M-1的亲和常数Ka,则称抗体是“免疫特异性的”,“特异性的”或“特异性结合”抗原。抗体对其同源抗原的亲和力通常也表示为解离常数KD,并且在某些实施方式中,如果抗体以小于或等于10- 4M,小于或等于约10-5M,小于或等于约10-6M,小于或等于10-7M,或小于或等于10-8M的KD结合,则抗体特异性结合本发明的细胞内组分。抗体的亲和力可以很容易使用常规技术测定,例如Scatchard等人描述的那些技术。(Ann.N.Y.Acad.Sci.USA 51:660(1949))。
本公开的细胞可以从任何物种(包括任何哺乳动物)分离,衍生或制备。用于治疗感染的“哺乳动物”是指任何哺乳动物,包括人类,家畜和农场动物,以及动物园,竞技动物或宠物动物,例如狗,猫,牛,马,绵羊,猪,山羊,兔等,优选地,哺乳动物是人。
本公开的细胞可以用于细胞疗法中以治疗疾病或病症。“治疗(Treating)”或“治疗(treatment)”或“缓解”是指治疗性治疗和预防性(prophylactic)或预防性(preventative)措施;其中目的是预防或减缓(减轻)目标病理状况或病症。需要治疗的患者包括已患有该疾病的患者以及易患该疾病的患者或需要预防该疾病的患者。当在用本公开的受试细胞接受细胞疗法后,患者显示可观察和/或可测量的减少或不存在以下一种或多种时,可以成功地“治疗”受试者或哺乳动物:减少一种或多种与疾病或病症有关的症状;降低发病率和死亡率,改善生活质量问题。用于评估成功治疗和疾病改善的上述参数可通过医生熟悉的常规程序容易地测量。本公开的方法可用于在开始治疗受试者之前,期间或之后确定细胞疗法的安全性和/或功效。
可以使用一种或多种方法标记本发明的捕获剂以使其可检测。如本文所用,“标记”是指可检测的化合物或组合物,其直接或间接与捕获剂(例如抗体)缀合,以产生“标记的”捕获剂(例如抗体)。标记物本身可以是可检测的(例如荧光标记物),或者在酶标记物的情况下,可以催化可检测的底物化合物或组合物的化学改变。
本公开的捕获剂可以选择性地或特异性地鉴定,捕获和/或定量细胞内组分,其中细胞内组分包含一种或多种小分子。“小分子”在本文中定义为具有低于约500道尔顿的分子量。
本公开的捕获剂包括小分子。
本公开的捕获剂可以选择性地或特异性地鉴定,捕获和/或定量细胞内组分,其中细胞内组分包含DNA分子,RNA分子或其任何组合。
本公开的捕获剂可包括核酸或标记的核酸。术语“核酸”和“多核苷酸”在本文中可互换使用,指单链或双链RNA,DNA或混合聚合物。多核苷酸可包括基因组序列,基因组外和质粒序列,以及表达或可适于表达多肽的较小工程化基因区段。
“分离的核酸”是基本上与其他基因组DNA序列分离的核酸以及天然伴随天然序列的蛋白质或复合物如核糖体和聚合酶。该术语包括已从其天然存在的环境中除去的核酸序列,包括重组或克隆的DNA分离物和由异源系统生物合成的化学合成的类似物或类似物。基本上纯的核酸包括分离形式的核酸。当然,这是指最初分离的核酸,并不排除随后通过人工添加到分离的核酸中的基因或序列。
术语“多肽”以其常规含义使用,即作为氨基酸序列使用。多肽不限于产品的特定长度。肽,寡肽和蛋白质包括在多肽的定义内,并且除非另有明确说明,否则这些术语可在本文中互换使用。该术语也不涉及或排除多肽的表达后修饰,例如,糖基化,乙酰化,磷酸化等,以及本领域已知的天然存在的和非天然存在的其他修饰。多肽可以是完整蛋白质或其子序列。
“分离的多肽”是已经从其天然环境的组分中鉴定和分离和/或回收的多肽。在优选的实施方式中,将分离的多肽纯化至(1)通过Lowry方法测定的多肽的大于95重量%,最优选大于99重量%,(2)足以通过使用旋转杯测序仪获得N末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度,或(3)使用考马斯蓝或优选银染色在还原或非还原条件下通过SDS-PAGE均一性。分离的多肽包括重组细胞内的原位多肽,因为不存在多肽天然环境的至少一种组分。然而,通常,通过至少一个纯化步骤制备分离的多肽。
“天然序列”多核苷酸是与衍生自自然界的多核苷酸具有相同核苷酸序列的多核苷酸。“天然序列”多肽是与衍生自自然(例如,来自任何物种)的多肽(例如抗体)具有相同氨基酸序列的多肽。这些天然序列多核苷酸和多肽可以从自然界分离,或者可以通过重组或合成方法产生。
本文使用的术语多核苷酸“变体”是通常因一个或多个取代,缺失,添加和/或插入而与本文具体公开的多核苷酸不同的多核苷酸。此类变体可以是天然存在的或可以是合成产生的,例如,通过修饰本发明的一个或多个多核苷酸序列并评估如本文所述的编码多肽的一种或多种生物活性和/或使用任何多种本领域熟知的技术。
本文使用的术语多肽“变体”是因一个或多个取代,缺失,添加和/或插入而通常不同于本文具体公开的多肽的多肽。此类变体可以是天然存在的或可以是合成产生的,例如,通过修饰本发明的一种或多种上述多肽序列并评估如本文所述的多肽的一种或多种生物活性和/或使用任何多种本领域熟知的技术。
可以在本公开的多核苷酸和多肽的结构中进行修饰,并且仍然获得编码具有所需特征的变体或衍生多肽的功能分子。当需要改变多肽的氨基酸序列以产生本发明多肽的等同物或甚至改进的变体或部分时,本领域技术人员通常会改变编码DNA序列的一个或多个密码子。
例如,某些氨基酸可以取代蛋白质结构中的其他氨基酸,而不会明显丧失其结合其他多肽(例如抗原)或细胞的能力。由于蛋白质的结合能力和性质决定了蛋白质的生物功能活性,因此可以在蛋白质序列中进行某些氨基酸序列替换,当然,也可以在其基础DNA编码序列中进行,然而获得具有类似蛋白质的蛋白质属性。因此预期可以对公开组合物的肽序列或编码所述肽的相应DNA序列进行各种改变,而不会明显丧失其生物学效用或活性。
在许多情况下,多肽变体将含有一个或多个保守取代。“保守取代”是其中氨基酸取代具有相似性质的另一种氨基酸的取代,使得肽化学领域的技术人员预期多肽的二级结构和亲水性质基本上不变。
在进行这种改变时,可以考虑氨基酸的亲水指数。亲水氨基酸指数在赋予蛋白质相互作用生物学功能方面的重要性通常在本领域中被理解(Kyte和Doolittle,1982)。可以接受的是,氨基酸的相对亲水特性有助于所得蛋白质的二级结构,这又决定了蛋白质与其他分子的相互作用,例如酶,底物,受体,DNA,抗体,抗原等。根据其疏水性和电荷特征,每种氨基酸都被赋予了亲水指数(Kyte和Doolittle,1982)。这些值是:异亮氨酸(+4.5);缬氨酸(+4.2);亮氨酸(+3.8);苯丙氨酸(+2.8);半胱氨酸/半胱氨酸(+2.5);蛋氨酸(+1.9);丙氨酸(+1.8);甘氨酸(-0.4);苏氨酸(-0.7);丝氨酸(-0.8);色氨酸(-0.9);酪氨酸(-1.3);脯氨酸(-1.6);组氨酸(-3.2);谷氨酸(-3.5);谷氨酰胺(-3.5);天冬氨酸(-3.5);天冬酰胺(-3.5);赖氨酸(-3.9);和精氨酸(-4.5)。
某些氨基酸可以被具有相似的亲水指数或分数的其他氨基酸取代,并且仍然产生具有相似生物活性的蛋白质,即仍然获得生物学功能等同的蛋白质。在进行这种改变时,优选其亲水指数在±2以内的氨基酸的取代,特别优选±1以内的氨基酸,更优选±0.5以内的氨基酸。可以基于亲水性有效地取代相似的氨基酸。蛋白质的最大局部平均亲水性,由其相邻氨基酸的亲水性决定,与蛋白质的生物学特性相关。
以下亲水性值指定为氨基酸残基:精氨酸(+3.0);赖氨酸(+3.0);天冬氨酸(+3.0±1);谷氨酸(+3.0±1);丝氨酸(+0.3);天冬酰胺(+0.2);谷氨酰胺(+0.2);甘氨酸(0);苏氨酸(-0.4);脯氨酸(-0.5±1);丙氨酸(-0.5);组氨酸(-0.5);半胱氨酸(-1.0);蛋氨酸(-1.3);缬氨酸(-1.5);亮氨酸(-1.8);异亮氨酸(-1.8);酪氨酸(-2.3);苯丙氨酸(-2.5);色氨酸(-3.4)。应当理解,氨基酸可以取代具有相似亲水性值的另一种氨基酸,并且仍然获得生物学上等同的,特别是免疫学上等同的蛋白质。在这种变化中,优选亲水性值在±2以内的氨基酸的取代,特别优选±1以内的氨基酸取代,更优选±0.5以内的氨基酸取代。
如上所述,氨基酸取代因此通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性,例如,它们的疏水性,亲水性,电荷,大小等。考虑到各种前述特征的示例性取代是本领域技术人员公知的,包括:精氨酸和赖氨酸;谷氨酸和天冬氨酸;丝氨酸和苏氨酸;谷氨酰胺和天冬酰胺;和缬氨酸,亮氨酸和异亮氨酸。
可以基于残基的极性,电荷,溶解度,疏水性,亲水性和/或两亲性质的相似性进一步进行氨基酸取代。例如,带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸;带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸;具有相似亲水性值的不带电荷的极性头部基团的氨基酸包括亮氨酸,异亮氨酸和缬氨酸;甘氨酸和丙氨酸;天冬酰胺和谷氨酰胺;和丝氨酸,苏氨酸,苯丙氨酸和酪氨酸。可代表保守变化的其他氨基酸组包括:(1)Ala,Pro,Gly,Glu,Asp,Gln,Asn,Ser,Thr;(2)Cys,Ser,Tyr,Thr;(3)Val,Ile,Leu,Met,Ala,Phe;(4)Lys,Arg,His;(5)Phe,Tyr,Trp,His。变体还可以或可选地包含非保守变化。在一个优选的实施方式中,变体多肽与天然序列的不同之处在于取代,缺失或添加五个或更少的氨基酸。变体也可(或备选地)通过例如缺失或添加对多肽的免疫原性,二级结构和亲水性质具有最小影响的氨基酸进行修饰。
当比较多核苷酸和多肽序列时,如果两个序列中的核苷酸或氨基酸序列在最大对应性比对时是相同的,则称两个序列是“相同的”,如下所述。通常通过在比较窗口上比较序列来鉴定和比较序列相似性的局部区域来进行两个序列之间的比较。如本文所用的“比较窗口”是指至少约20个连续位置的片段,通常为30~约75、40~约50,其中在两个序列最佳对齐后序列可与连续位置的相同数量的参考序列进行比较。
用于比较的序列的最佳比对可以使用Lasergene生物信息学软件套件(DNASTAR,Inc.,Madison,WI)中的Megalign程序,使用默认参数进行。该程序体现了以下参考文献中描述的几种比对方案:Dayhoff,M.O.(1978)A model of evolutionary change inproteins–Matrices for detecting distant relationships.In Dayhoff,M.O.(ed.)Atlas of Protein Sequence and Structure,National Biomedical ResearchFoundation,Washington DC Vol.5,Suppl.3,pp.345-358;Hein J.(1990)UnifiedApproach to Alignment and Phylogenes pp.626-645Methods in Enzymology vol.183,Academic Press,Inc.,San Diego,CA;Higgins,D.G.and Sharp,P.M.(1989)CABIOS 5:151-153;Myers,E.W.and Muller W.(1988)CABIOS 4:11-17;Robinson,E.D.(1971)Comb.Theor 11:105;Santou,N.Nes,M.(1987)Mol.Biol.Evol.4:406-425;Sneath,P.H.A.and Sokal,R.R.(1973)Numerical Taxonomy–the Principles and Practice ofNumerical Taxonomy,Freeman Press,San Francisco,CA;Wilbur,W.J.and Lipman,D.J.(1983)Proc.Natl.Acad.,Sci.USA 80:726-730。
或者,可以如下进行用于比较的序列的最佳比对:由Smith and Waterman(1981)Add.APL.Math 2:482的局部同一性算法,由Needleman and Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443的同一性比对算法,通过寻找Pearson and Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:2444的相似性方法,通过这些算法的计算机化实施(威斯康星遗传学软件包中的GAP,BESTFIT,BLAST,FASTA和TFASTA,Genetics Computer Group(GCG),575Science Dr.,Madison,WI),或通过检查。
适用于确定序列同一性百分比和序列相似性的算法的一个优选实例是BLAST和BLAST 2.0算法,其分别在Altschul et al.(1977)Nucl.Acids Res.25:3389-3402和Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215:403-410中描述。可以使用BLAST和BLAST 2.0,例如使用本文所述的参数,以确定本发明的多核苷酸和多肽的序列同一性百分比。用于进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心公开获得。
“同源性”是指在比对序列并在必要时引入缺口以实现最大百分比同源性后,多核苷酸或多肽序列变体中的残基与非变体序列相同的百分比。在特定实施方式中,多核苷酸和多肽变体与本文所述的多核苷酸或多肽具有至少70%,至少75%,至少80%,至少90%,至少95%,至少98%或至少99%的多核苷酸或多肽同源性。
如在本说明书和所附权利要求中所使用的,单数形式“a”,“an”和“the”包括复数指代,除非内容另有明确说明。
【实施例】
【实施例1:制备本发明组合物的方法】
用于本公开的示例性12,000+室PDMS基体的模具是使用深反应离子蚀刻(DRIE)方法的硅主蚀刻。将其在真空干燥器中用三甲基氯硅烷(Sigma-Aldrich)蒸气预处理30分钟以促进PDMS释放。然后将晶片在丙烯酸模具中压缩,以形成PDMS基体的形状。将PDMS预聚物弹性体基料和固化剂Sylgard 184(Dow Corning)与0.1%(v/m)Triton X-100(Sigma-Aldrich)完全混合(A和B部分比例为10:1)在真空干燥器中30分钟以除去气泡。将表面活性剂(Triton X-100)加入到PDMS中以使PDMS的长期疏水性回收最小化。使用注射器将PDMS注入模具中并且模具固化在80℃的烘箱中烘烤1.5小时。从模具中取出PDMS后得到的芯片为25mm(宽度)×55mm(长度),高度为4.75mm。
裂解组合物:通过在80℃下恒定混合约3小时,在去离子水中制备3%(v/v)聚乙烯醇(PVA)(Mw 146,000~186,000,99+%水解,Sigma-Aldrich)溶液。一旦溶液变得完全透明,使3%(v/v)PVA溶液冷却。将3%(v/v)溶液以300×g离心10分钟以除去任何颗粒。在开始涂覆过程之前,将0.2%(v/v)Triton X-100加入到PVA溶液中并在搅拌棒中以200rpm混合30分钟。
接头组合物:最初通过在甲醇中超声处理15分钟来清洁PDMS室。微室用压缩空气干燥并用氧等离子体处理(30秒,40W,4cc/min,用Glow Research生产的AutoGlow 200)。然后在室温下用2%APTES的丙酮溶液将微室涂覆10分钟。用丙酮严格洗涤微室,然后在80℃下烘烤30分钟。随后使表面氨基与交联剂戊二醛(1%在dH 2O,0.1%NaOH,pH 9.2中)反应,在室温下温育10分钟。对微室进行超声处理(约10秒)以去除所有气穴。样品用去离子水冲洗室,室表面用压缩空气完全干燥(60秒)。
涂敷组合物:通过向制备的Triton X-100/PVA溶液中加入0.1%戊二醛和10%盐酸制备PVA涂料溶液。将溶液以100rpm混合30秒并缓慢移液到微室上以避免气泡。然后用2000rpm的涂敷溶液旋涂微室4分钟。然后将样品在80℃下烘烤1小时并用干燥剂真空密封以除去残留的水分。根据细胞内蛋白质捕获的需要,从真空中取出微室。
细胞装载和室准备:从真空中取出室并用3%BSA封闭30分钟。将靶细胞用CellTrace Violet染色剂染色并加载到涂覆的微室上,并用包含多种捕获剂的重复图案的表面封闭。将细胞温育2小时。除去包含多种捕获剂的重复图案的表面以进行可视化。
【实施例2:多学科平台和使用方法】
【方案A:细胞内双带单细胞/单珠捕获方案】
微室阵列芯片的制造:用于12,000+微室阵列PDMS的模具是使用深反应离子蚀刻(DRIE)方法蚀刻的硅母版。将其在真空干燥器中用三甲基氯硅烷(Sigma-Aldrich)蒸气预处理30分钟以促进PDMS释放。然后将晶片在丙烯酸模具中压缩,以形成PDMS芯片的形状。将PDMS预聚物弹性体基料和固化剂Sylgard 184(Dow Corning)完全混合(部分A和B以10:1的比例)并置于真空干燥器中30分钟以除去气泡。使用注射器将PDMS注入模具中,并将模具在烘箱中在80℃下固化1.5小时。从模具中取出PDMS后得到的芯片为25mm(宽度)×55mm(长度),高度为4.75mm。
水凝胶涂层:用氧等离子体处理PDMS芯片,在10%(w/v)二苯甲酮水溶液中浸泡1分钟,用甲醇冲洗,并用压缩空气干燥。将PDMS微室用9%PVA-SbQ水溶液覆盖,并以2000rpm旋涂4分钟以形成均匀层。然后用光掩模掩蔽芯片并暴露于深紫外光下1小时。
抗体沉积:通过在1%(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(APTES)中在水中温育30分钟来使PDMS微室表面官能化。然后用水冲洗PDMS微室并使用压缩空气干燥,接着在1%戊二醛水溶液中温育10分钟。然后用水冲洗PDMS微室并使用压缩空气干燥,接着在PBS中的1mg/ml蛋白G中温育30分钟。然后用PBS漂洗PDMS微室并使用压缩空气干燥,接着在细胞捕获抗体中温育30分钟。然后用PBS漂洗PDMS微室并使用压缩空气干燥。
链霉亲和素沉积:将PBS中的丙烯酰胺-链霉亲和素溶液(1mg/ml)旋涂在PDMS上,以2000rpm旋转4分钟。然后在暴露于深紫外光下1小时后,通过光掩模将该涂层以区域特异性方式交联到PVA-SbQ上。
珠制备和装载:将珠用PBS洗涤2次,然后以适当的浓度重悬于PBS中。然后将珠溶液移液到微室上,并将珠温育30分钟以允许结合。温育后,用PBS漂洗微室PDMS以除去未结合的珠。
裂解缓冲液加载到水凝胶:为了将裂解缓冲液加载到水凝胶中,将涂覆的微室在3%SDS中浸泡1小时。然后用水冲洗微室PDMS并用压缩空气干燥。
细胞制备和上样:将靶细胞用CellTrace Violet染色并重悬于适当浓度的RNA酶抑制剂溶液(50%PBS,3%Ficoll PM-400,10mM EDTA,100mM Tris pH 7.5,25mM DTT)中,然后加载涂在微型室上。使细胞结合,然后用RNA酶抑制剂溶液冲洗以除去未结合的细胞。
检测后珠去除:温育期结束后,从微室PDMS中取出抗体载玻片。将载玻片和PDMS用PBS+0.1%Triton X-100冲洗10次,将其收集在50mL falcon管中。然后将微室PDMS置于相同的falcon管中并用PBS-T QC至50mL。将该管在室温下旋转10分钟,然后以1000×g离心5分钟以沉淀珠。离心后,吸出过量的PBS-T,将微室PDMS用10mL PBS-T冲洗到相同的falcon管中,然后丢弃。将falcon管再次以1000×g旋转10分钟以使珠沉淀。离心后,吸出过量的PBS-T,留下约5mL。将沉淀重悬于该相同的5mL中并通过100μM过滤器。然后将珠以1000×g沉淀2分钟并重悬于1mL 6×SSC中。此时,可以加工珠用于cDNA合成和NGS。
【方案B:具有尺寸排阻单珠捕获的细胞内可UV交联的PVA单细胞捕获】
微室阵列芯片的制造:用于12,000+微室阵列PDMS的模具是使用深反应离子蚀刻(DRIE)方法蚀刻的硅母版。将其在真空干燥器中用三甲基氯硅烷(Sigma-Aldrich)蒸气预处理30分钟以促进PDMS释放。然后将晶片在丙烯酸模具中压缩,以形成PDMS芯片的形状。将PDMS预聚物弹性体基料和固化剂Sylgard 184(Dow Corning)完全混合(部分A和B以10:1的比例)并置于真空干燥器中30分钟以除去气泡。使用注射器将PDMS注入模具中,并将模具在烘箱中在80℃下固化1.5小时。从模具中取出PDMS后得到的芯片为25mm(宽度)×55mm(长度),高度为4.75mm。
水凝胶涂层:用氧等离子体处理PDMS芯片,在10%(w/v)二苯甲酮水溶液中浸泡1分钟,用甲醇冲洗,并用压缩空气干燥。将PDMS微室用9%PVA-SbQ水溶液覆盖,并以2000rpm旋涂4分钟以形成均匀层。然后用光掩模掩蔽芯片并暴露于深紫外光下1小时。
抗体沉积:通过在1%(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(APTES)中在水中温育30分钟来使PDMS微室表面官能化。然后用水冲洗PDMS微室并使用压缩空气干燥,接着在1%戊二醛水溶液中温育10分钟。然后用水冲洗PDMS微室并使用压缩空气干燥,接着在PBS中的1mg/ml蛋白G中温育30分钟。然后用PBS漂洗PDMS微室并使用压缩空气干燥,接着在细胞捕获抗体中温育30分钟。然后用PBS漂洗PDMS微室并使用压缩空气干燥。
珠制备和装载:用PBS洗涤珠2次,然后以适当的浓度重悬于PBS中。然后将珠溶液移液到微室上,并将单个珠落入尺寸排阻孔中。温育后,用PBS漂洗微室PDMS以除去残留的珠。
裂解缓冲液加载到水凝胶:为了将裂解缓冲液加载到水凝胶中,将涂覆的微室在3%SDS中浸泡1小时。然后用dH2O冲洗微室PDMS并用压缩空气干燥。
细胞制备和上样:将靶细胞用CellTrace Violet染色并重悬于适当浓度的RNA酶抑制剂溶液(50%PBS,3%Ficoll PM-400,10mM EDTA,100mM Tris pH 7.5,25mM DTT)中,然后加载到涂层微室。使细胞结合,然后用RNA酶抑制剂溶液冲洗以除去未结合的细胞。
检测后珠去除:温育期结束后,从微室PDMS中取出抗体载玻片。将载玻片和PDMS用PBS+0.1%Triton X-100冲洗10次,将其收集在50mL falcon管中。然后将微室PDMS置于相同的falcon管中并用PBS-T QC至50mL。将该管在室温下旋转10分钟,然后以1000×g离心5分钟以沉淀珠。离心后,吸出过量的PBS-T,将微室PDMS用10mL PBS-T冲洗到相同的falcon管中,然后丢弃。将falcon管再次以1000×g旋转10分钟以使珠沉淀。离心后,吸出过量的PBS-T,留下约5mL。将沉淀重悬于该5mL中,并通过100μM过滤器。然后将珠以1000×g沉淀2分钟并重悬于1mL 6×SSC中。此时,可以加工珠用于cDNA合成和NGS。
【方案C:分泌蛋白质组学PLL-g-PEG-生物素单细胞捕获】
微室阵列芯片的制造:用于12,000+微室阵列PDMS的模具是使用深反应离子蚀刻(DRIE)方法蚀刻的硅母版。将其在真空干燥器中用三甲基氯硅烷(Sigma-Aldrich)蒸气预处理30分钟以促进PDMS释放。然后将晶片在丙烯酸模具中压缩,以形成PDMS芯片的形状。将PDMS预聚物弹性体基料和固化剂Sylgard 184(Dow Corning)完全混合(部分A和B以10:1的比例)并置于真空干燥器中30分钟以除去气泡。使用注射器将PDMS注入模具中,并将模具在烘箱中在80℃下固化1.5小时。从模具中取出PDMS后得到的芯片为25mm(宽度)×55mm(长度),高度为4.75mm。
PLL-g-PEG-生物素钝化:用70%乙醇洗涤PDMS并在空气流下干燥。PDMS微室表面通过暴露于氧等离子体而官能化。然后将PDMS浸泡在11.5mg/ml N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和19.2mg/ml N-羟基磺基琥珀酰亚胺钠盐(Sulfo-NHS)的0.05M MES+0.5M NaCl缓冲液的混合物中15分钟,用PBS和水冲洗,并在10mM HEPES缓冲液中的0.5mg/ml PLL(20)-g[3.5]-PEG(2):聚-L-赖氨酸-g-聚(乙二醇)-生物素(PLL-g-PEG-生物素)的溶液中温育3小时或过夜。
UV光刻:钝化的PDMS表面覆盖有具有所需微图案的光掩模,并暴露于深紫外光10分钟。
抗体沉积:将PDMS芯片在1%PluronicF-127溶液中温育30分钟。然后用水冲洗PDMS微室并使用压缩空气干燥,接着在114μg/ml中性亲和素溶液中温育30分钟。然后用水冲洗PDMS微室并使用压缩空气干燥,接着在1mg/ml蛋白G-生物素中温育30分钟。然后用水冲洗PDMS微室并使用压缩空气干燥,接着在细胞捕获抗体中温育30分钟。然后用水冲洗PDMS微室并使用压缩空气干燥。
细胞制备和上样:将靶细胞用CellTrace Violet染色剂染色,并以适当的浓度重悬于PBS中,然后加载到涂覆的微室上。使细胞结合,然后用PBS漂洗以除去未结合的细胞。
【以参考方式加入】
除非明确排除或以其他方式限制,否则本文引用的每篇文献,包括任何交叉引用的或相关的专利或申请,均通过引用整体并入本文。任何文件的引用并不是承认它是关于本文公开或要求保护的任何发明的现有技术或单独的,或与任何其他参考文献的任何组合,教导,暗示或公开任何这样的发明。此外,如果本文件中术语的任何含义或定义与通过引用并入的文件中的相同术语的任何含义或定义相冲突,则以本文件中赋予该术语的含义或定义为准。
【其他实施例】
虽然已经说明和描述了本公开的特定实施例,但是在不脱离本公开的精神和范围的情况下可以进行各种其他改变和修饰。所附权利要求的范围包括在本公开的范围内的所有这样的改变和修饰。
Claims (38)
1.用于对单细胞的一种或多种细胞内靶进行多重分析的非诊断方法,包括:
(a)在足以裂解单细胞的条件下使生物样品的单细胞与装置接触,以在基体的多个室的每个室内产生单细胞裂解物,
其中所述装置包括:
表面,其包含与其可操作地连接的多种捕获剂,其中
每种捕获剂特异性结合不同的细胞内靶,并且
所述多种捕获剂形成重复图案;
基体,其包括多个室,其中
所述基体与所述表面连接而同时可从所述表面释放,并且
所述多个室中的每个室包括所述表面的所述多种捕获剂的重复图案的至少一个重复单元,并且
其中在所述多个室的每个室内,所述单细胞裂解物与所述表面流体连通;
(b)将所述多个室的每个室内的单细胞裂解物温育足够的时间以允许多种捕获剂中的至少一种捕获剂特异性结合至少一种细胞内靶以产生捕获剂:靶复合物;和
(c)使至少一种捕获剂:靶复合物可视化以在多重分析中鉴定单细胞的一种或多种细胞内靶。
2.权利要求1的方法,其中所述可视化包括:
使至少一种捕获剂:靶复合物与标记的第二抗体接触,所述第二抗体结合所述捕获剂,及检测所述标记的第二抗体,或
使第一捕获剂:靶复合物与结合第一捕获剂的第一标记的第二抗体接触,
使第二捕获剂:靶复合物与结合第二捕获剂的第二标记的第二抗体接触,和
检测第一标记的第二抗体和第二标记的第二抗体,其中第一标记的第二抗体和第二标记的第二抗体各自包含不同的标记。
3.权利要求2的方法,其中所述标记的第二抗体包含荧光、金或银标记。
4.权利要求2的方法,其中所述方法还包括定量所述至少一种细胞内靶。
5.权利要求4的方法,其中所述定量包括测量所述标记的第二抗体的强度和/或密度。
6.权利要求4的方法,其中所述细胞内靶是磷蛋白。
7.权利要求1的方法,
其中在所述多个室的每个室内,所述生物样品与珠流体连通,并且
其中所述珠包含独立于与所述表面可操作地连接的多种捕获剂的特异性结合至少一种细胞内靶的多种捕获剂,以产生捕获剂:靶复合物;和
进行下列中的至少一个:
(i)对至少一种捕获剂:靶复合物的靶进行测序,以在多重分析中鉴定单细胞的一种或多种细胞内靶,或
(ii)使至少一种捕获剂:靶复合物可视化,以在多重分析中鉴定单细胞的一种或多种细胞内靶。
8.权利要求7的方法,
其中所述珠捕获剂包含编码条形码的核酸序列,
其中所述条形码包含编码条形码的序列和编码条形码柄的序列,并且
其中所述方法包括通过合成cDNA条形码序列来对所述条形码进行测序。
9.权利要求7的方法,其中所述细胞内靶是核酸序列。
10.权利要求9的方法,其中所述核酸序列是mRNA序列。
11.权利要求8的方法,其中合成条形码包括在足以进行杂交和cDNA合成的条件下,使编码条形码柄的序列,包含与编码条形码柄的序列的一部分互补的序列的引物和聚合酶接触,其中接触产生cDNA条形码序列。
12.权利要求8的方法,其中所述测序在所述室中进行。
13.权利要求11的方法,其中编码条形码的核酸序列还包含下列中的一种或多种:编码PCR柄的序列,编码唯一分子标识符UMI的序列,编码模板转换寡核苷酸TSO柄的序列和编码TSO杂交位点的序列。
14.权利要求11的方法,其中编码条形码的核酸序列从5'到3'还包含:编码PCR柄的序列,编码条形码的序列,编码条形码柄的序列,编码唯一分子标识符UMI的序列,编码模板转换寡核苷酸TSO柄的序列和编码TSO杂交位点的序列。
15.权利要求8的方法,其中
每个珠包含唯一的条形码,
每个室的每个珠包括唯一的条形码,或
所述多个室中的每个珠包括唯一的条形码。
16.权利要求8的方法,其中编码条形码的序列包含12个核苷酸,或由12个核苷酸组成。
17.权利要求8的方法,还包括在足以使TSO与编码条形码的核酸的一部分杂交的条件下使编码珠条形码的核酸序列和TSO接触,以产生核酸/TSO双链体。
18.权利要求1的方法,其中所述表面包含玻璃。
19.权利要求1的方法,其中所述基体包括聚二甲基硅氧烷PDMS。
20.装置在制造用于对单细胞的一种或多种细胞内靶进行多重分析的产品中的用途,
其中所述装置包括:
表面,其包含与其可操作地连接的多种捕获剂,其中
每种捕获剂特异性结合不同的细胞内靶,并且
所述多种捕获剂形成重复图案;
基体,其包括多个室,其中
所述基体与所述表面连接而同时可从所述表面释放,并且
所述多个室中的每个室包括所述表面的所述多种捕获剂的重复图案的至少一个重复单元,
其中所述多重分析通过包括下列步骤的方法实施:
(a)在足以裂解单细胞的条件下使生物样品的单细胞与装置接触,以在基体的多个室的每个室内产生单细胞裂解物,其中在所述多个室的每个室内,所述单细胞裂解物与所述表面流体连通;
(b)将所述多个室的每个室内的单细胞裂解物温育足够的时间以允许多种捕获剂中的至少一种捕获剂特异性结合至少一种细胞内靶以产生捕获剂:靶复合物;和
(c)使至少一种捕获剂:靶复合物可视化以在多重分析中鉴定单细胞的一种或多种细胞内靶。
21.权利要求20的用途,其中所述可视化包括:
使至少一种捕获剂:靶复合物与标记的第二抗体接触,所述第二抗体结合所述捕获剂,及检测所述标记的第二抗体,或
使第一捕获剂:靶复合物与结合第一捕获剂的第一标记的第二抗体接触,
使第二捕获剂:靶复合物与结合第二捕获剂的第二标记的第二抗体接触,和
检测第一标记的第二抗体和第二标记的第二抗体,其中第一标记的第二抗体和第二标记的第二抗体各自包含不同的标记。
22.权利要求21的用途,其中所述标记的第二抗体包含荧光、金或银标记。
23.权利要求21的用途,其中所述方法还包括定量所述至少一种细胞内靶。
24.权利要求23的用途,其中所述定量包括测量所述标记的第二抗体的强度和/或密度。
25.权利要求23的用途,其中所述细胞内靶是磷蛋白。
26.权利要求20的用途,
其中在所述多个室的每个室内,所述生物样品与珠流体连通,并且
其中所述珠包含独立于与所述表面可操作地连接的多种捕获剂的特异性结合至少一种细胞内靶的多种捕获剂,以产生捕获剂:靶复合物;和
进行下列中的至少一个:
(i)对至少一种捕获剂:靶复合物的靶进行测序,以在多重分析中鉴定单细胞的一种或多种细胞内靶,或
(ii)使至少一种捕获剂:靶复合物可视化,以在多重分析中鉴定单细胞的一种或多种细胞内靶。
27.权利要求26的用途,
其中所述珠捕获剂包含编码条形码的核酸序列,
其中所述条形码包含编码条形码的序列和编码条形码柄的序列,并且
其中所述方法包括通过合成cDNA条形码序列来对所述条形码进行测序。
28.权利要求26的用途,其中所述细胞内靶是核酸序列。
29.权利要求28的用途,其中所述核酸序列是mRNA序列。
30.权利要求27的用途,其中合成条形码包括在足以进行杂交和cDNA合成的条件下,使编码条形码柄的序列,包含与编码条形码柄的序列的一部分互补的序列的引物和聚合酶接触,其中接触产生cDNA条形码序列。
31.权利要求27的用途,其中所述测序在所述室中进行。
32.权利要求30的用途,其中编码条形码的核酸序列还包含下列中的一种或多种:编码PCR柄的序列,编码唯一分子标识符UMI的序列,编码模板转换寡核苷酸TSO柄的序列和编码TSO杂交位点的序列。
33.权利要求30的用途,其中编码条形码的核酸序列从5'到3'还包含:编码PCR柄的序列,编码条形码的序列,编码条形码柄的序列,编码唯一分子标识符UMI的序列,编码模板转换寡核苷酸TSO柄的序列和编码TSO杂交位点的序列。
34.权利要求27的用途,其中
每个珠包含唯一的条形码,
每个室的每个珠包括唯一的条形码,或
所述多个室中的每个珠包括唯一的条形码。
35.权利要求27的用途,其中编码条形码的序列包含12个核苷酸,或由12个核苷酸组成。
36.权利要求27的用途,其中所述方法还包括在足以使TSO与编码条形码的核酸的一部分杂交的条件下使编码珠条形码的核酸序列和TSO接触,以产生核酸/TSO双链体。
37.权利要求20的用途,其中所述表面包含玻璃。
38.权利要求20的用途,其中所述基体包括聚二甲基硅氧烷PDMS。
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