JP2011521644A - 細胞の空間的分離およびスクリーニングのための組成物および方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、細胞によってコードされる生体分子の表現型が、基質特異性および反応速度効率が含まれる多数のパラメータに基づいて評価される、個々のマイクロリアクターにおいて変種細胞のライブラリから特定のメンバーを単離するための方法を提供する。
酵素は、工業、農業、医学、および科学研究における触媒としてますます用いられている。その基質特異性、化学選択性、および環境との適合性により、酵素は、光学異性体として純粋な薬剤の合成、織物の加工、食品加工、医学的診断および治療、生体内変化、ならびにバイオレメディエーションなどの応用にとって長所を提供する。酵素は、高分子量ポリマーの改変に関して従来の化学プロセスより優れていることが証明されている。
その基質特異性、化学選択性、および環境との適合性により、酵素は、医学診断および治療において有用な光学異性体として純粋な薬剤の合成などの応用にとって長所を提供する。実際に、そのような酵素は、抗腫瘍ワクチン(たとえば、GM3、黒色腫関連糖スフィンゴリピッドを標的とする)、抗寄生虫ワクチン(たとえば、マラリアのグリコシルホスファチジルイノシトール(GPIアンカー)を標的とする)、抗菌ワクチン(たとえば、莢膜多糖類抗原インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)血清型b(HIB)を標的とする)、および他の抗菌剤が含まれる、多様な医学応用を有するオリゴ糖および複合糖質の合成において利用されている。例示的な抗腫瘍ワクチン、抗寄生虫ワクチン、抗菌ワクチン、および抗菌剤をそれぞれ、図5A〜5Dに示す。グリコシル化生体分子を用いることは、構造および機能的関係に関する詳しい知識を必要とするのみならず、大規模に臨床で使用するために定義された構造に対するアクセスを必要とする。
酵素工学操作および触媒の開発発明のための定向進化の概略図を図7に示す。本発明は、変異誘発および選択の反復ラウンドによって、既存の酵素足場から新規活性をうまく生成する能力を提供する。以下に詳細に記述されるように、さらなる選択またはスクリーニングのために所望の生体分子をランダムに変異誘発するための多くの技術が存在する。同様に選択およびスクリーニングのための多くの適した方法が存在する。当業者は、生体分子、たとえば関心対象タンパク質にとって利用可能な構造情報の量に基づいて、特異的技術を選ぶことができることを理解するであろう。個々の技術を選択する場合、ハイスループットを維持しながら遺伝子型と表現型との間の連鎖を維持することが非常に重要である。
本明細書において記述される本発明は、基質特異性および反応速度効率が含まれる多数のパラメータに基づいて細胞によってコードされる生体分子の表現型を評価する自動化可能なハイスループット法を提供する。この一般的な戦略によって、本来のまたは最小に変化させた基質を用いて多様な酵素のエクスビボスクリーニングを行うことができる。関心対象酵素は、細胞機構によって製造される。または、本発明によって、サイトカイン、ケモカイン、抗体、および代謝物が含まれる他の分泌された生体分子の所望の表現型に関する溶液中でのスクリーニングも行うことができる。
アミノ酸変化をコードする変異は、新規酵素活性を生成するために有用である。遺伝子は当業者に公知の任意の方法を用いて、たとえば所定の生物のゲノムライブラリからクローンを単離することによって、ゲノムデオキシリボ核酸(DNA)もしくはメッセンジャーリボ核酸(mRNA)源からの、または非培養環境微生物のDNAの不均一な混合物からの発現クローンのライブラリからのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅によって、得られる(米国特許第5,958,672号)。酵素ならびに他の非触媒タンパク質およびペプチドをコードする遺伝子を変異させるために、当業者に周知である多数の方法が存在する。これらの方法には、合理的(たとえば、部位特異的変異誘発によって点突然変異体または点突然変異体の群を作製する)、および推計学的(たとえば、ランダム変異誘発、コンビナトリアル変異誘発および組み換え)技術の双方が含まれる。タンパク質デザインオートメーションと呼ばれる合理的デザインは、望ましい折り畳みを達成するために可能性があるタンパク質の配列を客観的に予測するためにアルゴリズムを用いる。
本発明によって記述される方法によって、生体分子を機能に関してアッセイすることができる。1つの局面において、所望の生物活性に関するスクリーニングは、アプタマー、すなわち特異的標的分子に結合するオリゴ核酸またはペプチド分子を用いて行われる。別の局面において、所望の生物活性に関するスクリーニングは、マイクロデバイスにおけるマイクロウェルにおいて、蛍光発生基質による液相FRETに基づくアッセイを用いて行われる。別の局面において、生物活性は、基質/産物が抗体を用いて接触ガラス表面において捕捉される、固相支持蛍光(またはFRET)によってアッセイされる。好ましくは、基質の1つまたは複数の蛍光である。さらに別の局面において、所望の生物活性に関するスクリーニングは、1つまたは複数の基質が化学または酵素反応を用いて蛍光体によってさらに誘導体化される(すなわち、「クリック化学」、ソルターゼタグ付け、BirAビオチニル化等)固相支持親和性捕捉によって行われる。または、生体分子の機能は、双方の基質が親和性タグを有し、産物がサンドイッチELISAフォーマットにおいて検出される、固相支持抗体に基づく蛍光読み出しを用いてアッセイされる。好ましくは、二次抗体は蛍光体にコンジュゲートされる。
高等真核生物におけるO-連結グリコシル化の最も量の多い型は、「ムチン型」として知られる(Hang H and Bertozzi C, 2005 Bioorg Med Chem, 13(17):5021-5034)。ムチン生合成における第一段階は、Tn-抗原を形成するために、セリンまたはトレオニン側鎖のヒドロキシル基に対するα-N-アセチルガラクトサミン(GalNAc)付加である;この転移は、ポリペプチドN-アセチル-α-ガラクトサミニルトランスフェラーゼ(ppGalNAcTアーゼ)によって成就される(Ten Hagen et al., 2003 Glycobiol, 13(1): 1R-16R)。Tn-抗原は、多様なムチン型構造を産生するために下流のGTアーゼによってさらに仕上げされる(図2)。今日まで、ムチン型グリコシル化を含有する150を超える糖タンパク質が同定されており、その多くが疾患の進行に関係している(Hang 2005)。そのような1つの例は、癌上皮細胞におけるその発現の増加により腫瘍抗原として同定されている糖タンパク質であるMUC1であり、これは癌細胞の接着および腫瘍の浸潤の双方に関与する(Yu et al., 2007 J Biol Chem, 282(1):773-781;Kohlgraf et al., 2003 Cancer Res, 63(16):5011-5020)。癌関連ムチンは非常に免疫原性であり、免疫療法の標的として用いられる可能性がある(Hanisch and Ninkovic, 2006 Curr Prot Pep Sci, 7:307;Tarp and Clausen, In Press Biochem Biophys Acta)。
炭水化物ワクチンを開発するためには、大量の均一な糖ペプチドおよび糖タンパク質に対するアクセスが必要である(Grogan et al., 2002 Annu Rev Biochem, 71:593-634)。しかし、本来のまたは組み換え型糖タンパク質を単離しても、その各々が異なる生物学的特性を表示しうる限られた量の不均一な糖型を生じるに過ぎない(Freire et al., 2006 Glycobiol, 16(11):1150)。複合糖質の化学合成は、適切に保護されたグリコシルアミノ酸構築ブロックを用いる固相ペプチド合成(SPPS)によって均一な基質を提供する(Marcaurelle and Bertozzi, 2002 Glycobiol, 12(6):69R-77R)。本来の化学ライゲーションおよび発現されたタンパク質のライゲーションも同様に、より大きいペプチドおよびタンパク質さえにおいて糖を部位特異的に配置するために用いられている(Muir TW, 2003 Annu Rev Biochem, 72:249-289)。本明細書において記述される本発明の前に、これらの合成法を成就するにはなおも特別に訓練された化学者を必要とした。本発明は、調製的規模での複合糖質の効率的な合成を行うことができる酵素の生成を提供し、これは治療目的のためのそれらの試験において大きく役立つ。
癌細胞の表面上で過剰発現される糖タンパク質および糖脂質が同定されたことにより、免疫療法の標的としてそれらが研究されるようになった(Slovin et al., 2005 Immunol Cell Biol, 83(4):418)。腫瘍関連炭水化物抗原は典型的に、低レベルで様々な糖型で発現されることから、炭水化物に基づく抗癌ワクチンを開発するために別個の複合糖質の十分量を単離することは難しい。本明細書において記述される本発明の前に、炭水化物を化学合成するための一般的な方法は、自動アセンブリの出現によって改善されているが(Plante et al., 2003 In: Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry, Vol. 58, pp 35-54)、立体化学制御およびドナー/アクセプター適合性にとって必須の十分な保護基の操作を成就するためにはなおも専門家を必要とする。複合糖質の化学合成のさらなる短所には、臨床での必要条件を満たすために大規模の量を生成することが難しいこと、および合成された材料を精製することが難しいことが含まれる。
生物触媒は、バルク化学物質、薬剤、および食品成分の合成にとって重要なツールである。しかし、おそらく酵素の安定性、触媒特性、すなわち代謝回転速度、および基質範囲の制限により、そのような応用の数および多様性は限られている。生物触媒のツールキットにアクセスできることは、産業界が現在の制限を克服するために役立ち、一段階酵素的変換から代謝経路の工学操作による多段階微生物合成まで多くの新規応用の実現を可能にする。
抗生物質抵抗性細菌感染症の発生率の増加は、腸球菌感染患者を処置するために改善された構築物が必要であることを示している。多くのマクロライドおよびポリケチド抗生物質が、細胞標的の認識に関与して、それによって活性にとって必須である炭水化物を含有する(Walsh C, 2003 Antibiotics: Actions, origins, resistance. 1st ed.; American Society for Microbiology Press: Washington, D.C.)。糖置換基におけるおよび糖置換基周囲でのバンコマイシンおよびテイコプラニンなどの既存の糖ペプチド抗生物質の改変によって、オリタバンシンが含まれる新規処置の臨床試験に至った(Dong et al., 2002 J Am Chem Soc, 124:9064-9065)。多様な炭水化物が天然物アグリコン、タンパク質、および脂質に付着するための触媒としてGTアーゼを適合させることは、治療物質として試験するための新規材料を提供するであろう。本発明によって提供される方法は、広範囲の基質を効率的にグリコシル化することができる酵素を同定して、複合糖質の迅速かつ大規模産生に関して化学合成と競合することができる触媒の生成へと移行する。
以下の実験は、(1)関心対象酵素を分泌する酵母細胞のライブラリを空間的に分離するための技術の例証、および(2)技術の感度を決定するために不活性な変種からの活性なプロテアーゼを発現する細胞の濃縮からなる。簡単に説明すると、関心対象タンパク質を分泌することができる酵母細胞のライブラリを、各ウェルが平均して、1つのライブラリメンバーを含有するように、直径50ミクロンのマイクロウェルにローディングする。デバイスにおける各区画を酵素基質によって並行して調べる;酵素の代謝回転が成功すれば蛍光シグナルを生じる。技術の実現可能性は、プロテアーゼで証明されている。
本発明は、細胞によって分泌される生体分子をスクリーニングする段階を提供する。1つの局面において、細胞は原核細胞である。または、細胞は真核細胞である。好ましくは真核細胞は酵母細胞である。例示的な酵母細胞には、ピキア・パストリスが含まれる。プラスミドコードタンパク質を分泌する酵母細胞は、本発明の方法による進化のために酵素を発現させるために用いられる。酵母などの真核細胞発現宿主は、それらが妥当なタンパク質フォールディング、分泌、および翻訳後改変にとって必要な機構を含有することから、ppGalNAcTアーゼが含まれる多様な酵素の進化に関して細菌発現に対して長所を提供する。酵母はまた、各々のウェルが直径50μmである、ウェルあたり細胞1個の比率でマイクロデバイスを用いる空間的分離にとって理想的な大きさ(直径およそ5〜10μm)である。加えて、酵母は、急速に分裂して、おそらく数時間以内に1つの細胞に由来するライブラリメンバーの遺伝子タイピングを行うことができる。
考案した酵素選択戦略の実現可能性を、最初にタバコエッチウイルス(TEV)からの3C-型システインプロテアーゼについて試験する(Malcolm B, 1995 Protein Sci, 4(8): 1439-1445)。残基151位でのTEVにおける触媒システインがアラニンに変異すると、触媒的に不活性な変種が得られる(Phan et al., 2002 J Biol Chem, 277(52):50564-50572)。TEVプロテアーゼの本来のおよび変異体種に関する遺伝子を含有するベクターを様々な比率(1:10,000、1:1000、1:100、1:10)で混合して、これを用いて、触媒的に活性な種を濃縮するためのモデルライブラリを作製する。ベクター混合物によって形質転換された酵母細胞を、先に概説するようにウェルに分離する(図1)。アッセイの感度は、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)基質の一部としてのTEVプロテアーゼに関する最適な認識部位(ENLYFQG;SEQ ID NO: 1)を用いて決定される(選択肢1;図3)(Malcolm 1995;Behlke et al., 2005, Fluorescence and fluorescence applications. Integrated DNA Technologies)。グルタミンとグリシン残基の間でのペプチドが切断されると、分子内FRET消光を破壊して、それによって蛍光シグナルが得られる。
活性な触媒を発現するクローンの濃縮が成功した後、TEVプロテアーゼの定向進化に関するモデル実験を行う。触媒活性に基づいてスクリーニングできるか否かをさらに証明するために、不活性なC151A変異体をエラープローンPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)を用いてランダムに変異誘発させて、触媒的にコンピテントな変種を回収する。活性はおそらく残基151位での変異の直接逆転の結果として回復する可能性があるが、代替の変異を有するコンピテント変種を同定することが起こりうる。酵素の反応速度に関してスクリーニングできることが予想されることから、野生型TEVプロテアーゼと比較して触媒活性が増加したクローンを同定することが可能である。最後に、非天然基質の切断に関して野生型のTEVプロテアーゼの変異誘発から構築された変種のライブラリを試験する(選択肢2(2、X=Ala)、図3)。各選択ラウンドの後、活性なクローンを分泌する細胞を、ガラスキャピラリーによるマイクロマニピュレーションによってデバイスから回収する。回収されたクローンは、さらなる選択のためにランダムに変異誘発されるか、またはコードされた酵素を同定するためにシークエンシングされる。
以下の実験は、増加した触媒効率および変更された基質特異性を有するppGalNAcTアーゼ変種の進化からなる。マイクロデバイスを用いて、改善された触媒効率を有するppGalNAcTアーゼ-T1の変異体に関してスクリーニングする。ppGalNAcTアーゼ-T1は、腫瘍関連炭水化物エピトープであるTn-抗原を形成するためのSer/Thr残基へのα-GalNAcの転移に責任を有する。このスクリーンにおいて同定された変異体は、Tn-抗原のインビトロ合成のために用いられる。
TAMRA-改変ペプチドアクセプターと共にフルオレセイン改変UDP-糖ドナーによって、グリコシル化後に2つの蛍光体の間でのFRETにより580 nmで産物が検出される(Behlke 2005)。ppGalNAcTアーゼ-T1および他の保持型GTアーゼのUDP-糖結合ポケットに関する構造情報に基づいて、C-2でフルオレセインを有するUDP-GalNAc基質(3)を、UDP-GlcNAcに関して既に報告されているように合成する(Fritz 2004;Patenaude 2002;Helm et al., 2003 J Am Chem Soc, 125:11168-11169)。ppGalNAcTアーゼ-T1によるグリコシル化に関して最適な基質配列(
)を含有するアクセプターペプチド4を、市販の試薬を用いてC末端TAMRAによって合成する(Gerken et al., 2006 J Biol Chem, 281(43):32403-32416)。
ライブラリの選択および増幅の適切なラウンド後(典型的には4〜6回)、活性なクローンを分泌する細胞を、ガラスキャピラリーによるマイクロマニピュレーションによってデバイスから回収した後、さらなる選択のためにランダムに変異誘発するか、またはコードされる酵素を同定するためにシークエンシングする。コードされる酵素を、本来の非改変UDP-GalNAcおよびペプチド基質によって試験して、インビトロでTn-抗原を最善に合成することができる酵素を同定する。可能なライブラリメンバーを用いて、その免疫学的特性に関するさらなる試験のために、および抗癌ワクチンの開発における潜在的使用のためにTn-抗原を大量に合成する。
ppGalNAcTアーゼ-T1に近縁の保持型グリコシルトランスフェラーゼの構造試験により、酵素の特異的残基がUDP-糖ドナーにおける部分(C-3およびC-4)に接触すると、UDP-GlcNAcよりもUDP-GalNAcに対する特異性を増強することが示された(Patenaude et al., 2002 Nat Struct Biol, 9(9):685-690;Fritz et al., 2006 J Biol Chem, 281(13):8613-8619)。先に記述した変異誘発T1変種のライブラリをフルオレセイン改変UDP-GlcNAcドナーによってスクリーニングすると、この非天然基質を転移させることができるクローンを生じて、GTアーゼの活性部位特異性に関する理解を改善する。
先に記述された合成は、基質としてインビトロ合成Tn-抗原を用いて、シアリルTn-抗原を作出するために(図2)、シアリルトランスフェラーゼST6GalNAc-1を変異誘発することによって拡大される。様々なムチン型コア構造をインビトロ合成するための酵素の開発によって、多様な疾患に関係しているこのクラスの複合糖質の生物学的試験が可能となる。
以下の実験は、無細胞マイクロウェル系における酵素活性の検出を証明する。トリプシン切断アッセイによってマイクロウェルにおける酵素の代謝回転を検出するための方法を図11にダイアグラムにする。トリプシンの増加濃度(0.05μg/ml、0.5μg/ml、および5μg/ml)をマイクロウェルにおいて10μg/ml FTC-カゼインと共に1時間インキュベートした。図12において示されるように、観察された蛍光シグナルの強度はマイクロウェルにおけるトリプシンの濃度に依存した。異なる実験において、0.5μg/mlトリプシンをマイクロウェルにおいて10μg/ml FTC-カゼインと共にインキュベートして、顕微鏡写真を1時間および18時間で撮影した。図13において示されるように、観察された蛍光シグナルの強度は、インキュベーション時間に依存した。マイクロウェルは、マイクロウェルにおいて単離された酵素を調べるために既に用いられている。 JP2004309405A1;およびRondelez et al., 2005 Nat Biotechnol, 23(3):361-365を参照されたい。
以下の実験は、本発明のマイクロデバイス内で酵素、すなわち個々のピキア・パストリス(酵母)細胞によって分泌されたプロテアーゼが、FRETレポーター対を有するペプチド基質を切断して、それによって明るい蛍光シグナルを有する活性な酵素を含有する細胞が同定されることを証明する。具体的に、ピキア・パストリスは、ペプチド基質配列
を切断するヒトライノウイルス3Cプロテアーゼ(HRV-3CP)を分泌するように遺伝子操作された。HRV-3CPアッセイによってマイクロウェルにおいて酵素の代謝回転を検出するための方法を図14においてダイアグラムにする。HRV-3CP酵素を分泌することができるピキア・パストリスをマイクロデバイスにローディングした。細胞を、マイクロデバイスにおいて、50 mM Tris、pH 7.0、150 mM NaCl、および1 mM EDTAを補充したYPDにおいて100μg/mlで供給されたFRETペプチド基質
の存在下で18時間インキュベートした。分泌された酵素は、基質の切断に成功して、蛍光シグナルが得られた。図15の左のパネルの矢印は、ウェルにおける細胞を指摘し、これは図15の右のパネルにおいて観察される明るい蛍光ウェルに対応する。
Claims (16)
- 以下の段階を含む、液相生体分子スクリーニングを行う方法:
細胞のライブラリをマイクロデバイスに添加する段階であって、該マイクロデバイスが溶液中で該細胞を空間的に分離させるウェルを含有し、該細胞がウェルあたり約1個で分布して、複数の細胞が該溶液中に少なくとも1つの生体分子の変種を分泌する、段階;
分泌された生体分子変種に、各々が所望の生体分子表現型または活性を示す少なくとも1つの光学シグナル基質を接触させる段階;
多数のパラメータに基づいて細胞によってコードされる生体分子の表現型を評価する段階;および
該マイクロデバイスから所望の生体分子変種を分泌する細胞を単離する段階。 - 表現型が細胞のライブラリにおける1つまたは複数の光学シグナル基質によって生成された1つまたは複数の光学シグナルの経時的な変化を検出することによって評価されて、そのような変化が生体分子の変種の所望の生体分子の表現型または活性を示している、請求項1記載の方法。
- 光学シグナルが蛍光シグナルである、請求項2記載の方法。
- 生体分子表現型または活性が、蛍光シグナルの強度の変化に基づいてマイクロデバイス内でリアルタイムでまたはニアリアルタイム(near-real-time)でモニターされる、請求項3記載の方法。
- 生体分子が、ペプチド、ポリペプチド、プロテアーゼ、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、酵素、抗体、サイトカイン、ケモカイン、核酸、代謝物、小分子(<1 kDa)および合成分子からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
- 生体分子の分子量が約600 Daより大きく、かつ約100,000 Da未満である、請求項5記載の方法。
- パラメータが、触媒速度、反応の特異性、反応速度効率、および基質結合親和性からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
- パラメータが並行して評価される、請求項7記載の方法。
- 細胞が真核細胞である、請求項1記載の方法。
- 真核細胞が酵母細胞である、請求項9記載の方法。
- ウェルが、直径約10〜100μmの間である、請求項1記載の方法。
- 細胞がガラスキャピラリーによるマイクロマニピュレーションによって単離される、請求項1記載の方法。
- 生体分子にランダムに変異誘発させる段階をさらに含む、請求項12記載の方法。
- 生体分子をシークエンシングする段階をさらに含む、請求項12記載の方法。
- 生体分子が変異体グリコシルトランスフェラーゼ(GTアーゼ)またはグリコシダーゼである、請求項1記載の方法。
- GTアーゼが複合炭水化物の迅速かつ大規模産生に関して化学合成と競合することができる、請求項15記載の方法。
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