CN103348003B - 具有n-乙酰葡糖胺基转移酶活性的融合酶 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及具有N‑乙酰葡糖胺基转移酶活性的重组蛋白质。本公开还涉及用于制备复合的N‑聚糖的方法，其包括以下步骤：提供含有这种重组蛋白质的宿主细胞和培养该宿主细胞使得该重组蛋白质被表达。

Description

具有N-乙酰葡糖胺基转移酶活性的融合酶
相关申请的交叉参考
本申请要求2010年11月24日提交的61/417,144号美国临时申请的利益，其通过引用全部在此引入。
提交ASCII文本文件的序列表
下列以ASCII文本文件提交的内容通过引用全部引入本文：序列表的计算机可读形式(CRF)(文件名称：619672001040SEQLIST.txt，记录日期：2011年11月22日，大小：305KB)。
发明领域
本公开涉及可用于制备N-聚糖的组合物和方法。
发明背景
蛋白质的翻译后修饰通常是正确的蛋白质折叠和功能所必需的。常见的蛋白质修饰是在内质网中将寡糖(聚糖)添加到新生多肽上以形成糖蛋白，该过程被称为糖基化。N-糖基化在产生用于治疗目的的重组蛋白质中是特别重要的。由于标准的原核表达系统缺乏这种修饰所必需的适合的机制，这些治疗性蛋白质的产生必须使用替代的表达系统。酵母和真菌是用于表达蛋白质的引人注目的选择，因为它们在简单的培养基中可以很容易地大规模生长，这使得能够获得低的生产成本。此外，用来操纵酵母和真菌细胞的相对简单的遗传构成以及更复杂的真核细胞，如哺乳动物或昆虫细胞的工具是可得的(De Pourcq等，Appl Microbiol Biotechnol，87(5)：1617-31)。
真菌细胞和哺乳动物细胞共有导致甘露糖(8)N-乙酰葡糖胺(2)(Man8GlcNAc2)形成的糖基化早期阶段中的共同步骤。然而，在该过程的后期阶段中存在着显著的差异。例如，在酵母中，通过甘露糖基转移酶和甘露聚糖聚合酶向Man8GlcNAc2添加额外的甘露糖亚基以得到高甘露糖型的N-聚糖。相反，甘露糖从人Man8GlcNAc2除去以产生Man5GlcNAc2，接着是涉及酶N-乙酰葡糖胺基转移酶I(GnTI)、甘露糖苷酶II(Mns II)和N-乙酰葡糖胺基转移酶II(GnTII)的三个顺序反应，以将Man5GlcNAc2转化成GlcNAc2Man3GlcNAc2。
在哺乳动物和真菌细胞中糖基化过程之间的差异为糖基化哺乳动物蛋白在真菌细胞中的表达提出了挑战，因为具有高甘露糖型N-聚糖的糖蛋白不适合于人类中的治疗应用(De Pourcq等，2010；Wildt和Gerngross，Nature Reviews Microbiology，3：119-128)。因此，已经进行了对酵母和真菌物种中的糖基化途径重新工程化使他们能够表达重组人类蛋白质的研究。酵母或真菌细胞的糖工程(glycoengineering)的一般途径是破坏高甘露糖型N-聚糖的形成中所涉及的内源性基因。可以将这些基因的破坏与内源性甘露糖苷酶和/或来自不同物种的糖基转移酶和糖苷酶的过表达相结合(Chiba等，1998，J Biol Chem273：26298-304；Kainz等，2008，Appl Environ Microbiol 74：1076-86；Maras等，1997，Euro J Biochem 249：701-07；Maras等，1999，Febs Letters 452：365-70；Hamilton等，2003，Science301：1244-6；De Pourcq等，2010)。然而，在非哺乳动物细胞中糖基化的哺乳动物蛋白质产生仍然需要复杂的和费时的基因工程并且可能在制备所需的糖蛋白时是低效的。
因此，在本领域中仍然需要在非哺乳动物细胞中表达复合的N-聚糖的更简单和更有效的系统。
发明内容
本文描述的是包含具有N-乙酰葡糖胺基转移酶活性的重组蛋白质的组合物。本文还描述了制备复合的N-聚糖的方法和制备Man3GlcNAc2聚糖的方法。
因此，一个方面包括具有N-乙酰葡糖胺基转移酶活性的重组蛋白质，其中该重组蛋白质催化N-乙酰葡糖胺转移到受体聚糖的末端Manα3残基和催化N-乙酰葡糖胺转移到末端Manα6残基，以及其中该重组蛋白质包含来自至少两种不同的酶的催化结构域。在某些实施方式中，该受体聚糖被连接到选自于氨基酸、肽或多肽的分子上。在某些实施方式中，该分子是异源多肽。在某些可以与前面的实施方式相结合的实施方式中，该受体聚糖是Man3。在某些可以与前面的实施方式相结合的实施方式中，该重组蛋白质是包含N-乙酰葡糖胺基转移酶I催化结构域和N-乙酰葡糖胺基转移酶II催化结构域的融合蛋白质。在某些实施方式中，该N-乙酰葡糖胺基转移酶I催化结构域和N-乙酰葡糖胺基转移酶II催化结构域来自人类的酶。在某些实施方式中，该N-乙酰葡糖胺基转移酶I催化结构域包含与SEQ ID NO：1的氨基酸残基105-445至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的序列。在某些可以与前面的实施方式相结合的实施方式中，该N-乙酰葡糖胺基转移酶II催化结构域包含与SEQ ID NO：21的氨基酸残基30-447至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的序列。在某些可以与前面的实施方式相结合的实施方式中，该N-乙酰葡糖胺基转移酶I催化结构域是在N-乙酰葡糖胺基转移酶II催化结构域的N-末端。在某些可以与前面的实施方式相结合的实施方式中，该N-乙酰葡糖胺基转移酶II催化结构域是在N-乙酰葡糖胺基转移酶I催化结构域的N-末端。
在某些可以与前面的实施方式相结合的实施方式中，该重组蛋白还包含在N-乙酰葡糖胺基转移酶I催化结构域和N-乙酰葡糖胺基转移酶II催化结构域之间间隔区。在某些实施方式中，该间隔区包含来自非催化结构域(stem domain)的序列。在某些可以与前面的实施方式相结合的实施方式中，该间隔区的长度是至少5、至少10、至少15、至少20、至少30、至少40或至少50个氨基酸。在某些可以与前面的实施方式相结合的实施方式中，该间隔区包含选自于SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：120、SEQ ID NO：122和SEQ ID NO：124的序列。在某些实施方式中，该间隔区包含选自于SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：120和SEQ ID NO：124的序列。在某些实施方式中，该间隔区包含SEQ ID NO：120或SEQ ID NO：124的序列。在某些实施方式中，该间隔区包含SEQ ID NO：124的序列。
在某些可以与前面的实施方式相结合的实施方式中，该重组蛋白质还包含连接到催化结构域的N-末端的靶向肽。在某些实施方式中，该靶向肽包含非催化结构域。在某些实施方式中，该非催化结构域来自N-乙酰葡糖胺基转移酶Ⅰ酶或N-乙酰葡糖胺基转移酶Ⅱ酶。在某些实施方式中，N-乙酰葡糖胺基转移酶Ⅰ酶和N-乙酰葡糖胺基转移酶Ⅱ酶是人类的酶。在某些可以与前面的实施方式相结合的实施方式中，该非催化结构域是来自选自于甘露糖苷酶、甘露糖基转移酶、糖基转移酶、2型高尔基蛋白、MNN2、MNN4、MNN6、MNN9、MNN10、MNS1、KRE2、VAN1或OCH1的蛋白质。在某些实施方式中，该蛋白质来自选自于枝顶孢属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、隐球菌属(Cryptococcus)、金孢子菌属(Chrysosporium)、Chrysosporium lucknowense、线黑粉酵母属(Filibasidium)、镰孢菌属(Fusarium)、赤霉属(Gibberella)、腐质霉属(Humicola)、梨孢菌属(Magnaporthe)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、漆斑菌属(Myrothecium)、新考马脂霉属(Neocallimastix)、脉孢霉属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、裂褶菌属(Schizophyllum)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)或木霉属(Trichoderma)的生物体。在某些可以与前面的实施方式相结合的实施方式中，该靶向肽是Kre2靶向肽。在某些实施方式中，该靶向肽包含跨膜结构域。在某些可以与前面的实施方式相结合的实施方式中，该靶向肽还包含连接到非催化结构域的N-末端的跨膜结构域。在某些可以与前面的实施方式相结合的实施方式中，该跨膜结构域来自N-乙酰葡糖胺基转移酶Ⅰ酶或N-乙酰葡糖胺基转移酶Ⅱ酶。在某些实施方式中，该N-乙酰葡糖胺基转移酶Ⅰ酶和N-乙酰葡糖胺基转移酶Ⅱ酶是人类的酶。在某些可以与前面的实施方式相结合的实施方式中，该跨膜结构域是来自选自于甘露糖苷酶、甘露糖基转移酶、糖基转移酶、2型高尔基蛋白、MNN2、MNN4、MNN6、MNN9、MNN10、MNS1、KRE2、VAN1或OCH1的蛋白质。在某些实施方式中，该蛋白质来自选自于枝顶孢属、曲霉属、短梗霉属、隐球菌属、金孢子菌属、Chrysosporium lucknowense、线黑粉酵母属、镰孢菌属、赤霉属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、漆斑菌属、新考马脂霉属、脉孢霉属、拟青霉属、青霉属、瘤胃壶菌属、裂褶菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属或木霉属的生物体。在某些实施方式中，该靶向肽包含胞质结构域。在某些可以与前面的实施方式相结合的实施方式中，该靶向肽还包含连接到非催化结构域的N-末端的胞质结构域。在某些可以与前面的实施方式相结合的实施方式中，该靶向肽还包含连接到跨膜结构域的N末端的胞质结构域。在某些可以与前面的实施方式相结合的实施方式中，该胞质结构域来自N-乙酰葡糖胺基转移酶Ⅰ酶或N-乙酰葡糖胺基转移酶Ⅱ酶。在某些实施方式中，该N-乙酰葡糖胺基转移酶Ⅰ酶和N-乙酰葡糖胺基转移酶Ⅱ酶是人类的酶。在某些可以与前面的实施方式相结合的实施方式中，该胞质结构域是来自选自于甘露糖苷酶、甘露糖基转移酶、糖基转移酶、2型高尔基蛋白、MNN2、MNN4、MNN6、MNN9、MNN10、MNS1、KRE2、VAN1或OCH1的蛋白质。在某些实施方式中，该蛋白质来自选自于枝顶孢属、曲霉属、短梗霉属、隐球菌属、金孢子菌属、Chrysosporium lucknowense、线黑粉酵母属、镰孢菌属、赤霉属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、漆斑菌属、新考马脂霉属、脉孢霉属、拟青霉属、青霉属、瘤胃壶菌属、裂褶菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属或木霉属的生物体。
另一个方面包括重组蛋白质，其包含其中N-乙酰葡糖胺基转移酶II催化结构域位于N-乙酰葡糖胺基转移酶I催化结构域的N-末端的人N-乙酰葡糖胺基转移酶II催化结构域和人N-乙酰葡糖胺基转移酶I催化结构域、含有来自人N-乙酰葡糖胺基转移酶I非催化结构域的序列的位于催化结构域之间的间隔区序列以及位于N-乙酰葡糖胺基转移酶II催化结构域的N-末端的靶向肽，其中该靶向肽包含胞质结构域、跨膜结构域和来自人N-乙酰葡糖胺基转移酶II的非催化结构域。另一个方面包括包含与SEQ ID NO：95至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的序列的重组蛋白质。
另一个方面包括重组蛋白质，其包含其中N-乙酰葡糖胺基转移酶II催化结构域位于N-乙酰葡糖胺基转移酶I催化结构域的N-末端的N-乙酰葡糖胺基转移酶II催化结构域和N-乙酰葡糖胺基转移酶I催化结构域，其中包含选自于SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：120、SEQID NO：122和SEQ ID NO：124的序列的位于催化结构域之间的间隔区；以及位于N-乙酰葡糖胺基转移酶II催化结构域的N-末端的靶向肽，其中该靶向肽包含胞质结构域、跨膜结构域和来自人N-乙酰葡糖胺基转移酶II的非催化结构域。在某些实施方式中，该间隔区包含选自于SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：120和SEQ ID NO：124的序列。在某些实施方式中，该间隔区包含SEQ ID NO：120或SEQ ID NO：124的序列。在某些实施方式中，该间隔区包含SEQ IDNO：124的序列。
另一个方面包括编码上述实施方式中任一项的重组蛋白质的分离的多核苷酸。另一个方面包括含有可操作地与启动子连接的前述实施方式的分离多核苷酸的表达载体。在某些实施方式中，该启动子是组成型启动子。在某些实施方式中，该启动子是诱导型启动子。在某些实施方式中，启动子是来自选自于gpdA、cbh1、米曲霉(Aspergillus oryzae)TAKA淀粉酶、米赫根毛霉(Phizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉(Aspergillusniger)中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定的α-淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)glaA、米赫根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)乙酰胺酶、米曲霉乙酰胺酶、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)胰蛋白酶样蛋白酶、真菌内切α-L-阿拉伯糖酶(abnA)、真菌α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶A(abfA)、真菌α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶B(abfA)、真菌木聚糖酶(xlnA)、真菌肌醇六磷酸酶、真菌ATP合成酶、真菌亚基9(oliC)、真菌磷酸丙糖异构酶(tpi)、真菌醇脱氢酶(adhA)、真菌α-淀粉酶(amy)、真菌淀粉葡萄糖苷酶(glaA)、真菌乙酰胺酶(amdS)、真菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gpd)、酵母醇脱氢酶、酵母醇氧化酶、酵母乳糖酶、酵母3-磷酸甘油酸激酶、酵母磷酸丙糖异构酶、细菌α-淀粉酶、细菌Spo2或SSO的基因。另一个方面包括含有前述实施方式中任一项的表达载体的宿主细胞。
另一个方面包括产生前述实施方式中任一项重组蛋白质的方法，其包括以下步骤：将编码重组蛋白质的分离的多核苷酸引入宿主细胞，和培养该宿主细胞以使得表达该重组蛋白质。在某些实施方式中，该方法还包括从宿主细胞纯化重组蛋白质的步骤。在某些可以与前面的实施方式相结合的实施方式中，该宿主细胞是真菌细胞。在某些实施方式中，该真菌细胞选自于酵母或丝状真菌。
另一个方面包括制备复合的N-聚糖的方法，其包括以下步骤：提供宿主细胞，其中该宿主细胞包含编码融合蛋白质的多核苷酸，该融合蛋白质包含N-乙酰葡糖胺基转移酶I催化结构域和N-乙酰葡糖胺基转移酶II催化结构域，和培养该宿主细胞以使得表达该融合蛋白质，其中该融合蛋白质催化N-乙酰葡糖胺转移到受体聚糖的末端Manα3残基和N-乙酰葡糖胺转移到末端Manα6残基以产生复合的N-聚糖。在某些实施方式中，该复合的N-聚糖被连接于选自于氨基酸、肽或多肽的分子。在某些实施方式中，该分子是异源多肽。在某些可以与前面的实施方式相结合的实施方式中，该受体聚糖是Man3。在某些可以与前面的实施方式相结合的实施方式中，该复合的N-聚糖是GlcNAcβ2Manα3(GlcNAcβ2Manα6)Manβ4GlcNAcβ4GlcNAc。在某些可以与前面的实施方式相结合的实施方式中，该宿主细胞是真核细胞。在某些可以与前面的实施方式相结合的实施方式中，该宿主细胞是真菌细胞。在某些实施方式中，该真菌细胞是选自于酿酒酵母(S.cerevisiae)、乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、毕赤酵母(P.pastoris)、汉逊酵母(H.polymorpha)、白假丝酵母(C.albicans)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)或耶氏酵母(Yarrowia)的酵母细胞。在某些可以与前面的实施方式相结合的实施方式中，该真菌细胞是选自于木霉菌、枝顶孢属、曲霉属、短梗霉属、隐球菌属、金孢子菌属、Chrysosporium lucknowense、线黑粉酵母属、镰孢菌属、赤霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、漆斑菌属、新考马脂霉属、脉孢霉属、拟青霉属、青霉属、瘤胃壶菌属、裂褶菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属或弯颈霉属的丝状真菌细胞。在某些可以与前面的实施方式相结合的实施方式中，该宿主细胞还包含编码UDP-GlcNAc转运蛋白的多核苷酸。在某些可以与前面的实施方式相结合的实施方式中，该宿主细胞具有与野生型宿主细胞中的活性水平相比降低的多萜醇基(dolichyl)-P-Man:Man(5)GlcNAc(2)-PP-多萜醇基甘露糖基转移酶的活性水平。在某些实施方式中，该宿主细胞具有与野生型宿主细胞中的表达水平相比降低的alg3基因的表达水平。在某些实施方式中，从宿主细胞删除该alg3基因。在某些可以与前面的实施方式相结合的实施方式中，该宿主细胞具有与野生型宿主细胞中的活性水平相比降低的α-1，6-甘露糖基转移酶的活性水平。在某些实施方式中，该宿主细胞具有与野生型宿主细胞中的表达水平降低的och1基因的表达水平。在某些实施方式中，从宿主细胞中删除了och1基因。在某些可以与前面的实施方式相结合的实施方式中，该宿主细胞还包含编码α-1，2-甘露糖苷酶的多核苷酸。在某些可以与前面的实施方式相结合的实施方式中，该宿主细胞还包含编码β-1，4-半乳糖基转移酶的多核苷酸。在某些可以与前面的实施方式相结合的实施方式中，该宿主细胞还包含编码唾液酸转移酶的多核苷酸。在某些可以与前面的实施方式相结合的实施方式中，该宿主细胞是木霉属的细胞，其具有与野生型的木霉属细胞中的活性水平相比降低的多萜醇基-P-Man:Man(5)GlcNAc(2)-PP-多萜醇基甘露糖基转移酶的活性水平。在某些可以与前面的实施方式相结合的实施方式中，该宿主细胞是酵母或真菌细胞，其具有与野生型酵母细胞中的活性水平相比降低的多萜醇基-P-Man:Man(5)GlcNAc(2)-PP-多萜醇基甘露糖基转移酶的活性水平和降低的α-1，6-甘露糖基转移酶的活性水平，并进一步包含编码α-1，2-甘露糖苷酶的多核苷酸。
另一个方面包括制备复合的N-聚糖的方法，其包括以下步骤：提供木霉属的宿主细胞，其中该宿主细胞具有与野生型宿主细胞中的表达水平降低的alg3基因的表达水平且包含编码N-乙酰葡糖胺基转移酶I催化结构域的第一多核苷酸和编码N-乙酰葡糖胺基转移酶II催化结构域的第二多核苷酸；以及培养该宿主细胞以产生复合的N-聚糖。
另一个方面包括制备复合的N-聚糖的方法，其包括以下步骤：在缓冲液中将包含N-乙酰葡糖胺基转移酶I催化结构域和N-乙酰葡糖胺基转移酶II催化结构域的融合蛋白质、受体聚糖和N-乙酰葡糖胺供体一起孵育，其中该融合蛋白质催化N-乙酰葡糖胺转移到受体聚糖的末端Manα3残基和N-乙酰葡糖胺转移到末端Manα6残基以产生复合的N-聚糖。在某些实施方式中，该受体聚糖被连接于选自于氨基酸、肽或多肽的分子上。在某些实施方式中，该分子是异源多肽。在某些实施方式中，该受体聚糖是Man3。在某些可以与前面的实施方式相结合的实施方式中，该N-乙酰葡糖胺供体是UDP-GlcNAc转运蛋白。
另一个方面包括丝状真菌细胞，其包含alg3的突变和Man3GlcNAc2，其中该Man3GlcNAc2包括细胞分泌的中性N-聚糖的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％(摩尔％)。该中性N-聚糖可连接到选自于氨基酸、肽和多肽的分子上。在某些实施方式中，alg3的突变是alg3的缺失。在某些可以与前面的实施方式相结合的实施方式中，该细胞是里氏木霉(Trichoderma reesei)细胞。在某些可以与前面的实施方式相结合的实施方式中，该丝状真菌细胞还包含编码N-乙酰葡糖胺基转移酶I催化结构域的第一多核苷酸和编码N-乙酰葡糖胺基转移酶II催化结构域的第二多核苷酸。在某些可以与前面的实施方式相结合的实施方式中，该丝状真菌细胞还包含编码含N-乙酰葡糖胺基转移酶I催化结构域和N-乙酰葡糖胺基转移酶II催化结构域的融合蛋白质的多核苷酸。
另一个方面包括在宿主细胞中产生Man3GlcNAc2聚糖的方法，其包括以下步骤：提供具有与野生型宿主细胞中的活性水平相比降低的甘露糖基转移酶的活性水平的宿主细胞并培养该宿主细胞以产生Man3GlcNAc2聚糖，其中该Man3GlcNAc2聚糖包括宿主细胞分泌的中性N-聚糖的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％(摩尔％)。该中性N-聚糖可连接到选自于氨基酸、肽和多肽的分子上。在某些实施方式中，该Man3GlcNAc2聚糖被连接到异源多肽上。在某些可以与前面的实施方式相结合的实施方式中，该甘露糖基转移酶是多萜醇基-P-Man:Man(5)GlcNAc(2)-PP-多萜醇基甘露糖基转移酶。在某些可以与前面的实施方式相结合的实施方式中，该宿主细胞具有与野生型宿主细胞中的表达水平相比降低的alg3基因的表达水平。在某些实施方式中，从宿主细胞中删除alg3基因。在某些可以与前面的实施方式相结合的实施方式中，该宿主细胞是木霉属细胞。在某些可以与前面的实施方式相结合的实施方式中，该宿主细胞中的α-1，6-甘露糖基转移酶的活性水平与野生型宿主细胞中的活性水平相比降低。在某些可以与前面的实施方式相结合的实施方式中，该宿主细胞含有编码α-1，2-甘露糖苷酶的内源性多核苷酸。
另一个方面包括丝状真菌细胞，其具有与野生型丝状真菌细胞中的表达水平相比降低的alg3基因的表达水平，其中该丝状真菌细胞包含前述实施方式中任一项的重组蛋白质。在某些实施方式中，该alg3基因包含突变。优选地，该重组蛋白质具有N-乙酰葡糖胺基转移酶活性，其中该重组蛋白质催化N-乙酰葡糖胺转移到受体聚糖的末端Manα3残基和催化N-乙酰葡糖胺转移到末端Manα6残基，和其中该重组蛋白质是包含N-乙酰葡糖胺基转移酶I催化结构域和N-乙酰葡糖胺基转移酶II催化结构域的融合蛋白质。在某些实施方式中，alg3基因的突变是alg3基因的缺失。在某些可以与前面的实施方式相结合的实施方式中，该融合蛋白质是由可操作地与启动子连接的多核苷酸编码的。在某些实施方式中，该启动子是诱导型启动子。在某些实施方式中，该诱导型启动子是cbh1启动子。在某些可以与前面的实施方式相结合的实施方式中，该丝状真菌细胞还包含编码UDP-GlcNAc转运蛋白的多核苷酸。在某些可以与前面的实施方式相结合的实施方式中，该丝状真菌细胞具有与野生型的丝状真菌细胞中的活性水平相比降低的α-1，6-甘露糖基转移酶的活性水平。在某些实施方式中，该丝状真菌细胞具有与野生型宿丝状真菌细胞中的表达水平相比降低的och1基因的表达水平。在某些可以与前面的实施方式相结合的实施方式中，该丝状真菌细胞还包含编码α-1，2-甘露糖苷酶的多核苷酸。在某些可以与前面的实施方式相结合的实施方式中，该丝状真菌细胞还包含编码β-1，4-半乳糖基转移酶的多核苷酸。在某些可以与前面的实施方式相结合的实施方式中，该丝状真菌细胞还包含编码唾液酸转移酶的多核苷酸。在某些可以与前面的实施方式相结合的实施方式中，该丝状真菌细胞选自于木霉菌、枝顶孢属、曲霉属、短梗霉属、隐球菌属、金孢子菌属、Chrysosporium lucknowense、线黑粉酵母属、镰孢菌属、赤霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、漆斑菌属、新考马脂霉属、脉孢霉属、拟青霉属、青霉属、瘤胃壶菌属、裂褶菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属和弯颈霉属。
附图说明
图1显示了里氏木霉菌株M44、M81、M84、M109、MHO、M131、M132、M133、M134和M124上一般糖基化(average glycosylation)的中性N-聚糖质谱图。
图2显示单磷酸化的Man7Gn2的碎片分析。仅显示了单磷酸化的Man7Gn2的一种示例性结构。
图3显示了里氏木霉菌株M44、M81、M84、M109、M110、M131、M132、M133、M134和M124的酸性聚糖质谱图。
图4显示了在发酵罐中培养131.4小时(分批补料)的里氏木霉菌株M44的中性(a)和酸性(b)N-聚糖图谱。
图5显示了里氏木霉培养基中中性(a)和酸性(b)N-聚糖的质谱图。
图6显示了里氏木霉分泌的蛋白质的膜印迹。
图7显示了在发酵罐中培养的里氏木霉M44的分析蛋白质带的实例。蛋白质的糖基化与里氏木霉的一般糖基化没有显著不同。谱带聚焦于较少的基线信号，和与其他信号相比，频谱的主要信号是非定量的。
图8显示了来自亲本菌株和来自Alg3敲除菌株的DNA采用alg3探针获得的Southern印迹。
图9A显示具有预测的限制性产物大小的pTTv38构建体片段的限制性内切酶图谱。图9B显示了用EcoRI+PvuI(E+P)或KpnI+NheI(K+N)消化的来自亲本菌株和Alg3敲除菌株的基因组DNA的Southern印迹。对照DNA是用NotI消化的pTTv38质粒DNA。该印迹是用AmdS探针探测。
图10显示了中性N-聚糖的MALDI分析。部分A显示亲本菌株M124。部分B显示Alg3敲除的4A。方块代表N-乙酰葡糖胺，且圆圈代表甘露糖，除了标记为葡萄糖的一个。
图11显示了来自4A Alg3敲除菌株的Man3Gn2的碎片分析。
图12显示了来自Alg3敲除菌株4A(部分A)和亲本菌株M124(部分B)的Hex5Gn2的碎片分析。用方框标记的信号仅作为来自Alg3敲除菌株的异构体存在。
图13显示了α-甘露糖苷酶消化后的来自Alg3敲除菌株4A的中性N-聚糖。
图14显示了通过液相色谱分离来自Alg3敲除菌株的两种主要聚糖。
图15显示了Hex3HexNAc2(A部分)和Hex6HexNAc2(B部分)级分的质子NMR谱。在40℃下，使用配备有冷冻探针的Varian Unity INOVA 600MHz谱仪收集质谱。
图16显示了亲本菌株M124(部分A)和Alg3敲除菌株4A(B)的酸性级分。用星号标记具有两个磷酸根单元的N-聚糖。
图17显示了来自在烧瓶中培养5天的里氏木霉Alg3敲除菌株4A的上清液的中性N-聚糖。
图18显示了来自在发酵罐中培养10天的里氏木霉Alg3敲除菌株4A的上清液的中性N-聚糖。
图19显示了GnTI反应混合物的MALDI图谱。GnTI已经将54％的受体转化成具有一个额外的HexNAc的产物。
图20显示了GnTII表达的Western印迹分析。在12％SDS-PAGE凝胶上跑样和在硝酸纤维素膜上进行印迹。使用小鼠α-HIS单克隆抗体在膜上检测到组氨酸标记的GnTII。在左侧所示的数字是分子量标志物蛋白质的大小(kDa)。
图21显示了GnTII反应混合物的MALDI谱。83％的受体(m/z913.340)转化成产物(m/z 1136.433)。
图22显示了对于GnTI/GnTII融合蛋白质观察到的GnTI活性。
图23显示了通过靶向于alg3基因座得到的GnTI/GnTII里氏木霉转化体中存在的N-聚糖。
图24显示了来自GnTII/GnTI融合蛋白质的酶活性测试的纯化反应混合物的MALDI谱。
图25显示了β1-2，3，4，6-N-乙酰氨基葡糖苷酶反应混合物的图谱。
图26显示了β1-4GalT反应混合物的MALDI谱。
图27显示了观察到的来自里氏木霉M127pTTv110转化体(alg3基因座的gnt II/I)在第3天(A)、第5天(B)和第7天(C和D)的上清液蛋白质的N-聚糖。克隆17A在第7天产生了最多的G0。(E)来自在摇瓶中培养7天的里氏木霉菌株M127GnTII/I转化体克隆17A的上清液蛋白质的中性N-聚糖质谱。标记星号的信号来源于培养基。
图28显示了来自里氏木霉M202GnT II/I转化体克隆(A)9A-1和(B)31A-1(两者都用大豆胰蛋白酶抑制剂培养)的利妥昔单抗的中性N-聚糖，及(C)从在大豆胰蛋白酶抑制剂存在下在摇瓶中培养5天的里氏木霉M202GnT II/I转化体克隆9A-1纯化的利妥昔单抗的中性N-聚糖的质谱。
图29显示了间隔区修饰的GnTII/GnTI融合反应混合物的MALDI谱。部分(A)显示了具有3xG4S间隔区修饰的GnTII/GnTI的反应混合物。36％的受体已被转化为具有两个额外的HexNAc的产物。部分(B)显示了具有2xG4S间隔区修饰的GnTII/GnTI的反应混合物。38％的受体已被转化为具有两个额外的HexNAc的产物。在任一图谱中未检测到GnTI产物Hex3HexNAc2(计算m/z 933.318)的[M+Na]+信号的计算m/z值，因为所有的GnTI产物直接转化成Hex3HexNAc3(计算m/z 1136.318)。
图30显示了GnTII/I间隔区变异体的细胞沉淀(A)和上清液(B)的Western印迹。泳道1：GnTII阳性对照，2：GY3模拟株，3：GY7-2野生型GnTII/I，4：GY32-5 3xG4S间隔区，5：GY32-9 3xG4S间隔区，6：GY33-7 2xG4S间隔区，7：GY33-8 2xG4S间隔区，8：GY49-3CBHI间隔区和9：GY50-10 EGIV间隔区。
图31显示了在(A)第3天的表达阶段和(B)第4天的表达阶段后来自上清液的和在蛋白酶抑制剂存在下表达的野生型GnTII/I和间隔区变异体的GnT活性。x轴标示了样品身份(wt＝野生型；_1、_2＝间隔区变异体的平行克隆)，且y轴标示了形成的产物的百分比(GnTI和GnTII反应产物加在一起)。
图32显示了上清液、细胞和溶解产物中的GnTII/I融合蛋白质(具有野生型间隔区)的GnT活性。GnTI和GnTII产物被加在一起。
图33显示了(A)上清液、(B)细胞和(C)溶解产物中GnTII/I野生型和间隔区变异体的GnT活性。
图34显示了亲本菌株M124和GnTI转化体在第5天的中性N-聚糖的示例性图谱。用箭头标记Gn增加的信号(m/z 1460)(具有cbh1启动子的pTTv11，具有gpdA启动子的pTTv13)。
图35显示了第3天和第5天四个阳性GNT1转化体中Man5和Gn1Man5的量。定量相对于内部校准物(Hex2HexNAc4，2pmol)进行。
图36显示了具有内部校准物(NeuAcHex4HexNAc2，0.5pmol)的亲本M124菌株和GnT1转化体的磷酸化N-聚糖的示例性图谱。GnT1产物用箭头标记。
图37显示了来自第5天的不同GnTII菌株/克隆的中性N-聚糖的图表。部分(A)显示pTTv140克隆。部分(B)显示pTTv142克隆。部分(C)显示pTTv143克隆。部分(D)显示pTTv141克隆。
图38显示了来自第3天、第5天和第7天的不同GnTII菌株/克隆和亲本菌株M198的中性N-聚糖的实例。部分(A)显示克隆1-117A。部分(B)显示克隆3-11A。部分(C)显示克隆30A。部分(D)显示亲本菌株M198。
图39显示了里氏木霉菌株M198和GnTII克隆3-17A的经分离的蛋白质的膜。用箭头标记50kDa的蛋白质。
图40显示了亲本菌株M198(A)和GnTII克隆3-17A(B)的总的分泌蛋白质相对单个分泌蛋白质的柱形图。
图41显示了从第3天到第7天发酵罐培养的GnTII菌株M329和第5天的摇瓶培养菌株M329的柱形图。
图42显示了里氏木霉ALG3和ALG3同源物的多个氨基酸序列的比对。
详细说明
本发明涉及具有N-乙酰葡糖胺基转移酶活性的重组蛋白质，其中该重组蛋白质催化N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)转移到受体聚糖的末端Manα3残基和催化N-乙酰葡糖胺转移到受体聚糖的末端Manα6残基上，以及其中该重组蛋白质包含来自至少两种不同的酶的催化结构域。
在一些实施方式中，本发明的重组蛋白质包括两个催化结构域，其中一个催化结构域具有N-乙酰葡糖胺基转移酶I(GnTI)活性(例如，与末端Manα3残基反应)，和另一个催化结构域具有N-乙酰葡糖胺基转移酶II(GnTII)活性(例如，与末端Manα6残基反应)。
在一些实施方式中，本发明的重组蛋白质催化基本上顺序发生的反应。例如，本发明的重组蛋白质可以首先催化GlcNAc转移到末端Manα3残基上，然后催化GlcNAc转移到受体聚糖的末端Manα6残基上。在一个实施方式中，该基本上顺序的反应比按相反顺序的两个反应更有效至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍或至少100倍。在某些实施方式中，顺序反应意思是，如果GlcNAc还没有被转移到末端Manα3残基上，则基本上或完全没有GlcNAc可以被转移到末端Manα6残基上。在具体的实施方式中，受体聚糖包含GlcNAcβ2Manα3分支。
在一些实施方式中，重组蛋白质与Manα3和Manα6残基(任选地在分支受体聚糖中)特异性地反应，但是基本上不或绝对不与其他Manα结构(例如Manα单糖偶联物)、与Manα苯甲基和/或ManαSer/T-肽反应。非实质反应性优选地是低于与末端Manα3和Manα6残基的反应的0.1mM受体聚糖浓度的Vmax的10％、低于8％、低于6％、低于4％、低于2％、低于1％或低于0.1％。在具体实施方式中，重组蛋白质与受体聚糖的末端Manα3残基(优选为GnTI反应)和末端Manα6残基(优选为GnTII反应)具有基本上相似的反应性。优选地，在相同的条件下，任一种催化活性与另一种催化活性相比没有超过10倍、5倍、3倍或2倍的反应效率的差异。
在具体实施方式中，GlcNAc转移至末端Manα3和Manα6上产生至少10％、至少25％、至少50％、至少70％、至少90％或至少95％的Man3聚糖转化为带有两个末端GlcNAc的聚糖的转化率。反应的效率可以通过如本文公开的实施例中所述的体外或体内分析来测量。可以基本上如实施例中所述，或作为0.1mM的受体浓度和饱和供体浓度下的最大反应速率Vmax来测量GlcNAc转移反应的效率。在具体实施方式中，用连接到氨基酸、肽或多肽上的Man3受体聚糖来测量反应的效率。
本公开还涉及到一种制备复合的N-聚糖的方法，包括以下步骤：提供宿主细胞，其中该宿主细胞包含编码其中包含N-乙酰葡糖胺基转移酶I催化结构域和N-乙酰葡糖胺基转移酶II催化结构域的融合蛋白质的多核苷酸，以及培养该宿主细胞以使得该融合蛋白质被表达，其中该融合蛋白质催化N-乙酰葡糖胺转移到受体聚糖的末端Manα3残基和N-乙酰葡糖胺转移到受体聚糖的末端Manα6残基和以产生复合的N-聚糖。
本发明还涉及一种具有与野生型丝状真菌细胞中的表达水平相比降低的alg3基因表达水平的丝状真菌细胞，其中该丝状真菌细胞包含本发明的重组蛋白质。
定义
如本文所使用的“重组蛋白质”是指由重组核酸产生的任何蛋白质。如本文所使用的“重组核酸”是指其中至少以下一项为真的核酸多聚物：(a)核酸的序列对于给定的宿主细胞是外来的(即，不是天然存在于其中的)；(b)序列可以在给定的宿主细胞中天然地存在，但以非自然的(例如，大于预期的)量存在或以多于或少于天然表达水平的水平表达；或(c)核酸的序列包括两个或更多的子序列，其不是以在自然界发现的相同相互关系而存在。例如，对于情形(c)，重组核酸序列将具有两个或更多个来自不相关的基因的序列，其进行排列以形成新的功能性核酸。在另一个实例中，重组核酸序列将包含天然地不是彼此相邻的启动子序列和基因编码序列。
如本文所使用的“N-乙酰葡糖胺基转移酶活性”是指将N-乙酰葡糖胺基残基(GlcNAc)转移到受体聚糖的酶的活性。通常，具有这一活性的酶是N-乙酰葡糖胺基转移酶(GlcNAc转移酶)。在某些实施方式中，GlcNAc转移酶是真核的。在某些实施方式中，GlcNAc转移酶是形成从GlcNAc-残基的1-位至末端甘露糖残基的β-连接的哺乳动物酶。在某些实施方式中，GlcNAc转移酶是将β2-连接的GlcNAc-残基转移至聚糖的2-位末端甘露糖残基(特别是至N-连接的聚糖)的β2-N-乙酰葡糖胺基转移酶。在某些实施方式中，β2-GlcNAc转移酶是具有GnTI活性和GnTII活性的酶。GnTI活性将GlcNAc残基转移至Manα3分支。该Manα3分支可以是N-连接的聚糖核心结构上的Manα3(R-Manα6)Manβ分支，如Man3GlcNAc2或Man3或Man5GlcNAc2或Man5。GnTI酶可以是哺乳动物酶、植物酶或低等真核生物酶。GnTII活性将GlcNAc残基转移到N-连接的聚糖核心结构的Manα6-分支上如Manα6(GlcNAcβ2Manα3)Manβ-分支。这样的Manα6-分支的例子是GlcNAclMan3GlcNAc2。
如本文所使用的“N-乙酰葡糖胺”是指N-乙酰葡糖胺残基(GlcNAc)。GlcNAc可以是聚糖结构的部分。胺基团在2位上，具有D-构型，且具有作为残基的吡喃糖结构。或者它可以被命名为2-乙酰氨基-2-脱氧-D-吡喃葡萄糖(D-GlcpNAc)。GlcNAc也可以是游离的还原性单糖(即不是聚糖的部分)。
如本文所使用的“Man”是指甘露糖残基。“末端Manα3”或“末端Manα6”是指未被另一个单糖残基或多个残基取代为非还原性末端的末端残基的甘露糖。
如本文所使用的“聚糖”是指可连接到载体，如氨基酸、肽、多肽、脂质或还原性末端偶联物上的寡糖链。在某些实施方式中，本发明涉及通过至天冬酰胺残基(Asn)侧链的酰胺氮的N-连接与多肽N-糖基化位点(例如-Asn-Xxx-Ser/Thr-)偶联的N-连接聚糖，其中Xxx是除脯氨酸外的任何氨基酸残基。本发明还可以涉及作为多萜醇基-磷酸-寡糖(Dol-P-P-OS)前体脂质结构的部分的聚糖，其是真核细胞的内质网中N-连接聚糖的前体。该前体寡糖由其还原性末端连接至多萜醇脂质上的两个磷酸残基。例如，α3甘露糖基转移酶Alg3修饰N-聚糖的Dol-P-P-寡糖前体。一般情况下，本文所描述的聚糖结构是末端聚糖结构，其中非还原性残基不被其他的一个或多个单糖残基修饰。
如本文所使用的“糖蛋白”是指连接至聚糖的肽或多肽。聚糖可以在共翻译或翻译后的修饰中连接于肽或多肽上。
如本文所使用的“糖脂”是指连接到聚糖上的脂质并包括甘油糖脂、鞘糖脂和糖基磷脂酰肌醇。
如整个本公开中所使用的，糖脂和碳水化合物的命名基本上是根据由IUPAC-IUB生物化学命名委员会的推荐(例如Carbohydrate Res.1998，312，167；CarbohydrateRes.1997，297，1；Eur.J.Biochem.1998，257，29)。假定Gal(半乳糖)、Glc(葡萄糖)、GlcNAc(N-乙酰葡糖胺)、GalNAc(N-乙酰半乳糖胺)、Man(甘露糖)和Neu5Ac是D-构型的，Fuc是L-构型的，且所有单糖单元为吡喃糖形式(D-Galp、D-Glcp、D-GlcpNAc、D-GalpNAc、D-Manp、L-Fucp、D-Neup5Ac)。胺基团是如对于天然半乳糖和GalNAc或GlcNAc的2-位上的葡糖胺限定的。糖苷键部分地以较短的命名表示，部分地以较长的命名表示，唾液酸SA/Neu5X-残基α3和α6的意思分别与α2-3和α2-6相同，并且对于己糖的单糖残基，α1-3、α1-6、β1-2、β1-3、β1-4和β1-6可以分别缩写为α3、α6、β2、β3、β4和β6。乳糖胺是指Ⅱ型N-乙酰基乳糖胺、Galβ4GlcNAc和/或Ⅰ型N-乙酰基乳糖胺，Galβ3GlcNAc，且唾液酸(SA)是指N-乙酰基神经氨酸(Neu5Ac)、N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)或任何其它天然的唾液酸，包括Neu5X的衍生物。唾液酸是指NeuNX或Neu5X，其中优选X是Ac或GC。有时Neu5Ac/Gc/X可被称为NeuNAc/NeuNGc/NeuNX。
本发明的重组蛋白质
本发明涉及具有N-乙酰葡糖胺基转移酶活性的重组蛋白质，其中该重组蛋白质催化N-乙酰葡糖胺转移到受体聚糖的末端Manα3残基和催化N-乙酰葡糖胺转移到末端Manα6残基上。本发明的重组蛋白质可以包括但不限于，具有N-乙酰葡糖胺基转移酶活性的全长蛋白质、具有N-乙酰葡糖胺基转移酶活性的蛋白质片段、具有N-乙酰葡糖胺基转移酶活性的催化结构域和具有N-乙酰葡糖胺基转移酶活性的融合蛋白质。本发明的单一重组蛋白质具有催化N-乙酰葡糖胺的两种转移的能力。N-乙酰葡糖胺转移到末端Manα3残基可以在N-乙酰葡糖胺转移到末端Manα6残基之前或之后发生。或者，该转移可以同时发生。
受体聚糖可以连接到如氨基酸、肽或多肽的分子上。在某些实施方式中，所述氨基酸为天冬酰胺残基。天冬酰胺残基可以由侧链酰胺形成氨基糖苷键(生物的哺乳动物多肽N-聚糖连接结构)，并可以是肽链(如二肽、寡肽或多肽)的部分。聚糖可以是还原性末端的衍生物如还原性GlcNAc或Man的N-、O-或C-连接的(优选的糖苷的)衍生物，例如具有某些聚糖连接结构(选自于氨基酸、烷基、杂烷基、酰基、烷氧基、芳基、芳基烷基或杂芳基烷基)的间隔体或末端有机残基。间隔体还可以连接到多价载体或固相上。在某些实施方式中，含烷基的结构包括：甲基、乙基、丙基和C4-C26烷基、脂质如甘油脂质、磷脂、多萜醇磷脂和神经酰胺及衍生物。还原性末端还可以通过还原性胺化为仲胺连接或衍生结构而衍生化。某些载体包括生物多聚-或寡聚物，如(多)肽、多糖如葡聚糖、纤维素、直链淀粉或葡糖胺聚糖和其它有机聚合物或低聚物，如塑料，包括聚乙烯、聚丙烯、聚酰胺(例如，尼龙或聚苯乙烯)、聚丙烯酰胺和聚乳酸、树状聚合物如PAMAM、星型聚合物或海星树状聚合物或聚赖氨酸及聚烷基二醇如聚乙二醇(PEG)。固相可以包括微量滴定孔、二氧化硅颗粒、玻璃、金属(包括钢、金和银)，聚合物珠粒如聚苯乙烯或树脂珠、聚乳酸珠、聚糖珠或含有磁珠的有机间隔物。
在某些实施方式中，受体聚糖被连接到异源多肽。如本文所使用的“肽”和“多肽”是包括多个连续聚合的氨基酸残基的氨基酸序列。通常情况下，对于本发明来说，肽是包括最多50个氨基酸残基的那些分子，以及多肽包括超过50个氨基酸残基。肽或多肽可以包括修饰的氨基酸残基、不被密码子所编码的天然存在的氨基酸残基以及非天然存在的氨基酸残基。如本文所使用的“蛋白质”可以指任何大小的肽或多肽。术语“异源多肽”是指不是在给定宿主细胞中天然发现的，或对于给定的宿主细胞不是内源性的多肽。在某些实施方式中，异源多肽是治疗性蛋白质。例如，治疗性蛋白质可包括单克隆抗体、促红细胞生成素、干扰素、生长激素、酶或凝血因子。例如，受体聚糖可以连接到治疗性蛋白质如利妥昔单抗上。
受体聚糖
在某些实施方式中，受体聚糖的结构具有下式：[R1]yManα3([R2]zManα6)Man{β4GlcNAc(Fucαx)n[β4GlcNAc]m}q，其中q、y、z、n和m是0或1；x是任选的海藻糖残基的连接位3或6；R1是GlcNAc，优选GlcNAcβ2；和R2是分支结构的Manα3(Manα6)，条件是当z是1时，则y为0，和当z为0时，则y为0或1。()限定在正则的N-聚糖核心结构中的分支，其存在或不存在。[]和{}限定线性序列中存在或不存在的聚糖结构的部分。当z是0和y是0时，那么该结构是Man3聚糖，和当z是0和y是1时，该结构是GlcNAcMan3聚糖。当y为0和z为1时，该聚糖是Man5聚糖。受体聚糖可以β-糖苷连接到Asn残基上，优选从还原性末端GlcNAc。在一个实施方式中，受体聚糖是多肽连接的N-聚糖，其中m和q是1，且受体结构包含[R1]yManα3([R2]zManα6)Manβ4GlcNAc(Fucαx)nβ4GlcNAc的衍生物。任选的衍生物包括单糖残基如GlcNAc或木糖的取代。
受体聚糖可以是Man3、GlcNAcMan3或Man5。在某些实施方式中，受体聚糖是Man3或GlcNAcMan3。Man3是三甘露糖基的聚糖，其包含至少一个Manα3或Manα6残基，和优选是支链寡糖，如Manα3(Manα6)Man。其他的某些Man3寡糖是Manα3(Manα6)Manβ、Manα3(Manα6)Manβ4GlcNAc和多肽连接的Manα3(Manα6)Manβ4GlcNAcβ4GlcNAc。此外，根据宿主细胞的不同，聚糖可以在Man和/或GlcNAc残基中包含Fuc、Xyl或GlcNAc，如Manα3(Manα6)Manβ4GlcNAcβ4(Fucαx)nGlcNAc，其中x是3或6和n是0或1，也由指明了末端甘露糖结构和还原性末端成的单糖组成式如Man3GlcNAc2(n为0)和Man3GlcNAc2Fuc(n是1)描述。在某些实施方式中，特别是那些具有多肽连接结构的，Man3结构是Manα3(Manα6)Manβ4GlcNAcβ4(Fucα6)nGlcNAc。在某些实施方式中，多肽连接的GlcNAcMan3的结构是GlcNAcβ2Manα3(Manα6)Manβ4GlcNAcβ4(Fucα6)nGlcNAc，也由单糖组成式GlcNAcMan3GlcNAc2(n为0)和GlcNAcMan3GlcNAc2Fuc(n为1)描述。在某些实施方式中，多肽连接的Man5结构是Manα3{Manα3(Manα6)Manα6}Manβ4GlcNAcβ4(Fucα6)nGlcNAc，其中{}和()表示分支和n为0或1，也由单糖组成式Man5GlcNAc2(n是0)和Man5GlcNAc2Fuc(n是1)描述。
因此，某些Man3聚糖具有根据下式的结构，Manα3(Manα6)Manβ4GlcNAc(Fucαx)nβ4GlcNAc，其中n是0或1，表示分子部分的存在或不存在，其中x是3或6，和其中()限定结构中的分支。在其中受体聚糖是Man3的本发明实施方式中，该重组蛋白质催化N-乙酰葡糖胺转移至Man3的末端Manα3和Manα6，从而产生GlcNAc2Man3，GlcNAcβ2Manα3(GlcNAcβ2Manα6)Manβ4GlcNAcβ4(Fucαx)nGlcNAc，其中n是0或1，也通过单糖组成式GlcNAc2Man3GlcNAc2(n为0)和GlcNAc2Man3GlcNAc2Fuc(n是1)来描述。
在其中受体聚糖是Man5的本发明实施方式中，重组蛋白质催化N-乙酰葡糖胺转移到Man5的末端Manα3。已经将2个甘露糖从GlcNAcMan5(例如，通过甘露糖苷酶II)移除而形成GlcNAcMan3后，该重组蛋白质催化N-乙酰葡糖胺转移到末端Manα6，因此形成GlcNAc2Man3(其具有结构GlcNAcβ2Manα3(GlcNAcβ2Manα6)Manβ4GlcNAcβ4(Fucαx)nGlcNAc，其中n是0或1，如果连接到抗体上也被称为G0)。
含有N-乙酰葡糖胺基转移酶催化结构域的融合蛋白质
在某些实施方式中，本发明的重组蛋白质含有N-乙酰葡糖胺基转移酶I催化结构域和N-乙酰葡糖胺基转移酶II催化结构域的融合蛋白质。术语“融合蛋白质”是指含有与异源氨基酸连接的蛋白质或多肽的任何蛋白质或多肽。
N-乙酰葡糖胺基转移酶I(GlcNAc-TI；GnTI；EC 2.4.1.101)催化反应UDP-N-乙酰 基-D-葡糖胺+3-(α-D-甘露糖基)-β-D-甘露糖基-R<＝>UDP+3-(2-(N-乙酰基-β-D-葡糖胺基)-α-D-甘露糖基)-β-D-甘露糖基-R，其中R代表聚糖受体中N-连接的寡糖的其余部分。N-乙酰葡糖胺基转移酶I催化结构域是能够催化该反应的N-乙酰葡糖胺基转移酶I酶的任何部分。SEQ ID NO：1-19中列出了来自各种生物体的N-乙酰葡糖胺基转移酶I酶的氨基酸序列。另外的GnTI酶在CAZy数据库中的糖基转移酶家族13(cazy.org/GT13_all)中列出。酶学特征性的种类包括拟南芥(A.thaliana)AAR78757.1(US6 653459)、秀丽隐杆线虫(C.elegans)AAD03023.1(Chen S.等J.Biol.Chem1999；274(1)：288-97)、黑腹果蝇(D.melanogaster)AAF57454.1(Sarkar和Schachter Biol Chem.2001 Feb；382(2)：209-17)、中国仓鼠(C.griseus)AAC52872.1(Puthalakath H.等J.Biol.Chem 1996 271(44)：27818-22)、智人(H.sapiens)AAA52563.1(Kumar R.等Proc Natl Acad Sci U S A.1990Dec；87(24)：9948-52)、金黄地鼠(M.auratus)AAD04130.1(Opat As等Biochem J.1998 Dec15；336(Pt 3)：593-8)，(包括失活突变体的例子)、兔，穴兔(O.cuniculus)AAA31493.1(Sarkar M等.Proc Natl Acad Sci U S A.1991 Jan 1；88(1)：234-8)。可以在cazy.org/GT13_characterized中找到特征性活性酶的其他例子。在Unligil UM等EMBO J.2000 Oct16；19(20)：5269-80中通过X-射线晶体学描述了兔GnTI的催化结构域的三维结构。GnTI的蛋白质数据库(PDB)结构是1FO8、1FO9、1FOA、2AM3、2AM4、2AM5和2APC。在某些实施方式中，N-乙酰葡糖胺基转移酶I催化结构域是来自人N-乙酰葡糖胺基转移酶I酶(SEQ ID NO：1)或其变异体。在某些实施方式中，N-乙酰葡糖胺基转移酶I催化结构域包含与SEQ ID NO：1的氨基酸残基84-445至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的序列。在一些实施方式中，可以使用较短的序列作为催化结构域(如人类酶的氨基酸残基105-445或兔子的酶的氨基酸残基107-447；Sarkar等(1998)Glycoconjugate J 15：193-197)。可以用作GnTI催化结构域的另外的序列包括来自人类酶的大致氨基酸30至445的氨基酸残基或者在氨基酸残基30至105之间开始并延续至人类酶的大致氨基酸445的任何C-末端非催化结构域，或者另一个GnTI的相应同源序列或其催化活性的变异体或突变体。催化结构域可以包括酶的N-末端部分例如非催化结构域、跨膜结构域或胞质结构域的全部或部分。
如本文所使用的“胞质的”是用来指与细胞的细胞质相互作用的蛋白质的部分。
N-乙酰葡糖胺基转移酶II(GlcNAc-TII；GnTII；EC 2.4.1.143)催化反应UDP-N-乙 酰基-D-萄糖胺+6-(α-D-甘露糖基)-β-D-甘露糖基-R<＝>UDP+6-(2-(N-乙酰基-β-D-葡糖胺基)-α-D-甘露糖基)-β-D-甘露糖基-R，其中R代表聚糖中N-连接的寡糖的其余部分。N-乙酰葡糖胺基转移酶II催化结构域是能够催化该反应的N-乙酰葡糖胺基转移酶Ⅱ酶的任何部分。SEQ ID NO：20-33中列出了来自各种生物体的N-乙酰葡糖胺基转移酶II酶的氨基酸序列。在某些实施方式中，N-乙酰葡糖胺基转移酶II催化结构域是来自人类N-乙酰葡糖胺基转移酶Ⅱ酶(SEQ ID NO：20)。另外的GnTII种类在CAZy数据库中糖基转移酶家族16(cazy.org/GT16_all)中列出。酶学特征性种类包括，秀丽隐杆线虫、黑腹果蝇、智人、褐家鼠(Rattus norvegigus)、野猪(Sus scrofa)(cazy.org/GT16_characterized)的GnTII。在某些实施方式中，N-乙酰葡糖胺基转移酶II催化结构域包含与SEQ ID NO：21的氨基酸残基大致30至大致447至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的序列。催化结构域可以包括酶的N-末端部分例如非催化结构域、跨膜结构域或胞质结构域的全部或部分。
在某些实施方式中，N-乙酰葡糖胺基转移酶I催化结构域处于N-乙酰葡糖胺基转移酶II催化结构域的N-末端。在其它的实施方式中，N-乙酰葡糖胺基转移酶II催化结构域处于N-乙酰葡糖胺基转移酶I催化结构域的N-末端。术语“N-末端”是指与一组参照的氨基酸残基相比更接近以具有游离氨基(-NH2)的氨基酸结尾的多肽末端的一组氨基酸残基的定位。
间隔区
在本发明的某些实施方式中，该重组蛋白质包含在N-乙酰葡糖胺基转移酶I催化结构域和N-乙酰葡糖胺基转移酶II催化结构域之间间隔区。术语“间隔区”是指分隔N-乙酰葡糖胺基转移酶I催化结构域和N-乙酰葡糖胺基转移酶II催化结构域的任何序列的任何数目的连续氨基酸，使得该间隔区对催化结构域的酶学功能没有影响。通常，该间隔区为至少5、至少10、至少15、至少20、至少30、至少40或至少50个氨基酸长度。在某些实施方式中，间隔区包含来自非催化结构域的序列。“非催化结构域”是指其位置邻近天然酶如糖基转移酶或糖基水解酶的跨膜结构域和任选地将酶靶向于或协助酶保留在ER/高尔基体中的蛋白质结构域或其片段。非催化结构域一般从疏水性跨膜结构域之后的第一个氨基酸开始，且结束于催化结构域。示例性的非催化结构域包括但不限于，人GnTI的非催化结构域，人GnTII的从约30至约83或约30至约105的氨基酸残基，或里氏木霉KRE2的从约26至约106或从约26至约83的氨基酸残基。在其中间隔区包含来自非催化结构域的序列的某些实施方式中，间隔区包括人GnTI序列的氨基酸30-83(SEQ ID NO：34)。在其它实施方式中，间隔区可以包括SEQ ID NO：35-38中所列出的任何序列。
合适的间隔区的另外的例子包括但不限于，柔性间隔区3XG4S(SEQ ID NO：118)、柔性间隔区2XG4S(SEQ ID NO：120)、里氏木霉CBHI的间隔区(SEQ ID NO：122)以及里氏木霉EGIV纤维素酶的间隔区(SEQ ID NO：124)。
在某些实施方式中，间隔区的长度与GnTI非催化结构域的长度大致相同。在某些实施方式中，该长度为约74个氨基酸残基，加或减约37个氨基酸。例如，间隔区的长度是约30个氨基酸至约110个氨基酸，或从约35个氨基酸至约100个氨基酸，或如本文所描述的实施例中所示例的，加上或减去2、3、4或5个氨基酸。在一个实施方式中，间隔区长度与截短的GnTI非催化结构域相对应，例如，从氨基酸25至氨基酸104，或在氨基酸30到氨基酸101之间开始，到GnTI非催化结构域的末端。在某些实施方式中，间隔区可以包括人GnTI非催化结构域的部分，其可以从位于氨基酸70至氨基酸87(根据SEQ ID NO：34中的编号)之间或氨基酸76和氨基酸104之间的氨基酸开始，或者从氨基酸30、35、40、45、50、60、70、73、74、75、76、80、83、84、85、86、87、100、101、102、103或104开始，至人GnTI非催化结构域的末端。在其它实施方式中，间隔区可以包括异源的间隔肽，其可以包括真菌的间隔肽和/或重复的寡聚间隔肽。
通常，间隔区是没有特定构象的细长的肽，并包含允许高灵活性(例如，甘氨酸和丙氨酸)、亲水性(例如，丝氨酸和苏氨酸)的氨基酸残基及任选的阻止构象的脯氨酸。间隔区可以被糖基化。在某些实施方式中，间隔区是被O-糖基化，包括真菌O-甘露糖基化。在某些实施方式中，间隔区是内源性真菌、丝状真菌或木霉属的间隔肽，如天然地分隔蛋白结构域的间隔区。间隔区可以衍生自真菌，如丝状真菌(例如，里氏木霉)的分泌的或纤维素水解酶、其片段，或间隔区的多聚体和/或它的片段或其突变的同源物或等同物。天然的真菌间隔区可以含有二聚的或低聚的脯氨酸和/或甘氨酸和/或丝氨酸和/或苏氨酸，和/或选自于丝氨酸、苏氨酸、甘氨酸、脯氨酸或丙氨酸的多个氨基酸残基或它们的任意组合。在某些实施方式中，间隔区是重复的寡聚物，其含有具有1-10或1-5个氨基酸残基(选自于丝氨酸、苏氨酸、甘氨酸、脯氨酸或丙氨酸且任选地为选自于带负电荷的残基谷氨酸或天冬氨酸或带正电荷的残基赖氨酸或精氨酸的带电氨基酸残基)的单体。在某些实施方式中，带电的残基是带负电荷的。在某些实施方式中，该单体包含二聚或寡聚的氨基酸残基，和/或选自于丝氨酸、苏氨酸、甘氨酸、脯氨酸和丙氨酸的多个单一氨基酸残基。在某些实施方式中，寡聚物包含甘氨酸的二聚物或寡聚物的单体以及选自于丝氨酸、苏氨酸、甘氨酸、脯氨酸或丙氨酸的单一残基。在某些实施方式中该单一残基是丝氨酸或苏氨酸。在某些实施方式中，该残基是丝氨酸。在某些实施方式中，重复间隔区的序列是{(Yyy)nXxx}m，其中n是2-10，m是2-10，且Xxx和Yyy选自于丝氨酸、苏氨酸、甘氨酸、脯氨酸和丙氨酸，条件是Xxx和Yyy不是相同的氨基酸残基。在某些实施方式中，重复间隔区是{(Gly)nXxx}m，其中n是2-10，m是2-10，和Xxx选自于丝氨酸、苏氨酸、甘氨酸、脯氨酸和丙氨酸。在某些实施方式中，Xxx是丝氨酸或苏氨酸。在某些实施方式中，Xxx是丝氨酸。
靶向肽
在某些实施方式中，本发明的重组蛋白质包括连接到催化结构域的靶向肽。本文所用的术语“连接的”意思是对于多肽而言的氨基酸残基的两个聚合物或对于多核苷酸而言的核苷酸的两个聚合物或者彼此直接相相邻地偶联，或者处于同一多肽或多核苷酸中但被介于其间的氨基酸残基或核苷酸分隔。本文所用的“靶向肽”是指重组蛋白质的任何数目的连续氨基酸残基，其能够使重组蛋白质定位在宿主细胞内的内质网(ER)或高尔基器(Golgi)中。靶向肽可以是催化结构域的N-末端或C-末端。在某些实施方式中，该靶向肽是催化结构域的N-末端。在某些实施方式中，靶向肽提供与ER或高尔基体成分例如与甘露糖苷酶Ⅱ酶的结合。在其它实施方式中，靶向肽提供与内质网或高尔基体膜的直接结合。
靶向肽的部件可以来自通常驻留在ER或高尔基器中的任何酶。这样的酶包括甘露糖苷酶、甘露糖基转移酶、糖基转移酶、2型高尔基体蛋白质及MNN2、MNN4、MNN6、MNN9、MNN10、MNS1、KRE2、VAN1和OCH1酶。这样的酶可以来自酵母或真菌物种，例如枝顶孢属、曲霉属、短梗霉属、隐球菌属、金孢子菌属、Chrysosporium lucknowense、线黑粉酵母属、镰孢菌属、赤霉属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、漆斑菌属、新考马脂霉属、脉孢霉属、拟青霉属、青霉属、瘤胃壶菌属、裂褶菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属和木霉属。这类酶的序列可以在GenBank序列数据库中找到。
在某些实施方式中，靶向肽来自与重组蛋白质的催化结构域之一相同的酶和生物体。例如，如果该重组蛋白质包括人GnTII催化结构域，重组蛋白质的靶向肽是来自人GnTII酶。在其它实施方式中，靶向肽可以来自与重组蛋白质的催化结构域不同的酶和/或生物体。
可以在靶向本发明的重组蛋白质中使用的用于将蛋白质靶向于内质网或高尔基体的各种靶向肽的实例包括：与半乳糖基转移酶融合的Kre2/Mnt1 N-末端肽(Schwientek，JBC 1996，3398)、用于甘露糖苷酶定位至酵母细胞的ER以产生Man5的UDEL(Chiba，JBC1998，26298-304；Callewaert，FEBS Lett 2001，173-178)、与GnTI催化结构域融合的OCH1靶向肽(Yoshida等，Glycobiology 1999，53-8)、与α2-甘露糖苷酶融合的Mns1的酵母N-末端肽(Martinet等，Biotech Lett1998，1171)、与GnTI或β4GalT的催化结构域连接的Kre2的N-末端部分(Vervecken，Appl.Environ Microb 2004，2639-46)，各种方法综述于Wildt和Gerngross(Nature Rev Biotech 2005，119)、构巢曲霉中的全长GnTI(Kalsner等，Glycocon.J 1995，360-370)、米曲霉中的全长GnTI(Kasajima等，Biosci Biotech Biochem2006，2662-8)、曲霉属中与秀丽隐杆线虫GnTI融合的酵母Secl2定位结构的部分(Kainz等2008)、曲霉属中与人GnTI融合的酵母Mnn9的N末端部分(Kainz等2008)、与人GnTI融合的曲霉属Mnn10的N末端部分(Kainz等，Appl.Environ Microb 2008，1076-86)和里氏木霉中的全长人GnTI(Maras等，FEBS Lett 1999，365-70)。
在某些实施方式中，靶向肽是具有SEQ ID NO：115或SEQ ID NO：116的氨基酸序列的Kre2/Mnt1(即，Kre2)靶向肽。
可用于靶向肽的序列的其它例子包括在下面的表1中列出的序列。
表1：靶向肽。下划线是推定的跨膜结构域。在KRE2中，下划线和双下划线是能够实现高尔基体定位的非催化结构域。Other01和Other02是推定的甘露糖基化相关蛋白质。
可以通过在宿主细胞中按糖基化途径表达蛋白质(其中蛋白质之一包含作为唯一的靶向肽的非特征性序列)和测量基于聚糖生物合成的胞质定位产生的聚糖(例如，如Schwientek JBC 1996 3398中)，或通过表达与靶向肽融合的荧光报道蛋白质和利用免疫荧光或分级高尔基体的胞质膜和测量蛋白质的定位来分析蛋白质在高尔基体中的定位而测试非特征性序列用作靶向肽。
靶向肽可以包括非催化结构域。在某些实施方式中，非催化结构域来自N-乙酰葡糖胺基转移酶Ⅰ酶或N-乙酰葡糖胺基转移酶II酶。特别是在某些实施方式中，非催化结构域来自人N-乙酰葡糖胺基转移酶Ⅰ酶或人N-乙酰葡糖胺基转移酶Ⅱ酶。与来自人N-乙酰葡糖胺基转移酶Ⅰ酶的非催化结构域对应的序列是SEQ ID NO：34。与来自人N-乙酰葡糖胺基转移酶Ⅱ酶的非催化结构域对应的序列是SEQ ID NO：20的残基30-85。
靶向肽可以包括跨膜结构域。“跨膜结构域”是指以三维结构在膜中热力学稳定的氨基酸残基的任何序列。在其中靶向肽还包括非催化结构域的实施方式中，跨膜结构域处于非催化结构域的N-末端。在某些实施方式中，跨膜结构域来自N-乙酰葡糖胺基转移酶Ⅰ酶或N-乙酰葡糖胺基转移酶Ⅱ酶。特别地在某些实施方式中，跨膜结构域来自人N-乙酰葡糖胺基转移酶I酶或人N-乙酰葡糖胺基转移酶II酶。与来自人N-乙酰葡糖胺基转移酶Ⅰ酶的跨膜结构域对应的序列是SEQ ID NO：1的残基7-29。与来自人N-乙酰葡糖胺基转移酶Ⅱ酶的跨膜结构域对应的序列是SEQ ID NO：20的残基10-29。
靶向肽可以包括胞质结构域。术语“胞质结构域”指在细胞质环境中作为三维结构体热力学稳定的氨基酸序列。在其中靶向肽还包括非催化结构域的实施方式中，胞质结构域处于非催化结构域的N-末端。在其中靶向肽还包括跨膜结构域的实施方式中，胞质结构域处于跨膜结构域的N-末端。在某些实施方式中，胞质结构域来自N-乙酰葡糖胺基转移酶Ⅰ酶或N-乙酰葡糖胺基转移酶Ⅱ酶。特别地在某些实施方式中，胞质结构域来自人N-乙酰葡糖胺基转移酶Ⅰ酶或人N-乙酰葡糖胺基转移酶Ⅱ酶。与来自人N-乙酰葡糖胺基转移酶Ⅰ酶的胞质结构域对应的序列是SEQ ID NO：1的残基1-6。与来自人N-乙酰葡糖胺基转移酶Ⅱ酶的胞质结构域对应的序列是SEQ ID NO：20的残基1-9。
在某些实施方式中，该重组蛋白质包含人GnTI催化结构域N末端的人GnTII催化结构域，在催化结构域之间具有包含人GnTI非催化结构域序列的间隔区序列。在本实施方式中，该重组蛋白质还包括GnTII催化结构域N-末端的靶向肽，具有来自人GnTII的胞质结构域、跨膜结构域和非催化结构域。在本实施方式中的重组蛋白质的序列与SEQ ID NO：95至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同，且编码此实施方式的重组蛋白质的可能cDNA的序列是SEQ IDNO：96。
在其它实施方式中，该重组蛋白质包含具有间隔区序列的人GnTI催化结构域N-末端的人GnTII催化结构域。间隔区序列可以包括但不限于，与SEQ ID NO：118、120、122或124至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的序列。在本实施方式中，重组蛋白质还包括GnTII催化结构域N末端的靶向肽，具有来自人GnTII的胞质结构域、跨膜结构域和非催化结构域。因此，在某些实施方式中，该重组蛋白质的序列与选自于SEQ ID NO：119、121、123和125的序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同。在某些实施方式中，编码SEQ ID NO：119的重组蛋白质的可能的cDNA序列是SEQ ID NO：141。在其它实施方式中，编码SEQ ID NO：121的重组蛋白质的可能的cDNA序列是SEQ ID NO：139。在再其它的实施方式中，编码SEQ ID NO：123的重组蛋白质的可能的cDNA序列是SEQ ID NO：143。在进一步的实施方式中，编码SEQ ID NO：125的重组蛋白质的可能的cDNA序列是SEQ ID NO：145。
本发明重组蛋白质的制备
本发明的另一个方面包括编码本发明的重组蛋白质的分离的多核苷酸。如本文所使用的术语“多核苷酸”、“核酸序列”、“核酸的序列”及其变型应当是多聚脱氧核糖核苷酸(含有2-脱氧-D-核糖)、多聚核糖核苷酸(含有D-核糖)、作为嘌呤或嘧啶碱基的N-糖苷的任何其它类型的多核苷酸以及包含非核苷酸骨架的其它聚合物(条件是该聚合物在构造中包含如在DNA和RNA中发现的允许碱基配对和碱基堆积的核碱基)的通称。因此，这些术语包括已知类型的核酸序列修饰，例如，用类似物代替一个或多个天然存在的核苷酸；核苷酸间修饰，例如，如具有不带电的连接(例如，甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)、具有带负电的连接(例如，硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯等)以及具有带正电的连接(例如，氨基烷基磷酰胺酰、氨基烷基磷酸三酯)的那些；含有侧基部分的那些，诸如，例如蛋白质(包括核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚-L-赖氨酸等)；带有嵌入剂(例如，吖啶，补骨脂素等)的那些；和含有螯合剂(例如金属、放射性金属、硼、氧化性金属等)的那些。如本文所用的核苷酸和多核苷酸的符号是由IUPAC-IUB生物化学命名委员会所推荐的(Biochem.9：4022，1970)。
分离的多核苷酸的序列通过本领域普通技术人员已知的任何合适的方法制备，包括例如，直接化学合成或克隆。对于直接化学合成，核酸聚合物的形成通常涉及3′-封闭和5′-封闭的核苷酸单体顺序添加到延长的核苷酸链的末端5′-羟基基团上，其中各次添加通过延长链的末端5′-羟基基团对添加的单体的3′-位的亲核攻击实现，添加的单体通常是磷衍生物，如磷酸三酯、亚磷酰胺等等。这样的方法是本领域普通技术人员已知的，并在相关的文本和文献中描述[例如，在Matteucci等，(1980)Tetrahedron Lett 21：719-722；4,500,707、5,436,327和5,700,637号美国专利中]。此外，可以从天然来源通过使用适当的限制性内切酶分裂DNA，用凝胶电泳分离片段，以及之后通过本领域普通技术人员已知的技术如利用聚合酶链反应(PCR，例如，4,683,195号美国专利)从凝胶中回收所需的核酸序列来分离所需的序列。
本发明的各个多核苷酸可以整合到表达载体中。“表达载体”或“载体”是指转导、转化或感染宿主细胞，从而使细胞表达该细胞天然的核酸和/或蛋白质以外的其它核酸和/或蛋白质，或以该细胞非天然的方式表达核酸和/或蛋白质的化合物和/或组合物。“表达载体”包含宿主细胞要表达的核酸(通常为RNA或DNA)的序列。任选地，所述表达载体还包含帮助核酸成功进入到宿主细胞中的材料，如病毒、脂质体、蛋白质包膜等等。设想本发明中使用的表达载体包括核酸序列可以与任何特定的或所需的操作元件一起插入其中的那些。此外，表达载体必须是可以被转移到宿主细胞中并在其中复制的表达载体。某些表达载体是质粒，特别是具有已经有记录的和包含核酸序列的转录必须的或所需的操作元件的限制性酶切位点的那些。这样的质粒以及其他的表达载体是本领域普通技术人员公知的。
单个多核苷酸的整合可以通过已知的方法完成，包括，例如，使用限制性内切酶(如BamHI、EcoRI、Hhal、Xhol、Xmal等等)来切割表达载体中，例如质粒中的特定位点。限制性内切酶产生可以与多核苷酸退火的单链末端，其中该多核苷酸具有或经合成以具有其序列与切割的表达载体的末端互补的末端。利用适当的酶，如DNA连接酶进行退火。正如在本技术领域普通技术人员将理解的，通常用相同的限制性内切酶切割表达载体和所需的多核苷酸，从而保证表达载体的末端与多核苷酸的末端是彼此互补的。此外，可以使用DNA接头以利于核酸序列连接到表达载体中。
也可以通过利用本领域普通技术人员已知的方法(例如，4,683,195号美国专利)组合一系列单个多核苷酸。
例如，可以首先在独立的PCR中产生各个所需的多核苷酸。此后，设计使得PCR产物的末端含有互补序列的特异性引物。当PCR产物混合、变性和复性时，在其3′末端具有匹配的序列的链重叠并可以作为彼此的引物。通过DNA聚合酶延伸该重叠产生其中原始序列“拼接”在一起的分子。以这种方式，一系列的单个多核苷酸可以“拼接”在一起，且随后同时转导入宿主细胞中。因此，实现多个多核苷酸中每一个的表达。
然后将单个的多核苷酸或“拼接的”多核苷酸整合到表达载体中。本发明对于多核苷酸整合到表达载体中的过程并没有限制。本领域的那些普通技术人员熟悉多核苷酸整合到表达载体中的必要步骤。典型的表达载体包含跟随一个或多个调节区的所需多核苷酸，以及核糖体结合位点，例如3-9个核苷酸长度的位于大肠杆菌中起始密码子上游3-11个核苷酸的核苷酸序列。参阅Shine和Dalgarno(1975)Nature254(5495)：34-38以及Steitz(1979)Biological Regulation and Development(ed.Goldberger，R.F)，1：349-399(Plenum，New York)。
在本文中所使用的术语“可操作地连接的”是指其中将控制序列相对于DNA序列或多核苷酸的编码序列置于适当的位置以使得控制序列指导多肽的表达的构型。
调控区域包括，例如，包含启动子和操纵子的那些区域。启动子可操作地连接到所需多核苷酸或者编码多肽的多核苷酸部分，从而通过RNA聚合酶启动多核苷酸或编码多肽的多核苷酸部分的转录。操纵子是邻近启动子的核酸序列，其包含阻遏蛋白可以结合的蛋白结合域。在不存在阻遏蛋白的情况下，通过启动子启动转录。当存在时，特异于操纵子的蛋白质结合域的阻遏蛋白与操纵子结合，从而抑制转录。以这种方式，根据所用的特定的调节区和相应的阻遏蛋白的存在或不存在实现对转录的控制。例子包括乳糖启动子(与乳糖接触时Lad阻遏蛋白的构象发生改变，从而阻止Lad阻遏蛋白结合到操纵子)和色氨酸启动子(当与色氨酸复合时，TrpR阻遏蛋白具有与操纵子结合的构象，在没有色氨酸时，TrpR阻遏蛋白具有不与操纵子结合的构象)。另一个例子是tac启动子(见de Boer等(1983)ProcNatl Acad Sci USA 80(1)：21-25)。正如本领域普通技术人员将理解的，这些和其他的调节区可以被用在本发明中，且本发明在这一方面并不受限。
用于与编码本发明的重组蛋白质的分离的多核苷酸连接的某些启动子的实例包括来自以下基因的启动子：gpdA、cbh1、米曲霉TAKA淀粉酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定α-淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、泡盛曲霉glaA、米黑根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶，构巢曲霉乙酰胺酶、米曲霉乙酰胺酶、尖孢镰刀菌胰蛋白样蛋白酶、真菌内切α-L-阿拉伯糖酶(abnA)、真菌α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶A(abfA)、真菌α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶B(abfB)、真菌木聚糖酶(xlnA)、真菌肌醇六磷酸酶、真菌ATP合成酶、真菌亚基9(oliC)、真菌磷酸丙糖异构酶(tpi)、真菌醇脱氢酶(adhA)、真菌α-淀粉酶(amy)、真菌淀粉葡萄糖苷酶(glaA)、真菌乙酰胺酶(amdS)、真菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gpd)、酵母醇脱氢酶、酵母乳糖酶、酵母3-磷酸甘油酸激酶、酵母磷酸丙糖异构酶、细菌α-淀粉酶、细菌Spo2和SSO。在某些实施方式中，编码本发明的重组蛋白质的分离的多核苷酸可操作地连接组成型启动子。在其它实施方式中，编码本发明的重组蛋白质的分离的多核苷酸可操作地连接诱导型启动子。在某些优选的实施方式中，诱导型启动子来自cbh1基因。
虽然任何合适的表达载体可用于整合所需的序列，容易得到的表达载体包括但不限于：质粒，如pSClO1、pBR322、pBBRlMCS-3、pUR、pEX、pMRlOO、pCR4、pBAD24、pUC19；噬菌体，如M13噬菌体和λ噬菌体。当然，这样的表达载体可能只适用于特定的宿主细胞。然而，本领域的普通技术人员可以通过常规实验很容易地确定任何特定的表达载体是否适合于任何给定的宿主细胞。例如，表达载体可以被引入到宿主细胞中，然后监测其戚力和载体中包含的序列的表达。此外，可以参照描述表达载体和其对任何特定宿主细胞的适用性的有关文章和文献。
本发明的另一个方面包括含有表达载体的宿主细胞，该表达载体包含编码本发明的重组蛋白质的分离的多核苷酸。本文所用的“宿主细胞”指可以通过插入重组的DNA或RNA被转化的活的生物细胞。这种重组DNA或RNA可以是在表达载体中。因此，如本文所述的宿主细胞可以是原核生物体(例如，真细菌界的生物体)或真核细胞。正如本领域的普通技术人员将理解的，原核细胞缺乏膜界定的核，而真核细胞具有膜界定的核。在某些实施方式中，用于制备本发明的重组蛋白质的宿主细胞是真菌细胞，如酵母或丝状真菌。在其它实施方式中，宿主细胞是哺乳动物细胞。这样的细胞可以是人的或非人类的。
本发明的另一个方面包括本发明的重组蛋白质的制备方法。该方法包括以下步骤：向宿主细胞中引入编码重组蛋白质的分离的多核苷酸，和培养该宿主细胞使其表达重组蛋白质。该方法还可以包括从宿主细胞纯化重组蛋白质的步骤。
本发明的重组蛋白质的制备方法可包括向宿主细胞中引入或转移含有本发明的重组多核苷酸的表达载体。这种用于向宿主细胞中转移表达载体的方法是本领域普通技术人员公知的。例如，用表达载体转化大肠杆菌的一种方法涉及氯化钙处理，其中表达载体通过钙沉淀引入。也可以按照类似的程序使用其它的盐，例如，磷酸钙。此外，电穿孔(即，应用电流以增加细胞对核酸序列的渗透性)可用于转染宿主细胞。此外，核酸序列的显微注射提供转染宿主细胞的能力。也可以采用其他方式，例如脂质复合物、脂质体和树状聚合物。本领域的那些普通技术人员可以使用这些或其他的方法用期望的序列转染宿主细胞。
载体可以是自主复制的载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体的复制，例如质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。该载体可以包含用于确保自我复制的任何工具。或者，载体可以是当其引入宿主中时被整合到基因组中并与它已经被整合到其中的染色体一起复制的载体。此外，也可使用单一载体或质粒或一起包含待引入到宿主的基因组中的总DNA的两个或多个载体或质粒，或转座子。
载体可以包含一种或多种选择标记，其使得容易地选择转化的宿主。选择标记是基因，其产物提供，例如，生物杀灭剂或病毒抗性、重金属抗性、营养缺陷型的原养型等等。细菌细胞的选择可以基于已通过基因，如amp、gpt、neo和hyg基因赋予的抗菌素抗性。
酵母宿主的适当标记是，例如，ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于丝状真菌宿主的选择标记包括但不限于，amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草胺膦乙酰基转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸盐还原酶)、pyrG(乳清苷5′-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸盐腺苷转移酶)和trpC(邻氨基苯甲酸合酶)以及它们的等同物。那些用于曲霉属中的是构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。那些用于木霉中的是bar、pyr4和amdS。
载体可以包含允许载体整合到宿主的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的元件。
对于整合入宿主基因组中，载体可以依赖于该基因的序列或用于通过同源或非同源重组使载体整合到基因组中的载体的任何其它元件。或者载体可以包含用于引导通过同源重组整合到宿主基因组中的另外的核苷酸序列。该另外的核苷酸序列使载体能够在染色体中的精确位置整合到宿主基因组中。为了增加在精确的位置整合的可能性，该整合元件可以包含足够数目的核酸，如100至10,000个碱基对，优选为400至10,000个碱基对，最优选为800至10,000个碱基对，其与相应的目标序列高度同源以提高同源重组的概率。整合元件可以是与宿主基因组中的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非编码的或编码的核苷酸序列。另一方面，载体可以通过非同源重组被整合到宿主基因组中。
对于自主复制，该载体可以进一步包含复制起点，其使载体能够在所述宿主中自主复制。复制起点可以是在细胞中发挥功能的介导自主复制的任何质粒复制子。在本文中定义的术语“复制起点”或“质粒复制子”是使质粒或载体能够体内复制的序列。用于酵母宿主中的复制起点的实例是2μ复制起点，ARS1，ARS4，ARS1和CEN3的组合，及ARS4和CEN6的组合。用于丝状真菌细胞中的复制起点的实例是AMA1和ANSI(Gems等，1991；Cullen等，1987；WO 00/24883)。根据WO 00/24883中公开的方法，可以完成AMAl基因的分离以及包含该基因的质粒或载体的构建。
对于其他宿主，可以，例如，对于克鲁维酵母(Kluyveromyces)在Jeremiah D.Read等，Applied and Environmental Microbiology，Aug.2007，p.5088-5096中，对于发酵单胞菌(Zymomonas)在OsvaldoDelgado等，FEMS Microbiology Letters 132，1995，23-26中，对于树干毕赤酵母(Pichia stipitis)在US 7,501,275中，和对于梭状芽孢杆菌(Clostridium)在WO 2008/040387中找到转化方法。
可以将多于一个拷贝的基因插入到宿主中来增加基因产物的产生。可以通过将至少一个附加的基因拷贝整合入宿主基因组中或通过在其中含有可通过在适当的选择剂存在下培养细胞进行选择的扩增拷贝的选择标记基因的细胞的情况下包含带有核苷酸序列的可扩增选择标记基因并因此包含附加的基因拷贝，来获得基因拷贝数的增加。
用于接合上述元件来构建本发明的重组表达载体所使用的程序是本领域技术人员公知的(参见，例如，Sambrook等人，1989，同上文)。
用至少一种表达载体转化宿主细胞。当只使用单一表达载体(不添加中间体)时，该载体将包含所有必要的核酸序列。
一旦已经用表达载体转化了宿主细胞，就使该宿主细胞生长。本发明的方法可包括培养所述宿主细胞，以使得在细胞中表达重组核酸。对于微生物宿主，这个过程导致在合适的培养基中培养细胞。通常情况下，细胞在35℃下在适当的培养基中生长。在本发明中某些生长培养基包括，例如，常见的市售的培养基，例如Luria-Bertani(LB)肉汤、SabouraudDextrose(SD)肉汤或酵母培养基(YM)肉汤。其它详细说明的或合成的生长培养基也可被使用，并且微生物学或发酵领域中的技术人员知道用于特定的宿主细胞生长的合适的培养基。适宜生长的温度范围和其他条件在本领域中是已知的(见，例如，Bailey和Ollis1986)。
从宿主细胞纯化本发明的重组蛋白质的方法在本领域中是众所周知的(见E.L.V.Harris和S.Angel，Eds.(1989)Protein Purification Methods：A PracticalApproach，IRL Press，Oxford，England)。这样的方法包括但不限于，制备型圆盘凝胶电泳、等电聚焦、高效液相色谱(HPLC)、反相HPLC、凝胶过滤、离子交换和分配色谱法以及逆流分配，以及它们的组合。在某些实施方式中，重组蛋白质带有额外的序列标记以便于纯化。这些标记包括表位标签和蛋白质标签。表位标签的非限制性实例包括：c-myc、血凝素(HA)、多聚组氨酸(6x-HIS)、GLU-GLU和DYKDDDDK(FLAG)(SEQ ID NO：117)表位标签。可以通过多种已建立的方法将表位标签添加到肽上。表位标签的DNA序列可以作为寡核苷酸或通过PCR扩增所用的引物插入到重组蛋白质编码序列中。作为替代方案，可以将多肽编码序列克隆到产生具有表位标签的融合体的特定载体中，例如，pRSET载体(Invitrogen Corp.，SanDiego，Calif)。蛋白标签的非限制性实例包括谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、绿色荧光蛋白(GFP)和麦芽糖结合蛋白(MBP)。通过一些公知的方法将蛋白质标签连接到肽或多肽。在一种方法中，多肽或肽的编码序列可以被克隆到产生多肽或肽与目标蛋白质标签之间的融合体的载体中。合适的载体包括，但不限于，示例性的质粒、pGEX(Amersham PharmaciaBiotech，Inc.，Piscataway，N.J.)、pEGFP(CLONTECH Laboratories，Inc.，Palo Alto，Calif)和pMAL.TM.(New England BioLabs，Inc.，Beverly，Mass.)。表达后，可通过在适当的固相基质上的色谱法从宿主细胞的粗分解产物中纯化表位或蛋白质标记的多肽或肽。在某些情况下，可能优选地在纯化后移除表位或蛋白质标签(即，通过蛋白酶切割)。
复合聚糖的制备方法
本发明的另一个方面包括复合的N-聚糖的制备方法，其包括以下步骤：提供宿主细胞，其中该宿主细胞包含编码融合蛋白质的多核苷酸，该融合蛋白质包含N-乙酰葡糖胺基转移酶I催化结构域和N-乙酰葡糖胺基转移酶II催化结构域，和培养该宿主细胞以表达融合蛋白质，其中融合蛋白质催化N-乙酰葡糖胺转移到受体聚糖的末端Manα3残基和N-乙酰葡糖胺转移到末端Manα6残基以产生复合的N-聚糖。在某些实施方式中，这一方面包括在木霉菌细胞中产生人样N-聚糖的方法。
如本文所使用的术语“复合的N-聚糖”是指含有末端GlcNAc2Man3结构的N-聚糖。
复合的N-聚糖包括具有下式的任何聚糖：[GlcNAcβ2]zManα3([GlcNAcβ2]wManα6)Man{β4GlcNAcβ(Fucαx)n[4GlcNAc]m}P，其中n、m和p是0或1，表示分子部分的存在或不存在，条件是当m为0时，则n是0(海藻糖是连接到GlcNAc的分支)，其中x是3或6，其中()限定结构中的分支，其中[]限定聚糖结构的部分，其以线性序列存在或不存在，和其中z和w是0或1。优选地，w和z是1。在某些实施方式中，在复合的N-聚糖包括GlcNAcβ2Manα3(GlcNAcβ2Manα6)Manβ4GlcNAcβ4GlcNAc、GlcNAcβ2Manα3(Manα6)Manβ4GlcNAcβ4GlcNAc、GlcNAcβ2Manα3(GlcNAcβ2Manα6)Manβ4GlcNAcβ4(Fucα6)GlcNAc、GlcNAcβ2Manα3(Manα6)Manβ4GlcNAcβ4(Fucα6)GlcNAc和Manα3(Manα6)Manβ4GlcNAcβ4GlcNAc。在某些实施方式中，复合的N-聚糖是真菌非岩藻糖基化GlcNAcMan3、GlcNAc2Man3和/或Man3。
在某些实施方式中，复合的N-聚糖的制备方法会产生不同聚糖的混合物。该复合的N-聚糖可以占到这样的聚糖混合物的至少1％、至少3％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少50％或至少75％或更多。
可将受体聚糖和因此复合的N-聚糖连接到分子如氨基酸、肽或多肽上。在某些实施方式中，氨基酸衍生物是天冬酰胺残基。该天冬酰胺残基可以为侧链酰胺的氨基糖苷键(生物的哺乳动物多肽N-聚糖连接结构)，并可以是如二肽、寡肽或多肽的肽链的部分。聚糖可以是还原末端衍生物如还原性GlcNAc或Man的N-、O-或C-连接的，优选糖苷的，衍生物，如具有选自于氨基酸、烷基、杂烷基、酰基、烷氧基、芳基、芳基烷基和杂芳基烷基的某一聚糖连接结构的间隔体或末端有机残基。间隔体可再连接至多价载体或固相上。在某些实施方式中，含烷基的结构包括甲基、乙基、丙基和C4-C26的烷基、脂质如甘油脂、磷脂、多萜醇-磷脂和神经酰胺及衍生物。还原性末端也可以通过还原胺化为仲胺连接或衍生结构来衍生化。特定载体包括生物多聚或者低聚体，例如(多)肽、聚(糖)如葡聚糖、纤维素、直链淀粉或葡糖胺聚糖，以及其他的有机聚合物或寡聚物如塑料，包括聚乙烯、聚丙烯、聚酰胺(如尼龙或聚苯乙烯)、聚丙烯酰胺和聚乳酸，树状聚合物如PAMAM、星形或海星形树状聚合物，或者聚赖氨酸，和聚烷基二醇类如聚乙二醇(PEG)。固相可以包括微滴定孔、二氧化硅颗粒、玻璃、金属(包括钢、金和银)、聚合物珠如聚苯乙烯或树脂珠、聚乳酸珠、聚糖珠或含有磁珠的有机间隔体。
在某些实施方式中，受体聚糖连接到异源多肽。在某些实施方式中，异源多肽是治疗性蛋白质。治疗性蛋白质可包括单克隆抗体、促红细胞生成素、干扰素、生长激素、酶或凝血因子，并可以用于人类或动物的治疗。例如，受体聚糖可以连接到治疗性蛋白，如利妥昔单抗。
该受体聚糖可以是在题为“本发明的重组蛋白质”一节中所述的任何受体聚糖。
在某些实施方式中，受体聚糖可以是Man5。在这样的实施方式中，使用随机整合或通过靶向整合到已知不影响Man5糖基化的已知位点用GnTII/GnTI融合酶转化表达Man5的里氏木霉菌株。选择产生GlcNAcMan5的菌株。用能够切割Man5结构以生成GlcNAcMan3的甘露糖苷酶II型甘露糖苷酶的催化结构域进一步转化选择的菌株。在某些实施方式中，甘露糖苷酶II型酶属于糖苷水解酶家族38(cazy.org/GH38_all.html)。特征性酶包括列在cazy.org/GH38_characterized.html中的酶。特别有用的酶是裂解糖蛋白的高尔基体型酶，如α-甘露糖苷酶II(Man2A1；ManA2)亚家族。这样的酶的实例包括人类酶AAC50302、黑腹果蝇酶(Van den Elsen J.M.等(2001)EMBO J.20：3008-3017)、具有根据PDB索引1HTY的三维结构的那些和指为具有PDB中催化结构域的其他酶。对于细胞质表达，甘露糖苷酶的催化结构域通常与N-末端靶向肽融合，或与动物或植物的甘露糖苷酶II酶的内源性动物或植物高尔基体靶向结构一起表达。用甘露糖苷酶II型甘露糖苷酶的催化结构域转化后，选择有效地产生GlcNAc2Man3的菌株。
宿主细胞
复合的N-聚糖的制备方法包括提供宿主细胞的第一步骤。只要在用核酸序列转化后保持存活力，任何原核或真核宿主细胞都可以在本发明中使用。优选地，所述宿主细胞不受必要的核酸序列转导、随后的重组蛋白质表达或者产生的中间体的不利影响。合适的真核细胞包括，但不限于，真菌、植物、昆虫或哺乳动物细胞。
在某些实施方式中，宿主是真菌菌株。本文所用的“真菌”包括子囊菌门、担子菌门、壶菌门和接合菌门(如Hawksworth等，In，Ainsworth and Bisby′s Dictionary of TheFungi，8th edition，1995，CAB International，University Press，Cambridge，UK所定义的)以及卵菌门(如Hawksworth等，1995，同上，171页中所提及的)和所有有丝分裂孢子真菌(Hawksworth等人，1995，同上)。
在具体的实施方式中，真菌宿主是酵母菌株。本文所用的“酵母”包括产子囊酵母(内孢霉目)、basidiosporogenous酵母和属于半知菌的酵母(芽孢纲(Blastomycetes))。由于酵母的分类可能在未来发生改变，为了本发明的目的，酵母应定义为如酵母的生物学和活性(Biology and Activities of Yeast)(Skinner，F.A.，Passmore，S.M.，和Davenport，R.R.，eds，Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9，1980)中所描述的。
在某些实施方式中，酵母宿主是念球菌属、汉逊酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母菌属、裂殖酵母属或耶罗威亚酵母菌株。
在某些实施方式中，酵母宿主为酿酒酵母、乳酸克鲁维酵母、毕赤酵母、白色念珠菌、多形汉逊酵母、裂殖酵母属或耶罗威亚酵母。
在另一具体实施方式中，真菌宿主细胞是丝状真菌菌株。“丝状真菌”包括真菌亚门和卵菌亚门(Hawksworth等，1995年，如前，所定义的)的所有丝状形式。丝状真菌一般特征是由几丁质、纤维素、葡聚糖、脱乙酰壳多糖、甘露聚糖和其它复合多糖组成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝伸长且碳分解代谢是专性好氧的。与此相反，酵母例如酿酒酵母的营养生长是通过单细胞菌体出芽且碳分解代谢可以是发酵的。
丝状真菌宿主细胞可以是，例如，枝顶孢属、曲霉属、镰孢菌属、腐质霉属、毛霉属、毁丝霉属、脉孢霉属、青霉属、柱霉属(Scytalidium)、梭孢壳属、弯颈霉属或木霉属菌株。
在某些实施方式中，丝状真菌宿主细胞是木霉菌、枝顶孢属、曲霉属、短梗霉属、隐球菌属、金孢子菌属、Chrysosporium lucknowense、线黑粉酵母属、镰孢菌属、赤霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、漆斑菌属、新考马脂霉属、脉孢霉属、拟青霉属、青霉属、瘤胃壶菌属、裂褶菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属和弯颈霉属菌株。
在某些实施方式中，宿主细胞是哺乳动物细胞。这样的细胞可以是人类的或非人类的。
在其他某些实施方式中，宿主细胞是原核的，并且在某些实施方式中，该原核生物是大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)、梭状芽孢杆菌、发酵植物多糖梭菌(Clostridium phytofermentans)、热纤梭菌(Clostridium thermocellum)、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、热醋穆尔氏菌(Moorella thermoaceticd)、Thermoanaerobacterium saccharolyticum或产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)。在其它实施方式中，原核宿主细胞是Carboxydocella sp.、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、菊欧文氏菌(Erwiniachrysanthemi)、乳杆菌属(Lactobacillus sp.)、乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)、荚膜红假单胞菌(Rhodopseudomonas capsulata)、乳酸链球菌(Streptococcus lactis)、弗尼斯弧菌(Vibrio furnissii)、弗尼斯弧菌M1、Caldicellulosiruptor saccharolyticus或野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)。在其他实施方式中，宿主细胞是蓝细菌。细菌宿主细胞的其他例子包括，但不限于，属于埃希氏菌属(Escherichia)、肠杆菌属、固氮菌(Azotobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、克雷伯菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)、志贺氏菌(Shigella)、根瘤菌(Rhizobia)、透明颤菌(Vitreoscilla)、聚球菌属(Synechococcus)、集胞藻(Synechocystis)和副球菌属(Paracoccus)的分类学分类的这些物种。
在本发明的制备复合N-聚糖的方法中，该方法包括培养宿主细胞使得该融合蛋白质表达的步骤。对于微生物宿主，这个过程需要在合适的培养基中培养所述细胞。通常，细胞在35℃下在适当的培养基中生长。在本发明中的某些生长培养基包括，例如，常见的市售的培养基，例如Luria-Bertani(LB)肉汤，沙氏葡萄糖(SD)肉汤或酵母培养基(YM)肉汤。其它详细说明的或合成的生长培养基也可被使用，并且微生物学或发酵领域中的技术人员知道用于特定的宿主细胞生长的合适的培养基。适宜生长的温度范围和其他条件在本领域中是已知的(见，例如，Bailey和Ollis 1986)。在某些实施方式中，细胞培养物的pH值是在3.5和7.5之间、在4.0和7.0之间、在4.5和6.5之间，在5和5.5之间或在5.5。
制备复合的N-聚糖的方法中使用的宿主细胞包含编码在如题为“本发明的重组蛋白质”一节中所述的本发明的任何重组蛋白质的多核苷酸。在某些实施方式中，该宿主细胞包含编码融合蛋白质的多核苷酸，该融合蛋白质包含N-乙酰葡糖胺基转移酶I催化结构域和N-乙酰葡糖胺基转移酶II催化结构域，其中融合蛋白质催化N-乙酰葡糖胺转移到受体聚糖的末端Manα3残基和N-乙酰葡糖胺转移到受体聚糖的末端Manα6残基以产生复合的N-聚糖。
在某些实施方式中，该宿主细胞包含编码UDP-GlcNAc转运蛋白的多核苷酸。编码UDP-GlcNAc转运蛋白的多核苷酸可以是对于宿主细胞内源性的(例如，天然存在的)，或者它可以是对于宿主细胞异源的。
在某些实施方式中，该宿主细胞包含编码α-1，2-甘露糖苷酶的多核苷酸。编码α-1，2-甘露糖苷酶的多核苷酸在宿主细胞中可以是内源性的，或者它可以是对于宿主细胞异源的。这些多核苷酸特别可用于表达从高尔基体转移到内质网的高甘露糖聚糖而没有有效的外切-α-2-甘露糖苷酶切割的宿主细胞。α-1，2-甘露糖苷酶可以是属于糖苷水解酶家族47(cazy.org/GH47_all.html)的甘露糖苷酶I型酶。在某些实施方式中，α-1，2-甘露糖苷酶是在cazy.org/GH47_characterized.html中列出的酶。特别地，α-1，2-甘露糖苷酶可以是切割糖蛋白的ER型酶，如ER α-甘露糖苷酶I EC 3.2.1.113酶亚家族中的酶。这样的酶的例子包括人α-2-甘露糖苷酶IB(AAC26169)、哺乳动物ER甘露糖苷酶的组合或丝状真菌酶如α-1，2-甘露糖苷酶(MDS1)(里氏木霉AAF34579；Maras M等J Biotech.77，2000，255)。对于胞质表达，甘露糖苷酶的催化结构域通常与靶向肽融合，如HDEL、KDEL或者ER或早期高尔基蛋白的部分，或与动物或植物甘露糖苷酶Ⅰ酶的内源性ER靶向结构一起表达。
在某些实施方式中，该宿主细胞包含编码半乳糖基转移酶的多核苷酸。半乳糖基转移酶将β-连接的半乳糖残基转移到末端N-乙酰葡糖胺残基上。在某些实施方式中，半乳糖基转移酶是β-4-半乳糖基转移酶。一般情况下，β-4-半乳糖基转移酶属于CAZy糖基转移酶家族7(cazy.org/GT7_all.html)，且包括β-N-乙酰葡糖胺基-糖肽β-1，4-半乳糖基转移酶(EC 2.4.1.38)，其也被称为N-乙酰乳糖胺合酶(EC2.4.1.90)。可用的亚家族包括β4-GalT1、β4-GalT-II、-III、-IV、-V和-VI，如哺乳动物或人β4-GalTI或β4-GalT-∏、-III、-IV、-V和-VI或它们的任意组合。β4-GalT1、β4-GalT-II或β4GalTIII对于N-聚糖(如GlcNAcMan3、GlcNAc2Man3或GlcNAcMan5)上末端GlcNAcβ2结构的半乳糖基化是特别有用的(Guo S.等Glycobiology 2001，11：813-20)。催化区域的三维结构是已知的(例如，(2006)J.Mol.Biol.357：1619-1633)，并且该结构已经在PDB数据库中用代码2FYD表示。CAZy数据库包括某些酶的实例。特征性的酶也在CAZy数据库中被列在cazy.org/GT7_characterized.html中。可用的β4GalT酶的实例包括β4GalT1，例如牛(Bos taurus)酶AAA30534.1(Shaper N.L.等Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83(6)，1573-1577(1986))、人类的酶(Guo S.等Glycobiology 2001，11：813-20)和小家鼠(Mus musculus)酶AAA37297(Shaper，N.L.等1998 J.Biol.Chem.263(21)，10420-10428)；β4GalT∏酶如人β4GalT∏BAA75819.1、中国仓鼠(Cricetulus griseus)AAM77195、小家鼠酶BAA34385和日本青锵鱼(Oryzias latipes)BAH36754；及β4-GalTIII酶，如人β4-GalTIIIBAA75820.1、中国仓鼠(Cricetulus griseus)AAM77196和小家鼠酶AAF22221。
半乳糖基转移酶可以在宿主细胞的细胞质中表达。可以使用异源靶向肽，如Schwientek，J.Biol.Chem 1996 3398中描述的Kre2肽。可用于半乳糖基转移酶表达的启动子包括组成型启动子如gpd，内源性糖基化酶和糖基转移酶(如在高尔基体或ER中合成N-聚糖的甘露糖基转移酶)的启动子，和高产率的内源性蛋白质的诱导型启动子，如cbh1启动子。
在其中宿主细胞包含编码半乳糖基转移酶的多核苷酸的本发明某些实施方式中，宿主细胞还包含编码UDP-Gal和/或UDP-Gal转运蛋白的多核苷酸。在其中宿主细胞包含编码半乳糖基转移酶的多核苷酸的本发明某些实施方式中，在培养宿主细胞时，乳糖可以代替葡萄糖用作碳源。培养基可以是在pH值4.5和7.0之间，或在5.0和6.5之间。在其中宿主细胞含有编码半乳糖基转移酶的多核苷酸和编码UDP-Gal和/或UDP-Gal转运蛋白的多核苷酸的本发明的某些实施方式中，二价阳离子如Mn2+、Ca2+或Mg2+可被加入到细胞培养基中。
在某些实施方式中，宿主细胞中含有编码唾液酸转移酶的多核苷酸。唾液酸转移酶将α3-或α6-连接的唾液酸，如Neu5Ac，转移到半乳糖基化的复合聚糖的末端Gal。合适的唾液酸转移酶的实例可以在糖基化蛋白家族29(cazy.org/GT29.html)中找到。可用的α3或α6-唾液酸转移酶包括β-半乳糖苷α-2，6-唾液酸转移酶(EC 2.4.99.1)与某些亚家族ST6Gal-I，和N-乙酰氨基乳糖苷α-2，3-唾液酸转移酶(EC2.4.99.6)，具有与β-半乳糖苷α-2，3-唾液酸转移酶(EC 2.4.99.4)的可能的交叉反应性。α3-唾液酸转移酶的可用亚型包括ST3Gal-III和ST3Gal-IV。它们的酶学特征性的种类如在糖基化酶的CAZy数据库中(cazy.org/GT29_characterized.html)中表征的进行列举。编码α3-或α6-连接的唾液酸转移酶的多核苷酸可能对于宿主细胞是内源性的，或者它可以对于宿主细胞是异源的。宿主细胞中的唾液酸化作用可能需要合成供体CMP-唾液酸如CMP-Neu5Ac的酶的表达，特别是在真菌、植物、线虫/寄生虫或昆虫细胞中。
宿主细胞可以具有提高的或降低的各种内源酶的活性水平。活性水平降低可以通过用抑制剂、抗体等抑制内源性酶的活性来提供。在某些实施方式中，宿主细胞被遗传修饰来提高或降低各种内源性酶的活性。“遗传修饰的”是指用于建立以提高的水平、降低的水平或以突变的形式表达多肽的原核或真核宿主细胞的任何重组DNA或RNA方法。换句话说，宿主细胞已经用重组多核苷酸分子转染、转化或转导，并由此被改变以使得该细胞改变所需蛋白质的表达。
导致基因或基因产物导致基因表达、基因的功能或基因产物(即，由该基因编码的蛋白质)的功能降低的遗传修饰可被称为基因的灭活(完全或部分)、缺失、干扰、堵断、沉默或下调或表达的减弱。例如，导致该基因所编码的蛋白质的功能降低的基因中的遗传修饰可以是基因完全缺失(即，该基因不存在，并因此该蛋白质不存在)、会导致蛋白质不完整或没有翻译(例如，蛋白质不表达)的基因突变或者减少或消除蛋白质天然功能(例如，表达具有降低的或没有酶活性或作用的蛋白质)的基因突变的结果。更具体地，涉及降低本文所讨论的蛋白质的作用一般是指所述宿主细胞中的任何遗传修饰，其导致蛋白质的表达和/或功能性(生物活性)的降低，并包括蛋白质的活性降低(例如，降低的催化作用)、增加蛋白质的抑制或降解以及蛋白质表达的减少或消除。例如，通过阻断或减少蛋白质的产生、降低蛋白质的作用或抑制蛋白质的作用可以降低本发明蛋白质的作用或活性。这些修饰中一些修饰的组合也是可能的。阻断或减少蛋白质的产生可以包括将编码该蛋白质的基因置于需要在生长培养基中存在诱导化合物的启动子的控制下。通过建立使得从培养基耗尽诱导剂的条件，编码蛋白质的基因的表达(和因此蛋白质的合成)可以被关闭。阻断或降低蛋白质的作用也可以包括使用切除技术的方法，其与4,743,546号美国专利中描述的相似。使用这种方法，编码目的蛋白质的基因被克隆到特定的基因序列之间，这使得基因从基因组中特异性地受控切除。可以通过例如培养物的培养温度的改变，如在4,743,546号美国专利中，或者通过其他一些物理或营养信号来引起切除。
一般来说，根据本发明，突变体或修饰蛋白质的给定特性(例如，酶活性)的增加或减少是参照来自于相同的生物体(来自相同的来源或亲本序列)的野生型(即，正常的，非修饰的)蛋白质的相同特性做出的，其是在相同或同等的条件下测定或建立的。同样地，遗传修饰的宿主细胞的特性的提高或降低(例如，蛋白质的表达和/或生物活性，或产物的产生)是参照同一物种且优选相同菌株的野生型宿主细胞在相同或同等的条件下的相同特性作出的。这些条件包括在蛋白质的活性(例如，表达或生物活性)或宿主细胞的其他特性进行测量的培养条件(例如，培养基成分、温度、pH值等)，以及使用的检测分析类型、被评估的宿主细胞等等。如上面所讨论的，等同条件是相似但并不一定是相同的(例如，可以耐受条件的一些保守性变化)的条件(例如，培养条件)，且与在相同条件下进行的操作相比，基本上不改变对细胞生长或者酶表达或生物活性的影响。
优选地，与在野生型宿主细胞中的野生型蛋白质的活性相比，具有提高或降低给定蛋白质(例如，酶)的活性的遗传修饰的遗传修饰宿主细胞分别具有蛋白质活性或作用(例如，表达，产生和/或生物活性)至少约5％、更优选至少约10％、更优选至少约15％、更优选至少约20％、更优选至少约25％、更优选至少约30％、更优选至少约35％、更优选至少约40％、更优选至少约45％、更优选至少约50％、更优选至少约55％、更优选至少约60％、更优选至少约65％、更优选至少约70％、更优选至少约75％、更优选至少约80％、更优选至少约85％、更优选至少约90％和更优选至少约95％，或者5％和100％之间的全部整数的任何百分比(例如6％、7％、8％等)的提高或降低。当将分离的修饰核酸分子或蛋白质直接与分离的野生型核酸分子或蛋白质进行比较时(例如，如果是在体外与体内进行比较)，相同的差异是特定的。
在本发明的另一个方面，与在野生型宿主细胞中的野生型蛋白质的活性相比，具有提高或降低给定蛋白质(例如，酶)的活性的遗传修饰的遗传修饰宿主细胞分别具有蛋白质活性或作用(例如，表达，产生和/或生物活性)至少约2倍、和更优选至少约5倍、和更优选至少约10倍、和更优选为约20倍、和更优选至少约30倍、和更优选至少约40倍、和更优选至少约50倍、和更优选至少约75倍、和更优选至少约100倍、和更优选至少约125倍和更优选至少约150倍，或者从至少约2倍开始的全部整数的任何增量(例如，3倍、4倍、5倍、6倍等)的提高或降低。
在某些实施方式中，与野生型宿主细胞中的活性水平相比，该宿主细胞具有降低的多萜醇基-P-Man:Man(5)GlcNAc(2)-PP-多萜醇基甘露糖基转移酶活性水平。多萜醇基-P-Man:Man(5)GlcNAc(2)-PP-多萜醇基甘露糖基转移酶(EC 2.4.1.130)将α-D-甘露糖残基从多萜醇-磷酸D-甘露糖转移到膜脂连接的寡糖。通常情况下，多萜醇基-P-Man:Man(5)GlcNAc(2)-PP-多萜醇基甘露糖基转移酶是由alg3基因所编码的。在某些实施方式中，与野生型宿主细胞中的表达水平相比，宿主细胞具有降低的alg3基因表达水平。在某些实施方式中，从宿主细胞中删除了alg3基因。
在某些实施方式中，与野生型宿主细胞中的活性水平相比，该宿主细胞具有降低的α-1，6-甘露糖基转移酶的活性水平。α-1，6-甘露糖基转移酶(EC 2.4.1.232)将α-D-甘露糖残基从GDP-甘露糖转移到蛋白质结合寡糖中，从而在高尔基器中形成产生α-(1-＞6)-D-甘露糖基-D-甘露糖的连接的伸长。通常情况下，α-1，6-甘露糖基转移酶由och1基因编码。在某些实施方式中，与野生型宿主细胞中的表达水平相比，宿主细胞具有降低的och1基因表达水平。在某些实施方式中，从宿主细胞中删除och1基因。
在某些实施方式中，该宿主细胞具有降低的蛋白酶活性水平。在某些实施方式中，从宿主细胞中删除编码各种蛋白酶的基因。这些基因包括，例如，基因编码蛋白酶如pepl(曲霉属中的pepA)和纤维素分解酶，如纤维二糖水解酶1(cbh1)。
在某些实施方式中，该宿主细胞可以具有降低的参与非同源末端连接(NHEJ)的蛋白质活性水平以提高同源重组的效率。在某些实施方式中，从宿主细胞中删除编码这些蛋白质的基因。该基因和它们的同源物包括，但不限于，在例如，Ninomiya等2004，Ishibashi等2006，Villalba等2008，和Mizutani等2008中所描述的Ku70、Ku80、Lig4、Rad50、Xrs2、Sir4、Lif1或Nei1。
在制备复合N-聚糖的方法的某些实施方式中，宿主细胞是木霉属的细胞，其与野生型的木霉属细胞中的活性水平相比，具有降低的多萜醇基-P-Man:Man(5)GlcNAc(2)-PP-多萜醇基甘露糖基转移酶的活性水平。
在制备复合N-聚糖的方法的其它某些实施方式中，宿主细胞是酵母细胞，其与野生型的酵母细胞中的活性水平相比，具有降低的多萜醇基-P-Man:Man(5)GlcNAc(2)-PP-多萜醇基甘露糖基转移酶的活性水平和降低的α-1，6-甘露糖基转移酶的活性水平，并且还包含编码α-1，2-甘露糖苷酶的多核苷酸。
制备复合的N-聚糖的体外方法
在另一个方面，本发明提供了复合的N-聚糖的制备方法，包括将包含N-乙酰葡糖胺基转移酶I催化结构域和N-乙酰葡糖胺基转移酶II催化结构域的融合蛋白质、受体聚糖及N-乙酰葡糖胺供体一起在缓冲液中孵育的步骤，其中所述融合蛋白质催化N-乙酰葡糖胺转移至受体聚糖的末端Manα3残基和N-乙酰葡糖胺转移到受体聚糖的末端Manα6残基以产生复合的N-聚糖。在某些实施方式中，受体聚糖被连接到氨基酸、肽或多肽。在某些实施方式中，受体聚糖被连接到异源多肽。在某些实施方式中，受体聚糖是Man3。在某些实施方式中，N-乙酰葡糖胺供体是UDP-GlcNAc转运蛋白。通常情况下，缓冲液包含浓度为1μM至100mM、100μM至50mM或0.1mM至25mM的二价阳离子，如Mn2+、Ca2+或Mg2+。通常使用过量摩尔的N-乙酰葡糖胺供体，如相对于受体聚糖上的反应性受体位点过量1.1-100倍。受体聚糖的浓度通常介于1μM至100mM、100μM至50mM或1至25mM之间。当受体聚糖被连接到多肽上时，因为其较高的分子量，浓度范围通常是在低端。可以根据其在缓冲液中的溶解度调节反应物组分的浓度。可以调节酶活性(单位)的量以允许在合理的反应时间内实现有效的反应。合理的反应时间通常是从数分钟至数天。在某些实施方式中，反应时间为从约0.5个小时至一天或从1至6个小时。
有用的缓冲液包括适用于融合蛋白质的缓冲液，如TRIS、HEPES、MOPS，pH值范围为约5至8.5、5.5至8.0或6.0和7.5。TRIS、HEPES或MOPS缓冲液的浓度通常在5至150mM之间，10-100mM之间或10-60mM之间，其经调节以维持该pH。可以通过加入盐如10-200mM的NaCl和/或稳定的酶但非可糖基化的蛋白质(例如，纯的非糖基化的聚糖或含有白蛋白的非受体聚糖)优化该反应。在一些实施方式中，体外反应经调节以在细胞培养基中进行。可以使用磷酸盐缓冲液以降低反应速度。
制备Man 3 GlcNAc 2 聚糖的细胞与方法
在另一个方面，本发明提供了含有alg3突变和Man3GlcNAc2的丝状真菌细胞，其中Man3GlcNAc2占由细胞分泌的中性N-聚糖的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％(摩尔％)。中性N-聚糖可连接到氨基酸、肽或多肽。可通过本领域中已知的任何手段突变alg3基因，如点突变或删除整个alg3基因。优选地，通过alg3的突变降低或消除alg3蛋白质的功能。丝状真菌细胞可以是枝顶孢属、曲霉属、短梗霉属、隐球菌属、金孢子菌属、Chrysosporium lucknowense、线黑粉酵母属、镰孢菌属、赤霉属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、漆斑菌属、新考马脂霉属、脉孢霉属、拟青霉属、青霉属、瘤胃壶菌属、裂褶菌属、柱霉属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属或木霉属的细胞。在某些实施方式中，丝状真菌细胞是里氏木霉细胞。在某些实施方式中，丝状真菌细胞进一步包含一个或多个编码任何本发明的重组蛋白质的多核苷酸。例如，丝状真菌细胞可以进一步含有编码N-乙酰葡糖胺基转移酶I催化结构域的第一多核苷酸和编码N-乙酰葡糖胺基转移酶II催化结构域的第二多核苷酸。或者，丝状真菌细胞可以进一步含有编码融合蛋白质的多核苷酸，其中该融合蛋白质包括N-乙酰葡糖胺基转移酶I催化结构域和N-乙酰葡糖胺基转移酶II催化结构域。
在再另一个方面中，本发明提供了在宿主细胞中制备Man3GlcNAc2聚糖的方法，包括以下步骤：提供与野生型宿主细胞中的活性水平相比具有降低的甘露糖基转移酶活性水平的宿主细胞，和培养该宿主细胞以产生Man3GlcNAc2聚糖，其中Man3GlcNAc2聚糖构成由宿主细胞分泌的中性N-聚糖的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％(摩尔％)。
该Man3GlcNAc2聚糖可以连接到分子如氨基酸、肽或多肽上。在某些实施方式中，所述氨基酸为天冬酰胺残基。天冬酰胺残基可以与侧链酰胺形成氨基糖苷连接(生物的哺乳动物蛋白质N-聚糖连接结构)，并可以是如二肽、寡肽或多肽的肽链的部分。聚糖可以是还原性末端衍生物如还原性GlcNAc或Man的N-、O-或C-连接的，优选的糖苷的，衍生物，例如具有某些选自于氨基酸、烷基、杂烷基、酰基、烷氧基、芳基、芳基烷基或杂芳基烷基的聚糖连接结构的间隔体或末端有机残基。间隔体还可以连接到多价载体或固相上。在某些实施方式中，含烷基的结构包括：甲基、乙基、丙基和C4-C26的烷基、脂质如甘油脂质、磷脂、长醇-磷脂和神经酰胺及衍生物。还原性末端还可以通过还原性胺化衍生为仲胺连接或衍生结构而衍生化。某些载体包括生物多聚-或低聚物，如(多)肽、多(糖)如葡聚糖、纤维素、直链淀粉或糖胺聚糖和其它有机聚合物或低聚物如塑料，包括聚乙烯、聚丙烯、聚酰胺(例如，尼龙或聚苯乙烯)、聚丙烯酰胺和聚乳酸、树状聚合物如PAMAM，星型聚合物或海星树状聚合物、或聚赖氨酸和聚烷基二醇如聚乙二醇(PEG)。固相可以包括微量滴定孔、二氧化硅颗粒、玻璃、包括钢、金和银的金属、如聚苯乙烯或树脂珠的聚合物珠粒、聚乳酸珠、多糖珠或含有磁珠的有机间隔体。
在某些实施方式中，Man3GlcNAc2聚糖连接到异源多肽上。在某些实施方式中，异源多肽是治疗性蛋白质。治疗性蛋白质可包括单克隆抗体、促红细胞生成素、干扰素、生长激素、酶或凝血因子，并且可以用于治疗人或动物。例如，Man3GlcNAc2聚糖可以连接到治疗性蛋白如利妥昔单抗上。通常情况下，将Man3GlcNAc2聚糖进一步修饰以成为复合的聚糖。这样的修改可以在宿主细胞中体内发生或通过体外的方法发生。
在某些实施方式中，甘露糖基转移酶是多萜醇基-P-Man:Man(5)GlcNAc(2)-PP-多萜醇基甘露糖基转移酶。通常情况下，多萜醇基-P-Man:Man(5)GlcNAc(2)-PP-多萜醇基甘露糖基转移酶是由alg3基因所编码的。在某些实施方式中，与野生型宿主细胞中的表达水平相比，宿主细胞具有降低的alg3基因的表达水平。在某些实施方式中，从宿主细胞中删除了alg3基因。SEQ ID NO：97和98分别提供了里氏木霉中的alg3基因的核酸序列和氨基酸序列。
在某些实施方式中，与野生型宿主细胞中的活性水平相比，该宿主细胞中的α-1，6-甘露糖基转移酶的活性水平没有降低。通常情况下，α-1，6-甘露糖基转移酶是由och1基因编码的。在某些实施方式中，该宿主细胞含有编码α-1，2-甘露糖苷酶的内源性多核苷酸。
在某些实施方式中，宿主细胞是木霉属的细胞，并在某些实施方式中，宿主细胞是里氏木霉细胞。
本发明的丝状真菌细胞
在进一步的方面中，本发明提供了丝状真菌细胞，其与野生型丝状真菌细胞中的alg3基因的表达水平相比，具有降低的本发明alg3基因的表达水平，其中该丝状真菌细胞还包含如题为“本发明的重组蛋白质”一节中所描述的任何本发明的重组蛋白质。例如，在某些实施方式中，丝状真菌细胞还含有编码融合蛋白质的多核苷酸，其中该融合蛋白质包括N-乙酰葡糖胺基转移酶I催化结构域和N-乙酰葡糖胺基转移酶II催化结构域。该融合蛋白质的表达可以受控于可操作地与所述多核苷酸连接的启动子。该启动子可以是组成型启动子或诱导型启动子。在某些优选的实施方式中，该启动子是诱导型启动子，如cbh1诱导型启动子。
在另一个方面，本发明提供的丝状真菌细胞与野生型丝状真菌细胞中的alg3基因的表达水平相比具有降低的本发明alg3基因的表达水平，其中该丝状真菌细胞还包含编码重组N-乙酰葡糖胺基转移酶I催化结构域的第一多核苷酸和编码重组N-乙酰葡糖胺基转移酶II催化结构域的第二多核苷酸。在这样的实施方式中，重组N-乙酰葡糖胺基转移酶I催化结构域的表达受可操作地与第一多核苷酸连接的启动子的控制，且重组N-乙酰葡糖胺基转移酶II催化结构域的表达受可操作地与第二多核苷酸连接的启动子的控制。启动子可以是组成型启动子或诱导型启动子。在某些优选的实施方式中，启动子是诱导型启动子，如cbh1诱导型启动子。
在其它实施方式中，单一多核苷酸可以同时编码重组N-乙酰葡糖胺基转移酶I催化结构域和重组N-乙酰葡糖胺基转移酶II催化结构域，使得它们表达为独立的多肽。在这样的实施方式中，所述多核苷酸可以含有允许从该多核苷酸单独翻译各个催化结构域的内部核糖体进入位点。在这样的实施方式中，重组N-乙酰葡糖胺基转移酶I催化结构域的表达受可操作地与编码N-乙酰葡糖胺基转移酶I催化结构域的多核苷酸部分连接的启动子的控制，且重组N-乙酰葡糖胺基转移酶II催化结构域的表达受可操作地与编码N-乙酰葡糖胺基转移酶II催化结构域的多核苷酸部分连接的启动子的控制。启动子可以是组成型启动子或诱导型启动子。在某些优选的实施方式中，启动子是诱导型启动子，如cbh1诱导型启动子。
如本文所公开的，N-乙酰葡糖胺基转移酶I(GlcNAc-TI；GnTI；EC 2.4.1.101)催化反应UDP-N-乙酰基-D-葡糖胺+3-(α-D-甘露糖基)-β-D-甘露糖基-R<＝>UDP+3-(2-(N-乙酰基-β-D-葡糖胺基)-α-D-甘露糖基)-β-D-甘露糖基-R，其中R代表聚糖受体中N-连接的寡糖的其余部分。N-乙酰葡糖胺基转移酶I催化结构域是能够催化该反应的N-乙酰葡糖胺基转移酶I酶的任何部分。来自各种生物体的N-乙酰葡糖胺基转移酶I酶的氨基酸序列在SEQ IDNO：1-19中列出。另外的GnTI酶在CAZy数据库中的糖基转移酶家族13(cazy.org/GT13_all)中列出。酶学特征性种类包括拟南芥AAR78757.1(US6 653 459)、秀丽隐杆线虫AAD03023.1(Chen S.等J.Biol.Chem 1999；274(1)：288-97)、黑腹果蝇AAF57454.1(Sarkar和Schachter Biol Chem.2001 Feb；382(2)：209-17)、中国仓鼠AAC52872.1(Puthalakath H.等J.Biol.Chem 1996 271(44)：27818-22)、智人AAA52563.1(Kumar R.等Proc Natl AcadSci U S A.1990 Dec；87(24)：9948-52)、金黄地鼠AAD04130.1(Opat As等Biochem J.1998Dec 15；336(Pt 3)：593-8)(包括失活突变体的例子)、兔，穴兔AAA31493.1(Sarkar M等.ProcNatl Acad Sci U S A.1991 Jan 1；88(1)：234-8)。可以在cazy.org/GT13_characterized中找到特征性活性酶的其他例子。在Unligil UM等EMBO J.2000 Oct 16；19(20)：5269-80中通过X-射线晶体学描述了兔GnTI的催化结构域的三维结构。GnTI的蛋白质数据库(PDB)结构是1FO8、1FO9、1FOA、2AM3、2AM4、2AM5和2APC。在某些实施方式中，N-乙酰葡糖胺基转移酶I催化结构域是来自人N-乙酰葡糖胺基转移酶I酶(SEQ ID NO：1)或其变异体。在某些实施方式中，N-乙酰葡糖胺基转移酶I催化结构域包含与SEQ ID NO：1的氨基酸残基84-445至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的序列。在一些实施方式中，可以使用较短的序列作为催化结构域(如人类酶的氨基酸残基105-445或兔子的酶的氨基酸残基107-447；Sarkar等.(1998)Glycoconjugate J 15：193-197)。可以用作GnTI催化结构域的另外的序列包括来自人类酶的大致氨基酸30至445的氨基酸残基或者在氨基酸残基30至105之间开始和延续至人类酶的大致氨基酸445的任何C-末端非催化结构域，或者另一个GnTI的相应同源序列或其催化活性的变异体或突变体。催化结构域可以包括例如非催化结构域、跨膜结构域或胞质结构域的全部或部分的酶的N-末端部分。
如本文所公开的，N-乙酰葡糖胺基转移酶II(GlcNAc-TII；GnTII；EC 2.4.1.143)催化反应UDP-N-乙酰基-D-葡糖胺+6-(α-D-甘露糖基)-β-D-甘露糖基-R<＝>UDP+6-(2-(N-乙酰基-β-D-葡糖胺基)-α-D-甘露糖基)-β-D-甘露糖基-R，其中R代表聚糖受体中N-连接的寡糖的其余部分。N-乙酰葡糖胺基转移酶II催化结构域是能够催化该反应的N-乙酰葡糖胺基转移酶Ⅱ酶的任何部分。SEQ ID NO：20-33中列出了来自各种生物体的N-乙酰葡糖胺基转移酶II酶的氨基酸序列。在某些实施方式中，N-乙酰葡糖胺基转移酶II催化结构域是来自人N-乙酰葡糖胺基转移酶Ⅱ酶(SEQ ID NO：20)或其变异体。另外的GnTII种类在CAZy数据库中的糖基转移酶家族16(cazy.org/GT16_all)中列出。酶学特征性种类包括，秀丽隐杆线虫、黑腹果蝇、智人、褐家鼠、野猪(cazy.org/GT16_characterized)的GnTII。在某些实施方式中，N-乙酰葡糖胺基转移酶II催化结构域包含与SEQ ID NO：21的氨基酸残基大致30至大致447的至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的序列。催化结构域可以包括例如非催化结构域、跨膜结构域或胞质结构域的全部或部分的酶的N-末端部分。
在其中丝状真菌细胞含有本发明的融合蛋白质的实施方式中，该融合蛋白质可进一步包含在N-乙酰葡糖胺基转移酶I催化结构域和N-乙酰葡糖胺基转移酶II催化结构域之间的间隔区。可以使用如题为“间隔区”的一节中所描述的任何本发明的间隔区。在某些优选的实施方式中，间隔区是EGIV间隔区、2xG4S间隔区、3xG4S间隔区或CBHI间隔区。在其它实施方式中，间隔区包含来自非催化结构域的序列。
对于ER/高尔基体表达，N-乙酰葡糖胺基转移酶Ⅰ和/或N-乙酰葡糖胺基转移酶II催化结构域通常与靶向肽或者ER或早期高尔基蛋白质的部分融合，或与动物或植物N-乙酰葡糖胺基转移酶的内源性ER靶向结构一起表达。在某些优选的实施方式中，N-乙酰葡糖胺基转移酶Ⅰ和/或N-乙酰葡糖胺基转移酶II催化结构域包含如题为“靶向肽”的章节中所描述的任何本发明的靶向肽。优选地，靶向肽被连接至催化结构域的N末端。在一些实施方式中，靶向肽包含如题为“靶向肽”的章节中所描述的任何本发明的非催化结构域。在某些优选的实施方式中，靶向肽是Kre2靶向肽。在其它实施方式中，靶向肽进一步包含连接到非催化结构域的N-末端的跨膜结构域或连接到非催化结构域N-末端的胞质结构域。在靶向肽还包含跨膜结构域的实施方式中，靶向肽可以进一步含有连接到跨膜结构域的N末端的胞质结构域。
可以通过本领域中已知的任何适宜的方法降低本发明的alg3基因的表达水平，包括但不限于突变alg3基因。可通过例如，点突变或删除整个alg3基因来突变alg3。优选地，通过alg3的突变降低或消除alg3蛋白质的功能。alg3基因编码多萜醇基-P-Man:Man(5)GlcNAc(2)-PP-多萜醇基α-1，3-甘露糖基转移酶。如本文所公开的，本发明的多萜醇基-P-Man:Man(5)GlcNAc(2)-PP-多萜醇基甘露糖基转移酶将α-D-甘露糖残基从多萜醇-磷酸D-甘露糖移到膜脂连接的寡糖中。
在某些实施方式中，丝状真菌细胞可以含有编码UDP-GlcNAc转运蛋白的多核苷酸。编码UDP-GlcNAc转运蛋白的多核苷酸可以是丝状真菌细胞中内源性的(即，天然存在的)，或者它可以对于丝状真菌细胞是异源的。
在其它实施方式中，丝状真菌细胞也可以包含编码如题为“宿主细胞”的章节中描述的本发明的α-1，2-甘露糖苷酶的多核苷酸。编码α-1，2-甘露糖苷酶的多核苷酸在丝状真菌细胞中可以是内源性的，或者它可以对于丝状真菌细胞是异源的。这些多核苷酸特别可用于表达从高尔基体转移到内质网的高甘露糖聚糖而没有有效的外切-α-2-甘露糖苷酶切割的丝状真菌细胞。对于细胞质表达，甘露糖苷酶的催化结构域通常与靶向肽融合，如HDEL、KDEL或者ER或早期高尔基蛋白的部分，或与动物或植物甘露糖苷酶Ⅰ酶的内源性ER靶向结构一起表达。
在进一步的实施方式中，丝状真菌细胞也可以包含编码如题为“宿主细胞”的章节中描述的本发明的半乳糖基转移酶的多核苷酸。半乳糖基转移酶将β-连接的半乳糖残基转移到末端N-乙酰葡糖胺残基。在某些实施方式中，半乳糖基转移酶是β-4-半乳糖基转移酶。半乳糖基转移酶可以在丝状真菌的细胞质中表达。可以使用异源靶向肽，如SchwientekJ.Biol.Chem 1996 3398中描述的Kre2肽。可用于表达半乳糖基转移酶的启动子包括组成型启动子，如gpd，在高尔基体或ER中合成N-聚糖的内源性糖基化酶和糖基转移酶(如甘露糖基转移酶)的启动子，和高产率的内源性蛋质白的诱导型启动子，如cbh1启动子。在其中宿主细胞包含编码半乳糖基转移酶的多核苷酸的本发明的实施方式中，该宿主细胞还包含编码UDP-Gal和/或UDP-Gal转运蛋白的多核苷酸。在其中该丝状真菌细胞包含编码半乳糖基转移酶的多核苷酸的本发明的某些实施方式中，在培养丝状真菌细胞时，乳糖可以代替葡萄糖用作碳源。培养基可以是在pH 4.5和7.0之间，或在5.0和6.5之间。在其中丝状真菌细胞含有编码半乳糖基转移酶的多核苷酸和编码UDP-Gal和/或UDP-Gal转运蛋白的多核苷酸的本发明的某些实施方式中，二价阳离子如Mn2+、Ca2+或Mg2+可被加入到细胞培养基中。
在其它实施方式中，丝状真菌细胞也可以包含编码如题为“宿主细胞”的章节中所描述的本发明的唾液酸转移酶的多核苷酸。唾液酸转移酶将α3-或α6-连接的唾液酸，如Neu5 Ac，转移到半乳糖基化复合聚糖的末端Gal。编码α3-或α6-连接的唾液酸转移酶的多核苷酸可以对于丝状真菌细胞是内源性的，或者它可以对于丝状真菌细胞是异源的。丝状真菌细胞中的唾液酸化可能需要表达合成供体CMP-唾液酸如CMP-Neu5Ac的酶，特别是在真菌、植物、线虫/寄生虫或昆虫细胞中。
此外，丝状真菌细胞可以具有增加的或降低的各种另外的内源性酶的活性水平。活性水平降低可以通过用抑制剂、抗体等抑制内源性酶的活性来提供。在某些实施方式中，丝状真菌细胞被遗传修饰来增加或降低一种或多种内源性酶的活性。对丝状真菌细胞进行遗传修饰以增加或降低一种或多种内源性酶的活性的方法是本领域中公知的，并包括但不限于，如题为“宿主细胞”的章节中所描述的那些。在某些实施方式中，与野生型丝状真菌细胞中的活性水平相比，该丝状真菌细胞具有降低的α-1，6-甘露糖基转移酶的活性水平。α-1，6-甘露糖基转移酶(EC 2.4.1.232)在高尔基器中将引发GDP-甘露糖的α-D-甘露糖残基的伸长转移到蛋白质连接的N-聚糖寡糖中，从而形成α-(1-＞6)-D-甘露糖基-D-甘露糖连接。通常情况下，α-1，6-甘露糖基转移酶由och1基因编码。在某些实施方式中，与野生型丝状真菌细胞中的表达水平相比，丝状真菌细胞具有降低的och1基因的表达水平。在某些实施方式中，从丝状真菌细胞中删除och1基因。
丝状真菌细胞可以是，例如，枝顶孢属、曲霉属、短梗霉属、隐球菌属、金孢子菌属、Chrysosporium lucknowense、线黑粉酵母属、镰孢菌属、赤霉属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、漆斑菌属、新考马脂霉属、脉孢霉属、拟青霉属、青霉属、瘤胃壶菌属、裂褶菌属、柱霉属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属或木霉属细胞。在某些实施方式中，丝状真菌细胞是里氏木霉细胞。
含有由本发明的方法制备的复合N-聚糖的药物组合物
在另一个方面中，本发明提供了组合物，例如，药物组合物，其含有一种或多种与通过本发明的方法所产生的异源分子连接的复合N-聚糖，与药学上可接受的载体一起配制。本发明的药物组合物还可以在联合疗法中施用，即与其它药剂组合。例如，联合治疗可以包括与至少一种其它治疗剂相结合的与根据本发明的异源分子连接的复合N-聚糖。
如本文所使用的“药学上可接受的载体”包括任何和所有的生理上相容的溶剂、分散介质、涂层、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。优选地，载体适合于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊柱或表皮施用(例如，通过注射或输注)。取决于给药的途径，活性化合物，即连接到根据本发明的异源分子的复合N-聚糖，可以包被在材料中以保护该化合物免于酸和其它可能使化合物失活的自然条件的影响。
本发明的药物组合物可包含一种或多种药学上可接受的盐。“药学上可接受的盐”是指保留母体化合物的所需生物活性并且不产生任何不需要的毒理学效应的盐(见例如，Berge，S.M.等人(1977)J.Pharm.Sci.66：1-19)。这类盐的例子包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括由无毒的无机酸如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚磷酸等以及由无毒的有机酸如脂肪族单羧酸和二羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳族酸、脂族和芳族磺酸等衍生的那些。碱加成盐包括由碱土金属如钠、钾、镁、钙等以及由无毒的有机胺如N，N′-二苄基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因等衍生的那些。
本发明的药物组合物也可包括药学上可接受的抗氧化剂。药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基苯甲醚(BHA)、丁基化的羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙脂、α-生育酚等；以及(3)金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等等。
在本发明的药物组合物中可以采用的合适的水性和非水性载体的例子包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物、植物油如橄榄油和可注射的有机酯如油酸乙酯。可以，例如，通过使用包衣材料如卵磷脂，在分散体的情况下通过维持所需的颗粒尺寸，和通过使用表面活性剂保持适当的流动性。
这些组合物也可以包含辅剂如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可以通过消毒程序和通过包含各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸等来确保防止微生物的存在。组合物中包括等渗剂如糖、氯化钠等也可能是需要的。另外，可通过包括延迟吸收的试剂如单硬脂酸铝和明胶导致可注射药物形式的延长吸收。
药学上可接受的载体包括无菌水性溶液或分散液以及用于临时配制成无菌注射溶液或分散液的无菌粉末。使用这些用于药物活性物质的介质和试剂是本领域已知的。只要不是与活性化合物不相容的任何常规介质或试剂，就可以考虑将其用于本发明的药物组合物中。补充的活性化合物也可以加入组合物中。
治疗组合物通常在制备和贮存的条件下必须是无菌的和稳定的。该组合物可以配制成溶液、微乳液、脂质体或其他适合于高药物浓度的有序结构。载体可以是溶剂或分散介质，其包含例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。可以例如，通过使用包衣如卵磷脂，在分散体的情况下通过维持所需颗粒大小以及通过使用表面活性剂保持适当的流动性。在许多情况下，优选在组合物中包括等渗剂例如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇或氯化钠。另外，可通过在组合物中包括延迟吸收的试剂如单硬脂酸铝和明胶产生可注射药物形式的延长吸收。
可通过按照需要将所需量的活性化合物掺入具有上面列举的一种成分或其组合的溶剂中然后无菌微滤制得无菌注射溶液。一般情况下，分散体的制备是通过将活性化合物加入包含基本分散介质和上面所列举的那些的所需其它成分的无菌媒介中。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，特定的制备方法是从预先无菌过滤的溶液产生活性成分的粉末加任何附加的所需成分的真空干燥和冷冻干燥(冻干)。
可以与载体材料结合以产生单一剂型的活性成分的量根据被治疗的主体和特定的给药方式而变化。通常，可以与载体材料结合以产生单一剂型的活性成分的量是产生治疗效果的组合物的量。一般来说，100％中，这个量的范围是与药学上可接受的载体组合的从约0.01％到约99％的活性成分，优选地从约0.1％至约70％，最优选地从约1％至约30％的活性成分。
调整给药方案以提供最佳的所需反应(例如，治疗反应)。例如，可以施用单一大剂量，可以随着时间施用分割的数个剂量或可以按治疗情况的紧急状况所指示的按比例减少或增加该剂量。特别有利的是，为了便于给药的方便性和剂量均匀性，以单位剂量形式配制肠胃外组合物。本文所用的单位剂量形式是指适合作为用于待治疗受试者的单一剂量的物理分散单元，各个单元包含与所需的药物载体结合的经计算以产生所需的治疗效果的预定量的活性化合物。本发明的单位剂量形式的规格决定于并直接依赖于(a)该活性化合物的独特特性和所要达到的特定治疗效果，以及(b)合成这样的用于个体的治疗敏感性的活性化合物的领域中的固有局限性。
对于施用连接到异源分子的复合N-聚糖，特别是其中异源分子是抗体的情况中，其剂量范围从bolus0.0001至100mg/kg宿主体重，更通常为0.01至5mg/kg宿主体重。例如，剂量可以是0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重或10mg/kg体重或者在1-10mg/kg范围内。示例性的治疗方案要求每周给药一次、每两周给药一次、每三周给药一次、每四周给药一次、每月给药一次、每3个月给药一次或每3至6个月给药一次。连接到异源抗体的复合N-聚糖的某些剂量方案包括通过静脉内施用的1mg/kg体重或3mg/kg体重，其中抗体使用以下给药时间表之一施用：(i)每四周6个剂量，然后每隔3个月，(ii)每三个星期，(iii)3mg/kg体重一次，然后每三个星期1mg/kg体重。
或者，根据本发明的连接到异源分子的复合N-聚糖可以作为缓释制剂施用，在这种情况下，需要较低频率的施用。剂量和频率根据给药物质在患者中的半衰期变化。通常，人类抗体显示出最长的半衰期，其次是人源化抗体、嵌合抗体和非人抗体。施用剂量和频率可以根据治疗是预防性还是治疗性的而变化。在预防性应用中，在长的一段时间内以相对不频繁的间隔施用相对低的剂量。有些患者他们的余下生命中持续接受治疗。在治疗性应用中，有时需要以相对短的时间间隔的相对高剂量直到病情发展减轻或终止，且优选直到病人显示部分或完全的疾病症状的改善。此后，患者可以施用预防方案。
本发明的药物组合物中活性成分的实际剂量水平可以变化以便获得有效地实现对特定患者、组合物和给药方式的所需治疗反应而对病人无毒的活性组分的量。所选择的剂量水平取决于各种各样的药代动力学因素，包括所使用的本发明特定组合物或其酯、盐或酰胺的活性、给药途径、给药时间、施用的特定化合物排泄速率、治疗的持续时间、与使用的特定组合物结合的其它药物、化合物和/或材料、接受治疗的病人的年龄、性别、体重、状况、一般健康及过往病史，以及医学领域中公知的类似因素。
本发明的免疫球蛋白的“治疗有效剂量”优选地导致疾病症状严重程度的减轻、无疾病症状期频率和持续时间增加或预防由于疾病的痛苦带来的障碍或残疾。例如，对于肿瘤的治疗，“治疗有效剂量”优选地相对于未治疗的受试者抑制细胞生长或肿瘤生长至少约20％、更优选至少约40％、甚至更优选至少约60％和仍更优选至少约80％。可以预测人类肿瘤中的功效的动物模型系统中评估化合物抑制肿瘤生长的能力。或者，可以通过检验化合物的抑制能力评估组合物的这一性能，这种抑制在体外通过熟练技术人员熟知的分析评估。治疗有效量的治疗化合物可降低肿瘤大小，或以其他方式改善在受试者的症状。本技术领域的普通技术人员能够基于如对象的大小、受试者症状的严重程度和选择的特定组合物或给药途径的因素确定这些量。
可以使用本领域中已知的各种方法中的一种或多种，通过一个或多个给药途径施用本发明的组合物。如本领域技术人员将理解的，给药途径和/或方式根据所期望的结果而变化。本发明的结合部分的某些给药途径包括静脉内、肌内、皮内、腹膜内、皮下、脊柱或其它肠胃外给药途径，例如通过注射或输注。本文所用的短语“肠胃外给药”是指肠道和局部给药以外的施用方式，通常是通过注射，且包括，但不限于，静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心脏内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、包膜下、蛛网膜下腔、椎管内、硬膜外和胸骨内注射和输注。
或者，根据本发明的与异源分子连接的复合N-聚糖可以通过非肠胃外途径给药，如局部、表皮或粘膜给药途径，例如鼻内、口腔、阴道、直肠、舌下或局部。
活性化合物可以与防止化合物快速释放的载体一起制备，例如控释制剂，包括植入物、透皮贴片和微囊化递送系统。可以使用可生物降解的、生物相容的聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。许多用来制备这些制剂的方法是获得专利的或通常是本领域技术人员已知的。见，例如，Sustained and ControlledReleaseDrug Delivery Systems，J.R.Robinson，ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。
治疗组合物可以用本领域中已知的医疗设备施用。例如，在某个实施方式中，本发明的治疗组合物可以用无针皮下注射装置施用，如在第5,399,163、5,383,851、5,312,335、5,064,413、4,941,880、4,790,824或4,596,556号美国专利中公开的装置。可以用于本发明中的众所周知的植入物和模块的实例包括：4,487,603号美国专利，其公开了用于按控制速率分配药物的可植入微型输液泵；4,486,194号美国专利，其公开了通过皮肤施用药物的治疗装置；4,447,233号美国专利，其公开了用于以精确输注速率递送药物的药物输液泵；4,447,224号美国专利，其公开了用于连续药物递送的可变流量可植入输注装置；4,439,196号美国专利，其公开了具有多腔室隔室的渗透药物递送系统；和4,475,196号美国专利，其公开了渗透药物递送系统。
在某些实施方式中，使用根据本发明的与异源分子连接的复合N-聚糖来治疗可以用治疗性抗体治疗的任何疾病。
应当理解，虽然已经结合了本发明的某些特定实施方式来描述本发明，但前面的描述旨在说明而不是限制本发明的范围。本发明的范围内的其他方面、优点和修改对发明所属领域的技术人员是显而易见的。
尽管已经描述了本发明，但提供下列实施例以说明的方式而不是以限制的方式来说明本发明。
实施例
实施例1-用于糖工程的宿主菌株的选择
这个实施例的目的是确定用于糖工程的最佳的里氏木霉菌株。最佳的菌株产生大量的Man5 N-聚糖和少量的酸性聚糖。
样品
对不同的里氏木霉菌株包括M44(VTT-D-00775；Selinheimo等，FEBSJ.2006，273(18)：4322-35)、M81、M84、M109、M110、M131、M132、M133、M134和M124(M44的mus53缺失菌株)进行了分析。这10个菌株中的每一个都在摇瓶培养中生长。在三个不同的时间点取样：3天、5天和7天。收集上清液(分泌的蛋白质)和细胞沉淀，并在-20℃下冷冻保存直至进行聚糖分析。
在指定的时间点从分泌的蛋白质分离N-聚糖，随后是基质辅助激光解析电离飞行时间(MALDI-TOF)聚糖谱分析。对来自5天的时间点的细胞沉淀进行N-聚糖谱分析。对共80个样品(每个中性-和酸性上清部分30个，和每个中性-和酸性颗粒部分10个)进行分析。
还对菌株M44进行分批和分批补料发酵培养以评估摇瓶和发酵罐培养之间的聚糖谱差异。对于聚糖分析，分析来自三个不同时间点的样品，总共12个样品(6个中性和6个酸性部分)。作为对照，对培养液进行了分析。
质谱方法
采用Bruker Ultraflex TOF/TOF仪(Bruker Daltonics，Germany)进行MALDI-TOF质谱分析。在作为[M+Na]+离子的正离子反射模式中检测中性N-聚糖和在作为[M-H]-离子的负离子线性模式中检测酸性N-聚糖。基于它们在光谱中的相对信号强度对中性N-聚糖组分的相对摩尔丰度赋值。将在存在的聚糖图谱中的所得聚糖信号归一化为100％以便于进行样本之间的比较。
蛋白质特异性糖基化方法
用SDS-PAGE分离来自发酵罐培养样品的蛋白质，并印迹到PVDF膜上。切除目的蛋白条带，并通过用PNGase F酶解来释放N-聚糖。
里氏木霉菌株的中性N-聚糖谱
所需的Man5结构在图1所示的质谱中可以被观察为m/z值1257.4处的[M+Na]+信号。发现分析的里氏木霉菌株的中性糖组具有Man5或Man8作为主要中性聚糖种类(在表2中的H5N2和H8N2)。
表2：分析的里氏木霉菌株的不同的中性N-聚糖信号的百分比。
在中性N-糖基部分中观察到一些酸性N-聚糖。这可能是由于磷酸化聚糖的特定性质，如存在磷酸二酯结构，或可能导致在本研究中使用的实验条件下酸性物质泄漏至中性部分中的磷酸聚糖的其它性质。为检查相应的结构，对感兴趣的信号进行MS/MS分析。在MS/MS分析模式中使用Bruker Ultraflex TOF/TOF进行聚糖的质谱断裂化(图2)。由于聚糖没有全甲基化，不能得到基于MS/MS数据的明确结构指定。
里氏木霉菌株的酸性N-聚糖谱
对于糖工程目的，有最小量的酸性N-聚糖的菌株是有用的。因此，从用于筛选的菌株中分析酸性N-聚糖谱。分析的菌株的酸性N-聚糖谱示于图3和下表3中。
表3：分析的里氏木霉菌株的不同酸性N-聚糖信号的百分比。
M44 M81 M84 M109 M110 M131 M132 M133 M134 M124
m/z ％ ％ ％ ％ ％ ％ ％ ％ ％ ％
Hex3HexNAc2SP 989 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
Hex4HexNAc2SP 1151 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
Hex5HexNAc2SP 1313 4.0 5.2 0.0 3.7 0.0 2.8 7.4 0.0 5.2 2.8
Hex5HexNAc2SP2 1393 0.0 0.0 0.0 0.7 0.0 0.0 0.0 0.0 0.9 0.0
Hex6HexNAc2SP 1475 23.7 27.3 2.2 18.1 2.1 22.4 21.0 3.9 24.9 26.3
Hex6HexNAc2SP2 1555 0.0 2.8 0.0 2.4 0.0 3.2 1.1 0.0 3.6 1.7
Hex7HexNAc2SP 1637 30.3 18.8 1.1 16.2 2.0 14.9 24.7 0.0 17.2 23.3
Hex7HexNAc2SP2 1717 0.0 7.7 0.0 8.6 0.0 10.7 2.5 0.0 10.4 7.0
Hex8HexNAc2SP 1799 18.4 11.8 17.9 12.8 9.7 9.1 19.7 14.5 8.8 11.2
Hex8HexNAc2SP2 1879 5.1 8.8 0.0 11.0 0.0 14.8 4.0 0.0 12.4 10.0
Hex9HexNAc2SP 1961 7.3 6.4 49.1 9.5 37.9 5.9 6.1 53.9 4.1 3.5
Hex9HexNAc2SP2 2041 4.2 5.0 0.0 5.7 0.0 7.3 5.1 0.0 5.9 7.2
Hex10HexNAc2SP 2123 2.8 2.9 19.7 4.5 28.1 2.6 2.3 19.3 2.1 1.6
Hex10HexNAc2SP2 2203 2.8 2.1 0.0 2.2 0.0 2.7 3.6 0.0 1.9 3.3
Hex11HexNAc2SP 2285 1.5 1.3 3.7 2.1 9.5 1.2 0.9 5.0 1.0 0.8
Hex11HexNAc2SP2 2365 0.0 0.0 0.0 0.9 0.0 1.3 1.5 0.0 0.8 1.3
Hex12HexNAc2SP 2447 0.0 0.0 1.3 1.0 1.6 1.0 0.0 0.0 0.5 0.0
Hex12HexNAc2SP2 2527 0.0 0.0 0.0 0.4 0.0 0.0 0.0 0.0 0.3 0.0
Hex13HexNAc2SP 2609 0.0 0.0 1.2 0.4 1.1 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
Hex14HexNAc2SP 2771 0.0 0.0 0.6 0.0 0.9 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
来自发酵罐培养的M44菌株的N-聚糖谱
在发酵罐中培养M44菌株以找出不同培养条件下是否可以导致其聚糖谱的变化。对发酵罐中培养的样品进行N-聚糖分析(分批；41:10、88:45和112:50小时和分批补料；45:50、131:40和217:20小时)并与摇瓶培养的样品相比较。图4中显示了在发酵罐中培养的里氏木霉菌株M44分泌蛋白质的中性和酸性N-聚糖。下面的表4中给出了来自烧瓶和发酵罐培养物的N-聚糖百分比之间的对比。
表4：在烧瓶中和发酵罐中培养的里氏木霉菌株M44的N-聚糖信号的百分比。
摇瓶培养基的N-聚糖分析
作为对照实验，对里氏木霉的培养基(不接触真菌)进行了分析。图5a显示了中性N-聚糖分析，其中没有观察到N-聚糖。仅在基线以上可见轻微的己糖低聚物的信号(最有可能是来源于培养基中使用的植物材料)。在图5b(酸性聚糖)中，没有观察到对应于N-聚糖的信号。
分泌蛋白质的N-糖基化
要检查单个分泌蛋白质之间是否有糖基化的变异，用SDS-PAGE分离来自发酵培养物上清液的样品，并印迹到PVDF膜上。然后用膜上酶促释放解离选定条带的N-聚糖。结果示于图6和7中。
结论：中性聚糖
本研究的目的是确定具有最高量的Man5N-聚糖和最低量的酸性聚糖的用于糖工程的里氏木霉菌株。在质谱分析中以Man5作为主峰的菌株可以有较高的内源性α-1，2-甘露糖苷酶活性。基于里氏木霉N-糖基化的背景信息，Man5的可能结构是Manα3[Manα3(Manα6)Manα6]Manβ4GlcNAcβ4GlcNAc(Salovuori等，1987；Stals等，Glycobiology 14，2004，第725页)。
一些菌株包含H8N2作为主要的中性糖形。基于文献记载，该糖形最有可能是Glcα3Manα2Manα2Man5结构(Stals等，Glycobiology 14，2004，第725页)。有可能在这些菌株中的葡萄糖苷酶缺陷阻止了聚糖修剪为较小的糖形。
在一些菌株中，在中性谱中观察到酸性N-聚糖。这种情况可能是由于酸性的N-聚糖的较高比例或在将中性聚糖与酸性聚糖分离的过程中特定的结构泄漏到中性部分中。
在发酵罐中培养的菌株的聚糖谱与在摇瓶中培养的菌株的聚糖谱相比，对于糖工程稍微更有利。来自发酵罐培养的样品的单个蛋白质的糖基化与一般糖基化没有显著差异。所有分析的蛋白质含有Man5作为主要的糖形。这一观察结果表明所有分泌蛋白质经过了类似的聚糖加工。因此，表现为大多数分泌蛋白质类似地被里氏木霉宿主细胞糖基化，对于哺乳动物细胞并不总是这种情况。
酸性聚糖
N-聚糖的磷酸化一般不是糖工程所期望的，因为常规的治疗性蛋白质(包括抗体)中不存在末端磷酸残基。这一规则的一些例外情况是用于溶酶体糖基化储积障碍一些特殊化的蛋白质。N-聚糖的磷酸化在真菌中可能是蛋白特异性的。在动物中，甘露糖磷酸化是保守的溶酶体靶向信号。
至今为止，还没有过里氏木霉N-聚糖硫酸盐化的报告。因此，本报告中提及的酸性结构可能是磷酸化的聚糖。
如在烧瓶培养的情况下，当里氏木霉被培养在低pH值下时，磷酸化是更常见的，这可能与低pH值应激和菌丝体破坏有关(Stals等，2004，Glycobiology 14：713-724)。在这项研究中，在烧瓶和发酵罐培养的样品之间观察到明显的差异。在摇瓶培养样品中观察到酸性N-聚糖(其全部磷酸化)。发酵罐样品中酸性N-聚糖的量可能在检测限以下，或者因为较高的pH值，可能已没有明显的聚糖磷酸化。酸性N-聚糖与N-聚糖总量的比例不能用本研究中所使用的方法验证，这是由于中性和酸性聚糖物质之间不同的电离效率。
为了测定磷酸化水平，用N-聚糖酶从分批和分批补料发酵罐中培养的10μg里氏木霉分泌蛋白质释放N-聚糖。使用基于Bradford的方法用BSA作为标准测定蛋白质浓度。在MALDI-TOF分析之前将1pmol的标准分子NeuAcHex4HexNAc2加入酸性N-聚糖样品中。主要糖形(对于发酵罐为Hex7HexNAc2P和对于烧瓶培养为Hex6-8HexNAc2P)的量为0.9pmol/10μg分批培养的分泌蛋白质，0.6pmol/10μg分批补料培养的分泌蛋白质，和160pmol/10μg烧瓶培养的分泌蛋白质(当使得培养物的pH值下降时)。在MALDI-TOF分析之前，用10pmol的标准聚糖Hex2HexNAc4加入中性N-聚糖样品中来测量中性N-聚糖的量。主要糖形Hex5HexNAc2的量是87pmol/10μg分批和分批补料培养的分泌蛋白质以及145pmol/10μg烧瓶培养的分泌蛋白质。因此，酸性N-聚糖与N-聚糖总量的比例在分批培养中为1％，在分批补料培养中为0.7％和在烧瓶培养中为52％。定量是仅基于使用MALDI-TOF数据的信号强度比较。
在酸性部分中N-聚糖也较大。这可能是由于其中磷与一个己糖单元连接到聚糖主链上的磷酸-甘露糖基化反应。在酸性谱中看到一些双磷酸化结构。这种解释与此前公布的关于里氏木霉中发现的磷酸化聚糖的数据一致(Stals等2004，Glycobiology 14：725-737)。在在发酵罐中培养时，酸性N-聚糖的比例是很低的，在检测限以下。
里氏木霉培养基的N-聚糖谱没有显示里氏木霉的N-糖组被源自含植物材料培养基的聚糖污染。
总之，不同里氏木霉菌株的N-聚糖分析表明，菌株M44、M109、M131、M132和M124中的主要糖形是Man5或Manα3[Manα3(Manα6)Manα6]Manβ4GlcNAcβ4GlcNAc。考虑到产生Man5的菌株中可能存在葡萄糖，包括H8N2作为次要组分。两个菌株(M109和M131)包含的H8N2的量比H7N2大。H8N2的富集可能表明部分葡萄糖苷酶缺陷。
M44菌株几乎不含磷酸化聚糖。来自菌株M131、M109、M132和M124的样品中观察到在中性聚糖组分中看到的泄漏酸性聚糖作为在m/z 1521和m/z 1683处的信号，这表明较高的磷酸化水平和存在潜在的磷酸二酯结构。
本研究的目的是要找到具有最大的Man5Gn2结构产量和低水平的酸性(磷酸化)的N-聚糖产量的菌株。最好的菌株在pH控制的摇瓶培养条件下有80％以上的Man5。最好的菌株也具有降低的双磷酸化的聚糖产量和/或较大的磷酸化结构(见表3)。
实施例2-alg3缺陷木霉菌株的产生
载体构建和菌株产生
在里氏木霉的基因组序列中鉴定了编码ALG3甘露糖基转移酶的基因。设计了破坏构建体(disruption construct)以在alg3基因的1000bp的5′和3′侧翼区片段之间插入乙酰胺酶选择标记。通过PCR扩增侧翼区片段，并通过在酿酒酵母中的同源重组克隆制备构建体。通过消化从其骨架载体释放破坏盒(disruption cassette)和转化到里氏木霉菌株M124中。在乙酰胺酶培养基上选择转化体，并通过PCR用构建体5′侧翼区片段外的正向引物和AmdS选择标记内的反向引物筛选。
转化体的筛选
62个筛选的转化体中的58个给出了构建体整合到alg3基因座预期的大小的PCR产物。通过单孢子培养将9个PCR阳性转化体纯化为单核克隆，并从中制得孢子悬浮液。通过Southern杂交对这9个克隆进行破坏盒的正确整合的分析。在标准的杂交条件下来自亲本菌株和来自9个克隆的EcoRI-消化的基因组DNA与alg3探针杂交。探针与来自亲本菌株的DNA杂交但不与来自任何克隆的DNA杂交表示成功删除了alg3(图8)。
通过用AmdS探针的Southern杂交进行进一步分析。AmdS基因被包含在删除盒中且预计可在来自转化体的DNA中但不在来自亲本菌株的DNA中检测到。用EcoRI+PvuI(E+P)和KpnI+NheI(K+N)消化亲本菌株M124和9个转化体的基因组DNA。携带alg3-AmdS删除盒的NotI消化的质粒被用作阳性对照。探针识别来自阳性对照的预期约2.7kb的片段(AmdS)，但不与亲本菌株杂交。全部转化体给出了预期的信号(对于E+P为1.6+2.8kb和对于K+N为1.7+3.4kb，图9B中用箭头表示)，表明正确整合了删除盒。克隆11A和15A也表现出一些额外片段的杂交，表明删除盒非特异性地整合到基因组(图9B)。
N-聚糖分析学
对五个不同Alg3敲除菌株(4A、5A、6A、10A和16A)和亲本菌株M124的摇瓶培养物进行N-聚糖分析。从时间点3、5、7和9天采集样品。所有培养物重复地进行生长。
使用基于Bradford的分析针对BSA标准曲线测定来自所有时间点的随机选择的基因敲除菌株(4A)的分泌蛋白质的蛋白质浓度。第5天检测到最高的蛋白浓度。因此，第5天的样品用于所有五个基因敲除菌株的N-聚糖分析。一式三份地分析所有样品(包括重复的培养物)。将10μg用于N-聚糖分析。通过MALDI-TOF对中性和酸性N-聚糖进行分析。
在亲本菌株M124中的主要糖形是Man5Gn2。在所有的Alg3敲除菌株中的主要糖形是Man3(图10)。在亲本菌株M124中没有发现Man3。在不同的Alg3敲除菌株中Man3的量的范围在摇瓶培养物中为49.7％至55.2％之间(使得pH值下降)。亲本菌株中Hex6Gn2增加。作为观察到的中性N-聚糖信号的百分比的信号强度列于下面的表5中。
表5：Alg3敲除菌株的中性N-聚糖含量。
通过MALDI MS分析无法观察到各糖形的不同异构体的存在，因此进一步进行串联质谱研究。首先，研究Man3和Hex5Gn2结构。对于Man3，探询Man3结构是分支的还是线性的。对于此分析，将含有这两种结构的样品全甲基化和按照制造商的说明使用BrukerUltraflex III TOF/TOF仪通过质谱片断化进行分析(图11和12)。
接下来，确定Hex6Gn2结构的非还原性末端上的己糖单元是甘露糖还是葡萄糖。用α-甘露糖苷酶消化对所有敲除菌株和亲本菌株进行(图13)。使用切割α-甘露糖和保留主链的β-甘露糖不发生变化的杰克豆甘露糖苷酶。预期所得到的结构是Man1Gn2。
由于MALDI的低分子量范围效应，Man1GlcNAc2聚糖的相对强度可能有所降低，这解释了Hex6相对量的小幅增加。α-甘露糖苷酶消化后，Man3和Man4糖形消失了。没有观察到Man2结构。然而，Hex6(M/Z 1419)不被消化(表6)，这表明在该结构的非还原性末端上有葡萄糖单元。也存在一些不可消化的Hex5，可能是通过去除Hex6的空间位阻Man6分支的弱反应产生的。
表6：α-甘露糖苷酶消化前(天然)和消化后Alg3敲除菌株4A的中性N-聚糖。
对于Alg3敲除菌株中发现的不同结构的最终分析，对Alg3基因敲除菌株4A进行大规模的PNGase F消化。用HPLC纯化两种主要的聚糖(图14)，并通过NMR进行分析(图15)。
基于图15中给出的数据，Hex3HexNAc2物质被明确鉴定为Manα1-3(Manα1-6)Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc。Manα3和Manα6 H-1单元分别在5.105和4.914ppm处共振。在4.245ppm处观察到Manβ4H-2单元。这个信号是非常特征性的，因为相邻的Manα3-OH取代。在2.038和2.075处观察到核心GlcNAc单元的N-乙酰基-CH3信号。这些值与Sugabase数据库(www.boc.chem.uu.nl/sugabase/sugabase.html)中对于该戊多糖所报道的完全一致。此外，在相同的实验条件下，对于商业化生产的Manα1-3(Manα1-6)Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc(Glycoseparations，Inc.)测定质子-NMR谱，并得到几乎相同的化学位移。
图15B中显示了Hex6HexNAc2组分的NMR谱。该数据暗示此组分代表八糖Glcα1-3Manα1-2Manα1-2Manα1-3(Manα1-6)Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc。显示典型的αGlc 2.4Hz耦合的5.255信号证实了葡萄糖单元的存在。由于平伏的H-2构型，所有Man信号通常显示＜1赫兹耦合。与Sugabase数据相比观察到小的差异(表7)，这可能是由于本NMR测量中使用的不同温度(40℃对26℃)。
表7：Glcα1-3Manα1-2Manα1-2Manα1-3(Manαl-6)Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc的公开NMR数据。数据从Sugabase获得(在boc.chem.uu.nl/sugabase/sugabase上找到)。
最后，在不同时间点(第3天、第5天、第7天和第9天)分析随机选择的敲除菌株4A的N-聚糖谱。摇瓶培养的pH在开始时间点为4.8和在结束时间点为2.6。对重复培养的每个时间点的一式三份样品进行了分析。在全部重复中观察到，由于pH值的降低，Man3Gn2信号的相对量随着生长时间的变化下降。然而，Hex6Gn2信号的量随着生长时间的变化增高(表8)。
表8：来自Alg3敲除菌株4A的观察的中性聚糖信号的信号强度的百分比。分析了四个不同时间点(第3天、第5天、第7天和第9天)的重复培养物(3A和4A)。
Alg3敲除菌株4A(烧瓶3A)
Alg3敲除菌株4A(烧瓶4A)
注意到这两个分析(表4和7)之间关于在克隆4A(第5天)中Man3的百分比的差异。这种差异可能是由于分析方法中的差异。冻融循环后观察到某些异源培养基蛋白质制剂的不稳定性，这可能是由于聚糖和/或蛋白质的降解，从而导致较大的聚糖的量减少。表5中的数据的产生包括额外的冻融循环。
还通过MALDI分析了酸性N-聚糖部分(图16)。在亲本菌株M124中不同酸性化合物的丰度与所有Alg3敲除菌株(其中酸性部分似乎是非常相似的)都不同。
在亲本菌株中的三种主要聚糖是H6N2P1、H7N2P1和H8N2P1。在Alg3敲除菌株中，聚糖大小移向较小的聚糖：H5N2P1、H6N2P1和H4N2P1。此外，亲本菌株中双磷酸化聚糖更丰富。这可能是由于缺少将磷酸化的甘露糖连接到聚糖上的特定的酶的合适底物。磷酸化的甘露糖可以由其他的甘露糖残基进一步延长。在发酵条件下产生的亲本M124菌株的聚糖中实质上不存在磷酸化。
发酵罐和摇瓶生长样品的比较
将一个Alg3敲除菌株(转化体4A)以分批发酵在乳糖和酒糟提取物培养基上生长。该培养基是60克/升乳糖，加20克/升酒糟提取物，接种后体积为7升(发酵罐运行bio01616)。其他培养基组分为磷酸二氢钾和(NH4)2SO4。培养物的pH值控制在5.5和5.8之间。在运行的过程中提取生物质和培养上清液样品，并储存于-20℃。还收集菌丝体样品用于可能的RNA分析并立即冷冻在液氮中和转移至-70℃。分析从这些发酵的全过程中收集的样品的N-聚糖组成。对于发酵罐运行(bio01616)和转化体4A的摇瓶培养的5天时间点样品(图17和图18)进行N-聚糖分析。在摇瓶培养中的主要信号是Man3(59％)。在发酵罐培养中，主要信号是Man3(85％)，且Hex6比例下降到8％。
结论
Alg3敲除成功地产生50％或更多的预期的Man3糖形。通过碎片质谱和核磁共振谱验证了Manα3(Manα6)Manβ-的所需分支结构。
Alg3敲除的其他产物包括Man4(含甘露糖的次要产物)、Hex5(如图13所示的Hex6的降解产物)和Hex6(这是第二大组分)。Hex6组分由甘露糖苷酶抗性和特定的核磁共振信号(包括Glca3Man末端)表征为包含末端Glc。据认为通过用于减少末端Glc的量的方法可以进一步优化聚糖结构，末端Glc可能造成葡萄糖苷酶II对分子Manα6臂上缺乏甘露糖的聚糖的效率不佳。对发酵条件的进一步优化可能降低末端Glc的量。
这一数据表明，与较早的在曲霉属(Kainz等，Appl Environ Microb.2008 1076-86)和毕赤酵母(Davidson等Glycobiology 2004，399-407)中的Alg3敲除的数据相比，里氏木霉中的Alg3基因敲除产生更好的糖基化结果。在Kainz等和Davidson等的工作中报道了相似或更高的Hex6相应产物水平。这些研究还报告了与α2-甘露糖，OCH1产物和较大的尺寸，及由毕赤酵母中产生的细胞类型特异性聚糖相关的额外问题。总之，里氏木霉Alg3敲除的N-聚糖分析表明敲除菌株中的主要糖形是Man3Gn2，哺乳动物型N-聚糖的有效产生的理想起点。
实施例3-单个GnTI和GnTII酶的纯化和活性
为了研究其受体特异性和活性，人GnTI和GnTII(N-乙酰葡糖胺基转移酶I和N-乙酰葡糖胺基转移酶II)在毕赤酵母中表达为水溶性的分泌蛋白质。
用于在毕赤酵母中生产的GnTI构建体的产生
获得人GnTI(P26572)序列的全长序列并亚克隆到里氏木霉过表达载体中。将编码人GnTI可溶性部分的蛋白质编码序列(CDS)克隆到pBLARG-SX表达载体以便在毕赤酵母中产生分泌形式的蛋白质用于酶学研究。在克隆过程中，将His标签编码序列添加到框的5′端以在截短的蛋白质的N-末端得到标记。通过测序分析验证了该序列。产生的载体pTTg5线性化并通过电穿孔转化至毕赤酵母GY190细胞中以产生菌株GY4。挑取Arg+转化体，并通过PCR筛选。测试含有整合的质粒的GY4克隆的蛋白质表达。
可溶性GnTI的表达和纯化
首先将表达可溶性GnTI的毕赤酵母菌株GY4在+30℃下在BMGY培养基(1％酵母提取物，2％蛋白胨，100mM磷酸钾pH 6.0，1.34％酵母氮基质，4×10-5％生物素，1％甘油)中振荡过夜进行生长到OD6002-6。然后通过离心收获细胞，并在BMMY培养基(与BMGY一样，但用0.5％的甲醇代替1％甘油)中重悬浮到OD600为1。将培养物放置在带挡板的烧瓶中，并返回到在+16℃下的振摇孵育器中。每24小时加入100％甲醇至终浓度为0.5％以保持诱导。诱导0、24、48和72小时后获取1毫升的表达培养物样品，并存储细胞沉淀和上清液用于分析。3天的诱导之后，通过离心收获整个培养物的细胞，并收集上清液用于进一步纯化GnTI。
制备粗GnTI样品用于活性测定
处理含有可溶性His标记的GnTI的毕赤酵母细胞培养物用于通过浓度和缓冲交换的活性测定。简单地说，在用MeOH诱导后的第3天，通过将细胞沉淀在50ml的Falcon管(Eppendorf 5810R，3220rcf，在4℃下5分钟)并收集上清液来收获摇瓶培养物的40毫升毕赤酵母上清液。然后用Millipore Amicon Ultracel 30K浓缩器通过顺序离心(Eppendorf5810R或相当的，3220rcf，在4℃下10分钟)将上清液浓缩至＜2.5毫升。用100mM MES，pH6.1将浓缩物的体积调切至2.5毫升。浓缩物用PD-10凝胶过滤柱(GE Healthcare 17-0851-01)进行缓冲液交换。首先用100mM的MES，pH 6.1平衡柱，然后加入样品(2.5毫升)，丢弃穿流液，收集用2.25毫升MES缓冲液进行的洗脱。最后，用Millipore Biomax 30K浓缩器(Eppendorf 5417，12 000rcf，5分钟4℃下)将500μl的洗脱液浓缩到100μl，并直接用于活性测定。
GnTI酶的活性测定
Manα1-6(Manα1-3)Manβ1-4GlcNAc(Man3Gn)在GnTI活性测定中被用作GnTI的受体。通过在室温下孵育总体积为10μl的含有0.1mM的受体Man3GlcNAc、20mM的UDP-GlcNAc、50mM的GlcNAc、100mM MnCl2、0.5％BSA和8μl GnTI在100mM MES，pH 6.1中的反应混合物过夜进行GnTI反应。通过在100℃下孵育反应物5分钟使反应停止。
在GnTI活性测定的同时，控制粗酶制剂中可能的HexNAc′ase活性。GlcNAcβ1-2Manα1-6(GlcNAcβ1-2Manα1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc-Asn(＝Gn2Man3Gn2-Asn)被用作HexNAc′ase的底物。GnTI以类似的方式进行反应，除了加入100pmol的Gn2Man3Gn2-Asn而不是Man3Gn和UDP-GlcNAc。没有检测到HexNAc′ase活性。
纯化反应混合物用于通过顺序Hypersep C18(100mg，Thermo Scientific，cat no：60300-428)和在HyperSep 96孔真空管(Thermo Scientific)上的Hypercarb(10mg/96孔板/1PKG，cat no 60302-606)层析的MALDI分析。用300μl的EtOH和300μl的MQ水制备Hypersep C18，然后把收集板放在下面，并上样和用150μl MQ水洗脱。用300μl的MeOH和300μl的MQ水制备Hypercarb。加载来自Hypersep C18的洗脱液，用150μl 0.5M的NH4Ac移除盐，并用2×300μl的MQ水洗涤孔。用150μl 25％的ACN洗脱GnTI反应产物，和用25％的ACN和0.05％的TFA洗脱HexNAc′ase反应产物。在Speedvac中干燥样品。
用Bruker Ultraflex TOF/TOF仪(Bruker Daltonics，Germany)进行基质辅助激光解析电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱(MS)分析。作为[M+Na]+离子的正离子反射模式中检测受体糖和产物。Hex3HexNAc1和Hex3HexNAc2的[M+Na]+信号的计算m/z值分别为733.238和933.318。从Hex3HexNAc1和Hex3HexNAc2的对应信号计算受体和产物的百分比(图19)。
用于毕赤酵母中生产的GnTII构建体的产生
用分别含有Kpnl和EcoRI限制性位点的引物GP3和GP13PCR-扩增编码人GnTII的核苷酸序列。将EcoRI/KpnI消化的PCR片段接合到类似消化的pBLARG-SX克隆载体中。验证序列后，将最终的构建体转化到毕赤酵母菌株GS190中以产生菌株GY22。通过PCR筛选阳性酵母转化体。研究了在16℃和30℃下两个克隆(其中只有一个在图20中示出)在甲醇诱导AOX1启动子控制下的GnTII表达。
可溶性GnTII的表达
根据Western印迹分析(图20)，毕赤酵母菌株GY22产生可溶性重组GnTII酶。GnTII有49049.0Da的计算分子量和两个预测的N-糖基化位点。重组GnTII在16℃下分泌到培养基中(泳道9)。当生长在+30℃下时，重组GnTII滞留在细胞内(泳道4)。
可溶性GnTII的活性测定
按如上对于GnTI所述，处理含有可溶性His标记GnTII的毕赤酵母细胞培养物用于活性测定。对细胞培养物进行离心，收集上清液并浓缩，缓冲液交换至100mM MES，pH 6.1中，并在活性测试之前将所得样品进行进一步浓缩。
活性测定与GnTI类似地进行。使用GnMan3Gn作为GnTII受体。
在存在0.1mM的受体GnMan3Gn，20mM UDP-GlcNAc，50mMGlcNAc，100mM MnCl2，0.5％的BSA和在100mM的MES，pH 6.1中的GnTII的情况下进行GnTII反应。如以上对于GnTI所述的，通过顺序Hypersep C18和在真空歧管上在96-孔板上的Hypercarb色谱进行用于MALDI-TOF MS分析的反应混合物的纯化。
用Bruker Ultraflex TOF/TOF仪(Bruker Daltonics，Germany)进行MALDI-TOFMS。作为[M+Na]+离子的正离子反射模式中检测受体糖和产物。从它们的信号强度计算反应结束时产物和受体的比率(GnMan3Gn受体和具有一个GlcNAc添加的产物的[M+Na]+信号的计算m/z值分别为933.318和1136.397)。
重复产生GnTII的毕赤酵母的培养，并制备来自上清液的GnTII浓缩物(60倍)和根据上面描述的方法测定其活性。在2.5小时、5小时和过夜的时间点样品的MALDI谱分别表明80％、83％和82％的受体转化为产物。在2.5小时内达到接近最大反应。
另外，制备粗GnTII样品，并如上面对于粗GnTI样品所述的进行活性分析。将反应混合物孵育过夜，纯化，并进行MALDI分析。MALDI谱显示GnTII活性(图21)。粗GnTII样品中没有检测到HexNAc′ase活性。
用于合成在上述GnTII活性测定中使用的GnTII受体的方法如下所述。从如上所述的毕赤酵母培养基制备GnTI样品。此GnTI样品显示出高GnTI活性，且因此它可以用于将约40nmol的Man3Gn转化成GnMan3Gn。在0.5mM的Man3Gn、20mM的UDP-GlcNAc、50mM的GlcNAc、100mM的MnCl2、0.5％的BSA和GnTI样品存在下进行反应。在室温下将反应混合物孵育3天。用Hypercarb色谱和MALDI分析将约1％的样品进行纯化。根据MALDI谱，GnTI反应将几乎所有Man3Gn受体转化为GnMan3Gn产物。只有2.8％的受体没有被转化。
实施例4-GnTI/GnTII融合蛋白质
GnTI/GnTII表达构建体的产生
通过用5′-末端的65-mer融合引物(其包含同框融合位点(来自GnTI的短序列，含有天然发生的AleI限制性位点，移除终止密码子并与GnTII序列重叠))和含有SpeI或NdeI限制性位点的与GnTII同源的3′-端引物扩增1313bp的GnTII片段来构建重组GnTI/II融合蛋白质。这一融合位点允许融合片段直接克隆到具有cbh1启动子(用AleI/NdeI克隆)控制下的野生型GnTI或具有在gpd启动子(用AleI/SpeI克隆)控制下的野生型GnTI的里氏木霉过表达载体中。使用高保真Phusion聚合酶(Finnzymes)和标准的扩增和克隆程序。通过直接的表达载体测序验证该序列。将得到的载体用于表达作为里氏木霉中的跨膜蛋白的融合体。
为了获得融合蛋白质的功能性的更多信息，融合GnTI/II蛋白质也在毕赤酵母中表达为可溶性蛋白质。将编码蛋白质的可溶性部分的GnTI/II融合体的CDS克隆到pBLARG-SX表达载体中以产生用于酶学研究的蛋白质。在克隆过程中，将His标签编码序列添加到框的5′-端以在截短的白质的N-末端获得标记。通过测序分析验证了该序列。将得到的载体线性化，并通过电穿孔转化至毕赤酵母菌株GS 190中以产生菌株GY6。挑取Arg+转化体，并通过PCR筛选。测试含有整合的质粒的毕赤酵母克隆的蛋白质表达。
毕赤酵母中产生的可溶性GnTI/II的纯化
毕赤酵母中的表达和纯化过程按以上对于重组GnTI蛋白所述的进行。
GnTI/II融合蛋白质的酶活性测试
如上对GnTI分析所述的使用Man3Gn寡糖作为受体和UDP-GlcNAc作为供体进行活性分析。通过MALDI-TOF质谱分析反应的产物。对于GnTI/GnTII融合蛋白质只观察到GnTI活性(图22)。
通过随机整合用GnTI/GnTII构建体转化里氏木霉
利用随机整合将带有gpdA启动子的嵌合人GnTI/GnTII质粒共转化至里氏木霉M124菌株中。通过含有乙酰胺酶标记基因的质粒的共转化实现选择。将20个PCR阳性转化体纯化至单核克隆并在摇瓶培养中生长以用于聚糖分析。将所有的转化体和亲本菌株M124培养在补充有4％的乳糖和2％的酒糟提取物的木霉基本培养基(TrMM)，pH 4.8中。在第3天、第5天和第7天收集上清液和菌丝体样品，并冷冻贮存直至分析。此外，作为对照，通过随机整合用GnTI构建体转化里氏木霉。
通过随机整合获得的里氏木霉GnTI/GnTII菌株的聚糖分析
对在三个不同时间点(第3天、第5天和第7天)来自里氏木霉菌株M124的GnTI/GnTII转化体的20个不同克隆的样品进行了分析。分析来自两个亲本M124菌株的样品用于对照。在96孔板中一式三份对5μg的上清液蛋白质进行N-聚糖酶反应而无SDS变性。通过基于Bradford的分析(Bio-Rad Quick Start Bradford蛋白质分析)使用BSA作为标准测定上清液的蛋白质浓度。通过MALDI-TOF MS对中性和酸性N-聚糖进行分析。使用GnTI/GnTII构建体在任何时间点在任何克隆中以及具有gpdA启动子的GnTI转化体的克隆中没有检出G0产物。
通过靶向整合用GnTI/GnTII构建体转化里氏木霉
将嵌合的GnTI/GnTII序列亚克隆到pTTv38骨架中，pTTv38为包含乙酰胺酶标记基因和用于alg3基因座整合的5′-和3′-侧翼序列位点的载体。将该载体作为消化的片段转化到里氏木霉M124菌株中。通过这一转化，检测到18个PCR阳性转化体，其产生表明正确整合到alg3基因座的PCR片段。在单孢纯化步骤后在摇瓶中培养这些转化体，并如下文所述进行分析。
通过靶向于alg3基因座获得的里氏木霉GnTI/GnTII菌株的聚糖分析
在三个不同的时间点(第3天、第5天和第7天)获得Δalg3里氏木霉GnTI/GnTII转化体的的10个不同克隆的上清液样品。在摇瓶中用两种不同的培养基组合物培养克隆。TrMM，pH 5.5，具有2％的酒糟提取物，4％的乳糖和K-邻苯二甲酸盐缓冲用于所有克隆，且同时地，TrMM，pH 5.5，具有2％的酒糟提取物，4％的乳糖，1％酪蛋白氨基酸和K-邻苯二甲酸盐缓冲用于其中5个克隆。继续培养7天：在+28℃下5天和+24℃下第6和7天。
在96孔板中一式三份地对5μg上清液蛋白质进行N-聚糖分析。从第3天、第5天和第7天对样品进行分析。使用BSA作为标准，通过基于布Bradford的分析(Bio-Rad QuickStart Bradford protein Assay)测定上清液的蛋白质浓度。通过MALDI-TOF MS对中性和酸性N-聚糖进行分析。
在每一个克隆中发现可检测量的糖形G0。克隆201A包含最多的1.2％的Gn2Man3(图23和表9)。此外，在这个特定的克隆中Hex6量是最低的。具有1％酪蛋白氨基酸的第二种培养基没有给出任何额外的G0/GlcNAcβ2Manα3(GlcNAcβ2Manα6)Manβ4GlcNAcβ4GlcNAcβ的产生。第3天和第7天的样品的结果与第5天样品基本上是相同的。
表9：观察到的里氏木霉GnTI/II转化体(GnTI/II整合到alg3基因座)的分泌蛋白质的N-聚糖的信号强度百分比。在其名称中带有字母A的克隆在培养基A)中培养，带有B的在培养基B)中培养，培养基B)相对于培养基A)有额外的1％的酪蛋白氨基酸。
实施例5-GnTII/GnTI融合蛋白质
GnTII/GnTI表达构建体的产生
通过应用PCR重叠技术产生GnTII/GnTI融合表达构建体。用在融合位点处包含50bp同框重叠的引物单独地从GnTII和GnTI模板扩增融合片段。从琼脂糖凝胶纯化片段并根据标准程序用作用于融合构建体扩增的PCR模板。将融合构建体克隆到带有ApaI/SpeI限制性位点的载体中。通过测序分析验证得到的构建体。生成用于在毕赤酵母中表达在目标蛋白质的N-末端带有His标签的可溶性形式GnTII/GnTI的载体。与如上对于GnTI/II融合构建体所述类似的方式产生该载体。
毕赤酵母中产生的可溶性GnTII/GnTI的纯化
按以上对于重组GnTI蛋白质所述的进行毕赤酵母中的表达和纯化过程。
GnTII/GnTI融合蛋白质的酶活性测试
使用Man3Gn寡糖作为受体，按如上对于GnTI所述的进行活性分析。来自GnTII/GnTI反应的纯化的反应混合物的MALDI谱表明两个GlcNAcP残基被转移到受体上(图24)。
表10：GnTII/GnTI融合蛋白质活性的总结。
通过β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶表征
用来自肺炎链球菌的β1-2，3，4，6-N-乙酰葡糖胺糖苷酶处理在GnTII/GnTI活性反应中形成的混合物。用MALDI MS分析来确定转移的β-连接GlcNAc残基都被切割了(图25)。
通过β1-4GalT半乳糖基化
用来自牛奶的β1-4GalT处理在GnTII/GnTI活性反应中形成的混合物。预期β1-4GalT使产物混合物中的末端GlcNAc残基半乳糖基化。根据β1-4GalT反应混合物的MALDI谱，两种产物均被半乳糖基化。两个半乳糖转移到Gn2Man3Gn产物上，这表明GlcNAc残基与单独的甘露糖分支连接(图26)。
通过随机整合用GnTII/GnTI构建体转化里氏木霉
设计嵌合GnTII/GnTI序列，并克隆到含有gpdA启动子的载体中。质粒序列验证后，共转化至带有潮霉素标记基因的里氏木霉M124菌株中。对十三个PCR阳性转化体进行了鉴定。将所有阳性转化体和亲本菌株M124培养在TrMM，pH 4.8(补充有4％的乳糖和2％的酒糟提取物)中。此外，7个转化体和亲本菌株培养在TrMM，pH 5.5(具有4％的乳糖，2％的酒糟提取物和1％酪蛋白氨基酸，用100mMPIPPS(哌嗪1，4-二丙基磺酸)缓冲)中。用pH测量来监测菌株的增长率。在第3天、第5天和第7天收集上清液和菌丝体样品，冷冻保存，并分析聚糖结构。GnTII/GnTI序列也被克隆至含有cbh1启动子的质粒中。此外，作为对照，通过随机整合用GnTI构建体转化里氏木霉。
通过随机整合获得的里氏木霉GnTII/GnTI菌株的聚糖分析
对在两种不同培养基中培养的里氏木霉菌株M124GnTII/GnTI转化体和亲本M124株的156个上清液样品进行了分析。第一种培养基是TrMM，pH 4.8，补充有2％的酒糟提取物和4％的乳糖，和第二种培养基是TrMM，pH 5.5，补充有2％酒糟提取物，4％的乳糖，100mM的PIPPS和1％的酪蛋白氨基酸。细胞在这两种类型的培养基中生长3、5和7天。
对于用于来自第3天和第5天时间点的样品的5μg上清液蛋白，在96孔板中一式三份地进行N-聚糖酶反应而无SDS变性。使用BSA作为标准，由基于Bradford的分析(Bio RadQuick Start Bradford Protein Assay)测定上清液的蛋白质浓度。通过MALDI-TOF MS进行中性和酸性N-聚糖的分析。
在3天和5天时间点的任何克隆中没有看见预期的GnTII/GnTI产物的征兆。此外，从通过随机整合所产生的带有gpdA启动子的GnTI和GnTI/II转化体没有观察到产物。
通过靶向整合用GnTII/GnTI构建体转化里氏木霉
构建具有在cbh1启动子控制下的嵌合GnTII/GnTI序列的带有pyr4基因环路标记(loopout marker)的载体，并亚克隆至alg3侧翼区片段之间的骨架载体中进行靶向整合。将PmeI消化的表达盒转化至里氏木霉菌株M127(M124的pyr4-菌株)中。在板选择后，克隆经PCR筛选和通过单孢子纯化。为了获得用于聚糖分析的材料，如所描述的进行摇瓶培养。将表明正确整合至M127转化体的alg3基因座的五个PCR阳性转化体在28℃下在300毫升体积中培养7天，培养基含有TrMM，pH 5.5，补充40克/升的乳糖、20克/升酒糟提取物和100mM的PIPPS。为了避免细菌污染，在接种时将100毫克/升氨苄青霉素加入到烧瓶中。第3天、第5天和第7天收集用于聚糖分析的样品。
通过靶向于alg3基因座获得的里氏木霉GnTII/GnTI菌株的聚糖分析
在96孔板上对于5μg上清液蛋白质一式三份地制备里氏木霉菌株M124(对照)、M127GnTII/GnTI转化体的5个不同克隆和对照培养基样品的上清液样品。使用牛BSA作为标准，通过基于Bradford的分析(Bio-Rad Quick Start Bradford Protein Assay)测定上清液的蛋白质浓度。如所描述地进行PNGase F反应而无SDS变性。首先用Hypersep C-18纯化释放的N-聚糖，然后用Hypersep Hypercarb(都来自Thermo Scientific)纯化，其中中性和酸性聚糖分离。这两种纯化在96孔形式中进行。通过MALDI-TOF MS分析中性N-聚糖。
对比来自里氏木霉M127 GnTII/GnTI转化体的中性N-聚糖的比例与来自菌株M124(其除了pyr4阳性外其它都与菌株M127相同)的比例。五个GnTII/GnTI转化体中的四个在所有时间点(3、5和7天)产生G0作为主要糖形。只有克隆46A是G0阴性的(图27)。在所有时间点每一个克隆的Man3Gn比例都是小的，但Hex6的比例还是相当大的。在第7天，与其它克隆相比，克隆17A产生最多的G0和最少的Hex6(图27)。第5天在摇瓶条件下GnTII/GnTI转化体中的四个克隆产生40％左右的糖形G0(图27)。具有受控pH值的发酵条件可以增加alg3敲除体中的G0产物的量和减少Hex6的量。
在培养基样品中，观察到了一系列植物型的N-聚糖，但没有观察到G0相对应的信号。
通过靶向整合用GnTII/GnTI构建体转化产生利妥昔单抗的里氏木霉
将题为“通过靶向整合用GnTII/GnTI构建体转化里氏木霉”的章节中所述的表达盒转化到里氏木霉菌株M279(菌株M202的pyr4-株)中。通过删除M124中的pepl蛋白酶和引入利妥昔单抗重链和轻链(带有Kex2切割位点)获得M202。板选择后，克隆经PCR筛选和通过单孢子纯化。为了获得用于聚糖分析的材料，按题为“通过靶向整合用GnTII/GnTI构建体转化里氏木霉”的章节中所述的进行摇瓶培养，和此外，某些培养基补充有0.3毫克/毫升大豆胰蛋白酶抑制剂(SBTI)和1％酪蛋白氨基酸。首先接种时加入SBTI，然后在第3-6天每天添加。在冷冻前向所有样品添加PMSF和胃蛋白酶抑制剂A。
通过靶向于alg3基因座获得的产生利妥昔单抗的里氏木霉GnTII/GnTI菌株的聚 糖分析
从具有SBTI的第5天的上清液样品和从没有SBTI的第5天和第7天样品用蛋白G亲和层析纯化利妥昔单抗。对约10μg的变性蛋白质进行PNGase F反应。首先用Hypersep C-18纯化释放的N-聚糖，然后用Hypersep Hypercarb(都来自Thermo Scientific)纯化，其中中性和酸性聚糖分离。以96孔形式进行纯化步骤。通过MALDI-TOF MS分析中性和酸性N-聚糖。GnTII/GnTI转化体克隆中的两个，9A-1和31A-1，分别产生约30％和约24％的G0糖形。然而，合理数量的Hex6和GnMan3仍观察到(图28)。来自其他克隆的利妥昔单抗含有很少或没有G0。
间隔区的优化
构建了一系列用于GnTII/GnTI融合蛋白质的间隔区修饰。这些变异体在毕赤酵母中产生并在体外研究酶稳定性和活性。
在此描述了用于克隆GnTII/GnTI融合蛋白质的材料和方法。通过采用PCR重叠策略在两部分中扩增T45序列。首先，片段用GP13 5′引物和GP93 3′引物扩增，且第二片段用GP92 5′引物和GP2 3′引物扩增。在由供应商提供的标准条件下用Phusion高保真PCR聚合酶(Finnzymes)进行扩增。循环条件如下：98℃下初始变性30秒，在98℃下变性5秒，在65℃下退火30秒，在72℃下延伸45秒，重复20次，并在72℃下最后延伸20分钟。用FermentasGeneJET凝胶提取试剂盒从琼脂糖凝胶纯化得到的PCR产物。在无引物的标准条件下将这些具有重叠的经修饰的序列的片段在相同的反应混合物中合并。十个退火/延伸循环如下进行：在98℃下进行初始变性30秒，在98℃下变性5秒，在65℃下退火30秒，在72℃延伸45秒，重复10次，并在72℃下进行20分钟的最后延伸。加入引物GP13(5′)和GP2(3′)，和如上20个扩增循环所述继续循环。用Fermentas GeneJET PCR纯化试剂盒纯化扩增的T45片段，按照标准方法用EcoRI/KpnI(New England Biolabs)进行消化，并克隆到EcoRI/KpnI消化的酵母表达载体pBLARG-SX中。用引物3′AOX、5′AOX、GP9、GP37、GP38和GP122测序得到的载体。发现该序列是正确的。
将这种得到的质粒作为模板用于3xG4S间隔区修饰。按如上对于T45所述进行T46序列的克隆，GP13 5′-引物和GP95 3′-引物用于第一片段的合成，和GP94 5′-引物和GP23′-引物用于第二片段的合成。将片段组合，并加入引物GP13(5′)和GP2(3′)用于扩增。然后用EcoRI/KpnI消化扩增的片段T46，并克隆到酵母表达载体pBLARG-SX中。用上述引物对得到的载体进行测序，发现该序列是正确的。
用类似的PCR重叠方法构建纤维素酶相关的天然间隔区。利用CBHI相关间隔区，用GP13 5′-引物和GP107 3′-引物扩增第一片段。用GP108 5′-引物和GP2 3′-引物扩增第二片段(表11)。利用EGIV相关间隔区，用GP13 5′引物和GP109 3′引物扩增第一片段。用GP1105′-引物和GP2 3′-引物扩增第二片段(表11)。在这两种情况下，从琼脂糖凝胶纯化PCR产物，组合，并用作下一PCR反应的模板以扩增序列T50和T51。然后分别用EcoRI/KpnI消化T50和T51 PCR产物并克隆到酵母表达载体pBLARG-SX中。
用高保真Phusion聚合酶(Finnzymes)进行所有的PCR扩增。从MWG Operon订购引物(表11)。测序是由Helsink大学生物技术研究所的DNA测序实验室作为商业服务进行的。
表11：引物序列。
引物 序列5′-3′
按实施例3中对于GnTI所描述的类似方式，通过浓缩和缓冲液交换处理间隔区修饰的(3xG4S和2xG4S)GnTII/GnTI融合酶用于活性测定。用Man3Gn受体进行活性测定，和如在GnTI活性测定中所描述的进行反应混合物的纯化。还如对于GnTI反应混合物所描述的进行MALDI分析，但是此外，接着形成GnTII产物，Hex3HexNAc3。Hex3HexNAc3的[M+Na]+信号的计算m/z值是1136.318(图29)。
间隔区变异体
GnTII/I间隔区变异体从GnTII/I融合蛋白质的野生型间隔区序列进行改变。修饰的间隔区被列于表12中。在+16℃下用蛋白酶抑制剂表达所有四个间隔区变异菌株(GY32、GY33、GY49和GY50)、野生型GnTII/I融合菌株(GY7-2)和模拟菌株(GY3)。菌株在+30℃，220rpm下接种在60毫升BMGY培养基中过夜(O/N)。沉淀过夜培养物，并将细胞重悬浮于60毫升BMMY培养基中。在开始甲醇诱导的同时并在此后每天一次在培养基中加入蛋白酶抑制剂，1mMEDTA，1.5μM胃蛋白酶抑制剂A(Sigma)和1完全无EDTA的蛋白酶抑制剂混合片(Roche)。在第3天和第4天从培养物取25毫升样品，并使用浓缩管(Millipore)浓缩上清液样品，在PD-10柱中缓冲交换到100mM MES pH 6.1中和浓缩至最终50X。细胞沉淀重悬浮于500μl的1xPBS中，除了野生型的细胞沉淀(第三)(其重悬浮在500μl的100mM MES pH 6.1和完全(无EDTA)抑制剂混合物中)。
包含3xG4S间隔区的GnTII/GnTI融合蛋白质的氨基酸序列示于SEQ ID NO：119中。包含3xG4S间隔区的GnTII/GnTI融合蛋白质的核苷酸序列示于SEQ ID NO：141中。包含2xG4S间隔区的GnTII/GnTI融合蛋白质的氨基酸序列示于SEQ ID NO：121中。包含2xG4S间隔区的GnTII/GnTI融合蛋白质的核苷酸序列示于SEQ ID NO：139中。包含CBHI间隔区的GnTII/GnTI融合蛋白质的氨基酸序列示于SEQ ID NO：123中。包含CBHI间隔区的GnTII/GnTI融合蛋白质的核苷酸序列示于SEQ ID NO：143中。包含EGIV间隔区的GnTII/GnTI融合蛋白质的氨基酸序列示于SEQ ID NO：125中。包含EGIV间隔区的GnTII/GnTI融合蛋白质的核苷酸序列示于SEQ ID NO：145中。
通过重复离心和重悬细胞在具有完全(无EDTA)抑制剂混合物的100mM的MES pH6.1中洗涤200μl细胞悬浮液样品。通过取得200μl洗涤的细胞样品，加入50μl的玻璃珠和2μl的Triton X-100并置于珠磨器中6分钟来制备细胞裂解液。如上进行50倍浓缩的毕赤酵母培养物上清液、细胞样品和细胞裂解液的GnTI活性分析。
表12：酵母菌株的说明
来自第3天的细胞沉淀和50倍浓缩的培养基上清液的Western印迹分析如图30所示。CBHI间隔区变异体(GY49)从细胞沉淀样品而非上清液给出强信号。从上清液检测到EGIV间隔区变异体(GY50)，但只获得微弱的信号。从野生型GnTII/I融合菌株(GY7-2)和2xG4S间隔区变异菌株GY33-7和GY33-8的上清液样品中也获得了微弱的信号(图30)。
然后将含有间隔区变异体的GnTII/I融合蛋白质的活性与包含野生型间隔区的GnTII/I融合蛋白质的活性进行比较。
上清液中的融合GnTII/I活性。提供了GnTI底物Man3Gn，和反应产物GnMan3Gn作为用于融合蛋白质的GnTII活性的受体。在第3天和第4天表达阶段后获取用于活性分析的样品。图31显示了包含野生型间隔区或间隔区变异体的GnTII/I融合蛋白质的培养物活性分析结果。在抑制剂(1.5μM胃蛋白抑制剂A，1mM EDTA，1片/50毫升完全无EDTA的蛋白酶抑制剂混合片)存在下进行样品培养。为简单起见，一起加入GnTI和GnTII反应产物。所有活性测定样品中只含有少量(＜5％)的GnTI产物GnMan3Gn，说明GnTII主动地将GnMan3Gn转化为Gn2Man3Gn。
所有四个间隔区变异体显示GnT活性，虽然克隆和培养天数之间有一些变异性。包含2xG4S(克隆_1)、3xG4S(克隆_1和克隆_2)或EGIV间隔区变异体的GnTII/I融合蛋白质比具有野生型间隔区的酶显示出更高的活性(图31)。包含CBHI间隔区变异体的GnTII/I融合蛋白质表现出与具有野生型间隔区的酶相当的活性(图31)。包含2xG4S变异体(克隆_2)的GnTII/I融合蛋白质比具有野生型间隔区的酶的活性低(图31)。第4天的样品比第3天的样品具有较高的活性，例外的是包含3xG4S间隔区变异体的GnTII/I融合蛋白质(克隆_1和克隆_2)，其在第3天显示出较高的活性(图31)。包含EGIV间隔区变异体的GnTII/I融合蛋白质在第4天有最高的活性(图31)。
细胞和细胞裂解液中的融合GnTII/I活性。细胞、细胞裂解液和来自包含具有野生型间隔区的GnTII/I融合蛋白质的细胞的上清液样品的活性试验表明，裂解液样品含有最高的活性(图32)。在细胞表面上的活性第二高，且上清液样品中观察到的活性最低(图32)。因此，表现为大多数GnTII/I融合蛋白质定位于细胞内或在细胞表面上，只有少量被分泌。
包含具有野生型间隔区或间隔区变异体的GnTII/I融合蛋白质的细胞的GnT活性如图33中所示。将细胞重悬浮在500μl的100mMMES，pH 6.1与完全无EDTA抑制剂混合物中，且按上述方法制备于500μl的PBS中的间隔区变异体及用于活性测试的细胞和裂解液。
如图33所示，包含间隔区变异体的GnTII/I融合蛋白质在细胞中比在上清液中有显着高得多的GnTII/I活性。在裂解液中，酶呈现为失活的。据认为，这种活性的缺乏是由于释放的蛋白酶的作用。包含CBHI间隔区变异体的GnTII/I融合蛋白质在细胞和裂解液中显示高活性(图33)，这与在细胞沉淀样品中显示较高信号的Western印迹分析相关(图30)。
讨论。在上清液中，包含2xG4S和3xG4S间隔区变异体的GnTII/I融合蛋白质比包含野生型间隔区的GnTII/I融合蛋白质具有更高的活性，而CBHI间隔区变异体与包含野生型间隔区的GnTII/I融合蛋白质具有相当的活性。此外，含EGIV间隔区变异体的GnTII/I融合蛋白质显示最高的GnT活性。第3天样品的Western印迹分析与第4天活性的结果有一定的相关性。Western印迹分析显示野生型，两个克隆2xG4S和EGIV的上清液样品的微弱条带。检测的活性顺序如下：EGIV＞2xG4S(克隆_1)＞3xG4S(克隆_2)＞3xG4S(克隆_1)＞CBHI＝野生型＝2xG4S(克隆_2)。
包含野生型间隔区的GnTII/I融合蛋白质的上清液、细胞和细胞裂解液样品中GnTII/I融合蛋白质活性的测定表明，大部分的活性关联在细胞内和较低的量分泌。据认为，这解释了为什么Western印迹分析中观察到His标记的GnTII/I的信号在细胞部分中比在上清液部分中好得多。
完全无EDTA抑制剂片对丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶、EDTA对金属蛋白酶和胃蛋白酶抑制剂A对天冬氨酸蛋白酶的抑制提高了GnTII/I融合蛋白质的产量。对于使用丝氨酸蛋白酶抑制剂的这个观察与Salamin等(Appl.Environ.Microbiol.，76(2010)4269-4276)的工作一致，这表明毕赤酵母培养基中的丝氨酸型蛋白酶活性完全被PMSF抑制。此外，Vad等(J.Biotechnol.116(2005)251-260)报道在毕赤酵母中存在与酿酒酵母蛋白质二硫键异构酶共表达结合的10mM EDTA的情况下完整人甲状旁腺激素的高产量，超过300毫克/升。
包含四个间隔区变异体中的每一个的所有GnTII/I融合蛋白质具有GnTII/I的活性，并且具有2xG4S和EGIV间隔区变异体的酶的活性比包含野生型间隔区的GnTII/I融合蛋白质的活性更高。
实施例6-Man5作为受体聚糖的融合蛋白质的用途
具有Man5型N-糖基化的利妥昔单抗表达里氏木霉菌株的构建
原始的利妥昔单抗序列是统一的密码子协和的。产生了含有合成的利妥昔单抗轻链和重链的原始质粒。抗体链和CBHI融合蛋白质被设计有40个核苷酸的重叠序列，如用于重链的表达载体pHHO1(乙酰胺酶选择标记，用于整合到cbh1基因座中的cbh1侧翼)或用于轻链的pHHO2(潮霉素选择标记，用于整合到egl1基因座中的egl1侧翼)，以确保使用酵母同源重组的克隆。
将所获得的基因质粒转化入大肠杆菌中。制备DNA，并消化合成的基因和从质粒骨架分离。通过对带有CBHI融合蛋白质和重链或轻链任一的里氏木霉表达载体进行酵母同源重组来构建表达载体。从酵母援救重组质粒并转化至大肠杆菌中。经过PCR筛选后，分离正确的克隆并测序。消化表达盒片段并从质粒主链分离，产生大约10.2kb的片段用于重链构建体和10.8kb的片段用于轻链构建体。将重链和轻链片段共转化到里氏木霉菌株M124中。筛选转化体的潮霉素抗性和以乙酰胺作为唯一氮源生长的能力。连续两轮将转化体在双重选择培养基上划线，并通过PCR测试表达构建体到基因组中的整合。
GnTII/I串联酶和甘露糖苷酶II引入表达利妥昔单抗抗体的里氏木霉菌株
除了将重组GnTII/I引入产生Man5的菌株，如M124外，还需要甘露糖苷酶II活性以从GlcNAcMan5聚糖结构移除两个甘露糖，以使GnTII/I可以使用GlcNAcMan3作为受体分子。
在前面的实施例中所描述的GnTII/I的表达盒可以使用基本如上所述的方法靶向于，例如，里氏木霉的cbh2基因座。为生成GlcNAcMan3受体分子用于GnTII/I融合蛋白质，然后使用如上所述的转化方法将甘露糖苷酶II活性引入菌株中。
通过设计带有用于驱动甘露糖苷酶表达的启动子的所需含甘露糖苷酶的表达盒，将甘露糖苷酶II活性引入到表达利妥昔单抗抗体的M124菌株中。有用的启动子为来自gpdA或cbh1的那些。可通过随机整合转化甘露糖苷酶II活性，然后筛选具有最合适的表达水平的菌株。表达盒与专有的选择标记基因连接，或选择标记作为单独的表达盒共转化。根据上面描述的方法进行转化。
甘露糖苷酶II融合构建体可以源自里氏木霉的胞质结构域、跨膜结构域和非催化结构域，或KRE2的靶向肽，并与人甘露糖苷酶II的N-末端氨基酸缺失同框接合。通过KRE2靶向肽序列将编码的融合蛋白质定位在ER/高尔基体内同时保留其甘露糖苷酶催化结构域活性，且能够将GlcNAcMan5GlcNAc2水解成GlcNAcMan3GlcNAc2。在某些实施方式中，可以在M124菌株中表达全长人甘露糖苷酶II。
KRE2靶向肽包含KRE2的从约1至约106或从约1至约83的氨基酸。
Kre2 aa 1-106
MASTNARYVRYLLIAFFTILVFYFVSNSKYEGVDLNKGTFTAPDSTKTTPKPPATGDAKDFPLALTPNDPGFNDLVGIAPGPRMNATFVTLARNSDVWDIARSIRQ(SEQ ID NO：115)
Kre2 aa 1-83
MASTNARYVRYLLIAFFTILVFYFVSNSKYEGVDLNKGTFTAPDSTKTTPKPPATGDAKDFPLALTPNDPGFNDLVGIAPGPR(SEQ ID NO：116)
如上所述用甘露糖苷酶II构建体转化木霉后，选择木霉菌株，连续两轮在选择性培养基上划线，并通过PCR测试表达构建体到基因组中的整合。然后将选择的产生Man5和表达GnTII/I融合蛋白质、甘露糖苷酶II和利妥昔单抗抗体的木霉菌株的转化体培养在摇瓶或发酵罐条件中并如上所述分析聚糖含量。
实施例7-GnTI和GnTII在里氏木霉中的表达
通过随机整合用GnTI构建体转化里氏木霉M124
将密码子优化的人GntI转化至里氏木霉M124株中。GntI基因被克隆到在两个不同启动子的控制下的载体中：(1)cbh1基因的诱导型启动子，和(2)gpdA基因的组成型表达启动子。在这两个启动子任一控制下的含GntI的载体用含乙酰胺或潮霉素抗性标记基因的质粒各自共转化至里氏木霉M124菌株中。
通过PCR筛选具有gpdA启动子下和乙酰胺选择下的GntI的34个转化体，且均为GntI阳性。对于具有cbh1启动子和乙酰胺选择下的GntI的转化体，26个中的19个对于GntI构建体为PCR阳性。此外，对具有在cbh1启动子和潮霉素选择下的GntI的五个菌株进行最初DNA提取。所有这些菌株为PCR阳性。纯化二十五个gpdA启动子转化体，和所有的cbh1启动子的转化体(14+5)纯化至单核克隆并制备孢子悬浮液。
为了初始分析的目的，将23个gpdA启动子转化体和19个cbh1启动子转化体(14个从乙酰胺和5个从潮霉素选择生长)，以及亲本菌株M124培养在具有50ml木霉基本培养基(补充有2％的酒糟提取物和4％的乳糖)的250ml摇瓶中。通过pH测量监测菌株的生长。在第3天、第5天和第7天收集样品(上清液和菌丝体)，冷冻保存直至用于聚糖结构分析。
通过随机整合获得的里氏木霉GnTI菌株的聚糖分析
通过基于Bradford的分析(Bio-Rad Quick Start Bradford Protein Assay)，使用BSA作为标准测定所有上清液样品的蛋白质浓度。将进行N-聚糖分析的样品的分泌蛋白质含量调整到5μg或10μg。在96孔板上对5μg上清液蛋白或在1.5ml管中对10μg上清液蛋白进行N-聚糖分析。一式三份进行所有的N-聚糖分析。用MALDI-TOF MS进行中性和酸性N-聚糖的分析。
为了得到更精确的四个GnT1转化体中产生的GnT1产物Gn1Hex5的量(从第3和5天)和产生的酸性N-聚糖的量的测量，用已知的聚糖掺入MALDI谱。对于中性和酸性N-聚糖，分别使用2pmol/谱的1177Da质量值的Hex2HexNAc4和0.5pmol的1362Da质量值的甘露糖基苷Hex4HexNAc2的内部标准。一式三份进行分析。
在任何gpdA启动子转化体中没有观察到GnT1产物。但是，8个cbhI启动子转化体产生了GnT1产物Gn1Man5(图34和图35，及表13)；五个具有潮霉素选择，三个具有乙酰胺选择。
表13：与内部标准Hex2HexNAc4相比第3天和第5天的四个阳性GnT1转化体和亲本M124菌株中Man5和Gn1Man5的信号强度百分比。Man5是亲本M124菌株中的主要糖形。
在所有阳性转化体的磷酸化N-聚糖中也发现了GnT1产物Gn1Man6P1、Gn1Man7P1和Gn1Man8P1。GnT1转化体中磷酸化N-聚糖的量增加，图谱偏向较大的N-聚糖，其中Man7P1或Man8P1具有最强的信号(Man6P1在亲本M124中具有最强的信号)(图36)。
八个GnTI转化全产生Gn1Man5结构。Gn1Man5在克隆39中是最丰富的。然而，最好的克隆似乎是克隆8，其产生第二高水平的Gn1Man5，但具有高比例的Man5和Gn1Man5(图35)。克隆8，其包含是cbh1启动子控制下的GnTI，被命名为菌株M198，并被选择用于继续分析。
通过靶向整合用GnTII构建体转化里氏木霉M198菌株
建立了五个携带GnTII的载体(表14)。其中的两个载体含有在GNTII中的天然哺乳动物高尔基体靶向肽。在其他三个载体中，哺乳动物靶向肽被里氏木霉MNT1(α-1，2-甘露糖转移酶)靶向肽替代。所有五个载体含有cbh1启动子或gpdA启动子和pyr4环标记。此外，所有五个载体靶向于整合入alg3基因座中，从而删除alg3基因。在cbh1启动子下的MNT1/GnTII结构中，对两种不同大小的GnTII序列缺失进行了测试。
表14：构建的GNT2载体。
质粒名称 启动子 靶向肽 N-末端缺失(GnTII)
pTTv140 cbh1 哺乳动物 N/A
pTTv141 gpdA 哺乳动物 N/A
pTTv142 cbh1 里氏木霉MNT1 74个氨基酸
pTTv143 cbh1 里氏木霉MNT1 104个氨基酸
pTTv144 gpdA 里氏木霉MNT1 74个氨基酸
除了pTTv144载体外，将这些载体分别转化至产生最佳py4-阴性GnTI的菌株M198(M319)中作为PmeI片段。将转化体纯化至单核克隆并进行PCR筛选。显示两端的正确整合的克隆然后被选择用于继续分析。
为了研究产生的表达GNTII的菌株的生长特性，制备了大摇瓶培养物。以两个单独批次制备摇瓶培养物。第一批包含pTTv140、pTTv142和pTTv143。第二批包含pTTv141。将亲本菌株M198用作对照菌株。细胞生长在TrMM培养基(补充有40克/升乳糖，20克/升酒糟提取物和100mM的PIPPS)，pH 5.5中。培养每个构建体的五个转化体。pTTv140、pTTv142和pTTv143培养物在第3、5、7和9天采样。pTTv141培养物在第3、5、7和10天进行采样。测定各个样品的pH值和细胞干重，并将培养物上清液样品用于聚糖结构分析。
通过将GnTII靶向于里氏木霉M198菌株的alg3基因座获得的里氏木霉菌株的多糖 分析
对含有pTTv140载体(含天然靶向肽和cbh1启动子)、pTTv142载体(含MNT1靶向肽、GNTII 74 aa N-末端缺失和cbh1启动子)、pTTv143载体(含MNT1靶向肽、GNTII 110 aa N-末端缺失和cbh1启动子)和pTTv141载体(含靶向肽和gpdA启动子)的五种不同的克隆进行了分析。
在96孔板上对于5μg的上清液蛋白对第5天的样品一式三份地制备N-聚糖分析物，并对第3天和第7天的样品一式两份地制备N-聚糖分析物。上清液的蛋白质浓度通过使用BSA作为标准通过基于Bradford的分析(BioRad Quickstart Bradford Protein Assay)测定。如所述的进行PNGase F反应。首先用Hypersep C-18 100毫克和然后用HypersepHypercarb 10毫克(都来自Thermo Scientific)纯化释放的N-聚糖，其中中性和酸性聚糖分离。这两种纯化均以96孔形式进行。通过MALDI-TOF MS分析中性N-聚糖。
对用GnTII转化的四个不同菌株的N-聚糖进行分析。用pTTv140载体转化并因此包含天然靶向肽和cbhI启动子的克隆1-117A产生约40％的G0和约13％的Hex6(图37A)。用pTTv143载体转化并因此包含MNT1靶向肽、GnTII 110 aa的N-末端缺失和cbhI启动子的克隆产生约10％的G0(图37C)。克隆3B(其包含gbdA启动子)产生约28％的G0和约19％的Hex6(图37D)。
含pTTv140、pTTv141和pTTv142载体的代表性克隆的糖基化模式也显示为随时间变化而稳定的(图38)。
蛋白质特异性糖基化
为了分析糖基化中的蛋白质特异性变化，用SDS-PAGE分离来自含pTTv142载体的克隆3-17A和来自亲本菌株M198的样品并印迹至PVDF膜上。切除目的蛋白质条带(M198的四个条带和3-17A克隆的四个条带)，并用PNGase F通过膜上酶促释放来释放N-聚糖(图39)。
利用MALDI-TOF MS分析脱离和纯化的中性N-聚糖。总分泌蛋白质的糖基化模式与M198亲本菌株的分离的50kDa蛋白质类似(图40)。最小尺寸的蛋白质条带为未糖基化的。
在GnTII克隆3-17A中，大多数的非典型信号消失了，证实它们来自培养基中。此外，克隆3-17A的糖基化模式与总分泌蛋白质的聚糖模式不同(图40B)。来自克隆3-17A的G0量约为35％至36％(图40B)。
GnTII菌株的发酵罐培养
GnTII菌株1-117A M329(其包含pTTv140载体)的发酵罐培养是在TrMM pH 5.5+2％的酒糟提取物+6％的乳糖+0.5％磷酸二氢钾+0.5％硫酸铵在+28℃(pH 5.5)中发酵。对第3天获取的样品如上面在“蛋白质特异性糖基化”一节中描述的对5μg分泌蛋白质一式三份地进行N-聚糖分析。在第3天G0的量为约48％和Hex6的量为约19％(图41)。
实施例8-里氏木霉ALG3同源物
通过随机整合用GnTI构建体转化里氏木霉M124
从其他生物体鉴定了里氏木霉ALG3同源物。这些同源物可以被用来设计ALG3缺失构建体用于里氏木霉以外的丝状真菌细胞。ALG3同源物被列于表15中。里氏木霉ALG3和ALG3同源物的多氨基酸序列比对如图42中所示。
表15：ALG3同源物。
参考序列 生物体 SEQ ID NO：
Trire2|104121|fgenesh5_pg.C_scaffold_3000076 Trichoderma reesei 126
Triat2|270085|fgenesh1_pg.contig_14#_149 Trichoderma atroviride 127
TriviGv29_8_2|194462|fgenesh1_pm.87_#_115 Trichoderma virens 128
EGU81920.1 Fusarium oxysporum Fo5176 129
XP_389829.1 Gibberella zeae PH-1 130
AEO60805.1 Myceliophthora thermophila 131
XP_962259.1 Neurospora crassa OR74A 132
XP_001824044.1 Aspergillus oryzae R1B40 133
XP_001259497.1 Neosartorya fischeri NRRL 181 134
XP_001398696.2 Aspergillus niger CBS 513.88 135
XP_362427.2 Magnaporthe oryzae 70-15 136
NP_593853.1 Schizosaccharomyces pombe 972h 137
实施例9-GnTII/GnTI融合蛋白质变异体
GnTII/GnTI表达构建体的产生
如实施例4和5中所描述的构建在诱导型启动子cbh1控制下和包含4个间隔区变异体之一的重组GnTI/II融合蛋白质。这四种间隔区变异体是2xG4S间隔区、3xG4S间隔区、CBHI间隔区以及EGIV间隔区。
简单地说，用在融合位点含有50bp的同框重叠的引物单独地从GnTII和GnTI模板扩增融合片段。从琼脂糖凝胶纯化片段，并根据标准程序用作用于融合构建体扩增的PCR模板。将该融合构建体克隆到在诱导型启动子cbh1的控制下的具有ApaI/SpeI限制性位点的载体中。此外，GNTII域中的天然哺乳动物高尔基体靶向肽被里氏木霉MNT1(α-1，2-甘露糖基转移酶)靶向肽取代。
为了将2xG4S间隔区变异体引入到融合蛋白质中，通过用PCR重叠策略以两部分扩增T45序列。首先，用AKT1-6-1 5′引物(GGTACCGGGCCCACTGCGCATCATGCGCTTCCGAATCTACAAGCG(SEQ ID NO：146))和GP933′引物扩增片段，和用GP92 5′引物和AKT1-6-4 3′引物(GGCGCGCCACTAGTCTAATTCCAGCTGGGATCATAGCC(SEQ ID NO：147))扩增第二片段。用Phusion高保真PCR聚合酶(Finnzymes)在供应商提供的标准条件下进行扩增。循环条件如实施例5中所描述。从琼脂糖凝胶纯化所得的PCR产物，且在无引物的标准条件下，具有重叠的、经修饰的序列的片段在相同的反应混合物中合并。如实施例5中所描述地进行十个退火/延伸循环。加入引物AKT1-6-1(5′)和AKT1-6-4(3′)，和如实施例5中所描述地继续进行20个扩增循环。然后纯化扩增的T45片段，根据标准方案用ApaI/SpeI(New England Biolabs)消化，并克隆到里氏木霉表达载体中。然后用合适的引物组通过测序来验证克隆的片段，和将产生的序列用于构建具有2xG4S启动子和alg3靶向的里氏木霉表达载体。
将得到的质粒用作模板用于3xG4S间隔区修饰。如上对于T45所述的进行T46序列的克隆。将AKT1-6-1 5′引物和GP95 3′-引物用于第一片段的合成，和GP94 5′-引物和AKT1-6-4 3′引物用于第二片段的合成。将片段合并，并添加引物AKT1-6-1(5′)和AKT1-6-4(3′)用于扩增。然后用ApaI/SpeI消化扩增的片段T46，并克隆到里氏木霉表达载体中。然后通过用适当的引物组测序来验证克隆的片段和将产生的序列用于构建具有3xG4S启动子和alg3靶向的里氏木霉表达载体。
用类似的PCR重叠方法构建CBHI和EGIV间隔区。对于CBHI间隔区，用AKT1-6-1 5′引物和GP107 3′-引物扩增第一片段。用GP1085′-引物和AKT1-6-4 3′-引物(表11)扩增第二片段。对于EGIV间隔区，用AKT1-6-1 5′引物和GP109 3′引物扩增第一片段。用GP110 5′引物和AKT1-6-4 3′引物(表11)扩增第二片段。在这两种情况下，从琼脂糖凝胶纯化PCR产物，合并并用作下一PCR反应的模板来扩增序列T50和T51。然后用ApaI/SpeI消化T50和T51PCR产物，并克隆到里氏木霉表达载体中。然后通过用适当的引物组测序来验证克隆的片段和将产生的序列用于构建具有CBHI或EGIV启动子和alg3靶向的里氏木霉表达载体。
用Phusion高保真PCR聚合酶(Finnzymes)进行所有的PCR扩增。引物(表11)从MWGOperon订购。测序是由Helsinki大学生物技术研究所的DNA测序实验室作为商业服务完成。
然后构建所述的带有间隔区变异体(2xG4S、3xG4S、CBHI和EGIV)的嵌合GnTII/GnTI序列亚克隆到cbh1启动子的控制下的里氏木霉表达载体，其中pyr4基因环路标记和alg3侧翼区片段用于靶向整合到骨架中。表达盒转化至里氏木霉菌株M279(M202的pyr4-菌株)。板选择后，克隆经PCR筛选和通过单孢子纯化。为了获得用于聚糖分析的材料，按所述进行摇瓶培养。
GnTII/I融合蛋白质变异体引入表达利妥昔单抗抗体的里氏木霉菌株按实施例5中所描述的将重组GnTII/I融合蛋白质变异体引入表达利妥昔单抗的里氏木霉菌株M279中。
简单地说，将具有cbh1启动子控制下的GnTII/GnTI融合蛋白质、MNTI靶向肽、pyr4环路标记及4个间隔区变异体中的各变异体的载体各自亚克隆到用于靶向整合的alg3侧翼区片段之间的骨架载体中，从而删除alg3基因。将PmeI消化的表达盒转化至里氏木霉菌株M279(pyr4-菌株)中。板选择后，克隆经PCR筛选和通过单孢子纯化。
通过靶向于alg3基因座获得的产生利妥昔单抗的里氏木霉GnTII/GnTI变异体菌 株的多糖分析
为了获得用于聚糖分析的材料，按照实施例5中所描述的进行摇瓶培养，和此外，一些培养基补充有0.3毫克/毫升大豆胰蛋白酶抑制剂(SBTI)和1％酪蛋白氨基酸。接种时首次添加SBTI，然后在第3-6天每天添加。在冷冻前向所有样品加入PMSF和胃蛋白酶抑制剂A。
用蛋白G亲和层析法从具有SBTI的第5天的上清液样品和没有SBTI的第5天和第7天的样品纯化利妥昔单抗。对约10μg的变性蛋白质进行PNGase F反应。首先用Hypersep C-18然后用Hypersep Hypercarb(均来自Thermo Scientific)纯化N-聚糖，其中中性和酸性聚糖分离。以96孔形式进行纯化步骤。通过MALDI-TOF MS分析中性和酸性N-聚糖来测试利妥昔单抗抗体上G0糖形的存在。

Claims (54)

1.一种具有N-乙酰葡糖胺基转移酶活性的重组蛋白质，其中该重组蛋白质催化N-乙酰葡糖胺转移到受体聚糖的末端Manα3残基上和催化N-乙酰葡糖胺转移到末端Manα6残基，以及其中所述重组蛋白质是由N-乙酰葡糖胺基转移酶I催化结构域和N-乙酰葡糖胺基转移酶II催化结构域及在N-乙酰葡糖胺基转移酶I催化结构域和N-乙酰葡糖胺基转移酶II催化结构域之间的间隔区组成的融合蛋白质，且其中所述N-乙酰葡糖胺基转移酶I催化结构域完全来自SEQ ID NO：1且包含与SEQ ID NO：1的氨基酸残基105-445 100％相同的序列和其中所述N-乙酰葡糖胺基转移酶II催化结构域完全来自SEQ ID NO：20且包含与SEQ ID NO：20的氨基酸残基30-447 100％相同的序列。
2.如权利要求1的重组蛋白质，其中所述N-乙酰葡糖胺基转移酶II催化结构域处于N-乙酰葡糖胺基转移酶I催化结构域的N-末端。
3.如权利要求2的重组蛋白质，其中所述间隔区包含来自非催化结构域的序列。
4.如权利要求1-3任一项的重组蛋白质，其中所述间隔区包含选自于SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：120、SEQ ID NO：122和SEQ ID NO：124的序列。
5.如权利要求4的重组蛋白质，其中所述间隔区包含选自于SEQ ID NO：118、SEQ IDNO：120和SEQ ID NO：124的序列。
6.如权利要求4的重组蛋白质，其中所述间隔区包含SEQ ID NO：124或SEQ ID NO：120的序列。
7.一种具有N-乙酰葡糖胺基转移酶活性的重组蛋白质，其中该重组蛋白质催化N-乙酰葡糖胺转移到受体聚糖的末端Manα3残基上和催化N-乙酰葡糖胺转移到末端Manα6残基，以及其中所述重组蛋白质是由(i)N-乙酰葡糖胺基转移酶I催化结构域；(ii)N-乙酰葡糖胺基转移酶II催化结构域；(iii)在N-乙酰葡糖胺基转移酶I催化结构域和N-乙酰葡糖胺基转移酶II催化结构域之间的间隔区和在所述重组蛋白质N-末端的靶向肽组成的融合蛋白质，且其中所述N-乙酰葡糖胺基转移酶I催化结构域完全来自SEQ ID NO：1且包含与SEQ ID NO：1的氨基酸残基105-445 100％相同的序列和其中所述N-乙酰葡糖胺基转移酶II催化结构域完全来自SEQ ID NO：20且包含与SEQ ID NO：20的氨基酸残基30-447 100％相同的序列。
8.如权利要求7的重组蛋白质，其中所述靶向肽包含非催化结构域。
9.如权利要求3的重组蛋白质，其中所述非催化结构域是来自选自于甘露糖苷酶和糖基转移酶的蛋白质。
10.如权利要求8的重组蛋白质，其中所述非催化结构域是来自选自于甘露糖苷酶和糖基转移酶的蛋白质。
11.如权利要求10的重组蛋白质，其中所述蛋白质来自选自于枝顶孢属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、隐球菌属(Cryptococcus)、金孢子菌属(Chrysosporium)、线黑粉酵母属(Filibasidium)、镰孢菌属(Fusarium)、赤霉属(Gibberella)、腐质霉属(Humicola)、梨孢菌属(Magnaporthe)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、漆斑菌属(Myrothecium)、新考马脂霉属(Neocallimastix)、脉孢霉属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、裂褶菌属(Schizophyllum)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)和木霉属(Trichoderma)的生物体。
12.如权利要求7的重组蛋白质，其中所述靶向肽是Kre2靶向肽。
13.如权利要求8的重组蛋白质，其中所述靶向肽包含连接至非催化结构域的N-末端的跨膜结构域。
14.如权利要求8的重组蛋白质，其中所述靶向肽包含连接到非催化结构域的N-末端的胞质域。
15.如权利要求13的重组蛋白质，其中所述靶向肽包含连接到跨膜结构域的N末端的胞质域。
16.如权利要求7的重组蛋白质，其中所述N-乙酰葡糖胺基转移酶II催化结构域位于所述N-乙酰葡糖胺基转移酶I催化结构域的N-末端，所述间隔区序列包含人N-乙酰葡糖胺基转移酶I非催化结构域且位于所述催化结构域之间，所述靶向肽位于N-乙酰葡糖胺基转移酶II催化结构域的N-末端，该靶向肽包含胞质结构域、跨膜结构域和来自人N-乙酰葡糖胺基转移酶II的非催化结构域。
17.如权利要求1的重组蛋白质，其由与SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：123或SEQ ID NO：125 100％相同的序列组成。
18.如权利要求7的重组蛋白质，其中所述N-乙酰葡糖胺基转移酶II催化结构域位于所述N-乙酰葡糖胺基转移酶I催化结构域的N-末端，所述间隔区位于所述催化结构域之间，该间隔区包含选自于SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：120、SEQ ID NO：122和SEQ ID NO：124的序列，所述靶向肽位于N-乙酰葡糖胺基转移酶II催化结构部的N-末端且该靶向肽包含胞质结构域、跨膜结构域和来自人N-乙酰葡糖胺基转移酶II的非催化结构域。
19.如权利要求18的重组蛋白质，其中所述间隔区来自选自于SEQ ID NO：118、SEQ IDNO：120和SEQ ID NO：124的序列。
20.如权利要求18的重组蛋白质，其中所述间隔区来自SEQ ID NO：124或SEQ ID NO：120的序列。
21.如权利要求18的重组蛋白质，其中所述间隔区来自SEQ ID NO：124的序列。
22.一种分离的多核苷酸，其编码上述权利要求中任一项的重组蛋白质。
23.一种表达载体，其包含可操作地与启动子连接的如权利要求22所述的分离的多核苷酸。
24.一种包含如权利要求23所述的表达载体的宿主细胞。
25.一种制备复合的N-聚糖的方法，其包括：
(1)提供宿主细胞，其中该宿主细胞包含编码权利要求1的重组蛋白质的多核苷酸；和
(2)培养该宿主细胞以使该重组蛋白质被表达，其中该重组蛋白质催化N-乙酰葡糖胺转移到受体聚糖的末端Manα3残基和催化N-乙酰葡糖胺转移到末端Manα6残基，以产生复合的N-聚糖。
26.如权利要求25的方法，其中所述受体聚糖被连接于异源多肽。
27.如权利要求25或权利要求26的方法，其中所述复合的N-聚糖是GlcNAcβ2Manβ3(GlcNAcβ2Manβ6)Manβ4GlcNAcβ4GlcNAc。
28.如权利要求25或权利要求26的方法，其中所述宿主细胞是选自于木霉菌、枝顶孢属、曲霉属、短梗霉属、隐球菌属、金孢子菌属、线黑粉酵母属、镰孢菌属、赤霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、漆斑菌属、新考马脂霉属、脉孢霉属、拟青霉属、青霉属、瘤胃壶菌属、裂褶菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属和弯颈霉属的丝状真菌细胞。
29.如权利要求25或权利要求26的方法，其中所述宿主细胞还包含编码UDP-GlcNAc转运蛋白的多核苷酸。
30.如权利要求25或权利要求26的方法，其中所述宿主细胞具有与野生型宿主细胞中的活性水平相比降低的多萜醇基-P-Man:Man(5)GlcNAc(2)-PP-多萜醇基甘露糖基转移酶的活性水平。
31.如权利要求30的方法，其中所述宿主细胞具有与野生型宿主细胞中的表达水平相比降低的alg3基因的表达水平。
32.如权利要求30的方法，其中从所述宿主细胞删除该alg3基因。
33.如权利要求25或权利要求26的方法，其中所述宿主细胞具有与野生型宿主细胞中的活性水平相比降低的α-1,6-甘露糖基转移酶的活性水平。
34.如权利要求33的方法，其中所述宿主细胞具有与野生型宿主细胞中的表达水平相比降低的och1基因的表达水平。
35.如权利要求25或权利要求26的方法，其中所述宿主细胞还包含编码α-1,2-甘露糖苷酶的多核苷酸。
36.如权利要求25或权利要求26的方法，其中所述宿主细胞还包含编码αβ-1,4-半乳糖基转移酶的多核苷酸。
37.如权利要求25或权利要求26的方法，其中所述宿主细胞还包含编码唾液酸转移酶的多核苷酸。
38.一种制备复合的N-聚糖的方法，其包括：
(1)提供木霉属宿主细胞，其中该宿主细胞具有与野生型宿主细胞中的表达水平相比降低的alg3基因的表达水平并包含权利要求1的重组蛋白质；以及
(2)培养该宿主细胞以产生复合的N-聚糖。
39.一种制备复合的N-聚糖的方法，包括在缓冲液中将权利要求1的重组蛋白质、受体聚糖和N-乙酰葡糖胺供体一起孵育，其中该重组蛋白质催化N-乙酰葡糖胺转移到受体聚糖的末端Manα3残基和N-乙酰葡糖胺转移到末端Manα6残基以产生复合的N-聚糖。
40.一种具有与野生型丝状真菌细胞中的表达水平相比降低的alg3基因的表达水平的丝状真菌细胞，其中所述丝状真菌细胞包含如权利要求1-21中任一项所述的重组蛋白质。
41.如权利要求40的丝状真菌细胞，其中所述alg3基因包含突变。
42.如权利要求41的丝状真菌细胞，其中所述alg3基因突变是alg3基因的缺失。
43.如权利要求40-42中任一项的丝状真菌细胞，其中所述重组蛋白质是由可操作地与启动子连接的多核苷酸编码的。
44.如权利要求43的丝状真菌细胞，其中所述启动子是诱导型启动子。
45.如权利要求44的丝状真菌细胞，其中所述诱导型启动子是cbh1启动子。
46.如权利要求40-42中任一项的丝状真菌细胞，其中所述丝状真菌细胞还包含编码UDP-GlcNAc转运蛋白的多核苷酸。
47.如权利要求40-42中任一项的丝状真菌细胞，其中所述丝状真菌细胞具有与野生型丝状真菌细胞中的活性水平相比降低的α-1,6-甘露糖基转移酶的活性水平。
48.如权利要求47的丝状真菌细胞，其中所述丝状真菌细胞具有与野生型宿丝状真菌细胞中的表达水平相比降低的och1基因的表达水平。
49.如权利要求40-42中任一项的丝状真菌细胞，其中所述丝状真菌细胞还包含编码α-1,2-甘露糖苷酶的多核苷酸。
50.如权利要求40-42中任一项的丝状真菌细胞，其中所述丝状真菌细胞还包含编码β-1,4-半乳糖基转移酶的多核苷酸。
51.如权利要求40-42中任一项的丝状真菌细胞，其中所述丝状真菌细胞还包含编码唾液酸转移酶的多核苷酸。
52.如权利要求40-42中任一项的丝状真菌细胞，其中所述丝状真菌细胞选自于木霉菌、枝顶孢属、曲霉属、短梗霉属、隐球菌属、金孢子菌属、线黑粉酵母属、镰孢菌属、赤霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、漆斑菌属、新考马脂霉属、脉孢霉属、拟青霉属、青霉属、瘤胃壶菌属、裂褶菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属和弯颈霉属。
53.如权利要求9或10的重组蛋白质，其中所述糖基转移酶是甘露糖基转移酶。
54.如权利要求53的重组蛋白质，其中所述甘露糖基转移酶选自MNN2、MNN4、MNN6、MNN9、MNN10、MNS1、KRE2、VAN1和OCH1。
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Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2011333685A1 (en) 2010-11-24 2013-06-27 Glykos Finland Oy Fusion enzymes having N-acetylglucosaminyltransferase activity
WO2013174927A1 (en) 2012-05-23 2013-11-28 Novartis International Pharmaceutical Limited Production of fucosylated glycoproteins
JP2016518114A (ja) * 2013-03-14 2016-06-23 グリコビア，インコーポレイテッド オリゴ糖組成物、糖タンパク質および原核生物においてそれらを産生する方法
CN105492457A (zh) 2013-07-04 2016-04-13 诺华股份有限公司 O-甘露糖基转移酶缺陷的丝状真菌细胞及其使用方法
EP3019602B1 (en) * 2013-07-10 2018-09-05 Glykos Finland Oy Multiple proteases deficient filamentous fungal cells and methods of use thereof
SI3019621T1 (sl) 2013-07-10 2019-03-29 Glykos Finland Oy Proizvodnja glikoproteinov, ki imajo povečano zasedenost N-glikozilacijskega mesta
BR112016002045A2 (pt) 2013-07-29 2017-08-29 Danisco Us Inc Variantes de enzimas
CA2954974A1 (en) 2014-07-21 2016-01-28 Glykos Finland Oy Production of glycoproteins with mammalian-like n-glycans in filamentous fungi
CN105695439B (zh) * 2014-11-27 2023-08-01 丰益(上海)生物技术研发中心有限公司 一种β-葡萄糖苷酶基因的重组表达方法
JP2021534763A (ja) * 2018-08-21 2021-12-16 クララ フーズ カンパニー 微生物におけるタンパク質のグリコシル化の修飾
US10927358B2 (en) * 2019-01-16 2021-02-23 Fornia Biosolutions, Inc. Endoglucanase compositions and methods
CN110448719B (zh) * 2019-06-28 2020-05-22 浙江大学 一种促进凝血的丝素-多肽电纺膜及其制备方法

Family Cites Families (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4500707A (en) 1980-02-29 1985-02-19 University Patents, Inc. Nucleosides useful in the preparation of polynucleotides
US4475196A (en) 1981-03-06 1984-10-02 Zor Clair G Instrument for locating faults in aircraft passenger reading light and attendant call control system
US4447233A (en) 1981-04-10 1984-05-08 Parker-Hannifin Corporation Medication infusion pump
US4439196A (en) 1982-03-18 1984-03-27 Merck & Co., Inc. Osmotic drug delivery system
US4447224A (en) 1982-09-20 1984-05-08 Infusaid Corporation Variable flow implantable infusion apparatus
US4487603A (en) 1982-11-26 1984-12-11 Cordis Corporation Implantable microinfusion pump system
US4486194A (en) 1983-06-08 1984-12-04 James Ferrara Therapeutic device for administering medicaments through the skin
US4743546A (en) 1985-02-13 1988-05-10 Biotechnica International, Inc. Controlled gene excision
US4596556A (en) 1985-03-25 1986-06-24 Bioject, Inc. Hypodermic injection apparatus
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4941880A (en) 1987-06-19 1990-07-17 Bioject, Inc. Pre-filled ampule and non-invasive hypodermic injection device assembly
US4790824A (en) 1987-06-19 1988-12-13 Bioject, Inc. Non-invasive hypodermic injection device
US5700637A (en) 1988-05-03 1997-12-23 Isis Innovation Limited Apparatus and method for analyzing polynucleotide sequences and method of generating oligonucleotide arrays
GB8822228D0 (en) 1988-09-21 1988-10-26 Southern E M Support-bound oligonucleotides
US5312335A (en) 1989-11-09 1994-05-17 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
US5064413A (en) 1989-11-09 1991-11-12 Bioject, Inc. Needleless hypodermic injection device
US5383851A (en) 1992-07-24 1995-01-24 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
DE19754622A1 (de) 1997-12-09 1999-06-10 Antje Von Dr Schaewen Pflanzliche GntI-Sequenzen und Verwendung derselben zur Gewinnung von Pflanzen mit verminderter oder fehlender N-Acetylglucosaminyltransferase I (GnTI)-Aktivität
US7244601B2 (en) * 1997-12-15 2007-07-17 National Research Council Of Canada Fusion proteins for use in enzymatic synthesis of oligosaccharides
DE69932345T2 (de) 1998-10-26 2007-07-19 Novozymes A/S Erstellung und durchmusterung von interessierenden dna-banken in zellen von filamentösen pilzen
CA2382184A1 (en) * 1999-08-19 2001-03-01 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Novel yeast mutants and process for producing glycoprotein containing mammalian type sugar chain
US7598055B2 (en) * 2000-06-28 2009-10-06 Glycofi, Inc. N-acetylglucosaminyltransferase III expression in lower eukaryotes
US7795002B2 (en) 2000-06-28 2010-09-14 Glycofi, Inc. Production of galactosylated glycoproteins in lower eukaryotes
JP4820055B2 (ja) * 2001-12-27 2011-11-24 グライコフィ， インコーポレイテッド 哺乳動物型糖質構造を操作するための方法
US7569376B2 (en) * 2002-05-03 2009-08-04 Neose Technologies, Inc. Fucosyltransferase fusion protein
WO2006026992A1 (en) * 2004-09-07 2006-03-16 Novozymes A/S Altered structure of n-glycans in a fungus
US7501275B2 (en) 2004-10-27 2009-03-10 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Yeast transformation system
US20080026376A1 (en) 2006-07-11 2008-01-31 Huaming Wang KEX2 cleavage regions of recombinant fusion proteins
MX2009003605A (es) 2006-10-03 2009-04-22 Metabolic Explorer Sa Procedimiento para integracion cromosomica y reemplazo de secuencia de adn en clostridia.
TW201028431A (en) * 2008-10-31 2010-08-01 Lonza Ag Novel tools for the production of glycosylated proteins in host cells
AU2011333685A1 (en) 2010-11-24 2013-06-27 Glykos Finland Oy Fusion enzymes having N-acetylglucosaminyltransferase activity

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