JP2016518114A - オリゴ糖組成物、糖タンパク質および原核生物においてそれらを産生する方法 - Google Patents

オリゴ糖組成物、糖タンパク質および原核生物においてそれらを産生する方法 Download PDF

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Abstract

種々のオリゴ糖組成物および糖タンパク質を産生する方法および組成物が開示される。グリコシル化経路を宿主細胞内に導入することによって、原核宿主細胞が、ヒト様、例えば、高マンノース、ハイブリッドおよび複合グリコシル化パターンを産生するのに有効な条件下で培養される。

Description

連邦政府が支援した研究および開発の声明
本発明は、米国国立衛生研究所によって助成金番号１Ｒ４３ＧＭ０８８９０５−０１、２Ｒ４４ＧＭ０８８９０５−０２および５Ｒ４４ＧＭ０８８９０５−０３下で政府の支援を受けてなされた。政府は本発明において特定の権利を有する。
関連出願の相互参照
本出願は、全ての目的でその全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１３年３月１４日に出願された米国仮出願第６１／７８５，５８６号に関連する。
配列表
本出願はＥＦＳ−Ｗｅｂにより提出され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる配列表を含む。［ＤＡＴＥ］に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは［．ｔｘｔ］の名前を付けられ、［＃＃＃＃＃＃＃］バイトのサイズである。
本発明は概して糖鎖生物学およびタンパク質工学の分野に関する。より具体的には、本明細書に記載される実施形態は、原核生物におけるオリゴ糖組成物および治療用糖タンパク質産生に関する。
糖治療薬（Ｇｌｙｃｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）
タンパク質ベースの治療は、最近、ＦＤＡにより承認された新規薬物の４つの１つを占める（Ｗａｌｓｈ，Ｇ．、「Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｅｎｃｈｍａｒｋｓ」、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １８：８３１−３（２０００）；Ｗａｌｓｈ，Ｇ、「Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｅｎｃｈｍａｒｋｓ」、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２１：８６５−７０（２００３）；およびＷａｌｓｈ，Ｇ、「Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｅｎｃｈｍａｒｋｓ」、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２４：７６９−７６（２００６））。
いくつかのタンパク質治療薬は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（例えばインスリン）などの原核発現系を使用して産生されうるが、治療用タンパク質の大部分は、それらの完全な生物学的機能を達成するために、原核生物に存在していないと考えられる追加の翻訳後修飾を必要とする。特に、Ｎ結合型タンパク質グリコシル化は全ての真核タンパク質種の過半数に影響を与えると予測されており（Ａｐｗｅｉｌｅｒら、「Ｏｎ ｔｈｅ Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ，ａｓ Ｄｅｄｕｃｅｄ Ｆｒｏｍ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ Ｄａｔａｂａｓｅ」、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １４７３：４−８（１９９９））、しばしば、多数のタンパク質の、適切なフォールディング、薬物動態安定性、組織ターゲティングおよび有効性に不可欠である（Ｈｅｌｅｎｉｕｓら、「Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｎ−ｌｉｎｋｅｄ Ｇｌｙｃａｎｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９１：２３６４−９（２００１））。ほとんどの細菌は自身のタンパク質をグリコシル化しないので、抗体を含む、ほとんどの治療的に関連する糖タンパク質の発現は哺乳動物細胞に割り当てられる。しかしながら、哺乳動物細胞培養は以下を含む多くの欠点を受ける：（ｉ）細菌と比べて、ＣＨＯ細胞などの真核宿主は製造費用が非常に高く体積当たりの生産性が低いこと、（ｉｉ）レトロウイルス汚染、（ｉｉｉ）安定な細胞株を生成するのに比較的長い時間が必要とされること、（ｉｖ）安定な「高産生」真核細胞株を遺伝子組換えにより迅速に生成することが相対的に困難であること、および（ｖ）内因性非ヒトグリコシル化経路を有するＣＨＯなどの宿主細胞を使用した場合に現れるグリコフォーム不均一性により生じる高い産生物変動性（Ｃｈｏｉら、「Ｕｓｅ ｏｆ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｔｏ Ｈｕｍａｎｉｚｅ Ｎ−ｌｉｎｋｅｄ Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｙｅａｓｔ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ」、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １００：５０２２−７（２００３））。他方で、大腸菌における発現はこれらの制限を受けない。
大腸菌における治療用タンパク質の発現
多くの治療用組換えタンパク質は、現在、宿主生物として大腸菌を使用して発現される。最適な例の１つはヒトインスリンであり、これは１９８２年にＥｌｉ Ｌｉｌｌｙによって大腸菌において最初に産生された。その時から、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ−１、ＩＧＦＢＰ−３）、ケラチノサイト成長因子、インターフェロン（ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β１ｂ、ＩＦＮ−γ１ｂ）、インターロイキン（ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−１１）、組織壊死因子（ＴＮＦ−α）および組織プラスミノゲン活性化因子（ｔＰＡ）を含む、大腸菌発現を利用する膨大な数のヒト治療用タンパク質が米国および欧州において承認されている。しかしながら、ほとんど全ての糖タンパク質は哺乳動物細胞において産生される。通常は、グリコシル化されるタンパク質を大腸菌において発現する場合、宿主におけるグリコシル化の欠如により、機能障害を有するタンパク質が生じうる。例えば、非グリコシル化（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）ヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）（例えば、抗組織因子ＩｇＧ１）は大腸菌において可溶型および高レベルで発現されうる（Ｓｉｍｍｏｎｓら、「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ：Ｒａｐｉｄ ａｎｄ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２６３：１３３−４７（２００２））。しかしながら、大腸菌由来のｍＡｂが同種抗原および新生児受容体への結合能を保持し、哺乳動物細胞由来の抗体に匹敵する循環半減期を示していたものの、それらはＮ−グリカンの不在に起因してＣ１ｑおよびＦｃγＲＩ受容体に結合できなかった。
真核および原核Ｎ結合型タンパク質グリコシル化
Ｎ結合型タンパク質グリコシル化は真核生物の小胞体（ＥＲ）において発生する不可欠で、保存されたプロセスである（Ｂｕｒｄａら、「Ｔｈｅ Ｄｏｌｉｃｈｏｌ Ｐａｔｈｗａｙ ｏｆ Ｎ−ｌｉｎｋｅｄ Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ」、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １４２６：２３９−５７（１９９９））。それは、分泌および膜タンパク質の、タンパク質フォールディング、オリゴマー化、品質管理、ソーティングならびに輸送に重要である（Ｈｅｌｅｎｉｕｓら、「Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｎ−ｌｉｎｋｅｄ Ｇｌｙｃａｎｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９１：２３６４−９（２００１））。真核Ｎ結合型タンパク質グリコシル化経路は２つの異なるプロセスに分けられうる：（ｉ）小胞体の膜における脂質結合型オリゴ糖の構築および（ｉｉ）脂質アンカードリコールピロリン酸から、新生ポリペプチドの選択されたアスパラギン残基へのオリゴ糖の転移。Ｎ結合型タンパク質グリコシル化の特性、すなわち（ｉ）オリゴ糖構築のための担体としてのドリコールピロリン酸（Ｄｏｌ−ＰＰ）の使用、（ｉｉ）完全に構築されたＧｌｃ3Ｍａｎ9ＧｌｃＮＡｃ2オリゴ糖のみの転移、および（ｉｉｉ）配列Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ（ここでＮはアスパラギンであり、Ｘはプロリンを除く任意のアミノ酸であり、Ｓ／Ｔはセリン／トレオニンである）によって特性付けられるアスパラギン残基の認識（Ｇａｖｅｌら、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ Ｂｅｔｗｅｅｎ Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ ａｎｄ Ｎｏｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ Ａｃｃｅｐｔｏｒ Ｓｉｔｅｓ：Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ ３：４３３−４２（１９９０））は真核生物において高度に保存されている。オリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＳＴ）は、脂質ドナーであるドリチルピロリン酸からアクセプタータンパク質へのオリゴ糖の転移を触媒する。酵母において、ｉｎ ｖｉｖｏで複合体を構成する８個の異なる膜タンパク質が同定されている（Ｋｅｌｌｅｈｅｒら、「Ａｎ Ｅｖｏｌｖｉｎｇ Ｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ」、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １６：４７Ｒ−６２Ｒ（２００６））。ＳＴＴ３はＯＳＴの触媒サブユニットを表すと考えられる（Ｎｉｌｓｓｏｎら、「Ｐｈｏｔｏｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ ｏｆ Ｎａｓｃｅｎｔ Ｃｈａｉｎｓ ｔｏ ｔｈｅ ＳＴＴ３ Ｓｕｂｕｎｉｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ Ｃｏｍｐｌｅｘ」、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １６１：７１５−２５（２００３）およびＹａｎら、「Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｙｌ Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ Ｓｕｂｕｎｉｔｓ．Ｓｔｔ３ｐ ｉｓ Ｄｉｒｅｃｔｌｙ Ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｔｈｅ Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｓｓ」、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７７：４７６９２−７００（２００２））。それはＯＳＴ複合体において最も保存されたサブユニットである（Ｂｕｒｄａら、「Ｔｈｅ Ｄｏｌｉｃｈｏｌ Ｐａｔｈｗａｙ ｏｆ Ｎ−ｌｉｎｋｅｄ Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ」、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １４２６：２３９−５７（１９９９））。
反対に、特に「天然の全てのタンパク質の半数より多くは最終的に糖タンパク質であることが見出されるだろう」というある推定によるために、細菌におけるグリコシル化経路の欠如は治療用タンパク質を作製するための原核発現宿主の有用性は大いに制限される（Ａｐｗｅｉｌｅｒら、「Ｏｎ ｔｈｅ Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ，ａｓ Ｄｅｄｕｃｅｄ Ｆｒｏｍ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ Ｄａｔａｂａｓｅ」、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １４７３：４−８（１９９９））。しかしながら、最近、病原菌、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉのゲノムがＮ結合型タンパク質グリコシル化のためのある経路をコードすることが発見された（Ｓｚｙｍａｎｓｋｉら、「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｍｕｃｏｓａｌ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ」、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ３：２２５−３７（２００５））。この経路についての遺伝子は、Ｓｚｙｍａｎｓｋｉおよび共同研究者により１９９９年に最初に同定され（Ｓｚｙｍａｎｓｋｉら、「Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ａ Ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ」、Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ３２：１０２２−３０（１９９９））、タンパク質グリコシル化のためのｐｇｌと名付けられた１７−ｋｂ遺伝子座を含む。ｐｇｌ遺伝子座の発見の後、２００２年においてＬｉｎｔｏｎらは２つのＣ．ｊｅｊｕｎｉ糖タンパク質、ＰＥＢ３およびＣｇｐＡを同定し、これらのようなＣ．ｊｅｊｕｎｉ由来の糖タンパク質がＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）特異的レクチンダイズ凝集素（ＳＢＡ）に結合することを示した（Ｌｉｎｔｏｎら、「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ＰＥＢ３ ａｎｄ ＣｇｐＡ ｉｎ Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ」、Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ４３：４９７−５０８（２００２））。その後すぐに、Ｙｏｕｎｇらは、ＰＥＢ３およびＣｇｂＡを含む、３０超の潜在的なＣ．ｊｅｊｕｎｉ糖タンパク質を同定し、質量分析およびＮＭＲを使用してＮ結合型グリカンが、構造ＧａｌＮＡｃ−α１，４−ＧａｌＮＡｃ−α１，４−［Ｇｌｃβ１，３］ＧａｌＮＡｃ−α１，４−ＧａｌＮＡｃ−α１，４−ＧａｌＮＡｃ−α１，３−Ｂａｃ−β１，Ｎ−Ａｓｎ（ＧａｌＮＡｃ5ＧｌｃＢａｃ、式中、Ｂａｃはバシロサミンまたは２，４−ジアセトアミド−２，４，６−トリデオキシグルコースである）を有するヘプタサッカリドであることを明らかにした（Ｙｏｕｎｇら、「Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｎ−ｌｉｎｋｅｄ Ｇｌｙｃａｎ Ｐｒｅｓｅｎｔ ｏｎ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ，Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ」、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７７：４２５３０−９（２００２））。分岐したヘプタサッカリドは、内膜の細胞質側における脂質担体ウンデカプレニルピロホスフェート（Ｕｎｄ−ＰＰ）へのヌクレオチド活性化糖の逐次付加によって合成され（Ｆｅｌｄｍａｎら、「Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｎ−ｌｉｎｋｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｄｉｖｅｒｓｅ Ｏ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ」、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０２：３０１６−２１（２００５））、一旦構築されると、推定ＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）輸送体ＷｌａＢによって膜を横切ってフリップする（Ａｌａｉｍｏら、「Ｔｗｏ Ｄｉｓｔｉｎｃｔ Ｂｕｔ Ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅａｂｌｅ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｆｏｒ Ｆｌｉｐｐｉｎｇ ｏｆ Ｌｉｐｉｄ−ｌｉｎｋｅｄ Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ」、Ｅｍｂｏ Ｊ ２５：９６７−７６（２００６）およびＫｅｌｌｙら、「Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎ−ｌｉｎｋｅｄ Ｇｌｙｃａｎ ｉｎ Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ ａｎｄ Ａｄｄｉｔｉｏｎ Ｏｎｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｈｒｏｕｇｈ Ｂｌｏｃｋ Ｔｒａｎｓｆｅｒ」、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １８８：２４２７−３４（２００６））。次に、ペリプラズムにおける基質タンパク質へのヘプタサッカリドの転移は、真核ＯＳＴ ＳＴＴ３の触媒サブユニットと顕著な配列類似性を有する単一の内在性膜タンパク質であるＰｇｌＢと名付けられたＯＳＴによって触媒される（Ｙｏｕｎｇら、「Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｎ−ｌｉｎｋｅｄ Ｇｌｙｃａｎ Ｐｒｅｓｅｎｔ ｏｎ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ， Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ」、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７７：４２５３０−９（２００２））。ＰｇｌＢは、真核グリコシル化プロセス（Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ）に使用されるものと同様のシークオンである、モチーフＤ／Ｅ−Ｘ1−Ｎ−Ｘ2−Ｓ／Ｔ（ここで、Ｄ／Ｅはアスパラギン酸／グルタミン酸であり、Ｘ1およびＸ2はプロリンを除く任意のアミノ酸であり、Ｎはアスパラギンであり、Ｓ／Ｔはセリン／トレオニンである）においてヘプタサッカリドをアスパラギンに結合する（Ｋｏｗａｒｉｋら、「Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ Ｓｉｔｅ Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」、Ｅｍｂｏ Ｊ ２５：１９５７−６６（２００６））。
微生物の糖鎖工学的操作（Ｇｌｙｃｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）
哺乳動物、酵母またはさらに細菌宿主細胞において治療用糖タンパク質を発現する場合に遭遇する主要な問題は非ヒトグリカンの付加である。例えば酵母は、治療用糖タンパク質を産生するための２つの最も頻繁に使用される系のうちの１つであり、高い免疫原性を持つマンナン型であるＮ−グリカン（最大１００個までのマンノース残基を含有する）を組換え糖タンパク質に転移する。哺乳動物発現系はまた、シアル酸のＮ−グリコシルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）型（ＣＨＯ細胞およびミルク中で産生される）または末端α（１，３）−ガラクトース（Ｇａｌ）（マウス細胞中で産生される）などの非ヒト糖残基を用いて治療用タンパク質を修飾しうる。非ヒト糖を保持する治療用タンパク質の反復投与は、ヒトにおける免疫反応を含む、有害反応を引き起こしうる。
治療用糖タンパク質を産生するための天然のグリコシル化系を使用する代替として、糖鎖工学的に操作した（ｇｌｙｃｏ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）発現系の利用可能性が、治療用タンパク質のグリコシル化をカスタマイズする可能性を切り開き、改善された治療用糖タンパク質の開発を導く可能性がある。そのような系は望ましくないグリカンを排除し、高い程度の均一性でヒトグリコシル化を実施する可能性を有する。酵母ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）は、特定の治療的機能のためのグリコシル化能力を発現系に与えるように糖鎖工学的に操作されている（Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｔ．Ｕ．、「Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔｓ ａｎｄ Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｆｕｎｇｉ」、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２２：１４０９−１４（２００４）；Ｈａｍｉｌｔｏｎら、「Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｉｎ Ｙｅａｓｔ：Ｔｈｅ Ａｄｖｅｎｔ ｏｆ Ｆｕｌｌｙ Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ Ｙｅａｓｔ」、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １８：３８７−９２（２００７）；およびＷｉｌｄｔら、「Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ Ｐａｔｈｗａｙｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ」、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ３：１１９−２８（２００５））。
例えば、糖鎖工学的に操作されたＰ．パストリス株のパネルが、モノクローナル抗体リツキサン（抗ＣＤ２０ ＩｇＧ１抗体）の種々のグリコフォームを産生するために使用された（Ｌｉら、「Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ＩｇＧｓ ｉｎ Ｇｌｙｃｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ」、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２４：２１０−５（２００６））。これらの抗体は市販のリツキサンと同一のアミノ酸配列を共有するが、特異的グリコフォームは、関連するＦＣγＲＩＩＩ受容体と比べて約１００倍高い結合親和性を示し、改善されたｉｎ ｖｉｔｒｏヒトＢ細胞枯渇を示した（Ｌｉら、「Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ＩｇＧｓ ｉｎ Ｇｌｙｃｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ」、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２４：２１０−５（２００６））。糖鎖工学的に操作したＰ．パストリスは大成功を収め、将来性もあるが、欠点を有さないわけではない。例えば、酵母および全ての他の真核生物において、Ｎ結合型グリコシル化は生存に不可欠である（Ｈｅｒｓｃｏｖｉｃｓら、「Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ」、ＦＡＳＥＢ Ｊ ７：５４０−５０（１９９３）およびＺｕｆｆｅｒｅｙら、「ＳＴＴ３，ａ Ｈｉｇｈｌｙ Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ Ｙｅａｓｔ Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｙｌ Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｉｎ ｖｉｖｏ」、ＥＭＢＯ Ｊ １４：４９４９−６０（１９９５））。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓおよび共同研究者は、望ましくない酵母Ｎ−グリコシル化反応の多くを体系的に排除し、再度工学的に操作した（Ｃｈｏｉら、「Ｕｓｅ ｏｆ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｔｏ Ｈｕｍａｎｉｚｅ Ｎ−ｌｉｎｋｅｄ Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｙｅａｓｔ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ」、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １００：５０２２−７（２００３））。しかしながら、マンナン型Ｎ−グリカンの排除は酵母におけるグリコシル化ストーリーの半分のみである。これは、酵母はまたＯ結合型グリコシル化を実施し、これによりＯ−グリカンが糖タンパク質におけるＳｅｒまたはＴｈｒ残基に結合するためである（Ｇｅｎｔｚｓｃｈら、「Ｔｈｅ ＰＭＴ Ｇｅｎｅ Ｆａｍｉｌｙ：Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｏ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｉｓ Ｖｉｔａｌ」、ＥＭＢＯ Ｊ １５：５７５２−９（１９９６））。Ｎ結合型グリコシル化と同様に、Ｏ−グリコシル化は生存に不可欠であり（Ｇｅｎｔｚｓｃｈら、「Ｔｈｅ ＰＭＴ Ｇｅｎｅ Ｆａｍｉｌｙ：Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｏ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｉｓ Ｖｉｔａｌ」、ＥＭＢＯ Ｊ １５：５７５２−９（１９９６））、したがって糖鎖工学的に操作された酵母から遺伝子的に欠失できない。酵母とヒトのＯグリコシル化機構の間に相違が存在するので、糖鎖工学的に操作された酵母株によるＯ−グリカンの可能な付加は免疫反応を含む有害反応を引き起こす可能性を有する。
Ａｅｂｉおよび彼の共同研究者はＣ．ｊｅｊｕｎｉのグリコシル化遺伝子座を大腸菌内に転移し、Ｎ−グリカンでタンパク質を翻訳後修飾する驚くべき能力をこれらの細胞に付与した（Ｗａｃｋｅｒら、「Ｎ−ｌｉｎｋｅｄ Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ ａｎｄ ｉｔｓ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎｔｏ Ｅ． ｃｏｌｉ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９８：１７９０−３（２００２））。しかしながら、原核および真核グリコシル化機構で共有される機能的類似性にも関わらず、原核グリコシル化機構（ＧａｌＮＡｃ5ＧｌｃＢａｃ）により結合されたオリゴ糖鎖は真核グリコシル化経路により結合されたものと構造的に異なる（Ｓｚｙｍａｎｓｋｉら、「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｍｕｃｏｓａｌ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ」、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ３：２２５−３７（２００５）；Ｙｏｕｎｇら、「Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｎ−ｌｉｎｋｅｄ Ｇｌｙｃａｎ Ｐｒｅｓｅｎｔ ｏｎ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ，Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ」、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７７：４２５３０−９（２００２）；およびＷｅｅｒａｐａｎａら、「Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ−ｌｉｎｋｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ：Ｆｒｏｍ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｔｏ Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ」、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １６：９１Ｒ−１０１Ｒ（２００６））。多数の試み（成功していない）が、構造的に均質のヒト様グリカンを用いてＮ結合型糖タンパク質を発現するように真核Ｎ−グリコシル化経路を用いて大腸菌を再プログラムするためになされている。
より最近、Ｖａｄｅｒｒａｍａ−Ｒｉｎｃｏｎら、「Ａｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎ Ｅ． ｃｏｌｉ」、Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏ ８、４３４−４３６（２０１２）により、原核宿主細胞が真核グリコシルトランスフェラーゼを用いて糖鎖工学的に操作されうることが示された。具体的には、原核宿主細胞におけるＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼおよびＧＤＰ−マンノーストランスフェラーゼの発現により、ほぼ全ての真核Ｎ結合型オリゴ糖構造の基礎となる、トリマンノシルコア構造の産生が実証された。しかしながら、完全に精巧なヒト様グリカンは依然としてさらなる糖鎖工学的操作を必要とする。
したがって、本発明は、高マンノース、ハイブリッドおよび複合型などのヒト様グリカンを産生することを対象とする。
本発明は、オリゴ糖組成物を産生するため、ならびに原核宿主細胞において組換え糖タンパク質を産生するための方法および物質を提供する。特異的Ｎ−グリカンを含む種々の糖タンパク質組成物が本発明の方法を使用して産生される。特定の実施形態において、所望のグリコフォームは優勢種として産生される。
本発明はまた、例えば、対象において免疫または免疫学的寛容（例えばアネルギー）を誘発するために、特異的オリゴ糖組成物を含むワクチン抗原を産生するための方法および物質を提供する。本発明の種々の態様は、樹状細胞および／または他の抗原提示細胞の表面上で発現されうるレクチンに結合しうる抗原−炭水化物コンジュゲートを対象とする。
本発明の第１の態様は、オリゴ糖組成物を産生する方法であって、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ残基の末端マンノース残基への転移を触媒する１つまたは複数のＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ酵素活性（ＥＣ２．４．１．１０１；ＥＣ２．４．１．１４３；ＥＣ２．４．１．１４５；ＥＣ２．４．１．１５５；ＥＣ２．４．１．２０１）を発現するように前記末端マンノース残基を有するオリゴ糖組成物を産生する組換え原核宿主細胞を培養するステップであって、末端ＧｌｃＮＡｃ残基を有するオリゴ糖組成物を産生するのに有効な条件下で実施される、ステップを含む、方法に関する。
本発明の第２の態様は、オリゴ糖組成物を産生する方法であって、宿主細胞を培養してＵＤＰ−ガラクトース残基の前記末端ＧｌｃＮＡｃ残基への転移を触媒する１つまたは複数のガラクトシルトランスフェラーゼ酵素活性（ＥＣ２．４．１．３８）を発現させるステップであって、末端ガラクトース残基を有するオリゴ糖組成物を産生するのに有効な条件下で実施される、ステップを含む、方法に関する。
本発明の第３の態様は、オリゴ糖組成物を産生する方法であって、宿主細胞を培養してＣＭＰ−ＮＡＮＡ残基の前記末端ガラクトース残基への転移を触媒する１つまたは複数のシアリルトランスフェラーゼ酵素活性（ＥＣ２．４．９９．４およびＥＣ２．４．９９．１）を発現させるステップであって、末端シアル酸残基を有するオリゴ糖組成物を産生するのに有効な条件下で実施される、ステップを含む、方法に関する。
本発明の他の態様は、溶解度向上融合タンパク質としての酵素の１つまたは複数の発現に関する。本発明のさらなる態様は、目的のタンパク質をコードする遺伝子へのグリカンの転移を含み、これにより宿主細胞はグリコシル化タンパク質を産生する。
さらなる態様は、優勢なグリコフォームを産生するためのさらなる酵素の培養条件および過剰発現を含む。本発明の特徴のある態様は、高マンノース、ハイブリッドおよび／または複合オリゴ糖組成物ならびに高マンノース、ハイブリッドおよび／または複合グリコシル化タンパク質を産生するために種々のグリコシルトランスフェラーゼ活性を発現する原核宿主細胞を提供する。
好ましい態様において、本発明は、糖タンパク質治療薬および診断薬を設計、発見および開発するための技術を商業化する。具体的には、本発明は、微生物細胞において真正のヒト糖タンパク質を効果的に産生するための有効で低コストの戦略の開発を提供する。種々の態様において、本発明の糖鎖工学的に操作した細菌はＮ結合型糖タンパク質を立体特異的に産生しうる。一実施形態において、細菌は、特異的アスパラギンアクセプター部位（例えば、Ｎ結合型グリコシル化）において標的タンパク質を効果的にグリコシル化しうる新規グリコシル化経路をコードする遺伝子で形質転換される。これらの特別に工学的に操作された細胞株を使用して、目的の種々の組換えタンパク質が発現され、グリコシル化されうる。
さらに、本発明は、例えば、タンパク質の薬物動態特性を変え、生物学的現象においてグリコシル化の役割を解明すると考えられる、原核生物におけるオリゴ糖構造の配列を工学的に操作するための方法を提供する。種々の態様において、本発明は、研究、工業および治療用途のための治療用タンパク質、新規糖鎖コンジュゲート、免疫促進剤（例えば、ワクチン）の生物工学的合成を提供する。
高マンノース型のＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2グリコフォームの産生の図である。予測されるＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2グリコフォームと一致する、ＧＬＹ０２から抽出した脂質放出グリカン（Ａ）のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトル（ｍ／ｚ １２５７．６）、および予測されるＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2グリコフォームと一致する、α１，２−マンノシダーゼでさらに処理した脂質放出グリカン（Ｂ）のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトル（ｍ／ｚ ９３３．４）。 ハイブリッドＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2グリコフォームの産生の図である。予測されるＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2グリコフォームと一致する、ＧＬＹ０３から抽出した脂質放出グリカン（Ａ）のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトル（ｍ／ｚ １１３６．５）、および予測されるＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2グリコフォームと一致する、β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼでさらに処理した脂質放出グリカン（Ｂ）のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトル（ｍ／ｚ ９３３．５）。 複合ＧｌｃＮＡｃ2Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2グリコフォームの産生の図である。予測されるＧｌｃＮＡｃ2Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2グリコフォームと一致する、ＧＬＹ０６．１から抽出した脂質放出グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトル（ｍ／ｚ １３３９．８）。 ハイブリッド分岐グリコフォームの産生の図である。予測されるＧｌｃＮＡｃ2Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2グリコフォームと一致する、ＧＬＹ０５から抽出した脂質放出グリカン（Ａ）のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトル（ｍ／ｚ １３３９．７）、および予測されるＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2グリコフォームと一致する、β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼでさらに処理した脂質放出グリカン（Ｂ）のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトル（ｍ／ｚ ９３３．５）。 多重アンテナグリコフォームの産生の図である。ｅｘ ｖｉｖｏで合成したグリカン（Ａ）のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトル、および予測されるＧｌｃＮＡｃ3Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2 と一致する、ＧＬＹ０６．１から抽出した脂質放出グリカン（Ｂ）のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトル（ｍ／ｚ １５４３．１）。 ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2グリコフォームの産生の図である。予測されるＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2グリコフォームと一致する、ＧＬＹ０４．１から抽出した脂質放出グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトル（ｍ／ｚ １２９８．７）。 Ｇａｌ2ＧｌｃＮＡｃ2Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2グリコフォームの産生の図である。ｅｘ ｖｉｖｏで合成したグリカン（Ａ）のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトル、および予測されるＧａｌ2ＧｌｃＮＡｃ2Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2と一致する、ＧＬＹ０４．２から抽出した脂質放出グリカン（Ｂ）のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトル（ｍ／ｚ １６６２．２）。 ＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2グリコフォームの産生の図である。予測されるＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2と一致する、ｅｘ ｖｉｖｏで合成したグリカンの陽イオンモードのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトル（ｍ／ｚ １５６５．７）。 グリカン収量の増大の図である。（Ａ）Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2グリコフォームと一致する、ＭａｎＣ／Ｂ（左）の過剰発現を有する（ＧＬＹ０１．２）または有さない（ＧＬＹ０１）、およびＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2グリコフォーム（ＧＮＭ３ＧＮ２）と一致するＧｌｍＳ（右）の過剰発現を有する（ＧＬＹ０１．１）または有さない（ＧＬＹ０１．３）、Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2グリカン標準（Ｍ３ＧＮ２ Ｓｔｄ）と共に実行した大腸菌から抽出した脂質放出グリカンの蛍光体支援糖質電気泳動（ＦＡＣＥ）。（Ｂ）示される通り、ＭａｎＣ／Ｂを過剰発現させ、グリセロールを補充したＧＬＹ０１．２から抽出した脂質放出グリカンの量。（Ｃ）いずれかの０．２％グリセロールまたはピルビン酸塩補充を有するＧＬＹ０１．２から抽出した脂質放出グリカンのＦＡＣＥ。 産物形成の増大の図である。（Ａ）ＧＬＹ０１株、（Ｂ）ＧＬＹ０２株、および（Ｃ）ＭａｎＣ／Ｂの過剰発現を有さないＧＬＹ０１．１株および（Ｄ）ＧＬＹ０１．４株、（Ｅ）ＧＬＹ０２．１株、および（Ｆ）ＭａｎＣ／Ｂの過剰発現を有するＧＬＹ０１．５株から抽出した脂質放出グリカンのＭＡＤＬＩ−ＴＯＦ質量スペクトル。ＭａｎＣ／Ｂの添加で、中間体グリコフォームに対応するピークの欠如を観察した。 グリコシル化グルカゴン産生の図である。Ｍ３、Ｍ５、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2、およびＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2糖ペプチドを産生する、種々の糖鎖工学的に操作した株由来のＣ末端グリコシル化部位で付加した部分的に精製したグルカゴンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ。 グリコシル化抗原の図である。４つの連続するＣ末端グリコシル化部位で付加し、抗ヘキサヒスチジン抗体（左）および末端アルファ−マンノースに特異的なコンカナバリンＡレクチン（右）で検出したＧＬＹ０１において発現した、腸外の病原性大腸菌（ＥｘＰＥＣ）に元々由来する、部分的に精製した（Ａ）３４７３タンパク質および（Ｂ）１２７５タンパク質のウエスタンブロット。
定義
用語および方法の以下の定義は、本開示をより良く説明するため、および当業者を本開示の実施について導くために提供される。
本明細書に述べられている全ての刊行物、特許および他の参考文献は、それらの全体が参照として本明細書に組み込まれる。
ＥＣ番号は、国際生化学分子生物学連合命名法委員会（Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＮＣ−ＩＵＢＭＢ））（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈｅｍ．ｑｍｕｌ．ａｃ．ｕｋ／ｉｕｂｍｂ／ｅｎｚｙｍｅ／において利用可能）によって確立されている。本明細書に参照されるＥＣ番号は、東京大学によって一部出資されている、京都遺伝子ゲノム百科事典（Ｋｙｏｔｏ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）によって維持されるＫＥＧＧ Ｌｉｇａｎｄデータベースに由来する。他に示さない限り、ＥＣ番号は２０１３年３月の日付でデータベースで提供されている通りである。
本明細書に参照される受託番号は、米国国立衛生研究所によって維持されているＮＣＢＩデータベース（国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ））に由来する。他に示さない限り、受託番号は２０１３年３月の日付でデータベースで提供される。
本発明の方法および技術は概して、他に示されない限り、当該分野において周知であり、本明細書全体にわたって引用され、説明される種々の一般的およびより専門的な参考文献に記載される従来の方法に従って実施される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９２年、および２００２年による補遺）；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９９０）；Ｔａｙｌｏｒ ａｎｄ Ｄｒｉｃｋａｍｅｒ、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ（２００３）；Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍａｎｕａｌ、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．、Ｆｒｅｅｈｏｌｄ，Ｎ．Ｊ．；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｓｅｃｔｉｏｎ Ａ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｖｏｌ Ｉ、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（１９７６）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｓｅｃｔｉｏｎ Ａ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｖｏｌ ＩＩ、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（１９７６）；Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ ｏｆ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９９）を参照のこと。
他に説明されない限り、本明細書に使用される全ての技術的および科学的用語は、本開示に属する当業者に一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様または等価の方法および物質が本開示を実施または試験する際に使用されてもよいが、適切な方法および物質は以下に記載される。物質、方法および実施例は例示のみであり、限定することを意図していない。本開示の他の特徴は以下の詳細な説明および請求項から明らかである。
仮出願における「請求項」という用語は実施形態または好ましい実施形態と同義語である。
本明細書に使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」を意味し、単数形「１つの（ａ）」もしくは「１つの（ａｎ）」または「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明確に反対を示さない限り、複数の参照を含む。例えば、「細胞を含む」という参照は、このような細胞の１つまたは複数を含む。「または」という用語は、文脈が明確に反対を示さない限り、述べられている代替の要素の単一の要素または２つ以上の要素の組合せを指す。
糖タンパク質に関して「ヒト様」という用語は、ヒトにおいて産生されるタンパク質と同様または全く同一である、タンパク質におけるアスパラギン残基のアミド窒素に結合した（Ｎ結合した）、結合したＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基を有するタンパク質を指す。
「Ｎ−グリカン」または「Ｎ結合型グリカン」とは、Ｎ結合型オリゴ糖構造を指す。Ｎ−グリカンは、タンパク質または合成糖タンパク質中間体に結合されうるものであり、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでさらに操作されうる。糖タンパク質に見出される優勢な糖は、グルコース（Ｇｌｕ）、ガラクトース（Ｇａｌ）、マンノース（Ｍａｎ）、フコース（Ｆｕｃ）、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）およびシアル酸（例えば、Ｎ−アセチル−ノイラミン酸（ＮｅｕＡｃまたはＮＡＮＡ））である。ヘキソース（Ｈｅｘ）もまた、見出されうる。Ｎ−グリカンは、「トリアマンノシルコア」に付加される周囲の糖（例えば、ＧｌｃＮＡｃ、ガラクトース、フコースおよびシアル酸）を含む分岐（「アンテナ」または「アーム」）の数に関して異なる。「トリアマンノシルコア」という用語は、「Ｍ３」、「Ｍ３ＧＮ２」、「トリアマンノースコア」、「五糖類コア」または「パウチマンノースコア」とも称され、Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2オリゴ糖構造を表し、その構造においてＭａｎα１，３アームおよびＭａｎα１，６アームがジ−ＧｌｃＮＡｃ構造（ＧｌｃＮＡｃ2）：β１，４ＧｌｃＮＡｃ−β１，４ＧｌｃＮＡｃから伸びる。Ｎ−グリカンは、それらの分岐した構成成分（例えば、高マンノース、複合またはハイブリッド）に従って分類される。
「高マンノース」型Ｎ−グリカンは、ジ−ＧｌｃＮＡｃオリゴ糖構造上に４つ以上のマンノース残基を含む。「Ｍ４」はＭａｎ4ＧｌｃＮＡｃ2を表し、「Ｍ５」はＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2を表す。
「ハイブリッド」型Ｎ−グリカンは、トリマンノースコアのα１，３マンノース（Ｍａｎα１，３）アームの末端上に少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃ残基およびトリマンノースコアのα１，６マンノース（Ｍａｎα１，３）アーム上にゼロまたは複数のマンノース
を有する。種々のＮ−グリカンは、「グリコフォーム」とも称される。ハイブリッドグリカンの例は「ＧＮＭ３ＧＮ２」であり、これはＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2である。
「複合」型Ｎ−グリカンは典型的に、Ｍａｎα１，３アームに結合される少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃ残基およびトリマンノースコアのＭａｎα１，６アームに結合される少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃを有する。複合Ｎ−グリカンはまた、シアル酸または誘導体で任意選択に修飾されるガラクトースまたはＮ−アセチルガラクトサミン残基を有してもよい（例えば、「Ｎｅｕ」はノイラミン酸を指し、「Ａｃ」はアセチルを指す）。複合Ｎ−グリカンはまた、「２つに分かれる」ＧｌｃＮＡｃおよびコアフコースを含む鎖間置換を有してもよい。複合Ｎ−グリカンはまた、しばしば、「多重アンテナグリカン」と称されるか、または「多分岐グリカン」とも呼ばれる、トリマンノースコア上に多重アンテナを有してもよく、これはトリアンテナ、テトラアンテナまたはペンタアンテナグリカンであってもよい。
「Ｇ０」という用語は、ＧｌｃＮＡｃ2Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2を指す。「Ｇ０（１）」という用語は、ＧｌｃＮＡｃ3Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2を指し、「Ｇ０（２）」という用語は、ＧｌｃＮＡｃ4Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2を指し、「Ｇ０（３）」という用語は、ＧｌｃＮＡｃ5Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2を指す。「Ｇ１」という用語は、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ2Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2を指し、「Ｇ２」は、Ｇａｌ2ＧｌｃＮＡｃ2Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2を指し、「Ｇ３」は、Ｇａｌ3ＧｌｃＮＡｃ3-5Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2を指し、「Ｇ４」は、Ｇａｌ4ＧｌｃＮＡｃ4-5Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2を指し、「Ｇ５」は、Ｇａｌ5ＧｌｃＮＡｃ5Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2を指す。「Ｓ１」という用語は、ＮＡＮＡＧａｌ1-5ＧｌｃＮＡｃ1-5Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2を指し、「Ｓ２」は、ＮＡＮＡ2Ｇａｌ2-5ＧｌｃＮＡｃ2-5Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2を指す。「Ｓ３」は、ＮＡＮＡ3Ｇａｌ3-5ＧｌｃＮＡｃ3-5Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2を指し、「Ｓ４」は、ＮＡＮＡ4Ｇａｌ4-5ＧｌｃＮＡｃ4-5Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2を指し、「Ｓ５」は、ＮＡＮＡ5Ｇａｌ5ＧｌｃＮＡｃ5Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2を指す。
本明細書に使用される場合、「優勢には」という用語または「優勢」もしくは「それは優勢である」などの変形は、糖タンパク質が除去された（例えば、ＰＮＧａｓｅで処理されグリカンが放出された）後、全Ｎ−グリカンのうち最も高いモルパーセント（％）を有すると測定されるグリカン種を意味すると理解され、質量分析、例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによって分析される。つまり、「優勢には」という語句は、任意の他の個々の実体より多いモルパーセントで存在する、特異的グリコフォームなどの個々の実体と定義される。例えば、組成物が４０モルパーセントのＡ種、３５モルパーセントのＢ種および２５モルパーセントのＣ種からなる場合、組成物は優勢にはＡ種を含む。「豊富な」、「均一」、「均質」および「から本質的になる」という用語もまた、グリカンに関して優勢と同義語である。
ポジティブモードにおいてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによって測定したＮ−グリカンのモル％とは、全Ｎ−グリカンのモル％に対して転移したサッカリドのモル％を指す。Ｋ＋およびＮａ＋などの特定のカチオン付加物は、通常、溶出されるピークと関連し、それぞれの付加物の分子量によってＮ−グリカンの質量は増加する。
他に示されない限り、および一般形式「配列番号」として本明細書に記載される全ての配列についての例として、「配列番号１を含む核酸」とは、少なくとも一部が、（ｉ）配列番号１の配列、または（ｉｉ）配列番号１と相補的な配列のいずれかを有する、核酸を指す。２つの間の選択は文脈により決定される。例えば、核酸がプローブとして使用される場合、２つの間の選択は、プローブが所望の標的に相補的であるという要求によって決定される。
「単離された」または「実質的に純粋な」核酸またはポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡまたは混合ポリマー）または糖タンパク質は、その天然宿主細胞における天然ポリヌクレオチドに天然に付随する他の細胞構成成分、例えば、それが天然に会合するリボソーム、ポリメラーゼおよびゲノム配列から実質的に分離されているものである。この用語は、（１）その天然に存在する環境から除去されている、（２）「単離されたポリヌクレオチド」が天然に見出されるポリヌクレオチドの全てまたは一部と会合していない、（３）それが天然に結合しないポリヌクレオチドに作動可能に結合される、または（４）天然に存在しない、核酸、ポリヌクレオチドを含む。「単離された」または「実質的に純粋」という用語はまた、組換えまたはクローニングされたＤＮＡ単離体、化学的に合成されたポリヌクレオチド類似体または異種系によって生物学的に合成されるポリヌクレオチド類似体に関して使用されうる。
しかしながら、「単離された」は、このように記載される核酸、ポリヌクレオチドまたは糖タンパク質が、それ自体でその天然環境から物理的に除去されていることを必ずしも必要としない。例えば、生物のゲノム内の内因性核酸配列は、この内因性核酸配列の発現が変更されるように、異種配列が内因性核酸配列に隣接して配置されている場合、「単離された」とみなされる。この文脈において、異種配列がそれ自体内因性である（同じ宿主細胞またはその子孫に由来する）か、または外因性である（異なる宿主細胞またはその子孫に由来する）かに関わらず、異種配列は内因性核酸配列に天然に隣接しない配列である。例として、プロモーター配列は、この遺伝子が変化した発現パターンを有するように、（例えば、同種組換えにより）宿主細胞のゲノム内の遺伝子の天然プロモーターに置換されてもよい。この遺伝子は、それが天然に隣接する配列の少なくとも一部から分離されるため、ここで「単離された」状態となる。
核酸はまた、それがゲノム内の対応する核酸に対して天然に存在しない任意の改変を含有する場合、「単離された」とみなされる。例えば、内因性コード配列は、それが、例えば、ヒトの介入によって人工的に導入される挿入、欠失または点突然変異を含有する場合、「単離された」とみなされる。「単離された核酸」はまた、異種部位において宿主細胞染色体内に組み込まれた核酸およびエピソームとして存在する核酸構築物を含む。さらに、「単離された核酸」は、組換え技術によって産生される場合、他の細胞性物質もしくは培養培地を実質的に含まなくてもよく、または化学的に合成される場合、化学前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まなくてもよい。
本明細書に使用される場合、治療用タンパク質の「治療有効量」という用語は、所与の疾患および／またはその合併症の臨床症状を治癒、軽減または部分的に停止するのに十分な量を指す。これを達成するのに適した量は、「治療有効量」と定義される。各々の目的に対する有効量は、疾患または損傷の重症度ならびに対象の体重および全身状態に依存する。適切な投薬量の決定は、値のマトリクスを構築し、マトリクスにおける異なる点を試験することによる、通常の実験を使用して達成されてもよく、それらの全ては熟練した医師または獣医師の通常の技量レベルの範囲内であることは理解される。
本明細書に使用される場合、「治療」、「治療している」という用語およびそれらの他の変形は、疾患または障害などの状態に対処する目的のための患者または対象の管理およびケアを指す。この用語は、患者が苦しんでいる所与の状態についてのあらゆる処置、例えば、症状もしくはその合併症を軽減すること、疾患、障害もしくは状態の進行を遅延させること、疾患、障害もしくは状態を処置または排除すること、および／または状態の予防、ここで予防とは疾患、状態もしくは障害に対処する目的のための患者の管理およびケアとして理解される、を含むことが意図され、また、症状または合併症の発症を予防するために問題となっている活性化合物を投与することを含む。治療される患者は好ましくは哺乳動物、特にヒトであるが、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギまたはブタなどの他の動物の治療が本発明の範囲内である。
例えば、重度の低血糖症（低血糖）を生じるインスリン昏睡またはインスリン反応を患っている患者についての本発明のグルカゴンペプチドの治療有効量は成人に対して１ｍｇ（１単位）である。４４ｌｂ（２０ｋｇ）未満の体重の小児に対して治療有効量は０．５ｍｇである。（１）患者が意識不明である、（２）患者が糖または糖入り製品を食べることができない、（３）患者が発作を有する、または（４）通常の清涼飲料水または果汁などの糖もしくは糖入り製品の反復投与が患者の状態を改善しない場合、グルカゴンが与えられる。他の場合、用量は０．２５単位〜２単位の範囲であってもよく、それは筋肉内または静脈内に投与されてもよい。１ミリグラムの純粋なグルカゴンが１単位とほぼ等しい。投薬スケジュールは異なり得るが、１日に約１回から事象ごとに必要に応じてでありうる。実際のスケジュールは、患者に投与されるグルカゴンの種類（グルカゴンまたはグルコシル化グルカゴン）および個々の患者の反応を含む、多くの要因に依存する。より高い用量範囲は典型的には低血糖用途に使用されないが、他の治療用途に有用であってもよい。患者にとって適切な用量を達成し、確立する手段は当該分野において周知であり、一般に実施される。
本明細書に使用される場合、「薬学的に許容される」という用語は、その通常の意味を与えられる。薬学的に許容される組成物は概して製剤の他の物質と適合性があり、概して対象に有害ではない。
本発明の任意の組成物は治療有効量で対象に投与されてもよい。ワクチンに関して、本明細書に使用される場合、「治療有効」または「有効」な量もしくは用量は、対象内で免疫または寛容を誘発する、および／または対象が疾患に（例えば、外来性病原体、がん、自己免疫疾患などに対して）、より効果的に抵抗しうるのに必要な量を意味する。対象に投与される場合、有効量は処置される特定の状態および希望する結果に依存する。治療有効用量は、例えば、以下にさらに記載されるものなどの要因を利用して、および単に通常の実験だけを使用して当業者により決定されうる。
いくつかの実施形態において、治療有効量は細胞培養アッセイから最初に決定されうる。例えば、樹状細胞反応を誘発するのに有用な本発明の組成物の有効量は刺激指数に関してｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを使用して評価されうる。刺激指数は特定の対象についての本発明の特定の組成物の有効量を決定するために使用されてもよく、投薬量は対象において所望のレベルを達成するように上方または下方に調整されてもよい。治療有効量はまた、動物モデルから決定されてもよい。適用される用量は相対的バイオアベイラビリティおよび投与される組成物の効力に基づいて調整されてもよい。上記の方法および他の方法に基づいて最大効果を達成するために用量を調節することは当業者の能力の範囲内である。これらの用量は単に通常の実験のみを使用して調整されうる。
本発明の組成物を対象に投与する際に、投薬量、投薬スケジュール、投与経路などは、これらの組成物の既知の活性に影響を及ぼすように選択されうる。投薬量は、任意選択に本発明の組成物のアッセイの結果と組み合わせて、実験モデルの結果に基づいて推定されうる。投薬量は投与様式に応じて局所または全身の所望の組成レベルを達成するように適切に調整されうる。投薬量は１日当たり１回または複数回投与で与えられてもよい。特定の対象の反応がこのような用量で不十分である事象において、さらに高い用量（または異なる、より局所的な送達経路による効果的に高い用量）が、対象の耐性が許容する程度まで利用されてもよい。１日当たりの複数回投与もまた、いくつかの場合、対象内または対象の活性部位内における組成物の適切な全身レベルを達成するために意図される。
対象に対する組成物の用量は、組成物の治療有効量が、対象内の組成物の活性部位、すなわち、身体内の樹状細胞および／または他の抗原提示細胞に到達するような用量であってもよい。投薬量は、いくつかの場合、対象におけるあらゆる潜在的に有害な副作用を回避または最小化しながら、最大量で与えられてもよい。実際に投与される組成物の投薬量は、活性部位において所望される最終濃度、対象への投与方法、組成物の有効性、対象における組成物の寿命、投与のタイミング、（例えばカクテルのような）併用治療の効果などの要因に依存する。送達される用量はまた、対象に関連する状態に依存してもよく、いくつかの場合、対象ごとに異なり得る。例えば、対象の年齢、性別、体重、大きさ、環境、健康状態または健康の現在の状態もまた、必要とされる用量および／または活性部位における組成物の濃度に影響を与えうる。投薬量の違いは異なる個体の間で発生してもよく、または同じ個体で異なる日に発生してもよい。最高用量、すなわち、健全な医学的判断に従って最も高い安全な用量が使用されることが好適でありうる。好ましくは、剤形は対象に実質的に有害な影響を及ぼさないような剤形である。特定の実施形態において、組成物は予防的手段として対象に投与されてもよい。いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、人口統計または疫学研究に基づいて対象に投与されてもよいか、または特定の分野もしくは経歴の対象に投与されてもよい。
本発明の組成物の投与は、組成物がその標的、すなわち、身体内の樹状細胞および／または他の抗原提示細胞に到達しうる、任意の医学的に許容される方法によって達成されうる。選択される特定の様式は、もちろん、以前に記載されている要因、例えば、特定の組成物、処置される対象の状態の重症度、治療効果に必要とされる投薬量などの要因に依存する。本明細書に使用される場合、処置の「医学的に許容される」様式は、臨床的に許容されない有害な作用を引き起こさずに対象において組成物の効果的なレベルを生じうる様式である。
任意の医学的に許容される方法が対象へ組成物を投与するために使用されてもよい。投与は、処置される状態に応じて、局所的（すなわち、特定の領域、生理学系、組織、器官または細胞種類）または全身的であってもよい。例えば、組成物は、肺、経鼻的、経皮的、非経口注射もしくは移植を介して、外科的投与により、または本発明の組成物による標的への接近が達成される任意の他の投与方法で投与されてもよい。本発明と共に使用されうる非経口様式の例には、静脈内、皮内、皮下、腔内、筋肉内、腹腔内、硬膜外または髄腔内が含まれる。移植様式の例には、任意の移植可能性または注射可能性がある薬物送達系が含まれる。
本発明の特定の実施形態において、本発明の組成物の投与は、特定の期間、例えば、数時間、数日、数週、数ヶ月または数ヶ年にわたって組成物への連続曝露を生じるように設計されうる。これは、例えば、上記の方法の１つによる本発明の組成物の反復投与によって、または組成物が反復投与をせずに長期間にわたって送達される、持続もしくは制御放出送達系によって達成されうる。このような送達系を使用した組成物の投与は、例えば、経口剤形、ボーラス注射、経皮パッチまたは皮下移植によってであってもよい。実質的に一定の濃度の組成物を維持することが、いくつかの場合、好適でありうる。
組成物はまた、所定のスケジュールで投与されてもよいが、代替として、症状が現れた場合に投与されてもよい。本明細書に使用される場合、「所定のスケジュール」とは、予め決められた指定された期間を指す。所定のスケジュールは、そのスケジュールが予め決められる限り、同一の長さまたは異なる長さである期間を含みうる。例えば、所定のスケジュールは、毎日、２日毎、３日毎、４日毎、５日毎、６日毎、毎週、隔週、毎月、隔月または任意の設定した数の日もしくは週の間隔で、２カ月毎、３カ月毎、４カ月毎、５カ月毎、６カ月毎、７カ月毎、８カ月毎、９カ月毎、１０カ月毎、１１カ月毎、１２カ月毎などの組成物の投与を含みうる。あるいは、予め決められた所定のスケジュールは、最初の週の間、毎日、続いて数カ月の間、毎月、次いでその後、３カ月毎の組成物の投与を含みうる。特定の日における投与を伴う適切なスケジュールが前もって決定される限り、任意の特定の組合せが、所定のスケジュールに含まれる。
いくつかの場合、組成物はアレルギー事象を予防するためにアレルギー事象を予測して対象に投与される。アレルギー事象は、必ずしも限定されないが、喘息発作、季節性アレルギー性鼻炎（例えば、花粉熱、花粉、ブタクサ過敏症）または通年性アレルギー性鼻炎（例えば、本明細書に記載されるものなどのアレルゲンに対する過敏症）であってもよい。いくつかの場合、組成物はアレルギー事象の実質的に前に投与される。本明細書に使用される場合、「実質的に前」とは、アレルギー事象の少なくとも６カ月、少なくとも５カ月、少なくとも４カ月、少なくとも３カ月、少なくとも２カ月、少なくとも１カ月、少なくとも３週間、少なくとも２週間、少なくとも１週間、少なくとも５日、または少なくとも２日前を意味する。
同様に、組成物は、アレルギー事象の直前（例えば、アレルギー事象の４８時間以内、２４時間以内、１２時間以内、６時間以内、４時間以内、３時間以内、２時間以内、１時間以内、３０分以内または１０分以内）、アレルギー事象と実質的に同時（例えば、対象がアレルゲンと接触しているか、またはアレルギー症状を経験している時間の間）またはアレルギー事象の後に投与されうる。対象を特定のアレルゲンに対して脱感作するために、抗原またはアレルゲンを含有するコンジュゲートが、従来の脱感作療法と整合するようなある期間にわたって、非常に少ない用量で投与されてもよい。
本発明による使用に適した他の送達系には、徐放、遅延放出、持続放出または制御放出送達系が含まれる。このような系は、多くの場合、組成物の反復投与を回避する可能性があり、対象に対する利便性を向上する。多くの種類の放出送達系が当業者に利用可能であり、知られている。それらには、例えば、ポリ乳酸および／もしくはポリグリコール酸、ポリ無水物、ポリカプロラクトンならびに／またはそれらの組合せなどのポリマーベースの系；コレステロール、コレステロールエステルなどのステロール、ならびにモノグリセリド、ジグリセリドおよびトリグリセリドなどの脂肪酸または中性脂肪を含む脂質ベースである非ポリマー系；ヒドロゲル放出系；リポソームベースの系；リン脂質ベースの系；シラスティック系；ペプチドベースの系；ワックスコーティング；従来の結合剤および賦形剤を使用した圧縮錠剤；または部分的に融合されたインプラントが含まれる。製剤は、例えば、ミクロスフェア、ヒドロゲル、ポリマーリザーバ、コレステロールマトリクスまたはポリマー系などであってもよい。いくつかの実施形態において、系は、例えば、組成物を含有する製剤の拡散または浸食／分解率の制御により、組成物の持続または制御放出を可能にする場合がある。加えて、ポンプベースのハードウェア送達系が、本発明の１つまたは複数の実施形態を送達するために使用されてもよい。
長期の放出装置の使用が本発明のいくつかの実施形態において特に好適でありうる。本明細書に使用される場合、「長期の放出」は、組成物を含有する装置が、少なくとも３０または４５日の間、好ましくは少なくとも６０または９０日の間、またはいくつかの場合、さらにより長い間、治療有効レベルの組成物を送達するように構築され、配置されることを意味する。長期の放出インプラントは当業者に周知であり、上記の放出系のいくつかを含む。
グリコシル化工学的操作
本明細書に提供される新規発現系および方法を使用して、本発明の種々の態様が、原核宿主細胞の糖鎖工学的操作によって高マンノース、ハイブリッドおよび複合グリカンを産生するために提供される。本発明の１つの態様は、構造的に均質のヒト様グリカンを用いてＮ結合型糖タンパク質を発現する生合成経路を含む組換え原核宿主に関する。本発明の応用は治療用タンパク質のための改善された生化学および薬物動態安定性を含む。さらなる実施形態は、対象において防御免疫を引き起こしうる炭水化物がコンジュゲートしたワクチンを産生するための方法および組成物を提供する。安全でより効果的な糖タンパク質およびワクチンを産生するための迅速な微生物に基づいた製造プロセスが本発明の目的である。
原核生物における高マンノース型のグリカン産生
トリマンノシルコアから構築して、本発明は、図１に示されるように高マンノース型のグリカンを産生するマンノシルトランスフェラーゼ酵素の組換え発現のための方法を提供する。一実施形態において、この方法は、組換え原核宿主細胞を培養して、原核宿主細胞において２つのＧＤＰ−マンノース残基のトリマンノースオリゴ糖組成物への転移を触媒する１つまたは複数のアルファ−１，２−マンノシルトランスフェラーゼ酵素活性（ＥＣ２．４．１．１３１）を発現させるステップを提供する。実施例３はα−１，２−マンノシルトランスフェラーゼ酵素活性（ＥＣ２．４．１．１３１）の発現を記載している。好ましいα−１，２−マンノシルトランスフェラーゼ酵素活性は、溶解度向上剤である、ＧＳＴに融合されるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ａｌｇ１１によってコードされる。表Ｉは種々の溶解度向上剤を記載している。
したがって、本発明は、高マンノース型のオリゴ糖組成物を産生する方法であって、末端マンノース残基を有するオリゴ糖組成物を産生する組換え原核宿主細胞を培養して、ＧＤＰ−マンノース残基の末端マンノース残基への転移を触媒する１つまたは複数のアルファ−１，２−マンノシルトランスフェラーゼ酵素活性（ＥＣ２．４．１．１３１）を発現させるステップであって、少なくとも４つの末端マンノース残基を有するオリゴ糖組成物を産生するのに有効な条件下で実施される、ステップを含む、方法を提供する。特定の実施形態において、オリゴ糖組成物はトリマンノースコア上に少なくとも２つのさらなるマンノース残基を含む。好ましい実施形態において、ワクチン候補が、Ｍ５グリコフォームにＮ結合する原核宿主細胞において組換えにより発現される。図１に示される主要なグリコフォームの予想される構造は、Ｍａｎα１−２Ｍａｎα１−２Ｍａｎα１−３（Ｍａｎα１−６）−Ｍａｎβ１−４−ＧｌｃＮＡｃβ１−４−ＧｌｃＮＡｃである。
本発明の原核宿主細胞において、糖タンパク質のグリコシル化前にグリコシル化酵素が脂質結合型グリカンに対して作用する。真核生物において、アルファ−１，２−マンノシルトランスフェラーゼが小胞体膜の細胞質側でドリコールピロリン酸に結合するトリマンノースコアグリカンに対して作用する。次いで、Ｍａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2−ドリコールピロリン酸は、フリッピング前のオリゴ糖の完全な構築を確実にするためにＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2−ドリコールピロリン酸に高度に特異的である内因性フリッパーゼ酵素によって小胞体内にフリップされる（Ｓａｎｙａｌ ＆ Ｍｅｎｏｎ、ＰＮＡＳ２００９）。原核生物において、Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2脂質はフリップされうることが示されており（Ｖａｌｄｅｒｒａｍａ−Ｒｉｎｃｏｎら、「Ａｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ」、Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．ＡＯＰ（２０１２））、フリッピングに対する特異性は知られておらず、トリマンノースコアを越えたオリゴ糖の構築を危険にさらす。したがって、本発明の目的は、マンノース残基をＭ３オリゴ糖基質へ転移し、さらにペリプラズム内でオリゴ糖のフリッピング活性を触媒する原核系においてＭａｎ7-9ＧｌｃＮＡｃ2、Ｍａｎ6ＧｌｃＮＡｃ、Ｍａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2およびＭａｎ4ＧｌｃＮＡｃ2を含む、高マンノース型のオリゴ糖組成物を産生することである。好ましい実施形態において、宿主細胞は、５０モル％またはそれ以上の高マンノース型のグリカンを産生する。
原核生物におけるＧｎＴ発現
特定の態様において、オリゴ糖組成物を産生する方法であって、前記末端マンノース残基を有するオリゴ糖組成物を産生する組換え原核宿主細胞を培養して、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ残基の末端マンノース残基への転移を触媒する１つまたは複数のＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ酵素活性（ＥＣ２．４．１．１０１；ＥＣ２．４．１．１４３；ＥＣ２．４．１．１４５）を発現させるステップであって、末端ＧｌｃＮＡｃ残基を有するオリゴ糖組成物を産生するのに有効な条件下で実施される、ステップを含む、方法が提供される。真核生物において、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼはグリコシル化タンパク質のアスパラギン残基に共有結合するオリゴ糖に対して作用する。原核生物において、オリゴ糖は、ハイブリッドおよび複合オリゴ糖の産生を危険にさらす、タンパク質グリコシル化プロセスとは関係なく産生される。
ハイブリッドグリコフォームを産生するために、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ残基が、アクセプター基質である、トリマンノシルコアオリゴ糖構造のＭａｎα１，３アームへ転移される。例示的な実施形態において、本発明は、Ａｌｇ１３、Ａｌｇ１４、Ａｌｇ１およびＡｌｇ２を発現する宿主細胞において、溶解度向上剤である、ＭＢＰに融合されるＮ．ｔａｂａｃｕｍ ＧｎＴＩをコードする遺伝子で形質転換された原核宿主細胞を提供する。ハイブリッドグリコフォームＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2は図２Ａに示されるように産生される。示されるグリコフォームの予想される構造は、β１−２−ＧｌｃＮＡｃＭａｎα１−３（Ｍａｎα１−６）−Ｍａｎβ１−４−ＧｌｃＮＡｃβ１−４−ＧｌｃＮＡｃである。
複合グリコフォームを産生するために、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ残基は、アクセプター基質である、トリマンノシルコアオリゴ糖構造のＭａｎα１，３およびＭａｎα１，６アームの両方に転移される。この実施形態において、原核宿主細胞は、Ａｌｇ１３、Ａｌｇ１４、Ａｌｇ１、Ａｌｇ２およびＧｎＴＩを発現する宿主細胞においてＭＢＰに融合されるヒトＧｎＴＩＩをコードする遺伝子で形質転換される。複合ＧｌｃＮＡｃ2Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2（Ｇ０）グリコフォームは図３に示されるように産生され、予想される構造はβ１−２−ＧｌｃＮＡｃＭａｎα１−３（β１−２−ＧｌｃＮＡｃ Ｍａｎα１−６）−Ｍａｎβ１−４−ＧｌｃＮＡｃβ１−４−ＧｌｃＮＡｃである。
本発明のさらなる態様において、多重アンテナグリカンが産生される。例えば、原核宿主細胞は、Ａｌｇ１３、Ａｌｇ１４、Ａｌｇ１、Ａｌｇ２およびＧｎＴＩを発現する宿主細胞においてＭＢＰに融合されるウシＧｎＴＩＶをコードする遺伝子で形質転換される。図４Ａは、本発明の方法を使用して産生されたＧｌｃＮＡｃ2Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2ハイブリッドグリコフォームを示し、２つのＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ残基はトリマンノシルコアのＭａｎα１，３アームへ転移される。示されるグリコフォームの予想される構造は、β１−２−ＧｌｃＮＡｃ（β１−２−ＧｌｃＮＡｃ）Ｍａｎα１−３（Ｍａｎα１−６）−Ｍａｎβ１−４−ＧｌｃＮＡｃβ１−４−ＧｌｃＮＡｃである。
代替の実施形態において、グリカンはまた、例えば、実施例７に記載されるオリゴ糖の酵素合成により、ｅｘ ｖｉｖｏで形成されてもよい。例えば、図５は、２つのＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ残基のＭａｎα１，３アームへの転移および１つのＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ残基の、トリマンノシルコアオリゴ糖構造のＭａｎα１，６アームへの転移を生じる、ＧｎＴＩ、ＧｎＴＩＩ、ＧｎＴＩＶ（ｅｖ ｖｉｖｏ）、Ａｌｇ１３、Ａｌｇ１４、Ａｌｇ１およびＡｌｇ２を発現することによって産生される、ＧｌｃＮＡｃ3Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2グリコフォームを含む複合多重アンテナグリカンのＭＳを示す。示されるグリコフォームの予想される構造は、（β１−２−ＧｌｃＮＡｃＭａｎα１−３）β１−２−ＧｌｃＮＡｃ（β１−２−ＧｌｃＮＡｃ Ｍａｎα１−６）−Ｍａｎβ１−４−ＧｌｃＮＡｃβ１−４−ＧｌｃＮＡｃである。
ＧｎＴＶ（ＥＣ２．４．１．１５５）およびＧｎＴＶＩ（２．４．１．２０１）などのさらなるＧｎＴ活性が原核系において発現されうる。結果として、本発明の方法を使用して、トリマンノースコア上で最大で５つの分岐の多重アンテナグリカンが実現されうる。複数の分岐したグリカンは、例えば、エリスロポエチンにおけるシアル化を向上させることが可能であり、血清半減期および効力を増加させる（Ｅｌｌｉｏｔ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２００３；Ｍｉｓａｉｚｕ、Ｂｌｏｏｄ １９９５）。
グリコシルトランスフェラーゼ溶解度向上剤
種々のＧｎＴｓが宿主細胞において発現されうるが、好ましい実施形態において、ＧｎＴｓは、例えばＭＢＰに融合され、末端ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ残基をトリマンノシルコアへ転移する融合タンパク質として発現され、実際にグリコシルトランスフェラーゼの溶解度を向上させる。表１は、膜標的化ドメインおよび溶解度向上剤のクラスを提供しているリストを提供する。
融合物のライブラリーを使用して、ＧｌｃＮＡｃ(1-5)Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2などのグリカンが本発明の原核系において産生される。本発明の特定の態様において、ＭＢＰ融合グリコシルトランスフェラーゼが原核宿主において発現される。他の膜標的化ドメインおよび溶解度向上剤、例えばＭｓｔＸもまた、発現されうる。このようなＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ−ＭＢＰまたはＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ−ＭｓｔＸ融合物は、アクセプターオリゴ糖基質へのＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ残基の付加についてスクリーニングされる。好ましい実施形態において、以下の融合物：Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ ＧｎＴＩ−ＭＢＰ、Ｈ．Ｓａｐｉｅｎｓ ＧｎＴＩＩ−ＭＢＰ、Ｂ．ｔａｕｒｕｓ ＧｎＴ ＩＶ−ＭＢＰは、トリマンノシルコアへのＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ転移をもたらす。したがって、ＧｎＴ融合物のライブラリーが、原核宿主細胞においてハイブリッド、複合およびマルチアンテナグリカンを産生するために作製されうる。本発明の方法を使用して種々のＧｎＴ融合構築物が作製されうる。このような融合構築物は本発明の範囲内であり、より良い活性または向上した溶解度についてスクリーニングされうる。
原核生物におけるガラクトシルトランスフェラーゼ発現
本発明のさらなる態様において、オリゴ糖組成物を産生する方法であって、宿主細胞を培養して、ＵＤＰ−ガラクトース残基の前記末端ＧｌｃＮＡｃ残基への転移を触媒する１つまたは複数のガラクトシルトランスフェラーゼ酵素活性（ＥＣ２．４．１．３８、ＥＣ２．７．８．１８）を発現させるステップであって、末端ガラクトース残基を有するオリゴ糖組成物を産生するのに有効な条件下で実施される、ステップを含む、方法が提供される。図６は、大腸菌において産生されるハイブリッドグリコフォームＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2のＭＳを示す。実施例５は、ＵＤＰ−ガラクトース残基を、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2アクセプターオリゴ糖へ転移する、大腸菌におけるＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ β−１，４ＧａｌＴの発現を記載している。
原核生物においてハイブリッドガラクトシル化グリコフォームを産生するために、ＵＤＰ−ガラクトース残基を、複合グリコフォームのためのトリマンノシルコアのβ−１，２ＧｌｃＮＡｃＭａｎα１，３ならびにトリマンノシルコアのβ−１，２ＧｌｃＮＡｃＭａｎα１，３およびβ−１，２ＧｌｃＮＡｃＭａｎα１，６アームの両方へ転移する。このような実施形態において、原核宿主細胞が、Ａｌｇ１３、Ａｌｇ１４、Ａｌｇ１、Ａｌｇ２、ＧｎＴＩおよびＧｎＴＩＩを発現する宿主細胞においてＨ．ｐｙｌｏｒｉ ＧａｌＴをコードする遺伝子で形質転換される。実施例８は、複合Ｇａｌ2ＧｌｃＮＡｃ2Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2グリコフォームを産生する方法を提供する。図７は、複合ガラクトシル化グリカンＧａｌ2ＧｌｃＮＡｃ2Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2の質量と相関するｍ／ｚ１６６２．２におけるピークを示す。Ｇａｌ(1-4)ＧｌｃＮＡｃ2Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2を含む、さらなるガラクトシル化グリコフォームが産生されうる。ハイブリッド末端ガラクトースグリカンの予想される構造は、β１−４Ｇａｌβ１−２−ＧｌｃＮＡｃＭａｎα１−３（Ｍａｎα１−６）−Ｍａｎβ１−４−ＧｌｃＮＡｃβ１−４−ＧｌｃＮＡｃであり、複合末端ガラクトースグリカンは、β１−４Ｇａｌβ１−２−ＧｌｃＮＡｃＭａｎα１−３（β１−４Ｇａｌβ１−２−ＧｌｃＮＡｃ Ｍａｎα１−６）−Ｍａｎβ１−４−ＧｌｃＮＡｃβ１−４−ＧｌｃＮＡｃである。
限定されないが、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｄｏｎｏｖａｎｉ、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ（ＧＡＬＴ）、Ｂｏｓ Ｔａｕｒｕｓ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉａ，ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ（ＧａｌＴ Ｉ）、Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ、Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ ｇｒｉｓｅｕｓ、Ｅｑｕｕｓ ｃａｂａｌｌｕｓ、Ｍａｃｒｏｐｕｓ ｅｕｇｅｎｉｉ（４β−ＧａｌＴ）、Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ（ＧａｌＴ Ｉ）およびＳｕｓ ｓｃｒｏｆａ、Ｏｖｉｓ ａｒｉｅｓを含む、種々の他の生物由来のガラクトシルトランスフェラーゼが発現されてもよい。
いくつかの実施形態において、種々のガラクトシルトランスフェラーゼ酵素活性は、ＭＢＰまたはｍｓｔＸなどの溶解度向上剤に融合され、ＵＤＰ−ガラクトースのアクセプターオリゴ糖基質への付加についてスクリーニングされる。ＧｎＴｓと異なり、ヒトおよびウシＧａｌＴ−ｍｓｔＸ融合物は、ＵＤＰ−ガラクトースを末端ＧｌｃＮＡｃオリゴ糖基質へ転移するように見えなかった。
より好ましい実施形態において、酸化細菌株がＨ．ｐｙｌｏｒｉ β−１，４−ＧａｌＴの発現のために使用される。
例示的な実施形態において、以下の酵素が、原核宿主：Ａｌｇ１３、Ａｌｇ１４、Ａｌｇ１、Ａｌｇ２、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｃｕｍ ＧｎＴＩ、ヒトＧｎＴＩＩ、ウシＧｎＴＩＶ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ β−１，４ＧａｌＴにおいて発現される。ＧｎＴｓおよびＧａｌＴは酸化細菌宿主において発現される。
原核生物におけるシアリルトランスフェラーゼ発現
完全な複合オリゴ糖構造は末端シアル酸、例えばＮＡＮＡ残基において終端する。原核生物におけるシアリルトランスフェラーゼの発現はかなり興味深い。これまで、いくつかのグループが、何年間も糖タンパク質産生のためのシアル酸転移のタスクを引き受けていたが、原核生物においてヒト様グリカンを産生するためのシアル酸転移の産生についての報告は存在していない。
したがって、本発明は、組換え原核宿主を培養して、ＣＭＰ−ＮＡＮＡ残基の末端ガラクトース残基への転移を触媒する１つまたは複数のシアリルトランスフェラーゼ酵素活性（ＥＣ２．４．９９．４およびＥＣ２．４．９９．１）を発現させるステップであって、末端シアル酸残基を有するオリゴ糖組成物を産生するのに有効な条件下で実施される、ステップによってオリゴ糖組成物を産生する方法を提供する。ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏのいずれかで本発明の方法を使用して種々のシアリルトランスフェラーゼが発現される。一実施形態において、α−２，３シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．９９．４）が宿主細胞または培養培地において発現される。さらなる実施形態において、α−２，６シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．９９．１）が宿主細胞または培養培地において発現される。
好ましい実施形態において、以下の酵素：Ａｌｇ１３、Ａｌｇ１４、Ａｌｇ１、Ａｌｇ２、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｃｕｍ ＧｎＴＩ、ウシＧｎＴＩＶ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ β−１，４−ＧａｌＴおよびＰ．ｄａｍｓｅｌａｅ ＳＴ６が原核宿主において発現される。この方法は、ＣＭＰ−ＮＡＮＡの正確なオリゴ糖基質への適切な転移を実証するｉｎ ｖｉｖｏおよびｅｘ ｖｉｖｏ反応の組合せを可能にしうる。図８に示されるように、ハイブリッドシアリル化グリコフォームが産生され、ここで示されるグリコフォームの予想される構造は、２，６ＮＡＮＡβ１−４Ｇａｌβ１−２−ＧｌｃＮＡｃＭａｎα１−３（Ｍａｎα１−６）−Ｍａｎβ１−４−ＧｌｃＮＡｃβ１−４−ＧｌｃＮＡｃである。
糖ヌクレオチド前駆体
さらに他の実施形態において、糖ヌクレオチド前駆体を増加させるために宿主細胞を培養する方法が提供される。例えば、ＧＤＰ−マンノース合成を触媒する酵素が系において発現される。ホスホマンノムターゼ酵素活性（ＭａｎＢ）（ＥＣ５．４．２．８）およびマンノース−１−ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ酵素活性（ＭａｎＣ）（ＥＣ２．７．７．１３）が本発明の宿主細胞に導入される。図９Ａ（左）は、ＭａｎＣ／Ｂが過剰発現される場合のトリマンノシルコアの増加した産生を示す。
さらなる実施形態において、細胞質におけるグリコシルドナーの十分なプールが生成される。ＧｎＴＩおよびＧｎＴＩＩに対する基質である、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃは大腸菌細胞質において天然に存在するが、宿主細胞はＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ合成を増加させるために工学的に操作されうる。このような実施形態において、宿主細胞を培養して、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ合成を触媒する、グルタミン−フルクトース−６−ホスフェートトランスアミナーゼ酵素活性ＧｌｍＳ（ＥＣ２．６．１．１６）、ＧｌｍＵ（ＥＣ２．７．７．２３＆ＥＣ２．３．１．１５７）、ＧｌｍＭ（ＥＣ５．４．２．１０）を発現することによってＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを増加させる方法が提供される。図９Ａ（右）は、ＧｌｍＳが過剰発現した場合のＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2の増加を示す。ＭａｎＣ／Ｂと共にグリセロールを添加することにより、図９Ｂに示されるように増加したグリカン収率が生じる。ピルビン酸塩もまた、図９Ｃに示されるようにグリカン収率を増加させるように見える。
ＭａｎＣ／Ｂの過剰発現は図１０に証明されるように産生されたグリカンの均質性に対して劇的な効果を有した。Ｍ３グリコフォーム（Ｄ）、Ｍ５グリコフォーム（Ｅ）およびＧＮＭ３ＧＮ２（Ｆ）は優勢なグリカンを生じ、反応の不完全なヌクレオチド糖転移に起因しうるピークを除去しているように見える。したがって、宿主細胞は、産生される正確なグリコフォームを産生し、制御しうる。
酵母において、Ｂｏｂｒｏｗｉｃｚらは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおいてＵＤＰ−ガラクトース輸送体、ＵＤＰ−ガラクトース４−エピメラーゼおよびβ１，４ＧａｌＴの発現により末端ガラクトシル化グリカンＰｉｃｈｉａの増加した産生を示した（Ｂｏｂｒｏｗｉｃｚら、Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ａｎ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙ ｂｌｏｃｋｅｄ ｉｎ ｃｏｒｅ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｉｎ ｔｈｅ ｙｅａｓｔ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ：ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｘ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｇａｌａｃｔｏｓｅ．Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ２００４ Ｓｅｐ；１４（９）：７５７−６６．）。ＵＤＰ−ガラクトースはまた、大腸菌の細胞質において天然に存在するが、研究は、ＵＤＰ−ガラクトースの利用可能性が、ウリジレートキナーゼ（ｐｙｒＨ）、Ｇｌｃ−１−Ｐウリジルトランスフェラーゼ（ｇａｌＵ）、Ｇａｌ−１−Ｐウリジルトランスフェラーゼ（ｇａｌＴ）、ガラクトキナーゼ（ｇａｌＫ）およびＵＤＰ−ガラクトースエピメラーゼ（ｇａｌＥ）を含むＵＤＰ−Ｇａｌ合成遺伝子の過剰発現によって増加しうることを示している（Ｃｈｕｎｇ，Ｓ．ら、Ｇａｌａｃｔｏｓｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｉａｌｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｇｌｙｃａｎ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ ｕｓｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ ｗｉｔｈ ｉｎ ｓｉｔｕ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｇａｒ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２００５．３９（１）：ｐ．６０−６６．）。したがって、好ましい実施形態において、大腸菌Ｋ１２由来のｇａｌＥＴＫ、ｇａｌＵおよびｐｙｒＨから選択される１つまたは複数の遺伝子が、酵母ベースの組換えを使用してクローニングされ、続いてガラクトースのアクセプターオリゴ糖組成物への転移のためのグリコシルドナー基質の十分なＵＤＰ−Ｇａｌプールを確実にするために宿主株において発現される。
ＣＭＰ−ＮＡＮＡレベルの調節が酵母および昆虫細胞の両方において示されている。Ｈａｍｉｌｔｏｎらは、ＣＭＰ−シアル酸輸送体、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼ、ＣＭＰ−シアル酸シンターゼ、Ｎ−アセチルノイラミネート−９−ホスフェートシンターゼおよびシアリルトランスフェラーゼを使用してＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおいて首尾良いシアル酸転移のための増加した細胞ＣＭＰ−ＮＡＮＡプールを示した（Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｓ．Ｒ．ら、Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｘ ｈｕｍａｎ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｙｅａｓｔ．Ｓｃｉｅｎｃｅ、３０１、１２４４（２００３））。Ｌａｗｒｅｎｃｅらは、増加したＣＭＰ−ＳＡ基質産生昆虫細胞のためのＮ−アセチルマンノサミン供給により、シチジン一リン酸シアル酸シンターゼ（ＣＭＰ−ＳＡ）およびシアル酸ホスフェートシンターゼ（ＳＡＳ）遺伝子の共発現を示した（Ｌａｗｒｅｎｃｅら、Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｓｉａｌｉｃ ａｃｉｄ ｐａｔｈｗａｙ ｇｅｎｅｓ ｔｏ ｇｅｎｅｒａｔｅ ＣＭＰ−ｓｉａｌｉｃ ａｃｉｄｓ ｉｎ ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌｓ．Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ Ｊ．２００１ Ｍａｒ；１８（３）：２０５−１３）。大腸菌Ｋ１などの選択した少しの宿主細胞のみが内因性ＣＭＰ−ＮＡＮＡ機構を有するが、多くの原核生物はＣＭＰ−ＮＡＮＡを産生する機構を欠き、増加したＣＭＰ−ＮＡＮＡレベルが、原核生物における適切なシアル化のために必要とされることが少なくとも予想される。
大腸菌および他の細菌における真核タンパク質、特に膜タンパク質の首尾良い発現は重要なタスクである（Ｂａｎｅｙｘら、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆｏｌｄｉｎｇ ａｎｄ Ｍｉｓｆｏｌｄｉｎｇ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ」、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２２：１３９９−１４０８（（２００４））。したがって、正確にフォールディングされ、正確に局在化するタンパク質（例えば、内膜内への挿入）の高発現収率を達成するために多くの問題に対する考慮が与えられなければならない。これらの要因の全ては、大腸菌細胞内で発現される場合、真核タンパク質が機能的であるかどうかをまとめて決定づける。
さらなる糖鎖工学的操作
糖生合成と競合する特定の酵素（例えば、マンノシルトランスフェラーゼ）を発現しないまたは減衰する宿主細胞のような特定の酵素活性を欠く宿主細胞が好ましい。好ましい実施形態において、Ｖａｌｄｅｒｒａｍａ−Ｒｉｎｃｏｎらに示されるようにＧＤＰ−Ｄ−マンノースデヒドラターゼ酵素活性（ＥＣ４．２．１．４７）を減弱している宿主細胞を培養する方法が提供される。ＧＤＰ−マンノースデヒドラターゼ（ＧＭＤ）をコードするｇｍｄ遺伝子を欠く大腸菌株が構築され、それは実際に、ＧＤＰ−Ｌ−フコースの合成における第１のステップとしてＧＭＤによってＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノースに変換される、Ａｌｇ１およびＡｌｇ２に対する基質、すなわちＧＤＰ−マンノースの利用可能性を増加させる（Ｒｕｆｆｉｎｇ，Ａ．＆Ｃｈｅｎ，Ｒ．Ｒ．Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｍｉｃｒｏｂｅｓ ｆｏｒ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ａｎｄ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｍｉｃｒｏｂ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔ ５、２５（２００６）。宿主細胞のさらなる工学的操作が、特定の競合経路をノックアウトするために必要とされうる。
コドン最適化
本発明のさらなる実施形態において、真核グリコシルトランスフェラーゼは、大腸菌（および他の細菌）と、酵母および哺乳動物細胞などの高等生物との間のコドン使用頻度バイアスに関連する制限を克服するようにコドン最適化されている。コドン使用頻度バイアスとは、タンパク質−コードＤＮＡ配列（遺伝子）におけるコドンの出現頻度の生物の間の差異を指す。コドンはポリペプチド鎖において特異的アミノ酸残基をコードする連続した３つのヌクレオチド（トリプレット）である。コドン最適化は、特異的トランスバージョンヌクレオチド変化、すなわち、プリンからピリミジンもしくはピリミジンからプリンへのヌクレオチド変化、または転移ヌクレオチド変化、すなわち、プリンからプリンもしくはピリミジンからピリミジンへのヌクレオチドの変化を生じることによって達成されうる。いくつかの場合、コドン最適化ポリペプチドバリアントは、非コドン最適化ポリペプチドと同じ生物学的機能を保持する。大腸菌における発現に関して、１つまたは複数のコドンが、例えば、Ｇｒｏｓｊｅａｎら、Ｇｅｎｅ １８：１９９−２０９（１９８２）に記載されるように最適化されうる。本明細書に使用される場合、「*」は停止コドンを示す。
本明細書に記載されるａｌｇ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、ＭａｎＢ／Ｃ、ｇｌｍＳ、オリゴサッカリルトランスフェラーゼの核酸分子、ポリペプチド分子ならびにホモログ、バリアントおよび誘導体はまた、天然に存在しうるか、または公知の遺伝子工学的操作技術を使用した化学合成を含むｉｎ ｖｉｖｏで作製されうる、ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドバリアントを含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド配列は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７または２９と少なくとも７５％、７７％、８０％、８５％、９０％または９５％の同一性を有する。他の実施形態において、ポリペプチドバリアントは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３１、３２または３３と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、７７％、８０％、８５％、９０％または９５％の相同性を有する。
本発明はまた、上記の核酸分子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子を含む。上記のように、および当該分野において周知のように、ストリンジェントなハイブリダイゼーションは、特定の条件の設定下で特異的ＤＮＡハイブリッドについて熱融点（Ｔm）より約２５℃下にて実施され、ここでＴmは標的配列の５０％が完全に一致したプローブとハイブリダイズする温度である。ストリンジェントな洗浄は、特定の条件の設定下で特異的ＤＮＡハイブリッドについてＴmより約５℃低い温度にて実施されうる。
本発明のポリヌクレオチドまたは核酸分子は少なくとも１０塩基の長さのヌクレオチドの多量体型を指す。それらには、ＤＮＡ分子（例えば、線状、環状、ｃＤＮＡ、染色体、ゲノムもしくは合成、二本鎖、一本鎖、三本鎖、四本鎖、部分的に二本鎖、分岐、ヘアピン、環状または南京錠の構造）およびＲＮＡ分子（例えば、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ゲノムまたは合成）および記載されたＤＮＡまたはＲＮＡ分子の類似体ならびに非天然ヌクレオチド類似体、非天然ヌクレオシド間結合またはその両方を含有するＤＮＡまたはＲＮＡの類似体が含まれる。本発明の単離された核酸分子は、核酸が由来する生物の染色体ＤＮＡにおいて天然に隣接する配列を含まない核酸分子（すなわち、核酸分子の５’および３’末端に位置する配列）を含む。種々の実施形態において、単離された核酸分子は、核酸分子が由来する微生物の天然に隣接するヌクレオチド染色体ＤＮＡ配列の約１０ｋｂ、５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂ、０．１ｋｂ、５０ｂｐ、２５ｂｐまたは１０ｂｐ未満を含有しうる。
異種核酸分子は、プロモーターおよび任意の他の５’調節分子ならびに正確なリーディングフレームに対して適切なセンス（５’→３’）方向において発現系またはベクター内に挿入される。核酸構築物の調製は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）に記載されているような当該分野において周知の標準的なクローニング法を使用して実施されうる。ＣｏｈｅｎおよびＢｏｙｅｒによる米国特許第４，２３７，２２４号もまた、制限酵素切断およびＤＮＡリガーゼによるライゲーションを使用した組換えプラスミドの形態の発現系の産生を記載している。
適切な発現ベクターは宿主細胞と適合性がある種に由来するレプリコンおよび制御配列を含有するものを含む。例えば、大腸菌が宿主細胞として使用される場合、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８またはｐＢＲ３２２などのプラスミドが使用されてもよい。他の適切な発現ベクターは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ：第３版、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ、２００１、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓに記載されている。例えば、核酸構築物の調製、突然変異生成、シークエンシング、ＤＮＡの細胞内への導入および遺伝子発現ならびにタンパク質の分析において核酸を操作するための多くの公知の技術およびプロトコールは、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌら、（１９９２）に詳細に記載されている。
異なる遺伝子シグナルおよびプロセシング事象は、多くのレベルの遺伝子発現（例えば、ＤＮＡ転写およびメッセンジャーＲＮＡ（「ｍＲＮＡ」）翻訳）およびその結果として、リボソーム表面に示される融合タンパク質の量を制御する。ＤＮＡの転写は、ＲＮＡポリメラーゼの結合を指揮し、それによりｍＲＮＡ合成を促進するＤＮＡ配列である、プロモーターの存在に依存する。プロモーターは「強度」（すなわち、転写を促進するそれらの能力）に多様性がある。クローニングされた遺伝子を発現する目的のために、高レベルの転写ならびにそれにより発現および表面提示を得るための強力なプロモーターを使用することが望まれる。したがって、利用される宿主系に応じて、多数の適切なプロモーターのいずれか１つが、ストール配列（ｓｔａｌｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）に結合する目的のタンパク質をコードするデオキシリボ核酸分子を保持する発現ベクター内に組み込まれてもよい。例えば、大腸菌、そのバクテリオファージまたはプラスミドを使用する場合、Ｔ７ファージプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、リボソームＲＮＡプロモーター、大腸菌ファージラムダのＰRおよびＰLプロモーターならびに限定されないが、ｌａｃＵＶ５、ｏｍｐＦ、ｂｌａ、ｌｐｐなどを含む他のものなどのプロモーターが、隣接するＤＮＡセグメントの高レベルの転写を指揮するために使用されてもよい。さらに、組換えＤＮＡまたは他の合成ＤＮＡ技術によって産生されるハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃＵＶ５（ｔａｃ）プロモーターまたは他の大腸菌プロモーターが、挿入される遺伝子の転写を提供するために使用されてもよい。
原核生物におけるｍＲＮＡの翻訳は真核生物のものと異なる適切な原核シグナルの存在に依存する。原核生物におけるｍＲＮＡの効果的な翻訳は、ｍＲＮＡにおけるＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ（「ＳＤ」）配列と呼ばれるリボソーム結合部位を必要とする。この配列は、タンパク質のアミノ末端メチオニンをコードする、開始コドン、通常ＡＵＧの前に位置するｍＲＮＡの短いヌクレオチド配列である。ＳＤ配列は１６Ｓ ｒＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）の３’末端に相補的であり、リボソームの正確な位置決めを可能にしうるようにｒＲＮＡと二本鎖を形成することによって恐らくリボソームに対するｍＲＮＡの結合を促進する。遺伝子発現を最大化することに関する概説については、ＲｏｂｅｒｔｓおよびＬａｕｅｒ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、６８：４７３（１９７９）を参照のこと。
宿主細胞
本発明によれば、宿主細胞は原核生物である。このような細胞は目的の治療用組換えタンパク質を産生するための組換えタンパク質を発現するための宿主として役立つ。例示的な宿主細胞には、大腸菌および他のＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｓｐ．、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．、Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｐ．、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｓｐ． Ｖｉｂｒｉｏ ｓｐ．、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ． Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｓｐ．、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｓｐ．、Ｐｅｃｔｉｎａｔｕｓ ｓｐ．、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｚｙｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｐ．、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．、Ｆｒａｎｋｉａ ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｓｐ．、Ｎｏｃａｒｄｉａ ｓｐ．、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｓｐ．、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．、Ｈｅｌｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．、Ｈｅｌｉｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓｐ．、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｓｐ．、Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａ ｓｐ．、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｓｐ．、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ，ｓｐ．、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｓｐ．、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ ｓｐ．、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐ．、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐ．、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｓｐ．、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｓｐ．、Ｂｄｅｌｌｏｖｉｂｒｉｏ ｓｐ．、Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｐ．、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐ．、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｓｐ．、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｓｐ．、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｓｐ．、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｓｐ．、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｓｐ．、Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｓｐ．、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ ｓｐ．、Ｃａｒｄｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．、Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ ｓｐ．、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｓｐ．、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｐ．、Ｋｉｎｇｅｌｌａ ｓｐ．、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｓｐ．、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ．、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｐｌｅｓｉｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｓｐ．およびＷｏｌｂａｃｈｉａ ｓｐ．などのアルファ−プロテオバクテリア、シアノバクテリア、スピロヘータ、緑色硫黄および緑色非硫黄細菌、グラム陰性球菌、選好性グラム陰性桿菌、腸内細菌−グルコース発酵グラム陰性桿菌、グラム陰性桿菌−非グルコース発酵菌、グラム陰性桿菌−グルコース発酵、オキシダーゼ陽性が含まれる。
本発明の一実施形態において、大腸菌宿主株Ｃ４１（ＤＥ３）が使用されるが、これは、この株が一般的な膜タンパク質過剰発現について以前から最適化されているからである（Ｍｉｒｏｕｘら、「Ｏｖｅｒ−ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ：Ｍｕｔａｎｔ Ｈｏｓｔｓ Ｔｈａｔ Ａｌｌｏｗ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｓｏｍｅ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｇｌｏｂｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｔ Ｈｉｇｈ Ｌｅｖｅｌｓ」、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２６０：２８９−２９８（１９９６）。宿主株のさらなる最適化はＤｎａＪタンパク質をコードする遺伝子の欠失を含む（例えば、ΔｄｎａＪ細胞）。この欠失の理由は、ｄｎａＪの不活性化が、過剰発現した膜タンパク質の蓄積を増加させ、一般に膜タンパク質過剰発現に関連する重度の細胞毒性を抑性することを知られているからである（Ｓｋｒｅｔａｓら、「Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ：Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｒｏｌｅ ｏｆ ＤｎａＪ ｏｎ ｔｈｅ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｃａｎｎａｂｉｎｏｉｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ（２００８））。出願人はＡｌｇ１およびＡｌｇ２の発現後にこれを観察した。さらにＮ−グリカン生合成の最適レベルを保証するには、競合する糖生合成反応を欠失させる必要がある。例えば、大腸菌Ｏ１６抗原生合成経路の遺伝子の欠失（Ｆｅｌｄｍａｎら、「Ｔｈｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ａ Ｐｕｔａｔｉｖｅ Ｐｏｌｙｉｓｏｐｒｅｎｏｌ−ｌｉｎｋｅｄ Ｓｕｇａｒ Ｔｒａｎｓｌｏｃａｓｅ（Ｗｚｘ）Ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｏ Ａｎｔｉｇｅｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ ｉｓ Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｏ Ｒｅｐｅａｔ」、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７４：３５１２９−３５１３８（１９９９））は、バクトプレノール−ＧｌｃＮＡｃ−ＰＰ基質が所望の哺乳動物Ｎ−グリカン反応に利用可能であることを保証する。望ましくない副反応を取り除くために、以下が大腸菌宿主株から欠失している代表的な遺伝子である：ｗｂｂＬ、ｇｌｃＴ、ｇｌｆ、ｇａｆＴ、ｗｚｘ、ｗｚｙ、ｗａａＬ。さらに他の株には、ＭＣ４１００、ＢＬ２１、ＯＲＩＧＡＭＩ（商標）、Ｓｈｕｆｆｌｅ（登録商標）が含まれる。
宿主細胞に発現ベクターを形質転換／トランスフェクトする方法は当該分野において周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）に記載されるように、選択される宿主系に依存する。真核細胞に関して、適切な技術は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン、エレクトロポレーション、リポソーム媒介性トランスフェクションおよびレトロウイルスもしくは他のウイルス、例えばワクシニアまたは昆虫細胞に関してバキュロウイルスを使用した形質導入を含んでもよい。細菌細胞に関して、適切な技術は、塩化カルシウム形質転換、エレクトロポレーションおよびバクテリオファージを使用したトランスフェクションを含んでもよい。
本発明の真核宿主細胞の重要な利点は以下を含む：（ｉ）細菌の遺伝子操作に関する大量のデータ；（ｉｉ）タンパク質産生のために細菌を使用した確立された実績、２００３年以来、ＦＤＡに承認されたタンパク質治療薬の約３０％は大腸菌細菌において産生される；および（ｉｉｉ）タンパク質薬物の細菌産生のための多数の会社における既存のインフラストラクチャー。
種々の真核タンパク質発現系と比較して、本発明の方法および組成物を使用して利用されるプロセスは、ヒト病原体を含まず、免疫原性Ｎ結合型およびＯ結合型グリコシル化反応を含まず、迅速なクローニングおよび速い成長率、速い倍増時間（約２０分）、高い成長（高いＯＤ）、高い力価およびタンパク質収率（全可溶性タンパク質（ＴＳＰ）の５０％の範囲）、ペリプラズムまたは上清からの容易な産生物精製が可能で、遺伝的に扱いやすく、完全に研究され、広範囲の発現最適化方法のコレクション（例えば、プロモーター工学的操作、ｍＲＮＡ安定化法、シャペロン共発現、プロテアーゼ減少など）と適合性がある、拡張可能で、費用効率が高く、最適な組換え糖タンパク質発現を提供する。
糖タンパク質発現のための宿主としての原核生物、例えば大腸菌の別の主な利点は、酵母および他の全ての真核生物と異なり、天然のグリコシル化系が存在しないことである。したがって、グリコシル化関連遺伝子の付加（または後の除去）は、糖鎖工学的に操作した大腸菌細胞の生存にほとんどまたは全く関係ないと考えられる。さらに、内因性グリコシル化反応による標的タンパク質に対する非ヒトグリカン結合の可能性は本質的にこれらの細胞において排除される。
したがって、種々の実施形態において、糖タンパク質発現および種々のオリゴ糖組成物（例えば、高マンノース、ハイブリッド、複合）の産生の代替が開示され、原核宿主細胞がそれらを産生し、Ｎ結合型糖タンパク質を産生するために使用され、真核細胞培養に関連する大きな障壁を回避する魅力的な解決策を提供する。タンパク質薬物開発および製造に関連するコストおよび時間を同時に劇的に低下させながら、構造的に均質なヒト様Ｎ−グリカンを生じる産生ビヒクルとしての細菌の使用が本発明の目的である。
原核生物におけるオリゴ糖の標的タンパク質への部位特異的転移
Ｖａｌｄｅｒｒａｍａ−Ｒｉｎｃｏｎらに記載されているように、細菌グリコシル化機構の「ヒト化」を開始するために、Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2オリゴ糖構造が、大腸菌における脂質結合型生合成を含む組換え経路を介して生成される。具体的には、いくつかの真核グリコシルトランスフェラーゼの１つが大腸菌において機能的に発現され、生じた脂質結合型オリゴ糖はオリゴサッカリルトランスフェラーゼを介してタンパク質へ転移される。
原核宿主細胞におけるグリカン構築は真核生物と異なりウンデカプレニルリン酸（Ｕｎｄ−Ｐ）上で脂質結合し、それらはドリコールリン酸（Ｄｏｌ−Ｐ）上で構築される。Ｃ．ｊｅｊｕｎｉにおいて、ヌクレオチドにより活性化した糖の脂質担体への逐次付加によるＮ結合型グリコシル化が進行し、分岐ヘプタサッカリドの形成を生じる。次いでこのグリカンはＰｇｌＫ（以前はＷｌａＢ）によって内膜を横切ってフリップされ、次いでＯＴａｓｅ ＰｇｌＢはグリカンのアスパラギン側鎖への転移を触媒する。Ｂａｃは２，４−ジアセトアミド−２，４，６−トリデオキシグルコースであり、ＧａｌＮＡｃはＮ−アセチルガラクトサミンであり、ＨｅｘＮＡｃはＮ−アセチルヘキソサミンであり、Ｇｌｃはグルコースである。Ｓｚｙｍａｎｓｋｉら、「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｍｕｃｏｓａｌ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ」、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ３：２２５−３７（２００５）を参照のこと。ＰｇｌＫフリッパーゼは内膜を横切って脂質結合型Ｃ．ｊｅｊｕｎｉヘプタサッカリドを転座するのに関与する。偶然にも、ＰｇｌＫは脂質結合型オリゴ糖媒介物のグリカン構造に対して緩和した特異性を示す（Ａｌａｉｍｏら、「Ｔｗｏ Ｄｉｓｔｉｎｃｔ Ｂｕｔ Ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅａｂｌｅ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｆｏｒ Ｆｌｉｐｐｉｎｇ ｏｆ Ｌｉｐｉｄ−ｌｉｎｋｅｄ Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ」、Ｅｍｂｏ Ｊ ２５：９６７−７６（２００６）およびＷａｃｋｅｒら、「Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ Ｓｕｇｇｅｓｔｓ ａ Ｃｏｍｍｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｎｄ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ」、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０３：７０８８−９３（２００６）。
好ましい実施形態において、本発明の宿主細胞は、内膜を横切ってウンデカプレノール結合型オリゴ糖を転座する、フリッパーゼ酵素活性（Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＮ ＡＰ００９０４８．１）を発現する。このような酵素活性は、内因性もしくは異種であってもよいか、または発現において修正されるように工学的に操作されてもよい。さらなる実施形態において、原核宿主細胞はｐｇｌＫおよびｒｆｔ１を含むフリッパーゼ活性を含む。
原核生物におけるヒト様オリゴ糖構造の産生は、種々のオリゴ糖の、ポリペプチド鎖上のＮ−Ｘ−Ｓ／Ｔ部位への転移を伴う。これは、オリゴ糖の標的タンパク質への転移に関与するオリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＳＴ）として知られている内在性膜タンパク質またはタンパク質複合体の機能的発現を必要とする。種々の原核および真核ＯＳＴは脂質結合型オリゴ糖を標的タンパク質へ転移する能力を有する。本発明は、高マンノース、ハイブリッドおよび複合グリカンのタンパク質への転移を実証している原核系を開示する。したがって、原核タンパク質発現系はグリコシル化標的タンパク質を産生する少なくとも１つのＯＳＴ活性を含む。このような実施形態において、宿主細胞はグリコシルトランスフェラーゼ酵素に加えてオリゴサッカリルトランスフェラーゼ酵素活性（ＥＣ２．４．１．１１９）を発現する。種々のＯＳＴ（表２）が発現される可能性があり、内因性もしくは異種であってもよいか、または発現において修正されるように工学的に操作されてもよい。さらなる実施形態において、原核宿主細胞は、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ（Ａｅｂｉら）またはＣ．ｌａｒｉ（Ｖａｌｄｅｒｒａｍａ−Ｒｉｎｃｏｎら）由来のＰｇｌＢなどの少なくとも１つのオリゴサッカリルトランスフェラーゼ活性を含む。タンパク質へ転移されるオリゴ糖はタンパク質にＮ結合される。
オリゴ糖組成物
最近、いくつかの真核発現宿主がＮ−糖タンパク質を作製するための哺乳動物細胞培養の代替として導入されている。これらには、遺伝子工学的に操作した酵母Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｓ．Ｒ．ら、Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｙｅａｓｔ ｔｏ ｐｒｏｄｕｃｅ ｃｏｍｐｌｅｘ ｔｅｒｍｉｎａｌｌｙ ｓｉａｌｙｌａｔｅｄ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００６．３１３（５７９２）：ｐ．１４４１−３）、組換えバキュロウイルスのための宿主として培養した昆虫細胞（Ａｕｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｊ．、Ｊ．Ｒ．Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ、およびＤ．Ｌ．Ｊａｒｖｉｓ、Ａ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｔｏ ｐｒｏｄｕｃｅ ＣＭＰ−ｓｉａｌｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ｓｉａｌｙｌａｔｅｄ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、２００３．１３（６）：ｐ．４９７−５０７）、および植物細胞（Ａｖｉｅｚｅｒ，Ｄ．ら、Ａ ｐｌａｎｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｇｌｕｃｏｃｅｒｅｂｒｏｓｉｄａｓｅ ｅｎｚｙｍｅ−−ａ ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ ｐｈａｓｅ Ｉ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ、２００９．４（３）：ｐ．ｅ４７９２）が含まれる。不幸にも、非ヒトグリコフォームは、哺乳動物、植物、昆虫および酵母細胞を含む任意の真核宿主細胞を使用した場合、天然グリコシル化経路から生じる。哺乳動物宿主細胞は、制御されないレベルのマンノース−６−リン酸およびフコースをグリカンに付加し、多くの場合、末端シアル酸を欠くことが示されている（Ｖａｎ Ｐａｔｔｅｎ，Ｓ．Ｍ．ら、Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｍａｎｎｏｓｅ ｃｈａｉｎ ｌｅｎｇｔｈ ｏｎ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ｇｌｕｃｏｃｅｒｅｂｒｏｓｉｄａｓｅ ｆｏｒ ｅｎｚｙｍｅ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｇａｕｃｈｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、２００７．１７（５）：ｐ．４６７−７８）。植物細胞は免疫原性ベータ−１，２−キシロースおよびコアアルファ−１，３フコースを付加し（Ｂａｒｄｏｒ，Ｍ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｍａｍｍａｌｓ ｏｆ ｔｗｏ ｔｙｐｉｃａｌ ｐｌａｎｔ ｇｌｙｃｏ−ｅｐｉｔｏｐｅｓ，ｃｏｒｅ ａｌｐｈａ（１，３）−ｆｕｃｏｓｅ ａｎｄ ｃｏｒｅ ｘｙｌｏｓｅ．Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、２００３．１３（６）：ｐ．４２７−３４）、コアアルファ−１，３フコースはまた、昆虫細胞にも見出される（Ｂｅｎｃｕｒｏｖａ，Ｍ．ら、Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ＩｇＧ ａｎｄ ＩｇＥ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｐｌａｎｔ ａｎｄ ｉｎｓｅｃｔ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｇｌｙｃａｎｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｇｌｙｃｏｆｏｒｍｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ．Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、２００４．１４（５）：ｐ．４５７−６６）。Ｏ結合型グリコシル化はまた、酵母において不可欠なプロセスであり（Ｇｅｎｔｚｓｃｈ，Ｍ．およびＷ．Ｔａｎｎｅｒ、Ｔｈｅ ＰＭＴ ｇｅｎｅ ｆａｍｉｌｙ：ｐｒｏｔｅｉｎ Ｏ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｉｓ ｖｉｔａｌ．Ｅｍｂｏ Ｊ、１９９６．１５（２１）：ｐ．５７５２−９）、望ましくないＯ−グリカンは標的糖タンパク質に共有結合されうる。
原核グリコシル化機構により結合したオリゴ糖鎖は、高等真核およびヒトグリコシル化経路によって結合したものと構造的に異なる（Ｗｅｅｒａｐａｎａら、「Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ−ｌｉｎｋｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ：Ｆｒｏｍ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｔｏ Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ」、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １６：９１Ｒ−１０１Ｒ（２００６）。原核生物において産生され、本発明の方法由来のオリゴ糖組成物はまた、酵母、昆虫、哺乳動物およびさらにヒト細胞などの真核系と区別される。
いくつかの特徴により、真核宿主細胞発現系、例えばＣＨＯ、ＮＳ０、ｌｅｍｎａ、Ｓｆ９と比較して本発明の方法によって産生されたオリゴ糖組成物が区別される。例えば、本発明のオリゴ糖組成物はフコースを欠く。抗体におけるフコースの不在は増加したＡＤＣＣおよびＣＤＣ活性に関連している（Ｓｈｉｎｋａｗａ Ｔら、Ｔｈｅ ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ ｆｕｃｏｓｅ ｂｕｔ ｎｏｔ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ｇａｌａｃｔｏｓｅ ｏｒ ｂｉｓｅｃｔｉｎｇ Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ１ ｃｏｍｐｌｅｘ−ｔｙｐｅ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｓｈｏｗｓ ｔｈｅ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｒｏｌｅ ｏｆ ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ．Ｊ Ｂｉｏ Ｃｈｅｍ、２７８、３４６６−７３、２００３）。さらに、原核生物は免疫原性に関連するＯ結合型グリカンを本来的に欠く。本発明のオリゴ糖組成物は高マンノースまたはマンノースリン酸などの多くの真核発現系に存在する望ましくないグリカンを発現しない。加えて、糖鎖工学的に操作した大腸菌は、（ｉ）Ｎ末端またはＣ末端を含むグリコシル化の特定部位および化学量論の制御、（ｉｉ）グリコフォームの選択、（ｉｉｉ）グリコシル化は大腸菌において不可欠なプロセスではないため、新規グリコフォームを工学的に操作する能力、および（ｉｖ）産生物の均一性を改善し、マンノース６−リン酸受容体などのヒト宿主内の他の受容体への誤った局在化を回避するのに役立ちうるＯ−グリコシル化およびマンノース６−リン酸を含む競合するグリコシル化経路の欠失を提供する（Ｈａｙｅｔｔｅ，Ｍ．Ｐ．ら、Ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｒｅａｃｔｉｎｇ ｗｉｔｈ Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ Ｏ−ｌｉｎｋｅｄ ｏｌｉｇｏｍａｎｎｏｓｉｄｅｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ａｎ ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ ａｎｄ ｎｅｏｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄｓ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ３０、４１１−４１７（１９９２）．Ｐｏｄｚｏｒｓｋｉ，Ｒ．Ｐ．、Ｇｒａｙ，Ｇ．Ｒ．＆Ｎｅｌｓｏｎ，Ｒ．Ｄ． Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｎａｔｉｖｅ Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ ｍａｎｎａｎ ａｎｄ ｍａｎｎａｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｏｎ ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｌｙｍｐｈｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４４、７０７−７１６（１９９０）．）。
本発明のオリゴ糖組成物は均一であってもよく、また、抗炎症特性を増加させる、例えば、静脈内Ｉｇ（ＩＶＩＧ）のＦｃにおけるα２，６シアル酸を濃縮するように、濃縮されてもよい（Ａｎｔｈｏｎｙら、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＩＶＩＧ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２００８ Ｄｅｃ １６；１０５（５０）：１９５７１−８）。さらなる研究により、全てのヒトにおいて、時々、高レベルでＮｅｕ５Ｇｃ特異的抗体の存在が示された（Ｇｈａｄｅｒｉら、Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ Ｎ−ｇｌｙｃｏｌｙｌｎｅｕｒａｍｉｎｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２０１０ Ａｕｇ；２８（８）：８６３−７）。したがって、治療用タンパク質、例えば、特異的シアル酸残基（例えば、Ｎｅｕ５Ａｃ、Ｎｅｕ５Ｇｃと対照的にＮｅｕＮＡｃ）を有する抗体の濃縮は、タンパク質治療薬の免疫原性または無効性などの有害な反応を減少させうる。
本明細書に示されるように、原核系は比較的高収率にて均質なグリカンを生じうる。好ましい実施形態において、オリゴ糖組成物は少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、９９モル％において単一のグリコフォームから本質的になる。さらなる実施形態において、オリゴ糖組成物は少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、９９モル％の２つの望ましいグリコフォームから本質的になる。なおさらなる実施形態において、オリゴ糖組成物は少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、９９モル％の３つの望ましいグリコフォームから本質的になる。
特定の実施形態において、産生されるオリゴ糖組成物は、ＧｌｃＮＡｃ1-5Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2およびＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2である。特定のグリコールを工学的に操作した宿主細胞は、優勢にはＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2またはＧｌｃＮＡｃ2Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2であるオリゴ糖組成物を産生する。
他の実施形態において、産生されるオリゴ糖組成物は、Ｇａｌ1-5ＧｌｃＮＡｃ1-5Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2およびＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2である。グリコールについて工学的に操作した特定の宿主細胞は、優勢にはＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ2Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2またはＧａｌ2ＧｌｃＮＡｃ2Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2であるオリゴ糖組成物を産生する。
さらに他の実施形態において、産生されるオリゴ糖組成物は、ＮＡＮＡ1-5Ｇａｌ1-5ＧｌｃＮＡｃ1-5Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2である。グリコールについて工学的に操作した特定の宿主細胞は、優勢にはＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2またはＮＡＮＡ2Ｇａｌ2ＧｌｃＮＡｃ2Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2であるオリゴ糖組成物を産生する。
さらに他の実施形態において、産生されるオリゴ糖組成物は、Ｍａｎ2ＧｌｃＮＡｃ2、Ｍａｎ4ＧｌｃＮＡｃ、Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2、ＨｅｘＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2、ＨｅｘＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ、Ｍａｎ6ＧｌｃＮＡｃおよびＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2である。グリコールについて工学的に操作した特定の宿主細胞は、優勢にはＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2であるオリゴ糖組成物を産生する。
したがって、本発明は、広範な一連の新規オリゴ糖組成物およびＮ結合型糖タンパク質の立体特異的生合成を提供する。特定の実施形態において、代謝経路およびタンパク質工学的操作技術を使用した大腸菌における真核Ｎ−グリコシル化経路の再構成により、構造的に均質なヒト様グリカンを有するＮ−糖タンパク質が生じる。これにより、各々の糖鎖工学的に操作した細胞株が特有の炭水化物の特徴に対応することが保証される。
グリカンは、3Ｈ−ＧｌｃＮＡｃおよび3Ｈ−マンノースまたは蛍光レクチン（例えば、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−ＣｏｎＡ）による細胞の代謝標識によって分析されうる。グリカンはまた、ＰＮＧａｓｅにより放出されてもよく、ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳ下で検出されてもよい。
グリカンの定量はＭＳにより推定されうるか、またはＨＰＬＣによってより正確に行われる。ＮＭＲはグリカン構造のグリコシド結合を決定しうる。
標的糖タンパク質
目的の種々の糖タンパク質を産生するために、標的タンパク質をコードする遺伝子が宿主細胞内に導入される。
「標的タンパク質」、「目的のタンパク質」または「治療用タンパク質」は、限定されないが、インターフェロンなどのサイトカイン、Ｇ−ＣＳＦ、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子およびヒトプロテインＣなどの凝固因子、可溶性ＩｇＥ受容体α鎖、ＩｇＧ、ＩｇＧ断片、ＩｇＭ、インターロイキン、ウロキナーゼ、キマーゼおよび尿素トリプシン阻害剤、ＩＧＦ結合タンパク質、上皮細胞成長因子、成長ホルモン放出因子、アネキシンＶ融合タンパク質、アンギオスタチン、血管内皮細胞成長因子−２、骨髄系前駆細胞阻害因子−１、オステオプロテゲリン、α−１アンチトリプシン、ＤＮａｓｅ ＩＩ、α−フェトプロテイン、ＡＡＴ、ｒｈＴＢＰ−１（ａｋａ ＴＮＦ結合タンパク質１）、ＴＡＣＩ−Ｉｇ（膜貫通活性化因子およびカルシウム調節因子およびシクロフィリンリガンド相互作用物質）、ＦＳＨ（卵胞刺激ホルモン）、ＧＭ−ＣＳＦ、グルカゴン、グルカゴンペプチド、ＧＬＰ−１ ｗ／およびｗ／ｏ ＦＣ（グルカゴン様タンパク質１）ＩＬ−１受容体アゴニスト、ｓＴＮＦｒ（ａｋａ可溶性ＴＮＦ受容体Ｆｃ融合物）、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ（細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４−Ｉｇ）、受容体、ヒト成長ホルモンなどのホルモン、エリスロポエチン、ペプチド、ステープルペプチド、ヒトワクチン、動物ワクチン、血清アルブミンならびにＡＴＩＩＩ、ｒｈトロンビン、グルコセレブロシダーゼおよびアスパラギナーゼなどの酵素を含む。
大腸菌由来の既に承認されている治療薬もまた、標的タンパク質である。それらには、ホルモン（ヒトインスリンおよびインスリン類似体、カルシトニン、副甲状腺ホルモン、ヒト成長ホルモン、グルカゴン、ソマトロピンおよびインスリン成長因子１）、インターフェロン（α１、α２ａ、α２ｂおよびγ１ｂ）、インターロイキン２および１１、血管内皮成長因子−αに対して産生された軽鎖および重鎖、腫瘍壊死因子α、コレラＢサブユニットタンパク質、Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド、顆粒球コロニー刺激因子および組織プラスミノゲン活性化因子が含まれる。
また、標的タンパク質には、タンパク質を含む糖タンパク質コンジュゲートおよびタンパク質に融合されるＤ−Ｘ1−Ｎ−Ｘ2−Ｔモチーフ（ここで、Ｄはアスパラギン酸であり、Ｘ1およびＸ2はプロリン以外の任意のアミノ酸であり、Ｎはアスパラギンであり、Ｔはトレオニンである）を含む少なくとも１つのペプチドが含まれる。
好ましい実施形態において、グリカンの少なくとも３０、５０、７０、９０、９５および好ましくは１００モル％は、ＯＳＴによって標的タンパク質へ転移される。
培養条件
他の実施形態において、酸化条件下で宿主細胞を培養する方法が提供される。好ましくは、酸化細菌株が使用される。培養条件により、糖タンパク質およびグリカンの増加した収率および力価が生じうる。そのようなプロセス条件およびパラメータには、ｐＨ、温度、モル浸透圧濃度、培養時間、培地、栄養素、溶存酸素濃度、窒素、ヌクレオチド糖のレベルまたは利用可能性を調節することが含まれ、さらに炭素源、例えばグリセロール（図９Ｂ）が産生系に影響を与えうる。培養条件は産生物および利用される特定の宿主細胞に応じて変わりうる。系の生産性もまた、培養条件によって影響される可能性がある。さらなる代謝工学的操作が、生産性を最大化し、成長阻害代謝産物を制限するために必要とされてもよい。
オリゴ糖の酵素合成
本発明の代替の態様において、実施例７に記載されるように、グリカンは、アクセプターグリカン、精製された酵素／溶菌液を使用し、ヌクレオチド糖を付加して、細胞を含まない抽出物中で合成される。
特定の実施形態において、本発明は、組換え原核生物、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃおよびＧｎＴ（ＥＣ２．４．１．１０１；ＥＣ２．４．１．１４３；ＥＣ２．４．１．１４５）を含む細胞培養物であって、前記ＧｎＴがＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ残基の前記末端マンノース残基への転移を触媒し、末端ＧｌｃＮＡｃ残基を有するオリゴ糖組成物を産生するのに有効な条件下で培養される、細胞培養物を提供する。
さらなる実施形態において、本発明は、組換え原核生物、ＵＤＰ−ガラクトースおよびＧａｌＴ（ＥＣ２．４．１．３８）を含む細胞培養物であって、前記ＧａｌＴがＵＤＰ−ガラクトース残基の前記末端ＧｌｃＮＡｃ残基への転移を触媒し、末端ガラクトース残基を有するオリゴ糖組成物を産生するのに有効な条件下で培養される、細胞培養物を提供する。
好ましい実施形態において、本発明は、組換え原核生物、ＣＭＰ−ＮＡＮＡおよびシアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．９９．４およびＥＣ２．４．９９．１）を含む細胞培養物であって、前記シアリルトランスフェラーゼがＣＭＰ−ＮＡＮＡ残基の前記末端ガラクトース残基への転移を触媒し、末端シアル酸残基を有するオリゴ糖組成物を産生するのに有効な条件下で培養される、細胞培養物を提供する。
非グリコシル化対グリコシル化ＩｇＧ
本発明の別の態様は、天然抗原を認識し、結合するＦｖ部分を含むグリコシル化抗体および保存されたアスパラギン残基においてグリコシル化されるＦｃ部分に関する。代替の実施形態には、ダイアボディ、ｓｃＦｖ、ｓｃＦＶ−Ｆｃ、ｓｃＦｖ−ＣＨ、ＦａｂおよびｓｃＦａｂが含まれる。
本発明のグリコシル化抗体はモノクローナルまたはポリクローナル抗体の形態であってもよい。
単一の免疫グロブリン分子は２本の同一の軽（Ｌ）鎖および２本の同一の重（Ｈ）鎖を含む。軽鎖は１つの定常ドメイン（ＣL）および１つの可変ドメイン（ＶL）からなり、一方、重鎖は３つの定常ドメイン（ＣH１、ＣH２およびＣH３）および１つの可変ドメイン（ＶH）からなる。ＶHおよびＶLドメインは共にＦｖとして知られている分子の抗原結合部分を構成する。Ｆｃ部分は保存されたＡｓｎ２９７残基においてグリコシル化される。この位置におけるＮ−グリカンの結合により、エフェクター相互作用に不可欠である「開いた」構造が生じる。
モノクローナル抗体は、Ｃａｂｉｌｌｙらによる米国特許第４，８１６，５６７号およびＡｎｄｅｒｓｏｎら、「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ」、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：４５６−６２（２００４）に記載されているように、組換えＤＮＡ法を使用して作製されうる。モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドは、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子を特異的に増幅するオリゴヌクレオチドプライマーを使用してＲＴ−ＰＣＲなどによって、成熟Ｂ細胞またはハイブリドーマ細胞などから単離され、それらの配列は従来の手順を使用して決定される。次いで重鎖および軽鎖をコードする単離されたポリヌクレオチドは適切な発現ベクター内へクローニングされ、次いでそれらは本発明の宿主細胞内にトランスフェクトされ、モノクローナル抗体が生成される。一実施形態において、組換えＤＮＡ技術が、重鎖および軽鎖ポリペプチドを細菌ペリプラズムに誘導するようにＮ末端輸送シグナルペプチド（例えば、ＰｅｌＢシグナルペプチド）で重鎖および軽鎖を修飾するために使用される。また、重鎖および軽鎖は、２シストロン性の構築物（例えば、２つのポリペプチドを生じるように翻訳される単一のｍＲＮＡ）または代替として、２つのシストロン系のいずれかから発現されうる（例えば、２つの別個のｍＲＮＡが重鎖および軽鎖の各々のために産生される）。細菌ペリプラズムにおいて完全長ＩｇＧの高レベル発現および効果的な構築を達成するために、２シストロン性および２つのシストロン構築物の両方が有益な発現比を達成するように操作されうる。例えば、翻訳レベルは、発現ベクターにおける２シストロン性および２つのシストロン構築物のすぐ上流に挿入される一連の翻訳開始領域（ＴＩＲ）を使用して上昇または低下されうる（Ｓｉｍｍｏｎｓら、「Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｌｅｖｅｌ ｉｓ ａ Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｆａｃｔｏｒ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ」、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １４：６２９−３４（１９９６））。この抗体を産生するプラスミドが、グリコシル化酵素を発現するためにプラスミドまたはゲノムにコードされた遺伝子も保有する細菌宿主内に導入される場合、生じる抗体はペリプラズムにおいてグリコシル化される。所望の種の組換えモノクローナル抗体またはその断片はまた、記載されているようにファージディスプレイライブラリーから単離されてもよい（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、「Ｐｈａｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｄｏｍａｉｎｓ」、Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２−５５４（１９９０）；Ｃｌａｃｋｓｏｎら、「Ｍａｋｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｕｓｉｎｇ Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ」、Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６２８（１９９１）；およびＭａｒｋｓら、「Ｂｙ−Ｐａｓｓｉｎｇ Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ．Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ Ｖ−Ｇｅｎｅ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ Ｄｉｓｐｌａｙｅｄ ｏｎ Ｐｈａｇｅ」、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１））。
モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドは代替の抗体を生成する組換えＤＮＡ技術を使用した多くの異なる方法でさらに改変されてもよい。一実施形態において、例えば、マウスモノクローナル抗体の軽鎖および重鎖の定常ドメインはキメラ抗体を生成するためにヒト抗体のこれらの領域を置換されうる。あるいは、マウスモノクローナル抗体の軽鎖および重鎖の定常ドメインは融合抗体を生成するために非免疫グロブリンポリペプチドを置換されうる。他の実施形態において、定常領域はモノクローナル抗体の所望の抗体断片を生成するために切断または除去される。さらに、可変領域の部位特異的または高密度突然変異生成がモノクローナル抗体の特異性および親和性を最適化するために使用されうる。
いくつかの実施形態において、本発明の抗体はヒト化抗体である。ヒト化抗体は可変領域内に非ヒト（例えばマウス）抗体由来の最小配列を含有する抗体である。このような抗体はヒト対象に投与される場合、抗原性およびヒト抗マウス抗体反応を減少させるために治療的に使用される。実際に、ヒト化抗体は典型的に最小の非ヒト配列を有するか、非ヒト配列を全く有さないヒト抗体である。ヒト抗体はヒトによって産生される抗体またはヒトによって産生される抗体に対応するアミノ酸配列を有する抗体である。
ヒト化抗体は当該分野において公知の種々の技術を使用して産生されうる。抗体は、ヒト抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を、所望の特異性、親和性および能力を有する非ヒト抗体（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスターなど）のものと置換することによってヒト化されてもよい（Ｊｏｎｅｓら、「Ｒｅｐｌａｃｉｎｇ ｔｈｅ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｒｅｇｉｏｎｓ ｉｎ ａ Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｗｉｔｈ Ｔｈｏｓｅ Ｆｒｏｍ ａ Ｍｏｕｓｅ」、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、「Ｒｅｓｈａｐｉｎｇ Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、「Ｒｅｓｈａｐｉｎｇ Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｇｒａｆｔｉｎｇ ａｎ Ａｎｔｉｌｙｓｏｚｙｍｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４−１５３６（１９８８））。ヒト化抗体は、抗体特異性、親和性および／または能力を改良し、最適化するためにＦｖフレームワーク領域および／または置き換えた非ヒト残基のいずれかにおけるさらなる残基の置換によってさらに改変されてもよい。
二重特性抗体もまた、本発明の方法における使用に適している。二重特異性抗体は少なくとも２つの異なるエピトープにつき、特異的に認識し、結合しうる抗体である。二重特異性抗体はインタクトな抗体または抗体断片であってもよい。二重特異性抗体を作製するための技術は当該分野において一般的である（Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、「Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｈａｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（Ｊａｎｕｓｉｎｓ）Ｔａｒｇｅｔ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｏｎ ＨＩＶ Ｉｎｆｅｃｔｅｄ Ｃｅｌｌｓ」、ＥＭＢＯ Ｊ．１０：３６５５−３６５９（１９９１）およびＧｒｕｂｅｒら、「Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ Ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ａ Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｈａｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５３６８−７４（１９９４））。
原核生物におけるグリコシル化グルカゴンペプチド産生
簡単なｉｎ ｖｉｔｒｏ糖鎖コンジュゲーション技術がグルカゴンペプチドを改善するために実証されているが、それらは小さく、通常、単量体であり、通常、数時間未満の短い半減期を有し、ＰＥＧ化が小さなペプチドで十分に作用することはめったにないので治療的なこのようなペプチドの欠点が依然として存在している。現在のアプローチは依然として、顕著に阻害される活性がもたらす問題がある。
本発明は所望のグリカンを有する新規グリコシル化ペプチドに関する。グリコシル化グルカゴンペプチドの利点には、改善された溶解度、ゲルおよび線維形成に対して改善された物理的安定性、増加した半減期ならびに改善された活性および薬物動態特性が含まれる。他の利点には、タンパク質およびグリカンの両方を産生する、単一または同時のｉｎ ｖｉｖｏプロセスの能力が含まれ、それにより複数のステップが回避される。いくつかの実施形態において、新規グリコシル化グルカゴンペプチドは、長時間の血漿消失半減期および長時間の吸着相および中性ｐＨまたはわずかに塩基性ｐＨにおける改善された水溶解度に起因してｉｎ ｖｉｖｏで長時間曝露される。他の実施形態において、本発明は水溶液中のゲルおよび線維の形成に対して改善された安定性を有する。好ましい実施形態において、優勢なＮ−グリカンは哺乳動物に対して有害な免疫原性がないものである。
Ｎ−グリコシル化部位占有率は、産生される任意の特定の糖タンパク質のための真核系、例えばＣＨＯおよび酵母により異なっていてもよい。成長条件を設定することで複数の部位における占有率を制御しうる。
グルカゴンペプチドは、典型的にはグリコシル化を有さない。特定の実施形態において、グリコシル化部位がペプチド上へ工学的に操作される。例示的な実施形態において、本発明のグルカゴンペプチドは１つのグリコシル化部位を有する。特定の実施形態において、ペプチドごとに複数のグリカンを付加することでより良い活性を付与する方法が提供される。さらなる実施形態において、宿主細胞が、優勢種として特異的Ｎ−グリカンを有するグルカゴンペプチドを産生するように工学的に操作される。例示的なグリコシル化パターンは図１１に示される。
したがって、本発明の方法は１つまたは複数のグリコフォームを含む糖タンパク質および糖ペプチドを提供する。好ましくは、グリコフォームは、改善された溶解度または安定性特性および増加した受容体結合活性を付与する、Ｍ４、Ｍ５、Ｇ０、Ｇ０（１）、Ｇ０（２）、Ｇ０（３）、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４、Ｇ５、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ５を含む。グルカゴンなどの非グリコシル化ペプチドと比較して、本発明はペプチドについての半減期を増加させると考えられる。ｈＧＨ、ＡＳＮａｓｅおよびＩＬ１−Ｒａなどのさらなるペプチドが本発明の方法によって産生される。他のペプチドの産生は本発明の範囲内である。好ましい実施形態において、グルカゴンペプチドの少なくとも５０モル％がグリコシル化される。
ワクチン調製
候補抗原の免疫原性を増強する一般化された方法は、ワクチン開発の初期段階において投資される時間およびコストを減少させ、目的の任意の疾患に適用されうる。免疫原性を増強する１つの記載された戦略は、マンノシル化、マンノース−末端グリカンのタンパク質へのコンジュゲーションである。マンノースは、飲作用を介して吸収される抗原と比較して抗原提示の最大２００倍の増加を生じる受容体により媒介されるエンドサイトーシスによる内在化のための抗原提示細胞（ＡＰＣ）上にＣＤ２０６およびＣＤ２０９を含む特異的受容体に対して抗原を標的とする（Ｅｎｇｅｒｉｎｇ，Ａ．ら、Ｔｈｅ ｍａｎｎｏｓｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ａｓ ａ ｈｉｇｈ ｃａｐａｃｉｔｙ ａｎｄ ｂｒｏａｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ．Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９７．２７（９）：ｐ．２４１７−２５．Ｌａｍ，Ｊ．Ｓ．ら、Ａ Ｍｏｄｅｌ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｅｘｐｌｏｉｔｉｎｇ Ｆｕｎｇａｌ Ｍａｎｎｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｔｏ Ｉｎｃｒｅａｓｅ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２００５．１７５（１１）：ｐ．７４９６−７５０３．）。抗原のマンノシル化は以下を含むいくつかの利点を付与する：（ｉ）ＡＰＣによる増加した抗原取り込み、（ｉｉ）最大１０，０００倍までの増強したＭＨＣクラスＩＩにより媒介される抗原提示、（ｉｉｉ）Ｔ細胞増殖および成熟の促進、ならびに（ｉｖ）血清の殺菌活性を含む体液性免疫反応の改善（Ａｒｉｇｉｔａ，Ｃ．ら、Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ Ｂ Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ：Ｒｏｌｅ ｏｆ Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、２００３．７１（９）：ｐ．５２１０−５２１８．）。大腸菌はワクチン産生のためのプラットフォームとして使用されていない。その主たる理由は、Ｎ−グリコシル化についての経路を天然にコードせず、したがって糖タンパク質の製造に適さないからである。
特定の実施形態において、本発明は、大腸菌の糖鎖工学的に操作した株によるマンノシル化ワクチン抗原のための方法および組成物を提供する。免疫原性に対するマンノシル化の効果はマウスモデルにおいて評価される。細菌においてワクチン候補を産生する能力は複数の利点を提供する。大腸菌は、ＥｘＰＥＣ（腸管外病原体）および他の細菌タンパク質を発現するための優れたプラットフォームであり、容易な組換えＤＮＡ操作をもたらし、大きな組合せライブラリーを生成するために使用されうるものであり、迅速および低コストの菌株開発の可能性があり、産生物まで迅速に増加し、真核発現系で遭遇するウイルス汚染についての危険性を排除する（Ａｇｕｉｌａｒ−Ｙａｎｅｚ，Ｊ．ら、Ａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ／Ｈ１Ｎ１／２００９ ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ｖａｃｃｉｎｅ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ、２０１０．５（７）：ｐ．ｅ１１６９４．Ｃｈｏｉ，Ｂ．−Ｋ．ら、Ｕｓｅ ｏｆ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｇｅｎｅｔｉｃ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｔｏ ｈｕｍａｎｉｚｅ Ｎ−ｌｉｎｋｅｄ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｙｅａｓｔ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、２００３．１００（９）：ｐ．５０２２−５０２７．）。大腸菌におけるマンノシル化候補抗原の産生は、さらなる化学的または酵素的な修飾を必要とせずにｉｎ ｖｉｖｏで所望の糖タンパク質の合成を可能にする可能性がある。したがって、ワクチン開発についての新たなパラダイムが、大腸菌により産生されるワクチン候補の効果を増大させる方法によって提供される。
本発明の糖鎖工学的に操作した大腸菌は増強した免疫原性でマンノシル化タンパク質を産生すると意図される。大腸菌におけるマンノシル化抗原の合成は、増強した免疫原性特性を有する候補タンパク質の安価で迅速な産生を可能にする、ワクチン開発の大幅な進歩を表す。過去において、マンナンまたはマンノース末端グリカンのｉｎ ｖｉｔｒｏ化学コンジュゲーション、酵母の高マンノースオリゴ糖を用いてグリコシル化するためのＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるタンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ発現、またはマンノシル化リポソームにおける抗原のｉｎ ｖｉｔｒｏカプセル化を含む、いくつかの戦略が抗原をマンノシル化するために利用されていた（Ｌａｍ，Ｊ．Ｓ．ら、Ａｒｉｇｉｔａ，Ｃ．ら、Ａｐｏｓｔｏｌｏｐｏｕｌｏｓ，Ｖ．ら、Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ／ｒｅｄｕｃｔｉｖｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｎｎａｎ ｔｏ ａｎｔｉｇｅｎ ｓｅｌｅｃｔｓ ｆｏｒ Ｔ１ ｏｒ Ｔ２ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１９９５．９２（２２）：ｐ．１０１２８−１０１３２．Ｓｈｅｎｇ，Ｋ．ら、Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎ ｕｓｉｎｇ ａ ｎｏｖｅｌ ｍａｎｎｏｓｙｌａｔｅｄ ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ ｐｏｔｅｎｔｉａｔｅｓ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、２００８．３８（２）：ｐ．４２４−３６．）。しかしながら、これまで、ワクチン開発のための、細菌におけるマンノース末端グリカンのタンパク質に対する直接的なｉｎ ｖｉｖｏコンジュゲーションは決して達成されなかった。大腸菌発現プラットフォームは、一般的なタンパク質産生およびグリカンを発現するための異所性宿主の両方の観点から既存の技術よりも複数の利点を提供する。
尿路病原性大腸菌（ＵＰＥＣ）抗原、ｃ１２７５を予備発現およびグリコシル化のために選択した。ｃ１２７５タンパク質を、ＧｌｙｃＴａｇ（図３ａ）で修飾し、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉヘプタサッカリドグリカンを構築するのに必要なＯＳＴ ＰｇｌＢおよびグリコシルトランスフェラーゼで共発現した、糖鎖工学的に操作した大腸菌のペリプラズムに対して標的化した。精製すると、グリコシル化ｃ１２７５が、ウエスタンブロットにおいてゆっくり移動するバンドの出現およびこのオリゴ糖を認識することが知られている、ＧａｌＮＡｃ特異的レクチンダイズ凝集素（ＳＢＡ）とのこれらの産生物の反応性に基づいて明らかになった（図１２）（Ｙｏｕｎｇ，Ｎ．Ｍ．ら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｎ−ｌｉｎｋｅｄ ｇｌｙｃａｎ ｐｒｅｓｅｎｔ ｏｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２００２．２７７（４５）：ｐ．４２５３０−９．）。興味深いことに、ｃ１２７５のグリコシル化は必ずしもＧｌｙｃＴａｇの存在に依存しない。配列分析により、ＰｇｌＢに対する公開されたアクセプター部位の要件を満たすこのタンパク質における天然ＤＳＮＡＴモチーフの存在が明らかにされる。ｃ１２７５の成功したグリコシル化は、候補ワクチン抗原が、大腸菌ペリプラズムにおいて首尾良く発現され、グリコシル化されうるという仮説を支持する。
従来のワクチンは体液性免疫反応のみを誘導する。ＤＮＡワクチンは、体液性および細胞媒介性免疫の両方を誘発し、生ウイルスワクチンのような危険性もないため、かなり有望である。減弱した生ウイルスワクチンと対照的に、ＤＮＡワクチンは、特定の受容体と結合しなければならない生ウイルスと同じまたは異なる組織または細胞に送達されうる。それらの天然形態における抗原の産生は宿主免疫系に対する抗原の提示を改善する。生きている減弱したワクチンと異なり、ＤＮＡワクチンは感染性がなく、病原性に戻ることはない。
候補抗原はＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2などの種々のオリゴ糖で修飾される。これにより、ワクチン製剤に使用するための真核マンノース末端グリカンで修飾された抗原が生成されうる。多くの標的抗原はマウスモデルにおいて防御を付与することが知られているＥｘＰＥＣワクチン候補の公開された評価から選択される。しかしながら、本発明は高度にモジュール化されているので、種々のタンパク質およびペプチド候補についてのワクチン開発を向上させるために広範に適用されうることは指摘されるべきである。
医薬製剤
糖タンパク質の治療製剤は、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で、所望の程度の純度を有する糖タンパク質を、任意選択の生理学的に許容される担体、賦形剤または安定剤と混合することによって調製されうる（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ 第１６版、Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））。許容される担体、賦形剤または安定剤は、利用される投薬量および濃度で受容者に非毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸およびメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド、ベンゼトニウムクロリド；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリジンなどのアミノ酸；単糖、二糖およびグルコース、マンノースまたはデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；および／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴ（商標）もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含む。
グリカンはＰＥＧポリマーのための便利なアンカーである。なぜならマンノースまたはガラクトースなどの特定の糖は、過ヨウ素酸ナトリウムなどの穏やかな酸化剤の存在下で反応性アルデヒドに容易に変換されうるからである（Ｓｏａｒｅｓ，Ａ．Ｌ．ら、Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｏｎ ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｅ．ｃｏｌｉ Ｌ−ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ．Ｉｎｔ Ｊ Ｐｈａｒｍ、２００２．２３７（１−２）：ｐ．１６３−７０）。次いでヒドラジン基で官能化されたＰＥＧポリマーはグリコＰＥＧ化バイオコンジュゲートを作製するために使用されうる。これにより、部位特異的で、高度に制御され、均質で、活性なタンパク質コンジュゲートの合成が可能となる。ＰＥＧ化は、しばしば非特異的であるプロセスの結果として、しばしば不均質および活性の損失の問題を生じる。部位特異的ＰＥＧ化法は以下のいずれかを含む：（ｉ）特異的リジン（Ｎａｒｉｍａｔｓｕ，Ｓ．ら、Ｌｙｓｉｎｅ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎ−ａｌｐｈａ ｍｕｔａｎｔ ｆｏｒ ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ、２０１１．５６（２）：ｐ．４８９−９３．Ｙｏｕｎ，Ｙ．Ｓ．およびＫ．Ｃ．Ｌｅｅ、Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｈｉｇｈ−ｙｉｅｌｄ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｙｓ（２１）−ａｍｉｎｅ ＰＥＧｙｌａｔｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ（ＧＲＦ）（１−２９）ｕｓｉｎｇ ａ ＧＲＦ（１−２９）ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ ＦＭＯＣ−ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ ａｔ Ｔｙｒ（１）ａｎｄ Ｌｙｓ（１２）．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ、２００７．１８（２）：ｐ．５００−６）またはＮ末端のアミン基（Ｌｅｅ，Ｈ．ら、Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｏｎｏ−ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ．Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ、２００３．２０（５）：ｐ．８１８−２５．Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｙ．ら、Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｌｙｓｉｎｅ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ＴＮＦ−ａｌｐｈａ ｗｉｔｈ ｆｕｌｌ ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２００３．２１（５）：ｐ．５４６−５２）へのＰＥＧターゲティングを可能にしうるようにリジンを突然変異すること、または（ｉｉ）遊離チオール基のターゲティングを可能にしうるように不対システイン残基を付加すること（Ｓｈａｕｎａｋ，Ｓ．ら、Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｎａｔｉｖｅ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄｓ ｉｎ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ、２００６．２（６）：ｐ．３１２−３．Ｄｏｈｅｒｔｙ，Ｄ．Ｈ．ら、Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｃｙｓｔｅｉｎｅ ａｎａｌｏｇｕｅｓ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ、２００５．１６（５）：ｐ．１２９１−８．Ｍａｎｊｕｌａ，Ｂ．Ｎ．ら、Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ａｔ Ｃｙｓ−９３（ｂｅｔａ）：ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｃｏｌｌｉｇａｔｉｖｅ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ＰＥＧｙｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｌｅｎｇｔｈ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ＰＥＧ ｃｈａｉｎ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ、２００３．１４（２）：ｐ．４６４−７２）。これらのアプローチはいくつかの主要な欠点を有する。第１に、正電荷を持つリジンは、しばしば、タンパク質構造／機能にとって重要である（Ｙｏｓｈｉｏｋａ，Ｙ．ら、Ｏｐｔｉｍａｌ ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｎｔ ＴＮＦ−ａｌｐｈａ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｉｔｓ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｐｏｔｅｎｃｙ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ、２００４．３１５（４）：ｐ．８０８−１４）。第２に、システイン残基を付加することは可溶性発現およびジスルフィド結合形成に関する重大な問題を生じ、さらに哺乳動物発現宿主への変更を必要としうる（Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｏｕ，Ａ．ら、Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｏｌｙｓｉａｌｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ Ｆｖ ｆｒａｇｍｅｎｔ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ、２００９．２０（５）：ｐ．９２４−３１）。第３に、部位特異的ＰＥＧ化は結合したＰＥＧ分子の数をきびしく制限する。グリコＰＥＧ化はタンパク質内の特異的残基に既に結合したグリカンへのＰＥＧのコンジュゲーションを含む。その利点は以下である：（ｉ）プロセスが部位特異的であり、（ｉｉ）グリコシル化部位が活性部位から離れて工学的に操作されてもよく、（ｉｉｉ）産生物が高度に活性であり、比較的均質でありうる。
本明細書における製剤はまた、治療される特定の兆候に対する必要に応じて、１つより多い活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有するものを含有してもよい。例えば、製剤は別の抗体または化学療法剤をさらに含んでもよい。このような分子は、好適には、意図する目的に有効な量の組合せで存在する。
活性成分はまた、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミン小球体、マイクロエマルション、ナノ粒子およびナノカプセル）またはマクロエマルションにおいて、例えば、コアセルベーション技術によって、または界面重合によって調製したマイクロカプセル、例えば、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタクリレート（ｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｙｌａｔｅ））マイクロカプセルのそれぞれにおいて捕捉されうる。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ 第１６版、Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に開示されている。
ｉｎ ｖｉｖｏ投与のために使用される製剤は無菌でなければならない。これは滅菌濾過膜による濾過によって容易に達成される。持続放出調製剤が調製されてもよい。持続放出調製剤の適切な例には、成形物品、例えばフィルムまたはマイクロカプセルの形態のマトリクスである、糖タンパク質を含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリクスが含まれる。持続放出マトリクスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とエチル−Ｌ−グルタミン酸塩のコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドからなる注射可能なミクロスフェア）などの分解性乳酸−グリコール酸コポリマーおよびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が含まれる。エチレン−酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸などのポリマーは１００日以上にわたる間、分子を放出しうるのに対して、特定のヒドロゲルは短期間、タンパク質を放出する。カプセル化された抗体が長期間身体内に保持されたままである場合、それらは３７℃の水分への曝露の結果として変性または凝集する可能性があり、生物活性の損失および免疫原性の変化可能性を生じる。合理的な戦術が、関与する機構に応じて安定化のために考案されうる。例えば、凝集機構がチオ−ジスルフィド置換による分子間Ｓ−Ｓ結合形成であると発見された場合、安定化は、スルフヒドリル残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥し、水分含有量を制御し、適切な添加剤を使用し、特定のポリマーマトリクス組成物を開発することによって達成されうる。
医薬組成物は凍結乾燥されてもよい。凍結乾燥した抗体製剤は米国特許第６，２６７，９５８号に記載されている。安定な水性抗体製剤は米国特許第６，１７１，５８６号（Ｂ１）に記載されている。
特定の態様において、本発明の方法および組成物は、アッセイ、診断、試薬およびキットなどの非治療目的のために使用されてもよい。
キット
本発明はオリゴ糖物質を含有する製造物品およびキットをさらに提供する。製造物品はラベルを有する容器を含む。適切な容器には、例えば、ボトル、バイアルおよび試験管が含まれる。容器はガラスまたはプラスチックなどの種々の材料から形成されてもよい。容器は本明細書に記載されるオリゴ糖調製物を含む組成物を保持する。他の実施形態において、キットは糖タンパク質を含む。容器上のラベルは、組成物が特定の疾患または障害の治療または予防のために使用されることを示し、また、上記のもののようなｉｎ ｖｉｖｏのための指示書を示してもよい。本発明のキットは上記の容器および緩衝剤を含む第２の容器を含む。それは、使用のための指示書と共に、他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、注射器および添付文書を含む、市販および使用者の観点から望ましい他の物質をさらに含んでもよい。
最終的に、原核生物（例えば、大腸菌）における種々のグリコフォームの合成は、タンパク質への結合、グリカン配列への組込み、および他のヒト様、Ｎ結合型グリカン、診断薬、キットまたは試薬を産生する基質としての利用を促進する。
上記の開示は概して本発明を記載している。より具体的な説明は以下の実施例において以下に提供される。実施例は単に例示目的のためであり、本発明の範囲を限定することを意図していない。状況に応じて目的にあった手段が提案または与えられるならば、形態の変更および等価物の置換が意図される。特定の用語が本明細書に利用されているが、そのような用語は説明的な意図であり、限定することを目的としない。
（実施例１）
プラスミド構築
Ｖａｄｅｒｒａｍａ−Ｒｉｎｃｏｎらは、大腸菌の細胞質膜におけるＵｎｄ−ＰＰでのＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2の生合成およびアセンブリの生合成経路を近年開示した。いずれかの野生型ヌクレオチド配列またはコドン最適化配列を有するＡｌｇ１３、Ａｌｇ１４、Ａｌｇ１およびＡｌｇ２活性を含む経路は、真核生物グリコシルトランスフェラーゼ活性を原核宿主細胞に付与する。この経路は、ＧｌｃＮＡｃおよびマンノース単位をウンデカプレノール結合担体基質に加え、トリマンノシルコアオリゴ糖構造を生じさせることに役立つ。大腸菌は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃからウンデカプレニルリン酸塩（Ｕｎｄ−Ｐ）へのＧｌｃＮＡｃ−１−リン酸塩の転移を媒介して、Ｕｎｄ−ＰＰ−ＧｌｃＮＡｃを形成する膜内在性タンパク質ＷｅｃＡを有する（Ｒｉｃｋ， Ｐ．Ｄ． ＆ Ｓｉｌｖｅｒ， Ｒ．Ｐ． ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ： Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ． （Ｆ．Ｃ．ａ．ｏ． Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ編） １０４−１２２ （Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｉｏｎ， Ｄ．Ｃ．； １９９６）。従って、天然で産生されるＵｎｄ−ＰＰ−ＧｌｃＮＡｃは、所望のＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2グリカンの候補前駆体として存在する。第２のＧｌｃＮＡｃ残基の添加のため、２つのサブユニット、Ａｌｇ１３およびＡｌｇ１４を含むＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅβ１，４−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼを発現させた。酵母において、Ａｌｇ１４は、Ｄｏｌ−ＰＰ−ＧｌｃＮＡｃ2への触媒作用が生じる小胞体の細胞質ゾル表面に可溶性Ａｌｇ１３を補充するための膜アンカーとして機能する膜内在性タンパク質である（Ｂｉｃｋｅｌ，Ｔ．ら， Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｌｉｐｉｄ−ｌｉｎｋｅｄ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ：Ａｌｇ１３ｐ ａｎｄ Ａｌｇ１４ｐ ｆｏｒｍ ａ ｃｏｍｐｌｅｘ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ＧｌｃＮＡｃ（２）−ＰＰ−ｄｏｌｉｃｈｏｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８０，３４５００−３４５０６（２００５））。大腸菌において共発現させたとき、Ａｌｇ１４は膜画分において局在化することを観察し、一方Ａｌｇ１３を細胞質画分と膜画分の両方において見出し、これは酵母における状況と一致する。続くステップのため、第１のマンノースをグリカンに付着させる、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅβ１，４−マンノシルトランスフェラーゼＡｌｇ１、およびα１，３−マンノース残基とα１，６−マンノース残基両方のグリカンへの付加を触媒する、二官能性マンノシルトランスフェラーゼＡｌｇ２を発現させた（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ，Ｍ．Ｋ．，ら，Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｕａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｌｇ２ ａｎｄ Ａｌｇ１１：ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍａｎｎｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ ｉｎ Ｎ−ｌｉｎｋｅｄ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４５，９５９３−９６０３（２００６））。大腸菌における発現後、Ａｌｇ１とＡｌｇ２の両方は細胞膜に局在化した。正確に局在化したＡｌｇ酵素が、Ｕｎｄ−ＰＰでのＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2を産生する能力があるかどうかを判定するために、Ａｌｇ１３、Ａｌｇ１４、Ａｌｇ１およびＡｌｇ２の同時発現を可能にするプラスミドｐＹＣＧ（Ｖａｌｄｅｒｒａｍａ−Ｒｉｎｃｏｎら）を構築した。
プラスミドｐＭＷ０７を構築した（Ｖａｌｄｅｒｒａｍａ−Ｒｉｎｃｏｎら）。プラスミドｐＭＱ７０（Ｓｈａｎｋｓら，２００６ ＡＥＭ．７２（７）５０２７−５０３６．）を、Ｅａｍ１１０５ｌのイソ制限酵素であるＡｈｄ１で直鎖化した。ｐ１５ａ ｏｒｉ遺伝子およびｃａｔ遺伝子をｐＢＡＤ３３から増幅し、これを使用して、直鎖化したベクターｐＭＱ７０で酵母を同時形質転換した。酵母における相同組換えは、ｃｏｌＥ１ ｏｒｉ遺伝子とｂｌａ遺伝子の置換をもたらし、ベクターｐＭＷ０７（Ｖａｌｄｅｒｒａｍａ−Ｒｉｎｃｏｎら）を生じた。表３は、種々の株の構築および遺伝子型を挙げる。
（実施例２）
分析プロトコール
Ｎ結合オリゴ糖の抽出方法および精製方法を、Ｇａｏら（Ｇａｏら，“Ｎｏｎ−ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｌｉｐｉｄ ｌｉｎｋｅｄ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｂｙ ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ−ａｓｓｉｓｔｅｄ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，”Ｍｅｔｈｏｄ Ｅｎｚｙｍｏｌ ４１５：３−２０）に記載される通り進めた。精製したオリゴ糖を、ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）をマトリクスとして使用するＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析（ＡＢ Ｓｃｉｅｘ ＴＯＦ／ＴＯＦ ５８００）により分析した。
グリカン図は、ＧｌｙｃｏＷｏｒｋｂｅｎｃｈ ２．０において作成した、標準的ＣＦＧ（Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ ｆｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）白黒表記法である。
（実施例３）
大腸菌におけるヒト様Ｎ結合Ｍａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2高マンノース型のオリゴ糖の産生
ヒト、および他の真核生物において、Ｍａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2グリコフォームは、グリカン合成において鍵となる中間体である。真核生物において、この鍵となるグリコフォームは、小胞体膜の細胞質ゾル側において合成される。酵素Ａｌｇ１１は、α１，２−マンノース残基２つの、Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2グリカンコアのα１，３マンノースへの付加を触媒する。Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2トリマンノシルコア（Ｖａｌｄｅｒｒａｍａ−Ｒｉｎｃｏｎら）の産生のため使用するプラスミドｐＭＷ０７−ＹＣＧ−ＰｇｌＢ．ＣＯへのグルタチオンＳ−トランスフェラーゼをコードする遺伝子（ｇｓｔ）の融合物として、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＡｌｇ１１をコードする遺伝子をクローニングした。得られたプラスミドを、エレクトロポレーションにより大腸菌ＭＣ４１００ ΔｗａａＬ ｇｍｄ：：ｋａｎに形質転換した（Ｇｌｙ０２）。Ｇｌｙ０２を、ルリア−ベルターニ（ＬＢ）培地１００ｍＬにおいて成長させ、培養液が光学密度３．０に達したら、０．２％（ｖ／ｖ）アラビノースを加えることにより誘導した。
精製したオリゴ糖の質量分析による分析は、所望のＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2グリコフォームと一致する優勢なピーク（ｍ／ｚ １２５７．６ Ｎａ＋）を明らかにした（図１Ａ）。いくつかの試料において、小さなピークが出現し、これはＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2グリコフォームと一致した（ｍ／ｚ ９３３．５ Ｎａ＋）。他の例において、Ｍａｎ2ＧｌｃＮＡｃ2、Ｍａｎ4ＧｌｃＮＡｃ、Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2、ＨｅｘＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2、ＨｅｘＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ、Ｍａｎ6ＧｌｃＮＡｃと一致する、グリカンを含む小さなピークが出現した。予測されるα１，２マンノース残基のＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2グリカンコアへの付加を確認するために、精製したグリカンを、製造元のプロトコールに従いα１，２マンノシダーゼ（Ｐｒｏｚｙｍｅ）で処理した。酵素とインキュベートした後、グリカンを標識し、質量分析およびＧａｏらの方法におけるＦＡＣＥゲルにより分析した。未処理の試料において、Ｍａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2グリコフォームと一致する優勢なピークを観察した（図示せず）。処理した試料において、Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2グリコフォームと一致する優勢なピーク（ｍ／ｚ ９３３．４ Ｎａ＋）を観察した（図１Ｂ）。これは、α１，２−マンノース残基２つのＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2グリカンコアへの予測される付加を確かにする。結果として、ヒト様Ｍａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2グリコフォームを、大腸菌におけるＡｌｇ１１の発現により産生することができる。Ｍａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2グリコフォームは、真核生物において一時的なオリゴ糖であるので、その単離は、他の手段による課題である。活性酵素の十分な量の発現における困難性に起因し、この系におけるＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2の合成も課題であった。種々の融合パートナーを、Ａｌｇ１１単独と共に調査し、調べたＡｌｇ１１部分の多数について効率的な産物形成の欠如をもたらした。Ａｌｇ１１に融合したｇｓｔおよびｍｓｔＸは、この系においてＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2グリコフォームを産生した。
（実施例４）
大腸菌におけるハイブリッドＮ結合ＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2オリゴ糖の産生
ヒト、および他の真核生物において、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2グリコフォームは、グリカン合成において鍵となる中間体である。このグリコフォームは、典型的には、真核生物のゴルジにおいてタンパク質に付着したＮ結合グリカンでのみ見出される。ここで、グリカンを、大腸菌において脂質担体にてアセンブルした。これを達成するために、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｃｕｍ Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ（ＧｎＴＩ）の切断形態（残基３０〜４４６）をコードする遺伝子を合成した。ＧｎＴＩ遺伝子をＰＣＲにより増幅し、天然のシグナル配列を欠く大腸菌マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）をコードする遺伝子（ｍａｌＥ）への融合物としてプラスミドｐＭＱ７０にサブクローニングした。得られたｐＭＱ７０−ＭＢＰ−ＮｔＧｎＴＩを、Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2トリマンノシルコアの産生のため第２のプラスミドｐＭＷ０７−ＹＣＧ−ＰｇｌＢ．ＣＯと共にエレクトロポレーションにより大腸菌ＭＣ４１００ ΔｗａａＬ ｇｍｄ：：ｋａｎ（Ｇｌｙ０３）およびＯｒｉｇａｍｉ２ ｇｍｄ：：ｋａｎ（Ｇｌｙ０３．１）に形質転換し（Ｖａｌｄｅｒｒａｍａ−Ｒｉｎｃｏｎら）、ルリア−ベルターニ（ＬＢ）培地１００ｍＬにおいて成長させた。培養液が光学密度３．０に達したら、０．２％（ｖ／ｖ）アラビノースを加えることにより、グリコシルトランスフェラーゼ発現を誘導した。
精製したオリゴ糖の質量分析による分析は、所望のＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2グリコフォームと一致する、優勢なピーク（ｍ／ｚ １１３６．５ Ｎａ＋）を明らかにした（図２Ａ）。小さなピークは、Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2グリコフォームと一致した（ｍ／ｚ ９３３．４ Ｎａ＋）。予測されるＧｌｃＮＡｃのＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2グリカンコアへの付加を確認するために、精製したグリカンを、製造元のプロトコールに従いβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で処理した。酵素とインキュベートした後、グリカンを標識し、質量分析、およびＧａｏらの方法におけるＦＡＣＥゲルにより分析した。未処理の試料において、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2グリコフォームと一致する優勢なピークを観察した（図示せず）。処理した試料において、優勢なピークは、Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2グリコフォームと一致する（図２Ｂ）。これは、β−ＧｌｃＮＡｃのＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2グリカンコアへの予測される付加を確かにする。結果として、ヒト様ＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2グリコフォームを、大腸菌におけるＧｎＴＩの発現により産生することができる。ＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2グリコフォームは、真核生物において一時的なオリゴ糖であるので、その単離は、他の手段による課題である。大腸菌におけるヒトＧｎＴＩ単独、またはｍｓｔＸに融合したヒトＧｎＴＩの発現をまず試み、所望のＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2グリコフォームを効率的に産生しない、この系を使用する上での障害にも遭遇した（図示せず）。さらに、ＭＢＰに融合しないとき、Ｎ． ｔａｂａｃｃｕｍ ＧｎＴＩは、所望の産物を産生できなかった（図示せず）。
（実施例５）
大腸菌におけるＮ結合ＧｌｃＮＡｃ2Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2複合オリゴ糖の産生
ヒト、および他の真核生物において、ＧｌｃＮＡｃ2Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2複合グリコフォーム（「Ｇ０」）は、グリカンを完全に装飾する「コア」であるので、グリカン合成において鍵となる中間体である。このグリコフォームを、真核生物のゴルジにおいてタンパク質に付着したＮ結合グリカンにて典型的にはただ見出しただけである。ここで、グリカンを、大腸菌において脂質担体にてアセンブルした。これを達成するために、ヒトＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ（ＧｎＴＩＩ）の切断形態（残基３０〜４４７）をコードする遺伝子を合成した。ＧｎＴＩＩ遺伝子をＰＣＲにより増幅し、天然のシグナル配列を欠くＭＢＰへの融合物としてプラスミドｐＭＱ７０にサブクローニングした。得られたｐＭＱ７０−ＭＢＰ−ｈＧｎＴＩＩを、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2基質オリゴ糖の産生のため第２のプラスミドｐＭＷ０７−ＹＣＧ−ＭＢＰ−ＮｔＧｎＴＩと共にエレクトロポレーションにより大腸菌ＭＣ４１００ΔｗａａＬ ｇｍｄ：：ｋａｎ、（ｇｌｙ０６）Ｏｒｉｇａｍｉ２ ｇｍｄ：：ｋａｎ（Ｇｌｙ０６．１）、ＤＲ４７３ ｇｍｄ：：ｋａｎ（ｇｌｙ０６．２）およびＳｈｕｆｆｌｅ ΔｗａａＬ ｇｍｄ：：ｋａｎ（Ｇｌｙ０６．３）に形質転換した。ルリア−ベルターニ（ＬＢ）培地１Ｌへの接種直後に加えた０．２％（ｖ／ｖ）アラビノースでグリコシルトランスフェラーゼ発現を誘導した。
精製したオリゴ糖の質量分析による分析は、所望のＧｌｃＮＡｃ2Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2グリコフォームと一致する優勢なピーク（ｍ／ｚ １３３９．８ Ｎａ＋）を明らかにした（図３）。小さなピークは、Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2グリコフォームと一致した（ｍ／ｚ ９３３．５ Ｎａ＋）。ＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2と一致する第２の小さなピーク（ｍ／ｚ １１３６．６ Ｎａ＋）もスペクトルにおいて観察した。発現単独により、またはｍｓｔＸもしくはＭＢＰに融合させることで、３つの生物由来のＧｎＴＩＩを調べ、糖鎖工学的に操作した大腸菌におけるＧｎＴＩＩの発現が課題であると判明した。加えて、酸化細菌株と非酸化細菌株の両方において、ＧｎＴＩＩ発現を調べた。調べた６つのＧｎＴＩＩ部分および４つの細菌株のうち、４つの細菌株のうち１つにおいてＭＢＰに融合したヒトＧｎＴＩＩでＧｌｃＮＡｃ2Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2グリカンの効率的な産生を見出した（図示せず）。
（実施例６）
大腸菌における分岐Ｎ結合ＧｌｃＮＡｃ2Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2ハイブリッドオリゴ糖の産生
多重アンテナＮ結合グリカンの合成は、ヒトおよび他の真核生物において共通する特徴である。Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＶ（ＧｎＴＩＶ）によるＧｌｃＮＡｃ残基のＧｌｃＮＡｃ2Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2への付加により、トリアンテナオリゴ糖の産生を達成する。ＧｎＴＩＶはまたＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2にて作用し、ＧｌｃＮＡｃ2Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2複合グリカンの構造異性体であるバイアンテナハイブリッドオリゴ糖を産生することができる。ウシＧｎＴＩＶの切断形態（残基９３〜５３５）をコードする細菌コドン最適化遺伝子を合成した。ＧｎＴＩＶ遺伝子をＰＣＲにより増幅し、天然のシグナル配列を欠くＭＢＰへの融合物としてプラスミドｐＭＱ７０にサブクローニングした。得られたｐＭＱ７０−ＭＢＰ−ｈＧｎＴＩＶを、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2基質オリゴ糖の産生のため第２のプラスミドｐＭＷ０７−ＹＣＧ−ＭＢＰ−ＮｔＧｎＴＩと共にエレクトロポレーションにより大腸菌ＭＣ４１００ ΔｗａａＬ ｇｍｄ：：ｋａｎ（Ｇｌｙ０５）およびＯｒｉｇａｍｉ２ ｇｍｄ：：ｋａｎ（Ｇｌｙ０５．１）に形質転換した。ルリア−ベルターニ（ＬＢ）培地１Ｌへの接種直後に加えた０．２％（ｖ／ｖ）アラビノースでグリコシルトランスフェラーゼ発現を誘導した。
精製したオリゴ糖の質量分析による分析は、所望のＧｌｃＮＡｃ2Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2グリコフォームと一致する優勢なピーク（ｍ／ｚ １３３９．７ Ｎａ＋）を明らかにした（図４Ａ）。いくつかの試料において、小さなピークは、Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2グリコフォームと一致した（ｍ／ｚ ９３３．５ Ｎａ＋）。予測されるＧｌｃＮＡｃのＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2グリカンへの付加を確認するために、精製したグリカンを、製造元のプロトコールに従いβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で処理した。酵素とインキュベートした後、グリカンを標識し、質量分析により分析した。未処理の試料において、ＧｌｃＮＡｃ2Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2グリコフォームと一致する優勢なピークを観察した（図示せず）。処理した試料において、優勢なピークは、Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2グリコフォームと一致する（図４Ｂ）。これは、β−ＧｌｃＮＡｃのＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2グリカンコアへの予測される付加を確かにした。酸化細菌株と非酸化細菌株の両方においてＧｎＴＩＶ発現を調べ、糖鎖工学的に操作した大腸菌におけるＧｎＴＩＶの発現が課題であると判明した。ＧｌｃＮＡｃ2Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2グリカンの効率的な産生は、酸化細菌株においてのみ見出された（図示せず）。
（実施例７）
大腸菌における多重アンテナＮ結合ＧｌｃＮＡｃ3Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2ハイブリッドオリゴ糖の産生
トリアンテナＮ結合グリカンの合成は、ヒトおよび他の真核生物において見出される特徴である。１つのかかるトリアンテナオリゴ糖の産生を、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＶ（ＧｎＴＩＶ）によるＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ残基のＧｌｃＮＡｃ2Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2への付加により達成する。ウシＧｎＴＩＶをコードするコドン最適化遺伝子を合成した。ＧｎＴＩＶ遺伝子をＰＣＲにより増幅し、プラスミドｐＭＱ７０−ＭＢＰ−ｈＧｎＴＩＩにおけるヒトＧｎＴＩＩ遺伝子の３’末端の後にサブクローニングした。得られた構築物を、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2基質オリゴ糖の産生のため第２のプラスミドｐＭＷ０７−ＹＣＧ−ＭＢＰ−ＮｔＧｎＴＩと共にエレクトロポレーションにより大腸菌細胞（Ｏｒｉｇａｍｉ２ ｇｍｄ：：ｋａｎ）に形質転換して、株ＧＬＹ０６．１を作り出した。ルリア−ベルターニ（ＬＢ）培地１Ｌへの接種直後に加えた０．２％（ｖ／ｖ）アラビノースでグリコシルトランスフェラーゼ発現を誘導した。Ｎ結合オリゴ糖の抽出方法および精製方法を、Ｇａｏらに記載される通り進めた。ＤＨＢを基質として用いたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析（ＡＢ Ｓｃｉｅｘ ＴＯＦ／ＴＯＦ ５８００）により、精製したオリゴ糖を分析した。
精製したオリゴ糖の質量分析による分析は、それぞれ、基質ＧｌｃＮＡｃ2Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2およびＧｌｃＮＡｃ3Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2産物グリコフォームと一致する１３３９．９（Ｎａ＋）および１５４３．１（Ｎａ＋）のｍ／ｚ値を有する２つの優勢なピークを明らかにした（図５Ｂ）。
基質オリゴ糖Ｇ０（１）を生成するために、０．２％ｖ／ｖアラビノースで２０時間、３０℃にて、ＧＬＹ０６の１Ｌの密な培養液を誘導した。Ｇａｏらに記載される方法を進めることにより、Ｇ０オリゴ糖を単離した。０．２％ｖ／ｖアラビノースで１６時間、２５℃にて誘導することにより、別の１００ｍＬの培養液において、グリコシルトランスフェラーゼを発現させた。この培養液を遠心分離によりペレット化し、ＧｎＴＩＶ活性緩衝液（５０ｍＭ トリス、１０ｍＭ ＭｎＣｌ2、ｐＨ７．５）２ｍｌに再懸濁し、超音波処理した。溶菌液を遠心分離により清澄化し、２０μＬを乾燥トリマンノシルコア基質（約５μｇ）に加えた。ヌクレオチド−糖の過剰量（２０μｇ）を反応液に加え、続いて３０℃にてインキュベートした。２４時間にわたり種々の時間ポイントで、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により、反応をモニターした。
精製したオリゴ糖の質量分析による分析は、所望のＧｌｃＮＡｃ3Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2グリコフォームと一致するピーク（ｍ／ｚ １５４２．９ Ｎａ＋）を明らかにした（図５Ａ）。
（実施例７）
大腸菌におけるハイブリッドＮ結合ＧａｌＧｌｃＮＡｃ2Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2ハイブリッドオリゴ糖の産生
ヒト、および他の真核生物において、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ2Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2グリコフォームは、グリカン合成における中間体である。このグリコフォームは、健常な成人においてやや非定型であるが、前立腺がんを有する個体において見出された（Ｋｙｓｅｌｏｖａら，“Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓｅｒｕｍ ｇｌｙｃｏｍｅ ｄｕｅ ｔｏ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｐｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ，”Ｊ． Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ．（２００７））。ここで、該グリカンを、大腸菌において脂質担体にてアセンブルした。ヘリコバクター・ピロリβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）をコードする遺伝子を合成し、ＰＣＲにより増幅し、プラスミドｐＭＱ７０にサブクローニングした。得られたｐＭＱ７０−ＨｐＧａｌＴを、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2基質オリゴ糖の産生のため第２のプラスミドｐＭＷ０７−ＹＣＧ−ＭＢＰ−ＮｔＧｎＴＩと共にエレクトロポレーションによりＭＣ４１００ ΔｗａａＬ ｇｍｄ：：ｋａｎ（Ｇｌｙ０４）およびＯｒｉｇａｍｉ２ ｇｍｄ：：ｋａｎ（Ｇｌｙ０４．１）に形質転換した。ルリア−ベルターニ（ＬＢ）培地１Ｌへの接種直後に加えた０．２％（ｖ／ｖ）アラビノースでグリコシルトランスフェラーゼ発現を誘導した。
精製したオリゴ糖の質量分析による分析は、所望のＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2グリコフォームと一致する優勢なピーク（ｍ／ｚ １２９８．７ Ｎａ＋）を明らかにした（図６）。いくつかの試料において、小さなピークは、Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2グリコフォームと一致した（ｍ／ｚ ９３３．５ Ｎａ＋）（図示せず）。ＭＢＰおよびｍｓｔＸに融合していない、および融合しているウシおよびヒト由来のＧａｌＴ両方、ならびにＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ由来のＧａｌＴは、大腸菌において所望のオリゴ糖を産生せず、糖鎖工学的に操作した大腸菌におけるＧａｌＴの発現が課題であると判明した（図示せず）。さらに、酸化細菌株と非酸化細菌株両方において、ヘリコバクター・ピロリＧａｌＴの発現を調べ、酸化細菌株においてのみ効率的なガラクトシル化が見出された。
（実施例８）
大腸菌におけるＮ結合Ｇａｌ2ＧｌｃＮＡｃ2Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2複合オリゴ糖の産生
ヒト、および他の真核生物において、Ｇａｌ2ＧｌｃＮＡｃ2Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2グリコフォームは、グリカン合成において鍵となる中間体である。このグリコフォームは、典型的には、真核生物においてタンパク質に付着したＮ結合グリカンにおいてのみ見出される。
１つの試料において、該グリカンを、Ｇｌｙ０６から産生したＧ０オリゴ糖および実施例７に記載される方法を用いて、ｅｘ ｖｉｖｏで産生した。精製したオリゴ糖の質量分析による分析は、所望のＧａｌＧｌｃＮＡｃ2Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2グリコフォームと一致する優勢なピーク（ｍ／ｚ １６６４．１ Ｎａ＋）を明らかにした（図７Ａ）。
末端をガラクトシル化したグリカンのｉｎ ｖｉｖｏ合成のため、ヘリコバクター・ピロリβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）をコードする遺伝子を合成し、ＰＣＲにより増幅し、プラスミドｐＭＱ１３２にサブクローニングした。得られたｐＭＱ１３２−ＨｐＧａｌＴを、ＧｌｃＮＡｃ2Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2基質オリゴ糖の産生のため第２のプラスミドｐＭＷ０７−ＹＣＧ−ＭＢＰ−ＮｔＧｎＴＩおよび第３のプラスミドｐＭＱ７０−ＭＢＰ−ｈＧｎＴＩＩと共に、エレクトロポレーションによりＯｒｉｇａｍｉ２ ｇｍｄ：：ｋａｎ（Ｇｌｙ０４．２）に形質転換した。ルリア−ベルターニ（ＬＢ）培地１Ｌへの接種直後に加えた０．２％（ｖ／ｖ）アラビノースでグリコシルトランスフェラーゼ発現を誘導した。
精製したオリゴ糖の質量分析による分析は、所望のＧａｌ2ＧｌｃＮＡｃ2Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2グリコフォームと一致する優勢なピーク（ｍ／ｚ １６６４．１ Ｎａ＋）を明らかにした（図７Ａ）。Ｇｌｙ０４．２において合成したグリカンの分析は、Ｇ２グリコフォームと一致するピーク（ｍ／ｚ １６６２．２ Ｎａ＋）、Ｇ１グリコフォームと一致するピーク（ｍ／ｚ １５００．０ Ｎａ＋）、およびＧ０グリコフォームと一致するピーク（ｍ／ｚ １３３７．９ Ｎａ＋）を明らかにした。大腸菌においてＧａｌ2ＧｌｃＮＡｃ2Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2グリコフォームを産生するとき、両方の産物を産生するために同一の酵素を使用するので、実施例７に記載した同一の課題に遭遇した。
（実施例８）
大腸菌におけるＮ結合ＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2ハイブリッドオリゴ糖の産生
基質オリゴ糖ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2を生成するために、０．２％ｖ／ｖアラビノースで２０時間、３０℃にて、ＧＬＹ０４．１の１Ｌの密な培養を誘導した。Ｇａｏらに記載される方法を進めることにより、基質オリゴ糖を単離した。０．２％ｖ／ｖアラビノースで１６時間、２５℃にて誘導することにより、別の１００ｍＬの培養液において、ＳＴ６を発現させた。この培養液を遠心分離によりペレット化し、ＳＴ６活性緩衝液（５０ｍＭ トリス、１０ｍＭ ＭｎＣｌ2、ｐＨ７．５）２ｍｌに再懸濁し、超音波処理した。溶菌液を遠心分離により清澄化し、２０μＬを、乾燥トリマンノシルコア基質（約５μｇ）に加えた。ヌクレオチド−糖の過剰量（２０μｇ）を反応液に加え、３０℃で続いてインキュベートした。２４時間にわたり種々の時間ポイントで、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により、反応をモニターした。
精製したオリゴ糖の質量分析による分析は、所望のＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2グリコフォームと一致するピーク（ｍ／ｚ １５６５．７ Ｎａ＋）を明らかにした（図８）。
（実施例９）
大腸菌におけるＮ結合グリカン収量の最適化
（ｉ）糖タンパク質産生の増大、および（ｉｉ）グリカンアレイなどの糖分析ツールの産生を促進することを含む、糖鎖工学的に操作した大腸菌において産生したＮ結合グリカンの量を増大する多数の方法が存在する。それゆえ、トリマンノシルコアグリカン、Ｍａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2グリカンの収量、ならびにＧｌｃＮＡｃ残基のトリマンノシルコアへの付加の改善が保証される。大腸菌におけるヌクレオチド−糖プールが制限的であり得ることを理解し、ヌクレオチド−糖生合成経路における酵素を、糖鎖工学的に操作した大腸菌における過剰発現の標的とした。具体的には、ホスホマンノムターゼ（ＭａｎＢ）、マンノース−１−ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ（ＭａｎＣ）、およびグルタミン−フルクトース−６−ホスフェートトランスアミナーゼ（ＧｌｍＳ）を調べ、ここで、ＭａｎＢおよびＭａｎＣはＧＤＰ−マンノースの形成に関与し、ＧｌｍＳはＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃの形成に関与する。
大腸菌由来のＭａｎＢおよびＭａｎＣをコードする遺伝子を、プラスミドｐＭＱ７０にバイシストロン性（ＭａｎＣ／ＭａｎＢ）にクローニングし、エレクトロポレーションによりＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2トリマンノシルコア（Ｖａｌｄｅｒｒａｍａ−Ｒｉｎｃｏｎら）の産生のためｐＭＷ０７−ＹＣＧ−ＰｇｌＢ．ＣＯと共に大腸菌ＭＣ４１００ ΔｗａａＬ ｇｍｄ：：ｋａｎに形質転換した（Ｇｌｙ０１．２）。大腸菌由来のＧｌｍＳをコードする遺伝子を、プラスミドｐＴｒｃ９９Ｙ（Ｖａｌｄｅｒｒａｍａ−Ｒｉｎｃｏｎら）にクローニングし、エレクトロポレーションによりｐＭＷ０７−ＹＣＧ−ＭＢＰ−ＮｔＧｎＴＩと共に大腸菌ＭＣ４１００ ΔｗａａＬ ｇｍｄ：：ｋａｎに形質転換した（Ｇｌｙ０１．３）。ｐＭＷ０７−ＹＣＧ−ＰｇｌＢ．ＣＯを含有する大腸菌ＭＣ４１００ ΔｗａａＬ ｇｍｄ：：ｋａｎ（Ｇｌｙ０１）およびｐＭＷ０７−ＹＣＧ−ＭＢＰ−ＮｔＧｎＴＩを含有する大腸菌ＭＣ４１００ ΔｗａａＬ ｇｍｄ：：ｋａｎ（Ｇｌｙ０１．１）を対照として使用した。Ｇｌｙ０１およびＧｌｙ０１．２をルリア−ベルターニ（ＬＢ）培地１００ｍＬにて成長させ、０．２％（ｖ／ｖ）アラビノースで光学密度（Ｏ．Ｄ．）３にて発現を誘導した。Ｇｌｙ０１．１およびＧｌｙ０１．３をＬＢ培地１００ｍＬにて成長させ、０．２％（ｖ／ｖ）アラビノースおよび１ｍＭ ＩＰＴＧ（Ｇｌｙ０１．３のみ）でＯ．Ｄ．３にて発現を誘導した。Ｎ結合オリゴ糖の抽出方法および精製方法を、Ｇａｏらに記載される通り進めた。精製したオリゴ糖を、Ｇａｏらに記載される方法を用いた蛍光体支援糖質電気泳動（ＦＡＣＥ）により分析した。
Ｇｌｙ０１．２の場合において、Ｇｌｙ０１と比較したとき、トリマンノシルコアの産生の多大な増大を観察した（図９Ａ、左パネル）。しかしながら、Ｇｌｙ０１トリマンノシルコアバンドはほぼ検出不可能であったので、収量の差を定量化することに困難があった。同様に、Ｇｌｙ０１．３の場合において、Ｇｌｙ０１．１と比較したとき、グリカン収量の多大な増大を観察した（図９Ａ、右パネル）。加えて、Ｇｌｙ０１．１と比較したとき、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2の多大な増大を観察し、このことが、この酵素を過剰発現の標的にする目標であった。ヌクレオチド−糖生合成に関与する多数の酵素が存在するので、多数の酵素がグリカン収量に対してほとんど効果を有し得ない、糖鎖工学的に操作した大腸菌において、過剰発現の標的にする酵素を決定することについて、注意深い考慮を行った。
ｃＡＭＰレベルは過剰のグリセロールを有する大腸菌において高いままなので、プロモーター抑制を介してプラスミドからの遺伝子発現をもたらさないように、グリセロールはグルコースの代わりの炭素供給源を提供する。グリセロールの使用は、図９Ｂに示す通り、グリカン収量を増大するようである。ピルビン酸塩は、クレブス回路においてＧＤＰをＧＴＰに再循環させる際に役割を果たす。ＧＴＰは、ＧＤＰ−マンノース形成に必要であるＧＤＰ−マンノースピロホスホリラーゼの基質である。グリカン収量の増大についても、ピルビン酸塩の添加と共に熟考した（図９Ｃ）。
精製したオリゴ糖の、ＭａｎＣ／Ｂの過剰発現を有する宿主細胞の質量分析による分析は、ＭａｎＣ／Ｂ過剰発現を有さない宿主細胞と比較して、小さなピークの事実上の排除を明らかにした。ＧＬＹ０１．４は、所望のＭ３グリコフォームと一致する単一の優勢なピーク（ｍ／ｚ ９３３．５ Ｎａ＋）を産生した（図１０Ｄ）。ＧＬＹ０２．１は、所望のＭ５グリコフォームと一致する単一の優勢なピーク（ｍ／ｚ １２５７．７ Ｎａ＋）を産生した（図１０Ｅ）。ＧＬＹ０１．５は、所望のハイブリッドＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2グリコフォームと一致する単一の優勢なピーク（ｍ／ｚ １１３６．９ Ｎａ＋）を産生した（図１０Ｆ）。
（実施例１０）
大腸菌におけるグリコシル化グルカゴン産生
グルカゴン構築物は、Ｎ結合グリコシル化部位（ＤＱＮＡＴ）を有するグルカゴン、続いてＣ末端の６つのヒスチジンタグからなる。ベクターｐＴｒｃ９９Ｙにおいて、３つの連続するＣ末端ＴＥＶタンパク質分解酵素部位の後のＭＢＰのＣ末端への融合物として、グルカゴンを発現させる。ＭａｎＣおよびＭａｎＢをコードする遺伝子も、グルカゴンコード領域の３’末端の後でこのベクターにクローニングした。得られたプラスミドを、対応するグリコシルトランスフェラーゼプラスミドと共にエレクトロポレーションにより大腸菌細胞（Ｏｒｉｇａｍｉ２ΔｗａａＬ、ｇｍｄ：：ｋａｎ）に形質転換した。それぞれの株の培養液１００ｍＬを、６００ｎｍでの光学密度約２．０まで成長させ、０．２％ｖ／ｖアラビノースで１６時間誘導し、続いて０．１ｍＭ ＩＰＴＧで８時間、３０℃にて誘導した。遠心分離により細胞を回収し、溶解緩衝液（５０ｍＭ ＰＯ４緩衝液、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に再懸濁し、超音波処理し、スピンして細片を取り除いた。清澄化した細胞溶菌液を、予め平衡化したＮｉ−ＮＴＡスピンカラム（Ｑｉａｇｅｎ）に添加し、３０ｍＭ イミダゾールを含有する緩衝液で洗浄した。融合タンパク質を３００ｍＭイミダゾール２００μＬで溶出した。続いて、溶出したタンパク質を、ＴＥＶタンパク質分解酵素（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）１μｇと、３０℃にてインキュベートした。２４時間にわたる種々の時間ポイントでの質量分析により、試料を分析した。
Ｃ末端グリコシル化部位と付加した部分的に精製したグルカゴンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳの分析は、以下：予測されるＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2糖ペプチド（ｍ／ｚ ６２８３）と一致するＧＬＹ０１．６株由来（図１１Ａ）、予測されるＧｌｃＮＡｃＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2糖ペプチド（ｍ／ｚ ６６１１）と一致するＧＬＹ０２．２株由来（図１１Ｂ）、予測されるＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2糖ペプチド（ｍ／ｚ ６４８８）と一致するＧＬＹ０１．７株由来（図１１Ｃ）、および予測されるＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2糖ペプチド（ｍ／ｚ ６６４９）と一致するＧＬＹ０４．３株由来（図１１Ｄ）の通りであった。アスタリスクは、グリコシルトランスフェラーゼと無関係な全試料に存在するバックグラウンドシグナルを示す。
（実施例１１）
大腸菌におけるマンノシル化ワクチン産生
候補抗原で遺伝子をクローニングすることおよび発現させること。グリコシル化研究のための調製物における候補抗原の良好な発現は、タンパク質が受容体アスパラギンをコードし、ペリプラズムで発現させることを必要とする。細菌のＯＳＴ ＰｇｌＢに対して最適化したＮ−グリコシル化シークオン４反復を含有するＧｌｙｃＴａｇを利用する。Ｓｅｃ経路を介して排出され、グリコシル化のため異所性タンパク質の排出において首尾よく機能する、大腸菌マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）由来のシグナルペプチドを使用する（Ｆｉｓｈｅｒ， Ａ．Ｃ．，ら，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ａｎｄ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｎ-Ｌｉｎｋｅｄ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０１１．７７（３）：８７１〜８８１ページ）。グリコシル化研究における使用に適当な発現レベルをもたらすためにイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘導可能なＴＲＣプロモーターからタンパク質を発現させる（Ｆｉｓｈｅｒら）。
大腸菌ワクチン抗原のマンノシル化。病原体ＥｘＰＥＣ大腸菌由来の候補ワクチン抗原ｃ１２７５および３４７３（Ｍｏｒｉｅｌら，ＰＮＡＳ ２０１０）をコードする遺伝子を、成熟ＭＢＰのＣ末端への融合物としてクローニングし、それらのＣ末端で４つの連続するグリコシル化シークオン（４×ＧｌｙｃＴａｇ）およびヘキサヒスチジンタグで修飾した。タンパク質をペリプラズムに標的化するために、ＤｓｂＡ由来のシグナルペプチドを利用した。得られたプラスミドを、エレクトロポレーションにより大腸菌細胞（ＭＣ４１００ ΔｗａａＬΔｇｍｄ：：ｋａｎ）においてｐＭＷ０７−ＹＣＧ−ＰｇｌＢと対形成させた。それぞれの株の培養液１０Ｌへの接種後、これを６００ｎｍでの光学密度約３．０まで成長させ、０．２％（ｖ／ｖ）アラビノースおよび１ｍＭ ＩＰＴＧの添加で誘導した。従前（Ｖａｌｅｒｒａｍａ−Ｒｉｎｃｏｎら）の通り、ＣｏｎＡアフィニティークロマトグラフィー、続いてニッケルアフィニティークロマトグラフィーにより、糖タンパク質を単離した。部分的に精製した試料を、抗ヘキサヒスチジン抗体およびＣｏｎＡレクチンを用いたウエスタンブロットにより分析した（図１２）。
アスパラギン結合マンノース末端グリカンでの抗原の修飾。Ｃ．ｊｅｊｕｎｉヘプタサッカリドの首尾よい付着後、マンノース−末端グリカンを候補抗原に付着させる。パウチマンノースオリゴ糖構造は正常なヒトＮ−グリカンとして存在し、そしてこれはヒト治療（Ｖａｎ Ｐａｔｔｅｎ，Ｓ．Ｍ．，ら，Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｍａｎｎｏｓｅ ｃｈａｉｎ ｌｅｎｇｔｈ ｏｎ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ｇｌｕｃｏｃｅｒｅｂｒｏｓｉｄａｓｅ ｆｏｒ ｅｎｚｙｍｅ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｇａｕｃｈｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００７．１７（５）：４６７〜４７８ページ）において現在使用されており、このことはグリカン自体がヒトにおいて許容されることを示唆している。プラスミド（ｐＹＣＧ−ＰｇｌＢ）は、ＯＳＴ ＰｇｌＢ、ならびにＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来の４つのグリコシルトランスフェラーゼ：Ａｌｇ１３、Ａｌｇ１４、Ａｌｇ１、およびＡｌｇ２を発現する（Ｖａｌｄｅｒｒａｍａら）。これらのタンパク質は、Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2グリカンおよびその誘導体の合成および結合を調和させ、ヒト複合Ｎ−グリカンの基礎を形成する。
Ｃ．ｊｅｊｕｎｉヘプタサッカリドとのグリコシル化により検証した候補抗原を、グリコシル化宿主株ＭＣ４１００ ΔｗａａＬ ｇｍｄ：：ｋａｎにおいてｐＹＣＧ−ＰｇｌＢと個々に共発現させる。グリコシル化経路酵素および抗原の誘導後、細胞を溶解し、α−結合マンノース残基を結合するＣｏｎＡレクチンで標的タンパク質を単離する。工学的に操作したグリカンはα−マンノース残基で終結するので、ＣｏｎＡでの精製は、完全な所望のグリカンで修飾したタンパク質の回収に有利に働く。ニッケル−アフィニティークロマトグラフィーを使用してマンノシル化抗原をさらに精製し、ＰＮＧａｓｅ Ｆでタンパク質の部分を処理してグリカンを切断する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いてＣｏｎＡおよび抗Ｈｉｓ抗体での免疫ブロットによる分析は、予測されるマンノシル化タンパク質の回収を検証する。付着したグリカンがＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2であることを確認するために、ＰＮＧａｓｅ Ｆで放出したグリカンを、（Ｖａｌｄｅｒｒａｍａ−Ｒｉｎｃｏｎら）において記載される通り、質量分析する。このプロセスは、均一な、細菌由来のマンノシル化標的抗原を生成すると予測される。レクチンＣｏｎＡでのウエスタンブロットによりマンノシル化抗原を検出し、質量分析によりグリカン同一性を確認する。
マンノシル化抗原の免疫原性の評価。マンノシル化ワクチン抗原および非グリコシル化ワクチン抗原を精製し、標的抗原の免疫特性を評価する。マウスモデルを用い、マンノシル化ＥｘＰＥＣ抗原に対する液性免疫応答および細胞介在性免疫応答両方のマーカーを調べる。
マンノシル化抗原の精製。ＣｏｎＡカラム上レクチン−アフィニティークロマトグラフィーを用いて、続いてニッケル精製により、マンノシル化抗原を精製する。ニッケル−アフィニティークロマトグラフィーにより、非グリコシル化抗原を同様に精製する。調製物を比較して、同様の純度を銀染色により確実にし、それぞれの試料についてエンドトキシンレベルを決定する。同様の純度のマンノシル化タンパク質および非グリコシル化タンパク質の適量を回収して、免疫原性研究を行う。
ヒトミエロイド（ｍＤＣ）によるマンノシル化抗原の試験結合。マンノシル化抗原または非グリコシル化抗原をｍＤＣとインキュベートして、マンノース受容体への結合を評価する（Ｗｉｅｓｅｒ，Ａ．，ら，Ａ Ｍｕｌｔｉｅｐｉｔｏｐｅ Ｓｕｂｕｎｉｔ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｃｏｎｖｅｙｓ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ Ｅｘｔｒａｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｉｎ Ｍｉｃｅ． Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２０１０．７８（８）：３４３２〜３４４２ページ）。洗浄後、細胞を固定し、フローサイトメトリーを用いてαＨｉｓ−ＦＩＴＣ抗体で表面に結合した抗原を検出する。遊離マンノースまたはマンナンとの競合は、マンノシル化抗原の特異的結合におけるマンノース受容体の役割を確認する（Ｗｉｅｓｅｒら）。このステップは、マウスモデルにおける免疫原性の評価に先立ち、マンノシル化抗原の予備的確認として役立つ。
マンノシル化抗原の免疫原性の測定。マンノシル化抗原の皮下投与後のマウスの免疫応答を、非グリコシル化対照と比較して評価する。このステップは、ワクチン候補についての抗原性の向上剤としてのＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2グリカンの使用の、重要な確認である。６匹のＣＤ１マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の群を、例えば、１日目、２１日目、および３５日目に抗原２０μｇで皮下免疫する。ＣＤ１マウスは、同一の予定表を用いたＥｘＰＥＣワクチン研究のための敗血症モデルとして従来使用され（Ｍｏｒｉｅｌ， Ｄ．Ｇら）、従って、これらの実験は、将来的に課題となる研究に対する道を開く。最終免疫の２週間後に回収した血清、およびＥＬＩＳＡを使用して、ＩｇＧおよびＩｇＭの力価を含む液性応答を定量化する（Ｐａｒｋ，Ｓ．−Ｕ．，ら，Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａ ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎｅ ｃｏｃｋｔａｉｌ ｉｎｄｕｃｅｓ ａ Ｔｈ１ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ｍｉｃｅ ａｇａｉｎｓｔ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ ｓｕｂｓｐ．ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ．Ｖａｃｃｉｎｅ， ２００８．２６（３４）：４３２９〜４３３７ページ）。ＧｌｙｃＴａｇおよび６×Ｈｉｓタグ両方を有する無関係の対照タンパク質との比較において、抗原特異的応答を評価する。液性免疫および細胞介在性免疫の両方は、ＥｘＰＥＣ感染と闘う際に役割を果たし得る（Ｔｈｕｍｂｉｋａｔ，Ｐ．，ら，Ａｎｔｉｇｅｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｃｌｅａｒａｎｃｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｂｌａｄｄｅｒ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００６．１７６（５）：３０８０〜３０８６ページ、Ｎａｌｌａｍｓｅｔｔｙ，Ｓ．およびＤ．Ｗａｕｇｈ，Ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ−ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ＭＢＰ ａｎｄ ＮｕｓＡ ｐｌａｙ ａ ｐａｓｓｉｖｅ ｒｏｌｅ ｉｎ ｔｈｅ ｆｏｌｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅｉｒ ｆｕｓｉｏｎ ｐａｒｔｎｅｒｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ，２００６．４５（１）：１７５〜８２ページ）ので、ＣＤ８＋ Ｔ細胞アッセイを使用して、細胞応答を定量化する（Ｓｉｖｉｃｋ，Ｋ．Ｅ．およびＨ．Ｌ．Ｔ．Ｍｏｂｌｅｙ，Ｗａｇｉｎｇ Ｗａｒ ａｇａｉｎｓｔ Ｕｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ： Ｗｉｎｎｉｎｇ Ｂａｃｋ ｔｈｅ Ｕｒｉｎａｒｙ Ｔｒａｃｔ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２０１０．７８（２）：５６８〜５８５ページ）。
正常な大腸菌ペリプラズム常在性ＭＢＰとの融合タンパク質として、モデル抗原を構築する。Ｎ末端ＭＢＰ融合物は、適切なフォールディングおよび細胞質からの排出を促進することができ、これがグリコシル化を改善することができる（Ｎａｌｌａｍｓｅｔｔｙら）。別のシグナルペプチド配列を試験することは、不適切な局在化に対処し得る。十分な標的タンパク質が、ペリプラズムに正しく局在化され、Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2グリカンでのグリコシル化の成功についての予測指標として働く全ての場合において、末端ＧｌｙｃＴａｇで修飾したタンパク質へのＣ．ｊｅｊｕｎｉヘプタサッカリドの付着を確実に達成する。しかしながら、ＧｌｙｃＴａｇの位置を調節すること、または細菌のＮ−グリコシル化反応においてタンパク質に従前にコンジュゲートされている大腸菌Ｏ９由来のポリ−マンノースＬＰＳのような異なるマンノース末端グリカンを利用することにより、グリコシル化も改善し得る（Ｗａｃｋｅｒ，Ｍ．，ら，Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｓｕｇｇｅｓｔｓ ａ ｃｏｍｍｏｎ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｆｏｒ ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｎｄ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２００６．１０３（１８）：７０８８〜７０９３ページ）。
ｍＤＣへの抗原結合および免疫原性に対するマンノシル化の効果を、マウスモデルを用いて評価する。抗原内部移行の動態は、ｍＤＣ結合および表面結合抗原を可視化する我々の能力に影響を与えるであろうし、必要であれば、エンドソーム輸送の阻害剤を利用するか、または透過処理した細胞において内部移行した抗原を評価する。細胞介在性免疫応答および抗原特異的液性免疫応答の定量を使用して、ワクチン抗原候補のマンノシル化が、これら免疫原性の指標に影響するかどうかを判定する。大腸菌Ｏ９由来のポリマンノースＬＰＳのような別のマンノースグリカンでグリコシル化した種々の抗原を評価する。あるいは、さらなるグリコシル化部位で抗原を修飾して、複数のグリカンの付着を促進することができる。
好ましい実施形態が、本明細書において詳細に描かれ、記載されるが、種々の修飾、付加、置換などが、本発明の精神から逸脱することなく成され得ること、およびそれゆえ、以下の請求の範囲において定義される本発明の範囲内であるとみなされることは、当業者に明らかであろう。
簡易配列表
配列番号１ コドン最適化ａｌｇ１３
配列番号２ ａｌｇ１３
配列番号３ コドン最適化ａｌｇ１４
配列番号４ ａｌｇ１４
配列番号５ コドン最適化ａｌｇ１
配列番号６ ａｌｇ１
配列番号７ コドン最適化ａｌｇ２
配列番号８ ａｌｇ２
配列番号９ ａｌｇ１１
配列番号１０ Ａｌｇ１１タンパク質
配列番号１１ ｍａｌＥ（ＭＢＰ）
配列番号１２ ＭａｌＥタンパク質（ＭＢＰ）
配列番号１３ ｍｓｔＸ
配列番号１４ ＭｓｔＸタンパク質
配列番号１５ ＧｎＴＩ（ＥＣ２．４．１．１０１）
配列番号１６ ＧｎＴＩタンパク質
配列番号１７ ＧｎＴ ＩＩ（ＥＣ２．４．１．１４３）
配列番号１８ ＧｎＴ ＩＩ（ＥＣ２．４．１．１４３）
配列番号１９ ＧｎＴＩＶ（ＥＣ２．４．１．１４５）
配列番号２０ ＧｎＴＩＶ（ＥＣ２．４．１．１４５）
配列番号２１ ＧａｌＴ（ＥＣ２．４．１．３８）
配列番号２２ ＧａｌＴ（ＥＣ２．４．１．３８）
配列番号２３ ｍａｎＢ（ＥＣ５．４．２．８）
配列番号２４ ｍａｎＢ（ＥＣ５．４．２．８）
配列番号２５ ｍａｎＣ（ＥＣ２．７．７．１３）
配列番号２６ ｍａｎＣ（ＥＣ２．７．７．１３）
配列番号２７ ｇｌｍＳ（ＥＣ２．６．１．１６）
配列番号２８ ｇｌｍＳ（ＥＣ２．６．１．１６）
配列番号２９（ＥＣ２．４．９９．１）ＳＴ６
配列番号３０（ＥＣ２．４．９９．１）ＳＴ６
配列番号３１ ＭＢＰ−ＧｎＴＩ融合物
配列番号３２ ＭＢＰ−ＧｎＴＩＩ融合物
配列番号３３ ＭＢＰ−ＧｎＴＩＶ融合物
配列番号３４ ＧＳＴ−ａｌｇ１１融合物

Claims (70)

  1. オリゴ糖組成物を産生する方法であって、
    ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ残基の末端マンノース残基への転移を触媒する１つまたは複数のＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ酵素活性（ＥＣ２．４．１．１０１；ＥＣ２．４．１．１４３；ＥＣ２．４．１．１４５；ＥＣ２．４．１．１５５；ＥＣ２．４．１．２０１）を発現するように前記末端マンノース残基を有するオリゴ糖組成物を産生する組換え原核宿主細胞を培養するステップであって、末端ＧｌｃＮＡｃ残基を有するオリゴ糖組成物を産生するのに有効な条件下で実施される、ステップ
    を含む、方法。
  2. 培養するステップが、ＵＤＰ−ガラクトース残基の前記末端ＧｌｃＮＡｃ残基への転移を触媒する１つまたは複数のガラクトシルトランスフェラーゼ酵素活性（ＥＣ２．４．１．３８）を発現する宿主細胞をさらに含み、前記培養するステップが、末端ガラクトース残基を有するオリゴ糖組成物を産生するのに有効な条件下で実施される、請求項１に記載の方法。
  3. 培養するステップが、ＣＭＰ−ＮＡＮＡ残基の前記末端ガラクトース残基への転移を触媒する１つまたは複数のシアリルトランスフェラーゼ酵素活性（ＥＣ２．４．９９．４およびＥＣ２．４．９９．１）を発現する宿主細胞をさらに含み、前記培養するステップが、末端シアル酸残基を有するオリゴ糖組成物を産生するのに有効な条件下で実施される、請求項１に記載の方法。
  4. 培養するステップが、１つまたは複数の真核生物ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ酵素活性（ＥＣ２．４．１．１４１またはＥＣ２．４．１．１４５）および１つまたは複数の真核生物マンノシルトランスフェラーゼ酵素活性（ＥＣ２．４．１．１４２、ＥＣ２．４．１．１３２）を発現する宿主細胞を含み、前記酵素が真核生物グリコシルトランスフェラーゼ活性を宿主細胞に付与する、請求項１、２または３に記載の方法。
  5. 培養するステップが、１つまたは複数の前記酵素の融合物を発現する宿主細胞をさらに含み、前記融合物が、以下：ＤｓｂＡ、ＧｌｐＥ、ＧＳＴ、ＭＢＰ、ＭｓｔＸ、ＮｕｓＡおよびＴｒｘＡから選択される溶解度向上剤の少なくとも１つを含む、請求項１、２または３に記載の方法。
  6. 培養するステップが酸化条件下である、請求項１、２または３に記載の方法。
  7. 培養するステップが、以下：ホスホマンノムターゼ酵素活性（ＭａｎＢ）（ＥＣ５．４．２．８）、マンノース−１−ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ酵素活性（ＭａｎＣ）（ＥＣ２．７．７．１３）およびグルタミン−フルクトース−６−ホスフェートトランスアミナーゼ酵素活性（ＧｌｍＳ）（ＥＣ２．６．１．１６）の１つまたは複数を発現する宿主細胞を含み、ＭａｎＢおよびＭａｎＣがＧＤＰ−マンノース合成を触媒し、ＧｌｍＳがＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ合成を触媒する、請求項１、２または３に記載の方法。
  8. 培養するステップが、ＧＤＰ−Ｄ−マンノースデヒドラターゼ酵素活性（ＥＣ４．２．１．４７）が減弱している宿主細胞を含む、請求項１、２または３に記載の方法。
  9. 培養するステップが、フリッパーゼ酵素活性を発現する宿主細胞を含む、請求項１、２または３に記載の方法。
  10. 培養するステップが、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ酵素活性（ＥＣ２．４．１．１１９）を発現する宿主細胞を含む、請求項１、２または３に記載の方法。
  11. 目的のタンパク質をコードする遺伝子を宿主細胞内に導入するステップをさらに含み、それによって宿主細胞がグリコシル化タンパク質を産生する、請求項１、２または３に記載の方法。
  12. オリゴ糖組成物が前記タンパク質にＮ結合される、請求項９に記載の方法。
  13. 培養するステップが、以下：天然抗原に結合するＦｖ部分および保存されたアスパラギン残基においてグリコシル化されたＦｃ部分、ダイアボディ、ｓｃＦＶ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、ｓｃＦｖ−ＣＨ、ＦａｂおよびｓｃＦａｂの少なくとも１つを含む抗体として前記グリコシル化タンパク質を発現する組換え原核宿主細胞を含む、請求項１１に記載の方法。
  14. グリコシル化タンパク質が、インターフェロンなどのサイトカイン、Ｇ−ＣＳＦ、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子およびヒトプロテインＣなどの凝固因子、可溶性ＩｇＥ受容体α鎖、ＩｇＧ、ＩｇＧ断片、ＩｇＭ、インターロイキン、ウロキナーゼ、キマーゼおよび尿素トリプシン阻害剤、ＩＧＦ結合タンパク質、上皮細胞成長因子、成長ホルモン放出因子、アネキシンＶ融合タンパク質、アンギオスタチン、血管内皮細胞成長因子−２、骨髄系前駆細胞阻害因子−１、オステオプロテゲリン、α−１アンチトリプシン、ＤＮａｓｅ ＩＩ、α−フェトプロテイン、ＡＡＴ、ｒｈＴＢＰ−１（ａｋａ ＴＮＦ結合タンパク質１）、ＴＡＣＩ−Ｉｇ（膜貫通活性化因子およびカルシウム調節因子およびシクロフィリンリガンド相互作用物質）、ＦＳＨ（卵胞刺激ホルモン）、ＧＭ−ＣＳＦ、グルカゴン、グルカゴンペプチド、ＧＬＰ−１ ｗ／およびｗ／ｏ ＦＣ（グルカゴン様タンパク質１）ＩＬ−Ｉ受容体アゴニスト、ｓＴＮＦｒ（ａｋａ可溶性ＴＮＦ受容体Ｆｃ融合物）、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ（細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４−Ｉｇ）、受容体、ヒト成長ホルモンなどのホルモン、エリスロポエチン、ペプチド、ステープルペプチド、ヒトワクチン、動物ワクチン、血清アルブミンならびにＡＴＩＩＩ、ｒｈトロンビン、グルコセレブロシダーゼおよびアスパラギナーゼなどの酵素を含む、請求項１１に記載の方法。
  15. 培養するステップが、ＭＢＰに作動可能に融合される、少なくとも１つのＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼまたはシアリルトランスフェラーゼを発現する宿主細胞を含む、請求項１、２または３に記載の方法。
  16. 培養するステップが、前記ガラクトシルトランスフェラーゼ酵素活性を発現する酸化宿主細胞を含む、請求項２に記載の方法。
  17. オリゴ糖組成物が、ＧｌｃＮＡｃ1-5Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2およびＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2を含む、請求項１に記載の方法。
  18. オリゴ糖組成物が、優勢にはＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2またはＧｌｃＮＡｃ2Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2である、請求項１に記載の方法。
  19. オリゴ糖組成物が、Ｇａｌ1-5ＧｌｃＮＡｃ1-5Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2およびＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2を含む、請求項２に記載の方法。
  20. オリゴ糖組成物が、優勢にはＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ2Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2またはＧａｌ2ＧｌｃＮＡｃ2Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2である、請求項２に記載の方法。
  21. オリゴ糖組成物が、ＮＡＮＡ1-5Ｇａｌ1-5ＧｌｃＮＡｃ1-5Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2を含む、請求項３に記載の方法。
  22. オリゴ糖組成物が、優勢にはＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2またはＮＡＮＡ2Ｇａｌ2ＧｌｃＮＡｃ2Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2である、請求項３に記載の方法。
  23. 宿主細胞が、グリセロールまたはピルビン酸塩の存在下で培養される、請求項１、２または３に記載の方法。
  24. ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ残基の末端マンノース残基への転移を触媒する１つまたは複数のＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ酵素活性（ＥＣ２．４．１．１０１；ＥＣ２．４．１．１４３；ＥＣ２．４．１．１４５；ＥＣ２．４．１．１５５；ＥＣ２．４．１．２０１）を含む前記末端マンノース残基を有するオリゴ糖組成物を産生する組換え原核宿主細胞であって、末端ＧｌｃＮＡｃ残基を有するオリゴ糖組成物を産生する、宿主細胞。
  25. ＵＤＰ−ガラクトース残基の前記末端ＧｌｃＮＡｃ残基への転移を触媒する１つまたは複数のガラクトシルトランスフェラーゼ酵素活性（ＥＣ２．４．１．３８）をさらに含み、末端ガラクトース残基を有するオリゴ糖組成物を産生する、請求項２４に記載の宿主細胞。
  26. ＣＭＰ−ＮＡＮＡ残基の前記末端ガラクトース残基への転移を触媒する１つまたは複数のシアリルトランスフェラーゼ酵素活性ＳｉａｌｙｌＴ（ＥＣ２．４．９９．４およびＳｉａｌｙｌＴ（ＥＣ２．４．９９．１）をさらに含み、末端シアル酸残基を有するオリゴ糖組成物を産生する、請求項２５に記載の宿主細胞。
  27. １つまたは複数の真核生物ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ酵素活性（ＥＣ２．４．１．１４１またはＥＣ２．４．１．１４５）および１つまたは複数の真核生物マンノシルトランスフェラーゼ酵素活性（ＥＣ２．４．１．１４２、ＥＣ２．４．１．１３２）を含み、前記酵素が真核生物グリコシルトランスフェラーゼ活性を宿主細胞に付与する、請求項２４、２５または２６に記載の宿主細胞。
  28. 前記酵素の１つまたは複数の融合物をさらに含み、前記融合物が、以下：ＤｓｂＡ、ＧｌｐＥ、ＧＳＴ、ＭＢＰ、ＭｓｔＸ、ＮｕｓＡおよびＴｒｘＡの少なくとも１つを含む、請求項２４、２５または２６に記載の宿主細胞。
  29. 酸化宿主である、請求項２４、２５または２６に記載の宿主細胞。
  30. 以下の酵素：ホスホマンノムターゼ酵素活性（ＭａｎＢ）（ＥＣ５．４．２．８）、マンノース−１−ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ酵素活性（ＭａｎＣ）（ＥＣ２．７．７．１３）およびグルタミン−フルクトース−６−ホスフェートトランスアミナーゼ酵素活性（ＧｌｍＳ）（ＥＣ２．６．１．１６）の１つまたは複数を含み、ＭａｎＢおよびＭａｎＣがＧＤＰ−マンノース合成を触媒し、ＧｌｍＳがＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ合成を触媒する、請求項２４、２５または２６に記載の宿主細胞。
  31. ＧＤＰ−Ｄ−マンノースデヒドラターゼ酵素活性（ＥＣ４．２．１．４７）の減弱をさらに含む、請求項２４、２５または２６に記載の宿主細胞。
  32. フリッパーゼ酵素活性をさらに含む、請求項２４、２５または２６に記載の宿主細胞。
  33. オリゴサッカリルトランスフェラーゼ酵素活性（ＥＣ２．４．１．１１９）をさらに含む、請求項２４、２５または２６に記載の宿主細胞。
  34. 目的のタンパク質をコードする遺伝子をさらに含み、それによって宿主細胞がグリコシル化タンパク質を産生する、請求項２４、２５または２６に記載の宿主細胞。
  35. 前記タンパク質にＮ結合するオリゴ糖組成物を産生する、請求項３４に記載の宿主細胞。
  36. 以下：天然抗原に結合するＦｖ部分および保存されたアスパラギン残基においてグリコシル化されたＦｃ部分、ダイアボディ、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、ｓｃＦｖ−ＣＨ、ＦａｂおよびｓｃＦａｂの少なくとも１つを含む抗体として前記グリコシル化タンパク質を発現する、請求項３４に記載の宿主細胞。
  37. グリコシル化タンパク質が、インターフェロンなどのサイトカイン、Ｇ−ＣＳＦ、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子およびヒトプロテインＣなどの凝固因子、可溶性ＩｇＥ受容体α鎖、ＩｇＧ、ＩｇＧ断片、ＩｇＭ、インターロイキン、ウロキナーゼ、キマーゼおよび尿素トリプシン阻害剤、ＩＧＦ結合タンパク質、上皮細胞成長因子、成長ホルモン放出因子、アネキシンＶ融合タンパク質、アンギオスタチン、血管内皮細胞成長因子−２、骨髄系前駆細胞阻害因子−１、オステオプロテゲリン、α−１アンチトリプシン、ＤＮａｓｅ ＩＩ、α−フェトプロテイン、ＡＡＴ、ｒｈＴＢＰ−１（ａｋａ ＴＮＦ結合タンパク質１）、ＴＡＣＩ−Ｉｇ（膜貫通活性化因子およびカルシウム調節因子およびシクロフィリンリガンド相互作用物質）、ＦＳＨ（卵胞刺激ホルモン）、ＧＭ−ＣＳＦ、グルカゴン、グルカゴンペプチド、ＧＬＰ−１ ｗ／およびｗ／ｏ ＦＣ（グルカゴン様タンパク質１）ＩＬ−Ｉ受容体アゴニスト、ｓＴＮＦｒ（ａｋａ可溶性ＴＮＦ受容体Ｆｃ融合物）、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ（細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４−Ｉｇ）、受容体、ヒト成長ホルモンなどのホルモン、エリスロポエチン、ペプチド、ステープルペプチド、ヒトワクチン、動物ワクチン、血清アルブミンならびにＡＴＩＩＩ、ｒｈトロンビン、グルコセレブロシダーゼおよびアスパラギナーゼなどの酵素を含む、請求項３４に記載の宿主細胞。
  38. ＭＢＰに作動可能に融合される、少なくとも１つのマンノシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼまたはシアリルトランスフェラーゼを発現する、請求項２４に記載の宿主細胞。
  39. 酸化宿主細胞が、ガラクトシルトランスフェラーゼ酵素活性を発現させるために使用される、請求項２４に記載の宿主細胞。
  40. ＧｌｃＮＡｃ1-5Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2およびＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2を含むオリゴ糖組成物を産生する、請求項２４に記載の宿主細胞。
  41. オリゴ糖組成物が、優勢にはＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2またはＧｌｃＮＡｃ2Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2である、請求項４０に記載の宿主細胞。
  42. Ｇａｌ1-5ＧｌｃＮＡｃ1-5Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2およびＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2を含むオリゴ糖組成物を産生する、請求項２５に記載の宿主細胞。
  43. オリゴ糖組成物が、優勢にはＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ2Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2またはＧａｌ2ＧｌｃＮＡｃ2Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2である、請求項４２に記載の宿主細胞。
  44. オリゴ糖組成物が、ＮＡＮＡ1-5Ｇａｌ1-5ＧｌｃＮＡｃ1-5Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2を含む、請求項２６に記載の宿主細胞。
  45. 前記オリゴ糖組成物が、優勢にはＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2またはＮＡＮＡ2Ｇａｌ2ＧｌｃＮＡｃ2Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2である、請求項４４に記載の宿主細胞。
  46. 高マンノース型のオリゴ糖組成物を産生する方法であって、ＧＤＰ−マンノース残基の末端マンノース残基への転移を触媒する１つまたは複数のアルファ−１，２−マンノシルトランスフェラーゼ酵素活性（ＥＣ２．４．１．−）を発現するように末端マンノース残基を有するオリゴ糖組成物を産生する組換え原核宿主細胞を培養するステップを含み、前記培養するステップが、末端マンノース残基を有するオリゴ糖組成物を産生するのに有効な条件下で実施される、方法。
  47. 培養するステップが、１つまたは複数の真核生物ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ酵素活性（ＥＣ２．４．１．１４１またはＥＣ２．４．１．１４５）および１つまたは複数の真核生物マンノシルトランスフェラーゼ酵素活性（ＥＣ２．４．１．１４２、ＥＣ２．４．１．１３２）を発現する宿主細胞を含み、前記酵素が真核生物グリコシルトランスフェラーゼ活性を宿主細胞に付与する、請求項４６に記載の方法。
  48. 培養するステップが、１つまたは複数の前記酵素の融合物を発現する宿主細胞をさらに含み、前記融合物が、以下：ＤｓｂＡ、ＧｌｐＥ、ＧＳＴ、ＭＢＰ、ＭｓｔＸ、ＮｕｓＡおよびＴｒｘＡから選択される溶解度向上剤の少なくとも１つを含む、請求項４６に記載の方法。
  49. 培養するステップが、以下：ホスホマンノムターゼ酵素活性（ＭａｎＢ）（ＥＣ５．４．２．８）、マンノース−１−ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ酵素活性（ＭａｎＣ）（ＥＣ２．７．７．１３）およびグルタミン−フルクトース−６−ホスフェートトランスアミナーゼ酵素活性（ＧｌｍＳ）（ＥＣ２．６．１．１６）の１つまたは複数を発現する宿主細胞を含み、ＭａｎＢおよびＭａｎＣがＧＤＰ−マンノース合成を触媒し、ＧｌｍＳがＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ合成を触媒する、請求項４６に記載の方法。
  50. 培養するステップが、ＧＤＰ−Ｄ−マンノースデヒドラターゼ酵素活性（ＥＣ４．２．１．４７）が減弱している宿主細胞を含む、請求項４６に記載の方法。
  51. 培養するステップが、フリッパーゼ酵素活性を発現する宿主細胞を含む、請求項４６に記載の方法。
  52. 培養するステップが、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ酵素活性（ＥＣ２．４．１．１１９）を発現する宿主細胞を含む、請求項４６に記載の方法。
  53. 目的のタンパク質をコードする遺伝子を宿主細胞内に導入するステップをさらに含み、それによって宿主細胞がグリコシル化タンパク質を産生する、請求項４６に記載の方法。
  54. オリゴ糖組成物が前記タンパク質にＮ結合される、請求項４６に記載の方法。
  55. 宿主細胞が、ＭＢＰに作動可能に融合される、少なくとも１つのマンノシルトランスフェラーゼを発現する、請求項４６に記載の方法。
  56. 培養するステップが、ワクチンとして前記グリコシル化タンパク質を発現する組換え原核宿主細胞を含む、請求項４６に記載の方法。
  57. オリゴ糖組成物が、Ｍａｎ2ＧｌｃＮＡｃ2、Ｍａｎ4ＧｌｃＮＡｃ、Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2、ＨｅｘＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2、ＨｅｘＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ、Ｍａｎ6ＧｌｃＮＡｃおよびＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2からなる群から選択される、請求項４６に記載の方法。
  58. オリゴ糖組成物が、優勢にはＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2である、請求項４６に記載の方法。
  59. ａ）１つまたは複数の真核生物ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ酵素活性（ＥＣ２．４．１．１４１またはＥＣ２．４．１．１４５）、ｂ）１つまたは複数の真核生物マンノシルトランスフェラーゼ酵素活性（ＥＣ２．４．１．１４２、ＥＣ２．４．１．１３２）、およびｃ）ＧＤＰ−マンノース残基のトリマンノースオリゴ糖組成物への転移を触媒する１つまたは複数のアルファ−１，２−マンノシルトランスフェラーゼ酵素活性（ＥＣ２．４．１．−））を含む、高マンノース型のオリゴ糖組成物を産生する組換え原核宿主細胞。
  60. １つまたは複数の真核生物ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ酵素活性（ＥＣ２．４．１．１４１またはＥＣ２．４．１．１４５）および１つまたは複数の真核生物マンノシルトランスフェラーゼ酵素活性（ＥＣ２．４．１．１４２、ＥＣ２．４．１．１３２）を含み、前記酵素が宿主細胞に真核生物グリコシルトランスフェラーゼ活性を付与する、請求項５９に記載の宿主細胞。
  61. １つまたは複数の前記酵素の融合物をさらに含み、前記融合物が、以下：ＤｓｂＡ、ＧｌｐＥ、ＧＳＴ、ＭＢＰ、ＭｓｔＸ、ＮｕｓＡおよびＴｒｘＡの少なくとも１つを含む、請求項５９に記載の宿主細胞。
  62. 以下の酵素：ホスホマンノムターゼ酵素活性（ＭａｎＢ）（ＥＣ５．４．２．８）、マンノース−１−ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ酵素活性（ＭａｎＣ）（ＥＣ２．７．７．１３）およびグルタミン−フルクトース−６−ホスフェートトランスアミナーゼ酵素活性（ＧｌｍＳ）（ＥＣ２．６．１．１６）の１つまたは複数を含み、ＭａｎＢおよびＭａｎＣがＧＤＰ−マンノース合成を触媒し、ＧｌｍＳがＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ合成を触媒する、請求項５９に記載の宿主細胞。
  63. ＧＤＰ−Ｄ−マンノースデヒドラターゼ酵素活性（ＥＣ４．２．１．４７）の減弱をさらに含む、請求項５９に記載の宿主細胞。
  64. フリッパーゼ酵素活性をさらに含む、請求項５９に記載の宿主細胞。
  65. オリゴサッカリルトランスフェラーゼ酵素活性（ＥＣ２．４．１．１１９）をさらに含む、請求項５９に記載の宿主細胞。
  66. 目的のタンパク質をコードする遺伝子をさらに含み、それによってグリコシル化タンパク質を産生する、請求項５９に記載の宿主細胞。
  67. 前記タンパク質にＮ結合されたオリゴ糖組成物を産生する、請求項５９に記載の宿主細胞。
  68. ワクチンとして前記グリコシル化タンパク質を発現する、請求項５９に記載の宿主細胞。
  69. オリゴ糖組成物が、Ｍａｎ2ＧｌｃＮＡｃ2、Ｍａｎ4ＧｌｃＮＡｃ、Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2、ＨｅｘＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2、ＨｅｘＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ、Ｍａｎ6ＧｌｃＮＡｃおよびＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2からなる群から選択される、請求項５９に記載の方法。
  70. オリゴ糖組成物が、優勢にはＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2である、請求項５９に記載の方法。
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