RU2013128619A - Слитные ферменты - Google Patents

Слитные ферменты Download PDF

Info

Publication number
RU2013128619A
RU2013128619A RU2013128619/10A RU2013128619A RU2013128619A RU 2013128619 A RU2013128619 A RU 2013128619A RU 2013128619/10 A RU2013128619/10 A RU 2013128619/10A RU 2013128619 A RU2013128619 A RU 2013128619A RU 2013128619 A RU2013128619 A RU 2013128619A
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
recombinant protein
host cell
filamentous fungal
catalytic domain
transferase
Prior art date
Application number
RU2013128619/10A
Other languages
English (en)
Inventor
Яри НАТУНЕН
Анне КАНЕРВА
Юкка ХИЛЬТУНЕН
Маркку САЛОХЕЙМО
Хели ВИСКАРИ
Анне ХУУСКОНЕН
Original Assignee
Новартис Интернэшнл Фармасьютикал Лтд.
Глюкос Финланд Ой
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Новартис Интернэшнл Фармасьютикал Лтд., Глюкос Финланд Ой filed Critical Новартис Интернэшнл Фармасьютикал Лтд.
Publication of RU2013128619A publication Critical patent/RU2013128619A/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/18—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a glycosyl transferase, e.g. alpha-, beta- or gamma-cyclodextrins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/005—Glycopeptides, glycoproteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C12Y204/01101—Alpha-1,3-mannosyl-glycoprotein 2-beta-N-acetylglucosaminyltransferase (2.4.1.101)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C12Y204/01143—Alpha-1,6-mannosyl-glycoprotein 2-beta-N-acetylglucosaminyltransferase (2.4.1.143)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

1. Рекомбинантный белок, обладающий активностью N-ацетилглюкозаминилтрансферазы, при этом рекомбинантный белок катализирует перенос N-ацетилглюкозамина на концевой остаток Manα3 и катализирует перенос N-ацетилглюкозамина на концевой остаток Manα6 акцепторного гликана, и при этом рекомбинантный белок содержит каталитический домен, по меньшей мере, из двух разных ферментов.2. Рекомбинантный белок по п.1, в котором рекомбинантный белок представляет собой слитый белок, содержащий каталитический домен N-ацетилглюкозаминилтрансферазы I и каталитический домен N-ацетилглюкозаминилтрансферазы II.3. Рекомбинантный белок по п.2, в котором каталитический домен N-ацетилглюкозаминилтрансферазы I и каталитический домен N-ацетилглюкозаминилтрансферазы II происходят из ферментов человека.4. Рекомбинантный белок по п.3, в котором каталитический домен N-ацетилглюкозаминилтрансферазы I содержит последовательность, которая по меньшей мере, на 70%, по меньшей мере, на 75%, по меньшей мере, на 80%, по меньшей мере, на 85%, по меньшей мере, на 90%, по меньшей мере, на 95%, по меньшей мере, на 96%, по меньшей мере, на 97%, по меньшей мере, на 98%, по меньшей мере, на 99% или на 100% идентична аминокислотным остаткам 105-445 последовательности SEQ ID NO: 1.5. Рекомбинантный белок по п.3, в котором каталитический домен N-ацетилглюкозаминилтрансферазы II содержит последовательность, которая, по меньшей мере, на 70%, по меньшей мере, на 75%, по меньшей мере, на 80%, по меньшей мере, на 85%, по меньшей мере, на 90%, по меньшей мере, на 95%, по меньшей мере, на 96%, по меньшей мере, на 97%, по меньшей мере, на 98%, по меньшей мере, на 99% или на 100% идентична аминокислотным остаткам 30-447 последовательности SEQ ID NO:

Claims (69)

1. Рекомбинантный белок, обладающий активностью N-ацетилглюкозаминилтрансферазы, при этом рекомбинантный белок катализирует перенос N-ацетилглюкозамина на концевой остаток Manα3 и катализирует перенос N-ацетилглюкозамина на концевой остаток Manα6 акцепторного гликана, и при этом рекомбинантный белок содержит каталитический домен, по меньшей мере, из двух разных ферментов.
2. Рекомбинантный белок по п.1, в котором рекомбинантный белок представляет собой слитый белок, содержащий каталитический домен N-ацетилглюкозаминилтрансферазы I и каталитический домен N-ацетилглюкозаминилтрансферазы II.
3. Рекомбинантный белок по п.2, в котором каталитический домен N-ацетилглюкозаминилтрансферазы I и каталитический домен N-ацетилглюкозаминилтрансферазы II происходят из ферментов человека.
4. Рекомбинантный белок по п.3, в котором каталитический домен N-ацетилглюкозаминилтрансферазы I содержит последовательность, которая по меньшей мере, на 70%, по меньшей мере, на 75%, по меньшей мере, на 80%, по меньшей мере, на 85%, по меньшей мере, на 90%, по меньшей мере, на 95%, по меньшей мере, на 96%, по меньшей мере, на 97%, по меньшей мере, на 98%, по меньшей мере, на 99% или на 100% идентична аминокислотным остаткам 105-445 последовательности SEQ ID NO: 1.
5. Рекомбинантный белок по п.3, в котором каталитический домен N-ацетилглюкозаминилтрансферазы II содержит последовательность, которая, по меньшей мере, на 70%, по меньшей мере, на 75%, по меньшей мере, на 80%, по меньшей мере, на 85%, по меньшей мере, на 90%, по меньшей мере, на 95%, по меньшей мере, на 96%, по меньшей мере, на 97%, по меньшей мере, на 98%, по меньшей мере, на 99% или на 100% идентична аминокислотным остаткам 30-447 последовательности SEQ ID NO: 21.
6. Рекомбинантный белок по любому из пп.2-5, в котором каталитический домен N-ацетилглюкозаминилтрансферазы II является N-концевым по отношению к каталитическому домену N-ацетилглюкозаминилтрансферазы I.
7. Рекомбинантный белок по любому из пп.2-5, дополнительно содержащий спейсер между каталитическим доменом N-ацетилглюкозаминилтрансферазы I и каталитическим доменом N-ацетилглюкозаминилтрансферазы II.
8. Рекомбинантный белок по п.7, в котором спейсер содержит последовательность из стволового домена.
9. Рекомбинантный белок по п.7, в котором спейсер содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122 и SEQ ID NO: 124.
10. Рекомбинантный белок по п.9, в котором спейсер содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120 и SEQ ID NO: 124.
11. Рекомбинантный белок по п.9, в котором спейсер содержит последовательность SEQ ID NO: 124 или SEQ ID NO: 120.
12. Рекомбинантный белок по п.9, в котором спейсер содержит последовательность SEQ ID NO: 124.
13. Рекомбинантный белок по любому из пп.1-5 и 8-12, дополнительно содержащий направляющий к мишени пептид, связанный с N-концом каталитических доменов.
14. Рекомбинантный белок по п.13, в котором направляющий к мишени пептид содержит стволовой домен.
15. Рекомбинантный белок по п.8 или 14, в котором стволовой домен происходит из белка, выбранного из группы, состоящей из маннозидазы, маннозилтрансферазы, гликозилтрансферазы, белка Гольджи типа 2, MNN2, MNN4, MNN6, MNN9, MNN10, MNS1, KRE2, VAN1 и OCH1.
16. Рекомбинантный белок по п.15, в котором белок получен из организма, выбранного из группы, состоящей из Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Cryptococcus, Chrysosporium, Chrysosporium lucknowense, Filibasidium, Fusarium, Gibberella, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Myrothecium, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Piromyces, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium и Trichoderma.
17. Рекомбинантный белок по п.13, в котором направляющий к мишени пептид представляет собой направляющий к мишени пептид Kre2.
18. Рекомбинантный белок по п.14, в котором направляющий к мишени пептид дополнительно содержит трансмембранный домен, связанный с N-концом стволового домена.
19. Рекомбинантный белок по п.14, в котором направляющий к мишени пептид дополнительно содержит цитоплазматический домен, связанный с N-концом стволового домена.
20. Рекомбинантный белок по п.18, в котором направляющий к мишени пептид дополнительно содержит цитоплазматический домен, связанный с N-концом трансмембранного домена.
21. Рекомбинантный белок, содержащий каталитический домен N-ацетилглюкозаминилтрансферазы II человека и каталитический домен N-ацетилглюкозаминилтрансферазы I человека, при этом каталитический домен N-ацетилглюкозаминилтрансферазы II расположен с N-концевой стороны по отношению к каталитическому домену N-ацетилглюкозаминилтрансферазы I, последовательность спейсера, содержащую последовательность из стволового домена N-ацетилглюкозаминилтрансферазы I человека, расположенную между каталитическими доменами, и направляющий к мишени пептид, расположенный с N-концевой стороны по отношению к каталитическому домену N-ацетилглюкозаминилтрансферазы II, при этом направляющий к мишени пептид содержит цитоплазматический домен, трансмембранный домен и стволовой домен из N-ацетилглюкозаминилтрансферазы II человека.
22. Рекомбинантный белок, содержащий последовательность, которая, по меньшей мере, на 70%, по меньшей мере, на 75%, по меньшей мере, на 80%, по меньшей мере, на 85%, по меньшей мере, на 90%, по меньшей мере, на 95%, по меньшей мере, на 96%, по меньшей мере, на 97%, по меньшей мере, на 98%, по меньшей мере, на 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 95.
23. Рекомбинантный белок, содержащий каталитический домен N-ацетилглюкозаминилтрансферазы II человека и каталитический домен N-ацетилглюкозаминилтрансферазы I, при этом каталитический домен N-ацетилглюкозаминилтрансферазы II расположен с N-концевой стороны по отношению к каталитическому домену N-ацетилглюкозаминилтрансферазы I; спейсер, расположенный между каталитическими доменами, при этом спейсер содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122 и SEQ ID NO: 124; и направляющий к мишени пептид, расположенный с N-концевой стороны по отношению к каталитическому домену N-ацетилглюкозаминилтрансферазы II, при этом направляющий к мишени пептид содержит цитоплазматический домен, трансмембранный домен и стволовой домен из N-ацетилглюкозаминилтрансферазы II человека.
24. Рекомбинантный белок по п.23, в котором спейсер содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120 и SEQ ID NO: 124.
25. Рекомбинантный белок по п.23, в котором спейсер содержит последовательность SEQ ID NO: 124 или SEQ ID NO: 120.
26. Рекомбинантный белок по п.23, в котором спейсер содержит последовательность SEQ ID NO: 124.
27. Изолированный полинуклеотид, кодирующий рекомбинантный белок по любому из указанных выше пунктов.
28. Экспрессирующий вектор, содержащий изолированный полинуклеотид по п.27, функционально связанный с промотором.
29. Клетка-хозяин, содержащая экспрессирующий вектор по п.28.
30. Способ получения сложного N-гликана, включающий:
(1) получение клетки-хозяина, при этом клетка-хозяин содержит полинуклеотид, кодирующий слитый белок, содержащий каталитический домен N-ацетилглюкозаминилтрансферазы I и каталитический домен N-ацетилглюкозаминилтрансферазы II; и
(2) культивирование клетки-хозяина так, чтобы слитый белок экспрессировался, при этом слитый белок катализирует перенос N-ацетилглюкозамина на концевой остаток Manα3 и N-ацетилглюкозамина на концевой остаток Manα6 акцепторного гликана с образованием сложного N-гликана.
31. Способ по п.30, в котором акцепторный гликан связан с гетерологичным полипептидом.
32. Способ по п.30 или 31, в котором сложный N-гликан представляет собой GlcNAcβ2Manβ3(GlcNAcβ2Manβ6)Manβ4GlcNAcβ4GlcNAc.
33. Способ по п.30 или 31, в котором клеткой-хозяином является клетка нитчатого гриба, выбранная из группы, состоящей из видов Trichoderma, Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Cryptococcus, Chrysosporium, Chrysosporium lucknowense, Filibasidium, Fusarium, Gibberella, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Myrothecium, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Piromyces, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia и Tolypocladium.
34. Способ по п.30 или 31, в котором клетка-хозяин дополнительно содержит полинуклеотид, кодирующий УДФ-GlcNAc-переносчик.
35. Способ по п.30 или 31, в котором клетка-хозяин имеет пониженный уровень активности долихил-P-Man:Man(5)GlcNAc(2)-PP-долихилманнозилтрансферазы по сравнению с уровнем активности в клетке-хозяине дикого типа.
36. Способ по п.35, в котором клетка-хозяин имеет пониженный уровень экспрессии гена alg3 по сравнению с уровнем экспрессии в клетке-хозяине дикого типа.
37. Способ по п.36, в котором ген alg3 удален из клетки-хозяина.
38. Способ по п.30, в котором клетка-хозяин имеет пониженный уровень активности α-1,6-маннозилтрансферазы по сравнению с уровнем активности в клетке-хозяине дикого типа.
39. Способ по п.38, в котором клетка-хозяин имеет пониженный уровень экспрессии гена och1 по сравнению с уровнем экспрессии в клетке-хозяине дикого типа.
40. Способ по п.30, в котором клетка-хозяин дополнительно содержит полинуклеотид, кодирующий α-1,2-маннозидазу.
41. Способ по п.30, в котором клетка-хозяин дополнительно содержит полинуклеотид, кодирующий β-1,4-галактозилтрансферазу.
42. Способ по п.30, в котором клетка-хозяин дополнительно содержит полинуклеотид, кодирующий сиалилтрансферазу.
43. Способ получения сложного N-гликана, включающий:
(1) получение клетки-хозяина Trichoderma, при этом клетка-хозяин имеет пониженный уровень экспрессии гена alg3 по сравнению с уровнем экспрессии в клетке-хозяине дикого типа и содержит первый полинуклеотид, кодирующий каталитический домен N-ацетилглюкозаминилтрансферазы I, и второй полинуклеотид, кодирующий каталитический домен N-ацетилглюкозаминилтрансферазы II; и
(2) культивирование клетки-хозяина для получения сложного N-гликана.
44. Способ получения сложного N-гликана, включающий инкубацию слитого белка, содержащего каталитический домен N-ацетилглюкозаминилтрансферазы I и каталитический домен N-ацетилглюкозаминилтрансферазы II, акцепторного гликана и донора N-ацетилглюкозамина вместе в буфере, при этом слитый белок катализирует перенос N-ацетилглюкозамина на концевой остаток Manα3 и N-ацетилглюкозамина на концевой остаток Manα6 акцепторного гликана с образованием сложного N-гликана.
45. Клетка нитчатого гриба, содержащая мутацию alg3 и Man3GlcNAc2, при этом Man3GlcNAc2 составляет, по меньшей мере, 50%, по меньшей мере, 60%, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 90% или, по меньшей мере, 100% нейтральных N-гликанов в клетке.
46. Клетка нитчатого гриба по п.45, в котором мутация alg3 представляет собой делецию alg3.
47. Клетка нитчатого гриба по п.45 или 46, в котором клеткой является клетка Trichoderma reesei.
48. Клетка нитчатого гриба по любому из пп.45 или 46, дополнительно содержащая первый полинуклеотид, кодирующий каталитический домен N-ацетилглюкозаминилтрансферазы I, и второй полинуклеотид, кодирующий каталитический домен N-ацетилглюкозаминилтрансферазы II.
49. Клетка нитчатого гриба по любому из пп.45 или 46, дополнительно содержащая полинуклеотид, кодирующий слитый белок, содержащий каталитический домен N-ацетилглюкозаминилтрансферазы I и каталитический домен N-ацетилглюкозаминилтрансферазы II.
50. Способ получения гликана Man3GlcNAc2 в клетке-хозяине, включающий:
(1) получение клетки-хозяина с пониженным уровнем активности маннозилтрансферазы по сравнению с уровнем активности в клетке-хозяине дикого типа; и
(2) культивирование клетки-хозяина для получения гликана Man3GlcNAc2, при этом гликан Man3GlcNAc2 составляет, по меньшей мере, 50%, по меньшей мере, 60%, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 90% или, по меньшей мере, 100% нейтральных N-гликанов в клетке-хозяине.
51. Способ по п.50, в котором гликан Man3GlcNAc2 связан с гетерологичным полипептидом.
52. Способ по п.50 или 51, в котором маннозилтрансфераза представляет собой долихил-P-Man:Man(5)GlcNAc(2)-PP-долихилманнозилтрансферазу.
53. Способ по п.50 или 51, в котором клетка-хозяин имеет пониженный уровень экспрессии гена alg3 по сравнению с уровнем экспрессии в клетке-хозяине дикого типа.
54. Способ по п.50 или 51, в котором клеткой-хозяином является клетка Trichoderma.
55. Способ по п.50 или 51, в котором уровень активности альфа-1,6-маннозилтрансферазы в клетке-хозяине не снижена по сравнению с уровнем активности в клетке-хозяине дикого типа.
56. Способ по п.50 или 51, в котором клетка-хозяин содержит эндогенный полинуклеотид, кодирующий α-1,2-маннозидазу.
57. Клетка нитчатого гриба, имеющая пониженный уровень экспрессии гена alg3 по сравнению с уровнем экспрессии в клетке нитчатого гриба дикого типа, при этом клетка нитчатого гриба содержит рекомбинантный белок по любому из пп.2-26.
58. Клетка нитчатого гриба по п.57, в котором ген alg3 содержит мутацию.
59. Клетка нитчатого гриба по п.58, в котором мутация гена alg3 представляет собой делецию гена alg3.
60. Клетка нитчатого гриба по любому из пп.57-59, в котором слитый белок кодируется полинуклеотидом, функционально связанным с промотором.
61. Клетка нитчатого гриба по п.60, в котором промотор представляет собой индуцируемый промотор.
62. Клетка нитчатого гриба по п.61, в котором индуцируемым промотором является промотор cbh1.
63. Клетка нитчатого гриба по любому из пп.57-59, в котором клетка нитчатого гриба дополнительно содержит полинуклеотид, кодирующий УДФ-GlcNAc-переносчик.
64. Клетка нитчатого гриба по любому из пп.57-59, в котором клетка нитчатого гриба имеет пониженный уровень активности α-1,6-маннозилтрансферазы по сравнению с уровнем активности в клетке нитчатого гриба дикого типа.
65. Клетка нитчатого гриба по п.64, в котором клетка нитчатого гриба имеет пониженный уровень экспрессии гена och1 по сравнению с уровнем экспрессии в клетке нитчатого гриба дикого типа.
66. Клетка нитчатого гриба по любому из пп.57-59, в котором клетка нитчатого гриба дополнительно содержит полинуклеотид, кодирующий α-1,2-маннозидазу.
67. Клетка нитчатого гриба по любому из пп.57-59, в котором клетка нитчатого гриба дополнительно содержит полинуклеотид, кодирующий β-1,4-галактозилтрансферазу.
68. Клетка нитчатого гриба по любому из пп.57-59, в котором клетка нитчатого гриба дополнительно содержит полинуклеотид, кодирующий сиалилтрансферазу.
69. Клетка нитчатого гриба по любому из пп.57-59, в котором клетка нитчатого гриба выбрана из группы, состоящей из видов Trichoderma, Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Cryptococcus, Chrysosporium, Chrysosporium lucknowense, Filibasidium, Fusarium, Gibberella, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Myrothecium, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Piromyces, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia и Tolypocladium.
RU2013128619/10A 2010-11-24 2011-11-24 Слитные ферменты RU2013128619A (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US41714410P 2010-11-24 2010-11-24
US61/417,144 2010-11-24
PCT/EP2011/070956 WO2012069593A2 (en) 2010-11-24 2011-11-24 Fusion enzymes

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2013128619A true RU2013128619A (ru) 2014-12-27

Family

ID=45093734

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2013128619/10A RU2013128619A (ru) 2010-11-24 2011-11-24 Слитные ферменты

Country Status (14)

Country Link
US (2) US9399764B2 (ru)
EP (1) EP2643456B1 (ru)
JP (1) JP6017439B2 (ru)
KR (1) KR20140018851A (ru)
CN (1) CN103348003B (ru)
AU (1) AU2011333685A1 (ru)
BR (1) BR112013013045A2 (ru)
CA (1) CA2819071A1 (ru)
DK (1) DK2643456T3 (ru)
IL (1) IL226481A0 (ru)
MX (1) MX338560B (ru)
RU (1) RU2013128619A (ru)
SG (1) SG190321A1 (ru)
WO (1) WO2012069593A2 (ru)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SG190321A1 (en) 2010-11-24 2013-06-28 Novartis Int Pharm Ltd Fusion enzymes having n-acetylglucosaminyltransferase activity
EP2852610B1 (en) 2012-05-23 2018-07-11 Glykos Finland Oy Production of fucosylated glycoproteins
US20160177355A1 (en) * 2013-03-14 2016-06-23 Adam C. Fisher Oligosaccharide compositions, glycoproteins and methods to produce the same in prokaryotes
PL3016970T3 (pl) 2013-07-04 2019-09-30 Glykos Finland Oy Komórki grzybów nitkowatych z niedoborem O-mannozylotransferazy i sposoby ich zastosowania
PL3019621T3 (pl) 2013-07-10 2019-05-31 Glykos Finland Oy Wytwarzanie glikoprotein o zwiększonym zajmowaniu miejsca N-glikozylacji
CA2916905A1 (en) 2013-07-10 2015-01-15 Novartis Ag Multiple proteases deficient filamentous fungal cells and methods of use thereof
EP3027743A1 (en) 2013-07-29 2016-06-08 Danisco US Inc. Variant enzymes
SG11201700446XA (en) 2014-07-21 2017-02-27 Glykos Finland Oy Production of glycoproteins with mammalian-like n-glycans in filamentous fungi
CN105695439B (zh) * 2014-11-27 2023-08-01 丰益(上海)生物技术研发中心有限公司 一种β-葡萄糖苷酶基因的重组表达方法
JP2021534763A (ja) * 2018-08-21 2021-12-16 クララ フーズ カンパニー 微生物におけるタンパク質のグリコシル化の修飾
US10927358B2 (en) * 2019-01-16 2021-02-23 Fornia Biosolutions, Inc. Endoglucanase compositions and methods
CN110448719B (zh) * 2019-06-28 2020-05-22 浙江大学 一种促进凝血的丝素-多肽电纺膜及其制备方法
CN116121094A (zh) * 2023-03-03 2023-05-16 天津科技大学 一株高产神经酰胺的酿酒酵母工程菌株、构建方法及其应用

Family Cites Families (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4500707A (en) 1980-02-29 1985-02-19 University Patents, Inc. Nucleosides useful in the preparation of polynucleotides
US4475196A (en) 1981-03-06 1984-10-02 Zor Clair G Instrument for locating faults in aircraft passenger reading light and attendant call control system
US4447233A (en) 1981-04-10 1984-05-08 Parker-Hannifin Corporation Medication infusion pump
US4439196A (en) 1982-03-18 1984-03-27 Merck & Co., Inc. Osmotic drug delivery system
US4447224A (en) 1982-09-20 1984-05-08 Infusaid Corporation Variable flow implantable infusion apparatus
US4487603A (en) 1982-11-26 1984-12-11 Cordis Corporation Implantable microinfusion pump system
US4486194A (en) 1983-06-08 1984-12-04 James Ferrara Therapeutic device for administering medicaments through the skin
US4743546A (en) 1985-02-13 1988-05-10 Biotechnica International, Inc. Controlled gene excision
US4596556A (en) 1985-03-25 1986-06-24 Bioject, Inc. Hypodermic injection apparatus
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4941880A (en) 1987-06-19 1990-07-17 Bioject, Inc. Pre-filled ampule and non-invasive hypodermic injection device assembly
US4790824A (en) 1987-06-19 1988-12-13 Bioject, Inc. Non-invasive hypodermic injection device
US5700637A (en) 1988-05-03 1997-12-23 Isis Innovation Limited Apparatus and method for analyzing polynucleotide sequences and method of generating oligonucleotide arrays
GB8822228D0 (en) 1988-09-21 1988-10-26 Southern E M Support-bound oligonucleotides
US5312335A (en) 1989-11-09 1994-05-17 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
US5064413A (en) 1989-11-09 1991-11-12 Bioject, Inc. Needleless hypodermic injection device
US5383851A (en) 1992-07-24 1995-01-24 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
DE19754622A1 (de) 1997-12-09 1999-06-10 Antje Von Dr Schaewen Pflanzliche GntI-Sequenzen und Verwendung derselben zur Gewinnung von Pflanzen mit verminderter oder fehlender N-Acetylglucosaminyltransferase I (GnTI)-Aktivität
US7244601B2 (en) * 1997-12-15 2007-07-17 National Research Council Of Canada Fusion proteins for use in enzymatic synthesis of oligosaccharides
ATE332968T1 (de) 1998-10-26 2006-08-15 Novozymes As Erstellung und durchmusterung von interessierenden dna-banken in zellen von filamentösen pilzen
AU784960B2 (en) * 1999-08-19 2006-08-10 Kirin Pharma Kabushiki Kaisha Novel yeast variants and process for producing glycoprotein containing mammalian type sugar chain
US7598055B2 (en) * 2000-06-28 2009-10-06 Glycofi, Inc. N-acetylglucosaminyltransferase III expression in lower eukaryotes
US7795002B2 (en) * 2000-06-28 2010-09-14 Glycofi, Inc. Production of galactosylated glycoproteins in lower eukaryotes
EP2359685B1 (en) 2001-12-27 2013-12-04 GlycoFi, Inc. Methods to engineer mammalian-type carbohydrate structures
EP1504023A4 (en) * 2002-05-03 2006-03-22 Neose Technologies Inc RECOMBINANT GLYCOSYL TRANSFERASE FUSION PROTEINS
WO2006026992A1 (en) 2004-09-07 2006-03-16 Novozymes A/S Altered structure of n-glycans in a fungus
US7501275B2 (en) 2004-10-27 2009-03-10 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Yeast transformation system
US20080026376A1 (en) 2006-07-11 2008-01-31 Huaming Wang KEX2 cleavage regions of recombinant fusion proteins
BRPI0622182B1 (pt) 2006-10-03 2018-07-31 Metabolic Explorer Processo para a substituição de uma sequência de DNA alvo através de recombinação homóloga em Clostridia, cepa recombinante de Clostridium e vetor para a substituição de uma sequência de DNA alvo por recombinação homóloga em Clostridia
TW201028431A (en) 2008-10-31 2010-08-01 Lonza Ag Novel tools for the production of glycosylated proteins in host cells
SG190321A1 (en) 2010-11-24 2013-06-28 Novartis Int Pharm Ltd Fusion enzymes having n-acetylglucosaminyltransferase activity

Also Published As

Publication number Publication date
JP6017439B2 (ja) 2016-11-02
SG190321A1 (en) 2013-06-28
AU2011333685A1 (en) 2013-06-27
MX338560B (es) 2016-04-20
EP2643456B1 (en) 2016-05-11
BR112013013045A2 (pt) 2021-10-26
CA2819071A1 (en) 2012-05-31
WO2012069593A2 (en) 2012-05-31
EP2643456A2 (en) 2013-10-02
IL226481A0 (en) 2013-07-31
CN103348003B (zh) 2016-09-07
DK2643456T3 (en) 2016-08-22
WO2012069593A3 (en) 2013-01-03
KR20140018851A (ko) 2014-02-13
US20130330780A1 (en) 2013-12-12
CN103348003A (zh) 2013-10-09
MX2013005853A (es) 2013-12-12
US9399764B2 (en) 2016-07-26
JP2014500019A (ja) 2014-01-09
US20170002337A1 (en) 2017-01-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2013128619A (ru) Слитные ферменты
JP2014500019A5 (ru)
US10988791B2 (en) Multiple proteases deficient filamentous fungal cells and methods of use thereof
US7332299B2 (en) Endomannosidases in the modification of glycoproteins in eukaryotes
Archer et al. The molecular biology of secreted enzyme production by fungi
US7029872B2 (en) Methods for producing modified glycoproteins
US10513724B2 (en) Production of glycoproteins with mammalian-like N-glycans in filamentous fungi
JP5255017B2 (ja) 複数のアンテナ構造を有する改変型糖タンパク質の生成
Iwashita Recent studies of protein secretion by filamentous fungi
US20210337826A1 (en) Modification of protein glycosylation in microorganisms
CN104136622A (zh) 用于降低重组蛋白的降解的方法和材料
KR102111078B1 (ko) O-만노실트랜스퍼라제 결핍 사상균 세포 및 이의 이용 방법
JP2014532406A (ja) 組換えタンパク質発現のための操作された下等真核宿主株
US20190276867A1 (en) Production of Glycoproteins Having Increased N-Glycosylation Site Occupancy
Akao et al. Cloning and expression of 1, 2-α-mannosidase gene (fmanIB) from filamentous fungus Aspergillus oryzae: in vivo visualization of the FmanIBp-GFP fusion protein
Geysens et al. Genomics of protein folding in the endoplasmic reticulum, secretion stress and glycosylation in the aspergilli
US8003349B2 (en) YLMPO1 gene derived from yarrowia lipolytica and a process for preparing a glycoprotein not being mannosylphosphorylated by using a mutated yarrowia lipolytica in which YLMPO1 gene is disrupted
US20140377804A1 (en) Filamentous Fungi Having Reduced UDP-Galactofuranose Content
JP2024509895A (ja) Ｎ－結合グリコシル化が低いか全くない外因性タンパク質の産生のための遺伝子組換え糸状菌

Legal Events

Date Code Title Description
FA92 Acknowledgement of application withdrawn (lack of supplementary materials submitted)

Effective date: 20160824