BRPI0622182B1

BRPI0622182B1 - Processo para a substituição de uma sequência de DNA alvo através de recombinação homóloga em Clostridia, cepa recombinante de Clostridium e vetor para a substituição de uma sequência de DNA alvo por recombinação homóloga em Clostridia

Info

Publication number: BRPI0622182B1
Application number: BRPI0622182-3A
Authority: BR
Inventors: Soucaille Philippe; Figge Rainer; Croux Christian
Original assignee: Metabolic Explorer
Priority date: 2006-10-03
Filing date: 2006-10-03
Publication date: 2018-07-31
Also published as: WO2008040387A1; AU2006349179A1; IL197844A0; US20120190116A1; EP2316952A1; JP5203375B2; US20080085558A1; CN101528930A; EP1908840A1; KR20090086939A; CN101528930B; KR101311619B1; MX2009003605A; CL2007002857A1; EP1908840B1; US8168434B2; ES2369859T3; NO20091371L; EP1908840A8; SI1908840T1

Abstract

processo para integração cromossômica e substituição de seqüência de dna em clostridia. a presente invenção esta relacionada a um novo método para substituição ou deleção de seqüências de dna em clostridia, com alta eficiência, fácil de realizar e aplicável em um nível industrial. esse método é útil para modificar vários boi genéticos em clostridia de uma maneira rotineira. esse método está baseado em um vetor replicativo trazendo pelo menos dois genes marcadores.

Description

(54) Título: PROCESSO PARA A SUBSTITUIÇÃO DE UMA SEQUÊNCIA DE DNA ALVO ATRAVÉS DE RECOMBINAÇÃO HOMÓLOGA EM CLOSTRIDIA, CEPA RECOMBINANTE DE CLOSTRIDIUM E VETOR PARA A SUBSTITUIÇÃO DE UMA SEQUÊNCIA DE DNA ALVO POR RECOMBINAÇÃO HOMÓLOGA EM CLOSTRIDIA (51) Int.CI.: C12N 15/74; C12N 15/90; C12R 1/145 (73) Titular(es): METABOLIC EXPLORER (72) Inventor(es): PHILIPPE SOUCAILLE; RAINER FIGGE; CHRISTIAN CROUX (85) Data do Início da Fase Nacional: 02/04/2009

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PROCESSO PARA A SUBSTITUIÇÃO DE UMA SEQUÊNCIA DE DNA ALVO ATRAVÉS DE RECOMBINAÇÃO HOMÓLOGA EM CLOSTRIDIA, CEPA RECOMBINANTE DE CLOSTRIDIUM E VETOR PARA A SUBSTITUIÇÃO DE UMA SEQUÊNCIA DE DNA ALVO POR RECOMBINAÇÃO HOMÓLOGA EM CLOSTRIDIA.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Clostridia são bactérias gram positivas, anaeróbicas e de baixo Gc que são amplamente utilizadas na indústria por suas capacidades para produzir solventes, em particular, butanol, etanol e acetona, mas também dióis como 1,3 propanodiol, ácidos orgânicos tais como ácido acético, butírico ou lático e vacinas.

A construção de Clostridia recombinante é uma parte importante do desenvolvimento no campo. As cepas de Clostridium são geneticamente modificadas para melhorar suas capacidades industriais.

Para realizar essas modificações, a recombinação homóloga é a técnica mais utilizada em todos os tipos de organismos. A transformação e a recombinação homóloga em vários microrganismos têm sido extensamente descritas no estado da técnica. Veja, por exemplo, (Datsenko e Wanner, PNAS, 2000) e (Fabret et al, Molecular Microbiology, 2002).

Clostridia não são naturalmente transformáveis e os métodos atualmente disponíveis para sua transformação são ineficientes e não permitem a introdução de múltiplas

Petição 870170062579, de 25/08/2017, pág. 32/38 mutações. Isso tem impedido desenvolvimentos industriais nesse campo.

Clostridia comumente produzem DNAses extracelulares e enzimas de restrição que degradam DNA estranho antes e após introdução nas células para transformação. Métodos clássicos baseados na introdução de fragmentos de PCR que funcionam bem em muitos microorganismos tais como E. coli ou levedura, não são viáveis nesses organismos, uma vez que a meia-vida extracelular e intracelular da estrutura de DNA a ser recombinada é muito curta e a eficiência de recombinação geralmente é baixa. Em outros organismos, essas dificuldades têm sido superadas usando vetores que se replicam no hospedeiro, aumentando assim a probabilidade do evento de recombinação. Todavia, após o evento de recombinação, o vetor que agora traz a seqüência de DNA alvo intacta tem de ser eliminado. Esse problema foi resolvido em Lactococcus lactis (Biswas e colaboradores, J

Bacteriol., 1993) usando unidades de replicação (replicons) sensíveis à temperatura que podem ser eliminados na temperatura não-permissiva. Nenhum vetor com essas características está atualmente disponível para Clostridia.

Portanto, a construção de mutantes em Clostridia tem sido, até hoje, muito trabalhosa e freqüentemente sem sucesso.

A inativação de genes em Clostridia foram reportadas nos seguintes artigos (veja Tabela 1).

Tabela 1

Cepa	Genótipo	Referência
Clostridium acetobutylicum	buk-, MLS^r	Green e
PJC4BK		colaboradores,
		1996
Clostridium acetobutylicum	pta-, MLS^r	Green e
PJC4PTA		colaboradores,
		1996
Clostridium acetobutylicum	aad-, MLS^r	Green e Bennett,
PJC4AAD		1996
Clostridium perfringens	Δ cpe, CatP	Sarker e
SM101 e F4969		colaboradores.,
		1999
Clostridium perfringens	Δ luxS	Ohtani e
Cepa 13		colaboradores,
		2002
Clostridium acetobutylicum	Δ spoA, MLS^r	Harris e
SKO1		colaboradores,
		2002
Clostridium perfringens	Δ spoOA	Huang e
Tipo A		colaboradores,

		2004
Clostridium perfringens	ccpA-, CatP	Varga e
SM101		colaboradores. ,
		2004
Clostridium acetobutylicum	Δ SpoIIE,	WO 2006/007530
ATCC 824 buk-	buk-, CatP

Inativação de gene foi até o momento realizada em

Clostridia através da transformação com DNA circular que não pode se replicar nas cepas alvo. Uma vez que DNAses e endonucleases de restrição de DNA presentes em Clostridia degradam rapidamente o DNA introduzido, e geralmente a freqüência de recombinação nesse gênero não é muito alta, a obtenção de mutantes tem sido muito trabalhosa.

Além disso, as cepas recombinantes descritas até o momento (veja acima) são todas resistentes ao MLS ou cloranfenicol e os genes marcadores correspondentes não podem ser removidos após o evento de recombinação ter ocorrido. Isso limita o número de possíveis recombinações ao número de marcadores de resistência disponíveis nessas bactérias para um máximo de 3. Além disso, para o uso industrial dessas bactérias, poderia ser útil ter cepas sem marcadores de forma a evitar a liberação de genes de resistência a antibiótico no meio de fermentação.

Além disso, algumas dessas cepas que têm sido obtidas através de eventos de recombinação únicos têm a desvantagem de que elas não são estáveis se cultivadas sem qualquer pressão de seleção.

Conseqüentemente, há ainda uma necessidade no estado da técnica por um método para a transformação de

Clostridia com alta eficiência, com uma etapa fácil de seleção de cepas recombinantes que permita substituições de seqüência de DNA sucessivas na mesma cepa, levando à

Clostridia recombinantes que são geneticamente estáveis e sem marcadores.

A presente invenção está relacionada a um novo método para substituição ou deleção de seqüências de DNA em

Clostridia, fácil de realizar e aplicável a nivel industrial. Esse método é útil para modificar vários loci genéticos em Clostridia de uma maneira rotineira.

Esse método é baseado em um vetor replicativo útil para a transformação de Clostridia com alta eficiência.

Um número ilimitado de mutações podem ser introduzidas no genoma com esse novo método, através da eliminação de cassetes de resistência do genoma e reutilização dos mesmos em sucessivos ciclos de substituição de seqüência de DNA.

A introdução eficiente de múltiplas mutações em

Clostridia deverá permitir que a indústria aprimore as cepas industriais existentes e desenvolva novos processos.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

A invenção proporciona um processo para a substituição de uma seqüência de DNA alvo através de recombinação homóloqa em Clostridia, compreendendo:

Transformação da referida cepa com um vetor compreendendo:

uma origem de replicação que permite sua replicação em Clostridia, e um cassete de substituição compreendendo um primeiro gene marcador envolvido por duas seqüências homólogas às regiões selecionadas em torno da seqüência de

DNA alvo, permitindo a recombinação do cassete, e

- um segundo gene marcador,

- seleção de cepas, tendo integrado em seu genoma o referido cassete, que expressam o primeiro gene marcador,

- seleção de cepas, tendo eliminado o referido vetor, que não expressam o segundo gene marcador.

Todas as técnicas de biologia molecular usadas para realização da invenção estão totalmente descritas em

Molecular cloning : a laboratory manual, 2^a edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, por Sambrook,

Fritsch e Maniatis.

Usado no contexto da presente invenção, o termo substituição de uma seqüência de DNA alvo significa que uma seqüência diferente da original é introduzida no locus da seqüência de DNA alvo.

De acordo com a invenção, uma seqüência de DNA é definida como um gene ou uma seqüência intergênica. Ambos podem compreender seqüências promotoras ou regulatórias.

A expressão seqüência de DNA alvo significa qualquer gene, região intergênica, seqüência promotora ou regulatória de interesse escolhida por aqueles habilitados na técnica. Ela significa, em particular, genes que codificam proteínas de interesse, por exemplo, enzimas envolvidas no metabolismo celular.

A seqüência de DNA substituída/inserida pode ser de codificação ou não. Ela pode ser uma seqüência mutante do gene alvo, seqüência promotora ou regulatória e/ou um marcador, tal como um gene de resistência a antibiótico ou uma enzima que gera cor. Ela pode ser mais longa ou mais curta do que a seqüência substituída, dependendo da distância que separa as duas regiões homólogas.

Em virtude da inserção, a expressão do gene alvo é usualmente perturbada, parcialmente ou completamente suprimida ou aumentada. A substituição da seqüência de DNA alvo por uma seqüência próxima da original, mas compreendendo mutações, leva à expressão real de uma proteína, seqüência promotora ou regulatória mutante.

Se a substituição da seqüência de DNA alvo proporciona, como um resultado, uma eliminação total da referida seqüência de DNA, o gene é qualificado como deletado.

A expressão recombinação homóloga se refere ao evento de substituição de um segmento de DNA por outro que possui regiões idênticas (homólogas) ou próximas disso.

Esse evento é também denominado crossover de DNA.

O termo transformação se refere à incorporação de ácido nucléico exógeno por uma célula, essa aquisição de novos genes sendo transitória (se o vetor que traz os genes é curado) ou permanente (no caso em que o DNA exógeno é integrado cromossomicamente).

O termo vetor se refere a um elemento extra-cromossomal trazendo genes ou cassetes, que está usualmente na forma de moléculas de DNA fita dupla circular, mas pode ser uma molécula de DNA fita simples também. Ambos os termos vetor e plasmídeo são usados indiferentemente.

O vetor de acordo com a invenção é um vetor replicativo. Ele compreende pelo menos uma origem de replicação e, preferencialmente, várias origens de replicação, permitindo que o mesmo seja funcional em diferentes espécies.

Em particular, um vetor preferido pode compreender duas origens de replicação:

- Ori, funcional em E. coli

- RepL de pIM13 derivado de B. subtilis, funcional em

Clostridia (Mermelstein e colaboradores, Biotechnology,

1992) .

A expressão seqüências homólogas a uma seqüência de

DNA alvo se refere às seqüências com alta similaridade de seqüência às regiões selecionadas da seqüência alvo.

O termo gene marcador se refere a uma seqüência que codifica uma proteína marcadora sob o controle de elementos regulatórios funcionais em Clostridia. Tais proteínas são bem conhecidas na técnica. Por exemplo, aqueles habilitados na técnica podem usar um gene de resistência a antibiótico, um marcador fluorescente ou colorido ou um marcador de auxotrofia. Exemplos de genes marcadores úteis serão fornecidos abaixo.

Após o evento de recombinação ter ocorrido, o vetor agora traz a seqüência de DNA alvo intacta e, conseqüentemente, tem de ser eliminado. A eliminação de um vetor replicativo geralmente acontece com sucessivas culturas de clones, seguido por seleção negativa ou

positiva	de	clones	tendo	eliminado esse vetor.	A
eliminação	do	vetor	também	pode ser uma etapa ativa	do
processo,	com	o	uso de	endonucleases que clivam

especificamente seqüências de DNA presentes no vetor. Uma vez que o vetor é curado, as cepas não expressam mais o segundo gene marcador e podem ser selecionadas com base nessa característica.

Em uma modalidade particular da invenção, o segundo gene marcador é um gene de resistência a antibiótico.

Dentre os genes de resistência a antibiótico úteis, aqueles habilitados na técnica saberíam qual é o mais apropriado. Por exemplo, os seguintes genes podem ser usados: gene CatP, que proporciona resistência ao cloranfenicol e tianfenicol ou gene MLS^R, que proporciona resistência à eritromicina.

Em uma modalidade preferida da invenção, o segundo gene marcador é um gene marcador contra-selecionável.

Um marcador contra-selecionável é um gene cuja presença é letal para o organismo hospedeiro sob determinadas circunstâncias, tal como a presença de seu substrato cognato. Marcadores contra-selecionáveis podem ser usados como uma seleção positiva para a perda do plasmídeo.

De preferência, o gene marcador contra-selecionável é um gene que restaura a atividade de um gene endógeno não essencial ausente ou deletado. Os marcadores contraselecionáveis mais usados são os genes que conferem sensibilidade à sacarose, estreptomicina ou ácido fusárico. Eles têm sido usados para construir cepas mutantes ou de vacina em várias cepas bacterianas. Para detalhes veja a revisão por Reyrat e colaboradores, 1998,

Infection and. Immunity. Marcadores contra-selecionáveis que podem ser usados em Clostridia incluem genes que proporcionam sensibilidade à 5-fluoro-uracila (5-FU), gama-glutamil hidrazida (GBS) ou 8-aza-2,6-diaminopurina (8ADP).

Em uma modalidade preferida, o marcador contraselecionável é o gene upp, o qual codifica fosforibosiltransferase de uracila, que promove a transformação de 5fluoro-uracila (5-FU) em um produto tóxico. Células tendo atividade de Upp não podem crescer sobre um meio com 5-FU.

O uso desse marcador contra-selecionável é particularmente útil quando as Clostridia transformadas são Aupp e, conseqüentemente, são capazes de crescer sobre um meio compreendendo 5-FU antes de transformação e após a eliminação do vetor. Cepas tendo eliminado o vetor podem ser positivamente selecionadas.

Mutantes supressores que podem surgir no gene upp na presença de 5-FÜ podem, algumas vezes, levar a falsas suposições com relação à perda do plasmídeo. Em uma modalidade preferida da invenção, o vetor compreende, além disso, um terceiro marcador, preferencialmente um gene de resistência a antibiótico que permite uma segunda seleção de cepas sensíveis ao antibiótico. Essa seleção negativa pode ser usada além da seleção positiva baseada no gene upp.

Em uma modalidade preferida da invenção, o vetor é eliminado através de digestão com endonucleases após o evento de recombinação ter ocorrido. De preferência, o vetor abriga seqüências de DNA que são reconhecidas por endonucleases de restrição e que estão, ao mesmo tempo, ausentes do genoma da espécie Clostridium usada. Portanto, o vetor é especificamente destruído sem perda de integridade do genoma de Clostridium.

Endonucleases de restrição são enzimas que clivam moléculas de DNA no local de seqüências de base específicas, o sítio de endonuclease de restrição. Aqueles habilitados na técnica serão capazes de determinar qual sítio de endonuclease de restrição está ausente do genoma da cepa de Clostridium de interesse. Possíveis endonucleases de restrição que podem ser aplicadas para C.

acetobutylicum são Asei, Fsel, Notl, Sfil, Srfl. Em outra modalidade, meganucleases, as quais reconhecem grandes sítios alvo de DNA (12-45 bp), tais como I-Scel, HO ou ICrel, podem ser usadas.

Em uma modalidade preferida da invenção, a cepa de

Clostridium a ser transformada abriga sobre seu genoma, pelo menos um gene que codifica endonuclease, o qual reconhece o sítio de endonuclease de restrição que está presente sobre o vetor. Opcionalmente, expressão da endonuclease de restrição está sob o controle de um promotor induzível.

Um promotor induzível é um elemento de DNA que permite a expressão condicional de uma seqüência alvo através da adição do indutor correspondente. Por exemplo, um sistema de promotor induzível em Clostridium que é conhecido por aqueles habilitados na técnica é descrito em Girbal e colaboradores, 2003, Appl. Env. Microbiol. 69:4985-8.

Após o evento de recombinação ter ocorrido e antes de seleção de cepas que tenham eliminado o vetor, a expressão da endonuclease de restrição pode ser induzida. A endonuclease de restrição clivará o vetor presente nas

Clostridia, levando à sua eliminação.

Opcionalmente, o gene que codifica a endonuclease de restrição pode ser inserido no genoma antes de introdução do vetor na cepa.

Em outra modalidade da invenção, o gene que codifica endonuclease de restrição pode também aumentar a freqüência de recombinação antes da eliminação do plasmídeo através do aumento da quantidade de DNA linear nas células, o qual é conhecido por se recombinar melhor do que o DNA circular.

Em uma modalidade particular da invenção, o primeiro gene marcador é um gene de resistência a antibiótico introduzido no meio do cassete de substituição.

Em uma modalidade específica da invenção, esse primeiro gene marcador pode ser removido do genoma das cepas de Clostridium transformadas. Em particular, o primeiro gene marcador pode ser envolvido por dois sítios alvo de recombinase e, então, ser eliminado pela ação de uma recombinase, após o evento de recombinação homóloga ter ocorrido.

Em uma modalidade vantajosa da invenção, a recombinase é expressa por um segundo vetor que traz o gene correspondente, o referido vetor sendo introduzido nas

Clostridia através de transformação.

De preferência, os sítios alvo de recombinase são as seqüências FRT. Recombinase FLP de Saccharomyces cerevisiae é ativa em uma seqüência de DNA de 34 pares de base particular, denominada a seqüência FRT (para o alvo da recombinase FLP) . Quando dois desses sítios FRT estão presentes, a enzima FLP cria rupturas dupla fita nas fitas de DNA, troca as extremidades do primeiro FRT por aquelas da segunda seqüência alvo e, então, prende novamente as fitas trocadas. Esse processo leva à deleção do DNA o qual repousa entre os dois sítios.

Em uma forma específica de realização da invenção, seqüências homólogas às regiões selecionadas em torno da seqüência de DNA alvo podem compreender mutações em até 10% dos pares de base que compõem o fragmento de DNA usado para o evento de recombinação.

Em uma modalidade vantajosa da invenção, as cepas de

Clostridium a serem transformadas sofrem deleção de genes que codificam endonucleases de restrição. Essas cepas apresentam a vantagem de que elas são prontamente transformáveis sem qualquer metilação prévia do plasmídeo in vivo.

Em outra modalidade vantajosa da invenção, as cepas de

Clostridium a serem transformadas sofrem deleção de genes que codificam as DNAses extracelulares.

Em outra modalidade da invenção, as Clostridia a serem transformadas sofrem deleção do gene upp.

Em outra modalidade vantajosa da invenção, as cepas de

Clostridium a serem transformadas são escolhidas dentre

Clostridium acetobutylicum, Clostridium bejeirinckii,

Clostridium saccharoperbutylacetonicum, Clostridium butylicum, Clostridium butyricum, Clostridium perfringens,

Clostridium tetani, Clostridium sporogenes, Clostridium thermocellum, Clostridium saccharolyticum (agora

Thermoanaerobacter saccharolyticum') , Clostridium thermosulfurogenes (agora Thermoanaerobacter thermosulfurigenes') , Clostridium thermohydrosulfuricum (agora Thermoanaerobacter ethanolicus) .

A cepa de Clostridium preferida é Clostridium acetobutylicum.

Em uma modalidade preferida da invenção, a cepa de

Clostridium acetobutylicum a ser transformada é uma cepa Δ

Cacl5, que sofreu deleção do gene que codifica a endonuclease de restrição Cac 8241. Essa cepa apresenta a vantagem de que ela é prontamente transformável sem qualquer metilação prévia do plasmideo in vivo.

Em outra modalidade preferida da invenção, a cepa de

Clostridium acetobutylicum a ser transformada é uma cepa cujo gene upp foi deletado, denominada Δ upp. Como uma consequência, a transformação da cepa com um vetor trazendo o gene upp permite a seleção de cepas sensíveis a meio com 5-FU e, então, a seleção positiva de cepas tendo perdido o plasmídeo que não são mais sensíveis a meio com

5-FU.

A cepa de Clostridium acetobutylicum a ser transformada também pode ser Δ Cacl5 Δ upp.

processo é vantajosamente usado para substituição sucessiva de dois ou mais genes alvo através de recombinação homóloga na mesma cepa de Clostridium.

A presente invenção também se refere a uma cepa de

Clostridium recombinante passível de ser obtida através do processo de acordo com a invenção. Vantajosamente, o processo de acordo com a invenção pode ser usado para obter cepas de Clostridium recombinantes em que o gene cacl5 foi deletado (cepa Acacl5), em que o gene upp foi deletado (cepa Δυρρ) e em que ambos os genes, cacl5 e upp, foram deletados (cepa ACacl5 Aupp).

A presente invenção também se refere ao vetor para transformação da cepa, tal como descrito acima.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura	1 : Mapa	do	vetor	pUC18-FRT-MLS2 .
Figura	2 : Mapa	do	vetor	pCons2-l.
Figura	3 : Mapa	do	vetor	pCIP2-l.

Figura 4 : Mapa do vetor pCons::UPP.

Figura 5 : Mapa do vetor pCLFl.

Figura 6 : Representação esquemática do método de deleção para Clostridia.

As seguintes etapas são realizadas sucessivamente:

A - Amplificação de duas regiões selecionadas em torno da seqüência de DNA alvo; 1, 2, 3, 4 representam primers de PCR.

B - Clonagem dos fragmentos de PCR obtidos no vetor de clonagem pTOPO.

C - Inserção de um marcador no sitio de restrição

StuI, presente nos primers de PCR.

D - Clonagem do cassete de substituição no sitio BamHI de pCONS 2.1 : construção do vetor pREP cio Y.

E - Transformação de Clostridium com o vetor pREP cio

Y.

F - Integração cromossômica do cassete de substituição através de crossover duplo durante subcultura.

G - Seleção de clones com fenotipos Ery^R e Thiam^s.

H - Análise por PCR para verificar a substituição de gene e perda do plasmídeo OR.

D' - Clonagem do cassete de substituição no sitio

BamHI de pCONS::UPP : Construção do vetor pREP cio Y:UPP.

Ε' - Transformação de Clostridium Aupp com o vetor pREP cloY: UPP.

F' - Integração cromossômica do cassete de substituição através de crossover duplo durante subcultura.

G' - Seleção de clones com os fenotipos Ery^R e 5-FU^R(Thiam^s) .

H' - Análise por PCR para verificar a substituição de gene e perda do plasmídeo.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Construção de vetores

1.1 Construção do pUC18-FRT-MLS2

Esse plasmídeo contém um gene MLS^r funcional em Clostridiã e flanqueado por dois sítios FRT e dois sítios

StuI e é útil para a construção dos cassetes de substituição. Reação em cadeia de polimerase inversa (IPCR) foi realizada com DNA polimerase Pwo com pKD4 como um plasmídeo modelo (Datsenko e Wanner, 2000) e oligonucleotídeos PKD4.1 e PKD4.2 como primers para amplificar a região do plasmídeo com os sítios FRT, mas sem o marcador Km^r. Esse fragmento com extremidade cega foi depois ligado ao gene MLS^r obtido após uma digestão com Híndlll do plasmídeo pETSPO (Harris e colaboradores,

2002, J. Bacteriol) e tratamento com Klenow. O plasmídeo correspondente (pKD4-Eryl) foi, então, usado como um template para amplificar o gene MLS^r flanqueado por dois sítios FRT e dois sítios StuI em uma reação de PCR usando os oligonucleotídeos FRT-MLSR-E e FRT-MLSR-R como primers 5 e DNA polimerase Pwo. Esse fragmento foi diretamente clonado no pUC18 digerido com Smal para produção do plasmídeo pUC18-FRT-MLS2 (Figura 1).

Primers de PCR:

PKD4.1 (SEQ ID N°l):

5'-ctggcgccctgagtgcttgcggcagcgtgagggg-3'

PKD4.2 (SEQ ID N°2):

5' -agcccggggatctcatgctggagttcttcgccc-3'

FRT-MLSR-F (SEQ ID N°3):

5'-tacaggccttgagcgattgtgtaggctggagc-3'

FRT-MLSR-R (SEQ ID N°4):

5'-aacaggcctgggatgtaacgcactgagaagccc-3'

1.2 Construção de pCons 2.1

Esse plasmídeo contém uma origem de replicação pIM13 funcional em Clostridia (mecanismo de replicação de rolamento circular), um gene catP que confere resistência ao tianfenicol e um sítio BamHI único para a clonagem do cassete de substituição. Esse plasmídeo foi construído em um procedimento em duas etapas a partir do plasmídeo pETSPO (Harris e colaboradores, 2002, J. Bacteriol) para remover parte de um poli-ligante e, dentre outros, um sítio BanHI e um EcoRI. IPCR foi realizada com DNA polimerase Pwo com pETSPO como um plasmídeo modelo e oligonucleotídeos PCONSAccI e PCONSEcoRI como primers, e o produto de PCR foi fosforilado e ligado. Após transformação de E. coli, o plasmídeo pConsO foi obtido. Esse plasmídeo foi, então, digerido com Bamtil para remover o cassete spoOA, o fragmento de DNA apropriado purificado e ligado para produção do plasmídeo pCons2-l. 0 mapa do pCons2-l é fornecido na Figura 2.

Primers de PCR:

PCONSAccI (SEQ ID N°5) :

5' - ccggggtaccgtcgacctgcagcc-3'

PCONSEcoRI (SEQ ID N°6):

5' - gaattccgcgagctcggtacccggc-3'

1.3 Construção do vetor pCIP 2-1

Nessa construção, a origem de replicação pIMl3 do pCons2-l foi substituída pela origem de replicação do plasmídeo pSOLl, um plasmídeo tendo um mecanismo de replicação Θ. Para essa finalidade, a origem de replicação do pSOLl foi amplificada por PCR com DNA polimerase Pwo usando DNA total de Clostridium acetobutylicum como um modelo e oligonucleotídeos ori-3-D e ori-4-R como primers.

Esse produto de PCR foi clonado no pCR-BluntII-TOPO e o plasmídeo resultante digerido por FcoRI e o fragmento de

2,2 kb foi purificado. Similarmente, o plasmídeo pCons2.1 foi digerido por FcoRI e o fragmento de 2,4 kb purificado e ligado no fragmento FcoRI de 2,2 kb contendo a origem de replicação do pSOLl para proporcionar o plasmídeo pCIP2-l (Figura 3).

Primers de PCR:

ORI-3-D (SEQ ID N°7):

5'-ccatcgatgggggtcatgcatcaatactatcccc-3'

ORI-4-R (SEQ ID N°8):

5'-gcttccctgttttaatacctttcgg-3’

1.4 Construção do vetor pCons::upp

O gene upp, com seu próprio sítio de ligação ribossômica (rbs) foi clonado no pCons2.1 no sítio Bcgl exatamente a jusante do gene CatP de forma a construir um óperon artificial com upp expresso sob o controle do promotor de CatP. Dessa forma, não foi introduzida nenhuma região homóloga que permitiría integração cromososmica do gene upp na cepa \cacl5 Λ upp em outros experimentos de deleção, os quais usam o gene upp como um marcador contraselecionável para perda de plasmídeo. O gene upp, com seu rbs, foi amplificado por PCR (Pfu) a partir de DNA genômico de C. acetobutylícum usando os oligonucleotídeos REP-UPP F e REP-UPP R como primers. O produto de PCR de 664 bp foi digerido por PvuII e clonado no pCons2.1 digerido por Bcgl e tratado com DNA polimerase T4 para cegar as extremidades.

Dessa forma, o vetor replicativo pCons::UPP (veja figura 4) foi obtido.

Primers de PCR:

REP-UPP F (SEQ ID N°9):

5'-aaaacagctgggaggaatgaaataatgagtaaagttacac-3'

REP-UPP R (SEQ ID N°10):

5' -aaaacagctgttattttgtaccgaataatctatctccagc-3'

1.5 Construção do vetor pCLFl

O gene FLP1 de S. cerevisiae que codifica a recombinase

FLP foi clonado no vetor pCons2.1 sob o controle do promotor e RBS do gene de tiolase (thl) de C.

acetobutylicum, permitindo alta expressão nesse organismo.

O gene FLP1 foi amplificado por PCR (Pfu) usando os oligonucleotideos FLP1-D e FLP1-R como primers e o plasmideo pCP20 (Datsenko e Wanner, 2000) como um modelo.

Primers de PCR:

FLP1-D (SEQ ID N°ll):

5' -aaaaggatccaaaaggagggattaaaatgccacaatttggtatattatgt aaaacaccacct-3'

FLP1-R (SEQ ID N°12):

5' -aaatggcgccgcgtacttatatgcgtctatttatgtaggatgaaaggta3

FLP1-D tem uma extensão 5' incluindo um sitio BamHI e a seqüência RBS de thl. FLP1-R introduziu um sitio SfoI em

3' do produto de PCR. 0 produto de PCR foi digerido por

BamHI e SfoI e diretamente clonado no vetor de expressão 5 pSOS95 que tinha sido digerido com as mesmas enzimas, proporcionando o plasmídeo pEX-FLPl (6281 bp) . 0 fragmento

Sall (1585 bp) do pEX-FLPl contendo o cassete de expressão

FLP1 foi clonado no sítio Sall do pCONS2.1 para obter o plasmídeo pCLFl (4878 bp) (Figura 5).

Exemplo 2: Deleção do gene cacl502 que codifica a enzima de restrição cac824I em Clostridivua acetobutylicvua.

Veja figura 6 para uma representação esquemática do método.

Dois fragmentos de DNA que envolvem o gene de codificação de Cac824I (CAC1502) foram amplificados por PCR com DNA polimerase Pwo usando DNA total de C.

acetobutylicum como modelo e dois pares específicos de oligonucleotídeo como primers (veja tabela 2). Usando pares de primers CAC 1B-CAC 2 e CAC 3-CAC 4B, fragmentos de DNA de 1493 bp e 999 bp foram obtidos, respectivamente. Ambos os primers, CAC 1B e CAC 4B, introduzem um sítio BamHI, enquanto que os primers CAC 2 e CAC 3 têm seqüências estendidas 5' complementares as quais introduzem um sítio

StuI. Fragmentos de DNA CAC 1B-CAC 2 e CAC 3-CAC 4B foram unidos em um experimento de fusão por PCR com os primers

CAC 1B e CAC 4B e o fragmento resultante foi clonado no vetor pCR4-TOPO-Blunt para produzir pTOPO:cacl5. No sítio

StuI único do pTOPO:cacl5, o fragmento StuI de 1372 bp do 5 pUC18-FRT-MLS2, abrigando o gene de resistência a antibiótico MLS^r com seqüências FRT sobre ambos os lados, foi introduzido. 0 cassete de substituição cacl502 obtido após digestão com BamHI do plasmídeo resultante foi clonado, no BamHI, no sítio pCons2-l, para produção do plasmídeo pREPCAC15 e no pCIP2.1 para produzir pCIPCAC15.

Os plasmídeos pREPCAC15 e pCIPCAC15 foram metilados ín vivo e usados para transformar C. acetobutylicum através de eletroporação. Após seleção sobre Placas de Petri de clones

resistentes à	eritromicina (40	pg/ml),	uma	colônia de cada
15 transformante	foi	cultivada	durante	24	horas em meio
sintético líquido	com eritromicina a	40	pg/ml e, então,
subcultivado	em	meio 2YTG	líquido	sem antibiótico.

Diluições apropriadas foram colocadas sobre agar

Clostridium reforçado (RCA) com eritromicina a 40 pg/ml.

Para selecionar integrantes tendo perdido os vetores pREPCAC15 ou pCIPCAC15, clones resistentes à eritromicina foram colocados em réplica sobre RCA com eritromicina a 40 qg/ml e RCA com tianfenicol a 50 pg/ml. Embora várias colônias com o fenotipo desejado fossem obtidas com os transformantes pREPCAC15, nenhuma de tais colônias foi obtida com os transformantes pCIPCAC15. Isso demonstra que o mecanismo de replicação Θ do pCIPCAC15 é menos favorável ao promover crossover duplo em C. acetobutylicum do que um mecanismo de rolamento circular. 0 genotipo de clones resistentes à eritromicina e sensíveis ao tianfenicol foi verificado através de análise por PCR (com os primers CAC 0 e CAC 5 localizados fora do cassete de substituição CAC15 e os primers CAC D e CAC R localizados dentro do cac!502) .

Cepas Acacl5: :mls^R, as quais perderam pREPCAC15, foram isoladas.

Uma cepa Acacl5: :mls^R foi transformada com o vetor pCLFl expressando o gene FLP1 que codifica a recombinase

Flp de S. cerevisiae. Após transformação e seleção de resistência ao tianfenicol (50 pg/ml) sobre placas de

Petri, uma colônia foi cultivada sobre meio líquido sintético com tianfenicol a 50 pg/ml e diluições apropriadas foram colocadas sobre RCA com tianfenicol a 50 pg/ml. Clones resistentes ao tianfenicol foram colocados em réplica sobre RCA com eritromicina a 40 pg/ml e RCA com tianfenicol a 50 pg/ml. 0 genotipo de clones com sensibilidade à eritromicina e resistência ao tianfenicol foi verificado através de análise por PCR com os primers

CAC 0 e CAC 5B.

Duas culturas sucessivas de 24 horas da cepa \cacl5 com sensibilidade à eritromicina e resistência ao tianfenicol foram realizadas de forma a liberar o pCLFl. A cepa Acacl5, a qual perdeu pCLFl, foi isolada de acordo com sua sensibilidade à eritromicina e tianfenicol. A cepa foi denominada C. acetobutylicum MGCAcacl5.

Tabela 2

Nome	SEQ ID NO:	Seqüências de Primer
CAC 1B	13	aaaggatccatgcacactcataaatttactgtaggaagtctg'
CAC 2	14	ggggaggcctaaaaaggggggtcccaaataatatttgccat agtaaccacc
CAC 3	15	Ccccctttttaggcctcccctcgaacttattagaatgattaag attccgg
CAC 4B	16	aaaggatcctcattaaatttcctccattttaagcctgtc
CAC 0	17	gtgatataattttcctttaaatggaggaggatctg
CAC 5B	18	gccgttaatagacattataattccattggc
CAC D	19	gaattcttaaaaatatttggatcattaagcgg
CAC R	30	gttgtattggaatctttgttattatttctccc

Exemplo 3: Deleção do gene upp que codifica a fosforibosiltransferase de uracila em Clostridivaa acetobutylicvaa Acacl5

Dois fragmentos de DNA a montante e a jusante do upp (CAC2879) foram amplificados por PCR com DNA polimerase Pwo usando DNA total de C. acetobutylícum como modelo e dois pares específicos de oligonucleotídeos como primers (veja tabela 3). Com os pares de primer UPP 1-UPP 2 e UPP 3-UPP

4, fragmentos de DNA de 1103 bp e 1105 bp foram obtidos, respectivamente. Ambos os primers UPP 1 e UPP 4 introduzem um sítio BamHI, enquanto que os primers UPP 2 e UPP 3 têm seqüências estendidas 5' as quais introduzem um sítio StuI.

Fragmentos de DNA UPP 1-UPP 2 e UPP 3-UPP 4 foram unidos em um experimento de fusão por PCR com os primers UPP 1 e UPP e o fragmento resultante foi clonado no pCR4-TOPO-Blunt para produzir pTOPO:upp. No sítio StuI único do pTOPO:upp, o fragmento StuI de 1372 bp do pUC18-FRT-MLS2, abrigando o gene de resistência a antibiótico MLS^r com seqüências FRT sobre ambos os lados, foi introduzido. O cassete de substituição upp obtido após digestão por BamHI do plasmídeo resultante foi clonado no pCons2-l no sítio BamHI para produzir o plasmídeo pREPUPP.

O plasmídeo pREPUPP foi usado para transformar a cepa

MGCAcacló de C. acetobutylícum através de eletroporação sem metilação prévia in vivo. Após seleção sobre placas de

Petri de clones resistentes à eritromicina (40 pg/ml), uma colônia foi cultivada durante 24 horas em meio sintético líquido com eritromicina a 40 pg/ml e, então, subcultivada em meio líquido 2YTG sem antibiótico. Diluições apropriadas foram colocadas sobre RCA com eritromicina a 40 pg/ml. Para selecionar integrantes tendo perdido o vetor pREPUPP, clones resistentes à eritromicina foram colocados em réplica sobre RCA com eritromicina a 40 pg/ml e RCA com tianfenicol a 50 pg/ml. O genotipo de clones resistentes à eritromicina e sensíveis a tianfenicol foi verificado através de análise por PCR (com os primers UPP 0 e UPP 5 localizados fora do cassete de substituição UPP e os primers UPP D e UPP R localizados dentro do UPP) . A cepa

Acacl5Aupp: :mls^R, que tinha perdido o pREPUPP, foi isolada.

A deleção prévia de cacl502 foi confirmada conforme anteriormente descrito no primeiro exemplo. A cepa Acacl5

Aupp::mls^R é resistente a 5-FU a 400 μΜ comparado com 50 μΜ para a cepa Acacló.

A cepa Acacl5Aupp: :mls^R foi transformada com o vetor pCLFl expressando o gene FLP1 que codifica a recombinase Flp de S. cerevisiae. Após transformação e seleção de resistência ao tianfenicol (50 pg/ml) sobre placas de

Petri, uma colônia foi cultivada em meio líquido sintético com tianfenicol a 50 pg/ml e diluições apropriadas foram colocadas sobre RCA com tianfenicol a 50 pg/ml. Clones resistentes ao tianfenicol foram colocados em réplica sobre

RCA com eritromicina a 40 pg/ml e RCA com tianfenicol a 50 pg/ml. O genotipo de clones com sensibilidade à eritromicina e resistência ao tianfenicol foi verificado através de análise por PCR com os primers UPP 0 e UPP 5.

Duas culturas sucessivas de 24 horas da cepa Acaclõàupp com sensibilidade à eritromicina e resistência ao tianfenicol foram realizadas de forma a liberar o pCLFl. A cepa \cacl5

Aupp, que tinha perdido o pCLFl, foi isolada através de determinação de sua sensibilidade à eritromicina e tianfenicol.

Tabela 3

Nome	SEQ ID NO:	Seqüências de Primer
UPP 1	21	aaaaggatcctcctgatctattaattcttgatgaaccc
UPP 2	22	ggggaggcctaaaaagggggattgcataaataaaaagggctgaa aaataaatttcag
UPP 3	23	ccccctttttaggcctccccttatttcattcctccattgtattt tttttctatttg
UPP 4	24	aaaaggatccgctattatgaataggttaaataagtcagctgg

UPP 0	25	aatacaagcaaagagaataggctatgtgcc
UPP 5	26	aatacaagcaaagagaataggctatgtgcc
UPP D	27	ggcatatgaagtaacaagagaaatgcagc
UPP R	28	ataatctatctccagcatctccaagacc

Exemplo 4 Deleção do gene cac3535 com o uso de upp e 5fluorouracila como uma possível seleção de perda de plasmídeo

Dois fragmentos de DNA a montante e a jusante do gene cac3535 que codifica um segundo sistema de modificaçãorestrição de C. acetobutylicum foram amplificados por PCR com DNA polimerase Pwo usando DNA total de C.

acetobutylicum como modelo e dois pares específicos de oligonucleotídeos (veja tabela 4). Com os pares de primer

RM 1-RM 2 e RM 3-RM 4, fragmentos de DNA de 1 kbp e 0,9 kbp foram obtidos, respectivamente. Ambos os primers RM 1 e RM introduzem um sítio BamHI, enquanto que os primers RM 2 e

RM 3 têm seqüências estendidas 5' complementares que introduzem um sítio StuI. Fragmentos de DNA RM 1-RM 2 e RM

3-RM 4 foram unidos em um experimento de fusão por PCR usando os primers RM 1 e RM 4 e o fragmento resultante foi clonado no vetor pCR4-TOPO-Blunt para produzir o plasmídeo pTOPO:cac3535. No sítio StuI único do pTOPO:cac3535, o fragmento StuI de 1372 bp do pUC18-FRT-MLS2, abrigando o gene de resistência a antibiótico MLS^r com seqüências FRT sobre ambos os lados, foi introduzido. 0 cassete de substituição CAC3535 obtido após digestão com BamHI do plasmídeo resultante foi clonado no pCons::upp no sítio

BamHI para proporcionar o plasmídeo pREPCAC3535::upp.

plasmídeo pREPCAC3535::upp foi usado para transformar a cepa MGCAcacló Aupp de C. acetobutylicum através de eletroporação. Após seleção de clones resistentes à eritromicina (40 pg/ml) sobre placas de

Petri, uma colônia foi cultivada durante 24 horas em meio sintético líquido com eritromicina a 40 pg/ml e 100 μΐ de cultura não diluída foram colocados sobre RCA com eritromicina a 40 pg/ml e 5-FU a 400 μΜ. Colônias resistentes à eritromicina e 5-FU foram colocadas em réplica sobre RCA com eritromicina a 40 pg/ml e RCA com tianfenicol a 50 pg/ml para verificar se a resistência à 5FU está associada à sensibilidade ao tianfenicol. O genotipo de clones resistentes à eritromicina e sensíveis ao tianfenicol foi verificado através de análise por PCR (com os primers RM 0 e RM 5 localizados fora do cassete de substituição cac3535 e os primers RM D e RM R localizados dentro do gene cac3535} . Dessa forma, a cepa Acacl5Aupp

Acac35::mls^R, que perdeu o pREPCAC3535::upp, foi isolada.

Tabela 4

Nome	SEQ ID NO:	Seqüências de Primer
RM 1	29	aaaaggatccgcagctttctggaaggactacggcg
RM 2	30	ggggaggcctaaaaagggggcatttacttatggtacggttcacccc
RM 3	31	ccccctttttaggcctccccgtctttaaaaagtaatttatcaaaggca tcaaggc
RM 4	32	ccccctttttaggcctccccgtctttaaaaagtaatttatcaaaggca tcaaggc
RM 0	33	cacattgtcatttataaaagtccctaggg
RM 5	34	gtagtaattccaacttcaactcttgccac
RM D	35	cttagaatagctgatattgcttgcgg
RM R	36	agcatctctcttaatgattctccgg

REFERÊNCIAS

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1/5

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Processo para a subst ituição de uma sequência de DNA alvo através de recombinação homóloga em Clostridiã caracterizado pelo fato de compreender:

transformar a referida cepa com um vetor compreendendo:

- uma origem de replicação que permite sua replicação em clostridiã, e

- um cassete de substituição compreendendo um primeiro gene marcador envolvido por duas sequências homólogas às regiões selecionadas em torno da sequência de DNA alvo, permitindo a recombinação do cassete, e

- um segundo gene marcador, em que o segundo gene marcador é um marcador contra-selecionável,

- selecionar as cepas, tendo integrado em seu genoma o referido cassete, que expressam o primeiro gene marcador,

- selecionar as cepas, tendo eliminado o referido vetor, que não expressam o segundo gene marcador.
2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o marcador contraselecionável ser um gene que restaura a atividade de um gene não essencial ausente ou deletado.
3. Processo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o marcador contraselecionável ser o gene upp.
4. Processo, de acordo com a reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o vetor compreender um terceiro marcador que permite uma seleção negativa de cepas tendo eliminado o referido vetor.
5. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o

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2/5 primeiro gene marcador ser um gene de resistência a antibiótico.
6. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o primeiro gene marcador ser envolvido por dois sítios alvo de recombinase.
7. Processo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o primeiro gene marcador ser eliminado pela ação de uma recombinase após o evento de recombinação homóloga ter ocorrido.
8. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 ou 7, caracterizado pelo fato de que a referida recombinase ser expressa por um gene trazido por um segundo vetor introduzido na cepa.
9. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 7, caracterizado pelo fato de que os referidos sítios alvo de recombinase serem sequências FRT, e a referida recombinase ser a FLP recombinase.
10. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que as Clostridia a serem transformadas sofrerem deleção para genes que codificam de endonuclease de restrição.
11. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que as Clostridia a serem transformadas sofrerem deleção para genes que codificam DNAse.
12. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que as Clostridia a serem transformadas sofrerem deleção para o gene upp.
13. Processo, de acordo com qualquer uma das

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Clostridium butylicum, reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que as cepas de Clostridium serem escolhidas entre Clostridium acetobutylicum, Clostridium bejeirinckii, saccharoperbutylacetonicum, Clostridium

Clostridium butyricum, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Clostridium sporogenes, Clostridium thermocellum, Clostridium saccharolyticum Thermoanaerobacter saccharolyticum) , Clostridium thermosulfurogenes (agora Thermoanaerobacter thermosulfurigenes), Clostridium thermohydrosulfuricum (agora ethanolicus).
14. Processo, de acordo com

Thermoanaerobacter reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a cepa de Clostridium ser Clostridium acetobutylicum.
15. Processo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a cepa de Clostridium acetobutylicum a ser transformada é Acacl5, em que o gene CAC1502 é deletado.
16. Processo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a cepa de Clostridium acetobutylicum a transformar é bupp.
17. Processo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a cepa de Clostridium acetobutylicum a transformar é ACacl5, em que o gene CAC1502 é deletado, bupp.
18. Processo para a substituição de dois ou mais genes alvo através de recombinação homóloga em uma mesma cepa de Clostridium, caracterizado pelo fato de que o processo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 17 é realizado sucessivamente duas ou mais vezes.
19. Cepa recombinante de Clostridium caracterizada pelo

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4/5 fato de ser passível de ser obtida pelo processo conforme definido por qualquer uma das reivindicações 1 a 18, em que o gene CAC1502 e/ou gene upp foi deletado.
20. Vetor para a substituição de uma sequência de DNA alvo por recombinação homóloga em Clostridia, caracterizado por compreender:

- uma origem de replicação que permite a sua replicação em Clostridia, e

- um cassete de substituição que compreende um primeiro gene marcador rodeado por duas sequências homólogas a regiões selecionadas em torno da sequência de DNA alvo, permitindo a recombinação do cassete e

- um segundo gene marcador, em que o segundo gene marcador é o gene upp, o qual é um marcador contra-selecionável.
21. Vetor, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o marcador contraselecionável é um gene que restaura a atividade de um gene ausente não essencial ou deletado.
22. Vetor, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o marcador contraselecionável é o gene upp
23. Vetor, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 22, caracterizado pelo fato de que o vetor compreende um terceiro marcador que permite uma seleção negativa de cepas que eliminaram o referido vetor.
24. Vetor, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 23, caracterizado pelo fato de que abriga sequências de DNA que são reconhecidas por endonucleases de restrição e que estão ao mesmo tempo ausentes do genoma da cepa de Clostridium utilizada.

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25. Vetor, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 0 a 24, caracterizado pelo fato de que o primeiro gene marcador é um gene de resistência a antibióticos.
26. Vetor, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 0 a 25, caracterizado pelo fato de que o primeiro gene marcador está rodeado por dois sítios alvo de recombinase.
27. Vetor, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que os referidos sítios alvo de recombinase são sequências de FRT, e a referida recombinase é a FLP recombinase.

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Beg 1(632) catP

FIGURA 2

2/4

FIGURA 3

UPP

FIGURA 4

3/4

FIGURA 5

4/4 cio X cio Y cio Z \ B cloZ cio X

BamHI StuI BamHI cio X FRT

.......... ....

BamHI StuI

MLS^r FRT do z i

StuI BamHI

0’ cio X bamHI

FftT

X

MLSR catP

UPP pREP do¥:UPP

E- I· ~ G- II

E’~ F’- G’-ΙΓ

FIGURA 6