ES2866823T3

ES2866823T3 - Nuevo polipéptido que presenta una actividad de ferredoxina-NADP+ reductasa, polinucleótido que codifica el mismo y utilizaciones del mismo

Info

Publication number: ES2866823T3
Application number: ES16747754T
Authority: ES
Inventors: Philippe Soucaille; Isabelle Meynial-Salles; Céline Foulquier; Antoine Riviere
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut National des Sciences Appliquees INSA; Institut National de Recherche pour lAgriculture lAlimentation et lEnvironnement
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut National des Sciences Appliquees INSA; Institut National de Recherche pour lAgriculture lAlimentation et lEnvironnement
Priority date: 2015-07-27
Filing date: 2016-07-22
Publication date: 2021-10-19
Anticipated expiration: 2036-07-22
Also published as: HUE053088T2; EP3328997A1; US20180216138A1; EP3328997B1; PT3328997T; CA2993485C; US10760100B2; WO2017017026A1; CA2993485A1

Abstract

Microorganismo que presenta actividad enzimática de ferredoxina NADP+ reductasa, en el que un polinucleótido que codifica un polipéptido que presenta una identidad de por lo menos 70% con la secuencia de SEC ID nº 1 y que presenta actividad de ferredoxina NADP+ reductasa se sobreexpresa, en el que la sobreexpresión se consigue mediante la sustitución del promotor nativo del polinucleótido con un promotor que induce un nivel más fuerte de expresión del polinucleótido o mediante la introducción en el microorganismo de un vector de expresión que porta y expresa dicho polinucleótido o mediante la introducción de copias adicionales del polinucleótido en el cromosoma del microorganismo.

Description

DESCRIPCIÓN

Nuevo polipéptido que presenta una actividad de ferredox¡na-NADP+ reductasa, polinucleótido que codifica el mismo y utilizaciones del mismo

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un nuevo polipéptido con actividad enzimática de reducción de NADP+ mediante la utilización de los electrones procedentes de la ferredoxina reducida (actividad de ferredoxina-NADP+ reductasa), un polinucleótido con una secuencia de nucleótidos codificante de dicho polipéptido y utilizaciones del mismo.

Más particularmente, la invención se refiere a la modulación de la actividad de la ferredoxina-NADP+ reductasa en un microorganismo mediante modificación del nivel de expresión del polinucleótido codificante de dicho polipéptido.

La presente invención se refiere además a la producción de productos químicos básicos, especialmente etanol, nbutanol, isopropanol, acetona, 1,3-propanodiol y 1,2-propanodiol, mediante microorganismos fermentadores, en los que se modula la actividad de la ferredoxina-NADP+ reductasa.

Técnica anterior

1) Producción de N-butanol:

El N-butanol se produce naturalmente en hospedadores nativos de crecimiento lento pertenecientes al género Clostridium, en forma de una mezcla con acetona y etanol en una fermentación bifásica, especialmente el mejor conocido C. acetobutylicum (Cornillot et al., 1997, Girbal y Soucaille 1998, Fontaine et al. 2002). Aunque la fermentación de acetona-butanol-etanol (ABE) ha sido la primera fermentación industrial a gran escala y a pesar de la larga historia de investigación sobre el proceso de la fermentación, todavía existen obstáculos actualmente. Debido a que los clostridios son anaerobios estrictos, las condiciones de crecimiento deben mantenerse anaeróbicas y la tasa de crecimiento es significativamente lenta en comparación con muchos de los microorganismos aeróbicos, resultando en una baja tasa de producción de butanol. Además, la utilización de cepas de Clostridium acetobutylicum o C. beijerinckii (que son los más estudiados) en un procedimiento continuo se encuentra limitada debido al riesgo de degeneración de las cepas.

Los avances en la manipulación genética de los clostridios han conducido recientemente a grandes incrementos del título y la productividad (Papoutsakis 2008, Soucaille 2007, Jiang et al. 2009, Tracy 2012). Actualmente, la cepa C. acetobutylicum ATCC 824, la mejor diseñada para la producción de n-butanol con alto rendimiento y título, se obtuvo utilizando una combinación de una disrupción de genes particulares que participan en la producción de ácidos y la sobreexpresión de la variante AdhE1D485G de alcohol deshidrogenasa. Se ha producido una concentración máxima de 18,4 g/l de n-butanol a partir de glucosa en cultivo por lotes con un rendimiento de 0,28 g/g de glucosa con cantidades bajas de acetona, etanol, acetato y butirato (2 g/l, 3 g/l, 2 g/l y 4.3 g/l, respectivamente) (Jang et al., 2012). Debido a que una de las desventajas de la producción de n-butanol en clostridios es la cosíntesis de acetona, que no puede utilizarse como fuente combustible, varios estudios se han centrado en estrategias para evitar el carbono que se pierde en este producto. Una alternativa es sobreexpresar la alcohol deshidrogenasa primaria/secundaria de C. beijrinckii NRRL B-593 codificada por el gen sadhB-593 para reducir la acetona en isopropanol. La cepa manipulada C. acetobutylicum 824 Abuk que sobreexpresa el gen sadh con la ruta de acetona era capaz de producir, a partir de glucosa, 21 g/l de mezcla IBE con un rendimiento de 0.34 g/g, en fermentaciones por lote controladas, sin ninguna traza de acetona (Dusséaux et al., 2013). Otra alternativa informada es la manipulación de Clostridium tyrobutyricum ATCC 25755, un acidógeno no solventogénico, mediante la expresión de la alcohol deshidrogenasa AdhE2 de C. acetobutylicum. La cepa recombinante cultivada, bajo condiciones por lotes a pH 6, en medio RCM con manitol como fuente de carbono, fue capaz de producir 20.5 g/l de butanol con un rendimiento de 0.33 g/g en presencia de 6 g/l de ácido butírico (Yu et al., 2012).

Para superar algunos de los problemas asociados al procedimiento clostridial de producción de butanol, se introdujo la ruta clostridial de fermentación del butanol en varios organismos heterólogos, tales como E. coli B o K12 (Atsumi et al., 2007; Heise et al., 2008, Garza et al. 2012) Saccharomyces cerevisiae (Steen et al. 2008), Bacillus subtilis, Pseudomonas putida (Nielsen et al. 2009) o Lactobacillus brevis (Berezina et al. 2010), para convertir el acetil-CoA en butanol. Los resultados de los que se informa muestran que los siete genes nativos de C. acetobutylicum de la ruta (thl, hbd, crt, bcd, etfAB y adhE2) son funcionales, con independencia del organismo heterólogo, aunque el título final de butanol es bastante bajo. Ninguna de las especies pudo producir más de 1 g/l de butanol.

Se han identificado dos cuellos de botella que limitan la producción de 1-butanol: i) la ruta requiere cuatro moles de NADH para producir 1 mol de 1-butanol en la cepa manipulada de E. coli y el equilibrado de NADH requiere un complejo activo de piruvato deshidrogenasa bajo condiciones anaerobias, mientras que dicho enzima es normalmente inactivo debido a la inhibición de NADh (Atsumi et al., 2007; Garza et al., 2012), ii) la actividad de la butiril-CoA deshidrogenasa (Bcd) que cataliza la conversión de crotonil-CoA a butiril-CoA era baja, aunque los genes etfA y etfB se expresaron simultáneamente con bcd (Inui M. et al. 2008, Berezina et al. 2010), y dicho complejo enzimático producía ferredoxina reducida que debe oxidarse en E. coli para que proceda la reacción tal como se ha descrito anteriormente (Li et al., 2008). Este último cuello de botella puede superarse mediante la utilización de un enzima alternativo para sustituir Bcd, una trans-enoil-CoA reductasa dependiente de NADH (Ter) (Bond-Watts et al., 2011, Shen et al. 2011). La combinación de la sobreexpresión de los seis genes siguientes: atoB (E. coli), adhE2, crt, hbd (C. acetobutylicum), fdh (C. boidini) y Ter (T. denticola) en la cepa JCL 299 de E. coli (AldhA, AadhE, AfrdBCApta) condujo a la producción de 15 g/l de butanol tras 75 horas de cultivo anaeróbico en matraces que contenían medio caldo Terrific con 2% de glucosa (Shen et al. 2011).

Otra notable alternativa a la producción de n-butanol es la manipulación del ciclo de p-oxidación endógena en E. coli mediante la introducción de modificaciones genéticas clave para eliminar el mecanismo regulador que reprime los genes que participan en la p-oxidación (fadR atoC(c) crp*AarcA), en combinación con la eliminación de rutas fermentativas nativas competitivas (AadhE, Apta, AfrdA, AyqhD, AeutE) y la sobreexpresión de tanto YqeF (una aciltransferasa predicha) y FucO (una L 1,2-propanodiol oxidorreductasa). En cultivo en biorreactor que contenía medio mineral complementado con 5% de glucosa bajo condiciones microanaeróbicas (5% de oxígeno disuelto), la cepa manipulada de E. coli produjo 14 g/l de n-butanol con un rendimiento de 0.33 g/g de glucosa) (Dellomonaco et al., 2011). Sin embargo, debe considerarse que este enfoque a nivel sistémico está limitado por los mal definidos componentes individuales de la ruta manipulada.

2) Producción de 1,3-propanodiol:

El 1.3-propanodiol (1.3Pdiol) es un compuesto químico importante ampliamente utilizado como monómero en la producción de polímeros (tereftalato de politrimetileno, por citar solo un ejemplo). Durante mucho tiempo se ha producido 1.3Pdiol mediante rutas químicas que generaban enormes costes y productos tóxicos. Se ha descubierto que muchos microorganismos pertenecientes a los géneros Klebsiella, Citrobacter, Lactobacilli y Clostridium producen naturalmente 1.3Pdiol a partir de glicerol, un metabolito de desecho abundante producido en la industria del biodiésel (Saxena et al., 2009). La mayoría de productores naturales catabolizan el glicerol en dos rutas paralelas: i) la oxidación del glicerol en dihidroxiacetona, que después se transforma en gliceraldehído-3-fosfato y adicionalmente a piruvato, que a su vez produce diversos productos secundarios y equivalente reductor de NADH², y ii) la reducción del glicerol en 3-hdiroxipropionaldehído (HPA) por una glicerol deshidratasa, seguido de la reducción de HPA en 1.3Pdiol por una 1.3Pdiol deshidrogenasa NADH-dependiente, generando de esta manera NAD+. Los coenzimas reducidos que se producen en la ruta oxidativa resultan necesarios para que la ruta reductora mantenga el equilibrio redox de la célula.

Dependiendo de los microorganismos, la producción de 1.3Pdiol puede ser anaeróbica absoluta (Clostridium butyricum), microaeróbica o aeróbica (Klebsiella o Citrobacter) (Saint Amans et al., 2001, Saxena et al. 2009). Con independencia de las condiciones, métodos y productores naturales que sean, el rendimiento de conversión del glicerol 1.3Pdiol se encontraba comprendido entre 0.51 y 0.64 moles/moles y puede alcanzarse un título final de 1.3Pdiol de hasta 102 g/l en condiciones alimentadas por lotes (Xu et al., 2009, Almeida et al. 2012). Los productos no naturales de 1.3 propanodiol, tales como E. coli o C. acetobutylicum, también se manipularon mediante la expresión de los genes de la ruta de 1.3 Pdiol. Por ejemplo, la expresión de la ruta de 1.3Pdiol de C. butyricum en C. acetobutylicum, naturalmente incapaz de crecer sobre glicerol como única fuente de carbono, condujo a la producción de 84 g/l de 1.3Pdiol con un rendimiento de 0.65 moles/moles (Meynial-Salles et al., 2005). Finalmente, la combinación de sobreexpresión de la glicerol deshidratasa independiente de B12 de C. butyricum con YqhD (una NADPH 1.3-propanodiol deshidrogenasa de E. coli de tipo salvaje) en E. coli (Tang et al., 2009) permitió la producción de 104 g/l de 1.3-Pdiol en un procedimiento en dos etapas (aeróbica y anaeróbica), con un rendimiento de conversión de glicerol a 1.3Pdiol de 90.2% (g/g) durante la etapa anaeróbica, un valor que implicaría que se producen 1.12 moles de 1,3-propanol a partir de 1 mol de glicerol, lo que resulta imposible.

3) Producción de propilenglicol:

El 1.2-propanodiol o propilenglicol es un diol de tres carbonos con centro estereogénico en el carbono central, ampliamente utilizado como producto químico básico. Es un constituyente de resinas de poliéster insaturadas, detergentes no iónicos, fluido refrigerante, anticongelante o descongelante para aviones. También puede utilizarse en productos de nutrición y cosméticos. Actualmente se produce mediante una ruta petroquímica utilizando un procedimiento de hidratación del óxido de propileno; este método adolece de varias desventajas asociadas a las grandes cantidades de agua consumida y a la generación de corrientes de residuos que contienen contaminantes ambientales (Saxena et al., 2010).

Respecto a la ruta biológica, se conocen amplios abanicos de microorganismos (tanto bacterias como levaduras) que producen 1.2-propanodiol i) a partir de azúcares conocidos, tales como glucosa o xilosa, que resultan metabolizados mediante la ruta de la glicólisis en dihidroxiacetona fosfato (DHAP) y después en metilglioxal, el precursor del 1.2-propanodiol (Bennett y San, 2001), o ii) a partir de desoxiazúcares (fucosa o ramnosa), tal como en E. coli, que conduce a la síntesis de (S)-1.2-propanodiol (Baldoma y Aguilar, 1988).

Clostridium sphenoides (Tran-Din y Gottschalk 1985) y Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum han sido descritos como los mejores productores naturales de 1.2-propanodiol; T. thermosaccharolyticum fue capaz de producir hasta 9 g/l de (R)-1.2-propanodiol a partir de glucosa, con un rendimiento de 0.47 moles/moles de glucosa consumida (Sánchez-Riviera et al. 1987).

Se llevó a cabo la manipulación metabólica de la ruta del 1.2-propanodiol en E. coli para forzar que las células produjesen 1.2-propanodiol a partir de azúcares comunes como la glucosa en lugar de desoxiazúcares. Una primera estrategia que combinaba i) la sobreexpresión de los enzimas clave implicados en la conversión de DHAP a 1.2-propanodiol, ii) con la eliminación de las rutas competidoras y iii) con una fermentación por lotes alimentados de glucosa resultó en una cepa manipulada de E. coli que producía 4.5 g/l de (R)-1.2-propanodiol, con un rendimiento de 0.45 moles/moles de glucosa consumida (Altaras y Cameron, 2000). Un estudio más reciente utilizó la introducción de modificaciones racionales clave en el metabolismo central para asociar el crecimiento y el consumo de glucosa a la ruta de 1.2-propanodiol a fin de favorecer la evolución metabólica in vivo (Meynial-Salles et al., 2005). Tras la evolución adaptativa bajo condiciones de cultivo apropiadas y reaislamiento de los clones evolucionados a partir de la población, la cepa manipulada evolucionada de E. coli A tpiA, ApflAB, AadhE, AldhA, AgloA, AaldA, AaldB Aedd, cultivada bajo condiciones por lotes en medio mineral con glucosa, produjo 1.8 g/l de 1.2-propanodiol con un rendimiento de 0.85 moles/moles.

Finalmente, se manipuló racionalmente E. coli para producir 1.2-propanodiol a partir de glicerol. En cultivo en fermentadores controlados, la cepa con mejor resultado fue capaz de producir 5.6 g/l de 1.2-propanodiol con un rendimiento de 0.25 moles/moles de glicerol consumido (Clomburg y González, 2011). También se demostró la producción de 1.2-propanodiol en glicerol en bruto generado en la industrial del biodiésel con un rendimiento equivalente al del glicerol puro.

4) Producción de etanol:

Se han aplicado varias técnicas de ingeniería metabólica y evolutiva al desarrollo de cepas eficientes productoras de etanol con un rendimiento y título elevados a partir de un amplio abanico de sustratos. Los organismos más estudiados son: i) Saccharomyces cerevisiae y Zymomonas mobilis que producen naturalmente etanol con un alto rendimiento y se han concentrado los esfuerzos en ampliar el abanico de sustratos, y ii) E. coli en el que los esfuerzos se han concentrado en la mejora del rendimiento de etanol (Girio et al. 2010). Ya se han obtenido cepas de E. coli B que producen anaeróbicamente hasta 45 g/l de etanol (Jarboe et al., 2007). Estas cepas se han construido mediante la mejora de la ruta endógena al etanol (evolución dirigida realizada en la piruvato deshidrogenasa) o introduciendo una ruta heteróloga compuesta de piruvato descarboxilasa y alcohol deshidrogenasa (de S. cerevisiae o Z. mobilis). En los mejores casos, se produjo etanol con rendimientos de 90% del máximo predicho, y estos enfoques ya han sido patentados (por ejemplo, Ingram et al., 1992, documento n° WO 9216615; Kim et al. 2007). La mala tolerancia de E. coli al etanol sigue siendo el factor principal que limita los títulos finales, y aparentemente está ligada en particular a la inhibición por el etanol de la piruvato descarboxilasa (Trinh et al., 2010).

En los últimos años, los esfuerzos se han concentrado en el desarrollo de cepas i) capaces de coutilizar azúcares C6 (glucosa, galactosa, etc.) y C5 (xilosa, arabinosa, etc.), los componentes presentes en los hidrolizados de biomasa lignocelulósica, o ii) que crecen sobre glicerol, una fuente de carbono económica y abundante. Por ejemplo, la sobreexpresión en E. coli K12 de tanto glicerol deshidrogenasa (glyDh) como la dihidroacetonacinasa (DHAK), dos enzimas específicos de la utilización del glicerol, ha permitido la producción de prácticamente 20 g/l de etanol a partir de glicerol en bruto durante la fermentación anaeróbica de pH controlado, con un rendimiento de 0.92 moles de etanol producido por cada mol de glicerol consumido (Cintolesi et al., 2012).

Finalmente, los rendimientos de fermentación de las tres mejores cepas manipuladas, E. coli KO11, Z. mobilis AX101 y S. cerevisiae 424A, se compararon sobre hidrolizados celulósicos (Lau et al., 2010). Los resultados indican que la ruta metabólica de E. coli KO101 y Z. mobilis resultó más eficaz para producir etanol a partir de azúcares consumidos que la ruta de S. cerevisiae 424A. Sin embargo, en ambas bacterias, el consumo de xilosa resultó fuertemente afectado en comparación con S. cerevisiae 424A, que fue capaz de utilizar tanto glucosa como xilosa a partir de hidrolizados celulósicos.

Descripción de la invención

De esta manera, la invención se refiere a un microorganismo tal como se define en las reivindicaciones.

La presente descripción da a conocer en una primera realización un microorganismo modificado que presenta actividad enzimática modulada de ferredoxina-NADP+ reductasa, en el que la actividad del polipéptido que presenta una identidad de por lo menos 70% respecto a la secuencia SEC ID n° 1 se atenúa o se potencia (“enhanced”).

Más particularmente, en dicha primera forma de realización, el microorganismo modificado que presenta actividad enzimática de ferredoxina-NADP+ reductasa es tal que la actividad del polipéptido que presenta una identidad de por lo menos 70% respecto a la secuencia SEC ID n° 1 se encuentra potenciada en comparación con el microorganismo no modificado.

El microorganismo modificado contiene o expresa un polipéptido que presenta una identidad de por lo menos 70% respecto a la secuencia SEC ID n° 1 y se caracteriza por que la actividad enzimática de ferredoxina-NADP+ reductasa de dicho polipéptido se encuentra potenciada en comparación con el microorganismo no modificado.

El polipéptido presenta una identidad de por lo menos 70%, particularmente de 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99%, o incluso de 100%, respecto a la secuencia SEC ID n° 1.

En una segunda forma de realización, la presente descripción da a conocer un microorganismo según la primera forma de realización con actividad enzimática de ferredoxina-NADP+ reductasa atenuada, en la que la expresión del gen nativo codificante del polipéptido que presenta una identidad de por lo menos 70% respecto a la secuencia SEC ID n° 1 se encuentra atenuada.

En una tercera forma de realización, la presente descripción da a conocer un microorganismo según la segunda forma de realización, en la que la producción de acetona y acetona se ha potenciado.

En una cuarta forma de realización, la presente descripción da a conocer un microorganismo según la primera forma de realización con actividad enzimática de ferredoxina-NADP+ reductasa potenciada, en la que un polinucleótido codificante del polipéptido que presenta una identidad de por lo menos 70% respecto a la secuencia SEC ID n° 1 se encuentra sobreexpresado.

En una quinta forma de realización, la presente descripción da a conocer un microorganismo según la cuarta forma de realización, en la que contiene por lo menos una modificación para producir etanol.

En una sexta forma de realización, la presente descripción da a conocer un microorganismo según la quinta forma de realización, en la que la modificación o modificaciones para producir etanol comprende:

• la potenciación de la expresión de por lo menos uno de los genes siguientes: pfor, fdx y udhA

• y/o

• la atenuación de la expresión de por lo menos uno de los genes siguientes: aceE, aceF, Ipd, pflA, pflB, poxB frdABCD, IdhA, mgsA, ackA, pta e iscR.

En una séptima forma de realización, la presente descripción da a conocer un microorganismo según la cuarta forma de realización, en la que contiene por lo menos una modificación para producir n-butanol.

En una octava forma de realización, la presente descripción da a conocer un microorganismo según la séptima forma de realización, en la que la modificación o modificaciones para producir n-butanol comprende:

• la potenciación de la expresión de por lo menos uno de los genes siguientes: pfor, fdx, atoB, hbd, crt, bcd, etfA, etfB, adhE2 y udhA,

• y/o

• la atenuación de la expresión de por lo menos uno de los genes siguientes: aceE, aceF, Ipd, pflA, pflB, frdABCD, adhE, IdhA, mgsA, ackA, pta e iscR

En una novena forma de realización, la presente descripción da a conocer un microorganismo según la cuarta forma de realización, en la que comprende por lo menos una modificación para producir 1,3-propanodiol a partir de glicerol.

En una décima forma de realización, la presente descripción da a conocer un microorganismo según la novena forma de realización, en la que la modificación o modificaciones para producir 1,3-propanodiol comprende:

• la potenciación de la expresión de por lo menos uno de los genes siguientes: pfor, fdx, pntAB, dhaB1, dhaB2 y yqhD

• y/o

• la atenuación de la expresión de por lo menos uno de los genes siguientes: aceE, aceF, lpd, poxB, ndh, aldA, aldB, ldhA, pflA, pflB, adhE, iscR, glpA y glpD.

Según una undécima forma de realización, la presente descripción da a conocer un microorganismo según la cuarta forma de realización, en la que comprende por lo menos una modificación para producir 1,2-propanodiol.

En una duodécima forma de realización, la presente descripción da a conocer un microorganismo según la undécima forma de realización, en la que la modificación o modificaciones para producir 1,2-propanodiol comprende:

• la atenuación de la expresión de por lo menos uno de los genes siguientes: ptsG, ptsH ptsl, crr, edd, eda, gloA, aceE, aceF, Ipd, aldA, aldB, IdhA, pflA, pflB, adhE, tpiA, gapA, pykA, pykF, ackA, pta, poxB, arcA y ndh,

• y/o

• la potenciación de la expresión de por lo menos uno de los genes siguientes: pfor, fd, pntAB, gapN, galP, glk, ppsA, mgsA, sadh, yqhD, yafB, ydhF, ycdW, yqhE, yeaE, yghZ, yajO, tas, ydjG, ydbC, gldA y fucO.

En una decimotercera forma de realización, la presente descripción da a conocer un método para modular la actividad enzimática de la ferredoxina-NADP+ reductasa en un microorganismo, en la que la actividad del polipéptido que presenta una identidad de por lo menos 70% respecto a la secuencia SEC ID n° 1 ha sido potenciada o atenuada en dicho microorganismo.

En una forma de realización particular, el porcentaje de identidad es de por lo menos 75%, de por lo menos 80%, de por lo menos 85%, de por lo menos 90%, de por lo menos 92%, de por lo menos 93%, de por lo menos 94%, de por lo menos 95%, de por lo menos 96%, de por lo menos 97%, de por lo menos 98%, de por lo menos 99% respecto a la secuencia SEC ID n° 1. En una forma de realización particular adicional, el polipéptido corresponde a SEC ID n° 1.

En una decimocuarta forma de realización, la presente descripción da a conocer un método según la decimotercera forma de realización, en la que la actividad enzimática de la ferredoxina-NADP+ reductasa se potencia mediante sobreexpresión de un polinucleótido codificante del polipéptido que presenta una identidad de por lo menos 70% respecto a la secuencia SEC ID n° 1.

La presente descripción da a conocer una decimoquinta forma de realización que se refiere a un método según la decimotercera forma de realización, en la que la actividad enzimática de la ferredoxina-NADP+ reductasa se atenúa mediante expresión de un polinucleótido codificante del polipéptido que presenta una identidad de por lo menos 70% respecto a la secuencia SEC ID n° 1.

Además, la presente descripción da a conocer una decimosexta forma de realización que se refiere a un método para preparar etanol, en el que el microorganismo según la quinta o sexta forma de realización se cultiva en un medio de cultivo apropiado que comprende una fuente de carbono y se recupera el etanol.

En una decimoséptima forma de realización, la presente descripción da a conocer un método para preparar nbutanol, en el que el microorganismo según la séptima u octava forma de realización se cultiva en un medio de cultivo apropiado que comprende una fuente de carbono y se recupera el n-butanol.

En una decimoctava forma de realización, la presente descripción da a conocer un método para preparar 1,3-propanodiol, en el que el microorganismo según la novena o décima forma de realización se cultiva en un medio de cultivo apropiado que comprende una fuente de carbono y se recupera el 1,3-propanodiol.

En una decimonovena forma de realización, la presente descripción da a conocer un método para preparar 1,2-propanodiol, en el que el microorganismo según la undécima o duodécima forma de realización se cultiva en un medio de cultivo apropiado que comprende una fuente de carbono y se recupera el 1,2-propanodiol.

Además, en la vigésima forma de realización, la presente descripción da a conocer la utilización de un microorganismo según la quinta o sexta forma de realización para producir etanol.

En la vigesimoprimera forma de realización, la presente descripción da a conocer la utilización de un microorganismo según la séptima u octava forma de realización para producir n-butanol.

Además, en la vigesimosegunda forma de realización, la presente descripción da a conocer la utilización de un microorganismo según la novena o décima forma de realización para producir 1,3-propanodiol.

Finalmente, la presente descripción da a conocer, en la vigesimotercera forma de realización, la utilización de un microorganismo según la undécima o duodécima forma de realización para producir 1,2-propanodiol.

La presente descripción da a conocer un polipéptido aislado que presenta actividad enzimática de ferredoxina-NADP+ reductasa que comprende la secuencia SEC ID n° 1, o un fragmento o secuencia homóloga de la misma.

La presente descripción da a conocer un polipéptido que presenta una identidad de por lo menos 70% respecto a la secuencia SEC ID n° 1 que presenta actividad enzimática de ferredoxina-NADP+ reductasa.

La presente descripción da a conocer la utilización de un polipéptido que presenta una identidad de por lo menos 70% respecto a la secuencia SEC ID n° 1 para la reducción de NADP+ utilizando electrones procedentes de la ferredoxina reducida en un microorganismo o en el medio de cultivo de un microorganismo.

La presente descripción da a conocer un polinucleótido que comprende una secuencia codificante de dicho polipéptido. Los inventores informan de la identificación de un gen de C. acetobutylicum codificante de una proteína que presenta una actividad de ferredoxina-NADP+ reductasa. Dicho gen se conocía anteriormente como gen CA_C0764 anotado como codificante de una subunidad pequeña potencial de la glutamato sintasa (Nolling et al., 2001). La glutamato sintasa (GOGAT) son proteínas heterodiméricas compuestas de una subunidad alfa grande y una subunidad beta pequeña que cataliza la conversión dependiente de NAD(P)H de alfa-cetoglutarato en glutamato. Dicha proteína ha sido purificada a partir de Clostridium pasteurianum (Singhal RK et al., 1989) y Bacillus subtilis (Matsuoka K. y Kimura K., 1986), y se ha mostrado que es una flavoproteína de hierro-azufre compleja (Vanoni M. y Curti B., 1999). No se ha informado en la literatura de ninguna asociación de la glutamato sintasa con la actividad de la ferredoxina-NADP+ reductasa.

La presente descripción da a conocer un casete de expresión que comprende dicho polinucleótido bajo el control de elementos reguladores funcionales en una célula hospedadora y un vector de transformación que comprende dicho casete o dicho polinucleótido.

La presente descripción da a conocer un microorganismo modificado que presenta actividad enzimática modulada de ferredoxina-NADP+ reductasa, en el que se atenúa o se potencia la actividad del polinucleótido de la invención.

Es un objetivo de la presente invención utilizar los nuevos conocimientos de un gen codificante de la proteína ferredoxina-NADP+ reductasa de C. acetobutylicum para diseñar microorganismos con actividad de ferredoxina-NADP+ reductasa potenciada y nuevas rutas metabólicas para la producción de etanol, n-butanol, 1,3-propanodiol o 1,2-propanodiol. Dichos microorganismos utilizan nuevas rutas metabólicas para convertir i) glucosa en etanol, n-butanol o 1,2-propanodiol, y ii) glicerol en 1,3-propanodiol. En determinadas formas de realización de la invención, microorganismos con actividad potenciada de la ferredoxina-NADP+ reductasa son modificados adicionalmente para potenciar: i) la actividad transhidrogenasa soluble para la producción de etanol o n-butanol con un rendimiento elevado, o ii) la transhidrogenasa unida a membrana para la producción de 1,3-propanodiol o 1,2-propanodiol con un rendimiento elevado. Adicionalmente, se proporciona un método para preparar etanol, nbutanol, 1,3-propanodiol o 1,2-propanodiol, en el que dichos microorganismos se cultivan en medio de cultivo apropiado y se recupera etanol, n-butanol, 1,3-propanodiol o 1,2-propanodiol.

También es un objetivo de la descripción utilizar los nuevos conocimientos de un gen codificante de la proteína ferredoxina-NADP+ reductasa de C. acetobutylicum para diseñar microorganismos con actividad de ferredoxina-NADP+ reductasa atenuada que resulta útil para la producción de acetona. La atenuación de dicho gen codificante de la ferredoxina-NADP+ reductasa proporciona una cepa de C. acetobutylicum capaz de producir butanol con un rendimiento más bajo y acetona con un rendimiento más alto, incrementando por lo tanto la productividad de acetona del procedimiento. Se proporciona un método para preparar acetona, en el que dichos microorganismos se cultivan en medio de cultivo apropiado y se recupera acetona.

La presente descripción da a conocer un método para modular la actividad enzimática de la ferredoxina-NADP+ reductasa en un microorganismo, en el que se atenúa o se potencia la actividad del polinucleótido de la invención en dicho microorganismo.

Descripción detallada de la invención

SEC ID n°1:

MDNPNLLSEEANRCLLCKNPRCKANCPINTPIPEIISLYKEGKIMEAGEILFNNNPLSVICSL

V CIHEDQCKGN C VRGIKSEPIKFHEIEEEIS EKYLKE AKLKN V QKDKDR1 AI VGGGP AGITV

AFVLANKGYNVTIFEAHDKIGGVLRYGIPEYRLTKKLVDKLEERLIEVGVKIRPNTVIGPVI

SLDRLLEDSYKAVFIGTGVWNPKTLDVKGETLGNVHFAIDYLKSPESYRLGKKVAVTGAG

NVAMDAARTAKRNGAEVTILYRKSFNEMPASKQEIRETKEDGVEFKLFRAPIEITEEGIKV

AFTEN VTDAEGKIRTKIIEGKEEFFECD SV W A V SQ APKDNIV SNTTGLDTKWGLIVTDEK

GNTTKKGTFACGDVVTGAKTVVEAAAQAKVVAETIDEYCKNN

Tal como se utiliza en la presente memoria, los términos siguientes pueden utilizarse para la interpretación de las reivindicaciones y especificación.

Según la invención, el término "polipéptido" se refiere a un péptido o proteína que comprende una secuencia de dos o más aminoácidos unidos con enlaces peptídicos.

El término "aislado" se refiere a una secuencia de proteína o ADN que se separa de por lo menos un componente con el que se encuentra naturalmente asociado.

La expresión "ferredoxina-NADP+ reductasa" se refiere a un polipéptido responsable de una actividad enzimática que cataliza la reducción de NADP+ utilizando electrones procedentes de la ferredoxina reducida. Dicha actividad enzimática fue descrita en C. acetobutylicum por Vasconcelos et al. (1994), proporcionando métodos para medir dicha actividad enzimática.

Las expresiones "actividad de enzima" y "actividad enzimática" se utilizan intercambiablemente y se refieren a la capacidad de un enzima de catalizar una reacción química específica, por ejemplo la reducción de NADP+ utilizando electrones procedentes de la ferredoxina reducida para la actividad enzimática de la ferredoxina-NADP+ reductasa.

El polipéptido aislado de la presente descripción puede obtenerse de microorganismos que presentan actividad de ferredoxina-NADP+ reductasa, por ejemplo mediante la utilización del procedimiento de purificación tal como se indica en los ejemplos, posteriormente. Entre los microorganismos que pueden utilizarse para aislar el polipéptido se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, C. acetobutylicum.

La expresión "que comprende la secuencia SEC ID n° 1" se refiere a que la secuencia de aminoácidos del polipéptido puede no estar estrictamente limitada a SEC ID n° 1 sino que puede contener aminoácidos adicionales. La expresión "un fragmento de SEC ID n° 1" se refiere a que la secuencia del polipéptido puede incluir menos aminoácidos que SEC ID n° 1, aunque todavía suficientes aminoácidos para conferir actividad de ferredoxina-NADP+ reductasa. Es bien conocido en la técnica que puede modificarse un polipéptido mediante sustitución, inserción, eliminación y/o adición de uno o más aminoácidos, conservando simultáneamente su actividad enzimática. Por ejemplo, son comunes las sustituciones de un aminoácido en una posición dada por un aminoácido químicamente equivalente que no afecte a las propiedades funcionales de una proteína. En el contexto de la presente invención, las sustituciones se definen como intercambios dentro de uno de los grupos siguientes:

■ Residuos alifáticos, no polares o ligeramente polares pequeños: Ala, Ser, Thr, Pro, Gly

■ Residuos polares con carga negativa, y sus amidas: Asp, Asn, Glu, Gln

■ Residuos polares con carga positiva: His, Arg, Lys

■ Residuos no polares alifáticos grandes: Met, Leu, Ile, Val, Cys

■ Residuos aromáticos grandes: Phe, Tyr, Trp.

De esta manera, puede esperarse que cambios que resultan en la sustitución de un residuo con carga negativa por otro (tal como ácido glutámico por ácido aspártico) o un residuo con carga positiva por otro (tal como lisina o arginina) produzcan un producto funcionalmente equivalente.

Las posiciones en las que se modifican los aminoácidos y el número de aminoácidos sujetos a modificación en la secuencia de aminoácidos no se encuentran particularmente limitados. El experto en la materia es capaz de reconocer las modificaciones que pueden introducirse sin afectar a la actividad de la proteína. Por ejemplo, las modificaciones en la parte N-terminal o C-terminal de una proteína no se esperaría que alterasen la actividad de la proteína.

El término "homólogo" se refiere a polipéptidos sometidos a modificaciones tales como las definidas anteriormente, aunque conservando la actividad enzimática original.

En una forma de realización específica de la invención, el polipéptido de la presente invención presenta una identidad de por lo menos 70% respecto a la secuencia SEC ID n° 1, preferentemente una identidad de por lo menos 80% y más preferentemente de por lo menos 90%.

Los métodos para la determinación del porcentaje de identidad entre las dos secuencias de proteína son conocidos por el experto en la materia. Por ejemplo, puede llevarse a cabo después de la alineación de las secuencias mediante la utilización del software CLUSt a Lw , disponible en el sitio de intemet http://www.ebi.ac.uk/clustalw/ con los parámetros por defecto indicados en el sitio de internet. A partir de la alineación, puede realizarse fácilmente el cálculo del porcentaje de identidad mediante el registro del número de residuos idénticos en la misma posición en comparación con el número total de residuos. Alternativamente, puede realizarse el cálculo automático mediante la utilización de, por ejemplo, los programas BLAST, disponibles en el sitio de internet http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ con los parámetros por defecto indicados en el sitio de internet.

En una forma de realización específica, el polipéptido comprende por lo menos 100 aminoácidos contiguos de la secuencia SEC ID n° 1, preferentemente por lo menos 150, por lo menos 200, por lo menos 250, por lo menos 300, por lo menos 350 o más preferentemente por lo menos 400 aminoácidos contiguos de la secuencia mostrada en s Ec ID n° 1. En otra forma de realización de la invención, el polipéptido presenta una secuencia polipeptídica estrictamente idéntica a la secuencia SEC ID n° 1.

La presente descripción da a conocer un polinucleótido que comprende una secuencia codificante del polipéptido de la invención.

El término "polinucleótido" se refiere a un polímero de ribonucleótidos (o ARN) o a un polímero de desoxirribonucleótidos (o ADN), es decir, de cadena sencilla o de doble cadena, que contiene opcionalmente bases nucleótidas sintéticas, no naturales o alteradas. Un polinucleótido aislado en forma de ADN puede contener uno o más segmentos de ADN sintético, ADN genómico o ADNc.

El origen del polinucleótido no es necesariamente el organismo en el que se ha medido originalmente la actividad enzimática. La hibridación bajo condiciones de astringencia con una sonda que comprende la secuencia de nucleótidos SEC ID n° 2 puede ser utilizada para cribar una biblioteca génica para dichos polinucleótidos por el experto en la materia. Los protocolos detallados de hibridación se dan a conocer en Sambrook et al. (1989). Las secuencias de dichos polinucleótidos pueden extraerse de las bases de datos utilizando, por ejemplo, los programas BLAST definidos anteriormente y buscando homologías con la secuencia de nucleótidos s Ec ID n° 2.

SEC ID n° 2:

ATGGATAACCCTAATTTATTGTCAGAAGAGGCAAACAGATGCCTACTATGCAAAAACC CTAGATGTAAAGCAAATTGCCCTATTAATACACCCATACCAGAAATTATAAGCCTTTA TAAAGAAGGAAAAATTATGGAAGCAGGAGAAATTTTATTTAATAACAATCCTCTTTCA GTAATATGCTCATTGGTCTGTATTCATGAGGATCAATGTAAGGGAAATTGTGTAAGAG GAATAAAAAGCGAGCCAATAAAATTTCACGAGATAGAAGAAGAGATATCAGAGAAGT ACTTAAAAGAGGCCAAGCTTAAGAATGTTCAGAAGGACAAGGATAGAATTGCAATAG TTGGAGGAGGTCCAGCAGGAATCACAGTTGCATTTGTACTTGCTAATAAAGGCTATAA TGTTACCATTTTTGAGGCTCACGATAAAATAGGAGGAGTACTTAGATATGGTATTCCA GAGTATAGATTGACTAAGAAATTAGTGGATAAGCTTGAAGAAAGACTTATAGAGGTTG GAGTGAAAATTAGACCTAATACTGTTATTGGACCAGTTATTTCTTTGGACAGGTTACTT

GAAGATTCATATAAGGCAGTATTTATTGGAACTGGAGTATGGAATCCAAAAACCTTAG

ATGTAAAGGGAGAAACTTTAGGAAATGTTCATTTTGCTATTGATTATTTAAAATCTCCT GAAAGCTATAGATTAGGAAAAAAAGTAGCTGTAATAGGAGCAGGTAATGTTGCCATG GATGCTGCAAGAACTGCTAAGAGAAATGGTGCTGAGGTAACAATACTTTATAGAAAA AGCTTTAATGAGATGCCAGCATCAAAACAAGAAATAAGAGAAACTAAAGAAGATGGA GTAGAGTTTAAATTATTTAGAGCACCAATTGAAATAACAGAAGAGGGTATTAAAGTAG CATTTACAGAAAATGTTACAGATGCAGAAGGAAAAATAAGAACTAAAATTATTGAAG

GGATAATATAGTATCTAATACAACAGGCTTAGATACTAAATGGGGATTAATAGTAACA GATGAAAAAGGCAATACAACTAAAAAAGGAACCTTTGCATGTGGAGATGTAGTTACA GGAGCAAAAACTGTAGTTGAAGCTGCAGCACAAGCAAAAGTAGTTGCAGAAACTATT GATGAGTATTGCAAGAATAATTAA.

Los polinucleótidos preferidos son polinucleótidos que son idénticos por lo menos 80% a la secuencia de nucleótidos SEC ID n° 2. Los polinucleótidos más preferentes son polinucleótidos que son idénticos por lo menos 90% a la secuencia de nucleótidos SEC ID n° 2. Los polinucleótidos todavía más preferidos son polinucleótidos que son idénticos por lo menos al 95% a la secuencia de nucleótidos SEC ID n° 2.

En particular, el polinucleótido comprende la secuencia de nucleótidos SEC ID n° 2.

El término "codificante" se refiere al procedimiento por el que un polinucleótido, mediante los mecanismos de transcripción y traducción, produce una secuencia de aminoácidos. Dicho procedimiento lo permite el código genético, que es la relación entre la secuencia de bases en el ADN y la secuencia de aminoácidos en las proteínas. Una característica principal del código genético es que está degenerado, es decir, un aminoácido puede estar codificado por más de un triplete de bases (un "codón"). La consecuencia directa es que la misma secuencia de aminoácidos puede estar codificada por diferentes polinucleótidos. A título de ejemplo, las secuencias polinucleótidas derivadas de SEC ID n° 2 por degeneración del código genético también pueden codificar la secuencia polipeptídica SEC ID n° 1 y, por lo tanto, se encuentran contempladas en la presente invención. Es bien conocido por el experto en la materia que la utilización de codones puede variar según los organismos. Entre los codones codificantes del mismo aminoácido, algunos pueden ser utilizados preferentemente por un microorganismo dado. De esta manera, puede resultar de interés el diseño de un polinucleótido adaptado al uso de codones de un microorganismo particular a fin de optimizar la expresión de la proteína correspondiente en dicho organismo.

La presente invención se refiere además a un casete de expresión que comprende el polinucleótido de la invención bajo el control de elementos reguladores funcionales en un microorganismo hospedador.

El término "expresión" se refiere a la transcripción y traducción de una secuencia génica que conduce a la generación de la proteína correspondiente, producto del gen.

La expresión "casete de expresión" se refiere a un polinucleótido preferentemente unida con elementos reguladores, tales como promotores, intensificadores, sitio de unión ribosómica o terminador que permite la expresión del gen contenido en el polinucleótido dentro de un organismo hospedador adecuado. Dichos elementos reguladores pueden ser los elementos reguladores propios del gen, aunque también elementos modificados o sintéticos, que permiten una expresión más fuerte del gen. Por ejemplo, puede conseguirse una expresión más fuerte mediante la sustitución del promotor nativo del gen por promotores más fuertes. En E. coli, dichos promotores son, por ejemplo, el promotor lac, el promotor tac, el promotor trc, el promotor lambda cI y los promotores GI (Meynial-Salles et al., 2005, Soucaille et al. 2012). Para otros organismos, el experto en la materia puede tener la posibilidad de seleccionar el promotor mejor adaptado.

La expresión "microorganismo hospedador" se refiere a un microorganismo capaz de recibir genes foráneos o heterólogos o copias adicionales de sus propios genes y capaces de expresar dichos genes para producir un producto proteico activo.

La presente descripción da a conocer un vector de transformación que comprende el polinucleótido o el casete según la descripción.

El término "transformación" se refiere a la introducción de nuevos genes o copias adicionales de genes existentes en un organismo hospedador. Los genes adquiridos pueden incorporarse en ADN cromosómico o introducirse en forma de elementos extracromosómicos. A título de ejemplo, en E. coli, un método para transferir el ADN al interior de un organismo hospedador es la electroporación.

La expresión "vector de transformación" se refiere a cualquier vehículo utilizado para introducir un polinucleótido en un organismo hospedador. Dicho vehículo puede ser, por ejemplo, un plásmido, un fago u otros elementos conocidos por el experto en la materia según el organismo utilizado. El vector de transformación habitualmente contiene además del polinucleótido o del casete de expresión, otros elementos para facilitar la transformación de una célula hospedadora particular. Un vector de expresión comprende un casete de expresión que permite la expresión adecuada del gen transportado por el casete y elementos adicionales que permiten la replicación del vector en el organismo hospedador. Puede encontrarse presente un vector de expresión en una única copia en el organismo hospedador o en múltiples copias.

La presente descripción da a conocer un microorganismo modificado que presenta actividad enzimática modulada de ferredoxina-NADP+ reductasa, en el que se atenúa o se potencia la actividad del polipéptido de la invención.

La expresión "atenuación de la actividad de un enzima" se refiere a una reducción de la actividad del enzima de interés, en comparación con la actividad observada en el mismo microorganismo antes de cualquier modificación. El experto en la materia conoce numerosos medios para obtener dicho resultado, y por ejemplo:

• introducción de una mutación del gen, reducir el nivel de expresión de dicho gen o el nivel de actividad de la proteína codificada.

• Sustitución del promotor natural del gen por un promotor débil, que resulta en una menor expresión.

• Utilización de elementos que desestabilizan el ARN mensajero correspondiente o la proteína.

• Eliminación del gen en el caso de que se requiere una expresión nula.

Una "actividad enzimática incrementada" o una "actividad enzimática potenciada" se refiere a que la actividad es superior a la actividad original medida en el mismo microorganismo antes de cualquier modificación. El microorganismo no modificado correspondiente es un microorganismo que presenta las mismas características del microorganismo modificado excepto por la actividad enzimática considerada. Ventajosamente, la actividad se incrementa en por lo menos 50%, preferentemente en por lo menos 100% respecto a la actividad nativa del microorganismo no modificado correspondiente. Un método para medir la actividad de la ferredoxina-NADP+ reductasa se proporciona en el ejemplo 1, posteriormente.

Más particularmente, la expresión "potenciada" o "actividad enzimática potenciada" se refiere a que la actividad enzimática es superior a la que se produce naturalmente en un microorganismo que se encuentra no modificado o no transformado (es decir, actividad enzimática que se produce naturalmente en un microorganismo en ausencia de manipulación directa o indirecta de dicha actividad/microorganismo por parte del ser humano). Lo anterior puede aplicarse a un microorganismo no modificado que muestra o no alguna actividad enzimática antes de la modificación.

La expresión "actividad potenciada" en relación a una cepa modificada que posee actividad de ferredoxina-NADP+ reductasa (naturalmente, antes de la modificación) se refiere a un incremento de la actividad enzimática que es superior al margen de error inherente a la técnica de medición, preferentemente un incremento de aproximadamente 1.2 veces, 1.5 veces, particularmente 2 veces o superior de la actividad del microorganismo de tipo salvaje (es decir, la actividad del enzima del microorganismo no modificado), más preferentemente un incremento de aproximadamente 3 veces o superior, y lo más preferentemente un incremento de aproximadamente 5 veces o superior.

En el caso de que el microorganismo no modificado no contenga ninguna actividad de ferredoxina-NADP+ reductasa antes de su modificación, la "actividad potenciada" corresponde a la expresión de dicha actividad a un nivel detectable tras la modificación que conduce a la obtención del microorganismo modificado de la invención, resultando suficiente dicho nivel detectable para orientar el metabolismo del microorganismo modificado.

El término "modificación" o "transformación" se refiere a un procedimiento para introducir ADN heterólogo en una célula bacteriana. Se entiende que las células bacterianas transformadas o modificadas comprenden no sólo el producto final de un procedimiento de transformación, sino también progenie transgénica o modificada de las mismas.

El término "modificado" o "transformado" o "recombinante" se refiere a un organismo hospedador, tal como una bacteria, en la que se ha introducido una molécula de ácido nucleico heterólogo.

La molécula de ácido nucleico puede integrarse establemente en el genoma del hospedador o la molécula de ácido nucleico también puede encontrarse presente en forma de una molécula extracromosómica. Dicha molécula extracromosómica puede ser autorreplicante.

Una célula hospedadora "no transformada", "no modificada" o "no recombinante" se refiere a un organismo de tipo salvaje, por ejemplo, una bacteria, que no contiene ninguna molécula de ácido nucleico heterólogo.

Porcentaje de identidad: la expresión "porcentaje de identidad" en el contexto de dos secuencias de ácido nucleico o proteína, se refiere a dos o más secuencias o subsecuencias que presentan una identidad de, por ejemplo, 60%, preferentemente de 70%, más preferentemente de 80%, todavía más preferentemente de 90%, aún todavía más preferentemente de 95%, y lo más preferentemente de por lo menos 99% de residuos nucleótidos o aminoácidos, en la comparación y alineación para máxima correspondencia, según la medición con los algoritmos de comparación de secuencias siguientes o según la inspección visual.

Preferentemente, el porcentaje de identidad existe en una región de las secuencias que presenta una longitud de por lo menos aproximadamente 50 residuos, más preferentemente en una región de por lo menos aproximadamente 100 residuos, y lo más preferentemente el porcentaje de identidad existe a lo largo de por lo menos aproximadamente 150 residuos. En una forma de realización especialmente preferida, el porcentaje de identidad existe a lo largo de la longitud entera de las regiones codificantes.

Para una comparación de las secuencias, típicamente una secuencia actúa como una secuencia de referencia con la que se comparan las secuencias de ensayo. Al utilizar un algoritmo de comparación de secuencias, se introducen las secuencias de ensayo y de referencia en un ordenador, se fijan las coordenadas de la subsecuencia, en caso necesario, y se fijan los parámetros del programa de algoritmo de secuencias. A continuación, el algoritmo de comparación de secuencias calcula el porcentaje de identidad o similitud de la secuencia o secuencias respecto a la secuencia de referencia, basándose en los parámetros designados del programa.

El microorganismo según la presente descripción se selecciona de entre el grupo que consiste en bacterias, levaduras y hongos. Preferentemente, la bacteria se selecciona de entre el grupo que consiste en Clostridiaceae, Cyanobacteriaceae, Enterobacteriaceae, Bacillaceae, Streptomycetaceae, Pseudomonaceae y Corynebacteriaceae. Más preferentemente, la bacteria se selecciona del grupo que consiste en Clostridium acetobutylicum, Thermoanaerobacterium saccharolyticum, Clostridium thermocellum, Synecchococcus elongatus, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Lactobacillus brevis, Pseudomonas putida y Corynebacterium glutamicum. Preferentemente, la levadura es Saccharomyces cerevisiae.

La presente descripción da a conocer un microorganismo con actividad potenciada de ferredoxina-NADP+ reductasa, en el que la expresión del gen nativo codificante del polipéptido de la invención se ha potenciado. Lo anterior se obtiene preferentemente mediante la introducción de un promotor fuerte cadena arriba de la secuencia codificante del gen nativo.

Adicionalmente, pueden modificarse otros elementos reguladores del gen. Por ejemplo, las mutaciones adecuadas que pueden ser seleccionadas por el experto en la materia en la región cadena arriba del gen (codón inicial y sitio de unión ribosómica) pueden resultar en una expresión incrementada. Además, puede introducirse un promotor inducible a fin de activar/desactivar la expresión del gen cuando se desea.

En una forma de realización preferida, se encuentra presente un promotor fuerte cadena arriba de la secuencia codificante del gen nativo codificante del polipéptido según la invención.

También es un objetivo de la presente invención proporcionar un microorganismo con actividad potenciada de ferredoxina-NADP+ reductasa, en el que el polinucleótido de la invención se sobreexpresa.

Preferentemente, la sobreexpresión se consigue mediante transformación del organismo con el vector de la invención o mediante integración del polinucleótido o el casete de la invención en el cromosoma del organismo.

Puede introducirse una única copia o múltiples copias el gen transportado por vectores de expresión o integrado en el cromosoma, a fin de modular la sobreexpresión. Además, pueden utilizarse diferentes tipos de promotores que inducen un nivel diferente de expresión del gen.

La posición adecuada en el cromosoma para la inserción del nuevo gen puede ser seleccionada por el experto en la materia. Dicha posición (o locus) no debería afectar a las funciones esenciales del organismo hospedador. Los métodos para la integración de un gen en el cromosoma de un organismo hospedador se dan a conocer en, por ejemplo, Sambrook et al. (1989).

La presente descripción da a conocer un microorganismo con actividad potenciada de ferredoxina-NADP+ reductasa, que se modifica adicionalmente para producir etanol, n-butanol, 1,3-propanodiol y 1,2-propanodiol mediante nuevas rutas metabólicas.

En una forma de realización específica, se introducen modificaciones en el microorganismo con actividad potenciada de ferredoxina-NADP+ reductasa específicamente para la producción de etanol mediante una nueva ruta metabólica (figura 1).

Preferentemente, se incrementan las actividades de la piruvato ferredoxina oxidorreductasa y de la transhidrogenasa soluble. El método preferente es la sobreexpresión de los genes pfor (CA_C2229) y fdx (CA_C0303) codificantes de la piruvato ferredoxina oxidorreductasa y la ferredoxina, respectivamente, y el gen udhA codificante de la transhidrogenasa soluble. Adicionalmente, se incrementa la actividad de las proteínas de ensamblaje del agregado Fe-S, IscS, IscU e IscA, a fin de mejorar el ensamblaje de [4Fe-4S] en Pfor y Fdx para incrementar las actividades de la piruvato ferredoxina oxidorreductasa y de la transhidrogenasa soluble. Lo anterior puede conseguirse mediante la atenuación del gen iscR, codificante del factor IscR, responsable de la represión del operón isc. Además, puede introducirse una o varias mutaciones en los genes pfor, fdx or udhA para incrementar las actividades de piruvato ferredoxina oxidorreductasa y de transhidrogenasa soluble bajo las condiciones de cultivo utilizadas.

El otro gen cuya expresión puede potenciarse ventajosamente es adhE, codificante de una deshidrogenasa bifuncional de acetaldehído y etanol.

En otra forma de realización de la invención, se atenúa la actividad enzimática de la metilglioxal sintasa, el primer enzima de la derivación del metilglioxal, codificado por el gen mgsA.

Preferentemente, en el microorganismo según la invención, se atenúan algunas actividades enzimáticas que participan en las rutas de formación de producto secundario a fin de incrementar el rendimiento de etanol.

• la actividad de piruvato formato liasa, responsable de la síntesis de acetil-CoAy formato a partir de piruvato, codificada por los genes pflA y pflB;

• la actividad de piruvato deshidrogenasa, responsable de la síntesis de acetil-CoA y NADH partir de piruvato, codificada por los genes aceE, aceF y Ipd; la actividad de fumarato reductasa, responsable de la síntesis de succinato a partir de fumarato, codificada por el operón frdABCD;

• la actividad de lactato deshidrogenasa, responsable de la síntesis de lactato a partir de piruvato, codificada por el gen ldhA;

• las actividades de fosfotransacetilasa y acetato cinasa, responsables de la síntesis de acetato en dos etapas a partir de acetil-CoA, codificadas por los genes pta y ackA, respectivamente;

• la actividad de piruvato oxidasa, responsable de la síntesis de acetato en una etapa a partir de piruvato, codificada por el gen poxB.

Preferentemente, la atenuación de la actividad de obtiene mediante la atenuación de por lo menos uno de dichos genes.

Preferentemente, el microorganismo diseñado para producir etanol mediante dicha nueva ruta metabólica se selecciona de entre bacterias, levaduras u hongos. Más preferentemente, el microorganismo se selecciona de entre Enterobacteriaceae, Cyanobacteriaceae, Bacillaceae, Clostridiaceae, Streptomycetaceae, Pseudomonaceae y Corynebacteriaceae. Todavía más preferentemente, el microorganismo es de la especie Escherichia coli, Synecchococcus elongatus, Bacillus subtilis, Lactobacillus brevis, Pseudomonas putida, Clostridium acetobutylicum, Thermoanaerobacterium saccharolyticum, Clostridium thermocellum, o Corynebacterium glutamicum. Preferentemente, la levadura es Saccharomyces cerevisiae.

En otra forma de realización específica de la invención, se introducen modificaciones en el microorganismo con actividad potenciada de ferredoxina-NADP+reductasa potenciada específicamente para la producción de n-butanol mediante una nueva ruta metabólica (figura 2).

Preferentemente, se incrementan las actividades de piruvato ferredoxina oxidorreductasa, tiolasa, p-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa, crotonasa, butiril-CoA deshidrogenasa, butiraldehído deshidrogenasa, butanol deshidrogenasa y transhidrogenasa soluble. El método preferido es la sobreexpresión de los genes pfor (CA_C2229), fdx (CA_C0303) codificantes de la piruvato ferredoxina oxidorreductasa y ferredoxina, respectivamente; el gen atoB codificante de tiolasa, el gen hbd (CA_C2708) codificante de la p-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa, el gen crt (CA_C2712) codificante de crotonasa, los genes bcd (CA_C2711), etfA (CA_C2709) y etfB (CA_C2710) codificantes del complejo de butiril-CoA deshidrogenasa, el gen adhE2 (cap035) codificante de la deshidrogenasa bifuncional de butiraldehído y butanol, y el gen udhA codificante de transhidrogenasa soluble. Adicionalmente, se incrementa la actividad de las proteínas de ensamblaje del agregado Fe-S, IscS, IscU e IscA, a fin de mejorar el ensamblaje de [4Fe-4S] en Pfor y Fdx para incrementar las actividades de la piruvato ferredoxina oxidorreductasa y de la transhidrogenasa soluble. Lo anterior puede conseguirse mediante la atenuación del gen iscR, codificante del factor IscR, responsable de la represión del operón isc. Además, puede introducirse una o varias mutaciones en los genes pfor, fdx, atoB, hbd, crt, bcd, etfA, etfB, adhE2 o udhA para incrementar las actividades de piruvato ferredoxina oxidorreductasa, tiolasa, p-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa, crotonasa, butiril-CoA deshidrogenasa, butiraldehído deshidrogenasa, butanol hidrogenasa o transhidrogenasa soluble bajo las condiciones de cultivo utilizadas.

Preferentemente, en el microorganismo según la invención, se atenúan algunas actividades enzimáticas que participan en las rutas de formación de producto secundario a fin de incrementar el rendimiento de n-butanol.

• la actividad de piruvato formato liasa, responsable de la síntesis de acetil-CoA y formato a partir de piruvato, codificada por los genes pflA y pflB;

• la actividad de alcohol-aldehído deshidrogenasa, responsable de la síntesis de etanol a partir de acetil-CoA, codificada por el gen adhE.

Preferentemente, el microorganismo diseñado para producir n-butanol mediante dicha nueva ruta metabólica se selecciona de entre bacterias, levaduras u hongos. Más preferentemente, el microorganismo se selecciona de entre Enterobacteriaceae, Cyanobacteriaceae, Bacillaceae, Clostridiaceae, Streptomycetaceae, Pseudomonaceae y Corynebacteriaceae. Todavía más preferentemente, el microorganismo es de la especie Escherichia coli, Synecchococcus elongatus, Lactobacillus brevis, Pseudomonas putida, Bacillus subtilis, Clostridium acetobutylicum, Thermoanaerobacterium saccharolyticum, Clostridium thermocellum o Corynebacterium glutamicum. Preferentemente, la levadura es Saccharomyces cerevisiae.

En otra forma de realización específica de la invención, se introducen modificaciones en el microorganismo con actividad de ferredoxina-NADP+ reductasa potenciada específicamente para la producción de 1,3-propanodiol mediante una nueva ruta metabólica (figura 3).

Preferentemente, se incrementan las actividades de piruvato ferredoxina oxidorreductasa, glicerol deshidratasa independiente de B12, 1,3-propanodiol deshidrogenasa dependiente de NADP+ y transhidrogenasa unida a membrana. El método prefererido es la sobreexpresión de los genes pfor (CA_C2229) y fdx (CA_C0303) codificantes de piruvato ferredoxina oxidorreductasa y ferredoxina, los genes dhaBI y dhaB2 codificantes de glicerol deshidratasa y enzima activador de glicerol deshidratasa (Sarcabal et al, 1999), el gen yqhD codificante de 1,3-propanodiol dehsidrogenasa y genes pntAB codificantes de la transhidrogenasa unida a membrana. Adicionalmente, se incrementa la actividad de las proteínas de ensamblaje del agregado Fe-S, IscS, IscU e IscA, a fin de mejorar el ensamblaje de [4Fe-4S] en Pfor y Fdx para incrementar la actividad de la piruvato ferredoxina oxidorreductasa. Lo anterior puede conseguirse mediante la atenuación del gen iscR, codificante del factor IscR, responsable de la represión del operón isc. Además, puede introducirse una o varias mutaciones en los genes pfor, fdx, dhaBI, dhaB2, yqhD y pntAB para incrementar las actividades de piruvato ferredoxina oxidorreductasa, glicerol deshidratasa, 1,3-propanodiol deshidrogenasa dependiente de NADP+ y transhidrogenasa unida a membrana, bajo las condiciones de cultivo utilizadas.

Otros genes cuya expresión puede potenciarse ventajosamente son los siguientes: ack y pta, codificantes de acetato cinasa y fosfotransacetilasa, respectivamente.

En otra forma de realización de la invención, se atenúa el enzima transhidrogenasa soluble que participa en la oxidación de NADPH para producir NADH codificado por el gen udhA.

Preferentemente, en el microorganismo según la invención, se atenúan algunas actividades enzimáticas que participan en las rutas de formación de producto secundario a fin de incrementar el rendimiento de 1,3-propanodiol:

• la actividad de lactato deshidrogenasa, responsable de la síntesis de lactato a partir de piruvato, codificada por el gen IdhA;

• la actividad de piruvato oxidasa, responsable de la síntesis de acetato en una etapa a partir de piruvato, codificada por el gen poxB;

• la actividad de alcohol-aldehído deshidrogenasa, responsable de la síntesis de etanol a partir de acetil-CoA, codificada por el gen adhE;

• las actividades de aldehído deshidrogenasa, responsables de la síntesis de hidroxipropionato a partir de hidroxipropionaldehído codificado por los genes aldA y aldB;

• la glicerol-3-fosfato deshidrogenasa anaeróbica, responsable de la síntesis de dihidroxiacetona fosfato a partir de glicerol-3-fosfato codificado por el gen glpA;

• la glicerol-3-fosfato deshidrogenasa aeróbica, responsable de la síntesis de dihidroxiacetona fosfato a partir de glicerol-3-fosfato codificado por el gen glpD.

Preferentemente, la atenuación de la actividad se obtiene mediante la atenuación de por lo menos uno de dichos genes.

Preferentemente, el microorganismo diseñado para producir heterólogamente 1,3-propanodiol a partir de glicerol mediante dicha nueva ruta metabólica se selecciona de entre bacterias, levaduras u hongos. Más preferentemente, el microorganismo se selecciona de entre Enterobacteriaceae, Cyanobacteriaceae, Bacillaceae, Clostridiaceae, Streptomycetaceae, Pseudomonaceae y Corynebacteriaceae. Todavía más preferentemente, el microorganismo es de la especie Escherichia coli, Synecchococcus elongates, Lactobacillus brevis, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Clostridium acetobutylicum, Thermoanaerobacterium saccharolyticum, Clostridium thermocellum o Corynebacterium glutamicum. Preferentemente, la levadura es Saccharomyces cerevisiae.

En una forma de realización de la invención, el microorganismo con actividad potenciada de ferredoxina-NADP+ reductasa se modifica adicionalmente para producir 1,2-propanodiol a partir de una fuente de carbono mediante una nueva ruta metabólica.

Preferentemente, la piruvato ferredoxina oxidorreductasa, metilglioxal sintasa, metilglioxal reductasa, 1,2-propanodiol deshidrogenasa y transhidrogenasa unida a membrana. Con el fin de obtener el incremento de las actividades enzimáticas específicas, se sobreexpresan preferentemente los genes codificantes de las siguientes actividades: los genes pfor (CA_C2229) y fdx (CA_C0303) codificantes de piruvato ferredoxina oxidorreductasa y ferredoxina; el gen mgsA, codificante de la metilglioxal sintasa; los genes yqhD, yafB, ydhF, ycdW, yqhE, yeaE, yghZ, yajO, tas, ydjG y ydbC, todos codificantes de metilglioxal reductasas; el gen gldA, fucO o sadh de C. beijerinckii codificante de la 1,2-propanodiol deshidrogenasa y pntAB , codificante de transhidrogenasa unida a membrana.

Se utiliza preferentemente la combinación de la sobreexpresión de los genes pfor, fdx, mgsA, yqhD y gldA o pfor, fdx, mgsA, yqhD y sadh y pntAB.

Adicionalmente, se incrementa la actividad de las proteínas de ensamblaje del agregado Fe-S, IscS, IscU e IscA, a fin de mejorar el ensamblaje de [4Fe-4S] en Pfor y Fdx para incrementar las actividades de la piruvato ferredoxina oxidorreductasa y de la transhidrogenasa soluble. Lo anterior puede conseguirse mediante la atenuación del gen iscR, codificante del factor IscR, responsable de la represión del operón isc. Además, puede introducirse una o más mutaciones en los genes pfor, fdx, mgsA, yqhD y gldA para incrementar las actividades de piruvato ferredoxina oxidorreductasa, metilglioxal sintasa, metilglioxal reductasa y 1,2-propanodiol deshidrogenasa, bajo las condiciones de cultivo utilizadas.

• Atenuación de las actividades enzimáticas implicadas en la ruta de Entner-Doudoroff, codificadas por los genes edd y eda. La ruta de Entner-Doudoroff proporciona un modo alternativo de degradar la glucosa en gliceraldehído-3-fosfato y piruvato aparte de la glucólisis. La atenuación de la ruta de Entner-Doudoroff garantizar que la mayor parte, u óptimamente la totalidad, de la glucosa resulte degradada mediante glucólisis y se utilice para la producción de 1,2-propanodiol.

• La atenuación de enzimas que participan en la conversión del metilglioxal en lactato: glioxalasas I y II, codificadas por los genes gloA y gloB, respectivamente, que catalizan la síntesis de lactoil glutatión a partir de metilglioxal y las lactaldehído deshidrogenasasa codificadas por los genes aidA y aldB, que catalizan la síntesis de (S) lactato a partir de (S) lactaldehído y la glioxalasa III codificada por el gen yedU (también conocido como hchA), que cataliza la reducción de metilglioxal en (S) lactato. La atenuación de estos enzimas se desea para reservar el precursor metilglioxal para la síntesis de los productos deseados.

• La atenuación de enzimas que participan en la síntesis de productos secundarios, tales como lactato, etanol y formato: lactato deshidrogenasa, codificada por el gen idhA, que cataliza la síntesis de lactato a partir de piruvato; la alcohol-aldehído deshidrogenasa, codificada por el gen adhE, que cataliza la síntesis de etanol a partir de acetil-CoA, y la piruvato formato liasa, codificada por los genes pflA y pflB, que cataliza la síntesis de acetil-CoA y formato a partir de piruvato.

Preferentemente, se atenúa por lo menos uno de dichos genes.

En otra forma de realización específica de la invención, se atenúa la actividad de la triosa fosfato isomerasa. Preferentemente, dicho resultado se consigue mediante atenuación de la expresión del gen tpiA. Más preferentemente, se elimina el gen tpiA. El gen tpiA codifica el enzima 'triosa fosfato isomerasa', que cataliza la conversión de DHAP en gliceraldehído-3-fosfato. La atenuación de la expresión de dicho gen garantiza que la mitad de la glucosa metabolizada se convierte en 1,2-propanodiol.

En otra forma de realización específica de la invención, se atenúa la actividad de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa. La gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, también denominada GAPDH, es uno de los enzimas clave que participa en la conversión glucolítica de la glucosa en ácido pirúvico. La atenuación del enzima resulta en el redireccionamiento de parte de GA3P hacia la síntesis de 1,2-propanodiol. El rendimiento de 1,2-propanodiol sobre la glucosa en este caso puede ser superior a 1 mol/mol.

En otra forma de realización de la invención, en el microorganismo según la invención, se incrementa la eficiencia de la importación del azúcar. Una atenuación fuerte de la expresión del gen gapA que resulta en una reducción del flujo de carbono en la reacción de GAPDH en más de 50% resulta en la síntesis de menos de 1 mol de PEP por cada mol de glucosa importado. PEP resulta requerido por el sistema de azúcar-fosfotransferasa (PTS) utilizado normalmente para la importación de azúcares simples en la célula, ya que la importación está acoplada a una fosfotransferencia de p Ep a glucosa que proporciona glucosa-6-fosfato. De esta manera, la reducción de la cantidad de PEP impactará negativamente sobre la importación de los azúcares.

En una forma de realización específica, los azúcares podrían importarse en el microorganismo mediante un sistema de importación de azúcares independiente del fosfoenolpiruvato. Puede utilizarse el simportador de galactasaprotones codificado por el gen galP que no implica fosforilación. En este caso, la glucosa importada debe fosforilarse mediante la actividad de glucosa cinasa codificada por el gen glk. Para fomentar dicha ruta, se incrementa la expresión de por lo menos un gel seleccionado de entre galP y glk.

En otra forma de realización específica, se incrementa la eficiencia del sistema de azúcar-fosfotransferasa (PTS) mediante el incremento de la disponibilidad del metabolito fosfoenolpiruvato mediante el incremento de la actividad del enzima fosfoenolpiruvato sintasa. Dicho enzima está codificado por el gen ppsA. Por lo tanto, preferentemente en el microorganismo, se incrementa preferentemente la expresión del gen ppsA.

En otra forma de realización específica, la síntesis del producto secundario acetato se bloquea mediante atenuación de por lo menos un enzima implicado en su síntesis. Resulta preferido evitar dicha síntesis de acetato a fin de optimizar la producción de 1,2-propanodiol.

Para bloquear la producción de acetato, ventajosamente se atenúa por lo menos un gen seleccionado de entre ackA y pta. La totalidad de dichos genes codifican enzimas que participan en las diferentes rutas de biosíntesis de acetato.

Con el fin de obtener una sobreexpresión de un gen de interés, el experto en la materia conoce diferentes métodos, y por ejemplo:

1- La sustitución del promotor nativo del gen con un promotor que induce un nivel más fuerte de expresión del gen de interés.

2- La introducción en el microorganismo de un vector de expresión portador y expresante de dicho gen de interés.

3- La introducción de copias adicionales del gen de interés en el cromosoma del microorganismo.

Otro modo de obtener una actividad enzimática incrementada es introducir en el gen de interés una mutación específica que permite la traducción de un producto génico que presenta una actividad más elevada que la de la proteína nativa.

Bajo condiciones anaeróbicas o microaeróbicas, se incrementa ventajosamente la disponibilidad del NADH para la reducción de los precursores en 1,2-propanodiol. Lo anterior se obtuvo mediante alivio de la represión en el ciclo de los ácidos tricarboxílicos mediado por el regulador global ArcA (codificado por el gen arcA).

Preferentemente, el microorganismo diseñado para producir principalmente 1,2-propanodiol se selecciona de entre bacterias, levaduras u hongos. Más preferentemente, el microorganismo se selecciona de entre Enterobacteriaceae, Cyanobacteriaceae, Bacillaceae, Clostridiaceae, Pseudomonaceae Streptomycetaceae y Corynebacteriaceae. Todavía más preferentemente, el microorganismo es de la especie Escherichia coli, Synecchococcus elongatus, Lactobacillus brevis, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Clostridium acetobutylicum, Thermoanaerobacterium saccharolyticum, Clostridium thermocellum o Corynebacterium glutamicum. Preferentemente, la levadura es Saccharomyces cerevisiae.

La expresión "atenuación de la expresión de un gen" según la invención denota la supresión parcial o completa de la expresión de un gen, que en este caso se dice que se encuentra "atenuada". Dicha supresión de la expresión puede ser una inhibición de la expresión del gen, una eliminación de la totalidad o parte de la región promotora necesaria para la expresión génica, o una eliminación de la región codificante del gen. Preferentemente, la atenuación de un gen es esencialmente la eliminación completa de dicho gen, en el que el gen puede sustituirse por un gen marcador de selección que facilita la identificación, aislamiento y purificación de las cepas según la invención. Un gen se activa preferentemente mediante la técnica de recombinación homóloga (Datsenko, K.A. y Wanner, B.L., 2000).

La presente descripción da a conocer un método para modular la actividad enzimática de la ferredoxina-NADP+ reductasa en un microorganismo, en el que se potencia o se atenúa la actividad del polipéptido de la invención en dicho microorganismo.

Preferentemente, en dicho método, la actividad enzimática de la ferredoxina-NADP+ reductasa se potencia mediante sobreexpresión del polinucleótido de la invención.

Preferentemente, en dicho método, la actividad enzimática de ferredoxina-NADP+ reductasa se atenúa mediante la atenuación de la expresión del polinucleótido de la invención.

La presente descripción da a conocer un método para preparar etanol, en el que se cultiva un microorganismo según la invención en un medio de cultivo apropiado que comprende una fuente de carbono, y se recupera el etanol producido. La producción de etanol se lleva a cabo bajo condiciones microaeróbicas o anaeróbicas, preferentemente bajo condiciones anaeróbicas.

La expresión "sustrato de carbono" o "fuente de carbono" se refiere a cualquier fuente de carbono capaz de ser metabolizado por un microorganismo, en el que el sustrato contiene por lo menos un átomo de carbono. Los inventores se refieren particularmente a una fuente de carbono renovable, económica y fermentable, tal como monosacáridos, oligosacáridos, polisacáridos, sustratos de un solo carbono, y polioles, tales como glicerol. Los sacáridos de fórmula (CH²O)n también se denominan osas o "azúcares simples"; entre los monosacáridos se incluyen fructosa, glucosa, galactosa y manosa. Otras fuentes de carbono son disacáridos, trisacáridos, oligosacáridos y polisacáridos. Entre los disacáridos se incluyen sacarosa (sucrosa), lactosa y maltosa. El almidón y la hemicelulosa son polisacáridos, también conocidos como "azúcares complejos".

Ventajosamente, el etanol recuperado se purifica adicionalmente.

La invención se refiere además a un método para preparar n-butanol, en el que se cultiva un microorganismo según la invención en un medio de cultivo apropiado que contiene una fuente de carbono, y se recupera el n-butanol. La producción de n-butanol se lleva a cabo bajo condiciones microaeróbicas o anaeróbicas, preferentemente bajo condiciones anaeróbicas.

Ventajosamente, el n-butanol recuperado se purifica adicionalmente.

La invención se refiere además a un método para preparar 1,3-propanodiol, en el que se cultiva un microorganismo en un medio de cultivo apropiado que contiene glicerol como fuente de carbono, y se recupera el 1,3-propanodiol.

La producción de1,3-propanodiol se lleva a cabo bajo condiciones microaeróbicas o anaeróbicas, preferentemente bajo condiciones anaeróbicas.

Ventajosamente, se purifica adicionalmente el 1,3-propanodiol recuperado.

La invención se refiere además a un método para preparar 1,2-propanodiol, en el que se cultiva un microorganismo según la invención en un medio de cultivo apropiado que contiene una fuente de carbono, y se recupera el 1,2-propanodiol. La producción de 1,2-propanodiol se lleva a cabo bajo condiciones microaeróbicas o anaeróbicas, preferentemente bajo condiciones anaeróbicas.

Ventajosamente, se purifica adicionalmente el 1,2-propanodiol recuperado.

Las condiciones de cultivo para los procedimientos de fermentación pueden ser fácilmente definidas por el experto en la materia. En particular, las bacterias se fermentan a temperaturas de entre 20°C y 55°C, preferentemente de entre 25°C y 40°C, y preferentemente a aproximadamente 35°C para C. acetobutylicum y a aproximadamente 37°C para E. coli y K. pneumoniae.

Dicho procedimiento puede llevarse a cabo en un procedimiento por lotes, en un procedimiento de lotes alimentados o en un procedimiento continuo.

Las condiciones microaeróbicas se definen como condiciones de cultivo, en las que se disuelven porcentajes bajos de oxígeno (por ejemplo, utilizando una mezcla de gases que contiene entre 0.1% y 10% de oxígeno, completada a 100% con nitrógeno), en la fase líquida.

Se definen condiciones anaeróbicas como condiciones de cultivo en las que no se proporciona oxígeno en el medio de cultivo. Se obtienen condiciones estrictamente anaeróbicas mediante burbujeo con un gas inerte como el nitrógeno en el medio de cultivo para eliminar las trazas de otros gases. Puede utilizarse nitrato como un aceptor de electrones para mejorar la producción de ATP por la cepa y mejorar su metabolismo.

La expresión "medio de crecimiento apropiado" según la invención denota un medio de composición molecular conocida adaptado al crecimiento del microorganismo. Por ejemplo, un medio de cultivo mineral de composición fija conocida adaptado a la bacteria utilizada, que contiene por lo menos una fuente de carbono. En particular, de esta manera, el medio de cultivo mineral para E. coli o K. pneumoniae puede ser idéntico o de composición similar al medio M9 (Anderson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 32:120-128, 1946), medio M63 (Miller, A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual y Handbook for Escherichia coli y Related Bacteria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1992) o un medio tal como el definido por Schaefer et al. (Anal. Biochem. 270: 88-96, 1999).

La fuente de carbono utilizada para el cultivo de E. coli o C. acetobutylicum es preferentemente una fuente de carbono simple y puede ser arabinosa, fructosa, galactosa, glucosa, lactosa, maltosa, sacarosa, xilosa o glicerol. Una fuente de carbono simple especialmente preferida es la glucosa.

La invención se ha descrito anteriormente, posteriormente y en los Ejemplos con respecto a C. acetobutylicum y E. coli. De esta manera, los genes que pueden atenuarse, deleciones o sobreexpresarse para las cepas iniciales y evolucionadas según la invención se definen utilizando la denominación de los genes de E. coli o C. acetobutylicum. Sin embargo, dicha designación presenta un significado más general según la invención y cubre los genes correspondientes en otros microorganismos. Utilizando las referencias de GenBank de los genes de E. coli o C. acetobutylicum, el experto en la materia puede determinar genes equivalentes en otros organismos diferentes de E. coli o C. acetobutylicum.

Los medios de identificación de las secuencias homólogas y sus porcentajes de homología son bien conocidos por el experto en la materia y entre ellos se incluyen en particular los programas BLAST que pueden utilizarse en el sitio de internet http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ con los parámetros por defecto indicados en este sitio de internet. Las secuencias obtenidas pueden aprovecharse (alinearse) utilizando los programas CLUSTALW (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/), con los parámetros por defecto indicados en dichos sitios de internet.

La base de datos PFAM (base de datos de familias de proteínas de alineaciones y modelos de Markov ocultos http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/) es una gran colección de alineaciones de secuencias de proteínas. Cada PFAM permite visualizar múltiples alineaciones, visionar dominios de proteínas, evaluar distribuciones entre organismos, ganar acceso a otras bases de datos y visualizar estructuras de proteínas conocidas.

Se obtienen COG (agregados de grupos ortólogos de proteínas http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/) mediante comparación de secuencias de proteínas derivadas de 66 genomas unicelulares totalmente secuenciados que representan 14 líneas filogenéticas principales. Cada COG se define a partir de por lo menos tres líneas, permitiendo identificar dominios conservados antiguos.

Descripción de los dibujos

Figura 1: nueva ruta metabólica para la producción de etanol.

Figura 2: nueva ruta metabólica para la producción de butanol.

Figura 3: nueva ruta metabólica para la producción de 1.3-propanodiol.

Figura 4: nueva ruta metabólica para la producción de 1.2-propanodiol.

Figura 5: otra nueva ruta metabólica para la producción de 1.2-propanodiol.

Ejemplos

Ejemplo 1: purificación de actividad de ferredoxina-NADP+ en C. acetobutylicum e identificación del gen codificante

1.1 - Ensayos de actividad de ferredoxina-NADP+ reductasa y de actividad de NADPH ferredoxina reductasa:

Todos los ensayos enzimáticos se llevaron a cabo en la estación de trabajo anaeróbica bajo una atmósfera de nitrógeno. Todas las soluciones de reactivo se prepararon en el tampón de ensayo (previamente sometido a ebullición y desgasificado con nitrógeno) y se mantuvo bajo una atmósfera de nitrógeno. Se determinaron las actividades específicas en un intervalo en el que se había establecido linealidad con la concentración de proteína. Se llevó a cabo cada ensayo enzimático por lo menos por duplicado. Se define una unidad de actividad enzimática como la cantidad de enzima que cataliza la conversión de 1 jm ol de sustrato por min. Se proporcionan posteriormente las concentraciones de los componentes en las mezclas de reacción (1 ml de volumen total).

Se sometió a ensayo la actividad in vitro de la ferredoxina-NADP+ reductasa mediante la medición de la reducción de NADP+ utilizando electrones de metil viológeno reducido o ferredoxina reducida (CA_C0303) con H²como reductor del metil viológico o ferredoxina (CA_C 0303) (Demuez et al., 2007) en presencia de la hidrogenasa Fe-Fe de Clostridium acetobutylicum (CA_C0028) (Vasconcelos et al., 1994, Girbal et al., 2005). La reacción se llevó a cabo anaeróbicamente a 37°C en tampón de Tris-HCl 100 mM (pH 7) con DTT 2 mM, FAD 25 j M, metil viológeno 150 j M, NADP+1.6 mM, 6 U (o más) de hidrogenasa HydA purificada de C. acetobutylicum y extracto en bruto (o proteína purificada) y seguido de la monitorización del incremento en A340 nm como indicación de la aparición de NADPH utilizando un espectrofotómetro (Hewlett Packard 8453). Tras una corriente suave con hidrógeno en las celdas de cubeta de cuarzo, se iniciaron los ensayos mediante la adición de metil viológeno seguida de, tras la reducción del metil viológeno seguido a una longitud de onda de 560 nm, la adición de NADP+. En todas las reacciones, se restaron las tasas no enzimáticas de las tasas de reacción iniciales observadas.

Se sometió a ensayo la actividad in vitro de NADPH ferredoxina reductasa mediante monitorización del incremento de A560 nm como indicación de la reducción de metil viológeno utilizando un espectrofotómetro (Hewlett Packard 8453). La reacción se llevó a cabo anaeróbicamente a 37°C en celdas de cubeta de cuarzo en tampón de Tris-HCl 100 mM (pH 7,6) con DTT 2 mM, FAD 10 j M, NADPH 250 j M, etanol al 3% v/v, 45 U de Adh (S. cerevisiae), metil viológeno 10 mM, NADPH 250 j M y extracto en bruto o proteína purificada. Los ensayos se iniciaron mediante la adición de metil viológeno. En todas las reacciones, se restaron las tasas no enzimáticas de las tasas de reacción iniciales observadas.

El coeficiente de extinción del metil viológeno a 560 nm y NADPH a 340 era de 7.71 mM'1 cirr1 y 6.29 mM'1 cm'1, respectivamente. La concentración de proteínas totales del extracto libre de células o fracción purificada se determinó mediante el método de Bradford (reactivo de Biorad) (Bradford, 1976) con albúmina de suero bovino como el estándar.

1.2 - Purificación de ferredoxina NADP+ reductasa en C. acetobutylicum bajo condiciones solventogénicas:

La cepa C. acetobutylicum ATCC 824 se mantuvo en forma de esporas a -20°C en el medio sintético (MS), tal como se ha indicado anteriormente (Meynial-Salles et al., 2005). Los cultivos en matraz de cepas de C. acetobutylicum se cultivaron anaeróbicamente en medio sintético (MS) y se inocularon con solución madre de esporas al 10% (v/v) y se sometieron a choque térmico a 80°C durante 15 min. Las células se cultivaron a 37°C hasta una DO620 nm de aproximadamente 2.0 y el pH se mantuvo mediante tamponado del medio de cultivo con carbonato cálcico, antes de la inoculación del biorreactor al 10% (v/v).

Las fermentaciones por lotes de pH controlado se llevaron a cabo en medio sintético. Se utilizó un biorreactor Biostat B de 2 l (Sartorius, Aubagne, Francia) con un volumen de trabajo de 1.3 l. Tras la esterilización, el medio se purgó con nitrógeno libre de O²durante 30 min. Durante el curso del experimento, el medio se mantuvo bajo una ligera sobrepresión de nitrógeno para evitar la entrada de O²en el reactor. Todos los tubos están constituidos de caucho butilo y la salida de gases del reactor se protegió con un dispositivo de pirogalol.

Los cultivos se sometieron a ensayo a 300 rpm, la temperatura se fijó a 35°C y el pH se mantuvo a 4.8 con adición automática de NH⁴OH (3 N). La concentración celular se midió turbidimétricamente mediante monitorización de la densidad óptica (DO) a 620 nm (Biochrom libra S11) y la formación de los productos se midió por duplicado utilizando el análisis de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPCL) (serie Agilent 1200, Massy, Francia) (Dusséaux et al., 2013).

Al alcanzar la DO620 nm un valor aproximado de 16, después del cambio de fase acidogénica a solventogénica, las células se recolectaron bajo presión de hidrógeno y se transfirieron a una cámara anaeróbica. Las células se lavaron y se concentraron 20 veces en tampón de Tris-HCl 100 mM, DTT 2 mM, glicerol al 10% (pH 7.6) y se congelaron a -80°C.

El procedimiento de purificación entero se llevó a cabo bajo condiciones anaeróbicas. Todos los tampones de purificación se desgasificaron preliminarmente y se añadió FAD 10 pM y DTT 2 mM para evitar las pérdidas no reversibles de actividad.

Después, las células congeladas de los cultivos por lotes solventogénicos de C. acetobutylicum ATCC 824 se descongelaron y se fragmentaron mediante sonicación utilizando un desintegrador ultrasónico (Vibracell 72434, Bioblock) a 4°C en cuatro ciclos de 30 s a intervalos de 2 min. Se separaron los residuos mediante centrifugación a 8600 g durante 10 min, a 4°C (centrífuga Sigma, 2-16K). Se precipitaron los ácidos nucleicos mediante la adición de sulfato de estreptomicina (200 mg/ml) en el sobrenadante y se separaron mediante centrifugación tal como anteriormente. A continuación, el extracto recuperado se diluyó 5 veces en tampón de Tris-HCl 100 mM (pH 8) antes de cargarlo en una matriz HiTrap Capto-DEAE de 5 ml (GE Healthcare, ref. 28-9165-40) conectada a un purificador AKTA (GE Healthcare, Suecia). Se cribaron las fracciones activas con el ensayo de NADPH ferredoxina reductasa utilizando metil viológeno, tal como se ha indicado anteriormente. La columna se equilibró en tampón de Tris-HCl 100 mM (pH 8) y se llevó a cabo la elución con un gradiente en 3 etapas de tampón de Tris-HCl 100 mM NaCl 1 M (pH 8): 1 VC 0-4%, 20 VC 4-16% (elución diana) y 5 VC 16-100%; se recogieron fracciones de 2 ml. La fracción más activa de la columna Capto-DEAE se concentró en un Vivaspin 15/10000MW (Sartorius Stedim, ref. VS1502) para reducir el volumen de la muestra a 150 pl mediante centrifugación a 3000 g, 15 min. Durante la última etapa de purificación, se aplicó un volumen de muestra de 150 pl en una columna Superose 1210/300 GL (GE Healthcare, ref. 17-5173-01) equilibrada preliminarmente en tampón de Tris-HCl 100 mM NaCl 150 mM (pH 7.6) y se recogieron fracciones de 400 pl. Finalmente, la concentración de proteínas totales del extracto libre de células o fracción purificada se determinó mediante el método de Bradford (reactivo de Biorad) (Bradford, 1976) con albúmina de suero bovino como el estándar.

Se calcularon los rendimientos y factor de purificación de cada etapa. El factor de pureza de las fracciones activas separadas también se evaluó utilizando una SDS-electroforesis en geles de poliacrilamida de 40 ml.

Se evaluaron las actividades in vitro tanto de ferredoxina NADP+ reductasa como de NADPH ferredoxina reductasa en la fracción pura recuperada. Según la tabla 1, el enzima purificado es estrictamente dependiente de NADPH/NADP+.

Tabla 1: actividades específicas de ferredoxina-NADP+ reductasa y NADPH-ferredoxina reductasa sobre la fracción purificada final utilizando metil viológeno como sustrato:

1.3 - Identificación del gen codificante de actividad de ferredoxina-NADP+ reductasa:

La zona del gel correspondiente a la proteína en 45 kDa se recortó utilizando una punta de pipeta estéril. A continuación, dicho tapón de gel se utilizó para la identificación de las proteínas mediante espectroscopia de masa.

La muestra se sometió a digestión con tripsina y se analizó mediante nano CL/EM/EM en un CapLC-Q-TOF2 (Waters) y mediante MALDI en un MALDI MX (Waters). Se identificaron las proteínas candidatas con los programas informáticos ProteinLynx Global Server (Waters) y Mascot (Matrix Science) utilizando el banco de datos de proteínas de C. acetobutylicum. Para ambos análisis, sólo se identificó una proteína con una puntuación significativa (cobertura de la secuencia de 77%). Se mostró que dicha proteína de 45 kDa estaba codificada por CA_C0764, un gen que se ha anotado que codifica para una subunidad pequeña de la glutamato sintasa.

Ejemplo 2: modulación de la actividad de ferredoxina-NADP+ reductasa en C. acetobutylicum:

2.1 - Disrupción del gen CA_C0764 en C. acetobutylicum, validación de la pérdida de actividad de ferredoxina NADP+ reductasa y selectividad potenciada para acetona:

Con el fin de investigar la participación de CA_C0764 en la ruta metabólica in vivo de butanol en C. acetobutylicum, se utilizó la tecnología Clostron basada en intrón de grupo II (Heap J. et al., 2007) para inactivar el gen CA_C0764 en Acac15 de C. acetobutylicum (Soucaille et al., 2006). Dicha tecnología utiliza la inserción de un intrón de grupo II en un sitio diana genómico acoplado a un marcador activado por retrotransposición (resistencia a la eritromicina), permitiendo una inactivación génica estable.

2.1.1: construcción del mutante C. acetobutylicum Acac15cac0764-408s::CT:

El sitio diana del intrón se identificó en 408/409s pb (desde el inicio del orf) en la cadena de sentido y se diseñaron cebadores de PCR de redireccionamiento de intrón utilizando un algoritmo informático (Perutka et al., 2004):

1-408/409s-IBS que consta de 53 bases (SEC ID n° 3) AAAAAAGCTTATAATTATCCTTAGGCTACAATGTTGTGCGCCCAGATAGGGTG

2. 408/409s-EBS1d que consta de 60 bases (SEC ID n° 4) CAGATTGTACAAATGTGGTGATAACAGATAAGTCAATGTTACTAACTTACCTTTCTTTG

T

3. 408/409s-EBS2 que consta de 49 bases (SEC ID n° 5) TGAACGCAAGTTTCTAATTTCGATTTAGCCTCGATAGAGGAAAGTGTCT

Los tres 408/409-IBS, 408/409-IEBS1d, 408/409-EBS2 y los cebadores universales EBS se utilizaron en una reacción de un solo tubo con el plásmido pMTL007 (Heap J. et al., 2007) para mutar el intrón en varias posiciones que abarcan una región de 350 pb. La reacción de PCR, que redirecciona el intrón mediante mutación mediada por cebadores, se llevó a cabo según el protocolo del kit del Targetron Gene Knockout System (http://www.sigmaaldrich.com/life-science/functional-genomics-and-rnai/targetron.html). El fragmento de pCr de 350 pb se purificó y después se clonó en el plásmido pMTL007 en los sitios HindIII y BsrGI para sustituir el fragmento intrón original. A continuación, se introdujo el producto de ligación en células de E. coli químicamente competentes Top10 (Invitrogen™). A continuación se cultivaron algunas colonias individuales en cultivo líquido LB complementado con ampicilina (100 qg/ml), durante la noche a 37°C, para llevar a cabo finalmente una extracción de plásmido de ADN (kit miniprep de plásmido HP GenElute, Sigma) y se comprobó la presencia del plásmido pMTL007:Ca-cac0764-408s.

El plásmido redireccionado pMTL007:Ca-cac0764-408s se controló finalmente mediante restricción y mediante secuenciación del ADN utilizando los cebadores 408/409-IBS y 408/409-IEBS1d.

A continuación, se electroporó C. acetobutylicum Acac15 tal como se ha indicado anteriormente (Mermelstein et al., 1992) utilizando plásmido pMTL007:Ca-cac0764-408s redirecionado no metilado, debido a que se había eliminado el gen CA_C1502 codificante de la endonucleasa de restricción de tipo II Cac824I (Soucaille et al., 2006). Tras 5 horas de recuperación, las células se sembraron en medio RCA (medio nutritivo de Clostridium con 15 g/l de agar, Fluka (Saint-Quentin Fallavier, Francia, n° 27546) complementado con tianfenicol (10 qg/ml). Se seleccionaron colonias individuales de la placa y se sembraron por separado en una placa con RCA y eritromicina (40 qg/ml) para seleccionar los integrantes.

Los mutantes por inserción se cribaron mediante PCR de colonias utilizando los cebadores siguientes flanqueantes del sitio diana:

cac0764del_for (SEC ID n° 6): (homólogo de la secuencia 886263 a 886287) cgagccaataaaatttcacgagata

cac0764del_rv (SEC ID n° 7): (homólogo de la secuencia 886512 a 886541) ccaacctctataagtctttcttcaagctta

Los productos de PCR se purificaron y confirmaron mediante secuenciación del ADN.

Se seleccionó una de las colonias para curar el plásmido pMTL007:Ca-cac0764-408s y generar C. acetobutylicum Acac15cac0764408s::CT.

Se inoculó dicho clon en medio de crecimiento de Clostridium (MCC) complementado con eritromicina (40 qg/ml) para subcultivos sucesivos, tal como se ha indicado anteriormente (Dusséaux et al., 2013). Se inocularon 100 ql de cultivo maduro en 1 ml de medio MCC fresco complementado con eritromicina (40 qg/ml), se cultivaron anaeróbicamente a 37°C durante por lo menos 12 h hasta conseguir un crecimiento completo. Se repitió dicho procedimiento de transferencia por lo menos 3 veces. A continuación, el último cultivo se sembró en una placa de RCA sólido complementado con eritromicina (40 qg/ml). Las colonias se sembraron nuevamente en placas de RCA complementado con tianfenicol (10 |jg/ml) y después en placas de RCA complementadas con eritromicina (40 jg/ml). Se seleccionó un clon resistente a eritromicina y sensible a tianfenicol y se inoculó en 3 ml de medio sintético complementado con eritromicina (40 jg/ml), cultivado anaeróbicamente a 37°C durante por lo menos 24 h y se transfirió a 30 ml de medio sintético complementado con eritromicina (40 jg/ml). El cultivo se cultivó anaeróbicamente a 37°C durante 7 días hasta la esporulación y después la suspensión de esporas se almacenó a -20°C.

2.1.2: Análisis fenotípico del mutante C. acetobutylicum Acac15cac0764408s::CT:

La cepa C. acetobutylicum Acac15cac0764408s::CTse mantuvo en forma de esporas a -20°C en el medio sintético (MS), tal como se ha indicado anteriormente (Meynial-Salles et al., 2005). Los cultivos en matraz de cepas de C. acetobutylicum se cultivaron anaeróbicamente en medio sintético (MS) y se inocularon con solución madre de esporas al 10% (v/v) y se sometieron a choque térmico a 80°C durante l5 min. Las células se cultivaron a 37°C y el pH se mantuvo mediante tamponado del medio de cultivo con carbonato cálcico. Como control, se cultivó C. acetobutylicum Acac15 bajo las mismas condiciones.

El análisis fenotípico comparativo se llevó a cabo mediante medición de tanto el consumo de glucosa como la concentración de productos de fermentación, tal como se muestra en la tabla 2:

La cepa C. acetobutylicum Acac15cac0764408s::CT produce más acetona y menos butanol que la cepa de control.

2.1.3: determinación de la actividad de ferredoxina-NADP+ reductasa en el mutante C. acetobutylicum Acac15cac0764408s::CT:

Se cultivó la cepa C. acetobutylicum Acac15cac0764408s::CT anaeróbicamente en medio sintético (MS) y se inoculó con solución madre de esporas al 10% (v/v) y se sometieron a choque térmico a 80°C durante 15 min. Las células se cultivaron hasta una DO⁶²⁰nm aproximada de 2 y el pH se mantuvo mediante tamponado del medio de cultivo con carbonato cálcico. Como control, se cultivó C. acetobutylicum Acac15 bajo las mismas condiciones. Las células se transfirieron a una cámara anaeróbica, se recolectaron, se lavaron y se concentraron 20 veces en tampón de Tris-HCl 100 mM, DTT 2 mM, glicerol al 10% (pH 7.6), se congelaron a -80°C o se utilizaron inmediatamente. Las células se fragmentaron adicionalmente mediante sonicación utilizando un desintegrador ultrasónico (Vibracell 72434, Bioblock) a 4°C en cuatro ciclos de 30 s a intervalos de 2 min. Se separaron los residuos mediante centrifugación a 8600 g durante 10 min, a 4°C (centrífuga Sigma, 2-16K) y el extracto en bruto acelular se cargó en una columna SephadexG25 para eliminar las sales y metabolitos, antes de determinar la actividad de ferredoxina NADP+ reductasa utilizando ferredoxina como sustrato y siguiendo el procedimiento ya descrito en 1.1 (Tabla A).

Tabla A: se determinaron las actividades de ferredoxina-NADP+ reductasa en extractos en bruto utilizando ferredoxina como sustrato:

2.2 - Sobreexpresión del gen CA_C0764 en C. acetobutylicum, validación de la pérdida de actividad de ferredoxina-NADP+ reductasa y selectividad potenciada para butanol:

2.2.1: construcción de pCLF 0764 para la sobreexpresión de CA_C 0764:

El gen CA_C0764 se amplificó a partir del ADN genómico de C. acetobutylicum ATCC824 utilizando los cebadores Ocac07641 y Ocac0764r. Los cebadores se diseñaron para introducir una región RBS junto con el gen CA_C0764, así como para introducir los sitios de restricción BamHI y Sfol cadena arriba y cadena abajo, respectivamente: Ocac0764f (SEC ID n° 8):

AGGATCCATCAAAATTTAGGAGGTTAGTTA

Ocac0764r (SEC ID n° 9):

GGCGCCTTAATTATTCTTGCAATACTCATCAATAGTTTC

El fragmento de PCR amplificado a continuación se subclonó en un vector Zero Blunt TOPO (Invitrogen, Saint Aubin, Francia), proporcionando el plásmido Zero Blunt TOPO-cac0764 y se secuenció utilizando los cebadores universales T7P y T3P para garantizar que no se habían introducido mutaciones. El fragmento que contenía el gen CA_C0764 se purificó en un gel de agarosa tras la digestión del vector Zero Blunt TOPO-cac0764 con BamHI y SfoI. El vector pSOS94 de 7 kb (Dusséaux et al., 2013) también se digirió con BamHI y SfoI, y se ligó con el gen sadh digerido con BamHI-SfoI, proporcionando el vector pSOS94-cac0764 de 6.25 kb. El vector pSOS94-cac0764 se digirió con SalI, y los fragmentos que contenían el operón de cada vector se purificaron en un gel de agarosa. El vector pCLF1 de 4,9 kb (Soucaille et al., 2006) se digirió con SalI, se trató con fosfatasa antártica y se ligó con el fragmento anteriormente purificado, proporcionando pCLFcac0764.

A continuación, se electroporó Acac15 de C. acetobutylicum tal como se ha indicado anteriormente (Mermelstein et al., 1992), utilizando el plásmido pCLFcac0764 no metilado. Tras 5 horas de recuperación, las células se sembraron en medio RCA (medio nutritivo de Clostridium con 15 g/l de agar, medio Fluka (Saint-Quentin Fallavier, Francia, n° 27546) complementado con tianfenicol (10 pg/ml). Se seleccionaron colonias individuales de la placa y se sembraron por separado en una placa con RCA y tianfenicol (10 pg/ml) para seleccionar los integrantes. Se cribaron los transformantes mediante amplificación por PCR del operón sintético que expresaba CA_C0764. A continuación, las células se transfirieron y cultivaron en una placa de agar MS con tianfenicol (10 pg/ml) antes de la inoculación en medio MS líquido. Se cultivó anaeróbicamente un clon seleccionado a 37°C durante 7 días hasta la esporulación y después la suspensión de esporas se almacenó a -20°C.

2. 2.2: análisis fenotípico del mutante C. acetobutylicum Acac15 pCLF 0764:

La cepa mutante de C. acetobutylicum Acac15pCLF 0764 se mantuvo en forma de esporas a -20°C en el medio sintético (MS), tal como se ha indicado anteriormente (Meynial-Salles et al., 2005). Los cultivos en matraz de cepas de C. acetobutylicum se cultivaron anaeróbicamente en medio sintético (MS) (con la excepción de que se omitió la cisteína) y se inocularon con solución madre de esporas al 10% (v/v) y se sometieron a choque térmico a 80°C durante 15 min. Las células se cultivaron a 37°C durante varios días y el pH se mantuvo mediante tamponado del medio de cultivo con carbonato cálcico. Como control, se cultivó C. acetobutylicum Acac15 bajo las mismas condiciones.

El análisis fenotípico comparativo se llevó a cabo mediante medición de tanto el consumo de glucosa como la concentración de productos de fermentación, tal como se muestra en la tabla 3:

La cepa C. acetobutylicum Acac15 pCLFcac0764 produce menos acetona y más butanol y etanol que la cepa de control.

2.2.3 Determinación de la actividad de ferredoxina NADP+ reductasa en el mutante C. acetobutylicum Acac15 pCLF 0764:

Se cultivó la cepa mutante de C. acetobutylicum Acac15 pCLF 0764 anaeróbicamente en medio sintético (MS) a 37°C y se inoculó con solución madre de esporas al 10% (v/v) y se sometió a choque térmico a 80°C durante 15 min. Las células se cultivaron hasta una DO⁶²⁰nm aproximada de 2 y el pH se mantuvo mediante tamponado del medio de cultivo con carbonato cálcico. Como control, se cultivó C. acetobutylicum Acac15 bajo las mismas condiciones. Las células se transfirieron a una cámara anaeróbica, se recolectaron, se lavaron y se concentraron 20 veces en tampón de Tris-HCl 100 mM, DTT 2 mM, glicerol al 10% (pH 7.6), se congelaron a -80°C o se utilizaron inmediatamente. Las células se fragmentaron adicionalmente mediante sonicación utilizando un desintegrador ultrasónico (Vibracell 72434, Bioblock) a 4°C en cuatro ciclos de 30 s a intervalos de 2 min. Se separaron los residuos mediante centrifugación a 8600 g durante 10 min, a 4°C (centrífuga Sigma, 2-16K) y el extracto en bruto acelular se cargó en una columna SephadexG25 para eliminar las sales y metabolitos, antes de determinar la actividad de ferredoxina NADP+ reductasa utilizando ferredoxina como sustrato y siguiendo el procedimiento ya descrito en 1.1 (Tabla B).

Tabla B: se determinaron las actividades de ferredoxina-NADP+ reductasa en extractos en bruto utilizando ferredoxina como sustrato:

Ejemplo 3: producción heteróloga de etanol mediante una nueva ruta metabólica en una cepa de E. coli con una actividad potenciada de ferredoxina NADP+ reductasa:

3.1.10 Construcción de una cepa modificada de E. coliMG1655AldhA::FRT, ApflAB::FRT, Aack-pta::FRT, AiscR::FRT, AfrdABCD::FRT Aace::FRT, AmgsA

3.1.1 Construcción de una cepa modificada de E. coli MG1655 AldhA::FRT-cm-FRT

Se sustituyó el gen IdhA por un casete de resistencia a antibiótico cloranfenicol flanqueado por la diana de reconocimiento de Flp (FrT), que se generó mediante PCR mediante la utilización de cebadores con extensiones de homología de 80 nt, eliminando la mayor parte del gen en cuestión. La técnica utilizada fue descrita por Datsenko y Wanner en 2000.

Se diseñaron dos oligonucleótidos y se utilizaron para sustituir el gen IdhA:

1-DldhAr, que consta de 101 bases (SEC ID n° 10):

ttaaaccagttcgttcgggcaggtttcgcctttttccagattgcttaagttttgcagcgtagtctgagaaatactggtcagCATATGAATAT CCTCCTTAG

con una región (letras minúsculas) homóloga de la secuencia (1439878-1439958) del gen IdhA (secuencia 1439878 a 1440867), una secuencia de referencia en el sitio de internet http://ecocyc.org/ (Keseler et al. 2005) y una región (letras mayúsculas) para la amplificación del casete de resistencia al cloranfenicol del plásmido pKD3 (Datsenko y Wanner 2000).

2. DldhAf, que consta de 100 bases (SEC ID n° 11):

gaaactcgccgtttatagcacaaaacagtacgacaagaagtacctgcaacaggtgaacgagtcctttggctttgagctggTGTAGGCTG GAGCTGCTTCG

Con una región (letras minúsculas) homóloga a la secuencia (1440786-1440865) del gen IdhA (secuencia 1439878 a 1440867), una secuencia de referencia en el sitio de internet http://ecocyc.org/ y una región (letras mayúsculas) para la amplificación del casete de resistencia al cloranfenicol transportado en el plásmido pKD3. Se utilizaron ambos oligonucleótidos, DldhAr y DldhAf, para amplificar el casete de resistencia al cloranfenicol a partir del plásmido pKD3. A continuación, se introdujo mediante electroporación el fragmento de PCR amplificado en la cepa E. coli MG1655 portadora del plásmido auxiliar RED (pKD46) que expresa los genes del sistema a, p y exo codificantes de las recombinasas Gam, Bet y Exo para fomentar la recombinación homóloga. A continuación, se seleccionaron los transformantes resistentes a antibiótico y se comprobó la sustitución del gen IdhA por el casete de cloranfenicol mediante análisis de PCR utilizando ambos oligonucleótidos hslJC e IdhAC2.

3- hslJC (SEC ID n° 12):

gccatcagcaggcttagcgc (homológo de la secuencia 1439724 a 1439743)

4- ldhAC2 (SEC ID n° 13):

gggtattgtggcatgtttaaccg (homológo de la secuencia 1441007 a 1441029).

A continuación se eliminó el casete de resistencia al cloranfenicol mediante la utilización del plásmido pCP20 auxiliar Flp (Cheperanov y Wagernagel, 1995). Se transformaron los mutantes CmR con pCP20 y los transformantes resistentes a ampicilina se seleccionaron a 30°C, seguido de la purificación de colonia de algunos a 42°C y el ensayo para pérdida de la resistencia a antibióticos mediante análisis de PCR utilizando los oligonucleótidos anteriormente indicados (SEC ID n° 12 y n° 13).

3.1.2 Construcción de la cepa modificada E. coli MG1655 ApflAB::FRT-cm-FRT:

Se sustituyeron los genes pflAB por un casete de resistencia al cloranfenicol flanqueado por la diana de reconocimiento de Flp (FRT), que se generó mediante PCR mediante la utilización de cebadores con extensiones de homología de 80 nt, eliminando la mayor parte del gen en cuestión. La técnica utilizada fue descrita por Datsenko y Wanner en 2000.

Se diseñaron dos oligonucleótidos y se utilizaron para sustituir los genes pflAB:

1. DpflBr, que consta de 100 bases (SEC ID n° 14).

ccggacatcctgcgttgccgtaaatctggtgttctgaccggtctgccagatgcatatggccgtggccgtatcatcggtgaCATATGAAT ATCCTCCTTAG

Con una región (letras minúsculas) homóloga a la secuencia (952236--952315) del gen pflB (secuencia 950495 a 952777), una secuencia de referencia en el sitio de internet http://ecocyc.org/ y una región (letras mayúsculas) para la amplificación del casete de resistencia al cloranfenicol transportado en el plásmido pKD3 (Datsenko y Wanner, 2000).

2. Dpflaf, que consta de 100 bases (SEC ID n° 15):

gatgcactataagatgtgttaaaaacgctgtagcagaatgaagcgcggaataaaaaagcggcaactcaataaagttgccgTGTAGGCT GGAGCTGCTTCG

Con una región (letras minúsculas) homóloga a la secuencia (949470-949549) situada cadena arriba del gen pflA (secuencia 949563 a 950303), una secuencia de referencia en el sitio de intemet http://ecocyc.org/ y una región (letras mayúsculas) para la amplificación del casete de resistencia al cloranfenicol transportado en el plásmido pKD3.

Se utilizaron ambos oligonucleótidos, DpflBr y DpflA f, para amplificar el casete de resistencia al cloranfenicol a partir del plásmido pKD3. A continuación, se introdujo mediante electroporación el fragmento de PCR amplificado en la cepa E. coli MG1655 portadora del plásmido auxiliar RED (pKD46) que expresa los genes del sistema a, p y exo codificantes de las recombinasas Gam, Bet y Exo para fomentar la recombinación homóloga. A continuación, se seleccionaron los transformantes resistentes a antibiótico y se comprobó la sustitución de los genes pflAB por el casete de cloranfenicol mediante análisis de PCR utilizando ambos oligonucleótidos pflAB1 y pflAB2.

3. pflAB1 (SEC ID n° 16): agacattaaaaatatacgtgcagctacccg (homólogo de la secuencia 948462 a 948491) 4. pflAB2 (SEC ID n° 17): gtgaaagctgacaacccttttgatctttta (homólogo de la secuencia 953660 a 953689). 3.1.3 Construcción de una cepa modificada de E. coli MG1655 AldhA::FRT ApflAB:: cm.

A continuación, se sustituyeron ambos genes, pflA y pflB, por un casete de resistencia al cloranfenicol en la cepa MG1655 AldhA::FRTy se llevó a cabo la eliminación mediante transducción generalizada de fago PI a partir del lisado del mutante único (Miller, 1972).

Se seleccionaron los transductantes CmR en la placa y la sustitución de los genes pflAB por el casete de cloranfenicol enMG1655AldhA::FRT se comprobó mediante análisis de PCR utilizando ambos oligonucleótidos, pflAB1 y pflAB2. Finalmente, también se utilizaron los cebadores hslJC y ldhAC2 en el análisis de PCR para confirmar la eliminación de ldhA, el gen en la cepa ApflAB::cm. La cepa resultante se denominó MG1655 AldhA::FRT ApflAB::cm.

A continuación se eliminó el casete de resistencia al cloranfenicol mediante la utilización del plásmido pCP20 auxiliar Flp (Cheperanov y Wagernagel, 1995). Se transformaron los mutantes CmR con pCP20 y los transformantes resistentes a ampicilina se seleccionaron a 30°C, seguido de la purificación de colonias de algunos a 42°C y después se sometieron a ensayo para pérdida de la resistencia a antibióticos mediante análisis de PCR utilizando los oligonucleótidos anteriormente indicados (SEC ID n° 16 y n° 17). La nueva cepa se denominó MG1655 AldhA::FRT ApflAB::FRT.

3.1.4 Construcción de una cepa modificada de E. coli MG1655 AackA-pta::cm:

Se sustituyeron los genes ackA-pta por un casete de al antibiótico cloranfenicol flanqueado por la diana de reconocimiento de Flp (FRT), que se generó mediante PCR mediante la utilización de cebadores con extensiones de homología de 80 nt, eliminando la mayor parte del gen en cuestión. La técnica utilizada fue descrita por Datsenko y Wanner en 2000.

Se diseñaron dos oligonucleótidos y se utilizaron para sustituir los genes ackA-pta:

1. DackAf, que consta de 100 bases (SEC ID n° 18):

gtcgagtaagttagtactggttctgaactgcggtagttcttcactgaaatttgccatcatcgatgcagtaaatggtgaagTGTAGGCTGG AGCTGCTTCG

Con una región (letras minúsculas) homóloga de la secuencia (2411494-2411573) del gen ackA (secuencia 2411492 a 2412694), una secuencia de referencia en el sitio de internet http://ecocyc.org/y una región (letras mayúsculas) para la amplificación del casete de resistencia al cloranfenicol transportado en el plásmido pKD3 (Datsenko y Wanner, 2000).

2. Dptar, que consta de 97 bases (SEC ID n° 19):

tgctgtgcagactgaatcgcagtcagcgcgatggtgtagacgatatcgtcaaccagtgcgccacgggacaggtcgttCATATGAATA TCCTCCTTAG

Con una región (letras minúsculas) homóloga a la secuencia (2414906-2414830) del gen pta (secuencia 2412769 a 2414913), una secuencia de referencia en el sitio de internet http://ecocyc.org/ y una región (letras mayúsculas) para la amplificación del casete de resistencia al cloranfenicol transportado en el plásmido pKD3. Se utilizaron ambos oligonucleótidos, DackAf y Dptar, para amplificar el casete de resistencia al cloranfenicol a partir del plásmido pKD3. A continuación, se introdujo mediante electroporación el fragmento de PCR amplificado en la cepa E. coli MG1655 portadora del plásmido auxiliar RED (pKD46) que expresa los genes del sistema a, p y exo codificantes de las recombinasas Gam, Bet y Exo para fomentar la recombinación homóloga. A continuación, se seleccionaron los transformantes resistentes a antibiótico y se comprobó la sustitución de los genes ackA-pta por el casete de cloranfenicol mediante análisis de PCR utilizando ambos oligonucleótidos B2295f y YfcCR.

3. B2295f (SEC ID n° 20):

gcatgggtaaacttaaggcg (homólogo de la secuencia 2410902 a 2410921)

4. YfcCr (SEC ID n° 21):

taatcaccaacgtatcgggc (homólogo de la secuencia 2415147 a 2415166).

3.1.5: construcción de una cepa modificada de E. coli MG1655 AldhA::FRT ApflAB::FRT AackA-pta::FRT A continuación, se sustituyeron ambos genes, ackA y pta, por un casete de resistencia al cloranfenicol flanqueado por la diana de reconocimiento de Flp (FRT) en la cepa MG1655 AldhA::FRT ApflAB::FRTy se llevó a cabo la eliminación mediante transducción generalizada de fago P1 a partir del lisado de mutante único (Miller, 1972). Se seleccionaron los transductantes CmR en la placa y la sustitución de los genes ackA-pta por el casete de cloranfenicol enMG1655AldhA::FRT ApflAB::FRT se comprobó mediante análisis de PCR utilizando ambos oligonucleótidos, B2295f y YfcCr. Finalmente, tanto el par de cebadores hslJC e ldhAC2 como el par pFlAB1 y pflAB2 fueron utilizados en análisis de PCR para confirmar la eliminación de los genes ldhA y pflAB en la cepa AackA-pta::cm. La cepa resultante se denominó MG1655 AldhA::FRT ApflAB::FRT AackA-pta::cm.

A continuación se eliminó el casete de resistencia al cloranfenicol mediante la utilización del plásmido pCP20 auxiliar Flp (Cheperanov y Wagernagel, 1995). Se transformaron los mutantes CmR con pCP20 y los transformantes resistentes a ampicilina se seleccionaron a 30°C, seguido de la purificación de colonias de algunos a 42°C y el ensayo para pérdida de la resistencia a antibióticos mediante análisis de PCR utilizando los oligonucleótidos anteriormente indicados (SEC ID n° 20 y n° 21). La nueva cepa se denominó MG1655 AldhA::FRT ApflAB::FRT AackA-pta::FRT.

3.1.7 Construcción de una cepa modificada de E. coli MG1655 AiscR::km

Se sustituyeron los genes iscR por un casete de resistencia a la canamicina flanqueado por la diana de reconocimiento de Flp (FRT), que se generó mediante PCR mediante la utilización de cebadores con extensiones de homología de 50 nt, eliminando la mayor parte del gen en cuestión. La técnica utilizada fue descrita por Datsenko y Wanner en 2000.

Se diseñaron dos oligonucleótidos y se utilizaron para sustituir el gen iscR:

1. DiscRf, que consta de 70 bases (SEC ID n° 22):

tacaataaaaaaccccgggcaggggcgagtttgaggtgaagtaagacatgATTCCGGGGATCCGTCGACC

Con una región (letras minúsculas) homóloga de la secuencia (2660151 a 2660200) correspondiente a la secuencia cromosómica cadena arriba del gen iscR (secuencia 2659665 a 2660153), una secuencia de referencia en el sitio de internet http://ecocvc.org/. incluyendo el codón de inicio del gen iscR y una región (letras mayúsculas) para la amplificación del casete de resistencia a la canamicina transportado por el plásmido pKD13.

2. DiscRr, que consta de 70 bases (SEC ID n° 23):

cactccggcctgattctgaattctttttattaagcgcgtaacttaacgtcTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG

Con una región (letras minúsculas) homóloga de la secuencia (2659636 a 2659685) correspondiente a la secuencia cromosómica cadena abajo del gen iscR (secuencia 2659665 a 2660153), una secuencia de referencia en el sitio de internet http://ecocvc.org/. incluyendo los codones para los seis codones C-terminales y el codón de parada del gen iscR, y una región (letras mayúsculas) para la amplificación del casete de resistencia a la canamicina del plásmido pKD13 (Datsenko y Wanner, 2000).

Se utilizaron ambos oligonucleótidos, DiscRf y DiscRr, para amplificar el casete de resistencia a la canamicina a partir del plásmido pKD13. A continuación, se introdujo mediante electroporación el fragmento de PCR amplificado en la cepa E. coli MG1655 portadora del plásmido auxiliar RED (pKD46) que expresa los genes del sistema a, p y exo codificantes de las recombinasas Gam, Bet y Exo para fomentar la recombinación homóloga. A continuación, se seleccionaron los transformantes resistentes a antibiótico y se comprobó la sustitución del gen iscR por el casete de cloranfenicol mediante análisis de PCR utilizando los oligonucleótidos iscrls e iscrlrv

3. iscrls (SEC ID n° 24): cgccgcatccgacaacagg (homólogo de la secuencia 2660325 a 2660343)

4. iscrlrv (SEC ID n° 25): tgctggtgatgatgtgcttgcct (homólogo de la secuencia 2659253 a 2659275).

3.1.8 Construcción de una cepa modificada E. coli MG1655 AldhA::FRTApfZAB::FRTAackA-pta::FRT AiscR::FRT.

A continuación, se sustituyó el gen iscR por un casete de resistencia a la canamicina en la cepa MG1655 AldhA::FRT ApflAB::FRT AackA-pta::FRT y se llevó a cabo la eliminación mediante transducción generalizada de fago P1 a partir del lisado del mutante único (Miller, 1972).

Se seleccionaron los transductantes KmR en la placa y se comprobó la sustitución del gen iscR por el casete de canamicina en MG1655AldhA::FRT ApflAB::FRT AackA-pta:FRT mediante análisis de PCR utilizando ambos oligonucleótidos, iscrs e iscrlrv. Finalmente, también se utilizaron los pares de cebadores i) hslJC e ldhAC2, ii) pFLAB 1 y pflAB2 y iii) B2295f y YfcCR en el análisis de PCR para cONFIrmar la eliminación de los genes IdhA, pflAB y ackA-pta, respectivamente, en la cepa AiscR::km. La cepa resultante se denominó MG1655 AldhA::FRT ApflAB::FRT AackA-pta::FRT AiscR::km. A continuación se eliminó el casete de resistencia a la canamicina mediante la utilización del plásmido pCP20 auxiliar Flp (Cheperanov y Wagernagel, 1995). Se transformaron los mutantes CmR con pCP20 y los transformantes resistentes a ampicilina se seleccionaron a 30°C, seguido de la purificación de colonias de algunos a 42°C y el ensayo para pérdida de la resistencia a antibióticos mediante análisis de PCR utilizando los oligonucleótidos anteriormente indicados (SEC ID n° 24 y n° 25). La nueva cepa se denominó MG1655 AldhA::FRT ApflAB::FRT AackA-pta::FRT AiscR::FRT.

3.1.9 Construcción de una cepa modificada de E. coli MG1655 AfrdABCD::cm:

Se sustituyeron los genes frdA, frdB, frdC y frdD por un casete de resistencia al antibiótico cloranfenicol flanqueado por una diana de reconocimiento de Flp (FRT) que se generó mediante PCR mediante la utilización de cebadores con extensiones de homología de 50 nt, eliminando la mayor parte de los genes en cuestión. La técnica utilizada fue descrita por Datsenko y Wanner en 2000.

Se diseñaron dos oligonucleótidos y se utilizaron para sustituir los genesfrdA, frdB, frdC y frdD:

1. DfrdAf, que consta de 70 bases (SEC ID n° 26):

accctgaagtacgtggctgtgggataaaaacaatctggaggaatgtcgtgTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG

Con una región (letras minúsculas) homóloga de la secuencia (4380339 a 4380388) correspondiente a la secuencia cromosómica cadena arriba del gen frdA (secuencia 4378533 a 4380341), una secuencia de referencia en el sitio de internet http://ecocvc.org/. incluyendo el codón de inicio del gen frdA y una región (letras mayúsculas) para la amplificación del casete de resistencia al cloranfenicol del plásmido pKD3 (Datsenko y Wanner in 2000).

2. DfrdDr, que consta de 70 bases (SEC ID n° 27):

aggcgggccggatttacattggcgatgcgttagattgtaacgacaccaatCATATGAATATCCTCCTTAG

Con una región (letras minúsculas) homóloga de la secuencia (4377001 a 4377050) correspondiente a la secuencia cromosómica cadena abajo del gen frdD (secuencia 4377030 a 4377389), una secuencia de referencia en el sitio de internet http://ecocyc.org/. incluyendo los codones para los seis codones C-terminales y el codón de parada del gen frdD. y una región (letras mayúsculas) para la amplificación del casete de resistencia al cloranfenicol transportado por el plásmido pKD13.

Se utilizaron ambos oligonucleótidos, DfrdAf y DfrdDr. para amplificar el casete de resistencia al cloranfenicol a partir del plásmido pKD3. A continuación, se introdujo mediante electroporación el fragmento de PCR amplificado en la cepa E. coli MG1655 portadora del plásmido auxiliar RED (pKD46) que expresa los genes del sistema a, p y exo codificantes de las recombinasas Gam, Bet y Exo para fomentar la recombinación homóloga. A continuación, se seleccionaron los transformantes resistentes a antibiótico y se comprobó la sustitución de los genes frdABCD por el casete de cloranfenicol mediante análisis de PCR utilizando ambos oligonucleótidos, frdABCDIs y frdABCDIrv.

3. frdABCDIs (SEC ID n° 28):

ctggctcatacaaggcgtctcc (homólogo de la secuencia 4380779 a 4380800)

4. frdABCDIrv (SEC ID n° 29):

tcccattccactgtttagcggta (homólogo de la secuencia 4376610 a 4376632).

3.1.10 Construcción de una cepa modificada E. coli MG1655 AldhA::FRTApflAB::FRTAackA-pta::FRTAiscR::FRT AfrdABCD::FRT.

A continuación, se sustituyeron los genes frdABCD por un casete de resistencia al cloranfenicol en la cepa MG1655 AldhA::FRT ApflAB::FRT AackA-pta::FRT AiscR::FRT y se llevó a cabo la eliminación mediante transducción generalizada del fago P1 a partir de llisado del mutante único (Miller 1972).

Se seleccionaron los transductantes CmR en la placa y se comprobó la sustitución de los genes frdABCD por el casete de cloranfenicol en MG1655AldhA::FRT ApflAB::FRT AackA-pta::FRT AiscR::FRT mediante análisis de PCR utilizando ambos oligonucleótidos, frdABCD1s y frdABCD1rv. Finalmente, también se utilizaron los pares de cebadores i) hslJC e ldhAC2, ii) pFLAB1 y pflAB2 iii) B2295f e YfcCR y iv) iscrls e iscrlrv en el análisis de PCR para confirmar la eliminación de los genes IdhA, pflAB ackA-pta e iscR, respectivamente, en la cepa AiscR::km. La cepa resultante se denominó MG1655 AldhA::FRT ApflAB.FRT AackA-pta::FRT AiscR::FRT AfrdABCD::cm.

A continuación, se eliminó el casete de resistencia al cloranfenicol mediante la utilización del plásmido pCP20 auxiliar Flp (Cheperanov y Wagernagel, 1995). Se transformaron los mutantes CmR con pCP20 y los transformantes resistentes a ampicilina se seleccionaron a 30°C, seguido de la purificación de colonias de algunos a 42°C y después se sometieron a ensayo para pérdida de la resistencia a antibióticos mediante análisis de PCR utilizando los oligonucleótidos anteriormente indicados (SEC ID n° 28 y n° 29). La nueva cepa se denominó MG1655 AldhA::FRT ApflAB::FRT AackA-pta::FRT AiscR::FRT AfrdABCD::FRT.

3.1.11 Construcción de una cepa modificada de E. coli MG1655 AaceE::km:

Se sustituyeron los genes aceE por un casete de resistencia a la canamicina flanqueado por la diana de reconocimiento de Flp (FRT), que se generó mediante PCR mediante la utilización de cebadores con extensiones de homología de 50 nt, eliminando la mayor parte del gen en cuestión. La técnica utilizada fue descrita por Datsenko y Wanner en 2000.

Se diseñaron dos oligonucleótidos y se utilizaron para sustituir el gen aceE:

1. DaceEf, que consta de 70 bases (SEC ID n° 30):

acaggttccagaaaactcaacgttattagatagataaggaataacccatgATTCCGGGGATCCGTCGACC

Con una región (letras minúsculas) homóloga de la secuencia (122970 a 123019) correspondiente a la secuencia cromosómica cadena arriba del gen aceE (secuencia 123017 a 125680), una secuencia de referencia en el sitio de internet http://ecocvc.org/. incluyendo el codón de inicio del gen aceE y una región (letras mayúsculas) para la amplificación del casete de resistencia a la canamicina transportado por el plásmido pKD13 (Datsenko y Wanner 2000).

2. DaceEr, que consta de 70 bases (SEC ID n° 31):

gatttcgatagccattattcttttacctcttacgccagacgcgggttaacTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG

Con una región (letras minúsculas) homóloga de la secuencia (125660 a 125709) correspondiente a la secuencia cromosómica cadena abajo del gen aceE (secuencia 123017 a 125680), una secuencia de referencia en el sitio de internet http://ecocyc.org/. incluyendo los codones para los seis codones C-terminales y el codón de parada del gen aceE. y una región (letras mayúsculas) para la amplificación del casete de resistencia a la canamicina del plásmido pKD13 (Datsenko y Wanner. 2000).

Se utilizaron ambos oligonucleótidos, DaceEf y DaceEr. para amplificar el casete de resistencia a la canamicina a partir del plásmido pKD13. A continuación. se introdujo mediante electroporación el fragmento de PCR amplificado en la cepa E. coli MG1655 portadora del plásmido auxiliar RED (pKD46) que expresa los genes del sistema a. p y exo codificantes de las recombinasas Gam. Bet y Exo para fomentar la recombinación homóloga. A continuación. se seleccionaron los transformantes resistentes a antibiótico y se comprobó la sustitución de los genes aceE por el casete de canamicina mediante análisis de PCR utilizando ambos oligonucleótidos. aceEs y aceErv.

3. aceEs (SEC ID n° 32): gagagccgccgtgagcgttc (homólogo de la secuencia 122806 a 122825)

4. aceErv (SEC ID n° 33): ctgcaccgtcggcggaatcg (homólogo de la secuencia 125916 a 125935).

3.1.12 Construcción de una cepa modificada E. coli MG1655AldhA::FRTApflAB::FRTAackA-pta::FRTAiscR ::FRTAfrdABCD::FRTAaceE::FR7

A continuación. se sustituyó el gen aceE por el casete de resistencia a la canamicina en la cepa MG1655 AldhA::FRT ApflAB::FRT AackA-pta:FRT AiscR::FRTAfrdABCD::FRTy se llevó a cabo la eliminación mediante transducción generalizada de fago P1 a partir del lisado del mutante único (Miller 1972).

Se seleccionaron los transductantes kmR en la placa y se comprobó la sustitución del gen aceE por el casete de canamicina en MG1655 AldhA::FRT ApflAB::FRT AackA-pta::FRT AiscR ::FRTAfrdABCD::FRT mediante análisis de PCR utilizando ambos oligonucleótidos. aceEs y aceErv. Finalmente. también se utilizaron los pares de cebadores i) hslJC e ldhAC2, ii) pFLAB1 y pflAB2 iii) B2295f y YfcCR, iv) iscrls e iscrlrv y v) frdABCDls y frdABCD1rv en análisis de PCR para confirmar la eliminación de los genes IdhA, pflAB, ackA-pta, iscR y frdABCD. respectivamente. en la cepa AaceE::kan. La cepa resultante se denominó MG1655 AldhA::FRT ApflAB::FRT AackA-pta::FRT AiscR::FRT AaceE::km.

A continuación se eliminó el casete de resistencia a la canamicina mediante la utilización del plásmido pCP20 auxiliar Flp (Cheperanov y Wagernagel, 1995). Se transformaron los mutantes KmR con pCP20 y los transformantes resistentes a ampicilina se seleccionaron a 30°C. seguido de la purificación de colonia de algunos a 42°C y el ensayo para pérdida de la resistencia a antibióticos mediante análisis de PCR utilizando los oligonucleótidos anteriormente indicados (SEC ID n° 32 y n° 33). La nueva cepa se denominó MG1655 AldhA::FRT ApflAB::FRT AackA-pta::FRT AiscR::FRT AfrdABCD::FRT AaceE::FRT.

3.1.13 Construcción de una cepa modificada E. coli MG1655 AmgsA::cm:

Se sustituyeron los genes mgsA por un casete de resistencia al cloranfenicol flanqueado por la diana de reconocimiento de Flp (FRT). que se generó mediante PCR mediante la utilización de cebadores con extensiones de homología de 50 nt. eliminando la mayor parte del gen en cuestión. La técnica utilizada fue descrita por Datsenko y Wanner en 2000.

Se diseñaron dos oligonucleótidos y se utilizaron para sustituir el gen mgsA:

1. DmgsAf, que consta de 70 bases (SEC ID n° 34):

taagtgcttacagtaatctgtaggaaagttaactacggatgtacattatgTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG

Con una región (letras minúsculas) homóloga de la secuencia (1026236 a 1026285) correspondiente a la secuencia cromosómica cadena arriba del gen mgsA (secuencia 1025780 a 1026238), una secuencia de referencia en el sitio de internet http://ecocvc.org/. incluyendo el codón de inicio del gen mgsA y una región (letras mayúsculas) para la amplificación del casete de resistencia al cloranfenicol del plásmido pKD3.

2. DmgsAr, que consta de 70 bases (SEC ID n° 35):

aacaggtggcgtttgccacctgtgcaatattacttcagacggtccgcgagCATATGAATATCCTCCTTAG

Con una región (letras minúsculas) homóloga de la secuencia (1025751 a 1025800) correspondiente a la secuencia cromosómica cadena abajo del gen mgsA (secuencia 1025780 a 1026238), una secuencia de referencia en el sitio de internet http://ecocvc.org/. incluyendo los codones para los seis codones C-terminales y el codón de parada del gen mgsA. y una región (letras mayúsculas) para la amplificación del casete de resistencia al cloranfenicol transportado por el plásmido pKD13.

Se utilizaron ambos oligonucleótidos, DmgsAf y DmgsAr. para amplificar el casete de resistencia al cloranfenicol a partir del plásmido pKD3. A continuación, se introdujo mediante electroporación el fragmento de PCR amplificado en la cepa E. coli MG1655 portadora del plásmido auxiliar RED (pKD46) que expresa los genes del sistema a, p y exo codificantes de las recombinasas Gam, Bet y Exo para fomentar la recombinación homóloga. A continuación, se seleccionaron los transformantes resistentes a antibiótico y se comprobó la sustitución del gen mgsA por el casete de cloranfenicol mediante análisis de PCR utilizando ambos oligonucleótidos mgsAs y mgsArv.

3. mgsAs (SEC ID n° 36): cccagctcatcaaccaggtc (homólogo de la secuencia 1026715 a 1026734)

4. mgsArv (SEC ID n° 37): ggagtcgattatggaagaggcg (homólogo de la secuencia 1025559 a 1025580).

3.1.14 Construcción de una cepa modificada E. coli MG1655AldhA::FRTApflAB::FRTAackA-pta::FRTAiscR::FRTAfrdABCD::FRTAaceE::FRTAmgsA::FRT.

A continuación, el gen mgsA se sustituyó por un casete de resistencia al cloranfenicol en la cepa MG1655AldhA::FRT ApflAB::FRT AackA-pta::FRT AiscR::FRT AfrdABCD::FRTAaceE::FRT y la eliminación se llevó a cabo mediante transducción generalizada de fago P1 a partir del lisado del mutante único (Miller 1972).

Se seleccionaron los transductantes CmR en la placa y se comprobó la sustitución del gen mgsA por el casete de cloranfenicol en MG1655 AldhA::FRT ApflAB::FRT AackA-pta::FRT AiscR ::FRT AfrdABCD::FRT AaceE::FRT mediante análisis de PCR utilizando ambos oligonucleótidos, mgsAs y mgsArv. Finalmente, también se utilizaron los pares de cebadores i) hslJC e ldhAC2, ii) pFLAB1 y pflAB2 iii) B2295f y YfcCR, iv) iscrls e iscrlrv, v) frdABCD1s y frdABCD1rv y vi) aceEs y aceErv en análisis de Pcr para confirmar la eliminación de los genes IdhA, pflAB, ackA-pta, iscR, frdABCD y aceE, respectivamente en la cepa AmgsA::cm. La cepa resultante se denominó MG1655 AldhA::FRT ApflAB::FRT AackA-pta::FRT AiscR::FRT AfrdABCD::FRT AaceE::FRT AmgsA::cm. A continuación, se eliminó el casete de resistencia al cloranfenicol mediante la utilización del plásmido pCP20 auxiliar Flp (Cheperanov y Wagernagel, 1995). Se transformaron los mutantes CmR con pCP20 y los transformantes resistentes a ampicilina se seleccionaron a 30°C, seguido de la purificación de colonias de algunos a 42°C y el ensayo para pérdida de la resistencia a antibióticos mediante análisis de PCR utilizando los oligonucleótidos anteriormente indicados (SEC ID n° 36 y n° 37). La nueva cepa se denominó MG1655 AldhA::FRT ApflAB::FRT AackA-pta::FRT AiscR::FRT AfrdABCD::FRT AaceE::FRT AmgsA::FRT.

3.2 Construcción del vector de expresión pSC101-pGI1.6-cac2229-cac0764-cac0303

En primer lugar, se diseñaron tres genes sintéticos: CA_C2229, CA_C0764 y CA_C0303 codificantes de la ferredoxina oxidorreductasa, la ferredoxina NADP+ reductasa y la ferredoxina, respectivamente, a partir de Clostridium acetobutylicum, utilizando el método denominado de armonización de codones (Angov et al. 2008). Se seleccionaron los codones sinónimos de E. coli que se correspondiesen el máximo posible con la frecuencia de uso de codones de los genes nativos de C. acetobutylicum. Basándose en las secuencias generadas, los genes sintéticos fueron sintetizados adicionalmente por Life Technologies (ThermoFisher Scientific, Saint Aubin, Francia) mediante la introducción de la región RBS nativa junto con cada gen, así como la introducción de dos sitios de restricción únicos cadena arriba y cadena abajo de cada gen. A continuación, cada gen sintético con su región RBS flanqueada por dos sitios de restricción únicos se subclonó en el vector pCR4TOPO (Invitrogen, Saint Aubin, Francia) antes de ser clonados como operón en un plásmido derivado de pSC101 de bajo número de copia (Bernardi y Bernardi, 1984) bajo el control del promotor GI 1.6 (Meynial-Salles et al., 2005, Soucaille et al., 2012) y cadena arriba del terminador adc (de C. acetobutylicum), proporcionando el plásmido pSC101-pGI-cac2229-cac0764-cac0303, de 9.54 kb.

3.3 Introducción del vector de expresión pSC101-PGI-cac2229-cac0764-cac0303 en la cepa de E. coli MG1655 AldhA::FRT ApflAB::FRTAackA-pta::FRTAiscR::FRTAfrdABCD::FRT AaceE::FRTAmgsA::FRT.

Se utilizó el vector de expresión pSC101-PGI-cac2229-cac0764-cac0303 para transformar MG1655 AldhA::FRTApflAB::FRTAackA-pta:FRTAiscR::FRTAfrdABCD::FRT AaceE::FRTAmgsA::FRT mediante electroporación (Sambrook y Russel, 2001).

Se seleccionaron los transformantes en placas de agar LB complemetnado con espectinomicina (70 |jg/ml) a 37°C. A continuación, se cultivaron algunos transformantes en cultivo líquido de LB complementado con espectinomicina (100 jg/m l) durante la noche a 37°C para llevar a cabo la extracción del plásmido de ADN (kit miniprep de plásmido HP GenElute, Sigma) y comprobar la presencia del plásmido pSC101-PGI-cac2229-cac0764-cac0303. Finalmente se controló el plásmido pSC101-pGI-cac2229-cac0764-cac0303 mediante el perfil de restricción.

La cepa final de E. coli MG1655 AldhA::FRT ApflAB::FRT AackA-pta::FRT AiscR::FRT AfrdABCD:FRT AaceE::FRT AmgsA::FRT (pSC101-PGI-cac2229-cac0764-cac0303) se cultivó en medio líquido LB complementado con espectinomicina (100 jg/m l) y se mantuvo en solución de glicerol al 20% a -80°C.

3.4 Caracterización fisiológica de la cepa de E. coli MG1655 AldhA::FRTApflAB::FRTAackA-pta::FRTAiscR::FRTAfrdABCD::FRT AaceE::FRTAmgsA::FRT (pSC101-pGI1.6-cac2229-cac0764-cac0303):

La cepa de E. coli MG1655 AldhA::FRT ApflAB::FRT AackA-pta::FRT AiscR::FRT AfrdABCD::FRT AaceE::FRT AmgsA::FRT (pSC101-pGI1.6-cac2229-cac0764-cac0303) se cultivó anaeróbicamente en un medio mineral que contenía 20 g/l de glucosa que contenía sales minerales, tal como se ha indicado anteriormente (Meynial-salles et al. 2005) complementado con 4 g/l de extracto de levadura, nitrato sódico 5 mM y espectinomicina (100 jg/ml), y se inoculó con 100 j l de un cultivo de durante la noche en LB. Las células se cultivaron a 37°C durante varios días y se mantuvo el pH mediante tamponado del medio de cultivo con MOPS. Como controles, se cultivaron las cepas de E. coli MG1655 AldhA::FRT ApflAB::FRT AackApta::FRT AiscR::FRT AfrdABCD::FRT AaceE::FRT AmgsA::FRT E.coli (sin plásmido) y MG1655 AldhA::FRT ApflAB::FRT AackApta::FRT AiscR::FRT AfrdABCD::FRT AaceE::FRT AmgsA::FRT (pSC101-pGI1.6-cac2229-cac0303) (sin el gen cac0764) bajo las mismas condiciones.

El análisis fenotípico comparativo se llevó a cabo mediante medición de tanto el consumo de glucosa como la concentración de productos de fermentación para el cultivo de cada cepa, tal como se muestra en la tabla 3:

Tal como se muestra en la tabla 3, la expresión del operón sintético completo CA_C2229-CA_C0764-CA C0303 en E. coli MG1655 AldhA::FRTApflAB::FRTAackApta::FRTAiscR::FRTAfrdABCD::FRTAaceE::FRTAmgsA::FRT condujo a la producción de etanol como el producto de fermentación principal a partir de glucosa con un rendimiento de 42.5 g/g de glucosa consumida, correspondiente a 83% del rendimiento teórico. Además, la expresión del operón sintético completo CA_C2229-CA_C0764-CA_C0303 favoreció el crecimiento, que se vio fuertemente perjudicado en ambas cepas de control, ya que las cepas eran incapaces de equilibrar el redox. 3.5 Determinación de la actividad de la ferredoxina NADP+ reductasa en la cepa de E. coli MG1655 AldhA::FRTApfíAB::FRTAackA-pta::FRTAiscR::FRTAfrdABCD::FRT AaceE::FRTAmgsA::FRT (pSC101-pGI1.6-cac2229-cac0764-cac0303):

La cepa de E. coli MG1655 AldhA::FRTApflAB::FRTAackA-pta::FRTAiscR::FRTAfrdABCD::FRT AaceE::FRTAmgsA::FRT (pSC101-pGI1.6-cac2229-cac0764-cac0303) se cultivó anaeróbicamente en un medio de 20 g/l de glucosa que contenía sales minerales, tal como se ha indicado anteriormente (Meynial-salles et al., 2005) complementado con 4 g/l de extracto de levadura, nitrato sódico 5 mM y espectinomicina (100 ^g/ml), y se inoculó con 100 ^l de un cultivo de durante la noche en LB. Las células se cultivaron a 37°C hasta una DO⁵⁵⁰nm aproximada de 2, y se mantuvo el pH mediante tamponado del medio de cultivo con MOPS. Como controles, se cultivaron ambos MG1655 AldhA::FRTApflAB::FRTAackApta::FRTAiscR::FRTAfrdABCD::FRTAaceE::FRTAmgsA::FRT (pSC101-pGI1.6-cac2229-cac0303) (sin el gen cac0764) bajo las mismas condiciones. Las células se transfirieron a una cámara anaeróbica, se recolectaron, se lavaron y se concentraron 20 veces en tampón de Tris-HCl 100 mM, DTT 2 mM, glicerol al 10% (pH 7.6), se congelaron a -80°C o se utilizaron inmediatamente. Las células se fragmentaron adicionalmente mediante sonicación utilizando un desintegrador ultrasónico (Vibracell 72434, Bioblock) a 4°C en cuatro ciclos de 30 s a intervalos de 2 min. Se separaron los residuos mediante centrifugación a 8600 g durante 10 min, a 4°C (centrífuga Sigma, 2-16K) y el extracto en bruto acelular se cargó en una columna SephadexG25 para eliminar las sales y metabolitos, antes de determinar la actividad de ferredoxina NADP+ reductasa utilizando ferredoxina como sustrato y siguiendo el procedimiento ya descrito en 1.1 (tabla C).

Tabla C: se determinaron las actividades de ferredoxina-NADP+ reductasa en extractos en bruto utilizando ferredoxina como sustrato:

Ejemplo 4: producción heteróloga de n-butanol mediante una nueva ruta metabólica en una cepa de E. coli con una actividad potenciada de ferredoxina NADP+ reductasa:

4.1: construcción de una cepa modificada E. coli MG1655AldhA::FRT, ApflAB::FRT, Aackpta::FRT, AiscR::FRT, AfrdABCD::FRT Aace::FRT, AmgsA::FRT AadhE::FRT AmelB::TT02-Ptrc01/RBS01*2-crfhbd-TT07-FRT ptrc30/RBS01*2-atoB-FRT

4.1.1: construcción de una cepa modificada E. coli MG1655 AadhE::FRT-cm-FRT:

Se sustituyó el gen adhE por un casete de resistencia al cloranfenicol flanqueado por la diana de reconocimiento de Flp (FRT), que se generó mediante PCR mediante la utilización de cebadores con extensiones de homología de 80 nt, eliminando la mayor parte del gen en cuestión. La técnica utilizada fue descrita por Datsenko y Wanner en 2000.

Se diseñaron dos oligonucleótidos y se utilizaron para sustituir el gen adhE:

DadhE r de 100 bases (SEC ID n° 38):

atggctgttactaatgtcgctgaacttaacgcactcgtagagcgtgtaaaaaaagcccagcgtgaatatgccagtttcactCATATGAAT ATCCTCCTTAG

Con una región (letras minúsculas) homóloga de la secuencia (1297264 a 1297344), incluyendo el codón de inicio del gen adhE (secuencia 1294669 a 1297344), una secuencia de referencia en el sitio de intemet http://ecocyc.org/, y una región (letras mayúsculas) para la amplificación del casete de resistencia al cloranfenicol del plásmido pKD3. DadhEf de 100 bases (SEC ID n° 39):

ttaagcggattttttcgcttttttctcagctttagccggagcagcttctttcttcgctgcagtttcaccttctacataat TGTAGGCTGGAGCTGCTTCG

Con una región (letras minúsculas) homóloga de la secuencia (1294693 a 1294748) correspondiente a la secuencia cromosómica cadena abajo del gen adhE (secuencia 1294669 a 1297344), una secuencia de referencia en el sitio de internet http://ecocyc.org/ y una región (letras mayúsculas) para la amplificación del casete de resistencia al cloranfenicol transportado por el plásmido pKD3.

Se utilizaron ambos oligonucleótidos, DadhEf y DadhEr, para amplificar el casete de resistencia al cloranfenicol a partir del plásmido pKD3. A continuación, se introdujo mediante electroporación el fragmento de PCR amplificado en la cepa E. coli MG1655 portadora del plásmido auxiliar RED (pKD46) que expresa los genes del sistema a, p y exo codificantes de las recombinasas Gam, Bet y Exo para fomentar la recombinación homóloga. A continuación, se seleccionaron los transformantes resistentes a antibiótico y se comprobó la sustitución del gen adhE por el casete de cloranfenicol mediante análisis de PCR utilizando ambos oligonucleótidos ychGf y adhECr. ychGf (SEC ID n° 40) : ggctcattgcaccaccatccag (homólogo de la secuencia 1294357 a 1294378) adhECr (SEC ID n° 41) : gaaaagacgcgctgacaatacgcc (homólogo de la secuencia 1297749 a 1297772).

4.1.2. Construcción de una cepa modificada E. coli MG1655AldhA::FRTApflAB::FRTAackA-pta::FRTAiscR::FRTAfrdABCD::FR TAaceE::FRTAmgsA::FRTAadhE::FRT.

A continuación, se sustituyó el gen adhE por un casete de resistencia al cloranfenicol en la cepa MG1655AldhA::FRT ApflAB::FRTAackA-pta::FRTAiscR::FRT AfrdABCD::FRT AaceE::FRT AmgsA::FRT y se llevó a cabo la eliminación mediante transducción generalizada del fago P1 a partir del lisado del mutante único (Miller 1972).

Se seleccionaron los transductantes CmR en una placa y se comprobó la sustitución del gen adhE por el casete de cloranfenicol en MG1655 AldhA::FRT ApflAB::FRT AackA-pta::FRTAiscR::FRT AfrdABCD::FRTAaceE::FRT AmgsA::FRT mediante análisis de PCR utilizando ambos oligonucleótidos, ychGf y adhECr. Finalmente, también se utilizaron los pares de cebadores i) hslJC y ldhAC2, ii) pFLAB1 y pflAB2 iii) B2295f y YfcCR, iv) iscrls e iscrlrv, v) frdABCDls y frdABCDlrv, vi) aceEs y aceErv, y vii) mgsAs y mgsArv en análisis de PCR para confirmar la eliminación de los genes idhA, pflAB, ackA-pta, iscR, frdABCD, aceE y mgsA, respectivamente, en la cepa AadhE::cm. La cepa resultante se denominó MG1655 AldhA::FRT ApflAB::FRT AackA-pta::FRT AiscR::FRT AfrdABCD::FRT AaceE::FRT AmgsA::FRT AadhE::cm.

A continuación se eliminó el casete de resistencia al cloranfenicol mediante la utilización del plásmido pCP20 auxiliar Flp (Cheperanov y Wagernagel, 1995). Se transformaron los mutantes CmR con pCP20 y los transformantes resistentes a ampicilina se seleccionaron a 30°C, seguido de la purificación de colonias de algunos a 42°C y el ensayo para pérdida de la resistencia a antibióticos mediante análisis de PCR utilizando los oligonucleótidos anteriormente indicados (SEC ID n° 40 y n° 41). La nueva cepa se denominó MG1655 AldhA::FRT ApflAB::FRT AackA-pta::FRT AiscR::FRT AfrdABCD::FRT AaceE::FRT AmgsA::FRT AadhE::FRT.

4.1.3 Construcción de una cepa modificada E. coli MG1655AmelB::TT02-ptrc01/RBS01*2-crf-hbd-TT07-Km En primer lugar se diseñaron los dos genes sintéticos CA C2712 y CA C2708, codificantes de crotonasa y phidroxi-butiril-CoA deshidrogenasa, respectivamente, de Clostridium acetobutylicum , utilizando el método denominado de armonización de codones (Angov et al. 2008). Se seleccionaron los codones sinónimos de E. coli que se correspondiesen el máximo posible con la frecuencia de uso de codones de los genes nativos de C. acetobutylicum. Basándose en las secuencias generadas, los genes sintéticos fueron sintetizados adicionalmente en un operón por Life Technologies (ThermoFisher Scientific, Saint Aubin, Francia) mediante la introducción de la región RBS01 nativa junto con cada gen, así como la introducción de dos sitios de restricción únicos cadena arriba y cadena abajo de cada gen. A continuación, el operón sintético crt-hbd se clonó bajo el control del promotor ptrc01 en pUC18-TTadc-CI*0-PlambdaR*(-35)-AmelB::Km (Norrander et al., 1983) portador de dos regiones homólogas del locus melB y el casete de resistencia a la canamicina. El plásmido se digirió con SmaI-BamHI y se ligó con el operón sintético SmaI-crt-hbd-BamHI, proporcionando el plásmido pUC18-TTadc-CI*0-PlambdaR*(-35)-AmelB::TT02-ptrc01/RBS01*2-crf-hbd-TT07-Km.

A continuación, se utilizaron los cebadores ome1847 y ome1850 en una reacción de PCR en un único tubo con el plásmido pUC18-TTadc-CI*0-PlambdaR*(-35)-AmelB::TT02-Ptrc01/RBS01*2-crf-hbd-TT07-Km a fin de amplificar la región TT02-ptrc01/RBS01*2-crt-hbd-TT07::Km.

Ome1847 (SEC ID n° 42)

TTCGTCACGGAATCGTCAGAAC

Ome1850 (SEC ID n° 43)

CCTGATTTATACCGGCATTTCGG

A continuación, se introdujo mediante electroporación el fragmento de PCR amplificado en la cepa E. coli MG1655 portadora del plásmido auxiliar RED (pKD46) que expresa los genes del sistema a, p y exo codificantes de las recombinasas Gam, Bet y Exo para fomentar la recombinación homóloga. A continuación, se seleccionaron los transformantes resistentes al antibiótico y se comprobó la sustitución del gen melB por el casete TT02-ptrc01/RBS01*2-crt-hbd-TT07-Km mediante análisis de PCR utilizando ambos oligonucleótidos, ome1845 y 1846rv. La cepa final se denominó MG1655 AmelB::TT02-ptrc01/RBS01*2-crt-hbd-TT07-Km.

ome1845s (SEC ID n° 44)

gccgattttgtcgtggtggc (homólogo de la secuencia 4340168 a 4340187)

ome1846rv (SEC ID n° 45)

gccggttatccatcaggttcac (homólogo de la secuencia 4344065 a 4344044)

4.1.4 Construcción de una cepa modificada E. coli MG1655.AldhA::FRT ApflAB::FRT AackA-pta::FRT AiscR::FRT AfrdABCD::FRT AaceE::FRT AmgsA::FRT AadhE::FRT AmelB::TT02-ptrc01/RBS01*2-crf-hbd-TT07-FRT El locus melB en la cepa de E. coli MG1655 AldhA::FRTApflAB::FRTAackA-pta::FRTAiscR::FRTAfrdABCD::FRT AaceE::FRTAmgsA:FRTAadhE::FRT a continuación se sustituyó por el operón sintético ptrc01/RBS01*2-crt-hbd-TT07::Km y la sustitución se llevó a cabo mediante transducción generalizada del fago P1 a partir del lisado del mutante único (Miller 1972). Se seleccionaron los transductantes KmR en la placa y se comprobó la sustitución del gen melB por el operón sintético ptrc01/RBS01*2-crt-hbd-TT07-Km en MG1655 AldhA::FRT ApflAB::FRT AackA-pta::FRT AiscR ::FRT AfrdABCD::FRT AaceE::FRT AmgsA::FRT AadhE::FRT mediante análisis de PCR utilizando ambos oligonucleótidos, ome1845 y 1846rv. Finalmente, también se utilizaron los pares de cebadores i) hslJC y ldhAC2, ii) pFLAB1 y pflAB2 iii) B2295f y YfcCR, iv) iscrls e iscrlrv v) frdABCDls y frdABCD1rv, vi) aceEs y aceErv, vii) mgsAs y mgsArv y viii) ychGf yadhECr en análisis de Pcr para confirmar la eliminación de los genes ldhA, pflAB, ackA-pta, iscR, frdABcD, aceE, mgsA y adhE, respectivamente, en la cepa AmelB::TT02-ptrc01/RBS01*2-crf-hbd-TT07-Km. La cepa resultante se denominó MG1655 AldhA::FRT ApflAB::FRT AackA-pta::FRT AiscR::FRT AfrdABCD::FRT AaceE::FRT AmgsA::FRT AadhE::FRT AmelB::TT02-ptrc01/RBS01*2-crf-hbd-TT07-Km.

A continuación se eliminó el casete de resistencia a la canamicina mediante la utilización del plásmido pCP20 auxiliar Flp (Cheperanov y Wagernagel, 1995). Se transformaron los mutantes KmR con pCP20 y los transformantes resistentes a ampicilina se seleccionaron a 30°C, seguido de la purificación de colonias de algunos a 42°C y después se sometieron a ensayo para pérdida de la resistencia a antibióticos mediante análisis de PCR utilizando los oligonucleótidos anteriormente indicados (SEC ID n° 44 y n° 45). La nueva cepa se denominó MG1655 AldhA::FRT ApflAB::FRT AackA-pta::FRT AiscR::FRT AfrdABCD::FRT AaceE::FRT AmgsA::FRT AadhE::FRT AmelB::TT02-ptrc01/RBS01 *2-crt-hbd-TT07-FRT

4.1.5 Construcción de una cepa modificada E. coli MG1655 ptrc30/RBS01*2-atoB-cm:

Se utilizaron ambos oligonucleótidos Ome1246 y Odi0247, para amplificar el casete de resistencia al cloranfenicol a partir del plásmido pKD3 y se introdujeron las regiones ptrc30 y RBS01 cadena arriba del gen atoB, sustituyendo la región promotora natural.

Ome1246_3'D r (SEC ID n° 46)

TGTAGGCTGGAGCTGCTTCG

Homólogo de una región para la amplificación del casete de resistencia al cloranfenicol del plásmido pKD3 Odi 0247_Ptrc30/RBS01*2-atoB Rr (SEC ID n° 47) CAATTTTTCATttataacctccttaTTCCACACAGTATACGAGCCGGATGATTAATCGTCAACAGCT CCATGGTCCATATGAATATCCTCCTTA

Con una región (letras en negrita) homóloga de la secuencia 2324141 a 2324131 del gen atoB (secuencia 2324 131 a 2 325 315), una secuencia de referencia en el sitio de internet http://ecocyc.org/, una región (letras minúsculas) homóloga de la secuencia de consenso RBS01*2 que contiene el sitio de restricción Psil, una región (letra en cursiva) que contiene el promotor artificial ptrc30 y una región (letras subrayadas) para la amplificación del casete de resistencia al cloranfenicol del plásmido pKD3.

A continuación, se purificó el producto de PCR y se utilizó para una segunda PCR utilizando ambos oligonucleótidos, Odi0242 y 0246, para incrementar el tamaño de las regiones homólogas y finalmente favorecer la recombinación homóloga in vivo.

Odi 0242 (SEC ID n° 48) GCATCACTGCCCTGCTCTTCTCCGGTGTCATTTTCGTCATTGGTTTAACGCTGTTCTGAC GGCACCCCTACAAACAGAAGGAATATAAACTGGCTCACCTTCGGGTGGGCCTTTCTGCT GTAGGCTGGAGCTGCTTC

Con una región (letras en negrita) homóloga de la secuencia 2324042 a 2324130 cadena arriba del gen atoB (secuencia 2324 131 a 2325315), una secuencia de referencia en el sitio de intemet http://ecocyc.org/, una región (letras en cursiva) correspondiente al terminador transcripcional T7T del fago T7 (Harrington et al., 2001) y una región (letras subrayadas) para la amplificación del casete de resistencia al cloranfenicol del plásmido pKD3. Odi 0246 (SEC ID n° 49) TTACTGTCGCCCCCAGGTCGATGGCGCTGGTGGAAGCGAGTGAACCGTTAAAAC TACCGATAGCAGTACGTACCGCACTGACGATGACACAATTTTTCATTTATAACCTC CTTA

Con una región (letras en negrita) homóloga de la secuencia 2324230 a 2324131 del gen atoB (secuencia 2 324 131 a 2325 315), una secuencia de referencia en el sitio de internet http://ecocyc.org/ y una región (letras subrayadas) homóloga de la secuencia de consenso RBS01*2 que contiene el sitio de restricción Psil.

A continuación, se introdujo el segundo fragmento de PCR amplificado mediante electroporación en la cepa E. coli MG1655 portadora del plásmido auxiliar RED (pKD46) que expresa los genes del sistema a, p y exo codificantes de las recombinasas Gam, Bet y Exo para fomentar la recombinación homóloga. A continuación, se seleccionaron los transformantes resistentes a antibiótico y se comprobó la sustitución del gen atoB por el casete ptrc01/RBS01*2-cm mediante análisis de PCR utilizando ambos oligonucleótidos, atoBs y atoBrv. La cepa final se denominó MG1655 MG1655 ptrc30/RBS01*2-atoB-cm.

atoBs (SEC ID n° 50)

gcgcggcagcacgcagtac (homólogo de la secuencia 2323667 a 2323685)

atoBrv (SEC ID n° 51)

cgcacatcaggccatcgcgc (homólogo de la secuencia 2324584 a 2324565)

4.1.6 Construcción de una cepa modificada E. coli MG1655AldhA::FRT ApflAB::FRT AackA-pta::FRT AiscR::FRT AfrdABCD::FRT AaceE::FRT AmgsA::FRT AadhE::FRT AmelB::TT02-Ptrc01/RBS01*2-crf-hbd-TT07::FRT ptrc30/RBS01*2-atoB-:FRT

A continuación, la región promotora natural del gen atoB se sustituyó por la región artificial ptrc01/RBS01*2 en MG1655AldhA::FRT ApflAB::FRT AackA-pta::FRT AiscR::FRT AfrdABCD::FRT AaceE::FRT AmgsA::FRT AadhE::FRTAmelB::TT02-Ptrc01/RBS01*2-crf-hbd-TT07-FRT y la sustitución se llevó a cabo mediante transducción generalizada de fago P1 a partir del lisado del mutante único (Miller 1972).

Se seleccionaron los transductantes CmR en la placa y se comprobó la sustitución de la región promotora natural por la región artificial ptrc01/RBS01*2 en MG1655 AldhA::FRT ApflAB::FRT AackA-pta::FRT AiscR ::FRT AfrdABCD::FRT AaceE::FRT AmgsA::FRT AadhE::FRT AmelB: :TT02-Ptrc01/RBS01*2- crf-hbd-TT07-FRT mediante análisis de PCR utilizando ambos oligonucleótidos, atoBs y atoBrv. Finalmente, también se utilizaron los pares de cebadores i) hslJC y ldhAC2, ii) pFLAB1 y pflAB2, iii) B2295f y YfcCR, iv) iscrls eiscrlrv, v) frdABCDls y frdABCDlrv, vi) aceEs y aceErv, vii) mgsAs y mgsArv, viii) ychGf y adhECry ix) ome 1845 y 1846rv en el análisis de PCR para confirmar la eliminación de los genes IdhA, pflAB, ackA-pta, iscR, frdABCD, aceE, mgsA y adhE, respectivamente y la expresión de crt-hbd en la cepa ptrc30/RBS01*2-atoB-cm. La cepa resultante se denominó MG1655 AldhA::FRT ApflAB:: FRT AackA-pta::FRT AiscR::FRT AfrdABCD::FRT AaceE::FRT AmgsA::FRT AadhE::FRT AmelB::TT02-ptrc01/RBS01*2-crf-hbd-TT07-FRT ptrc30/RBS01 *2-atoB-cm.

A continuación se eliminó el casete de resistencia al cloranfenicol mediante la utilización del plásmido pCP20 auxiliar Flp (Cheperanov y Wagernagel, 1995). Se transformaron los mutantes CmR con pCP20 y los transformantes resistentes a ampicilina se seleccionaron a 30°C, seguido de la purificación de colonias de algunos a 42°C y el ensayo para pérdida de la resistencia a antibióticos mediante análisis de PCR utilizando los oligonucleótidos anteriormente indicados (SEC ID n° 50 y n° 51). La nueva cepa se denominó MG1655 AldhA::FRT ApflAB::FRT AackA-pta::FRT AiscR::FRT AfrdABCD::FRT AaceE::FRT AmgsA::FRT AadhE::FRT AmelB::TT02-ptrc01/RBS01*2-crt-hbd-TT07-FRT ptrc30/RBS01*2-atoB-FRT.

.2 Construcción del vector de expresión pSC101_pGI-cac2229-cac0764-cac0303_pthl-cap0035-cac2711-cac2710-cac2709:

En primer lugar, se diseñaron cuatro genes sintéticos: CA P0035, CA C2711, CA C2710 y CA C2701, codificantes de la butiraldehído/butanol deshidrogenasa NADH-dependiente AdhE2 bifuncional, la butiril-CoA deshidrogenasa y las flavoproteínas B y A de transferencia de electrones, respectivamente, a partir de Clostridium acetobutylicum utilizando el método denominado de armonización de codones (Angov et al. 2008). Se seleccionaron los codones sinónimos de E. coli que correspondiesen el máximo posible a la frecuencia de uso de codones de los genes nativos de C. acetobutylicum. Basándose en las secuencias generadas, los genes sintéticos fueron sintetizados adicionalmente por Life Technologies (ThermoFisher Scientific, Saint Aubin, Francia) mediante la introducción de la región RBS nativa junto con cada gen, así como la introducción de dos sitios de restricción únicos cadena arriba y cadena abajo de cada gen. Se sintetizaron CA_C2711, CA C2710 y CA C2701 en forma de un operón y se sintetizó adhE2 independientemente. El gen sintético adhE2 en primer lugar se insertó en el plásmido pSOS95 (Genbank, número de acceso AY187686.1) entre el sitio BamHI situado cadena arriba del promotor thl y el sitio Sfol, situado cadena arriba del terminador adc. A continuación, se introdujo el operón artificial sintético bcd-etfB-etfA en pSOS95-adhE2 entre el sitio Xhol situado cadena abajo del gen adhE2 y el sitio Sfol, situado cadena arriba del terminador adc, proporcionando el plásmido pSOS95 adhE2-bcd-etfB-etfA. A continuación, se digirió el plásmido pSOS95 adhE2-bcd-etfB-etfA con SalI y el fragmento que contenía el operón se purificó en gel de agarosa antes de ligarlo al plásmido pSC101_pGI-cac2229-cac0764-cac0303 predigerido con SalI, proporcionando el plásmido de 15.4 kb pSC101-pGI-cac2229-cac0764-cac0303-pthl-cap0035-cac2711-cac2710-cac2709.

4.3 Construcción del vector de expresión pSC101_pGI-cac2229-cac0764-cac0303-udhA_pthl-cap0035-cac2711-cac2710-cac2709:

Se amplificó el gen udhA a partir del ADN genómico de E. coli MG1655 utilizando los cebadores udhA-NheIf y udhA-xmalr. Los cebadores se diseñaron para introducir una región RBS junto con el gen udhA, así como para introducir los sitios de restricción NheI y XmaI cadena arriba y cadena abajo, respectivamente:

udhA-Nhelf: (SEC ID n° 52):

AATTGCTAGCATTATATACAAGGAGGAAACAGCTATGCCACATTCCTACGATTACGA TG

udhA-xmalr: (SEC ID n° 53)

AATTCCCGGGATAATTTTAAAACAGGCGGTTTAAACCGTTTAAC

El fragmento de PCR amplificado a continuación se subclonó en un vector Zero Blunt TOPO (Invitrogen, Saint Aubin, Francia), proporcionando el plásmido Zero Blunt TOPO-udhA y se secuenció utilizando los cebadores universales T7P y t 3p para comprobar que no se habían introducido mutaciones. El fragmento que contenía el gen udhA se purificó en un gel de agarosa tras la digestión del vector Zero Blunt TOPO-udhA con NheI y XmaI. El vector de expresión de 15.4 kb, pSC101_pGI-cac2229-cac0764-cac0303-pThl-cap0035-cac2711-cac2710-cac2709, también se digirió con NheI y XmaI, y se ligó con el fragmento de udhA digerido con NheI-XmaI, proporcionando el vector de 16.8 kb pSC101pGI-cac2229-cac0764-cac0303-udhA_pthl-cap0035-cac2711-cac2710-cac2709.

4,4. Introducción del vector de expresión pSC101_pGI-cac2229-cac0764-cac0303-udhA_pthl-cap0035-cac2711-cac2710-cac2709 en la cepa modificada E. coli MG1655 AldhA::FRT ApflAB::FRT AackA-pta:FRT AiscR::FRT AfrdABCD::FRT AaceE::FRT AmgsA::FRTAadhE::FRT AmelB::TT02-Ptrc01/RBS01*2-crt-hbd-TT07::FRT ptrc30/RBS01*2-atoB::FRT.

Se utilizó el vector de expresión pSC101pGI-cac2229-cac0764-cac0303-udhA_pthl-cap0035-cac2711-cac2710-cac2709 para transformar la cepa modificada de E. coli MG1655 AldhA::FRT ApflAB::FRT AackA-pta::FRT AiscR::FRT AfrdABCD::FRT AaceE::FRT AmgsA::FRT AadhE::FRT AmelB::TT02-ptrc01/RBS01*2-crt-hbd-TT07::FRT ptrc30/RBS01*2-atoB::FRT mediante electroporación (Sambrook y Russel 2o0l).

Se seleccionaron los transformantes en placas de agar LB complementado con espectinomicina (70 ^g/ml) a 37°C. A continuación, se cultivaron algunos transformantes en cultivo líquido de LB complementado con espectinomicina (100 |jg/ml) durante la noche a 37°C para llevar a cabo la extracción del plásmido de ADN (kit miniprep de plásmido Hp GenElute, Sigma) y comprobar la presencia del plásmido pSC101_pGI-cac2229-cac0764-cac0303-udhA_pthlcap0035-cac2711-cac2710-cac2709. Finalmente, se controló el plásmido pSC101_pGI-cac2229-cac0764-cac0303-udhA_pthl-cap0035-cac2711-cac2710-cac2709 mediante el perfil de restricción.

La cepa final de E. coli MG1655 AldhA::FRT ApflAB::FRT AackA-pta::FRT AiscR::FRT AfrdABCD::FRT AaceE::FRT AmgsA::FRT AadhE::FRT AmelB::TT02-ptrc01/RBS01*2-crf-hbd-TT07::FRT ptrc30/RBS01*2-atoB::FRT (pSC101_pGI-cac2229-cac0764-cac0303-udhA_pthl-cap0035-cac2711-cac2710-cac2709) se cultivó en medio líquido LB complementado con espectinomicina (100 |jg/ml) y se mantuvo en solución de glicerol al 20% a -80°C.

4.5:. Caracterización fisiológica de la cepa modificada de E. coli MG1655 AldhA::FRT ApflAB::FRTAackA-pta::FRTAiscR::FRTAfrdABCD::FRT AaceE::FRTAmgsA::FRT AadhE::FRTAmelB..TT02-ptrc01/RBS01*2-crfhbd-TT07..FRT ptrc30/RBS01*2-atoB..FRT pSC101_PGI-cac2229-cac0764-cac0303-udhA_PTbl-cap0035-cac2711-cac2710-cac2709.

La cepa de E. coli MG1655 AldhA::FRTApflAB::FRTAackA-pta::FRTAiscR::FRTAfrdABCD::FRT AaceE::FRTAmgsA::FRT AadhE::FRT AmelB::TT02-Ptrc01/RBS01*2-crf-hbd-TT07..Km ptrc30/RBS01*2-atoB..cm pSC101_pGI-cac2229-cac0764-cac0303-udhA_pthl-cap0035-cac2711-cac2710-cac2709 se cultivó anaeróbicamente en un medio mineral con 20 g/l de glucosa que contenía sales minerales, tal como se ha indicado anteriormente (Meynial-salles et al. 2005) complementado con 4 g/l de extracto de levadura, nitrato 5 mM y espectinomicina (l00 jg/m l) y se inoculó con 100 j l de un cultivo en LB durante la noche. Las células se cultivaron a 37°C durante varios días y se mantuvo el pH mediante tamponado del medio de cultivo con MOPS. Como control, se cultivó la cepa de E.coli MG1655 AldhA::FRT ApflAB::FRT AackApta::FRT AiscR::FRT AfrdABCD::FRT AaceE::FRT AmgsA::FRT Aa dhE::FRT AmelB..TT02-ptrc01/RBS01*2-crf-hbd-TT07..FRT ptrc30/RBS01*2-atoB..FRT bajo las mismas condiciones.

El análisis fenotípico comparativo se llevó a cabo mediante medición de tanto el consumo de glucosa como la concentración de productos de fermentación para el cultivo de cada cepa, tal como se muestra en la tabla 4.

Tal como se muestra en la tabla 4, la expresión de ambos operones sintéticos. CA_C2229-CA_C0764-CA_C0303 y CA_P0035-CA_C2711-CA_C2710-CA_C2709 en la cepa de E. coli MG1655AldhA::FRTApflAB::FRTAackApta::FRTAiscR::FRTAfrdABCD::FRTAaceE::FRTAmgsA ::FRTAadhE::FRTAmelB:.TT02-Ptrc01/RBS01*2-crt-hbd-TT07ptrc30/RBS01*2-atoB condujo a la producción de butanol como el producto principal de fermentación a partir de glucosa con un rendimiento de 0.3 g/g de glucosa consumida, correspondiente a 73% del rendimiento teórico. Además, la expresión de ambos operones sintéticos. CA_C2229-C4_C0764-CA_C0303 y CA_P0035-CA_C2711-CA_C2710-CA_C2709, favoreció el crecimiento, que se vio fuertemente perjudicado en la cepa de control (sin plásmido).

4.6: determinación de la actividad de ferredoxina NADP+ reductasa en la cepa modificada de E. coli MG1655 AldhA::FRTApflAB::FRTAackA-pta::FRTAiscR::FRTAfrdABCD::FRT AaceE::FRTAmgsA::FRTAadhE::FRTAmelB::TT02-ptrc01/RBS01*2-crt-hbd-TT07:.FRT ptrc30/RBS01*2-atoB..FRT pSC101_PGI-cac2229-cac0764-cac0303-udhA_PThl-cap0035-cac2711-cac2710-cac2709.

La cepa de E. coli MG1655 AldhA::FRTApflAB::FRTAackA-pta::FRTAiscR::FRTAfrdABCD::FRT AaceE::FRT AmgsA::FRTAadhE::FRT AmelB::TT02-Ptrc01/RBS01*2-crf-hbd-TT01..Km ptrc30/RBS01*2-atoB..cm pSC101_pGI-cac2229-cac0764-cac0303-udhA_pthl-cap0035-cac2711-cac2710-cac2709 se cultivó anaeróbicamente en un medio mineral con 20 g/l de glucosa que contenía sales minerales, tal como se ha indicado anteriormente (Meynial-salles et al. 2005) complementado con 4 g/l de extracto de levadura, nitrato 5 mM y espectinomicina (100 |jg/ml) y se inoculó con 100 |jl de un cultivo en LB durante la noche. Las células se cultivaron a 37°C hasta una DO⁵⁵⁰nm aproximada de 2, y se mantuvo el pH mediante tamponado del medio de cultivo con MOPS. Como control, se cultivó la cepa de E. coli MG1655 AldhA::FRTApflAB::FRTAackApta::FRTAiscR::FRTAfrdABCD::FRTAaceE::FRTAmgsA::FRTAa dhE::FRT AmelB::TT02-ptrc01/RBS01 *2-crf-hbd-TT07::FRT ptrc30/RBS01*2-atoB::FRT bajo las mismas condiciones.

Las células se transfirieron a una cámara anaeróbica, se recolectaron, se lavaron y se concentraron 20 veces en tampón de Tris-HCl 100 mM, DTT 2 mM, glicerol al 10% (pH 7.6), se congelaron a -80°C o se utilizaron inmediatamente. Las células se fragmentaron adicionalmente mediante sonicación utilizando un desintegrador ultrasónico (Vibracell 72434, Bioblock) a 4°C en cuatro ciclos de 30 s a intervalos de 2 min. Se separaron los residuos mediante centrifugación a 8600 g durante 10 min, a 4°C (centrífuga Sigma, 2-16K) y el extracto en bruto acelular se cargó en una columna SephadexG25 para eliminar las sales y metabolitos, antes de determinar la actividad de ferredoxina NADP+ reductasa utilizando ferredoxina como sustrato y siguiendo el procedimiento ya descrito en 1.1 (Tabla D).

Tabla D: actividades de ferredoxina-NADP+ reductasa determinadas en extractos en bruto utilizando ferredoxina como sustrato:

Ejemplo 5: producción heteróloga de 1,3-propanodiol mediante una nueva ruta metabólica en una cepa de E. coli con una actividad potenciada de ferredoxina NADP+ reductasa:

5.1: construcción de cepa modificada E. coli MG1655AldhA::FRT, ApflAB::FRT, AiscR::FRT, AfrdABCD::FRT AaceE::FRT, AmgsA::FRTAadhE::FRT, AaldA::FRT, AaldB::FRT, AglpD::FRT, AglpA::FRT

5.1.1: construcción de una cepa modificada E. coli MG1655AldhA::FRT, ApflAB::FRT, AiscR::FRT:

A continuación, se sustituyó el gen iscR por un casete de resistencia a la canamicina en la cepa MG1655 AldhA::FRTApflAB::FRTy se llevó a cabo la eliminación mediante transducción generalizada de fago P1 a partir del lisado del mutante único (Miller, 1972), utilizando la cepa MG1655AiscR::km (ver la sección 3.1.7).

Se seleccionaron los transductantes KmR en la placa y la sustitución del gen iscR por el casete de canamicina en MG1655AldhA::FRTApflAB::FRT se comprobó mediante análisis de PCR utilizando ambos oligonucleótidos, iscrs e iscrlrv. Finalmente, también se utilizaron los pares de cebadores i) hslJC y ldhAC2 y ii) pFLAB1 y pflAB2 en análisis de PCR para confirmar la eliminación de los genes IdhA y pflAB en la cepa AiscR::km. La cepa resultante se denominó MG1655 AldhA::FRTApflAB::FRT AiscR::km.

A continuación se eliminó el casete de resistencia a la canamicina mediante la utilización del plásmido pCP20 auxiliar Flp (Cheperanov y Wagernagel, 1995). Se transformaron los mutantes CmR con pCP20 y los transformantes resistentes a ampicilina se seleccionaron a 30°C, seguido de la purificación de colonias de algunos a 42°C y el ensayo para pérdida de la resistencia a antibióticos mediante análisis de PCR utilizando los oligonucleótidos anteriormente indicados (SEC ID n° 24 y n° 25). La nueva cepa se denominó MG1655 AldhA::FRTApflAB::FRTAiscR::FRT.

5.1.2: construcción de una cepa modificada E. coli MG1655AldhA::FRT, ApflAB::FRT, AiscR::FRT, AfrdABCD::FRT:

A continuación, se sustituyeron los genes frdABCD por un casete de resistencia al cloranfenicol en la cepa MG1655AldhA::FRTApflAB::FRTAiscR::FRTy se llevó a cabo la eliminación mediante transducción generalizada de fago P1 a partir del lisado del mutante único (Miller, 1972), utilizando la cepa de E. coli MG1655AfrdABCD::cm (ver la sección 3.1.9).

Se seleccionaron los transductantes CmR en la placa y se comprobó la sustitución de los genes frdABCD por el casete de cloranfenicol en MG1655AldhA::FRTApflAB::FRTAiscR::FRT mediante análisis de PCR utilizando los oligonucleótidos frdABCDls y frdABCDlrv. Finalmente, también se utilizaron los pares de cebadores i) hslJC y ldhAC2, ii) pFLAB1 y pflAB2 y iii) iscrls e iscrlrv en el análisis de PCR para confirmar la eliminación de los genes ldhA, pflAB y iscR, respectivamente, en la cepa AfrdABCD::cm. La cepa resultante se denominó MG1655AldhA::FRT ApflAB::FRAiscR::FRTAfrdABCD::cm.

A continuación se eliminó el casete de resistencia al cloranfenicol mediante la utilización del plásmido pCP20 auxiliar Flp (Cheperanov y Wagernagel, 1995). Se transformaron los mutantes CmR con pCP20 y los transformantes resistentes a ampicilina se seleccionaron a 30°C, seguido de la purificación de colonias de algunos a 42°C y después se sometieron a ensayo para pérdida de la resistencia a antibióticos mediante análisis de PCR utilizando los oligonucleótidos anteriormente indicados (SEC ID n° 28 y n° 29). La nueva cepa se denominó MG1655AldhA::FRTApflAB::FRTAiscR::FRTAfrdABCD::FRT.

5.1.3: construcción de la cepa modificada de E. coli MG1655AldhA::FRT, ApflAB::FRT, AiscR::FRT, AfrdABCD::FRTAaceE::FRT:

A continuación, se sustituyó el gen aceE por un casete de resistencia a la canamicina en la cepa MG1655 AldhA::FRTApflAB::FRTAiscR::FRTAfrdABCD::FRT y se llevó a cabo la eliminación mediante transducción generalizada de fago P1 a partir del lisado de mutante único (Miller, 1972) utilizando la cepa de E. coli MG1655 • aceE::km (ver sección 3.1.11).

Se seleccionaron los transductantes KmR en la placa y la sustitución del gen aceE por el casete de canamicina en MG1655AldhA::FRTApflAB::FRTAiscR::FRTAfrdABCD::FRT se comprobó mediante análisis de PCR utilizando los dos oligonucleótidos, aceEs y aceErv. Finalmente, también se utilizaron los pares de cebadores i) hslJC y ldhAC2, ii) pFLAB1 y pflAB2, iii) iscrls e iscrlrv y iv) frdABCDls y frdABCDlrv en análisis de PCR para confirmar la eliminación de los genes IdhA, pflAB, iscR y frdABCD, respectivamente en la cepa AaceE::km. La cepa resultante se denominó MG1655 AIdhA::FRT ApfIAB::FRTAiscR::FRTAaceE::km.

A continuación se eliminó el casete de resistencia a la canamicina mediante la utilización del plásmido pCP20 auxiliar Flp (Cheperanov y Wagernagel, 1995). Se transformaron los mutantes KmR con pCP20 y los transformantes resistentes a ampicilina se seleccionaron a 30°C, seguido de la purificación de colonia de algunos a 42°C y el ensayo para pérdida de la resistencia a antibióticos mediante análisis de PCR utilizando los oligonucleótidos anteriormente indicados (SEC ID n° 32 y n° 33). La nueva cepa se denominó MG1655AIdhA::FRTApfIAB::FRTAiscR::FRTAfrdABCD::FRTAaceE::FRT.

5.1.4: construcción de una cepa modificada de E. coli MG1655AIdhA::FRT, ApfIAB::FRT, AiscR::FRT, AfrdABCD::FRTAaceE::FRT, AmgsA::FRT:

A continuación, se sustituyó el gen mgsA por un casete de resistencia al cloranfenicol en la cepa MG1655 AldhA::FRT ApflAB::FRTAiscR::FRT AfrdABCD::FRTAaceE::FRTy se llevó a cabo la eliminación mediante transducción generalizada de fago P1 a partir del lisado del mutante único (Miller, 1972) utilizando la cepa de E. coli MG1655AmgsA::cm (ver la sección 3.1.13).

Se seleccionaron los transductantes CmR ten una placa y se comprobó la sustitución del gen mgsA por el casete de cloranfenicol en MG1655AldhA::FRTApflAB::FRTAiscR ::FRTAfrdABCD::FRTAaceE::FRT mediante análisis de PCR utilizando los dos oligonucleótidos, mgsAs y mgsArv. Finalmente, también se utilizaron los pares de cebadores i) hslJC y ldhAC2, ii) pFLAB1 y pflAB2, iii) iscrls e iscrlrv, iv) frdABCD1s y frdABCD1rv y v) aceEs y aceErv en análisis de PCR para confirmar la eliminación de los genes ldhA, pflAB, iscR, frdABCD y aceE, respectivamente, en la cepa AmgsA::cm. La cepa resultante se denominó MG1655 AldhA::FRTApflAB::FRTAiscR::FRTAfrdABCD::FRTAaceE::FRTAmgsA::cm.

A continuación se eliminó el casete de resistencia al cloranfenicol mediante la utilización del plásmido pCP20 auxiliar Flp (Cheperanov y Wagernagel, 1995). Se transformaron los mutantes CmR con pCP20 y los transformantes resistentes a ampicilina se seleccionaron a 30°C, seguido de la purificación de colonias de algunos a 42°C y el ensayo para pérdida de la resistencia a antibióticos mediante análisis de PCR utilizando los oligonucleótidos anteriormente indicados (SEC ID n° 36 y n° 37). La nueva cepa se denominó MG1655AldhA::FRTApflAB::FRTAiscR::FRTAfrdABCD::FRTAaceE::FRTAmgsA::FRT.

5.1.5: Construcción de una cepa modificada de E. coli MG1655AldhA::FRT, ApflAB::FRT, AiscR::FRT, AfrdABCD::FRT AaceE::FRT, AmgsA::FRTAadhE::FRT:

A continuación, se sustituyó el gen adhE por un casete de resistencia al cloranfenicol en la cepa MG1655 AldhA::FRT ApflAB::FRT AiscR::FRT AfrdABCD::FRTAaceE::FRT AmgsA::FRTy se llevó a cabo la eliminación mediante transducción generalizada de fago P1 a partir del lisado del mutante único (Miller, 1972) utilizando la cepa de E. coli MG1655AadhE::cm (ver la sección 4.1.1).

Los transductantes CmR se seleccionaron en una placa y la sustitución del gen adhE por el casete de cloranfenicol enMG1655AldhA::FRT ApflAB::FRTAiscR::FRT AfrdABCD::FRTAaceE::FRTAmgsA::FRT se comprobó mediante análisis de PCR utilizando ambos oligonucleótidos, ychGf y adhECr. Finalmente, también se utilizaron los pares de cebadores i) hslJC y ldhAC2, ii) pFLAB1 y pflAB2, iii) iscrls y iscrlrv, iv) frdABCD1s y frdABCD1rv, v) aceEs y aceErv y vi) mgsAs y mgsArv en análisis de PCR para confirmar la eliminación de los genes IdhA, pflAB, iscR, frdABcD, aceE y mgsA, respectivamente, en la cepa AadhE::cm. La cepa resultante se denominó MG1655 AldhA::FRT ApflAB::FRTAiscR::FRTAfrdABCD::FRT AaceE::FRTAmgsA::FRTAadhE::cm.

A continuación se eliminó el casete de resistencia al cloranfenicol mediante la utilización del plásmido pCP20 auxiliar Flp (Cheperanov y Wagernagel, 1995). Se transformaron los mutantes CmR con pCP20 y los transformantes resistentes a ampicilina se seleccionaron a 30°C, seguido de la purificación de colonias de algunos a 42°C y el ensayo para pérdida de la resistencia a antibióticos mediante análisis de PCR utilizando los oligonucleótidos anteriormente indicados (SEC ID n° 36 y n° 37). La nueva cepa se denominó MG1655 AldhA::FRTApflAB::FRTAiscR::FRTAfrdABCD::FRT AaceE::FRTAmgsA::FRTAadhE::FRT.

5.1.6: Construcción de una cepa modificada de E. coli MG1655 AaldA::FRT-cm-FRT:

Se sustituyó el gen aldA por un casete de resistencia al cloranfenicol flanqueado por la diana de reconocimiento de Flp (FRT), que se generó mediante PCR mediante la utilización de cebadores con extensiones de homología de 80 nt, eliminando la mayor parte del gen en cuestión. La técnica utilizada fue descrita por Datsenko y Wanner en 2000.

Se diseñaron dos oligonucleótidos y se utilizaron para sustituir el gen aldA:

1- AldA D f consta de 100 bases (SEC ID n° 54) atgtcagtacccgttcaacatcctatgtatatcgatggacagtttgttacctggcgtggagacgcatggattgatgtggtaGTGTAGGCTG GAGCTGCTTCG

Con una región (letras minúsculas) homóloga de la secuencia (1486256-1486336) que incluye el codón de inicio del gen aldA (secuencia 1486256 a 1487695), una secuencia de referencia en el sitio de internet http://ecocyc.org/, y una región (letras mayúsculas) para la amplificación del casete de resistencia al cloranfenicol del plásmido pKD3

2- aldAD r que consta de 100 bases (SEC ID n° 55):

ttaagactgtaaataaaccacctgggtctgcagatattcatgcaagccatgtttaccatctgcgccgccaataccggatttCATATGAAT ATCCTCCTTAG

Con una región (letras minúsculas) homóloga de la secuencia (1487615-1487695) correspondiente a la secuencia codificante de la parte C-terminal que incluye el codón de parada del gen aldA (1486256 a 1487695), una secuencia de referencia en el sitio de internet http://ecocyc.ora/, y una región (letras mayúsculas) para la amplificación del casete de resistencia al cloranfenicol transportado por el plásmido pKD3. Se utilizaron ambos oligonucleótidos, AldADr y aldADf, para amplificar el casete de resistencia al cloranfenicol a partir del plásmido pKD3. A continuación, se introdujo mediante electroporación el fragmento de PCR amplificado en la cepa E. coli MG1655 portadora del plásmido auxiliar RED (pKD46) que expresa los genes del sistema a, p y exo codificantes de las recombinasas Gam, Bet y Exo para fomentar la recombinación homóloga. A continuación, se seleccionaron los transformantes resistentes a antibiótico y se comprobó la sustitución del gen aldA por el casete de cloranfenicol mediante análisis de PCR utilizando ambos oligonucleótidos, Ydc F C f y gapCCr. 3. Ydc F C f (SEC ID n° 56):

tgcagcggcgcacgatggcgacgttccgccg (homólogo de la secuencia 1485722 a 1485752)

4. gapCCr (SEC ID n° 57):

cacgatgacgaccattcatgcctatactggc (homólogo de la secuencia 1488195 a 1488225)

5.1.7: construcción de una cepa modificada de E. coli MG1655AldhA::FRT, ApflAB::FRT, AiscR::FRT, AfrdABCD::FRTAaceE::FRT, AmgsA::FRTAadhE::FRTAaldA::FRT:

A continuación, el gen aldA se sustituyó por un casete de resistencia al cloranfenicol en la cepa MG1655AldhA::FRT ApflAB::FRTAiscR::FRT AfrdABCD:FRTAaceE::FRT AmgsA::FRT • adhE::FRT y se llevó a cabo la eliminación mediante transducción generalizada de fago P1 a partir del lisado de mutante único (Miller, 1972).

Los transductantes CmR se seleccionaron en una placa y la sustitución del gen adhE por el casete de cloranfenicol en MG1655AldhA::FRT ApfíAB::FRTAiscR::FRT AfrdABCD::FRTAaceE::FRTAmgsA::FRTAadhE::FRT se comprobó mediante análisis de PCR utilizando ambos oligonucleótidos, Ydc F C f y gapCCr. Finalmente, también se utilizaron los pares de cebadores i) hslJC y ldhAC2, ii) pFLAB1 y pflAB2, iii) iscrls y iscrlrv, iv) frdABCDls y frdABCD1rv, v) aceEs y aceErv vi) mgsAs y mgsArv y vii) ychGf y adhECr en análisis de PCR para confirmar la eliminación de los genes IdhA, pflAB, iscR, frdABCD, aceE, mgsA y adhE, respectivamente, en la cepa AaldA::cm. La cepa resultante se denominó MG1655 AldhA::FRT ApflAB::FRTAiscR::FRTAfrdABCD::FRTAaceE::FRTAmgsA::FRTAadhE::FRTAald A::cm.

A continuación se eliminó el casete de resistencia al cloranfenicol mediante la utilización del plásmido pCP20 auxiliar Flp (Cheperanov y Wagernagel, 1995). Se transformaron los mutantes CmR con pCP20 y los transformantes resistentes a ampicilina se seleccionaron a 30°C, seguido de la purificación de colonias de algunos a 42°C y después se sometieron a ensayo para pérdida de la resistencia a antibióticos mediante análisis de PCR utilizando los oligonucleótidos anteriormente indicados (SEC ID n° 56 y n° 57). La nueva cepa se denominó MG1655 AldhA::FRTApflAB::FRTAiscR::FRTAfrdABCD::FRTAaceE::FRTAmgsA::FRTAadhE::FRTAaldA ::FRT.

5.1.8: construcción de una cepa modificada de E. coli MG1655 AaldB::FRT-cm-FRT:

Se sustituyó el gen aldB por un casete de resistencia al cloranfenicol flanqueado por la diana de reconocimiento de Flp (FRT), que se generó mediante PCR mediante la utilización de cebadores con extensiones de homología de 80 nt, eliminando la mayor parte del gen en cuestión. La técnica utilizada fue descrita por Datsenko y Wanner en 2000.

Se diseñaron dos oligonucleótidos y se utilizaron para sustituir el gen aldB:

1- AldB D f que consta de 100 bases (SEC ID n° 58) tcagaacagccccaacggtttatccgagtagctcaccagcaggcacttggtttgctggtaatgctccagcatcatcttgtGTGTAGGCTG GAGCTGCTTCG

Con una región (letras minúsculas) homóloga a la secuencia (3752996-3753075) del gen aldB (secuencia 3752996 a 3754534), una secuencia de referencia en el sitio de internet http://ecocyc.org/ y una región (letras mayúsculas) para la amplificación del casete de resistencia al cloranfenicol transportado en el plásmido pKD3.

2- AldBD r que consta de 100 bases (SEC ID n° 59):

atgaccaataatcccccttcagcacagattaagcccggcgagtatggtttccccctcaagttaaaagcccgctatgacaaCATATGAAT ATCCTCCTTAG

Con una región (letras minúsculas) homóloga a la secuencia (3754455 a 3754534) del gen aldB (secuencia 3752996 a 3754534), una secuencia de referencia en el sitio de internet http://ecocyc.org/ y una región (letras mayúsculas) para la amplificación del casete de resistencia al cloranfenicol transportado en el plásmido pKD3. Se utilizaron ambos oligonucleótidos, AldBDr y aldBDf, para amplificar el casete de resistencia al cloranfenicol a partir del plásmido pKD3. A continuación, se introdujo mediante electroporación el fragmento de PCR amplificado en la cepa E. coli MG1655 portadora del plásmido auxiliar RED (pKD46) que expresa los genes del sistema a, p y exo codificantes de las recombinasas Gam, Bet y Exo para fomentar la recombinación homóloga. A continuación, se seleccionaron los transformantes resistentes a antibiótico y se comprobó la sustitución del gen aldB por el casete de cloranfenicol mediante análisis de PCR utilizando ambos oligonucleótidos aldBCf y YiaYCr.

3- aldB C f (SEC ID n° 60):

catatttccctcaaagaatataaaaaagaacaattaacgc (homólogo de la secuencia 3752449 to 3752488)

4- YiaYCr (SEC ID n° 61):

tatgttcatgcgatggcgcaccagctgggcg (homólogo de la secuencia 3755040 a 3755070)

5.1.9: construcción de una cepa modificada de E. coli MG1655AldhA::FRT, ApflAB::FRT, AiscR::FRT, AfrdABCD::FRT AaceE::FRT AmgsA::FRTAadhE:: FRTAaldA::FRTAaldB::FRT:

El gen aldB se sustituyó por un casete de resistencia al cloranfenicol en la cepa MG1655AldhA::FRT ApflAB::FRTAiscR::FRT AfrdABCD::FRTAaceE::FRT AmgsA::FRT AadhE::FRT AaldA::FRTy se llevó a cabo la eliminación mediante transducción generalizada de fago P1 a partir del lisado de mutante único (Miller, 1972). Los transductantes CmR se seleccionaron en una placa y la sustitución del gen adhE por el casete de cloranfenicol en MG1655 AldhA::FRT ApflAB::FRTAiscR::FRT AfrdABCD::FRTAaceE::FRTAmgsA::FRTAadhE::FRTAaldA::FRT se comprobó mediante análisis de PCR utilizando ambos oligonudeótidos, aldBCf y YiaYCr. Finalmente, también se utilizaron los pares de cebadores i) hsIJC y ldhAC2, ii) pFLAB1 y pflAB2, iii) iscrls y iscrlrv, iv) frdABCDls y frdABCD1rv, v) aceEs y aceErv vi) mgsAs y mgsArv vii) ychGf y adhECr y viii)Ydc F C f y gapCCr en análisis de PCR para confirmar la eliminación de los genes IdhA, pflAB, iscR, frdABCD, aceE, mgsA adhE y aldA, respectivamente, en la cepa AaldB::cm. La cepa resultante se denominó MG1655 AldhA::FRT ApflAB::FRTAiscR::FRTAfrdABCD::FRTAaceE::FRTAmgsA::FRTAadhE::FRTAald A::FRTAaldB::cm.

A continuación se eliminó el casete de resistencia al cloranfenicol mediante la utilización del plásmido pCP20 auxiliar Flp (Cheperanov y Wagernagel, 1995). Se transformaron los mutantes CmR con pCP20 y los transformantes resistentes a ampicilina se seleccionaron a 30°C, seguido de la purificación de colonias de algunos a 42°C y después se sometieron a ensayo para pérdida de la resistencia a antibióticos mediante análisis de PCR utilizando los oligonucleótidos anteriormente indicados (SEC ID n° 60 y n° 61). La nueva cepa se denominó G1655 AldhA::FRTApflAB::FRTAiscR::FRTAfrdABCD::FRTAaceE::FRTAmgsA::FRTAadhE::FRTAaldA ::FRTAaldB::FRT.

5.1.6: construcción de una cepa modificada de E. coli MG1655 AglpD::FRT-cm-FRT E. coli:

Se sustituyó el gen glpD por un casete de resistencia al cloranfenicol flanqueado por la diana de reconocimiento de Flp (FRT), que se generó mediante PCR mediante la utilización de cebadores con extensiones de homología de 80 nt, eliminando la mayor parte del gen en cuestión. La técnica utilizada fue descrita por Datsenko y Wanner en 2000.

Se diseñaron dos oligonucleótidos y se utilizaron para sustituir el gen glpD:

1- DglpD f que consta de 100 bases (SEC ID n° 62):

atggaaaccaaagatctgattgtgatagggggcggcatcaatggtgctggtatcgcggcagacgccgctggacgcggtttCATATGAA TATCCTCCTTAG

Con una región (letras minúsculas) homóloga de la secuencia (3560036 a 3560115), incluyendo el codón de inicio del gen glpD (secuencia 3560036 a 3561541), una secuencia de referencia en el sitio de internet http://ecocyc.org/ y una región (letras mayúsculas) para la amplificación del casete de resistencia al cloranfenicol del plásmido pKD3.

2- DglpD r que consta de 100 bases (SEC ID n° 63):

ttacgacgccagcgataacctctgctgcgtatactccaccagccactgactcacacgagattgttgatccgcatttagccTGTAGGCTG GAGCTGCTTCG

Con una región (letras minúsculas) homóloga de la secuencia (3561462-3561541) correspondiente a la secuencia codificante de la parte C-terminal del codón de parada del gen glpD (3560036 a 3561541), una secuencia de referencia en el sitio de internet http://ecocyc.org/, y una región (letras mayúsculas) para la amplificación del casete de resistencia al cloranfenicol transportado por el plásmido pKD3.

Se utilizaron ambos nucleótidos, DglpDr y DglpDf, para amplificar el casete de resistencia al cloranfenicol a partir del plásmido pKD3. A continuación, se introdujo mediante electroporación el fragmento de PCR amplificado en la cepa E. coli MG1655 portadora del plásmido auxiliar RED (pKD46) que expresa los genes del sistema a, p y exo codificantes de las recombinasas Gam, Bet y Exo para fomentar la recombinación homóloga. A continuación, se seleccionaron los transformantes resistentes a antibiótico y se comprobó la sustitución del gen glpD por el casete de cloranfenicol mediante análisis de PCR utilizando ambos oligonucleótidos, glpDCf y glpDCr.

3- glpDC f (SEC ID n° 64):

cgttaatacattcgaactgatcc (homólogo de la secuencia 3559822 to 3559844)

4- glpDCr (SEC ID n° 65):

gcgtgggctttgcggtaattccc (homólogo de la secuencia 3561750 a 3561772)

5.1.7: construcción de una cepa modificada de E. coli MG1655AldhA::FRT, ApflAB::FRT, AiscR::FRT, AfrdABCD::FRTAaceE::FRT,AmgsA::FRTAadhE::FRTAaldA::FRTAaldB::FRTAglpD::FRT:

El gen glpD se sustituyó por un casete de resistencia al cloranfenicol en la cepa MG1655 AldhA::FRT ApflAB::FRTAiscR::FRT AfrdABCD::FRTAaceE::FRT AmgsA::FRT AadhE::FRT AaldA::FRTAaldB::FRT y se llevó a cabo la eliminación mediante transducción generalizada de fago P1 a partir del lisado de mutante único (Miller, 1972).

Los transductantes CmR se seleccionaron en una placa y la sustitución del gen glpD por el casete de cloranfenicol en MG1655AldhA::FRT ApflAB::FRTAiscR::FRT AfrdABCD::FRTAaceE::FRTAmgsA::FRTAadhE::FRTAaldA::FRTAaldB::FRT se comprobó mediante análisis de PCR utilizando ambos oligonucleótidos, glpDCf y glpDCr. Finalmente, también se utilizaron los pares de cebadores i) hslJC y ldhAC2, ii) pFLAB1 y pflAB2, iii) iscrls y iscrlrv, iv) frdABCDls y frdABCD1rv, v) aceEs y aceErv vi) mgsAs y mgsArv vii) ychGf y adhECr viii)Ydc F C f y gapCCr y ix) aldBCf y YiaYCr en análisis de PCR para confirmar la eliminación de los genes IdhA, pflAB, iscR, frdABCD, aceE, mgsA, adhE, aldA, aldB, respectivamente, en la cepa AglpD::cm. La cepa resultante se denominó MG1655 AldhA::FRT ApflAB::FRTAiscR::FRTAfrdABCD::FRTAaceE::FRTAmgsA::FRTAadhE::FRTAald A: :FRTAaldB::FRTAglpD::cm. A continuación se eliminó el casete de resistencia al cloranfenicol mediante la utilización del plásmido pCP20 auxiliar Flp (Cheperanov y Wagernagel, 1995). Se transformaron los mutantes CmR con pCP20 y los transformantes resistentes a ampicilina se seleccionaron a 30°C, seguido de la purificación de colonias de algunos a 42°C y el ensayo para pérdida de la resistencia a antibióticos mediante análisis de PCR utilizando los oligonucleótidos anteriormente indicados (SEC ID n° 64 y n° 65). La nueva cepa se denominó MG1655 AldhA::FRTApflAB::FRTAiscR::FRTAfrdABCD::FRT AaceE::FRTAmgsA::FRTAadhE::FRTAaldA::FRTAaldB::FRTAglpD::FRT.

5.1.8: construcción de una cepa modificada E. coli MG1655 AglpA::FRT-cm-FRT:

Se sustituyeron el gen glpA por un casete de resistencia al cloranfenicol flanqueado por la diana de reconocimiento de Flp (FRT), que se generó mediante PCR mediante la utilización de cebadores con extensiones de homología de 80 nt, eliminando la mayor parte del gen en cuestión. La técnica utilizada fue descrita por Datsenko y Wanner en 2000.

Se diseñaron dos oligonucleótidos y se utilizaron para sustituir el gen glpA:

1- DglpA f que consta de 100 bases (SEC ID n° 66):

atgaaaactcgcgactcgcaatcaagtgacgtgattatcattggcggcggcgcaacgggagccgggattgcccgcgactgCATATGA ATATCCTCCTTAG

Con una región (letras minúsculas) homóloga de la secuencia (2350669-2350748), incluyendo el codón de inicio del gen glpA (secuencia 2350669 a 2352297), una secuencia de referencia en el sitio de internet http://ecocyc.org/,y una región (letras mayúsculas) para la amplificación del casete de resistencia al cloranfenicol del plásmido pKD3.

2- DglpA r que consta de 100 bases (SEC ID n° 67):

tcaaagcgcatctttctgctccttctccagaccacacaatccctgataaacccagcgggtaaattcgctttcgcgcaGTGTAGGCTGG AGCTGCTTCG

Con una región (letras minúsculas) homóloga de la secuencia (2352297 a 2352220) correspondiente a la secuencia codificante de la parte C-terminal del codón de parada del gen glpA (2350669 a 2352297), una secuencia de referencia en el sitio de internet http://ecocyc.org/, y una región (letras mayúsculas) para la amplificación del casete de resistencia al cloranfenicol transportado por el plásmido pKD3.

Se utilizaron ambos oligonucleótidos, DglpAr y DglpAf, para amplificar el casete de resistencia al cloranfenicol a partir del plásmido pKD3. A continuación, se introdujo mediante electroporación el fragmento de PCR amplificado en la cepa E. coli MG1655 portadora del plásmido auxiliar RED (pKD46) que expresa los genes del sistema a, p y exo codificantes de las recombinasas Gam, Bet y Exo para fomentar la recombinación homóloga. A continuación, se seleccionaron los transformantes resistentes a antibiótico y se comprobó la sustitución del gen glpA por el casete de cloranfenicol mediante análisis de PCR utilizando ambos oligonucleótidos, glpACf y glpACr.

3- glpAC f (SEC ID n° 68):

ttagcctccgttgcgttcttgc (homólogo de la secuencia 2349038 a 2349052)

4- glpACr (SEC ID n° 69):

gccgcccataatgacagtatcaaagcgc (homólogo de la secuencia 2352316 a 3352289)

5.1.9: construcción de una cepa modificada de E. coli MG1655AldhA::FRT, ApflAB::FRT, AiscR::FRT, AfrdABCD::FRTAace::FRT,AmgsA::FRTAadhE::FRTAaldA::FRTAaldB::FRTAglpD::FRT AglpA::FRT:

El gen glpA se sustituyó por un casete de resistencia al cloranfenicol en la cepa MG1655 AldhA::FRT ApflAB::FRTAiscR::FRT AfrdABCD::FRTAaceE::FRT AmgsA::FRT AadhE::FRT AaldA::FRTAaldB::FRTAglpD::FRTy se llevó a cabo la eliminación mediante transducción generalizada de fago P1 a partir del lisado de mutante único (Miller, 1972).

Los transductantes CmR se seleccionaron en una placa y la sustitución del gen glpA por el casete de cloranfenicol en MG1655AldhA::FRT ApflAB::FRTAiscR::FRT AfrdABCD::FRTAaceE::FRTAmgsA::FRTAadhE::FRTAaldA::FRTAaldB::FRTAglpD::FRT se comprobó mediante análisis de PCR utilizando ambos oligonucleótidos, glpACf y glpACr. Finalmente, también se utilizaron los pares de cebadores i) hslJC y ldhAC2, ii) pFLAB1 y pflAB2, iii) iscrls y iscrlrv, iv) frdABCDls y frdABCD1rv, v) aceEs y aceErv vi) mgsAs y mgsArv vii) ychGf y adhECr, viii)Ydc F C f y gapCCr, ix) aldBCf y YiaYCr y x) glpDCf y glpDCr en análisis de PCR para confirmar la eliminación de los genes IdhA, pflAB, iscR, frdABCD, aceE, mgsA, adhE, aldA, aldB y glpD,respectivamente, en la cepa AglpA::cm. La cepa resultante se denominó MG1655 AldhA::FRT ApflAB::FRTAiscR::FRTAfrdABCD::FRTAaceE::FRTAmgsA::FRTAadhE::FRTAald A::FRTAaldB::FRTAglpD::FRTAglpA::cm.

A continuación se eliminó el casete de resistencia al cloranfenicol mediante la utilización del plásmido pCP20 auxiliar Flp (Cheperanov y Wagernagel, 1995). Se transformaron los mutantes CmR con pCP20 y los transformantes resistentes a ampicilina se seleccionaron a 30°C, seguido de la purificación de colonias de algunos a 42°C y el ensayo para pérdida de la resistencia a antibióticos mediante análisis de PCR utilizando los oligonucleótidos anteriormente indicados (SEC ID n° 68 y n° 69). La nueva cepa se denominó MG1655 AldhA::FRTApflAB::FRTAiscR::FRTAfrdABCD::FRT AaceE::FRTAmgsA::FRTAadhE::FRTAaldA::FRTAaldB::FRTAglpD::FRTAglpA::FRT.

5.2 Construcción del vector de expresión pSC101-pGI-cac2229-cac0764-cac0303-pntAB

Se amplificaron los genes pntAB a partir del ADN genómico de E. coli MG1655 utilizando los cebadores pntA-Nhelf y pntB-xmalr. Se diseñaron los cebadores para introducir una región RBS junto con el gen pntA, así como la introducción de los sitios de restricción Nhel y Xmal cadena arriba de pntA y cadena abajo de pntB, respectivamente:

pntAA-Nhelf: (SEC ID n° 70):

AATTGCTAGCATTATATACAAGGAGGAAACAGCTatgcgaattggcataccaagagaacgg

pntB-xmalr: (SEC ID n° 71)

AATTCCCGGGATAATTttacagagctttcaggattgc

El fragmento de PCR amplificado a continuación se subclonó en un vector Zero Blunt TOPO (Invitrogen, Saint Aubin, Francia), proporcionando el plásmido Zero Blunt TOPO-pntAB y se secuenció utilizando los cebadores universales T7P y t 3p para comprobar que no se habían introducido mutaciones. El fragmento que contenía los genes pntAB se purificó en un gel de agarosa tras la digestión del vector Zero Blunt TOPO-pntAB con NheI y XmaI. El vector de expresión de 9.54 kb pSC101_pGI-cac2229-cac0764-cac0303 (3.2) también se digirió con NheI y XmaI, y se ligó en el fragmento pntAB digerido con NheI-XmaI, proporcionando el vector 12.5 kb pSC101pGI-cac2229-cac0764-cac0303-pntAB.

5.3 Construcción del vector de expresión pSC101-pGI-cac2229-cac0764-cac0303-pntAB_pthl-dhaB1-dhaB2-yqhD

Se amplificaron ambos genes, dhABI y dhaB2, a partir del plásmido pSPD5 (Meynial-Salles et al., 2005) utilizando los cebadores pdhaB1 y pdhaB2. Los cebadores se diseñaron para introducir una región RBS junto con el gen dhaBI, así como la introducción de los sitios de restricción BamHI y XhoI cadena arriba de dhABI y cadena abajo de dhaB2 respectivamente:

pdhaB1f: BamHI-RBS dhaB1 (SEC ID n° 72)

ggatccgtgattggaggagtaaaaatgataagtaaagg

pdhaB2r:XhoI-dhaB2 (SEC ID n° 73)

CTCGAGttactcagctccaattgtgcacggtattcccat

El fragmento de PCR amplificado a continuación se subclonó en un vector Zero Blunt TOPO (Invitrogen, Saint Aubin, Francia), proporcionando el plásmido Zero Blunt TOPO-dhaB1 y se secuenció utilizando los cebadores universales T7P y T3P para garantizar que no se habían introducido mutaciones. El fragmento que contenía los genes dhaB1-dhaB2 se purificó en un gel de agarosa tras la digestión del vector Zero Blunt TOPO- dhaB1-dha2 con BamHI y XhoI.

Se amplificó el gen yqhD se amplificó a partir de ADN genómico de E. coli MG1655 utilizando los cebadores pyqhD1 y pyqhD2. Los cebadores se diseñaron para introducir la región RBS01 junto con yqhD gene, así como la introducción de los sitios de restricción XhoI y SfoI cadena arriba y cadena abajo, respectivamente:

pyqhDI: Xhol RBS01 yqhD (SEC ID n° 74) CTCGAGttataacctccttaatgaacaactttaatctgcacaccccaacccgcattct

pyqhD2 : Sfol -yqhDrv (SEC ID n° 75)

GGCGCCttagcgggcggcttcgtatatacggcggctgacat

El fragmento de PCR amplificado a continuación se subclonó en un vector Zero Blunt TOPO (Invitrogen, Saint Aubin, Francia), proporcionando el plásmido Zero Blunt TOPO-yqhD y se secuenció utilizando los cebadores universales T7P y t 3p para comprobar que no se habían introducido mutaciones. El fragmento que contenía el gen yqhD se purificó en un gel de agarosa tras la digestión del vector Zero Blunt TOPO-yqhD con XhoI y SfoI.

El plásmido de 7 kb pSOS95 (Genbank, número de acceso AY187686.1) se digirió con BamHI (situado cadena abajo del promotor thl) y SfoI (situado cadena arriba del terminador adc) y se ligó con los fragmentos BamHI-XhoI dhaB1dhaB2 y xhol-Sfol yqhD, proporcionando el plásmido pSOS95 pthl-dhaB1-dhaB2-yqhD. El plásmido pSOS95pthl-dhaB1-dhaB2-yqhD se digirió con SalI y el fragmento que contenía el operón se purificó en gel de agarosa antes de la ligación con el plásmido pSC101_pGI-cac2229-cac0764-cac0303-pntAB predigerido con SalI (sección 5.2.), proporcionando el plásmido pSC101-pGI-cac2229-cac0764-cac0303-pntAB-pthl-dhaB1-dhaB2-yqhD.

5. Introducción del vector de expresión pSC101-pGI-cac2229-cac0764-cac0303-pntAB_pthl-dhaB1-dhaB2-yqhD en MG1655 AldhA::FRTApflAB::FRTAiscR::FRTAfrdABCD::FRT AaceE::FRTAmgsA::FRTAaceE: :FRTAmgsA::FRTAadhE::FRTAaldA::FRTAaldB::FRTAglpD:: FRTAglpA::FRT.

El vector de expresión The pSC101-pGI-cac2229-cac0764-cac0303-pntAB_pthl-dhaB1-dhaB2-yqhD se utilizó para transformar MG1655 AldhA::FRTApflAB::FRTAiscR::FRTAfrdABCD::FRT AaceE::FRTAmgsA::FRTAaceE::FRTAmgsA::FRTAadhE::FRTAaldA::FRTAaldB::FRTAglpD::F RTAglpA::FRT mediante electroporación (Sambrook y Russel 2001).

Los transformantes se seleccionaron en placas de agar LB complementado con espectinomicina (70 pg/ml) a 37°C. A continuación, se cultivaron algunos transformantes en cultivo líquido de LB complementado con espectinomicina (100 pg/ml) durante la noche a 37°C para llevar a cabo la extracción del plásmido de ADN (kit miniprep de plásmidos GenElute HP, Sigma) y comprobar para la presencia del plásmido. El plásmido pSC101-pGI- cac2229-cac0764-cac0303-pntAB_pthl-dhaB1-dhaB2-yqhD finalmente se controló mediante restricción.

La cepa final de E coli MG1655 AldhA::FRTApflAB::FRTAackA-pta::FRTAiscR::FRTAfrdABCD::FRT AaceE::FRTAmgsA::FRTAadhE::FRTAaldA::FRTAaldB::FRTAglpD::FRTAglpA::FRT. pSC101pGI- cac2229-cac0764-cac0303-pntAB_pthl-dhaB1-dhaB2-yqhD se cultivó en medio líquido de Lb complementado con espectinomicina (100 pg/ml) y se mantuvo en solución de glicerol al 20% a -80°C.

5.5 Caracterización fisiológica de la cepa modificada de E. coli MG1655 AldhA::FRTApflAB::FRTAackApta::FRTAiscR::FRTAfrdABCD::FRTAaceE::FRTAmgsA::FR T AadhE::FRTAaldA::FRTAaldB::FRTAglpD::FRTAglpA::FRTpSC101-pGI- cac2229-cac0764-cac0303-pntAB_pthldhaB1-dhaB2-yqhD.

La cepa de E coli MG1655 AldhA::FRTApflAB::FRTAackA-pta::FRTAiscR::FRTAfrdABCD::FRTAaceE::FRTAmgsA::FRTAadhE::FRTAaldA::FRTAaldB::F RTAglpD::FRTAglpA::FRT pSC101-pGI- cac2229-cac0764-cac0303-pntAB_pthl-dhaB1-dhaB2-yqhD se cultivó anaeróbicamente en n medio mineral con 20 g/l de glicerol que contenía sales minerales, tal como se ha indicado anteriormente (Meynial-salles et al. 2005) complementado con 4 g/l de extracto de levadura, nitrato sódico 5 mM y espectinomicina (100 pg/ml), y se inoculó con 100 pl de un cultivo de durante la noche en LB. Las células se cultivaron a 37°C durante varios días y se mantuvo el pH mediante tamponado del medio de cultivo con MOPS. Como control, se cultivó la cepa de E. coli MG1655AldhA::FRTApflAB::FRTAackApta::FRTAiscR::FRTAfrdABCD::FRTAaceE::FRTAmgsA ::FRTAadhE::FRTAaldA::FRTAaldB::FRTAglpD::FRTAglpA::FRT bajo las mismas condiciones.

Se llevó a cabo el análisis fenotípico comparativo mediante la medición del consumo de glicerol además de la concentración de los productos de fermentación para el cultivo de cada cepa, tal como se muestra en la tabla 5:

Tal como se muestra en la tabla 5, la expresión de los operones CA_C2229-CA_C0764-CA_C0303-pntAB y dhaB1-dhaB2-yqhDen E. coli MG1655 AldhA::FRTApflAB::FRTAackA-pta::FRTAiscR::FRTAfrdABCD::FRTAaceE::FRTAmgsA::FRTAadhE::FRTAaldA::FRTAaldB::F RTAglpD::FRTAglpA::FRT condujo a la producción de 1.3-propanodiol y acetato como los productos de fermentación principales a partir de glicerol. Además, la expresión de ambos operones, CA-C2229-CA-C0764-CA_C0303-pntAB y dhaB1-dhaB2-yqhD, favoreció el crecimiento, que resultó fuertemente perjudicada en la cepa de control.

Ejemplo 6: producción heteróloga de 1.2-propanodiol mediante una nueva ruta metabólica en una cepa de E. coli con una actividad potenciada de ferredoxina NADP+ reductasa:

6.1: construcción de una cepa modificada de E. coli MG1655AldhA::FRT, ApflAB::FRT, AiscR::FRT, AfrdABCD::FRT AaceE::FRT, AtpiA::FRTAadhE::FRT, AaldA::FRT, AaldB::FRT, AgloA::FRT, AhchA::FRT 6.1.1 Construcción de una cepa modificada de E. coli MG1655A tpiA::cm:

Se sustituyó el gen tpiA por un casete de resistencia al cloranfenicol flanqueado por la diana de reconocimiento de Flp (FRT), que se generó mediante PCR mediante la utilización de cebadores con extensiones de homología de 80 nt, eliminando la mayor parte del gen en cuestión. La técnica utilizada fue descrita por Datsenko y Wanner en 2000.

Se diseñaron dos oligonucleótidos y se utilizaron para sustituir el gen tpiA:

DtpiAr que consta de 100 bases (SEC ID n° 76):

atgcgacatcctttagtgatgggtaactggaaactgaacggcagccgccacatggttcacgagctggtttctaacctgcgtaCATATGAA TATCCTCCTTAG

Con una región (letras minúsculas) homóloga de la secuencia (4109530 a 4109449) que incluye el codón de inicio del gen tpiA (secuencia 4108763 a 4109530), una secuencia de referencia en el sitio de intemet http://ecocyc.org/ y una región (letras mayúsculas) para la amplificación del casete de resistencia al cloranfenicol del plásmido pKD3. DtpiAf, que consta de 100 bases (SEC ID n° 77):

CttaagcctgtttagccgcttctgcagctttaacgattactgcgaaggcgtcagctttcagagaagcaccaccaaccagcTGTAGGCTG GAGCTGCTTCG

Con una región (letras minúsculas) homóloga de la secuencia (4108762 a 4108841) correspondiente a la secuencia codificante de la parte C-terminal del codón de para del gen tpiA (4108763 a 4109530), una secuencia de referencia en el sitio de internet http://ecocyc.org/ y una región (letras mayúsculas) para la amplificación del casete de resistencia al cloranfenicol transportado por el plásmido pKD3.

Se utilizaron los oligonucleótidos DtpiAr y DtpiAf para amplificar el casete de resistencia al cloranfenicol a partir del plásmido pKD3. A continuación, se introdujo mediante electroporación el fragmento de PCR amplificado en la cepa E. coli MG1655 portadora del plásmido auxiliar RED (pKD46) que expresa los genes del sistema a, p y exo codificantes de las recombinasas Gam, Bet y Exo para fomentar la recombinación homóloga. A continuación, se seleccionaron los transformantes resistentes a antibiótico y se comprobó la sustitución del gen tpiA por el casete de cloranfenicol mediante análisis de PCR utilizando ambos oligonucleótidos, cdh y YIIQ.

cdh (SEC ID n° 78):

ggtgatgatagttatcgccg (homólogo de la secuencia 4107979 to 4107998)

YIIQ (SEC ID n° 79):

cgtgccatcgacagcagtcc (homólogo de la secuencia 4110023 a 4110042)

6.1.2 Construcción de una cepa modificada E. coli MG1655AldhA::FRT, ApflAB::FRT, AiscR::FRT, AfrdABCD::FRTAaceE::FRT, AtpiA::FRT

El gen tpiA se sustituyó por un casete de resistencia al cloranfenicol en la cepa MG1655AldhA::FRT ApflAB::FRTAiscR::FRTAfrdABCD::FRTAaceE::FRT (ver la sección 5.1.3) y se llevó a cabo la eliminación mediante transducción generalizada con el fago P1 a partir del lisado del mutante único (Miller, 1972) utilizando la cepa de E. coli MG1655AtpiA::cm.

Los transductantes CmR se seleccionaron en una placa y la sustitución del gen tpiA por el casete de cloranfenicol en MG1655AldhA::FRTApflAB::FRTAiscR : :FRTAfrdABCD::FRTAaceE::FRT se comprobó mediante análisis de PCR utilizando ambos oligonucleótidos, cdh y YIIQ. Finalmente, también se utilizaron los pares de cebadores i) hslJC y ldhAC2, ii) pFLAB1 y pflAB2, iii) iscrls y iscrlrv, iv) frdABCD1s y frdABCD1rv y v) aceEs y aceErv en análisis de PCR para confirmar la eliminación de los genes IdhA, pflAB, iscR, frdABCD y aceE, respectivamente, en la cepa AtpiA::cm. La cepa resultante se denominó MG1655 AldhA::FRTApflAB::FRTAiscR::FRTAfrdABCD::FRTAaceE::FRTAtpiA:: cm.

A continuación se eliminó el casete de resistencia al cloranfenicol mediante la utilización del plásmido pCP20 auxiliar Flp (Cheperanov y Wagernagel, 1995). Se transformaron mutantes CmR con pCP20 y se seleccionaron los transformantes resistentes a ampicilina a 30°C, seguido de la purificación de las colonias de unos cuantos a 42°C y el ensayo para la pérdida de la resistencia al antibiótico mediante análisis de PCR utilizando los oligonucleótidos anteriormente indicados (SEC ID n° 78 y n° 79). La nueva cepa se denominó MG1655AldhA::FRTApflAB::FRTAiscR::FRTAfrdABCD::FRTAaceE::FRTAtpiA::FRT.

6.1.3 Construcción de una cepa modificada de E. coli MG1655AldhA::FRT, ApflAB::FRT, AiscR::FRT, AfrdABCD::FRT AaceE::FRT, AtpiA::FRTAadhE::FRT:

El gen adhE se sustituyó por un casete de resistencia al cloranfenicol en la cepa MG1655AldhA::FRT ApflAB::FRTAiscR::FRTAfrdABCD::FRTAaceE::FRTAtpiA::FRT y se llevó a cabo la eliminación mediante transducción generalizada del fago P1 a partir del lisado del mutante único (Miller, 1972) utilizando la cepa de E. coli MG1655AadhE::cm (ver la sección 4.1.1).

Los transductantes CmR se seleccionaron en una placa y la sustitución del gen adhE por el casete de cloranfenicol en MG1655AldhA::FRTApflAB::FRTAiscR ::FRTAfrdABCD::FRTAaceE::FRTATpiA:FRT se comprobó mediante análisis de PCR utilizando ambos oligonucleótidos, ychGf y adhECr. Finalmente, también se utilizaron los pares de cebadores i) hslJC y ldhAC2, ii) pFLAB1 y pflAB2, iii) iscrls y iscrlrv, iv) frdABCDls y frdABCDlrv, v) aceEs y aceErv y vi) cdh y YIIQ en el análisis de PCR para confirmar la eliminación de los genes ldhA, pflAB, iscR, frdABCD, aceE y tpiA, respectivamente, en la cepa AadhE::cm. La cepa resultante se denominó MG1655 AldhA::FRTApflAB::FRTAiscR::FRTAfrdABCD::FRTAaceE::FRTAtpiA::FRTAadhE::cm.

A continuación se eliminó el casete de resistencia al cloranfenicol mediante la utilización del plásmido pCP20 auxiliar Flp (Cheperanov y Wagernagel, 1995). Los mutantes CmR se transformaron con pCP20, y los transformantes resistentes a ampicilina se seleccionaron a 30°C, seguido de la purificación de las colonias de algunos a 42°C y a continuación se sometieron a ensayo para pérdida de la resistencia al antibiótico mediante análisis de PCR utilizando los oligonucleótidos anteriormente indicados (SEC ID n° 40 y n° 41). La nueva cepa se denominó MG1655AldhA::FRTApflAB::FRTAiscR::FRTAfrdABCD::FRTAaceE::FRTAtpiA::FRT AadhE::F RT.

6.1.4 Construcción de una cepa modificada E. coli MG1655AldhA::FRT, ApflAB::FRT, AiscR::FRT, AfrdABCD::FRT AaceE::FRT, AtpiA::FRTAadhE::FRT AaldA::FRT

El gen aldA se sustituyó por un casete de resistencia al cloranfenicol en la cepa MG1655AldhA::FRT ApflAB::FRTAiscR::FRTAfrdABCD::FRTAaceE::FRT • tpiA::FRTAadhE::FRT y se llevó a cabo la eliminación mediante transducción generalizada de fago P1 a partir del lisado de mutante único (Miller, 1972) utilizando la cepa de E. coli MG1655AaldA::cm (ver la sección 5.1.6).

Los transductantes CmR se seleccionaron en una placa y la sustitución del gen aldA por el casete de cloranfenicol en MG1655AldhA::FRTApflAB::FRTAiscR ::FRTAfrdABCD::FRTAaceE::FRTAtpiA::FRT AadhE::FRT se comprobó mediante análisis de PCR utilizando ambos oligonucleótidos, YdcFCF y gapCCr. Finalmente, también se utilizaron los pares de cebadores i) hslJC y ldhAC2, ii) pFLAB1 y pflAB2, iii) iscrls y iscrlrv, iv) frdABCDls y frdABCDlrv, v) aceEs y aceErv, vi) cdh y YIIQ y vii) ychGf y adhECr en análisis de PCR para confirmar la eliminación de los genes ldhA, pflAB, iscR, frdABCD, ace, tpiA y adhE, respectivamente, en la cepa AaldA::cm. La cepa resultante se denominó MG1655 AldhA::FRTApflAB::FRTAiscR::FRTAfrdABCD::FRTAaceE::FRTAtpiA::FRT AadhE::FRTAaldA: :cm.

A continuación se eliminó el casete de resistencia al cloranfenicol mediante la utilización del plásmido pCP20 auxiliar Flp (Cheperanov y Wagernagel, 1995). Los mutantes CmR se transformaron con pCP20, y los transformantes resistentes a ampicilina se seleccionaron a 30°C, seguido de la purificación de las colonias de algunos a 42°C y a continuación se sometieron a ensayo para pérdida de la resistencia al antibiótico mediante análisis de PCR utilizando los oligonucleótidos anteriormente indicados (SEC ID n° 56 y n° 57). La nueva cepa se denominó MG 1655 AldhA::FRTApfíAB::FRTAiscR::FRTAfrdABCD::FRTAaceE::FRTAtpiA::FRT AadhE::F RTAaldA::FRT.

6.1.5 Construcción de una cepa modificada de E. coli MG1655AldhA::FRT, ApflAB::FRT, AiscR::FRT,AfrdABCD::FRTAaceE::FRT,AtpiA::FRTAadhE::FRTAaldA::FR T AaldB::FRT.

El gen aldB se sustituyó por un casete de resistencia al cloranfenicol en la cepa MG1655AldhA::FRT ApflAB::FRTAiscR::FRTAfrdABCD::FRTAaceE::FRTAtpiA::FRTAadhE::FRT AaldA::FRTy la eliminación se llevó a cabo mediante transducción generalizada del fago P1 a partir del lisado del mutante único (Miller, 1972) utilizando la cepa de E. coli MG1655AaldB::cm (ver la sección 5.1.8).

Los transductantes CmR se seleccionaron en una placa y la sustitución del gen aldB por el casete de cloranfenicol en MG1655AldhA::FRTApflAB::FRTAiscR ::FRTAfrdABCD::FRTAaceE::FRTAtpiA::FRT AadhE::FRT AaldA::FRT se comprobó mediante análisis de PCR utilizando ambos oligonucleótidos, aldBCf y YiaYCr. Finalmente, también se utilizaron los pares de cebadores i) hslJC y ldhAC2, ii) pFLAB1 y pflAB2, iii) iscrls y iscrlrv ,iv) frdABCDls y frdABCDlrv, v) aceEs y aceErv, vi) cdh y YIIQ, ychGf y adhECr y vii) YdcFCF y gapCCr en análisis de PCR para confirmar la eliminación de los genes IdhA, pflAB, iscR, frdABCD, aceE, tpiA adhE y aldA, respectivamente, en la cepa AaldB::cm. La cepa resultante se denominó MG1655 AldhA::FRTApflAB::FRTAiscR::FRTAfrdABCD::FRTAaceE::FRTAtpiA::FRT AadhE::FRTAaldA: :FRTAaldB::cm.

A continuación se eliminó el casete de resistencia al cloranfenicol mediante la utilización del plásmido pCP20 auxiliar Flp (Cheperanov y Wagernagel, 1995). Los mutantes CmRse transformaron con pCP20, y los transformantes resistentes a ampicilina se seleccionaron a 30°C, seguido de la purificación de las colonias de algunos a 42°C y a continuación se sometieron a ensayo para pérdida de la resistencia al antibiótico mediante análisis de PCR utilizando los oligonucleótidos anteriormente indicados (SEC ID n° 60 y n° 61). La nueva cepa se denominó MG1655 AldhA::FRTApflAB::FRTAiscR::FRTAfrdABCD::FRTAaceE::FRTAtpiA::FRT AadhE::F RTAaldA::FRTAaldB::FRT.

6.1.6 Construcción de una cepa modificada de E. coli MG1655AgloA::FRT-cm-FRT:

El gen gloA se sustituyó por un casete de resistencia al antibiótico cloranfenicol flanqueado por la diana de reconocimiento de Flp (FRT), que se generó mediante PCR utilizando los cebadores con extensiones de homología de 80 nt, eliminando la mayor parte del gen en cuestión. La técnica utilizada fue descrita por Datsenko y Wanner en 2000.

Se diseñaron dos oligonucleótidos y se utilizaron para sustituir el gen gloA:

GLOAD f que consistía en 100 bases (SEC ID n° 80):

atgcgtcttcttcataccatgctgcgcgttggcgatttgcaacgctccatcgatttttataccaaagtgctgggcatgaaGTGTAGGCTGG AGCTGCTTCG

Con una región (letras minúsculas) homóloga de la secuencia (1725861-1725940) que incluía el codón de inicio del gen gloA (secuencia 1725861 a 1726268), una secuencia de referencia en el sitio de intemet http://ecocyc.org/ y una región (letras mayúsculas) para la amplificación del casete de resistencia al cloranfenicol del plásmido pKD3. GLOA D R consistía en 100 bases (SEC ID n° 81) ttagttgcccagaccgcgaccggcgtctttctcttcgattaactcaattttgtaaccgtccggatcttccacaaacgcgaCATATGAATA TCCTCCTTAG

Con una región (letras minúsculas) homóloga de la secuencia (1726189-1726268) correspondiente a la secuencia codificante de la parte C-terminal del codón de parada del gen gloA (1725861 a 1726268), una secuencia de referencia en el sitio de internet http://ecocyc.org/y una región (letras mayúsculas) para la amplificación del casete de resistencia al cloranfenicol transportado por el plásmido pKD3.

Se utilizaron ambos oligonucleótidos, GLOADr y GLOADf, para amplificar el casete de resistencia al cloranfenicol a partir del plásmido pKD3. A continuación, se introdujo mediante electroporación el fragmento de PCR amplificado en la cepa E. coli MG1655 portadora del plásmido auxiliar RED (pKD46) que expresa los genes del sistema a, p y exo codificantes de las recombinasas Gam, Bet y Exo para fomentar la recombinación homóloga. A continuación, se seleccionaron los transformantes resistentes al antibiótico y se comprobó la sustitución del gen gloA por el casete de cloranfenicol mediante análisis de PCR utilizando ambos oligonucleótidos, NemACd y RntCr.

NemACd (SEC ID n° 82):

gaagtggtcgatgccgggattgaagaatggg (homólogo de la secuencia 1725331 a 1725361)

Rnt Cr (SEC ID n° 83):

ggtgatgatagttatcgccg (homólogo de la secuencia 1726765 a 1726795)

6.1.7 Construcción de una cepa modificada de E. coli MG1655AldhA::FRT,ApflAB::FRT, AiscR::FRT,AfrdABCD::FRTAaceE::FRT,AtpiA::FRTAadhE::FRT AaldA::FRT A aldB::FRTAgloA::FRT:

El gen gloA se sustituyó por un casete de resistencia al cloranfenicol en la cepa MG1655AldhA::FRT ApflAB::FRTAiscR::FRTAfrdABCD::FRTAaceE::FRTAtpiA::FRT AadhE::FRT AaldA::FRT AaldB::FRT y la eliminación se llevó a cabo mediante transducción generalizada de fago P1 a partir del lisado del mutante único (Miller 1972) utilizando la cepa de E. coli MG1655AgloA::cm.

Los transductantes CmR se seleccionaron en una placa y la sustitución del gen gloA por el casete de cloranfenicol en MG1655AldhA::FRTApflAB::FRTAiscR ::FRTAfrdABCD::FRTAaceE::FRTAtpiA::FRT AadhE::FRT AaldA::FRT AaldB::FRT se comprobó mediante análisis de PCR utilizando ambos oligonucleótidos, NemACd y RntCr. Finalmente, también se utilizaron los pares de cebadores i) hslJC y ldhAC2, ii) pFLAB1 y pflAB2, iii) iscrls y iscrlrv, iv) frdABCDls y frdABCDlrv, v) aceEs y aceErv, vi) cdh y YIIQ, ychGf y adhECr, vii) YdcFCF y gapCCr c y viii) aldBCf y YiaYCr en análisis de PCR para confirmar la eliminación de los genes ldhA, pflAB, iscR, frdABCD, aceE, tpiA, adhE, aldA y aldB, respectivamente, en la cepa AgloA::cm. La cepa resultante se denominó MG1655 AldhA::FRTApflAB::FRTAiscR::FRTAfrdABCD::FRTAaceE::FRTAtpiA::FRT AadhE::FRTAaldA: :FRTAaldB::FRTAgloA::cm.

A continuación se eliminó el casete de resistencia al cloranfenicol mediante la utilización del plásmido pCP20 auxiliar Flp (Cheperanov y Wagernagel, 1995). Los mutantes CmR se transformaron con pCP20, y los transformantes resistentes a ampicilina se seleccionaron a 30°C, seguido de la purificación de las colonias de algunos a 42°C y a continuación se sometieron a ensayo para pérdida de la resistencia al antibiótico mediante análisis de PCR utilizando los oligonucleótidos anteriormente indicados (SEC ID n° 82 y n° 83). La nueva cepa se denominó MG1655 AldhA::FRTApflAB::FRTAiscR::FRTAfrdABCD::FRTAaceE::FRTAtpiA::FRT AadhE::F RTAaldA::FRTAaldB::FRTAgloA::FRT.

6.1.8 Construcción de una cepa modificada de E. coli MG1655AgloB::FRT-cm-FRT:

El gen gloB se sustituyó por un casete de resistencia al antibiótico cloranfenicol flanqueado por la diana de reconocimiento de Flp (FrT), que se generó mediante PCR utilizando cebadores con extensiones de homología de 80 nt, eliminando la mayor parte del gen en cuestión. La técnica utilizada fue descrita por Datsenko y Wanner en 2000. Se diseñaron dos oligonucleótidos y se utilizaron para sustituir el gen gloB:

GLOBD f que consistía en 100 bases (SEC ID n° 84):

acaatcaggcagcgacctgcttcatcattcaaaacccagatgtaattgtcatcaaaggcgggaatactgttaagattcatGTGTAGGCTG GAGCTGCTTCG

Con una región (letras minúsculas) homóloga de la secuencia (234703-234782) que incluía el codón de inicio del gen gloB (secuencia 234027 a 234782), una secuencia de referencia en el sitio de intemet http://ecocyc.org/,y una región (letras mayúsculas) para la amplificación del casete de resistencia al cloranfenicol del plásmido pKD3. GLOB D R consistía en 100 bases (SEC ID n° 85) taatgtaattaatgaagaaacattattgcaacaacctgaagagcgttttgcatggttaaggtcaaagaaagataggttctgaCATATGAAT ATCCTCCTTAG

Con una región (letras minúsculas) homóloga de la secuencia (234027-234108) correspondiente a la secuencia codificante de la parte C-terminal del codón de parada del gen gloB (234027 a 234782), una secuencia de referencia en el sitio de internet http://ecocyc.org/y una región (letras mayúsculas) para la amplificación del casete de resistencia al cloranfenicol transportado por el plásmido pKD3.

Se utilizaron ambos oligonucleótidos, GLOBDr y GLOBDf, para amplificar el casete de resistencia al cloranfenicol a partir del plásmido pKD3. A continuación, se introdujo mediante electroporación el fragmento de PCR amplificado en la cepa E. coli MG1655 portadora del plásmido auxiliar RED (pKD46) que expresa los genes del sistema a, p y exo codificantes de las recombinasas Gam, Bet y Exo para fomentar la recombinación homóloga. A continuación, se seleccionaron los transformantes resistentes al antibiótico y se comprobó la sustitución del gen gloB por el casete de cloranfenicol mediante análisis de PCR utilizando ambos oligonucleótidos, MltDCfd y YafS Cr.

MltDCfd (SEC ID n° 86):

ggcgagtaatatcgcttttgcc (homólogo de la secuencia 233929 a 233950)

YafS Cr (SEC ID n° 87):

ggcgagtaatatcgcttttgcc (homólogo de la secuencia 234822 a 234845).

6.1.9 Construcción de una cepa modificada de E. coli MG1655AldhA::FRT,ApflAB::FRT, AiscR::FRT, AfrdABCD::FRTAaceE::FRT,AtpiA::FRTAadhE::FRTAald4::FRTA aldB::FRTAgloA::FRTAgloB::FRT:

El gen gloB se sustituyó por un casete de resistencia al cloranfenicol en la cepa MG1655AldhA::FRT ApflAB::FRTAiscR::FRTAfrdABCD::FRTAaceE::FRTAtpiA::FRT AadhE::FRT AaldA::FRT AaldB::FRT AgloA::FRTy la eliminación se llevó a cabo mediante transducción generalizada de fago P1 a partir del lisado del mutante único (Miller, 1972) utilizando la cepa de E. coli MG1655AgloB::cm.

Los transductantes CmR se seleccionaron en una placa y la sustitución del gen gloB por el casete de cloranfenicol en MG1655AldhA::FRTApflAB::FRTAiscR ::FRTAfrdABCD::FRTAaceE::FRTAtpiA::FRT AadhE::FRT AaldA::FRT AaldB::FRT AgloA::FRT se comprobó mediante análisis de PCR utilizando ambos oligonucleótidos, MltDCfd y YafS Cr. Finalmente, también se utilizaron los pares de cebadores i) hslJC y ldhAC2, ii) pFLABI y pflAB2, iii) iscrls y iscrlrv, iv) frdABCDls y frdABCDlrv, v) aceEs y aceErv, vi) cdh y YIIQ, ychGf y adhECr, vii) YdcFCF y gapCCr c y viii) aldBCf y YiaYCr y NemACd y RntCr en análisis de PCR para confirmar la eliminación de los genes IdhA, pflAB, iscR, frdABCD, aceE, tpiA, adhE, aldA, aldB y gloA, respectivamente, en la cepa AgloB::cm. La cepa resultante se denominó MG1655 AldhA::FRTApflAB::FRTAiscR::FRTAfrdABCD::FRTAaceE::FRTAtpiA::FRT AadhE::FRTAaldA: :FRTAaldB::FRTAgloA::FRTAgloB::cm.

A continuación se eliminó el casete de resistencia al cloranfenicol mediante la utilización del plásmido pCP20 auxiliar Flp (Cheperanov y Wagernagel, 1995). Se transformaron los mutantes CmR con pCP20 y los transformantes resistentes a ampicilina se seleccionaron a 30°C, seguido de la purificación de colonias de algunos a 42°C y el ensayo para pérdida de la resistencia a antibióticos mediante análisis de PCR utilizando los oligonucleótidos anteriormente indicados (SEC ID n° 86 y n° 87). La nueva cepa se denominó MG1655 AldhA::FRTApflAB::FRTAiscR::FRTAfrdABCD::FRTAaceE::FRTAtpiA::FRT AadhE::F RTAaldA::FRTAaldB::FRTAgloA::FRTAgloB::FRT.

6.1.10. Construcción de una cepa modificada de E. coli MG1655AhchA::FRT-cm-FRT:

Se sustituyó el gen hchA por un casete de resistencia al cloranfenicol flanqueado por la diana de reconocimiento de Flp (FRT), que se generó mediante PCR mediante la utilización de cebadores con extensiones de homología de 80 nt, eliminando la mayor parte del gen en cuestión. La técnica utilizada fue descrita por Datsenko y Wanner en 2000. Se diseñaron dos oligonucleótidos y se utilizaron para sustituir el gen hchA:

HchAD f que consta de 100 bases (SEC ID n° 88):

atgactgttcaaacaagtaaaaatccgcaggtcgatattgctgaagataatgcattcttcccttcagaatattcgcttagCCTTCAGAATA TTCGCTTAG GTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG

Con una región (letras minúsculas) homóloga de la secuencia (2033859-2033938) que incluía el codón de inicio del gen hchA (secuencia 2033859 a 2034710), una secuencia de referencia en el sitio de intemet http://ecocyc.org/ y una región (letras mayúsculas) para la amplificación del casete de resistencia al cloranfenicol del plásmido pKD3. HchA D R consta de 100 bases (SEC ID n° 89).

ttaacccgcgtaagctgccagcatttcctgcgccgccagtttacccaacgcattcgctgcaaaaggactgtcgccggtgaCATATGAAT ATCCTCCTTAG

Con una región (letras minúsculas) homóloga de la secuencia (2034631-2034710) correspondiente a la secuencia codificante de la parte C-terminal del codón de parada del gen hchA (2033859 a 2034710), una secuencia de referencia en el sitio de internet http://ecocyc.org/y una región (letras mayúsculas) para la amplificación del casete de resistencia al cloranfenicol transportado por el plásmido pKD3.

Se utilizaron ambos oligonucleótidos, HchADr y HchADf, para amplificar el casete de resistencia al cloranfenicol a partir del plásmido pKD3. A continuación, se introdujo mediante electroporación el fragmento de PCR amplificado en la cepa E. coli MG1655 portadora del plásmido auxiliar RED (pKD46) que expresa los genes del sistema a, p y exo codificantes de las recombinasas Gam, Bet y Exo para fomentar la recombinación homóloga. A continuación, se seleccionaron los transformantes resistentes a antibiótico y se comprobó la sustitución del gen hchA por el casete de cloranfenicol mediante análisis de PCR utilizando ambos oligonucleótidos, YedS_3Cf y YedvCr.

YedS_3Cf (SEC ID n° 90):

tgtgggcttagtctaccagttc (homólogo de la secuencia 2033243-2033264)

Yedv Cr (SEC ID n° 91):

cgttaccgcaaagaaattaa (homólogo de la secuencia 2034818 a 2034837).

6.1.11 Construcción de una cepa modificada de E. coli MG1655AldhA::FRT,ApflAB::FRT, AiscR::FRT,AfrdABCD::FRTAaceE::FRT,AtpiA::FRTAadhE::FRTAaldA::FRTA aldB::FRTAgloA::FRTAgloB::FRTAhchA::FRT.

El gen hchA se sustituyó por un casete de resistencia al cloranfenicol en la cepa MG1655AldhA::FRT ApflAB::FRTAiscR::FRTAfrdABCD::FRTAaceE::FRTAtpiA::FRT AadhE::FRT AaldA::FRT AaldB::FRT AgloA::FRT AgloB::FRTy se llevó a cabo la eliminación mediante transducción generalizada de fago P1 a partir del lisado de mutante único (Miller,1972) utilizando la cepa de E. coli MG1655AhchA::cm.

Los transductantes CmR se seleccionaron en una placa y la sustitución del gen hchA por el casete de cloranfenicol en MG1655AldhA::FRTApflAB::FRTAiscR ::FRTAfrdABCD::FRTAaceE::FRTAtpiA::FRT AadhE::FRT AaldA::FRT AaldB::FRT AgloA::FRT AgloB::FRT se comprobó mediante análisis de PCR utilizando ambos oligonucleótidos, YedS_3Cf y YedvCr. Finalmente, también se utilizaron los pares de cebadores i) hslJC y ldhAC2, ii) pFLAB1 y pflAB2, iii) iscrls y iscrlrv, iv) frdABCDls y frdABCDlrv, v) aceEs y aceErv, vi) cdh y YIiQ, ychGf y adhECr, vii) YdcFCF y gapCCr c, y viii) aldBCf y YiaYCr, NemACd y RntCr y MltDCfd y YafS Cr en análisis de PCR para confirmar la eliminación de los genes IdhA, pflAB, iscR, frdABCD, aceE, tpiA, adhE, aldA, aldB, gloA y gloB, respectivamente, en la cepa AhchA::cm. La cepa resultante se denominó MG1655 AldhA::FRTApflAB::FRTAiscR::FRTAfrdABCD::FRTAaceE::FRTAtpiA::FRT AadhE::FRTAaldA: :FRTAaldB::FRTAgloA::FRTAgloB::FRTAhchA::cm.

A continuación se eliminó el casete de resistencia al cloranfenicol mediante la utilización del plásmido pCP20 auxiliar Flp (Cheperanov y Wagernagel, 1995). Se transformaron los mutantes CmR con pCP20 y los transformantes resistentes a ampicilina se seleccionaron a 30°C, seguido de la purificación de colonias de algunos a 42°C y el ensayo para pérdida de la resistencia a antibióticos mediante análisis de PCR utilizando los oligonucleótidos anteriormente indicados (SEC ID n° 90 y n° 919). La nueva cepa se denominó MG1655 AldhA::FRTApflAB::FRTAiscR::FRAfrdABCD::FRTAaceE::FRTAtpiA::FRTAadhE::FRT AaldA::FRTAaldB::FRTAgloA::FRTAgloB::FRTAhchA::FRT.

6.2 Construcción del vector de expresión pSC101-pGI-cac2229-cac0764-cac0303_pthl gldA-yqhD

El gen gldA se amplificó a partir de ADN genómico de E. coli MG1655 utilizando los cebadores pgldAlf y pgldA2r. Los cebadores se diseñaron para introducir la región RBS01 junto con el gen gldA, así como la introducción de los sitios de restricción BamHI y Xhol cadena arriba y cadena abajo, respectivamente:

pgldA1f: BamHI-RBS gldA (SEC ID n° 92)

GGATCCttataacctccttaatggaccgcattattcaatcaccggg

pgldAr:XhoI-gldA (SEC ID n° 93)

CTCGAGttattcccactcttgcaggaaacgc

El fragmento de PCR amplificado a continuación se subclonó en un vector Zero Blunt TOPO (Invitrogen, Saint Aubin, Francia), proporcionando el plásmido Zero Blunt TOPO-gldA y se secuenció utilizando los cebadores universales T7P y t 3p para comprobar que no se habían introducido mutaciones. El fragmento que contenía los genes dhaB1-dhaB2 se purificó en un gel de agarosa tras la digestión del vector Zero Blunt TOPO-gldAcon BamHI y XhoI.

El plásmido pSOS95 pthl-dhaB1-dhaB2-yqhD (ver sección 5.3) se digirió con BamHI y XhoI, y se ligó con el fragmento BamHI-XhoI gldA, proporcionando el plásmido pSOS95pthl-gldA-yqhD. El plásmido pSOS95pthl-gldA-yqhD se digirió con SalI y el fragmento que contenía el operón se purificó en gel de agarosa antes de la ligación con el plásmido pSC101_pGI-cac2229-cac0764-cac0303 predigerido con SalI (3.2.), proporcionando el plásmido pSC101-pGI-cac2229-cac0764-cac0303_pthl-gldA-yqhD.

6.3 Construcción del vector de expresión pSC101-pGI-cac2229-cac0764-cac0303-pntAB_ythl sadhbej-yqhD

Se amplificó el gen sadh de C. beijerinckii a partir del plásmido SOS952 (Dusséaux et al. 2013) utilizando los cebadores psadh11 y psadh2r. Los cebadores se diseñaron para amplificar la región RBS junto con el gen sadh, así como la introducción de los sitios de restricción BamHI y XhoI cadena arriba y cadena abajo de sadh, respectivamente:

psadhlf: BamHI-RBSsadh (SEC ID n° 94)

GGATCCtatctttaaggaggaacatattttatgaaaggttttgcaatgc

psadh2r:XhoI-sadh (SEC ID n° 95)

CTCGAGttataatataactactgctttaattaagtcttttggc

El fragmento de PCR amplificado a continuación se subclonó en un vector Zero Blunt TOPO (Invitrogen, Saint Aubin, Francia), proporcionando el plásmido Zero Blunt TOPO-cac0764 y se secuenció utilizando los cebadores universales T7P y T3P para comprobar que no se habían introducido mutaciones. El fragmento que contenía el gen sadh se purificó en un gel de agarosa tras la digestión del vector Zero Blunt TOPO-sadh con BamHI y XhoI.

El plásmido pSOS95 pthl-dhaB1-dhaB2-yqhD (ver la sección 5.3) se digirió con BamHI y XhoI y se ligó con el fragmento BamHI-XhoI de sadh, proporcionando el plásmido pSOS95 pthl-sadh-yqhD. El plásmido pSOS95 pthlsadh-yqhD se digirió con SalI y el fragmento que contenía el operón se purificó en gel de agarosa antes de la ligación con el plásmido pSC101_pGI-cac2229-cac0764-cac0303-pntAB predigerido con SalI (5.2.), proporcionando el plásmido pSC101-pGI-cac2229-cac0764-cac0303-pntAB_ythl-sadh-yqhD.

6.4. Introducción del vector de expresión pSC101- pGI-cac2229-cac0764-cac0303-pntAB_pthl gldA-yqhD en la cepa de E coli MG1655 AldhA::FRTApflAB::FRTAiscR::FRAfrdABCD::FRTAaceE::FRTAtpiA::FRTAadhE::FRT AaldA::FRTAaldB::FRTAgloA::FRTAgloB::FRTAhchA::FRT:

El vector de expresión pSC101-pGI-cac2229-cac0764-cac0303-pntAB_pthl gldA-yqhD se utilizó para transformar la cepa de E coli MG1655AldhA::FRTApfIAB::FRTAiscR::FRAfrdABCD::FRTAaceE::FRTAtpiA::FRTAadhE::FRT AaldA::FRTAaldB::FRTAgloA::FRTAgloB::FRTAhchA::FRT mediante electroporación (Sambrook y Russel, 2001).

Los transformantes se seleccionaron en placas de agar LB complementadas con espectinomicina (70 pg/ml) a 37°C. A continuación, se cultivaron algunos transformantes en cultivo líquido de LB complementado con espectinomicina (100 pg/ml) durante la noche a 37°C para llevar a cabo la extracción del plásmido de ADN (kit miniprep de plásmido GenElute HP, Sigma) y comprobar la presencia del plásmido. El plásmido pSC101-pGI-cac2229-cac0764-cac0303-pthlgldA-yqhD finalmente se controló mediante el perfil de restricción.

La cepa final de E. coli MG1655 AldhA::FRTApflAB::FRTAiscR::FRAfrdABCD::FRTAaceE: :FRTAtpiA::FRTAadhE::FRT AaldA::FRTAaldB::FRTAgloA::FRTAgloB::FRTAhchA::FRT pSC101-pGI- cac2229-cac0764-cac0303-pthlgldA-yqhD se cultivó en medio líquido LB complementado con espectinomicina (100 pg/ml) y se mantuvo en solución de glicerol al 20% a -80°C.

6.5. Introducción del vector de expresión pSC101- pGI-cac2229-cac0764-cac0303-pntAB_pthl sadhbej-yqhD en la cepa de E coli MG1655 AldhA::FRTApflAB::FRTAiscR::FRAfrdABCD::FRTAaceE::FRTAtpiA::FRTAadhE::FRT AaldA::FRTAaldB::FRTAgloA::FRTAgloB::FRTAhchA::FRT:.

El vector de expresión pSC101- pGI-cac2229-cac0764-cac0303-pntAB_pthl sadhbej-yqhD se utilizó para transformar la cepa de E. coli MG1655 AldhA::FRTApflAB::FRTAiscR::FRAfrdABCD::FRTAaceE::FRTAtpiA::FRTAadhE::FRT AaldA::FRTAaldB::FRTAgloA::FRTAgloB::FRTAhchA::FRT mediante electroporación (Sambrook y Russel, 2001).

Los transformantes se seleccionaron en placas de agar LB complementadas con espectinomicina (70 pg/ml) a 37°C. A continuación, se cultivaron algunos transformantes en cultivo líquido de LB complementado con espectinomicina (100 pg/ml) durante la noche a 37°C para llevar a cabo la extracción del plásmido de ADN (kit miniprep de plásmido GenElute HP, Sigma) y comprobar la presencia del plásmido. El plásmido pSC101-pGI-cac2229-cac0764-cac0303-pntAB pthl-sadhbej-yqhD finalmente se controló mediante el perfil de restricción.

La cepa final de E. coli MG1655AldhA: :FRTApflAB::FRTAiscR::FRAfrdABCD::FRTAaceE: :FRTAtpiA::FRTAadhE::FRT AaldA::FRTAaldB::FRTAgloA::FRTAgloB::FRTAhchA::FRT pSC101-pGI-cac2229-cac0764-cac0303-pntAB_pthl-sadhbej-yqhD se cultivó en medio líquido LB complementado con espectinomicina (100 pg/ml) y se mantuvo en solución de glicerol al 20% a -80°C.

6.6 Caracterización fisiológica de las cepas modificadas de E. coli MG1655AldhA::FRTApflAB::FRTAiscR::FRAfrdABCD::FRTAaceE::FRTAtpiA::FRTAadhE::

FRTAaldA::FRTAaldB::FRTAgloA::FRTAgloB::FRTAhchA::FRT pSC101-pGI-cac2229-cac0764-cac0303-pntAB_pthl-sadhbej-yqhD y MG1655AldhA::FRTApflAB::FRTAiscR::FRAfrdABCD::FRTAaceE::FRTAtpiA::FRTAadhE::

FRTAaldA::FRTAaldB::FRTAgloA::FRTAgloB::FRTAhchA::FRT pSC101-pGI- cac2229-cac0764-cac0303-pthlgldA-yqhD.

Ambas cepas de E. coli MG1655AldhA::FRTApflAB::FRTAiscR::FRAfrdABCD::FRTAaceE: :FRTAtpiA::FRTAadhE::FRT AaldA::FRTAaldB::FRTAgloA::FRTAgloB::FRTAhchA::FRT (pSC101-pGI-cac2229- cac0764-cac0303-pntAB_pnt-sadhbeij-yqhD) y MG1655AlA::FRTApflAB::FRTAiscR::FRAfrdABCD::FRTAaceE::FRTAtpiA::FRTAadhE::FRT AaldA::FRTAaldB::FRTAgloA::FRTAgloB::FRTAhchA::FRT (pSC101-pGI- cac2229-cac0764-cac0303_pthlgldA-yqhD) se cultivaron anaerobiamente en un medio mineral con 20 g/l de glucosa que contenía sales minerales tal como se ha indicado anteriormente (Meynial-salles et al., 2005) complementado con 4 g/l de extracto de levadura, nitrato sódico 5 mM y espectinomicina (100 jg/ml), y se inoculó con 100 j l de un cultivo de durante la noche en LB. Las células se cultivaron a 37°C durante varios días y se mantuvo el pH mediante tamponado del medio de cultivo con MOPS. Como control, la cepa de E. coli MG1655AldhA::FRTApflAB::FRTAiscR::FRAfrdABCD::FRTAaceE::FRTAtpiA::FRTAadhE::FRT AaldA::FRTAaldB::FRTAgloA::FRTAgloB::FRTAhchA::FRT se cultivó bajo las mismas condiciones.

El análisis fenotípico comparativo se llevó a cabo mediante medición de tanto el consumo de glucosa como la concentración de productos de fermentación para el cultivo de cada cepa, tal como se muestra en la tabla 6:

Tal como se muestra en la tabla 6, la expresión de los operones CA_C2229-CA_C0764-CA_C0303 y gldA-yqhD o de los operones CA C2229-CA C0764-CA C0303 y sadhbej-yqhD en la cepa de E. coli MG1655AldhA::FRTApflAB::FRTAiscR::FRAfrdABCD::FRTAaceE::FRTAtpiA::FRTAadhE::FRT AaldA::FRTAaldB::FRTAgloA::FRTAgloB::FRTAhchA::FRT condujo a la producción de 1.2-propanodiol y acetato como los productos de fermentación principales a partir de glucosa. Además, la expresión de operones, con independencia de la combinación, favoreció el crecimiento, que resultó fuertemente perjudicado en la cepa de control.

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Microorganismo que presenta actividad enzimática de ferredoxina NADP+ reductasa, en el que un polinucleótido que codifica un polipéptido que presenta una identidad de por lo menos 70% con la secuencia de SEC ID n° 1 y que presenta actividad de ferredoxina NADP+ reductasa se sobreexpresa,

en el que la sobreexpresión se consigue mediante la sustitución del promotor nativo del polinucleótido con un promotor que induce un nivel más fuerte de expresión del polinucleótido o mediante la introducción en el microorganismo de un vector de expresión que porta y expresa dicho polinucleótido o mediante la introducción de copias adicionales del polinucleótido en el cromosoma del microorganismo.

2. Microorganismo según la reivindicación 1, en el que contiene por lo menos una modificación para producir etanol y en el que la por lo menos una modificación para producir etanol comprende:

• la potenciación de la expresión de por lo menos uno de los genes siguientes: pfor, fdx y udhA,

• y/o

• la atenuación de la expresión de por lo menos uno de los genes siguientes: aceE, aceF, Ipd, pflA, pflB, frdABCD, IdhA, mgsA, ackA, pta, poxB e iscR.

3. Microorganismo según la reivindicación 1, en el que contiene por lo menos una modificación para producir nbutanol y en el que la por lo menos una modificación para producir n-butanol comprende:

• la potenciación de la expresión de por lo menos uno de los genes siguientes: pfor, fdx, atoB, hbd, crt, bcd, etfA, etfB, adhE2, udhA,

• y/o

• la atenuación de la expresión de por lo menos uno de los genes siguientes: aceE, aceF, lpd, pflA, pflB, frdABCD, adhE, ldhA, mgsA, ackA, pta, poxB e iscR.

4. Microorganismo según la reivindicación 1, en el que comprende por lo menos una modificación para producir 1,3-propanodiol y en el que la por lo menos una modificación para producir 1,3-propanodiol comprende:

• la potenciación de la expresión de por lo menos uno de los genes siguientes: pfor, fdx, pntAB, dhaB1, dhoB2, yqhD,

• y/o

• la atenuación de la expresión de por lo menos uno de los genes siguientes: aceE, aceF, lpd, aldA, aldB, ldhA, pflA, pflB, adhE, iscR, glpA, poxB y glpD.

5. Microorganismo según la reivindicación 1, en el que comprende por lo menos una modificación para producir 1,2-propanodiol y en el que la por lo menos una modificación para producir 1,2-propanodiol comprende:

• la atenuación de la expresión de por lo menos uno de los genes siguientes: ptsG, ptsH ptsl, crr, edd, eda, gloA, aceE, aceF, lpd, aldA, aldB, ldhA, pflA, pflB, adhE, tpiA, gapA, pykA, pykF, ackA, pta, poxB, arcA y ndh,

• y/o

• la potenciación de la expresión de por lo menos uno de los genes siguientes: pfor, fd, pntAB, gapN, galP, glk, ppsA, mgsA, yqhD, yafB, ydhF, ycdW, yqhE, yeaE, yghZ, yajO, tas, ydjG, ydbC, gldA, fucO.

6. Método para potenciar la actividad enzimática de ferredoxina NADP+ reductasa en un microorganismo, en el que un polinucleótido que codifica el polipéptido que presenta una identidad de por lo menos 70% con la secuencia SEC iD n° 1 y que presenta una actividad de ferredoxina NADP+ reductasa se sobreexpresa en dicho microorganismo.

7. Método para preparar etanol, en el que el microorganismo según la reivindicación 2 se cultiva en un medio de cultivo apropiado que comprende una fuente de carbono y se recupera el etanol.

8. Método para preparar n-butanol, en el que el microorganismo según la reivindicación 3 se cultiva en un medio de cultivo apropiado que comprende una fuente de carbono y se recupera el n-butanol.

9. Método para preparar 1,3-propanodiol, en el que el microorganismo según la reivindicación 4 se cultiva en un medio de cultivo apropiado que comprende una fuente de carbono y se recupera el 1,3-propanodiol.

10. Método para preparar 1,2-propanodiol, en el que el microorganismo según la reivindicación 5 se cultiva en un medio de cultivo apropiado que comprende una fuente de carbono y se recupera el 1,2-propanodiol.

11. Utilización de un microorganismo según la reivindicación 2 para producir etanol.

12. Utilización de un microorganismo según la reivindicación 3 para producir n-butanol.

13. Utilización de un microorganismo según la reivindicación 4 para producir 1,3-propanodiol.

14. Utilización de un microorganismo según la reivindicación 5 para producir 1,2-propanodiol.