ES2731782T3 - Procedimiento de producción de al menos un metabolito de interés mediante la transformación de una pentosa en un microorganismo - Google Patents
Procedimiento de producción de al menos un metabolito de interés mediante la transformación de una pentosa en un microorganismo Download PDFInfo
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Abstract
Un procedimiento para la producción de al menos un metabolito de interés mediante la transformación de una pentosa en un microorganismo, caracterizado porque dicho procedimiento comprende al menos: (i) una operación de cultivo un microorganismo recombinante que expresa una vía sintética de asimilación de pentosas catalizada por un conjunto de enzimas: - una enzima recombinante que consiste en una quinasa adecuada para fosforilar en posición 1 una pentosa escogida entre (D)-xilulosa y/o (L)-ribulosa, - una enzima que consiste en una aldolasa adecuada de escindir la(s) pentosas-1-fosfonato para la obtención de glicolaldehído y dihidroxiacetona fosfato (DHAP), y en que la vía sintética de asimilación de pentosas comprende al menos las etapas siguientes: a) fosforilación en posición 1 de una pentosa escogida de (D)-xilulosa y/o (L)-ribulosa, caracterizada por dicha quinasa, b) escisión de pentosa-1-fosfato obtenido al final de la etapa a), para la obtención de glicolaldehído y dihidroxiacetona fosfato (DHAP), catalizada por dicha aldolasa, (ii) una operación de recuperación de dicho al menos un metabolito de interés obtenido al final de la operación de cultivo (i).
Description
DESCRIPCIÓN
Procedimiento de producción de al menos un metabolito de interés mediante la transformación de una pentosa en un microorganismo
Campo de la invención
La presente invención se refiere a un procedimiento de producción de al menos un metabolito de interés mediante transformación de una pentosa en un microorganismo. Más particularmente, proporciona un procedimiento para la biosíntesis de etilenglicol y/o ácido glicólico en un microorganismo que expresa una vía metabólica artificial/sintética de asimilación de pentosas procedentes, ventajosamente, de una fuente de carbono renovable.
Estado de la técnica
El etilenglicol (EG) y el ácido glicólico (AG) son compuestos utilizados en un amplio espectro de aplicaciones industriales en la industria petroquímica, como precursores de polímeros basados en EG, como el poli(tereftalato de etileno) (PET) o basados en AG como ciertas resinas termoplásticas, pero también como refrigerante en anticongelantes para automóviles para EG o para AG, en la industria textil, en las industrias de aceites y gases así como en un gran número de productos de belleza. Estos compuestos son todavía ampliamente producidos de forma petroquímica. No obstante, la ingeniería metabólica representa un sector de gran desarrollo desde hace más de 15 años. Este procedimiento comprende la concepción de vías de biosíntesis artificiales y/o la optimización de vías naturales en un organismo hospedante e implica la transferencia, la expresión y el acoplamiento funcional de múltiples etapas enzimáticas en el seno de dicho organismo, para permitir la producción de moléculas de interés. La concepción de vías de biosíntesis totalmente artificiales en el microorganismo hospedante permite, más particularmente, constituir un conjunto metabólico autónomo de producción de moléculas de interés. Estos métodos de producción presentan la ventaja de utilizar, como sustrato, una fuente carbonada renovable y representan en lo sucesivo una alternativa real a las fuentes de energía fósiles. A este respecto, han sido descritas diferentes vías metabólicas para la bioproducción de EG. Implican, en particular, intermedios de glicólisis. La empresa Genomatica particularmente ha descrito en sus solicitudes de patentes WO2011130378 y WO2012177983, vías metabólicas, principalmente anaeróbicas de síntesis de EG a partir de serina, 3-fosfohidroxipiruvato, 3-fosfoglicerato o glioxilato. Han sido descritas también técnicas para la bioproducción de AG. Así, la empresa Mitsui Chemicals Inc. ha descrito un método que utiliza un microorganismo para producir ácidos hidrocarboxílicos a partir de un alcohol polihidroxilado alifático que tiene un grupo hidroxilo en su extremo (documentos EP 2.025.759 y EP 2.025.760). Se trata de un método de bioconversión, como seo describe por Michihiko Kataoka en un artículo sobre la producción de AG utilizando microorganismos que oxidan etileno (Biosci Biotechnol Biochem, 2001). El AG puede ser producido también mediante bioconversión a partir de gliconitrilo, utilizando nitrilasas mutantes que tienen una actividad nitrilasa aumentada, como se describe por Dupont de Nemours en las solicitudes WO 2006/069110 y US 7.445.917. La biomasa lignocelulósica constituye una fuente de carbono duradera y una alternativa posible a las fuentes de carbono fósiles. Genera un interés creciente por la biosíntesis de metabolitos de interés industrial. Entre estos materiales carbonosos, la D-xilosa representa la segunda fuente más abundante después de la glucosa. No obstante, los microorganismos que no utilizan preferentemente pentosas y, cuando lo hacen, los rendimientos son extremadamente bajos. Por tanto, el desarrollo de vías metabólicas que asimilen este azúcar constituye un eje importante de investigación para la industria.
En la actualidad, las principales fuentes de utilización de pentosas para la producción de EG o AG mediante microorganismos, se basan en la utilización de vías naturales, optimizadas para la producción de moléculas de interés y/o en la adición de enzimas para utilizar los productos de estas vías naturales.
Por tanto, un método de producción AG orgánico optimizando las vías de asimilación de pentosas se describe en las solicitudes WO 2007140816 y WO 2007141336 presentadas por la entidad Metabolic Explorer. Estas solicitudes describen organismos genéticamente modificados a diferentes niveles para aumentar el flujo de la vía glioxilato, aumentar la conversión de glioxilato en glicolato y/o reducir el metabolismo de glicolato y de su intermedio, glioxilato. Una solicitud posterior de la entidad Metabolic Explorer (documento WO 2010108909) describe la posibilidad de tratar, además, para optimizar la producción de AG, mediante vías de producción de lactato (atenuando los genes que codifican metilglioxal-sintasa y D-lactato-deshidrogenasa), sobre la transición del metabolismo aeróbico/anaeróbico y atenuando el gen ArcA que regula el control de la vía respiratoria aeróbica y/o al atenuando
los genes que codifican proteínas importantes de glicolato.
Más recientemente, se han elaborado vías metabólicas de síntesis de EG basadas en vías metabólicas sintéticas de asimilación de pentosas. Así, Liu H et al. (Appl Microbiol Biotechnol, 2012, PMID: 23233208) describieron cepas de E. coli que expresan una vía metabólica de síntesis de etilenglicol a partir de D-xilosa y que implican enzimas (D)-xilosa deshidrogenasa, (D)-xilónico deshidratasa, 2-deshidro-3-desoxi-D-pentonato aldolasa y glicolaldehído reductasa. No obstante, los rendimientos de EG obtenidos mediante este método, de aproximadamente 275 mg por gramo de xilosa, pueden ser mejorados.
La institución Massachusetts Institute of Technology (MIT) ha descrito también en la solicitud WO 2013126721 una vía metabólica artificial de producción de EG a partir de pentosa. Esta vía implica la fosforilación en la posición 1 del ciclo de (D)-ribulosa o (L)-xilulosa. Esta vía no obstante necesita, para la asimilación de pentosas más abundantes como la (D)-xilosa y (L)-arabinosa, la expresión de varias isomerasas y epimerasas que permitan la conversión de D-xilosa en (D)-xilulosa y seguidamente en (D)-ribulosa y la conversión de (L)-arabinosa en (L)-ribulosa y seguidamente en (L)-xilulosa.
Por tanto, existe una necesidad en el estado de la técnica de nuevos procedimientos que efectúen la producción de metabolitos de interés mediante transformación de pentosas, particularmente de EG y/o de AG, ventajosamente a partir de fuentes carbonadas renovables y, más particularmente, basadas en la asimilación directa de pentosas más abundantes en estas fuentes naturales como (D)-xilosa y (L)-arabinosa.
Sumario de la invención
La invención descrita en la presente solicitud responde a los objetivos técnicos anteriormente mencionados. Se refiere a un procedimiento de transformación de al menos una pentosa en un microorganismo para la producción de al menos un metabolito de interés, mediante asimilación de dicha al menos una pentosa en un microorganismo. Más particularmente, suministra un procedimiento de biosíntesis simple y económico para producir de forma autónoma, en un microorganismo, un metabolito de interés y, particularmente etilenglicol y/o ácido glicólico, a partir de una fuente carbonada renovable como, por ejemplo, lignocelulosa y, en particular, hemicelulosa.
La utilización de este sustrato carbonado renovable suministra una alternativa duradera a la producción de metabolitos de interés (como etilenglicol y ácido glicólico), que son compuestos de alto valor añadido para la industria petroquímica y que en la actualidad continúan siendo producidos ampliamente por vía petroquímica.
La nueva vía de asimilación de pentosas descrita en la invención constituye una vía que es paralela a las vías naturales de asimilación de pentosas y que no existe en estado natural. Por tanto, es ampliamente independiente de las restricciones de regulación que rigen sobre las vías naturales de las células hospedantes. Por tanto, permite evitar vías naturales y sus regulaciones para producir metabolitos de interés, como etilenglicol y/o ácido glicólico. Esta propiedad permite su portabilidad de forma simplificada a un amplio espectro de microorganismos hospedantes, ya que su metabolismo endógeno no interfiere con la vía sintética de la invención.
Además, los cálculos sobre los rendimientos teóricos de la vía sintética de asimilación de pentosas se descrita en la presente solicitud, para la producción de etilenglicol y ácido glicólico, permiten estimar una mejora considerable de los rendimientos con respecto a los procedimientos de biosíntesis basados en la optimización de vías naturales y/o una simplificación de la realización y de la producción.
El procedimiento de la invención se caracteriza por tanto porque comprende las etapas siguientes:
1. (i) una operación de cultivo de un microorganismo recombinante que expresa una vía sintética de asimilación de pentosas que comprende al menos una de las etapas de reacción siguientes:
1. a) fosforilación en la posición 1 de una pentosa escogida de (D)-xilulosa y/o (L)-ribulosa
2. b) escisión del pentosa-1-fosfato obtenido al final de la etapa a), para la obtención de glicolaldehído y de dihidroxiacetonafosfato (DHAP), y
2. (ii) una operación de recuperación de al menos un metabolito de interés obtenido al final de la operación de cultivo (i).
Preferentemente, la etapa a) de la vía sintética de asimilación de pentosas puede ser catalizada por una enzima expresada de forma recombinante escogida entre el grupo constituido por cetohexo quinasa C (KHK-C), la ramnulosa quinasa (Rhab) y fuculosa quinasa (fucK).
De forma también preferente, la etapa b) es catalizada mediante una aldolasa, preferentemente de clase I. Una aldolasa de clase I según la invención se escoge normalmente entre el grupo constituido por aldolasa B (Aldo-B) y la fructosa-1,6-bis-fosfato-aldolasa (fructosa 1,6 bPaldolasa o FbaB).
Según un modo de realización, el procedimiento de producción se caracteriza porque:
• la etapa a) es catalizada por KhkC, y
• la etapa b) es catalizada por aldolasa B (aldo-B) y/o la fructosa-1,6-bP aldolasa (FbaB)
Un modo particular de realización del procedimiento de la invención permite obtener etilenglicol (EG) y/o ácido glicólico (AG).
En este procedimiento, la vía sintética de asimilación de pentosas comprende además las etapas siguientes: c) reducción del glicolaldehído obtenido al final de la etapa b) en etilenglicol, y/o
c') oxidación del glicolaldehído obtenido al final de la etapa b) a ácido glicólico.
Los modos de realización descritos a continuación pueden ser combinados entre ellos salvo indicación en contra, en el procedimiento de la invención.
La etapa c) puede ser catalizada por un glicolaldehído reductasa, particularmente escogida entre el grupo constituido por: aldehído reductasa (YqhD), glicerol deshidrogenasa (GldA) y propano-1,2-dioloxidoreductasa (FucO).
La etapa c') puede ser catalizada por una glicolaldehído deshidrogenasa, particularmente lactaldehído deshidrogenasa (AldA).
En un procedimiento de la invención, el microorganismo preferentemente se pone en cultivo sobre un medio carbonado que contiene (D)-xilosa y/o (L)-arabinosa.
En un modo de realización preferido del procedimiento de la invención, el medio de cultivo comprende un hidrolizado de biomasa que comprende hemicelulosa. Normalmente, la vía sintética de asimilación de pentosas del procedimiento según la invención comprende, previamente a la etapa a), al menos una de las etapas siguientes: • una etapa de transporte de (D)-xilosa y/o (L)-arabinosa en el microorganismo;
• una etapa de conversión de (D)-xilosa en (D)-xilulosa, y/o
• una etapa de conversión de (L)-arabinosa en (L)-ribulosa.
La conversión de (D)-xilosa en (D)-xilulosa puede ser catalizada por una (D)-xilosa isomerasa y/o por la acción de una (D)-xilosa reductasa y una xilitol deshidrogenasa.
La conversión de (L)-arabinosa en (L)-ribulosa puede ser catalizada por una (L)-arabinosa isomerasa y/o por la acción de una (L)-arabinosa reductasa y una arabitol deshidrogenasa.
Según el procedimiento de producción según la invención, el microorganismo recombinante puede ser una bacteria,
preferentemente seleccionada entre el grupo constituido por en Enterobacteriaceae, Clostridiaceae, Bacillaceae, Streptomycetaceae, Streptococcaceae, Methylobacteriacae y Corynebacteriaceae preferentemente Escherichia coli, Bacillus subtilis, Corynebacterium glutamicum, Clostridium acetobutylicum, Methylobacterium extorquens o Lactococcus lactis. El microorganismo puede ser también una levadura, preferentemente escogida entre Saccharomycetaceae, Pichiaceae y Schizosaccharomycetaceae, preferentemente Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus, Pichia jadinii, Scheffersomyces stipitis o Pichia pastoris. El microorganismo de la invención puede ser también un hongo, preferentemente escogido entre el grupo cosntituido por Penicillium, Aspergillus, Chrysosporium o Trichoderma.
Preferentemente, las actividades de (D)-xilulosa-5-quinasa y/o (L)-ribulosa-5-quinasa del microorganismo utilizado en el procedimiento de la invención han sido suprimidas.
La invención se refiere también a un microorganismo recombinante que expresa una vía sintética de asimilación de pentosas que comprende al menos ácidos nucleicos que codifican las enzimas siguientes:
1. i) una enzima adecuada para fosforilar en posición 1 las pentosas escogidas entre (D)-xilulosa y/o (L)-ribulosa. 2. ii) una enzima adecuada para escindir dicha pentosa fosforilada en posición 1 en glicolaldehído y DHAP.
Ventajosamente, las vías naturales de asimilación de pentosas de este microorganismo han sido suprimidas.
Generalmente, un microorganismo que expresa la vía sintética de asimilación de la invención se caracteriza además porque las actividades de (D)-xilulosa-5-quinasa y/o (L)-ribulosa-5-quinasa han sido suprimidas y/o porque porta al menos uno de las modificaciones siguientes:
• sobreexpresión de un gen que codifica una glioxilato reductasa;
• sobreexpresión de un gen que codifica una isocitrato liasa;
• deleción de los genes que codifican malato sintasa;
• deleción de los genes que codifican glioxilato carboligasas;
• deleción de los genes que codifican los genes que codifican glicolato oxidasas y/o glicolatos deshidrogenasas • deleción de los genes que codifican 2-ceto-4-hidroxiglutarato aldolasas, particularmente la Entner-Doudouroff aldolasa y/o fosfogluconato deshidratasa;
• deleción de un gen represor de la respuesta aeróbica, particularmente el gen arcA;
• atenuación y, particularmente, deleción de la expresión de isocitrato deshidrogenasa;
• deleción de los genes codificadores para sistemas de internalización de ácido glicólico;
• atenuación de las vías metabólicas que conducen a la producción de productos secundarios como acetato, lactato o etanol;
• sobreexpresión de al menos un gen que codifica un transportador de azúcares.
Preferentemente, el microorganismo recombinante comprende:
• al menos un ácido nucleico exógeno que codifica cetohexoquinasa C y
• al menos un ácido nucleico exógeno que codifica aldolasa B.
Ventajosamente, dicho microorganismo puede comprender las modificaciones siguientes:
• sobreexpresión del gen que codifica glicolaldehído reductasa principal;
• deleción del gen que codifica glicolaldehído deshidrogenasa.
En una variante, el microorganismo puede comprender al menos una de las modificaciones siguientes para optimizar la producción de ácido glicólico:
• sobreexpresión del gen que codifica glicolaldehído deshidrogenasa;
• deleción de al menos uno de los genes que codifican al menos una de las subunidades de glicolato oxidasa.
Normalmente, un microorganismo adecuado para optimizar la producción de ácido glicólico comprende las siguientes modificaciones:
• sobreexpresión de un gen que codifica glioxilato reductasa;
• sobreexpresión de un gen que codifica una isocitrato liasa, acompañado o no de la deleción de su represor transcripcional;
• deleción de los genes que codifican malato sintasas;
• deleción de los genes que codifican glioxilato carboligasas
• deleción de los genes que codifican glicolato oxidasas y/o glicolato deshidrogenasas;
• deleción de los genes que codifican 2-ceto-4-hidroxiglutaratoaldolasas, particularmente Entner-Doudouroff aldolasa y/o fosfogluconato deshidratasa;
• deleción de un gen que codifica un represor de genes implicados en el metabolismo respiratorio, particularmente el gen arcA;
• atenuación y, particularmente, deleción de la expresión de isocitrato deshidrogenasa;
• ocasionalmente la sobreexpresión de un gen que codifica un transportador de azúcares.
Todavía, preferentemente, particularmente en el caso de que el microorganismo recombinante para la producción de ácido glicólico sea Escherichia coli, el microorganismo comprende las modificaciones siguientes:
• la sobreexpresión del gen aldA que codifica una glicolaldehído deshidrogenasa;
• la sobreexpresión del gen ghrA;
• la sobreexpresión del gen aceA ocasionalmente acompañada de la deleción del gen icIR que codifica un represor transcripcional de la vía del glioxilato;
• la deleción de los genes aceB y glcB;
• la deleción de al menos uno de los genes glcDEFG;
• la deleción del gen glc;
• la deleción de los genes edd-eda;
• la deleción del gen arcA;
• la deleción del gen icd;
• la sobreexpresión del gen galP
Figuras
Figura 1. Vías naturales y vías sintéticas de asimilación de (D)-xilosa y (L)-arabinosa. Las reacciones catalizadas por las enzimas naturales están representadas en líneas discontinuas. Las reacciones catalizadas por enzimas sintéticas están representadas en trazos continuos. (1) (D)-xilosa isomerasa, (2) (D)-xilulosa-1-quinasa, (3) (D)-xilulosa-1-fosfato aldolasa, (4) glicolaldehído deshidrogenasa, (5) glicolaldehído reductasa, (6) (L)-arabinosa isomerasa, (7) (L)-ribulosa-1-quinasa, (8) (L)-ribulosa-1-fosfato aldolasa. El nombre de los genes bajo las reacciones corresponde a los genes de Escherichia coli que codifican la enzima con la actividad correspondiente.
Figura 2. Síntesis in vitro de etilenglicol mediante la vía sintética de asimilación de (D)-xilosa. Cromatogramas HPLC de (A) una solución 10 mM de etilenglicol y (B) una mezcla de reacción compuesta por (D)-xilulosa-1-quinasa (Khk-C, 0,005 Unidades/ml), (D)-xilulosa-1-fosfato aldolasa (AldoB, 1 Unidad/ml (Sigma-Aldrich A6338)) y una glicolaldehído reductasa (GldA, 1 Unidad/ml (Sigma-A G3512-250U)) o (r) una (D)-xilulosa-1-quinasa (Khk-C, 0,005 Unidad/ml) y una glicolaldehído reductasa (GldA, 1 Unidad/ml (Sigma-Aldrich G3512-250U)). Las enzimas fueron incubadas durante 3 horas a 37 °C en un tampón de reacción Hepes que contenía Hepes 100 mM; KCl 85 mM; MgCl27,5 mM a pH = 7; ATP 2 mM; ZnCl25 mM; NADH 0,4 mM. Las reacciones fueron iniciadas mediante la adición de (D)-xilulosa 5 mM.
Leyenda: Intensidad (eje de ordenadas) en función del tiempo en minutos (eje de abscisas)
Figura 3. Síntesis in vitro de etilenglicol por vía sintética de asimilación de (L)-arabinosa. Cromatogramas HPLC de (A) una solución de etilenglicol 1 mM y (B) una mezcla de reacción compuesta por una (L)-ribulosa-1-quinasa, (L)-ribulosa-1-fosfato aldolasa y una glicolaldehído reductasa. Las enzimas fueron incubadas durante 3 horas a 37 °C en un tampón de reacción Hepes que contenía Hepes 55 mM; KCl 45 mM; MgCl24 mM a pH = 7; ATP 4 mM; NADH 0,4 mM. Las reacciones fueron iniciadas mediante la adición de (L)-ribulosa 20 mM. Leyenda: Intensidad (eje de ordenadas) en función del tiempo en minutos (eje de abscisas).
Figura 4. Crecimiento de cepas de E. coli en medio mínimo que contenía (D)-xilosa Leyenda: DO a 600 nm (eje de ordenadas) en función del tiempo en minutos (eje de abscisas)
Figura 5. Seguimiento del crecimiento y producción de metabolitos sobre xilosa de una cepa de E. coli MG1655 AxylB pEXT20 khk-C-aldoB.
Leyenda: DO a 600 nm (eje de ordenadas a la izquierda) y xilosa en mM, etilenglicol en mM y ácido glicólico en mM (eje de ordenadas a la derecha) en función del tiempo en horas (eje de abscisas)
Figura 6. Producción de etilenglicol (en mM sobre el eje de ordenadas) por mutantes de glicolaldehído reductasa candidatos después de la incubación durante 12 h en presencia de glicolaldehído 10 mM.
Figura 7. Optimización de la producción de etilenglicol en diferentes mutantes según la invención expresada en rendimiento en mol/mol de xilosa (en eje de ordenadas) a través de la vía metabólica sintética de asimilación de (D)-xilosa.
Figura 8. Optimización de la producción de ácido glicólico en diferentes mutantes según la invención expresada en rendimiento en mol/mol de xilosa (en eje de ordenadas) a través de la vía metabólica sintética de asimilación de (D)-xilosa.
Figura 9. Crecimiento de la cepa 905 en medio mineral en presencia de glucosa y (D)-xilosa. Leyenda: DO a 600 nm (eje de ordenadas a la izquierda) y glucosa, xilosa, ácido glicólico y acetato en mM y mM (eje de ordenadas a la derecha) en función del tiempo en horas (eje de abscisas).
Figura 10. Crecimiento de la cepa 979 en medio mineral en presencia de glucosa y (D)-xilosa. Leyenda: DO a 600 nm (eje de ordenadas de la izquierda) y glucosa, xilosa, ácido glicólico y acetato en mM y mM (eje de ordenadas a la derecha) en función del tiempo en horas (eje de abscisas).
Figura 11. Crecimiento en medio mineral en presencia de xilosa como única fuente de carbono de cepas CEN.PK-2-1. Leyenda: DO a 600 nm (eje de ordenadas a la derecha) y xilosa en mM (eje de ordenadas a la izquierda) en función del tiempo en horas (eje de abscisas).
Figura 12. Crecimiento en medio mineral y xilosa como única fuente de carbono de cepas TMB3001. Leyenda: DO a 600 nm en función del tiempo en horas.
Figura 13. Crecimiento en medio mineral M9 y (L)-arabinosa de cepas AaraB con o sin vía sintética. Leyenda: DO a 600 nm en función del tiempo en horas.
Definiciones
Salvo indicación particular, los términos técnicos y científicos empleados en la presente solicitud tienen el significado habitual, entendido por un experto en la técnica adecuado para realizar la invención.
Salvo que se indique igualmente en contra, los diferentes modos de realización descritos a continuación pueden ser combinados entre ellos en la realización de la invención.
Mediante “vía de asimilación de pentosas” se entiende, según la invención, una vía metabólica, es decir, un conjunto de reacciones químicas que se desarrollan en el microorganismo, catalizadas por una serie de enzimas que intervienen de forma secuencial, que utilizan las pentosas como sustrato inicial y que dan lugar a su transformación para la formación de metabolitos de interés.
Mediante vía natural de asimilación de pentosas se entiende la asimilación de pentosas que implica su fosforilación en la posición 5, seguido de su utilización en la vía metabólica denominada pentosas fosfatos, que existe de forma natural en la mayoría de las células eucariotas y procariotas. Normalmente, la (L)-arabinosa es isomerizada en (L)-ribulosa, que seguidamente es fosforilada en la posición 5. El (L)-ribulosa-5-fosfato obtenido es epimerizado en el carbono C3 para producir (D)-xilulosa-5-fosfato, sustrato de la vía de pentosas fosfatos.
La expresión “ruta sintética” o “vía metabólica sintética” significa, según la invención, que dicha vía metabólica no se realiza de forma natural por el microorganismo. Esta condición es normalmente respetada cuando al menos una de las enzimas de dicho microorganismo que cataliza al menos una de las etapas a) o b) de la vía metabólica de la invención no es expresada de forma natural o cuando dicha al menos una enzima, cuando es expresada, no cataliza dicha al menos una etapa a) o b).
Como ejemplos, (i) la vía metabólica que implica la fosforilación en posición 1 de una pentosa escogida entre (D)-xilulosa y (L)-ribulosa, por la Khk-C de origen humano en una célula no humana y normalmente en un microorganismo, (ii) la vía metabólica que implica la fosforilación en posición 1 de una pentosa escogida entre (D)-xilulosa y (L)-ribulosa, por ramnulosa quinasa RhaB en un microorganismo y (iii) la vía metabólica que implica la fosforilación en la posición 1 de una pentosa escogida entre (D)-xilulosa y (L)-ribulosa, mediante fuculosa quinasa FucK en un microorganismo, son vías sintéticas según la invención.
La expresión de las enzimas RhaB y FucK en el seno de E. coli depende de la presencia de su sustrato natural, a saber, respectivamente (L)-ramnulosa y (L)-fucosa. En ausencia de su sustrato natural (o cuando este está presente en una concentración demasiado baja), la expresión de estas enzimas en un microorganismo y particularmente en el seno de E. coli puede ser obtenida de forma recombinante bajo el control de un promotor de forma inducible o constitutiva.
El término “transformación” o “transfección” se refiere a la adquisición de nuevos genes funcionales en una célula, después de la incorporación de ácidos nucleicos exógenos.
El término “modificación” o ""modificar” relacionado con el nivel de proteína o de actividad enzimática producida por
una célula hospedante se refiere al control de los niveles de proteína o de actividad enzimática producida durante el cultivo, de forma que estos niveles sean aumentados o disminuidos como se desee.
El término “modificado”, referido a un ácido nucleico o un polinucleótido, significa que el ácido nucleico se ha modificado con respecto a la versión salvaje contenida en la célula hospedante, particularmente mediante una mutación de tipo sustitución, inserción, deleción de una parte o la totalidad de dicho ácido nucleico o que dicho ácido nucleico ha sido unido de forma funcional a una zona de control de la transcripción.
Mediante “gen” se entiende, según la invención, un segmento de ADN implicado en la codificación de ARN ribosómicos, ARN reguladores, ARN de transferencia, secuencias reguladoras (que comprenden normalmente una región promotora) unidos de una manera funcional a la expresión de un péptido o un polipéptido o de una proteína, que incluyen regiones codificadoras (transcritas en ARN mensajero) y no codificadoras que preceden o que terminan la región codificadora, así como los intrones (regiones no codificadoras que separan las regiones codificadoras o exones).
La expresión “unido de forma funcional” se refiere a una yuxtaposición de elementos de forma que su disposición les permite estar funcionalmente unidos. Una secuencia reguladora, que contiene normalmente una región promotora, está funcionalmente unida a una región codificadora cuando controla la transcripción de la región codificadora, y un sitio de unión de un ribosoma está funcionalmente unido a una región codificadora cuando está colocado de forma que permita la traslación del ARNm.
El término “inactivación” o “supresión” o “atenuación” se refiere a la expresión disminuida o reducida o significativamente reducida de un gen o la actividad disminuida o reducida de una proteína o del producto de un gen, normalmente una enzima. Diferentes métodos conocidos por el experto en la técnica pueden ser empleados con este fin, como:
• la introducción de una mutación en el gen que da lugar a una expresión de una proteína cuya actividad es reducida,
• la sustitución del promotor natural por un promotor poco activo que da lugar a una baja expresión del gen,
• la utilización del elemento desestabilizante de ARNm correspondiente a la proteína, o
• la deleción del gen.
Normalmente, la atenuación de un gen o de una proteína se define mediante una actividad de la proteína expresada por dicho gen disminuida en al menos 50%, preferentemente en al menos 60%.
La inactivación o la deleción o la supresión de un gen o de una proteína se define mediante una actividad residual de la proteína producto de dicho gen inferior a 20%, particularmente inferior a 10%, particularmente inferior a 5%. El término “expresión” corresponde a la transcripción y a la traslación de un gen hacia una proteína, producto de dicho gen.
El término “sobreexpresión” corresponde a una expresión aumentada con respecto a la expresión natural de dicho gen en la misma célula hospedante. Normalmente, la sobreexpresión de una proteína se define mediante una actividad de al menos 200% de dicha proteína con respecto a su expresión natural en la célula hospedante.
La sobreexpresión de una proteína puede ser obtenida según diferentes técnicas conocidas por un experto en la técnica, como:
• la mutación de una proteína, con el fin de obtener una forma más activa o resistente a la inhibición,
• el aumento de la expresión del gen codificador para dicha proteína (por ejemplo, mediante la introducción de un promotor específico que regula la expresión del gen),
• la adición de múltiples copias de genes en la célula hospedante, etc.
Las células hospedadoras compatibles con la invención pueden expresar una copia endógena de uno o varios genes que codifican una proteína de interés según la invención, así como ocasionalmente una copia recombinante de dicho gen.
Un ácido nucleico que codifica una enzima asociada a la presente invención puede ser introducido en una célula hospedante según cualquier técnica estándar conocida por un experto en la técnica. Como ejemplo, los ácidos nucleicos pueden ser introducidos mediante transformación (química o electroporación), transfección, infección, transducción, etc.
Los genes que codifican proteínas asociadas a la invención pueden ser expresados de forma extracromosómica en un vector de expresión recombinante o pueden ser integrados en cromosomas.
Mediante “vector”, según la invención, se entiende un ácido nucleico en el que es insertada una secuencia de interés, mediante restricción y ligadura de forma que esté asociado de forma operativa a secuencias de regulación, para la expresión como transcrito de ARNm en una célula hospedante. Los vectores son compuestos por ARN o , preferentemente, ADN e incluyen de forma no limitativa plásmidos, fagémidos, genomas virales, bacteriófagos y cromosomas bacterianos.
Un vector según la invención puede comprender una o varias secuencias marcadoras para la identificación de células transformadas con dicho vector. Estos marcadores incluyen, por ejemplo, genes que codifican proteínas que aumentan o disminuyen la resistencia o la sensibilidad a compuestos antibióticos, genes que codifican enzimas cuya actividad es detectable mediante ensayos estándar (por ejemplo, luciferasa, galactosidasa, fosfatasa alcalina, etc.) o genes que modifican el fenotipo de las células transformadas (por ejemplo, que codifican GFP, es decir, “green fluorescent protein”).
Las secuencias reguladoras (promotoras) utilizadas en la expresión de proteínas recombinantes de la invención pueden ser secuencias reguladoras endógenas (es decir, el promotor nativo del gen al que está asociado) o exógenas. El promotor puede ser inducible o constituido.
Mediante “célula hospedante” o “microorganismo hospedante” se entiende cualquier tipo de célula susceptible de someterse a una transformación, transfección, transducción, etc., con una construcción de ácido nucleico o un vector de expresión que comprende uno o varios polinucleótidos, en particular uno o varios polinucleótidos que codifican enzimas descritas en la solicitud.
Las quinasas son enzimas del grupo de las transferasas que catalizan reacciones de fosforilación mediante la adición de un ión fosfato a una molécula diana.
Las oxidorreductasas son enzimas que catalizan reacciones de oxidorreducción y que transfieren H+ y electrones. Están asociadas a coenzimas de oxidorreducción (NAD, FAD, FMN, etc.)
La deshidrogenasa (o deshidrogenasa) es una enzima que oxida un sustrato mediante transferencia de uno o varios iones (H+) a un aceptor, generalmente una coenzima de tipo NAD+/NADP+ o flavina como FAD o FMN.
Una aldehído deshidrogenasa es una enzima de tipo deshidrogenasa que cataliza la oxidación de aldehídos.
Cuando las enzimas mencionadas en la presente solicitud son identificadas por su actividad específica, esta definición incluye todos los polipéptidos que tienen la misma actividad específica y que están presentes en diferentes células y, particularmente, diferentes microorganismos. La invención por tanto se refiere también a las proteínas homólogas de las proteínas de referencia mencionadas en la presente solicitud que tienen la misma actividad que las proteínas de referencia, así como a los genes que codifican dichas proteínas homólogas.
En ausencia de precisión, los genes y las proteínas mencionadas en la presente solicitud son identificadas en referencia a E. coli (particularmente a la cepa MG1655). La Khk-C y la aldolasa B son identificadas en referencia a H. sapiens. No obstante, las proteínas y, por tanto, los genes homólogos a las proteínas (y a los genes que las
codifican) identificadas en la presente solicitud pueden encontrarse en diferentes microorganismos.
Una proteína homologa a una proteína de referencia según la invención posee la misma función, es decir, en su caso para una enzima, cataliza la misma reacción que la enzima de referencia. Un gen homólogo de un gen que codifica una proteína de referencia según la presente invención codifica una proteína homóloga como se definió con anterioridad.
Normalmente, a partir del nombre de la proteína y de su secuencia, el experto en la técnica es capaz de identificar en otros microorganismos equivalentes de las proteínas mencionadas en la presente solicitud. Este trabajo rutinario se efectúa habitualmente utilizando secuencias de consenso identificadas por alineaciones de secuencias con otras proteínas procedentes de diferentes organismos.
De forma igualmente preferente, una proteína homóloga de una proteína de referencia corresponde a una enzima que tiene al menos 30% de identidad de secuencia, preferentemente 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95% de identidad con la secuencia de la proteína de referencia.
Con el fin de determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos para las necesidades de la invención, las secuencias serán alineadas para permitir una comparación óptima. Pueden ser introducidos espacios (huevos) en una u otra de las secuencias que van a ser alineadas con el fin de permitir una alineación óptima y las secuencias no homólogas pueden ser ignoradas para la comparación.
El porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos comparadas puede ser obtenido como se describe en el libro de D. Voet y J. G. Voet, Biochemistry (2a Edición, De Boeck & Larcier, 2005, sección 7.4, párrafo B). Las alineaciones se realizan con el programa CLUSTAL W (versión 1.82) con los parámetros siguientes: ( i) CPU MODE = ClustalW mp ; (2) ALIGNMENT = “full”; (3) OUTPUT FORMAT = “aln w/numbers”; (4) OUTPUT ORDER = “aligned”; (5) COLOR ALIGNMENT = “no”; (6) KTUP (word size) = “default”; (7) WINDOW LENGTH = “default”; (8) SCORE TYPE = “percent”; (9) TOPDIAG = “default”; (10) PAIRGAP = “default”; (11) PHYLOGENETIC TREE/TREE TYPE = “none”; (12) MATRIX = “default”; (13) GAP OPEN = “default”; (14) END GAPS = “default”; (15) GAP EXTENSION = “default”; (16) GAP DISTANCES = “default”; (17) TREE TYPE = “cladogram” y (18) TREE GRAP DISTANCES = “hide”.
La lignocelulosa está compuesta por ligninas, hemicelulosas y celulosa en proporciones variables. Las hemicelulosas son uno de los tres componentes principales de la biomasa lignocelulósica y representan aproximadamente 20-40% en peso de dicha biomasa.
Mediante “hemicelulosa” se entiende según la invención, un grupo de polisacáridos complejos que se caracterizan por su solubilidad en soluciones alcalinas (por ejemplo, KOH 1 M) y su insolubilidad en agua. Las hemicelulosas se definen estructuralmente como polisacáridos cuya cadena principal está compuesta por residuos p-(1,4)-D-piranosa, en la que el O4 está en la posición ecuatorial. Están fijadas cadenas laterales cortas sobre la cadena principal. Las hemicelulosas comprenden xilanos, arabinoxilanos, xiloglucanos, glucoronoxilanos y glucomananos. Su hidrolización realizada, por ejemplo, mediante contacto de un material lignocelulósico con ácido sulfúrico diluido a presiones y temperaturas elevadas, conduce a la liberación de azúcares monómeros. Según la naturaleza de la materia prima y las condiciones de hidrólisis, los porcentajes de xilosa, glucosa y arabinosa varían respectivamente de 60 a 80%, de 10 a 30% y de 10 a 30% en peso con respecto al peso total del hidrolizado de lignocelulosa.
Las lignocelulosas procedentes de maderas duras (normalmente árboles caducifolios), mazorcas de maíz, hierbas, hojas y periódicos tienen particularmente un contenido elevado de azúcares hemicelulósicos (Jorgensen H et al., Enzymatic conversion of lignocellulose into fermentable sugars: Challenges and opportunities, Biofuels, Bioprod Bioref, 2007, 1, 119-134). Representan fuentes de materias primas preferidas para la utilización de microorganismos modificados según la invención. Por “iniciador” o “cebador” se entiende una secuencia corta de ADN, complementaria del comienzo de una matriz, que sirve de punto de partida para la síntesis de la cadena complementaria de dicha matriz por una ADN polimerasa.
Descripción detallada
Vía sintética de asimilación de pentosas
La presente invención se refiere a un procedimiento de transformación de una pentosa en un microorganismo recombinante que expresa una vía sintética de asimilación de pentosas para la producción de al menos un metabolito de interés.
Este procedimiento según la invención comprende:
1. (i) una operación de cultivo un microorganismo recombinante que expresa una vía sintética de asimilación de pentosas, ilustrada de forma general en la figura 1, que comprende al menos las siguientes etapas:
1. a) la fosforilación en posición 1 de una pentosa escogida entre (D)-xilulosa y/o (L)-ribulosa, para la obtención respectivamente de (D)-xilulosa-1P y/o (L)-ribulosa-1P,
2. b) la escisión del pentosa-1-fosfato obtenido después de la etapa a) ((D)-xilulosa-1P y/o (L)-ribulosa-1P), para la obtención de glicolaldehído y de dihidroxiacetona fosfato (DHAP),
permitiendo dicha vía obtener al menos un metabolito de interés, y
2. (ii) una operación de recuperación de dicho al menos un metabolito de interés obtenido al final de la operación de cultivo (i).
Mediante “fosforilación” se entiende, ventajosamente, la adición de un grupo fosfato, en la forma de un fosforilo PO32"
Mediante “metabolito de interés” se entiende, particularmente, el glicolaldehído y el DHAP, pero también sus derivados susceptibles de ser obtenidos mediante reacciones de oxidación o reducción de estos compuestos, en particular etilenglicol (EG), ácido glicólico (AG) y sus derivados.
Mediante “derivados del ácido glicólico” se entiende en particular:
• ésteres de glicolato, como el éster glicolato de etilo o el éster glicolato de metilo, así como:
• polímeros que contienen glicolato como poli(ácido glicólico)
• así como el ácido glioxílico procedente de una oxidación de ácido glicólico.
Debe apreciarse que en la presente solicitud, las expresiones “ácido glicólico” y “glicolato”, así como las expresiones “ácido glioxílico" y "glioxilato” son utilizadas como sinónimos.
Preferentemente, la vía sintética de asimilación de pentosas expresada por el microorganismo comprende por lo tanto, además, de forma ventajosa, las etapas siguientes:
c) reducción del glicolaldehído obtenido al final de la etapa b) en etilenglicol, o
c') oxidación del glicolaldehído obtenido al final de la etapa b) a ácido glicólico.
En estos modos de realización, los metabolitos de interés obtenidos al final de la vía sintética de asimilación de pentosas según la invención son etilenglicol y/o ácido glicólico, y sus derivados.
Enzimas de la invención
La vía sintética de asimilación de pentosas, representada en la figura 1, es catalizada por un conjunto de enzimas. La enzima recombinante que cataliza la etapa de fosforilación a) de la vía sintética de asimilación de pentosas de la invención es una quinasa que fosforila la (D)-xilulosa o la (L)-arabinosa en la posición 1.
Esta enzima se escoge, por ejemplo, entre el grupo que constituido por:
• cetohexoquinasa, preferentemente la isoforma C de la cetohexoquinasa (KhK-C),
• ramnulosa quinasa (RhaB) y
• fuculosa quinasa (FucK).
La cetohexoquinasa C es codificada por el gen khk, que se encuentra normalmente en el H. sapiens.
En un modo de realización preferido, se utiliza el gen de H. sapiens que codifica Khk-C, de secuencia SEQ ID N° 1. La ramnulosa quinasa así como la fuculosa quinasa de la invención son codificadas, respectivamente, por los genes rhaB y fucK, que se encuentran normalmente en E. coli. Por tanto, en ciertos modos de realización, se utiliza el gen rhaB de E. coli que codifica la ramnulosa quinasa B (RhaB) de secuencia SEQ ID N° 6 o el gen fucK de E. coli que codifica la fuculosa quinasa (FucK) de la secuencia SEQ ID. N° 5.
La enzima que cataliza la etapa de escisión b) es una aldolasa que escinde (D)-xilulosa-IP o (L)-ribulosa-IP en glicolaldehído y DHAP.
Una aldolasa según la invención puede ser escogida entre aldolasa B, codificada por el gen aldoB, que se encuentra normalmente en Homo sapiens y fructosa-1,6 bisfosfato aldolasa B de E. coli, codificada por el gen fbaB que se encuentra normalmente en E. coli.
Por tanto, en ciertos modos de realización particulares, se usa el gen H. sapiens aldoB que codifica la aldolasa B, de secuencia SEQ ID N° 2 o el gen E. coli fbaB de que codifica la fructosa-1,6-bifosfato aldolasa B, de secuencia SEQ ID N° 9.
La enzima que cataliza la etapa de reducción c) es una glicolaldehído reductasa.
Una glicolaldehído (o aldehido) reductasa conveniente para la invención puede ser escogida, por ejemplo, entre la aldehido reductasa codificada por:
• el gen yqhD, que se encuentra normalmente en E. coli, que codifica la aldehído reductasa YqhD de la secuencia SEQ ID N° 4,
• la glicerol deshidrogenasa codificada por el gen gldA, que se encuentra normalmente en E. coli, que codifica la glicerol deshidrogenasa GldA y de secuencia SEQ ID N° 51 y
• la L-1,2-propanodiol oxidorreductasa codificada por el gen FucO, que se encuentra normalmente en E. coli, que codifica la L-1,2-propanodiol oxidorreductasa FucO y de secuencia SEQ ID N° 52.
La enzima que cataliza la etapa de oxidación c') es una glicolaldehído deshidrogenasa.
Una glicolaldehído deshidrogenasa que conviene para la invención es, por ejemplo, la glicolaldehído deshidrogenasa codificada por el gen aldA, que se encuentra normalmente en E. coli, que codifica la lactaldehído deshidrogenasa AldA, de secuencia SEC ID N° 3.
Las enzimas catalizan, respectivamente, las etapas de reducción y oxidación ventajosamente en presencia de la forma reducida u oxidada, respectivamente, de nicotinamida adenina dinucleótido (fosfato) (NAD(P)H), coenzima de oxidorreducción.
En ciertos modos de realización, el microorganismo utilizado en la presente invención expresa, ventajosamente, de forma nativa o recombinante, al menos una de las siguientes enzimas:
• una xilosa isomerasa, que convierte la (D)-xilosa en (D)-xilulosa como, por ejemplo, la enzima codificada por el
gen xylA de E. coli,
• una xilosa reductasa y una xilitol deshidrogenasa como, por ejemplo, las enzimas codificadas por los genes XYL1 y XYL2 de la levadura Scheffersomyces stipitis.
• una L-arabinosa isomerasa, que convierte la (L)-arabinosa en (L)-ribulosa como, por ejemplo, la enzima codificada por el gen E. coli araA, y/o
• una arabinosa reductasa y una arabitol deshidrogenasa.
Todavía de forma preferida, el microorganismo de la invención expresa, de forma nativa o recombinante, al menos una proteína que transporta las pentosas al interior de la célula y, particularmente:
• proteínas que transportan (L)-arabinosa como, por ejemplo, las enzimas codificadas por los genes araE, araF, araG o araH de E. coli; y /o
• proteínas que transportan (D)-xilosa como, por ejemplo, proteínas codificadas por los genes xylE, xylF, xylG o xylH de E. coli o incluso el gen galP que codifica una permeasa de azúcares, o el gen gal-2a de S cerevisiae.
Microorganismo recombinante
Mediante “microorganismo” se entiende, según la invención, una célula hospedante escogida entre las células procariotas, particularmente las arquebacterias, las bacterias o microalgas procariotas y células eucariotas, particularmente los hongos, las levaduras y las células vegetales y las microalgas eucariotas.
Mediante “microorganismo recombinante” o “microorganismo genéticamente modificado” o “microorganismo modificado” se entiende, según la invención, una célula hospedante que ha sido sometida a una modificación de su genoma, por ejemplo, mediante la adición de un ácido nucleico exógeno (o recombinante) o mediante la modificación de un ácido nucleico endógeno.
Las bacterias adecuadas para la invención pueden ser escogidas, por ejemplo, entre las familias de las Enterobacteriaceae, Clostridiaceae, Bacillaceae, Streptomycetaceae, Streptococcaceae, Methylobacteriacae y Corynebacteriaceae.
Las bacterias particularmente adecuadas para la invención pueden ser escogidas normalmente entre el grupo constituido por Escherichia coli, Bacillus subtilis, Corynebacterium glutamicum, Clostridium acetobutylicum, Methylobacterium extorquens y Lactococcus lactis.
Las levaduras adecuadas para la invención se pueden escogidas, por ejemplo, entre las familias de las Saccharomycetaceae, Pichiaceae y Schizosaccharomycetaceae.
Las levaduras particularmente adecuadas para la invención pueden ser escogidas normalmente entre el grupo constituido por Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus, Pichia jadinii, Scheffersomyces stipitis y Pichia pastoris.
Los géneros de hongos adecuados para la invención pueden ser escogidos normalmente entre el grupo constituido por Penicillium, Aspergillus, Chrysosporium y Trichoderma.
En un modo de realización preferido de la invención, se utiliza Escherichia coli, Scheffersomyces stipitis o Saccharomyces cerevisiae como microorganismos hospedante.
Ventajosamente, se utiliza un microorganismo capaz por naturaleza de asimilar (D)-xilosa y/o (L)-arabinosa.
Preferentemente, la vía sintética de asimilación de pentosas según la invención implica que al menos una enzima que cataliza una de las etapas de fosforilación a), de escisión b), de reducción c) o de oxidación c') es expresada de forma recombinante por el microorganismo.
Normalmente, al menos la enzima que cataliza la etapa de fosforilación a) y/o al menos la enzima que cataliza la etapa de escisión b) del procedimiento de la invención es expresada de forma recombinante.
En un modo de realización particular, las enzimas que catalizan las etapas de fosforilación a), de escisión b) y de reducción c) y/o de oxidación c') son enzimas recombinantes.
En ciertos modos de realización, al menos una de dichas enzimas recombinantes es una enzima codificada por un gen heterólogo (es decir, no expresado de forma natural en el organismo hospedante de referencia), en particular al menos una de las enzimas que catalizan las etapas a) y b) es codificada por un gen heterólogo.
Preferentemente, el microorganismo expresa al menos la KhkC.
Incluso preferentemente, el microorganismo expresa de forma recombinante:
• la KhkC (particularmente KhkC, H. sapiens codificada por el gen khkC de la secuencia SEQ ID N° 1) que cataliza la etapa a) de la vía de asimilación de pentosas, y
• la aldolasa B, codificada por el gen aldo-B (particularmente por el gen aldoB de la secuencia SEQ ID N° 2) o la fructosa-1,6, bis-fosfato aldolasa, codificada por el gen fbaB (particularmente el gen fbaB de la secuencia SEQ ID N° 9).
En un modo de realización particular, la glicolaldehído reductasa y/o la glicolaldehído deshidrogenasa catalizan, respectivamente, las etapas c) y c') de la vía sintética de asimilación de pentosas de la invención son enzimas endógenas, que se expresan de forma natural por el microorganismo.
En ciertos modos de realización, las enzimas endógenas de la vía sintética de asimilación de la invención pueden ser sobreexpresadas, particularmente las enzimas que codifican las etapas de reducción c) o de oxidación c'). En particular, la glicolaldehído deshidrogenasa puede ser sobreexpresada para estimular la etapa c') de oxidación. Por ejemplo, en E. coli, se puede sobreexpresar el gen aldA que codifica una glicolaldehído deshidrogenasa.
En ciertos modos de realización de la invención, las enzimas que convierten la (D)-xilosa o la (L)-arabinosa en (D)-xilulosa o (L)-ribulosa, respectivamente, a saber, las isomerasas o epimerasas como se describen con anterioridad, o incluso las proteínas que importan la (D)-xilosa o la (L)-arabinosa en la célula, son sobreexpresadas en el microorganismo.
En un modo de realización de la invención, los ácidos nucleicos que codifican las enzimas que catalizan las etapas a) y b) son clonados en operón en un vector de expresión bajo el control de un mismo promotor. En ciertos modos de realización, los ácidos nucleicos que codifican las enzimas que catalizan las etapas a), b) y c) y/o c') son clonados con operón.
La expresión de las proteínas recombinantes es controlada por un promotor inducible o, preferentemente, constitutivo.
Optimización de la vía sintética de asimilación de pentosas
En ciertos modos de realización, la actividad de una o varias enzimas endógenas de la célula hospedante puede ser modificada también de forma que se optimice la producción de etilenglicol y/o ácido glicólico.
Se describen a continuación ciertas modificaciones que pueden ser aportadas a un microorganismo de la invención.
1. A) Preferentemente, el microorganismo utilizado es genéticamente modificado de forma que se atenúe o suprima la actividad de las enzimas endógenas implicadas en las vías naturales de asimilación de pentosas de fosfatos y, particularmente, la o las enzima(s) que cataliza(n) la fosforilación en posición 5 del ciclo de pentosas y, más particularmente, la (L)-ribulosa-5-quinasa y/o la (D)-xilulosa-5-quinasa.
Como ejemplo, los genes araB y/o xylB, que codifican la ribulosa-5-quinasa y la xilulosa-5-quinasa, respectivamente,
que se encuentran normalmente en E. coli, se pueden ser atenuados o, preferentemente, inactivados.
Esta modificación permite orientar el flujo de carbono preferentemente hacia vía sintética de asimilación de pentosas de la invención y optimizar la producción de etilenglicol y/o ácido glicólico mediante dicha vía sintética.
En un modo de realización de la invención, se utiliza un microorganismo en el que ha sido suprimido el gen xylB y, particularmente, el gen xylB que codifica la secuencia de xilolosa quinasa de secuencia SEQ ID NO: 53.
2. B) La actividad de las enzimas de tipo glicolaldehído reductasa y/o glicolaldehído deshidrogenasa puede ser modificada también con el fin de orientar la vía sintética de asimilación de la invención hacia la producción de ácido glicólico o etilenglicol.
Como ejemplo, las enzimas codificadas por el gen aldA que codifica una glicolaldehído deshidrogenasa, así como los genes gldA, fucO y/o yqhD que codifican una glicolaldehído reductasa, pueden ser particularmente sobreexpresados para favorecer la producción dle etilenglicol o atenuados o inactivados para favorecer la producción de ácido glicólico.
Ventajosamente, la producción de etilenglicol es optimizada utilizando un microorganismo en el que se aportan además al menos una (y preferentemente las dos) de las modificaciones siguientes en cuanto a la expresión de enzimas endógenas:
• sobreexpresión del gen que codifica al menos una glicolaldehído reductasa, preferentemente la glicolaldehído reductasa principal, expresada por el microorganismo;
• inactivación o deleción del gen que codifica una glicolaldehído deshidrogenasa catalizando la etapa c', por ejemplo, el gen aldA.
Ventajosamente, la producción de ácido glicólico puede ser optimizada utilizando un microorganismo en el que se aportan al menos una de las modificaciones siguientes (y preferentemente al menos las dos primeras) en cuanto a la expresión de enzimas endógenas:
• sobreexpresión del gen que codifica la glicolaldehído deshidrogenasa, por ejemplo, la glicolaldehído deshidrogenasa codificada por el gen aldA;
• reducción de la degradación de ácido glicólico, particularmente mediante la atenuación o inactivación de la glicolato oxidasa, por ejemplo, mediante inactivación de al menos uno de los genes glcDEFG que codifica al menos una de las subunidades de la glicolato oxidasa;
• ocasionalmente, una inactivación del o de los genes que codifican una glicolaldehído reductasa.
Preferentemente, un microorganismo según la invención comprende, además de las modificaciones propias para la expresión de la vía sintética de asimilación de pentosas de la invención y, particularmente, apropiadas para catalizar las etapas de fosforilación a) y de escisión b) de esta vía, al menos una de las modificaciones complementarias descritas en los apartados A) o B) anteriores.
Incluso preferentemente, el microorganismo comprende al menos una de las modificaciones descritas en el apartado A). Según los modos de realización, esta modificación puede ser combinada con las modificaciones del apartado B) para optimizar la producción de etilenglicol o de ácido glicólico.
Las modificaciones anteriormente mencionadas pueden ser combinadas.
En particular:
• para optimizar la producción de etilenglicol, la inactivación de las enzimas que catalizan la fosforilación en posición 5 de pentosas, particularmente la (L)-ribulosa-5-quinasa y/o (D)-xilulosa-5-quinasa (como los genes xylB o araB) puede ser combinada con la inactivación de la vía de síntesis del ácido glicólico (particularmente, mediante la
inactivación del o de los genes que codifican una glicolaldehído deshidrogenasa, por ejemplo el gen aldA). Estas inactivaciones pueden estar combinadas a una sobreexpresión del gen que codifica la glicolaldehído reductasa que cataliza etapa c) del procedimiento de la invención.
• para optimizar la producción de ácido glicólico, la inactivación de las enzimas que catalizan la fosforilación en posición 5 de pentosas, particularmente la (L)-ribulosa-5-quinasa y/o (D)-xilulosa-5-quinasa (particularmente codificadas por los genes xylB o araB) pueden ser combinada con la inactivación de la glicolato oxidasa mediante inactivación de al menos uno de los genes glcDEFG que codifican sus subunidades y/o a la sobreexpresión de la glicolaldehído deshidrogenasa codificada por el gen aldA. Ocasionalmente, el gen que codifica la glicolaldehído reductasa que cataliza la etapa c) del procedimiento de la invención es también inactivado.
Por ejemplo, un microorganismo modificado para optimizar la producción de etilenglicol expresa al menos las actividades de fosforilación, de escisión y de reducción correspondientes a las etapas a), b) y c) anteriormente descritas, preferentemente las enzimas KhkC, aldolasa B (particularmente codificada por el gen aldoB) así como una glicolaldehído reductasa (como la aldehído reductasa YqhD o la glicerol deshidrogenasa GldA o incluso la enzima codificada por el gen fucO) y que comprende las modificaciones siguientes:
• la deleción del gen que codifica la aldehído deshidrogenasa, particularmente del gen aldA;
• la deleción de los genes que codifican la o las enzima(s) que cataliza(n) la fosforilación en posición 5 de la (D)-xilulosa y/o la (L)-ribulosa y, más particularmente, la (D)-xilulosa-5-quinasa y/o la (L)-ribulosa-5-quinasa, particularmente los genes araB y/o xylB.
C) Es también posible utilizar un microorganismo genéticamente modificado con el fin de favorecer, además de la vía sintética de la invención, la producción de ácido glicólico por vías naturales.
En efecto, los inventores han descubierto además que la producción de ácido glicólico puede ser también incluso aumentada combinando el funcionamiento de la vía sintética de asimilación según la invención con modificaciones genéticas que conduzcan en paralelo a la producción de ácido glicólico por la vía denominada del glioxilato.
Un microorganismo según la invención, por tanto, puede presentar modificaciones que favorezcan la producción de ácido glicólico a partir del glioxilato, como se describe en la solicitud WO 2010/108909.
Por tanto, la dihidroxiacetona fosfato (DHAP o glicerona fosfato), particularmente obtenida al final de la etapa de escisión b), podría integrar las vías naturales de la glicólisis, del ciclo de los ácidos tricarboxílicos (CAT) y de la vía del glioxilato, un shunt del CAT (véase para una revisión Neidhardt, F. C. (Ed. in Chief), R. Curtiss III, J. L. Ingraham, E. C. C. Lin, K. B. Low, B. Magasanik, W. S. Reznikoff, M. Riley, M. Schaechter, and H. E. Umbarger (eds). 1996. Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology. American Society for Microbiology).
La optimización de la vía del glioxilato puede ser obtenida por tanto mediante al menos una y, preferentemente, mediante una combinación, de las modificaciones siguientes:
1. i) sobreexpresión de un gen que codifica una glioxilato reductasa;
2. ii) sobreexpresión de un gen que codifica una isocitrato liasa, ocasionalmente acompañada de la deleción del gen que codifica su represor transcripcional;
3. iii) deleción de los genes que codifican malato sintasas;
4. iv) deleción de los genes que codifican glioxilato carboligasas;
5. v) deleción de los genes que codifican genes que codifican glicolato oxidasas o glicolato deshidrogenasas;
6. vi) deleción de los genes que codifican 2-ceto-4-hidroxiglutarato aldolasas, particularmente Entner-Doudouroff aldolasa y/o para fosfogluconato deshidratasas;
7. vii) deleción de un gen represor de respuesta aeróbica (es decir, un gen que codifica un represor de genes implicados en el metabolismo respiratorio), particularmente el gen arcA;
8. viii) atenuación y, particularmente, deleción de la expresión de isocitrato deshidrogenasa;
9. ix) ocasionalmente, deleción de los genes que codifican sistemas de internalización del ácido glicólico; y
10. x) ocasionalmente atenuación de las vías metabólicas que conducen a la preparación de productos secundarios como acetato, lactato o etanol.
En el caso de que el microorganismo recombinante, para la producción del ácido glicólico, sea Escherichia coli, las modificaciones anteriormente descritas corresponden a
1. i) la sobreexpresión del gen ghrA y/o el gen ycdW;
2. ii) la sobreexpresión del gen aceA acompañada o no por la deleción de su represor transcripcional, iclR;
3. iii) la deleción de los genes aceB y glcB;
4. iv) la deleción del gen gcl;
5. v) la deleción de al menos un gen escogido entre glcD, glcE, glcF o glcG;
6. vi) la deleción de los genes edd-eda;
7. vii) la deleción del gen arcA;
8. viii) la atenuación y, preferentemente, la deleción de la expresión del gen icd;
9. ix) la deleción de los genes glcA, lldP y/o yjcG;
10. x) la deleción de los genes ackA-pta, poxB, ldha y/o adhE.
Ventajosamente, las modificaciones siguientes son aportadas para optimizar la producción de ácido glicólico en un microorganismo según la presente invención, por ejemplo, en E. coli:
1. i) la sobreexpresión del gen ghrA
2. ii) la sobreexpresión de los genes aceA ocasionalmente acompañada por la deleción del gen icIR;
3. iii) la deleción de los genes aceB y glcB
4. iv) la deleción del gen glc;
V) la deleción de al menos un gen escogido entre glcD, glcE, glcF o glcG;
6. vi) la deleción de los genes edd-eda;
7. vii) la deleción del gen arcA
8. viii) la deleción del gen icd.
En un modo de realización, el microorganismo portador de las modificaciones que anteceden no expresa una enzima que cataliza la fosforilación en posición 5 de (L)-ribulosa y/o (D)-xilulosa y, más particularmente, (L)-ribulosa-5-quinasa y/o (D)-xilulosa-5-quinasa. Por tanto, en ciertos modos de realización se utiliza un microorganismo en el
que los genes xylB y/o araB son suprimido.
En una variante, el microorganismo (ventajosamente E. coli) expresa una o varias enzimas que catalizan la fosforilación en posición 5 de (L)-ribulosa y/o (D)-xilulosa y, más particularmente, (L)-ribulosa-5-quinasa y/o (D)-xilulosa-5-quinasa. Normalmente, el microorganismo expresa el gen xylB y/o el gen araB. Este microorganismo ofrece un excelente rendimiento de ácido glicólico cuando es cultivado en un medio que contiene glucosa, particularmente que contiene al menos glucosa y xilosa o xilulosa. Preferentemente, el medio contiene mayoritariamente glucosa.
D) Finalmente es posible, para aumentar la producción de etilenglicol o de ácido glicólico, utilizar un microorganismo en el que al menos un gen que codifica un transportador de azúcares (por ejemplo, el gen galP que codifica una permeasa de azúcares y/o o el gen gal-2a de S cerevisiae) es sobreexpresado. Ventajosamente, dicho gen es expresado de forma constitutiva.
En un modo de realización particularmente preferido de la invención, se utiliza para la producción de ácido glicicólico un microorganismo que combina las modificaciones descritas en los párrafos A) a D) anteriores. En particular, se utiliza un microorganismo que combina las modificaciones recogidas en los párrafos B), C) y D) anteriores para la producción de ácido glicólico.
Ventajosamente, este microorganismo expresa la KhkC y la aldolasa B y comprende las modificaciones siguientes:
• la sobreexpresión del gen que codifica glicolaldehído deshidrogenasa, por ejemplo, glicolaldehído deshidrogenasa codificada por el gen aldA;
• la sobreexpresión del gen ghrA;
• la sobreexpresión del gen aceA ocasionalmente acompañada de la deleción del gen icIR;
• la deleción de los genes aceB y glcB;
• la deleción del gen glc;
• la deleción de al menos un gen escogido entre glcD, glcE, glcF o glcG;
• la deleción de los genes edd-eda;
• la deleción del gen arcA;
• la deleción del gen icd;
• la sobreexpresión del gen galP.
En función del sustrato de cultivo escogido, este microorganismo puede portar también o no una deleción del gen xylB y/o del gen araB. Preferentemente, la expresión del gen xylB y/o del gen araB es conservada cuando el microorganismo es cultivado en un sustrato que comprende glucosa.
Igualmente en función del sustrato de cultivo, se utiliza un microorganismo que expresa, de forma recombinante o no, enzimas que convierten la (D)-xilosa o la (L)-arabinosa en (D)-xilulosa o (L)-ribulosa, respectivamente, a saber, (D)-xilulosa isomerasas o (L)-arabinosa isomerasas o (D)-xilosa reductasas/(D)-xilitol deshidrogenasas, o (L)-arabinosa reductasas/(L)-arabitol deshidrogenasas, como se describen con anterioridad.
De forma general, sin ser limitativo, el rendimiento teórico del procedimiento de la invención para etilenglicol es de aproximadamente 1 mol de etilenglicol por mol de xilosa o de arabinosa.
El rendimiento teórico del procedimiento de la invención para el ácido glicólico es de aproximadamente 1 mol de ácido glicólico por mol de xilosa o arabinosa, sin activación del ciclo de glioxilato. Durante un funcionamiento
paralelo de la vía sintética y del ciclo glioxilato, el rendimiento teórico es de aproximadamente 2 moles de ácido glicólico por mol de xilosa o arabinosa.
Cultivo del microorganismo
Las condiciones de cultivo del microorganismo según la invención pueden ser adaptadas según técnicas habituales, conocidas por un experto en la técnica.
Normalmente, las bacterias utilizadas como células hospedantes en la presente invención pueden ser cultivadas en medios de todos los tipos y de cualquier composición.
Los medios de cultivo son normalmente medios carbonados que comprenden o están complementados con diversos compuestos, que incluyen, particularmente, diferentes fuentes de carbono y, particularmente, pentosas como (D)-glucosa, (D)-xilosa, (L)-arabinosa y/o hidrolizados de biomasa lignocelulósica, particularmente hemicelulosa, almidón y sus derivados.
En ciertos modos de realización, el medio de cultivo comprende menos de 5%, particularmente menos de 4%, menos de 3%, menos de 2% o incluso menos de 1% de ramnulosa.
Mediante “hidrolizado de biomasa” se entiende, en particular, hidrolizados lignocelulósicos, en particular hidrolizados que contienen al menos 20% de xilosa y/o al menos 5%, particularmente al menos 10% de arabinosa, en peso con respecto al peso total del hidrolizado. En un modo de realización preferido, se utilizan así hidrolizados lignocelulósicos de maderas duras, de mazorcas de maíz o de papel.
Otros parámetros relativos a las condiciones de cultivo pueden ser optimizados mediante experimentación rutinaria, como el pH o la temperatura.
En ciertos modos de realización, la temperatura del cultivo varía de 25 a 43 °C y depende esencialmente del tipo de célula hospedante y del medio de cultivo. Como ejemplo, cuando la célula hospedante es E. coli, la temperatura de cultivo óptima varía generalmente entre 30 a 38 °C.
La duración del cultivo depende también de los parámetros de cultivo anteriormente mencionados. Normalmente, los cultivos pueden ser cultivados entre 6 y 300 horas.
Preferentemente, el o los metabolitos de interés obtenidos al final de la operación de cultivo del microorganismo según la invención son recuperados en el medio de cultivo.
La presente solicitud se refiere también a un microorganismo recombinante como se describe en la presente solicitud.
En particular, la presente invención se refiere a un microorganismo que expresa una vía sintética de asimilación de pentosas según la invención.
Según diferentes modos de realización, las vías naturales de asimilación de pentosas son conservadas o son inactivadas (por ejemplo, mediante la deleción de los genes que codifican xilulosa-5-quinasa y/o ribulosa-5-quinasa). Un microorganismo según la invención expresa al menos:
• un ácido nucleico que codifica una enzima adecuada para fosforilar, en posición 1, una pentosa escogida entre (D)-xilulosa y/o (L)-ribulosa, y
• un ácido nucleico que codifica una enzima de tipo aldolasa, adecuada para escindir el (D)-xilulosa-1-fosfato y/o el (L)-ribulosa-1-fosfato en glicolaldehído y DHAP, como se describió con anterioridad.
Preferentemente, al menos una de estas enzimas es expresada de forma recombinante.
En ciertos modos de realización, al menos una de estas enzimas es codificada por un ácido nucleico exógeno y, preferentemente, el microorganismo expresa al menos:
• un ácido nucleico que codifica la isoforma C de cetohexoquinasa (que se encuentra normalmente en H. sapiens) y • al menos un ácido nucleico que codifica la aldolasa B.
En ciertos modos de realización, el microorganismo es modificado además como se describe en los apartados A) a E) anteriores.
Por ejemplo, un microorganismo adecuado para la producción de ácido glicólico puede comprender ventajosamente las modificaciones siguientes:
• la sobreexpresión del gen que codifica la glicolaldehído deshidrogenasa, por ejemplo, la glicolaldehído deshidrogenasa codificada por el gen aldA;
• la sobreexpresión del gen ghrA;
• la sobreexpresión del gen aceA;
• ocasionalmente, la eliminación del gen icIR;
• la delecion del gen glc;
• la deleción de al menos un gen escogido entre los genes glcD, glcE, glcF o glcG;
• la deleción de los genes aceB y glcB.
• la deleción de los genes edd-eda;
• la deleción del gen ArcA;
• la deleción del gen icd;
• ocasionalmente la deleción de los genes xylB y/o araB.
Ejemplos
Composición de los medios
Medio Luria-Bertani (LB)
Para un litro de medio: 10 g de triptona, 5 g de extracto de levaduras, 5 g de cloruro de sodio en un litro de agua purificada. El medio es tratado en autoclave antes de su utilización. Para ser utilizado en medio sólido, se añade 2% de agar al medio antes del tratamiento en autoclave.
Medio mínimo M9
Para un litro de medio: 18 g de Na2HPO4*12H2O; 3 g de KH2PO4 ; 0,5 g de NaCl; 2 g de NH4Cl; 0,5 g de MgSO4 * 7 H2O; 0,015 g de CaCb * 2 H2O; 1 ml de una solución de elementos residuales (que contiene por litro 0,04 g de NaEDTA * 2 H2O, 0,18 g de CoCl2 * 6 H2O; ZnCbSO4 * 7 H2O; 0,04 g de Na2MoO4 * 2 H2O, 0,01 g de H3BO3 , 0,12 g de MnSO4 * H2O, 0,12 g de CuCb * H2O); cantidades de (D)-glucosa, (D)-xilosa y (L)-arabinosa indicadas en el texto. El medio se ajusta a pH 7 y se filtra.
YPD
El medio YPD es utilizado con medio rico para el crecimiento de S. cerevisiae. Para un litro, 10 g de extractos de levaduras, 20 g de bacto-peptona. El medio es tratado en autoclave antes de su utilización en 20 g de glucosa filtrada sin adiciones. Para ser utilizado en medio sólido, se agrega 2% de agar al medio antes del tratamiento en autoclave.
Medio mínimo de SCD para Saccharomyces cerevisiae
Para un litro, 1,7 g de base de nitrógeno de levaduras sin aminoácidos, 5 g de sulfato de amonio sin aminoácidos, se hacen gotear 0,940 g de aminoácidos esenciales excepto los utilizados para poner de manifiesto una auxotrofia, 900 ml de agua y seguidamente la totalidad se somete a tratamiento en autoclave. En el caso de una utilización en medio sólido, se añaden 20 g de bacto-agar. Se añaden 100 ml de una solución de azúcares al 20%.
Ensayo de crecimiento en medio M9 xilosa
Todos los cultivos se realizaron en matraces Erlenmeyer de 250 ml que contenían 50 ml de medio de cultivo y agitando los cultivos a 200 rpm.
Las células que iban a ser ensayadas se pusieron en cultivo durante la noche a 37 °C en medio LB. Este precultivo se utiliza seguidamente para inocular a medio DÜ600nm ~ 0,2 del medio M9 10 g/l de glucosa. En fase exponencial de crecimiento (OD entre 0,6 y 1), se añade el IPTG 1 mM y los cultivos se incuban así durante 16 a 18 horas. Después de este período de incubación, las células se lavan dos veces con agua esterilizada y se inoculan a DO600nm ~ 0,2 en medio M9 IPTG 1 mM glucosa y/o xilosa y/o arabinosa en las cantidades indicadas en el texto. La DO600nm es sometida a seguimiento y se tomaron partes alícuotas, se centrifugaron y se inyectaron en HPLC para un análisis de los metabolitos.
Métodos de construcción de cepas
Transformación bacteriana
Las transformaciones bacterianas se realizan sobre células quimiocompetentes comerciales o preparadas en laboratorio. Las células hechas quimicaocompetentes se preparan según el protocolo de cloruro de calcio (Dagert and Ehrlich, 1979). La transformación se efectúa seguidamente dejando transformar durante 20 minutos ADN plasmídico en contacto bacterias competentes sobre hielo y seguidamente se realiza un choque térmico a 42 °C durante 45 segundos. Las células se dejan 5 minutos sobre hielo y seguidamente se añade 1 ml de medio LB antes de incubar durante 1 hora a 37 °C. Seguidamente, las células se extienden sobre una cámara LB sólida complementada con el marcador de selección correspondiente.
De forma general, además de los plásmidos desarrollados en el contexto de la presente invención, se utilizaron los siguientes plásmidos: pACT3 (Dykxhoorn et al., 1996), pEXT20 (Dykxhoorn et al., 1997), pGEM-T (Promega), pET28a (Novagen), pCP20 (Cherepanov & Wackernagel, 1995), peX-A-aldoB (Eurofins) y pET11-KHK-C (Asipu et al., 2003).
Deleción de los genes mediante transducción de una cassette de kanamicina de una cepa KEIO
Para transferir una deleción de gen portada por una cepa KEIO de E. coli hacia una cepa receptora dada de MG1655 de E. coli, se realiza una transducción.
A partir de una cepa Keio dispuesta en cultivo en LB kanamicina 50 pM a 37°C durante una noche, se genera un lisado de fagos. Sobre un precultivo de 10 ml de LB inoculado en la mañana a partir de 200 pl del cultivo durante la noche en presencia de 2 g/l de glucosa y CaCl25 mM se añaden 200 pl de fago P1. El cultivo se deja 2 h que es el tiempo de lisis celular debida al fago. La reacción se detiene con 200 pl de cloroformo. El conjunto se centrifuga 10 min a 4500 x g y se recuperan 9 ml del condensado sobrenadante de los fagos y se almacena con 200 pl de cloroformo a 4 °C. La cepa receptora se pone en precultivo durante la noche. De este cultivo se recupera 1,5 ml y se centrifuga. El sedimento se recoge en 600 pl de MgSO4 10 mM CaCh 5 mM. La transducción se realiza disponiendo 100 pl de células en presencia de 100 pl del lisado de fagos. El conjunto se incuba 30 minutos a 30 °C sin agitación. Seguidamente, se añaden 100 pl de citrato de sodio 1 M así como 1 ml de LB. La expresión fenotípica de las cepas que han integrado la cassette de kanamicina se hace dejando reposar las células durante 1 hora a 37
°C bajo agitación. Las células seguidamente se extienden sobre la cámara de medio LB que contiene el marcador de selección y se dejan reposar durante una noche. A la mañana siguiente, las colonias formadas son ensayadas mediante PCR en cuanto a la presencia de la cassette de selección y en cuanto a la ausencia del gen suprimido. Protocolo de escisión de la cassette de selección flanqueada por secuencia FRT
La cassette es escindida del cromosoma utilizando la recombinación FLP portada por el plásmido pCP20 (Cherepanov y Wackernagel, 1995) que deja una región de cicatriz que contiene el sitio de FRT. El pCP20 es un plásmido que porta resistencia a la ampicilina y al cloranfenicol que presenta una replicación termosensible y una expresión de la recombinación FLP termoinducida. Los mutantes marcadores resistentes que contienen así la cassette son transformados con pCP20 y los transformantes resistentes a ampicilina que portan la resistencia del plásmido se seleccionan a 30 °C. Seguidamente se ponen en cultivo a 37 °C sobre LB sólido y seguidamente se ensayan en cuanto a la pérdida de resistencia a la ampicilina. La escisión de la cassette de selección se verifica seguidamente mediante PCR con los cebadores que han servido para amplificar con Taq polimerasa (NEB). Las deleciones múltiples se obtienen repitiendo la operación.
Clonación de genes sobre plásmido en S. cerevisiae
La clonación de un gen en S. cerevisiae utiliza las capacidades de recombinación genética de la levadura. El gen que va a ser clonado es asociado a una secuencia promotora y una secuencia terminadora que proporcionan tres fragmentos que van a ser ligados en un plásmido previamente linealizado. Para esto, se diseñan regiones homólogas de 40 nucleótidos sobre los cebadores. Estos 40 nucleótidos de homología permiten a los sistemas de recombinación de la levadura ligar el conjunto de los fragmentos después de la transformación. Cada fragmento es amplificado mediante PCR utilizando la PhusionTM polimerasa. El conjunto de los fragmentos y el vector receptor linealizado es transformado en una cepa competente de S. cerevisiae según el método descrito por Gietz y Woods (2002). Después del crecimiento de los transformantes, los plásmidos son extraídos según el método descrito por Zeugin y Hartley (1985). Los plásmidos seguidamente se utilizan para transformar una cepa DH10B de E. coli. Los plásmidos son extraídos de E. coli, verificados mediante secuenciado y utilizados para transformar la cepa receptora de S. cerevisiae.
Extracción de plásmidos en S. cerevisiae
Después de la transformación, las colonias obtenidas se vuelven a poner en suspensión en agua y seguidamente se centrifugan con el fin de una extracción de plásmido. El sedimento de células se vuelve a poner en suspensión en 400 pl de un tampón a 4 °C que contiene glucosa 50 mM, EDTA 10 mM, Tris-HCl 25 mM, pH 8 y se complementa con 0,1 mg/ml de RnaseA. Se utilizan 400 pl de una solución que contiene NaOH 0,2 M y 1% de SDS para hacer lisar las células. Seguidamente se añaden bolas de vidrio hasta una altura de un tercio del volumen total y las células se centrifugan a 4 °C durante 10 minutos. Esta etapa está seguida de una centrifugación de 60 segundos a 13.000 rpm. Se retiran 700 pl de la materia sobrenadante y se disponen en un nuevo tubo de 2 ml. Se añaden 325 pl de una solución a 4 °C de KAC 3 M a pH 5,5. La mezcla se deja incubar durante 10 minutos sobre hielo antes de ser centrifugada durante 10 minutos a 13.000 rpm a 4 °C. Se retiran 700 pl de materia sobrenadante y se depositan en un nuevo tubo. Se añaden 700 pl de isopropanol y el conjunto se agita intensamente antes de dejarlo incubar 10 minutos a temperatura ambiente. Seguidamente se realiza una centrifugación a temperatura ambiente durante 30 minutos a 13.000 rpm. La materia sobrenadante seguidamente se elimina y el sedimento se vuelve a poner en suspensión en 500 pl de etanol al 70% a -20 °C y seguidamente se centrifuga 5 minutos. La materia sobrenadante se elimina. Esta etapa se repite una vez más y seguidamente el sedimento se seca hasta la desaparición del etanol. Este sedimento seguidamente se recoge en 30 pl de H2O.
De forma general, los iniciadores utilizados para la expresión de la vía en E. coli se recogen en la tabla 3 y los iniciadores utilizados para la expresión de la vía en S. cerevisiae se recogen en la tabla 4.
Expresión y purificación de proteínas a partir de un plásmido pET28a
La cepa de E. coli BL21 (DE3) que contiene el pET28a que porta el gen de interés se pone en cultivo durante una noche a 37°C en 100 ml de medio LB en un Erlenmeyer de 500 ml bajo agitación a 200 rpm.
En la mañana siguiente, 10 a 50 ml de este precultivo de E. coli BL21 (DE3) que contiene el pET28a que porta el
gen de interés se ponen en cultivo en medio LB complementado con 50 pg/ml de kanamicina a 37°C.
La expresión proteica es provocada mediante la adición de IPTG 1 mM a los cultivos que alcanzan una DÜ6oonm ~0,7. Después de 3 horas a 37°C, las células se centrifugan y los sedimentos se congelan a -80°C. Para la purificación de las proteínas así expresadas, las células se recogen en 1 ml de tampón de lisis (50 mmol/l de Hepes [pH 7,5], 3 mol/l de NaCl, 0,25 mmol/l) y se guardan durante una hora en hielo.
Las células se someten a ultrasonidos y los residuos se separan mediante centrifugación durante 10 minutos a 13.000 RPM a 4 °C. Seguidamente se prepara una resida Talon © con 0,3 ml de resina en 3 ml de tampón de lisis. Toda la suspensión se deposita seguidamente sobre la resina y se incuba 20 minutos a temperatura ambiente antes de ser centrifugada 5 minutos a 2500 rpm a 4 °C. El sedimento se lava con 10 veces el volumen de la resina con un tampón de lisis y se incuba durante 10 minutos a temperatura ambiente. La operación se repite con el tampón de lisis que contiene imidazol 15 mM. Seguidamente el depósito se lava con 500 pl de imidazol 200 mM. El conjunto se vuelve a centrifugar durante 5 minutos a 2500 rpm a 4°C. La materia sobrenadante se recupera proporcionando la elución 1. La operación se repite proporcionando una elución 2. Las proteínas purificadas se encuentran en las diferentes eluciones que serán ensayadas.
Métodos analíticos
Para dosificar los productos de la vía sintética a partir de las materias sobrenadantes de los cultivos, se utilizó una HPLC (Ultimate 3000, Dionex) equipada con un dispositivo automático de toma de muestras y un horno (Shimadzu CTO-20A) y acoplado al detector RID-10A (Shimadzu) y UV SPD-20A (Shimadzu). Los compuestos se separaron en una columna Aminex HPX-87H (300 mm x 7,8 mm) equipada con una precolumna (Aminex). Los análisis se realizaron a una temperatura de 35 °C con un caudal de 0,5 ml/min de H2SO4 a 1,25 mM. Se inyectaron muestras de 20 pl en el aparato.
Ejemplo 1: Demostración de las actividades de (D)-xilulosa-1-quinasa y (L)-ribulosa-1-quinasa
Clonación de xiluloquinasas candidatas: khkC, rhaB y fucK en pET28a
La clonación de los genes khkC (SEQ ID N° 1), rhaB (SEQ ID N° 6) y fucK (SEQ ID N° 5) en pET28a se realiza como se indica con posterioridad. El gen khk-C es digerido a partir de pET11a-hk-C (Asipu et al., 2003) mediante NdeI/EcoRI. Se inserta mediante ligadura a través de la ligasa T4 (Biolabs) a continuación de tag-histidina del pET28a previamente digerido con estas mismas enzimas. La clonación de rhaB y fucK se realizó mediante amplificación por PCR rhaB y fucK a partir de ADN genómico de E. coli con los cebadores siguientes, respectivamente, P1/P2; P3/P4 citados en la tabla 3. Los fragmentos seguidamente se clonaron en el vector pGEM-T (Invitrogen). Seguidamente se digieren mediante Ncol y BamHI y seguidamente se ligaron en el plásmido pET28a a nivel de MCS previamente digerido por estas mismas enzimas. El producto de ligadura se transforma en una cepa BL21 (DE3) de E. coli. Los vectores pET28-khk-C, pET28-rhaB y pET28-fucK así obtenidos son verificados en cuanto al secuenciado que contiene los genes con las secuencias correctas.
Determinación de los parámetros cinéticos de las (D)-xiluloquinasas y (L) -ribuloquinasas candidatas
Las proteínas se expresan y purifican como se describió anteriormente y los parámetros cinéticos de las enzimas se determinan mediante la reacción de acoplamiento de piruvato quinasa/lactato deshidrogenasa que se basa en el principio siguiente (el ejemplo proporcionado corresponde a la dosificación de una actividad de (D)-xilulosa-1P aldolasa):
La reacción se realiza en el medio siguiente: NADH 0,4 mM (Sigma), PEP 2 mM (Sigma), ATP 4 mM (Sigma) en un tampón Hepes (Hepes 90 mM, KCl 77 mM, MgCl2 12 mM, ajustado a pH 7 con una solución de KOH). Se añade un volumen de 1,25 pl de una mezcla de enzimas piruvato quinasa/lactato deshidrogenasa (Sigma) a una mezcla de reacción total de 250 pl. La reacción arranca con la adición de 100 pl de (D)-xilulosa (Carbosynth) o (L)-ribulosa (Sigma) 10 mM. El consumo de NADH es seguido mediante espectrofluorometría a 340 nm.
Tabla 1A. Parámetros cinéticos de las quinasas sobre su sustrato natural y sobre (D)-xilulosa. Los sustratos naturales de Khk-C, RhaB y FucK son, respectivamente, fructosa, ramnulosa y fuculosa.
Estos resultados muestran que pueden ser identificadas las quinasas tienen la capacidad de fosforilar (D)-xilulosa en la posición 1.
Se utilizó la misma propuesta para caracterizar estos parámetros sobre (L)-ribulosa:
Tabla 1B. Parámetros cinéticos de las quinasas sobre su sustrato natural y sobre (L)-ribulosa.
La Khk-C es funcionalizada a la vez sobre (D)-xilosa como en (L)-ribulosa y presenta características apropiadas para su utilización en la vía sintética.
Ejemplo 2: Demostración de las actividades de (D)-xilulosa-1P-aldolasa y (L)-ribulosa-1P-aldolasa.
Clonación de genes que codifican las aldolasas candidatas AldoB, FbaB y AgaY
La clonación de las aldolasas candidatas se hace amplificando mediante PCR aldoB, fbaB y agaY (utilizando, respectivamente, los pares de cebadores P5/P6, P7/P8 y P11/P12 recogidos en la tabla 3). Esta amplificación se realizó a partir del plásmido peX-A-aldoB que porta aldoB con optimización de codones (Eurofins) o a Dn genómico de E. coli para fbaB y agaY, respectivamente. Los fragmentos se clonan seguidamente en pGEM (Invitrogen). Seguidamente son digeridos mediante BamHI y HindIII (para aldoB) o Ndel y BamHI (para fbaB y agaY) y seguidamente son ligados en plásmido pET28a a nivel de MCS previamente digerido mediante BamHI y HindIII o NdeI y BamHI para clonar respectivamente aldoB (SEQ ID N° 2) o fbaB (SEQ ID N° 9) y agaY (SEQ iD N° 8). El producto de ligadura se transforma en cepa BL21 (DE3) de E. coli. Los vectores pET28-aldoB, pET28-fbaB y pET28-agaY así obtenidos son verificados mediante secuenciado en cuanto a si contienen los genes con las secuencias correctas.
Determinación de los parámetros cinéticos de (D)-xilulosa-1-fosfato aldolasas y (L)-ribulo-1-fosfato aldolasa
candidatas
Las proteínas se expresan y purifican como se describe con anterioridad y los parámetros cinéticos de las enzimas se determinan sobre (D)-fructosa-1,6bP, (D)-xilulosa-1P y (L)-ribulosa-1P basándose en el principio siguiente (el ejemplo proporcionado corresponde a la dosificación de una actividad de (L)-ribulosa-1P aldolasa).
La reacción se realiza en la mezcla siguiente: NADH 0,4 mM, PEP 2 mM, ATP 4 mM (todos de Sigma) en tampón de Hepes (Hepes 90 mM, KCl 77 mM, MgCL 6,8 mM, ajustado a pH 7 con una solución de KOH). Las enzimas Khk-C purificadas y GldA (glicerol deshidrogenasa de Cellulomonas sp. de la empresa Sigma) se añaden a una cantidad de 15 pl de Khk-C (0,005 U) y 4 pl de una solución concentrada a 84 U/mg de GldA para una mezcla de reacción total de 250 pl. La reacción arranca con la adición de 100 pl de D-xilulosa o (L)-ribulosa 20 mM (Sigma). El consumo de NADH fue sometido a seguimiento mediante espectrofluorometría a 340 nm.
Tabla 2A. Parámetros cinéticos de aldolasas sobre (D)-fructosa-1,6-bifosfonato y sobre (D)-xilulosa-1-fosfato
Tabla 2B. Parámetros cinéticos de aldolasas sobre (D)-fructosa-1,6-bifosfonato y sobre (L)-ribulosa-1-fosfato
La AldoB posee una actividad sobre (D)-xilulosa-1-P y, por tanto, puede ser utilizada para la vía sintética de asimilación de xilosa. La FbaB posee una actividad sobre (D)-xilulosa-1P y (L)-ribulosa-1P y, por tanto, puede ser utilizada para la construcción de una vía sintética para la asimilación de (D)-xilosa o (L)-arabinosa.
Ejemplo 3: Funcionamiento in vitro de la vía metabólica sintética de asimilación de pentosas
Funcionamiento in vitro de la vía metabólica sintética de asimilación de (D)-xilosa
La vía metabólica de asimilación de D-xilosa ha sido reconstituida in vitro a partir de enzimas purificadas
(comerciales y expresadas y seguidamente purificadas a partir de E. coli) a partir de (D)-xilulosa para demostrar su funcionamiento mediante la producción de etilenglicol (figura 1).
Las enzimas utilizadas para la llevar a cabo la vía metabólica sintética son las siguientes:
• Khk-C (cetohexoquinasa/H.sapiens), codificada por el gen khkC de secuencia SEQ ID N° 1 o KHK-A (Prospecbio);
• Aldolasa B (AldoB/H.sapiens), codificada por el gen aldoB de secuencia SEQ ID N° 2 o aldolasa de conejo (Sigma-Aldrich-A2714);
• Glicerol deshidrogenasa Cellulomonas sp. (Sigma-Aldrich/G3512-250U).
El medio de reacción comprendía el tampón Hepes (Hepes 90 mM, KCl 77 mM, MgCb 6,8 mM) a pH = 7; ATP 4 mM; NADH 0,4 mM; 0,005 Unidades/ml de Khk-A (Prospecbio) o Khk-C (purificada a partir de pET28a); 1 Unidad/ml de aldolasa (AldoB, Sigma A6338) y 1 Unidad/ml de GldA (Sigma-G3512-250U). La reacción se inicia mediante la adición de (D)-xilulosa 5 mM (Cabosynth). Después de un tiempo de incubación de 3 h, el etilenglicol producido en el transcurso de la reacción se cuantifica mediante HPLC (figura 2).
La aparición de etilenglicol en la reacción que contiene (D)-xilulosa-1-quinasa, (D)-xilulosa-1P aldolasa y glicolaldehído reductasa demuestra el funcionamiento de la vía sintética.
Funcionamiento in vitro de la vía metabólica de asimilación de (L)-arabinosa
La vía metabólica de asimilación de (L)-arabinosa se reconstituye in vitro a partir de enzimas purificadas (comerciales y expresadas y seguidamente purificadas a partir de E. coli) a partir de (L)-ribulosa.
El funcionamiento de la vía se comprobó mediante la medición por HPLC de etilenglicol producido.
Las enzimas utilizadas para la realización de la vía metabólica sintética son las siguientes:
• Khk-C (cetohexoquinasa/H.sapiens), codificada por el gen khkC de secuencia SEQ ID N° 1;
• FbaB (fructosa-1,6-bifosfato aldolasa, E. coli) codificada por el gen fbaB, de secuencia SEC ID N° 9;
• GldA (glicerol deshidrogenasa Cellulomonas sp. (Sigma-Aldrich/G3512-250U).
Las enzimas son incubadas en medio de reacción que contiene: NADH 0,4 mM, ATP 4 mM, tampón Hepes pH 7 (Hepes 55 mM, KCl 45 mM, MgCl24 mM ajustado a pH 7 con KOH) para un volumen final de 500 pl. Se añade Khk-C a 0,005 Unidades/ml mientras que FbaB a 100 pg/ml. Se añade GldA a 1 U/ml. La reacción se inicia mediante la adición de L-ribulosa 20 mM (Sigma-Aldrich). Después de un tiempo de incubación de 3 h, el etilenglicol producido en el transcurso de la reacción se cuantifica mediante HPLC. Los resultados se presentan en la figura 3.
La aparición de etilenglicol en la reacción que contiene (L)-ribulosa-1-quinasa, (L)-ribulosa-1P aldolasa y glicolaldehído reductasa demuestra el funcionamiento de la vía sintética.
Ejemplo 4: Funcionamiento in vivo de la vía metabólica sintética de asimilación de (D)-xilosa
Clonación de genes de la vía sintética en operón
Los genes H. sapiens khk-C, que codifica la isoforma C de la enzima cetohexoquinasa (Khk), de secuencia SEQ ID N° 1 y aldoB que codifica la isoforma B de fructosa-1,6 aldolasa de secuencia SEQ ID N° 2 son clonados en operón sobre un plásmido pEXT20 (Dykxhoorn, (1996)) bajo el control de un promotor inducible de IPTG construido como sigue. El gen humano khk-C fue suministrad por el Dr. Asipu (Asipu et al., 2003) y amplificado con iniciadores P13 y P14 (tabla 3). La aldolasa es sintetizada con optimización de codones para E. coli mediante Eurofins® y es amplificada mediante PCR con los iniciadores P15 y P16 (tabla 3). Los iniciadores para la amplificación de los dos genes son conocidos para proporcionar fragmentos de PCR que pueden ser utilizados con el estuche de ensayo InFusión de Clonetech para la adición de una cola de 17 nt de homología con el fragmento contiguo. Se añade un RBS canónico (AGGAGG) a las secuencias de khk-C y aldoB. El plásmido pEXT20 es digerido por las enzimas de restricción BamHI y SacI. Se utiliza el estuche de ensayo In-Fusion de Clonetech para ligar mediante recombinación los dos fragmentos de PCR y el pEXT20 linealizado proporcionando el plásmido pEXT20-khk-C-aldoB. El vector pEXT20-khk-C-aldoB así obtenido es verificado mediante secuenciado que contiene los genes con las secuencias correctas. Este plásmido es transformado en una cepa AxylB de E. coli MG1655 en la que xylB, de secuencia SEQ ID N° 53, que codifica la xilulosa-5-quinasa, es suprimida. Los dos genes khk-c y aldoB son igualmente clonados individualmente sobre el pEXT20 y han sido amplificados en primer lugar por P60 y P61 y P62 y P63, respectivamente, y seguidamente ligados en pEXT20 mediante restricción con las enzimas BamHI y Salí proporcinando los plásmidos pEXT20-khk-Cet y pEXT20-aldoB.
Ensayo de la vía sintética mediante seguimiento del crecimiento de una cepa AxylB sobre (D)-xilosa
El crecimiento bacteriano, así como la producción de etilenglicol, se ensaya en medio líquido M9 que comprende (D)-xilosa 120 mM como la única fuente carbonada, en presencia de IPTG.
Para controlar la capacidad de las cepas que no poseen la vía de asimilación natural de (D)-xilosa para ser impulsada en presencia de (D)-xilosa, se ensayan las cepas MG1655, MG1655 AxylB y MG1655 AXylB que portan el pEXT20-khk-C, pEXT20 -aldoB o pEXT20-khk-C-aldoB.
Sin la vía sintética, solamente la cepa salvaje es impulsada en estas condiciones. La parte de XylB no permite el crecimiento sobre xilosa. Además, ni la presencia de Khk-C, ni la presencia de AldoB permite restaurar un crecimiento mediante la utilización de la vía natural de asimilación de xilosa (figura 4). Por el contrario, la cepa MG1655 AxylB, que porta el plásmido pEXT20-khkC-aldoB, es capaz de ser impulsada sobre xilosa.
Mediante un seguimiento de la producción de metabolitos durante el crecimiento mediante HPLC, el etilenglicol es identificado como producto principal de la fermentación de xilosa pasando por la vía sintética producida con un rendimiento de 0,45 moles por mol de xilosa (0,19 g de EG por g de xilosa) (figura 5).
La vía sintética de asimilación de (D)-xilosa por tanto es funcional in vivo y restaura el crecimiento de un mutante AxylB sobre este mismo azúcar.
Ejemplo 5: Identificación de la glicolaldehído reductasa principal
La optimización de la producción de etilenglicol depende de la identificación y la sobreexpresión de glicolaldehído reductasa responsable de la conversión de glicolaldehído en etilenglicol. Varias oxidorreductasas que tienen una actividad sobre glicolaldehído presentes de forma natural en E. coli, GldA, YqhD, FucO, DkgA, DkgB, YghZ, YeaE, YajO han sido identificadas (Lee et al., 2013). Se recuperaron mutantes de estos genes de la colección KEIO para determinar si uno de estos genes codifica la glicolaldehído reductasa principal. Para esto, se ensaya la capacidad de estos mutantes para generar etilenglicol a partir de glicolaldehído. Estas cepas son cultivadas en medio M9 en presencia de xilosa 133 mM y, cuando la DO600nm alcanza el valor de 1, las células son expuestas a glicolaldehído 10 mM. La cantidad de etilenglicol se mide seguidamente mediante HPLC después de 12 h de cultivo.
La ausencia de YqhD disminuye enormemente la producción de etilenglicol a partir de glicolaldehído (figura 6), sugiriendo que es la glicolaldehído reductasa principal en E. coli en las presentes condiciones de cultivo.
Ejemplo 6: Optimización de la cepa para la producción de etilenglicol por la vía sintética de la invención
Para mejorar la producción de etilenglicol, la glicolaldehído reductasa principal es sobreexpresada sobre un plásmido pACT3. Para esto, se amplifica yqhD (SEQ ID N° 4) con P11 y P12 y seguidamente es clonado en pACT3 mediante In-Fusion, previamente digerido con PstI y HindIII. La inserción de yqhD en el pACT3 linealizado se efectúa mediante recombinación por medio del estuche de ensayo In-Fusion (Clonetech), proporcionando el plásmido pACT3-yqhD. El vector pACT3-yqhD así obtenido se verifica mediante secuenciado. El producto de ligadura es seguidamente transformado en las cepas MG1655de interés. De la misma forma, se clonan gldA (SEQ ID N° 51) y fucO (SEQ ID N° 52) (respectivamente amplificadas por P24 y P25; y P26 y P27) mediante In-Fusion en el pACT3 previamente digerido con PstI y HindIII con el fin de ensayar su efecto.
En las presentes condiciones de cultivo, la reductasa principal de glicolaldehído es YqhD, pero ni su sobreexpresión ni la de otras reductasas GldA y FucO aumentan la producción de etilenglicol. El rendimiento, en efecto, es de solo 0,45 mol/mol de xilosa (0,19 g de EG por g de xilosa), un rendimiento comparable al de la cepa MG1655 AxylB que expresa el plásmido pEXT20-khkC-aldoB (figura 7).
Para aumentar la producción de etilenglicol, la vía de la oxidación del glicolaldehído a ácido glicólico debe ser bloqueada. Para esto, se ensaya el impacto de la deleción del gen aldehido deshidrogenasa AldA (SEQ ID N° 3). Para cuantificar la producción residual de ácido glicólico, se bloquea el reconsumo de este ácido mediante la inactivación de la glicolato deshidrogenasa (véase ejemplo 7) mediante la deleción de su subunidad GlcD (codificada por la secuencia del gen de la SEC ID N° 7). Las deleciones de aldA y/o glcD en una cepa AxylB por tanto son emprendidas para la transducción a partir de una cepa KEIO. Estas construcciones proporcionan las cepas MG1655 AxylB AaldA y MG1655 AxylB AaldA AglcD que son seguidamente transformadas por pEXT20-khkC-aldoB.
Gracias a la deleción de aldA, aumenta enormemente el rendimiento de EG. En efecto, la cepa MG1655 AxylB AaldA que portan el plásmido pEXT20-khkC-aldoB produce etilenglicol hasta un rendimiento de 0,88 mol por mol de xilosa (0,36 g EG por g de xilosa) (figura 7). La sobreexpresión de YqhD y FucO en estas condiciones hace posible alcanzar un rendimiento de 0,9 y 0,94, respectivamente, mol/mol (0,38 y 0,39 g EG por g de xilosa, respectivamente). Esto está muy cercano al rendimiento teórico máximo alcanzado de 1 mol/mol.
Ejemplo 7: Optimización de la cepa para la producción de ácido glicólico por la vía sintética de asimilación de D-xilosa
Para aumentar la producción de ácido glicólico a través de la vía sintética de la asimilación de pentosas, se sobreexpresa la glicolaldehído deshidrogenasa de E. coli. Para esto, se amplifica aldA a partir del ADN genómico de E. coli en MG1655 utilizando el par de cebadores (P17 y P18, tabla 3) y el fragmento obtenido es ligado en pGEM-T (Promega) según las instrucciones del fabricante. El fragmento es seguidamente digerido por las enzimas Kpnl y Hindlll y seguidamente es ligóado en el pACT3 en sí mismo linealizado por las dos mismas enzimas. El vector pACT3-aldA así obtenido es verificado por secuenciado en cuanto al contenido del gen con la secuencia correcta. Seguidamente se transforma pACT3-aldA en la cepa MG1655 AxylB pEXT20-khk-C-aldoB que proporciona la cepa AxylB pEXT20-khk-C-aldoB pACT3-aldA. Durante la puesta en cultivo de esta cepa sobre un medio M9 10 g/l de xilosa, la producción de etilenglicol disminuye significativamente (rendimiento de 0.2 mol/mol) pero la producción de ácido glicólico aumenta solo transitoriamente, indicando el reconsumo del ácido glicólico producido (fgura 8).
Para evitar el reconsumo de ácido glicólico, la glicolato oxidasa, codificada por glcDEF, es atenuada. Para esto, la cepa MG1655 AxylB AglcD es construida mediante deleción de glcD (SEC Id N° 7) a través de transducción de la mutación a partir de una cepa de la colección KEIO. La cepa MG1655 AxylB AglcD es transformada con plásmidos pEXT20-khkC-aldoB o pEXT20-aldA-khkC-aldoB. Este plásmido es construido a partir de pEXT20-khkC-aldoB escindido por las enzimas de restricción EcoRI y SmaI en las que es clonado mediante el método In-Fusion el gen aldA con un RBS en sentido ascendente. Este gen en sí mismo es amplificado mediante PCR a través de los cebadores P24 y P25. Durante la realización de esta cepa que contiene pEXT20-khkC-aldoB sobre un medio M9-xilosa (10 g/l), la producción de ácido glicólico aumenta significativamente y alcanza un rendimiento de 0,35 mol/mol (0,19 g de AG por g de xilosa) (figura 8). Cuando aldA es sobreexpresado sobre pEXT20, el rendimiento alcanza 0,92 moles/mol de xilosa (0,47 g de AG por g de xilosa).
La deleción de glcD permite la acumulación de ácido glicólico debido a la sobreexpresión de aldA utilizando 92% del flujo de carbono procedente de la parte C2 de la xilosa.
Ejemplo 8: Optimización de la cepa para la producción de ácido glicólico a través del ciclo de glioxilato
La producción de ácido glicólico puede ser aumentada todavía más combinando el funcionamiento de la vía sintética optimizada anteriormente descrita con intervenciones genéticas que conducen a la producción de ácido glicólico a través de la vía de glioxilato como se describe en las patentes US 20090155867 (Soucaille, 2009) y US 20120315682 (Dischert et al., 2012). Apoyándose en estos datos publicados, los genes aceB y glcB, que codifican malato sintasas, el gen glc que codifica glioxilato carboligasa, el gen arcA que codifica un represor de la respuesta aeróbica y el gen icd que codifica una isocitrato deshidrogenasa son suprimidos mediante el protocolo de transducción de fago P1 en la cepa MG1655. El operón glcDEFG que codifica una glicolato oxidasa, edd-eda que codifica, respectivamente, una fosfonogluconato deshidratasa y Entner-Doudoroff aldolasa así como el iclR, que
codifica el represor transcripcional de la vía del glioxilato, son suprimidos a través del procedimiento de deleción Datsenko. (Datsenko et al., 2000) utilizando los cebadores P52 y P53 y P54 y P55 y 64 y 65, respectivamente. Los plásmidos para la sobreexpresión paralela de isocitrato liasa, codificada por aceA y glioxilato reductasa, codificada por ghrA (o ycdW) son construidos para mejorar la producción de ácido glicólico a través de los ciclos de Krebs y del glioxilato. Para esto, un plásmido pACT3 es digerido por las enzimas BamHI y HindIII. El gen ghrA es amplificado mediante PCR como se describe con anterioridad usando el par de cebadores P40 y P41, mientras que el gen aceA es amplificado mediante el par de iniciadores P21 y P22. Los dos fragmentos amplificados y el plásmido linealizado son conjuntamente ligados mediante la utilización del estuche de ensayo In-Fusion (Clontech). Esta construcción proporciona el plásmido pACT3-ghrA-aceA.
Este plásmido es seguidamente transformado en la cepa que porta las deleciones AaceB AglcDEFGB Agcl Aeddeda AicIR AarcA Aicd. La cepa resultante es la cepa 1054. Cuando esta cepa se pone en cultivo sobre M9 glucosa, se producen 1,17 mol/mol de ácido glicólico (0,49 g AG por g de glucosa) sin producción de acetato (tabla 6).
Tabla 6. Producción de ácido glicólico y de acetato de las cepas de E. coli AaceB AglcDEFGB Agcl Aedd-eda AicIR con mutaciones adicionales en medio M9 1% de glucosa
Ejemplo 9: Optimización de la cepa para la producción de ácido glicólico a través de la coutilización del ciclo de glioxilato y de la vía sintética de asimilación de (D)-xilosa sobre glucosa y D-xilosa
Para la aplicación de la vía sintética de asimilación de xilosa descrita en este documento, es preferido realizar la producción de ácido glicólico sobre hidrolizados celulósicos o hemicelulósicos que contienen normalmente glucosa y xilosa en porcentajes diferentes. Para demostrar que el rendimiento de ácido glicólico sobre un sustrato que contiene a la vez los azúcares glucosa y xilosa puede ser aumentado a través de la producción simultánea de ácido glicólico por medio de la vía sintética y el ciclo del glioxilato, se construye una cepa que coexprese las dos vías de forma simultánea. La cepa E. coli AxylB AaceB AglcDEFGB Agcl Aedd-eda AicIR AarcA Aicd es cotransformada por los plásmidos pACT3-ghrA-aceA y pEXT20-khk-c-aldoB-aldA. La cepa así obtenida es la cepa 905. El seguimiento de la producción de ácido glicólico mediante HPLC se realiza durante un crecimiento de esta cepa sobre un medio mineral M9 0,1% de extractos de levaduras 0,2% de triptona y en presencia de 0,25% de glucosa y 0,5% de xilosa (figura 9)
Tabla 7. Producción de ácido glicólico a partir de cepas de E. coli en medio M9 2,5 g/l de glucosa 5 g/l (D)-xilosa 1 g/l de extracto de levaduras 2 g/l de triptona. proD: galP-galP sobreexpresada con el promotor proD constitutivo (Davis et al., 2011) (**) Rendimiento calculado sobre la base de azúcar total consumido
La cepa consume primeramente la glucosa y seguidamente la xilosa a pesar de la ausencia de xilB, mostrando así que la vía sintética es activa incluso en estas condiciones. Después de 100 h de cultivo, se producen 2,35 g/l de ácido glicólico por la cepa con un rendimiento sobre el azúcar utilizado total de 0,51 g/g (tabla 7). Este rendimiento es superior al obtenido con una cepa casi isogénica que no posee la vía sintética de asimilación de (D)-xilosa (tabla 7, cepa 1054), o que no porta la deleción del gen xylB que codifica la enzima que cataliza la entrada en la vía natural de asimilación de (D)-xilosa (tabla 7, cepa 1044).
La tasa de asimilación de xilosa después del consumo total de la glucosa se continúa siendo relativamente baja con un valor de aproximadamente 0,19 mmol/(l h). Para acelerar la asimilación de xilosa, la expresión de la permeasa de azúcares galP se hizo constitutiva utilizando el método siguiente: un fragmento de ADN que codifica el promotor constitutivo proD descrito por Davis (Davis et al., 2011) y sintetizado mediante Eurofins (SEC ID N° 90) es amplificado con iniciadores P56 y P57. Una cassette de expresión del gen kan es amplificado utilizando los iniciadores P58 y P59 y el plásmido pKD4 (SEQ ID N° 95) como matriz. Los dos fragmentos de PCR se fusionan mediante una extensión solapada pCr utilizando los iniciadores P59 y P57. El producto de PCR así obtenido es transformado en la cepa 905 utilizando el método de Datsenko y Wanner (Datsenko et al., 2000). Se recuperan clones resistentes a la kanamicina y se verifica si contienen el promotor sintético y constitutivo ante galP.
La nueva cepa así obtenida es cotransformada por pACT3 aceA-ghrA y pEXT20-khk-C-aldoB-aldA proporcionando la cepa 979. Su crecimiento y el seguimiento de la producción de ácido glicólico mediante HPLC se realizan sobre un medio mineral M9 0,1% de extracto de levaduras 0,2% de triptona en presencia de 0,25% de glucosa y 0,5% de xilosa (figura 10).
La cepa acumula 3,84 g/l de ácido glicólico con un rendimiento de 0,66 g/g sobre azúcar total. La tasa de asimilación de xilosa después del consumo total de la glucosa es aumentado gracias a la sobreexpresión de Galp y alcanza un valor de 0,32 mmol/(l h).
Ejemplo 10: Expresión de la vía sintética de asimilación de xilosa en Saccharomyces cerevisiae
Para ensayar la portabilidad de la vía sintética de asimilación de xilosa, se ensaya su expresión en otro microorganismo de interés, la levadura Saccharomyces cerevisiae.
La S. cerevisiae no posee un sistema enzimático natural para convertir (D)-xilosa en (D)-xilulosa y, por tanto, no es capaz de impulsarse sobre este azúcar. Habitualmente son expresadas dos vías metabólicas de forma heteróloga en esta levadura para realizar la conversión de (D)-xilosa en (D)-xilulosa y para facilitar su crecimiento sobre xilosa. La xilosa isomerasa (XI) cataliza la conversión de xilosa en xilulosa directa de forma redox neutra. Como alternativa, la acción secuencial de la xilosa reductasa (XR) y la xilitol deshidrogenasa (XDH) permite también una conversión de xilosa en xilulosa, utilizando los cofactores NADPH y NAD, respectivamente. Para mostrar el funcionamiento de la vía sintética de asimilación de xilosa en la levadura, esta vía sintética se complementa mediante una isomerasa de xilosa o bien mediante el sistema XR/XDH.
Para completar la vía sintética de asimilación de xilosa con una XI, se utiliza la XI de Clostridium phytofermentans codón optimizado para S. cerevisiae conocida por el equipo de Eckhard Boles (Brat et al., 2009). Se expresa khk-C bajo el control del promotor de la triosa fosfato isomerasa Tpi (Ptpi: SEC ID N° 15) y se usa el terminador Trk1 (SEC ID N° 12).
El gen de aldolasa AldoB se coloca bajo el control del promotor de la aldolasa natural de S. cerevisiae (pFab: SEC ID N° 14) y se utiliza también un terminador Tlk1 (SEC ID N° 13).
Estos genes son clonados mediante recombinación en levadura en el plásmido p425 linealizado por KpnI y HindIII proporcionando p425-khk-aldoB utilizando los cebadores siguientes (véase también la tabla 4): p 1' y P2' para Ptpi, P3' y P4' para khk-C, P5' y P6' para Trk1, P7' y P8' para pFab, P'9 y P'10 para aldoB y P'11 y P'12 para tlk1.
El plásmido p425-khk-aldoB se usa seguidamente en una cepa competente incapaz de impulsarse sobre xilosa, ya que está mutada para su xilulosa quinasa natural, Xks1 (SEQ ID N° 89).
Se realiza así cotransformación con un plásmido construido por el equipo de Eckhard Boles que contiene a la vez la xilulosa isomerasa y un transportador de xilosa Gal- en la cepa CEN.p K-2 xksl-.
Se ensaya la capacidad de la cepa para impulsarse en un medio mínimo que contiene únicamente xilosa (figura 11). En este caso, aunque el mutante xksl no es capaz de impulsarse sobre D-xilosa, el mutante xksl que porta la vía sintética restablece su crecimiento, indicando que la vía es funcional en la levadura.
La utilización de una XI no es el único medio posible para asimilar la xilosa convirtiéndola en xilulosa. En efecto, a continuación de una reacción de reducción catalizada por una xilosa reductasa (XR) y una deshidrogenación del xilitol así obtenido catalizada por una xilitol deshidrogenasa (XDH), se obtiene xilulosa. Por tanto, se utiliza la cepa TMB3001 (Eliasson et al., 2000) que expresa el sistema XR/XDH para ensayar si la vía sintética es capaz de ser utilizada en estas condiciones para asimilar la xilosa. Se construye un mutante xksl- en la cepa TMB3001 transformando un fragmento de PCR que contiene los bordes flanqueantes homólogos a las extremidades no codificadores de xksl para generar una deleción mediante recombinación homóloga. El fragmento de PCR es amplificado a partir de la cepa BY de entidad Yeast collection knockout (YKO) (Winzeler et al., 1999) con los cebadores P26' y P27' y que contiene una cassette kanMX para la selección de los recombinantes. La vía sintética es expresada en el plásmido pYCP-khk-C-aldoB construido de la forma siguiente. El plásmido pYCP-TPS1 (SEC ID N°: 80) es digerido por Agel y Xbal para extraer la cassette TPS1. Se diseñan los cebadores Fw pT pi y rev Tlk1 para tener una cola flotante de 40 nucleótidos homóloga al plásmido pYCP linealizado por Agel y Xbal con el fin de que se puede recombinar en el plásmido. Seguidamente se expresa khk-C codón optimizado para la levadura (SEQ ID N° 83) amplificado por P15' y P16' bajo el control del promotor de la triosa fosfato isomerasa Tpi (amplificada por P13' y P14') y del terminador Trk1 (amplificado por P17' y P18') y se expresa la aldolasa aldoB codón optimizada para la levadura (SEQ ID N°: 84) amplificado por P21' y P22' bajo el control del promotor de la aldolasa natural de S. cerevisiae pFbaB1 (amplificado por P19' y P20') y del terminador Tlk1 (amplificado por P23' y P24'). Estas construcciones son clonadas mediante recombinación en levadura en el plásmido pYCP proporcionando pYCP-khk-C-aldoB. Este plásmido se utiliza seguidamente en la cepa TMB3001 xks l- incapaz de impulsarse sobre xilosa ya que es mutada para xilulosa quinasa, Xks1.
Aunque que un mutante TMB3001 xksl- ha perdido su capacidad de impulsarse sobre xilosa, contrariamente a la cepa TMB3001, la cepa TMB3001 xks l- que lleva pYCP-khk-C-aldoB recupera un crecimiento sobre xilosa (figura 12). Esto sugiere que la vía sintética también es funcional en una cepa que asimila la xilosa a través del sistema XR/XDH.
Ejemplo 11: Funcionamiento in vivo de la vía metabólica sintética de la asimilación de (L)-arabinosa
Clonación de los genes de la vía sintética en el operón
Los genes H. sapiens khk-C que codifican isoforma C de la enzima cetohexoquinasa (Khk) de secuencia SEQ ID N° 1 y fbaB que codifica una fructosa-1,6-bifosfonato aldolasa isoforma B de E. coli de secuencia SEQ ID N°: 9 son clonados en operón sobre un plásmido pEXT20 (Dykxhoorn et al., 1996) bajo el control de un promotor inducible por IPTG construido como sigue. El gen khk-C humano es proporcionado por el Dr. Asipu (Asipu et al., 2003) y amplificado con los iniciadores P13 y P14 (tabla 3). La aldolasa es amplificada a partir de ADN genómico de E. coli de la cepa MG1655 con los cebadores P28 y P29 (tabla 3).
Los iniciadores para la amplificación de estos dos genes están diseñados para proporcionar fragmentos PCR que pueden ser utilizados con el estuche de ensayo In-Fusion de Clonetech mediante la adición de una cola de 17 nucleótidos de homología con el fragmento contiguo. Se escogen RBS a través del programa informático RBS Calculator (Salis et al., 2011). El gen fbaB, por lo tanto, precedido de un RBS de secuencia (TTAGGAGGTATACT) previsto para proporcionar una expresión máxima y khk-C está precedido por un RBS de secuencia (ACAGCTTTTAATTATACACTTTAAGGAGGACAGAC) previsto para minimizar la expresión. Los iniciadores para la amplificación de los dos genes con los nuevos RBS (P30 y P22 para khk-C y P31 y P32 para fbaB) están diseñados para proporcionar fragmentos PCR que pueden ser utilizados con el estuche de ensayo de Fusion mediante la adición de una cola de 15 nucleótidos de homología con el fragmento contiguo. El plásmido pEXT20 es digerido por
las enzimas de restricción BamHI y SalI. El estuche de ensayo In-Fusion de Clonetech es utilizado para ligar mediante recombinación los dos fragmentos de PCR y el pEXT20 linealizado, proporcionando el plásmido pEXT20-khk-C-RBSmax-fbaB. El plásmido pEXT20-khk-C-RBSmax-fbaB es transformado en MG16551655 AaraB. El vector pEXT20-khk-C-RBSmax-fbaB así obtenido es verificado mediante secuenciado. De forma análoga, los plásmidos pEXT20-khk-C y pEXT20-fbaB son construidos, utilizando los iniciadores 83/84 y 33/34 (tabla 3) mediante In-Fusion. Estos plásmidos son transformados en una cepa AaraB de E. coli MG1655 en la que araB, de secuencia SEQ ID N° 88, que codifica la ribulo-5-quinasa, es suprimido.
Ensayo de la vía sintética mediante seguimiento del crecimiento de una cepa AaraB sobre (L) -arabinosa
El crecimiento bacteriano es ensayado en medio líquido M9 que comprende (L)-arabinosa 60 mM como única fuente carbonada, en presencia de IPTG. Para controlar la capacidad de las cepas que no poseen la vía natural de asimilación de arabinosa para ser impulsada en presencia de (L)-arabinosa en medio M9, se ensayan las cepas MG1655 AaraB y MG1655 AaraB que portan los plásmidos pEXT20-khk-C, pEXT2-fbaB o pEXT20-khk-C-RBSmaxfbaB. Se efectúa un precultivo durante una noche en LB IPTG 100 pM 2% de L-arabinosa y seguidamente las células se transfirieren a medio M9 glucosa 2% arabinosa 2% IPTG 100 pM a DÜ600nm = 0,2 y seguidamente a DÜ600nm = 1, las células son transferidas a un medio M9 L-arabinosa 2% IPTG 100 pM a DÜ600nm = 0,2. Solo la cepa que expresa simultáneamente las enzimas KhkC y FbaB, que tienen actividades de (L)-ribulosa-1 quinasa y (L)-ribulosa-1P aldolasa, respectivamente, es impulsada en estas condiciones (figura 13). Estos resultados ponen de manifiesto el funcionamiento de la vía sintética de la asimilación de la (L)-arabinosa.
Tabla 3. Iniciadores utilizados para la expresión de la vía en E. coli
Tabla 4. Iniciadores utilizados para la expresión de la vía en S. cerevisiae
Tabla 5: Lista de secuencias de los genes
Referencias
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Claims (16)
1. Un procedimiento para la producción de al menos un metabolito de interés mediante la transformación de una pentosa en un microorganismo, caracterizado porque dicho procedimiento comprende al menos:
(i) una operación de cultivo un microorganismo recombinante que expresa una vía sintética de asimilación de pentosas catalizada por un conjunto de enzimas:
- una enzima recombinante que consiste en una quinasa adecuada para fosforilar en posición 1 una pentosa escogida entre (D)-xilulosa y/o (L)-ribulosa,
- una enzima que consiste en una aldolasa adecuada de escindir la(s) pentosas-1-fosfonato para la obtención de glicolaldehído y dihidroxiacetona fosfato (DHAP),
y en que la vía sintética de asimilación de pentosas comprende al menos las etapas siguientes:
a) fosforilación en posición 1 de una pentosa escogida de (D)-xilulosa y/o (L)-ribulosa, caracterizada por dicha quinasa,
b) escisión de pentosa-1-fosfato obtenido al final de la etapa a), para la obtención de glicolaldehído y dihidroxiacetona fosfato (DHAP), catalizada por dicha aldolasa,
(ii) una operación de recuperación de dicho al menos un metabolito de interés obtenido al final de la operación de cultivo (i).
2. Procedimiento para la producción de al menos un metabolito de interés según la reivindicación 1, caracterizado porque:
- la etapa de fosforilación a) de la vía sintética de asimilación de pentosas está catalizada por una enzima expresada de forma recombinante escogida entre el grupo constituido por cetohexoquinasa C (KhcC), ramnulosa quinasa (rhaB) y fuculosa quinasa (fucK) y/o
- la etapa de escisión b) de la vía sintética de asimilación de pentosas está catalizada por una aldolasa escogida entre el grupo constituido por aldolasa B (Aldo-B) y fructosa-1,6 bisfosfato aldolasa (FbaB).
3. Procedimiento para la producción de al menos un metabolito de interés según la reivindicación 2, caracterizado porque:
- la etapa a) es catalizada por la cetohexoquinasa C, y
- la etapa b) es catalizada por aldolasa B (Aldo-B) y/o la fructosa -1,6-bisfosfato aldolasa B.
4. Procedimiento para la producción de al menos un metabolito de interés según una de las reivindicaciones 1 a 3, siendo escogido dicho metabolito entre etilenglicol y/o ácido glicólico, caracterizado porque dicho microorganismo recombinante expresa una vía sintética de asimilación de pentosas catalizada además por las enzimas siguientes: - una enzima que consiste en una glicolaldehído reductasa, adecuada para catalizar la reducción del glicolaldehído obtenido al finas de la etapa b) a etilenglicol, y/o
- una enzima que consiste en una glicolaldehído deshidrogenasa, adecuada para catalizar una oxidación del glicolaldehído obtenido al fina de la etapa b), a ácido glicólico
y porque dicha vía sintética de asimilación de pentosas comprende además las etapas siguientes
c) reducción del glicolaldehído obtenido al final de la etapa b) a etilenglicol, catalizada por dicha glicolaldehído reductasa y/o
c') oxidación del glicolaldehído obtenido al final de la etapa b) a ácido glicólico, catalizada por dicha glicolaldehído deshidrogenasa.
5. Procedimiento para la producción de al menos un metabolito de interés según la reivindicación 4, para la producción de etilenglicol y/o de ácido glicólico, caracterizado porque:
- la etapa de reducción c) está catalizada por una glicolaldehído reductasa escogida entre el grupo constituido por aldehído reductasa (YqhD), glicerol deshidrogenasa (GldA) y propano-1,2-diol oxidorreductasa (FucO), y/o
- la etapa de oxidación c') está catalizada por una glicolaldehído deshidrogenasa que consiste en lactaldehído deshidrogenasa (AldA).
6. Procedimiento para la producción de al menos un metabolito de interés según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el microorganismo se pone en cultivo sobre un medio carbonado que contiene (D)-xilosa y/o (L)-arabinosa.
7. Procedimiento para la producción de al menos un metabolito de interés según la reivindicación 6, caracterizado porque el medio de cultivo comprende un hidrolizado de biomasa que comprende hemicelulosa.
8. Procedimiento para la producción de al menos un metabolito de interés según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque dicha vía sintética de asimilación de pentosas comprende, previamente a la etapa a):
- una etapa de conversión de (D)-xilosa en (D)-xilulosa y/o,
- una etapa de la conversión de (L)-arabinosa en (L)-ribulosa.
9. Procedimiento para la producción de al menos un metabolito de interés según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el microorganismo recombinante es escogido entre E. coli, S. cerevisiae y Scheffersomyces stipitis.
10. Procedimiento para la producción de al menos un metabolito de interés según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el microorganismo recombinante consiste en un microorganismo cuyas actividades de (D)-xilulosa-quinasa y/o (L)-ribulosa-5-quinasa han sido suprimidas.
11. Microorganismo recombinante que expresa una vía sintética de asimilación de pentosas y que comprende al menos ácidos nucleicos que codifican las enzimas siguientes:
i) una enzima que consiste en una quinasa adecuada de fosforilar en posición 1 una pentosa escogida entre (D)-xilulosa y/o (L)-ribulosa,
ii) una enzima que consiste en una aldolasa adecuada para escindir la(s) pentosa(s)-1 fosfato obtenidas al final de la etapa (i), para la obtención de glicolaldehído y de dihidroxiacetona fosfato (DHAP),
caracterizado porque las actividades de (D)-xilulosa-5-quinasa y/o (L)-ribulosa-5-quinasa de dicho microorganismo han sido suprimidas y/o el microorganismo es portador de al menos una de las modificaciones siguientes:
- sobreexpresión de un gen que codifica una glioxilato reductasa;
- sobreexpresión de un gen que codifica una isocitrato liasa acompañada o no de la deleción de su represor transcripcional;
- deleción de los genes que codifican malato sintasas;
- deleción de los genes que codifican glioxilato carboligasas;
- deleción de los genes que codifican glicolato oxidasas y/o glicolato deshidrogenasas;
- deleción de los genes que codifican 2-ceto-4-hidroxiglutarato aldolasas, particularmente Entner-Doudouroff aldolasa y fosfogluconato deshidratasas;
- deleción de un gen que codifica un represor de genes implicados en el metabolismo respiratorio, particularmente el gen arcA;
- atenuación y, particularmente, deleción de la expresión de isocitrato deshidrogenasa;
- deleción de los genes que codifican sistemas de internalización de ácido glicólico;
- atenuación de vías metabólicas que conducen a la producción de productos secundarios como acetato, lactato o etanol;
- sobreexpresión de al menos un gen que codifica un transportador de azúcares.
12. Microorganismo recombinante según la reivindicación 11, caracterizado porque comprende:
- al menos un ácido nucleico exógeno que codifica cetohexoquinasa C, y
- al menos un ácido nucleico exógeno que codifica aldolasa B.
13. Microorganismo según una de las reivindicaciones 11 o 12, que comprende además al menos una de las modificaciones siguientes:
- sobreexpresión del gen que codifica glicolaldehído reductasa principal;
- deleción del gen que codifica glicolaldehído deshidrogenasa.
14. Microorganismo según una de las reivindicaciones 11 o 12, que comprende además al menos una de las modificaciones siguientes:
- sobreexpresión del gen que codifica glicolaldehído deshidrogenasa;
- inactivación de al menos uno de los genes que codifican al menos una de las subunidades de glicolato oxidasa.
15. Microorganismo según la reivindicación 14, que comprende las siguientes modificaciones:
- sobreexpresión de un gen que codifica una glioxilato reductasa;
- sobreexpresión de un gen que codifica una isocitrato liasa acompañada o no de la deleción de su represor transcripcional;
- deleción de los genes que codifican malato sintasas;
- deleción de los genes que codifican glioxilato carboligasas;
- deleción de los genes que codifican glicolato oxidasas y/o glicolato deshidrogenasas;
- deleción de los genes que codifican 2-ceto-4-hidroxiglutarato aldolasas, particularmente Entner-Doudouroff aldolasa y fosfogluconato deshidratasas;
- deleción de un gen que codifica un represor de genes implicados en el metabolismo respiratorio, particularmente el gen arcA;
- atenuación y, particularmente, deleción de la expresión de isocitrato deshidrogenasa;
- ocasionalmente, la sobreexpresión de un gen que codifica un transportador de azúcares.
16. Microorganismo según la reivindicación 15, que comprende las modificaciones siguientes: - la sobreexpresión del gen aldA que codifica glicolaldehído deshidrogenasa;
- la sobreexpresión del gen ghrA;
- la sobreexpresión del gen aceA;
- la deleción del gen icIR;
- la deleción del gen gcl;
- la deleción de los genes aceB y glcB.
- la deleción de al menos un gen escogido entre glcD, glcE, glcF o glcG;
- la deleción de los genes edd-eda;
- la deleción del gen arcA;
- la deleción del gen icd;
- la sobreexpresión del gen galP.
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