BRPI0622182A2 - processo para integraÇço cromossâmica e substituiÇço de seqÜÊncia de dna em clostridia - Google Patents

Abstract

PROCESSO PARA INTEGRAÇçO CROMOSSâMICA E SUBSTITUIÇçO DE SEQÜÊNCIA DE DNA EM CLOSTRIDIA. A presente invenção esta relacionada a um novo método para substituição ou deleção de seqüências de DNA em Clostridia, com alta eficiência, fácil de realizar e aplicável em um nível industrial. Esse método é útil para modificar vários boi genéticos em Clostridia de uma maneira rotineira. Esse método está baseado em um vetor replicativo trazendo pelo menos dois genes marcadores.

Description

PARA INTEGRAÇÃO CROMOSSÔMICA E SUBSTITUIÇÃO DE SEQÜÊNCIA DE DNA EM CLOSTRIDIA".

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Clostridia são bactérias gram positivas, anaeróbicas e de baixo GC que são amplamente usadas na indústria por suas capacidades de produzir solventes, em particular butanol, etanol e acetona, mas também dióis tal como 1,3 propanodiol, ácidos orgânicos tais como ácido acético, butirico ou láctico e vacinas.

A construção de Clostridia recombinante é uma parte importante do desenvolvimento no campo. Cepas de Clostridium são geneticamente modificadas de forma a melhorar suas capacidades industriais.

Para realizar essas modificações, recombinação homóloga é a técnica mais usada em todos os tipos de organismos. Transformação e recombinação homóloga em vários microorganismos têm sido extensivamente descritas não estado da técnica. Veja, por exemplo, (Datsenko e Wanner ; PNAS, 2000) e (Fabret e colaboradores, Molecular Microbiology, 2002).

Clostridia não são naturalmente transformáveis e os métodos atualmente disponíveis para sua transformação são ineficazes e não permitem a introdução de múltiplas mutações. Isso tem impedido desenvolvimentos industriais nesse campo.

Clostridia coraumente produzem DNAses extracelulares e enzimas de restrição que degradam DNA estranho antes e após introdução nas células para transformação. Métodos clássicos baseados na introdução de fragmentos de PCR que funcionam bem em muitos microorganismos tais como E. coli ou levedura, não são viáveis nesses organismos, uma vez que a meia-vida extracelular e intracelular da estrutura de DNA a ser recombinada é muito curta e a eficiência de recombinação geralmente é baixa. Em outros organismos, essas dificuldades têm sido superadas usando vetores que se replicam no hospedeiro, aumentando assim a probabilidade do evento de recombinação. Todavia, após o evento de recombinação, o vetor que agora traz a seqüência de DNA alvo intacta tem de ser eliminado. Esse problema foi resolvido em Lactococcus lactis (Biswas e colaboradores, J Bacteriol., 1993) usando unidades de replicação (replicons) sensíveis à temperatura que podem ser eliminados na temperatura não-permissiva. Nenhum vetor com essas características está atualmente disponível para Clostridia. Portanto, a construção de mutantes em Clostridia tem sido, até hoje, muito trabalhosa e freqüentemente sem sucesso. A inativação de genes em Clostridia foram reportadas nos seguintes artigos (veja Tabela 1).

Tabela 1

<table>table see original document page 4</column></row><table> <table>table see original document page 5</column></row><table>

Inativação de gene foi até o momento realizada em Clostridia através da transformação com DNA circular que não pode se replicar nas cepas alvo. Uma vez que DNAses e endonucleases de restrição de DNA presentes em Clostridia degradam rapidamente o DNA introduzido, e geralmente a freqüência de recombinação nesse gênero não é muito alta, a obtenção de mutantes tem sido muito trabalhosa.

Além disso, as cepas recombinantes descritas até o momento (veja acima) são todas resistentes ao MLS ou cloranfenicol e os genes marcadores correspondentes não podem ser removidos após o evento de recombinação ter ocorrido. Isso limita o número de possíveis recombinações ao número de marcadores de resistência disponíveis nessas bactérias para um máximo de 3. Além disso, para o uso industrial dessas bactérias, poderia ser útil ter cepas sem marcadores de forma a evitar a liberação de genes de resistência a antibiótico no meio de fermentação.

Além disso, algumas dessas cepas que têm sido obtidas através de eventos de recombinação únicos têm a desvantagem de que elas não são estáveis se cultivadas sem qualquer pressão de seleção.

Conseqüentemente, há ainda uma necessidade no estado da técnica por um método para a transformação de Clostridia com alta eficiência, com uma etapa fácil de seleção de cepas recombinantes que permita substituições de seqüência de DNA sucessivas na mesma cepa, levando à Clostridia recombinantes que são geneticamente estáveis e sem marcadores.

A presente invenção está relacionada a um novo método para substituição ou deleção de seqüências de DNA em Clostridia, fácil de realizar e aplicável a nivel industrial. Esse método é útil para modificar vários Ioci genéticos em Clostridia de uma maneira rotineira.

Esse método é baseado em um vetor replicativo útil para a transformação de Clostridia com alta eficiência.

Um número ilimitado de mutações podem ser introduzidas no genoma com esse novo método, através da eliminação de cassetes de resistência do genoma e reutilização dos mesmos em sucessivos ciclos de substituição de seqüência de DNA.

A introdução eficiente de múltiplas mutações em Clostridia deverá permitir que a indústria aprimore as cepas industriais existentes e desenvolva novos processos.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

A invenção proporciona um processo para a substituição de uma seqüência de DNA alvo através de recombinação homóloga em Clostridia, compreendendo:

- Transformação da referida cepa com um vetor compreendendo:

uma origem de replicação que permite sua replicação em Clostridia, e

um cassete de substituição compreendendo um primeiro gene marcador envolvido por duas seqüências homólogas às regiões selecionadas em torno da seqüência de DNA alvo, permitindo a recombinação do cassete, e - um segundo gene marcador,

- seleção de cepas, tendo integrado em seu genoma o referido cassete, que expressam o primeiro gene marcador,

- seleção de cepas, tendo eliminado o referido vetor, que não expressam o segundo gene marcador.

Todas as técnicas de biologia molecular usadas para realização da invenção estão totalmente descritas em "Molecular cloning : a laboratory manual", 2a edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, por Sambrook, Fritsch e Maniatis.

Usado no contexto da presente invenção, o termo "substituição" de uma seqüência de DNA alvo significa que uma seqüência diferente da original é introduzida no locus da seqüência de DNA alvo.

De acordo com a invenção, uma seqüência de DNA é definida como um gene ou uma seqüência intergênica. Ambos podem compreender seqüências promotoras ou regulatórias.

A expressão "seqüência de DNA alvo" significa qualquer gene, região intergênica, seqüência promotora ou regulatória de interesse escolhida por aqueles habilitados na técnica. Ela significa, em particular, genes que codificam proteínas de interesse, por exemplo, enzimas envolvidas no metabolismo celular.

A seqüência de DNA substituída/inserida pode ser de codificação ou não. Ela pode ser uma seqüência mutante do gene alvo, seqüência promotora ou regulatória e/ou um marcador, tal como um gene de resistência a antibiótico ou uma enzima que gera cor. Ela pode ser mais longa ou mais curta do que a seqüência substituída, dependendo da distância que separa as duas regiões homólogas. Em virtude da inserção, a expressão do gene alvo é usualmente perturbada, parcialmente ou completamente suprimida ou aumentada. A substituição da seqüência de DNA alvo por uma seqüência próxima da original, mas compreendendo mutações, leva à expressão real de uma proteína, seqüência promotora ou regulatória mutante.

Se a substituição da seqüência de DNA alvo proporciona, como um resultado, uma eliminação total da referida seqüência de DNA, o gene é qualificado como "deletado".

A expressão "recombinação homóloga" se refere ao evento de substituição de um segmento de DNA por outro que possui regiões idênticas (homólogas) ou próximas disso. Esse evento é também denominado "crossover" de DNA.

O termo "transformação" se refere à incorporação de ácido nucléico exógeno por uma célula, essa aquisição de novos genes sendo transitória (se o vetor que traz os genes é curado) ou permanente (no caso em que o DNA exógeno é integrado cromossomicamente) . O termo "vetor" se refere a um elemento extra-cromossomal trazendo genes ou cassetes, que está usualmente na forma de moléculas de DNA fita dupla circular, mas pode ser uma molécula de DNA fita simples também. Ambos os termos "vetor" e "plasmídeo" são usados indiferentemente. O vetor de acordo com a invenção é um vetor replicativo. Ele compreende pelo menos uma origem de replicação e, preferencialmente, várias origens de replicação, permitindo que o mesmo seja funcional em diferentes espécies.

Em particular, um vetor preferido pode compreender duas origens de replicação:

- Ori, funcional em E. coli

- RepL de pIM13 derivado de B. subtilis, funcional em Clostridia (Mermelstein e colaboradores, Biotechnology, 1992) .

A expressão "seqüências homólogas a uma seqüência de DNA alvo" se refere às seqüências com alta similaridade de seqüência às regiões selecionadas da seqüência alvo.

O termo "gene marcador" se refere a uma seqüência que codifica uma proteína marcadora sob o controle de elementos regulatórios funcionais em Clostridia. Tais proteínas são bem conhecidas na técnica. Por exemplo, aqueles habilitados na técnica podem usar um gene de resistência a antibiótico, um marcador fluorescente ou colorido ou um marcador de auxotrofia. Exemplos de genes marcadores úteis serão fornecidos abaixo.

Após o evento de recombinação ter ocorrido, o vetor agora traz a seqüência de DNA alvo intacta e, conseqüentemente, tem de ser eliminado. A eliminação de um vetor replicativo geralmente acontece com sucessivas culturas de clones, seguido por seleção negativa ou positiva de clones tendo eliminado esse vetor. A eliminação do vetor também pode ser uma etapa ativa do processo, com o uso de endonucleases que clivam especificamente seqüências de DNA presentes no vetor. Uma vez que o vetor é curado, as cepas não expressam mais o segundo gene marcador e podem ser selecionadas com base nessa característica.

Em uma modalidade particular da invenção, o segundo gene marcador é um gene de resistência a antibiótico. Dentre os genes de resistência a antibiótico úteis, aqueles habilitados na técnica saberiam qual é o mais apropriado. Por exemplo, os seguintes genes podem ser usados: gene CatP, que proporciona resistência ao cloranfenicol e tianfenicol ou gene MLSr, que proporciona resistência à eritromicina.

Em uma modalidade preferida da invenção, o segundo gene marcador é um gene marcador contra-selecionável.

Um marcador contra-selecionável é um gene cuja presença é letal para o organismo hospedeiro sob determinadas circunstâncias, tal como a presença de seu substrato cognato. Marcadores contra-selecionáveis podem ser usados como uma seleção positiva para a perda do plasmideo.

De preferência, o gene marcador contra-selecionável é um gene que restaura a atividade de um gene endógeno não essencial ausente ou deletado. Os marcadores contra- selecionáveis mais usados são os genes que conferem sensibilidade à sacarose, estreptomicina ou ácido fusárico. Eles têm sido usados para construir cepas mutantes ou de vacina em várias cepas bacterianas. Para detalhes veja a revisão por Reyrat e colaboradores, 1998, Infection and Immunity. Marcadores contra-selecionáveis que podem ser usados em Clostridia incluem genes que proporcionam sensibilidade à 5-fluoro-uracila (5-FU), gama-glutamil hidrazida (GBS) ou 8-aza-2,6-diaminopurina (8ADP).

Em uma modalidade preferida, o marcador contra- selecionável é o gene upp, o qual codifica f osf oribosil- transferase de uracila, que promove a transformação de 5- fluoro-uracila (5-FU) em um produto tóxico. Células tendo atividade de Upp não podem crescer sobre um meio com 5-FU.

0 uso desse marcador contra-selecionável é particularmente útil quando as Clostridia transformadas são Aupp e, conseqüentemente, são capazes de crescer sobre um meio compreendendo 5-FU antes de transformação e após a eliminação do vetor. Cepas tendo eliminado o vetor podem ser positivamente selecionadas.

Mutantes supressores que podem surgir no gene upp na presença de 5-FU podem, algumas vezes, levar a falsas suposições com relação à perda do plasmideo. Em uma modalidade preferida da invenção, o vetor compreende, além disso, um terceiro marcador, preferencialmente um gene de resistência a antibiótico que permite uma segunda seleção de cepas sensíveis ao antibiótico. Essa seleção negativa pode ser usada além da seleção positiva baseada no gene upp.

Em uma modalidade preferida da invenção, o vetor é eliminado através de digestão com endonucleases após o evento de recombinação ter ocorrido. De preferência, o vetor abriga seqüências de DNA que são reconhecidas por endonucleases de restrição e que estão, ao mesmo tempo, ausentes do genoma da espécie Clostridium usada. Portanto, o vetor é especificamente destruído sem perda de integridade do genoma de Clostridium.

Endonucleases de restrição são enzimas que clivam moléculas de DNA no local de seqüências de base específicas, o sítio de endonuclease de restrição. Aqueles habilitados na técnica serão capazes de determinar qual sítio de endonuclease de restrição está ausente do genoma da cepa de Clostridium de interesse. Possíveis endonucleases de restrição que podem ser aplicadas para C. acetobutylicum são AscI, FseI, Not I, SfiI, SrfI. Em outra modalidade, meganucleases, as quais reconhecem grandes sítios alvo de DNA (12-45 bp) , tais como I-SceI, HO ou I- CreIf podem ser usadas.

Em uma modalidade preferida da invenção, a cepa de Clostridium a ser transformada abriga sobre seu genoma, pelo menos um gene que codifica endonuclease, o qual reconhece o sítio de endonuclease de restrição que está presente sobre o vetor. Opcionalmente, expressão da endonuclease de restrição está sob o controle de um promotor induzível.

Um promotor induzível é um elemento de DNA que permite a expressão condicional de uma seqüência alvo através da adição do indutor correspondente. Por exemplo, um sistema de promotor induzível em Clostridium que é conhecido por aqueles habilitados na técnica é descrito em Girbal e colaboradores, 2003, Appl. Env. Microbiol. 69:4985-8.

Após o evento de recombinação ter ocorrido e antes de seleção de cepas que tenham eliminado o vetor, a expressão da endonuclease de restrição pode ser induzida. A endonuclease de restrição clivará o vetor presente nas Clostridia, levando à sua eliminação. Opcionalmente, o gene que codifica a endonuclease de restrição pode ser inserido no genoma antes de introdução do vetor na cepa.

Em outra modalidade da invenção, o gene que codifica endonuclease de restrição pode também aumentar a freqüência de recombinação antes da eliminação do plasmideo através do aumento da quantidade de DNA linear nas células, o qual é conhecido por se recombinar melhor do que o DNA circular.

Em uma modalidade particular da invenção, o primeiro gene marcador é um gene de resistência a antibiótico introduzido no meio do cassete de substituição.

Em uma modalidade especifica da invenção, esse primeiro gene marcador pode ser removido do genoma das cepas de Clostridium transformadas. Em particular, o primeiro gene marcador pode ser envolvido por dois sítios alvo de recombinase e, então, ser eliminado pela ação de uma recombinase, após o evento de recombinação homóloga ter ocorrido.

Em uma modalidade vantajosa da invenção, a recombinase é expressa por um segundo vetor que traz o gene correspondente, o referido vetor sendo introduzido nas Clostridia através de transformação. De preferência, os sítios alvo de recombinase são as seqüências FRT. Recombinase FLP de Saccharomyces cerevisiae é ativa em uma seqüência de DNA de 34 pares de base particular, denominada a seqüência FRT (para o alvo da recombinase FLP). Quando dois desses sítios FRT estão presentes, a enzima FLP cria rupturas dupla fita nas fitas de DNA, troca as extremidades do primeiro FRT por aquelas da segunda seqüência alvo e, então, prende novamente as fitas trocadas. Esse processo leva à deleção do DNA o qual repousa entre os dois sítios.

Em uma forma específica de realização da invenção, seqüências homólogas às regiões selecionadas em torno da seqüência de DNA alvo podem compreender mutações em até 10% dos pares de base que compõem o fragmento de DNA usado para o evento de recombinação.

Em uma modalidade vantajosa da invenção, as cepas de Clostridium a serem transformadas sofrem deleção de genes que codificam endonucleases de restrição. Essas cepas apresentam a vantagem de que elas são prontamente transformáveis sem qualquer metilação prévia do plasmídeo in vivo.

Em outra modalidade vantajosa da invenção, as cepas de Clostridium a serem transformadas sofrem deleção de genes que codificam as DNAses extracelulares. Em outra modalidade da invenção, as Clostridia a serem transformadas sofrem deleção do gene upp.

Em outra modalidade vantajosa da invenção, as cepas de Clostridium a serem transformadas são escolhidas dentre Clostridium acetobutylicum, Clostridium bejeirinckii, Clostridium saccharoperbutylacetonicum, Clostridium butylicum, Clostridium butyricum, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Clostridium sporogenes, Clostridium thermocellum, Clostridium saccharolyticum (agora Thermoanaerobacter saccharolyticum), Clostridium thermosulfurogenes (agora Thermoanaerobacter thermosulfurigenes), Clostridium thermohydrosulfuricum (agora Thermoanaerobacter ethanolicus).

A cepa de Clostridium preferida é Clostridium acetobutylicum.

Em uma modalidade preferida da invenção, a cepa de Clostridium acetobutylicum a ser transformada é uma cepa Δ Cacl5, que sofreu deleção do gene que codifica a endonuclease de restrição Cac 8241. Essa cepa apresenta a vantagem de que ela é prontamente transf ormável sem qualquer metilação prévia do plasmideo in vivo.

Em outra modalidade preferida da invenção, a cepa de Clostridium acetobutylicum a ser transformada é uma cepa cujo gene upp foi deletado, denominada Δ upp. Como uma conseqüência, a transformação da cepa com um vetor trazendo o gene upp permite a seleção de cepas sensíveis a meio com 5-FU e, então, a seleção positiva de cepas tendo perdido o plasmídeo que não são mais sensíveis a meio com 5-FU.

A cepa de Clostridium acetobutylicum a ser transformada também pode ser Δ Cacl5 Δ upp.

O processo é vantajosamente usado para substituição sucessiva de dois ou mais genes alvo através de recombinação homóloga na mesma cepa de Clostridium.

A presente invenção também se refere a uma cepa de Clostridium recombinante passível de ser obtida através do processo de acordo com a invenção. Vantajosamente, o processo de acordo com a invenção pode ser usado para obter cepas de Clostridium recombinantes em que o gene cacl5 foi deletado (cepa Acacl5) , em que o gene upp foi deletado (cepa Aupp) e em que ambos os genes, cacl5 e upp, foram deletados (cepa ACacl5 Aupp).

A presente invenção também se refere ao vetor para transformação da cepa, tal como descrito acima.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura 1 : Mapa do vetor pUC18-FRT-MLS2.

Figura 2 : Mapa do vetor pCons2-l.

Figura 3 : Mapa do vetor pCIP2-l. Figura 4 : Mapa do vetor pCons::UPP. Figura 5 : Mapa do vetor pCLFl.

Figura 6 : Representação esquemática do método de deleção para Clostridia.

As seguintes etapas são realizadas sucessivamente:

A - Amplificação de duas regiões selecionadas em torno da seqüência de DNA alvo; 1, 2, 3, 4 representam primers de PCR.

B - Clonagem dos fragmentos de PCR obtidos no vetor de clonagem pTOPO.

C - Inserção de um marcador no sitio de restrição StuI, presente nos primers de PCR.

D - Clonagem do cassete de substituição no sitio BamHI de pCONS 2.1 : construção do vetor pREP cio Y.

E- Transformação de Clostridium com o vetor pREP cio Y.

F - Integração cromossômica do cassete de substituição através de "crossover" duplo durante subcultura.

G - Seleção de clones com fenotipos EryR e Thiams.

H- Análise por PCR para verificar a substituição de gene e perda do plasmideo OR.

D' - Clonagem do cassete de substituição no sitio BamHI de pCONS::UPP : Construção do vetor pREP cio Y:UPP. E' - Transformação de Clostridium Aupp com o vetor ρREP cloY: UPP.

F1 - Integração cromossômica do cassete de substituição através de "crossover" duplo durante subcultura.

G1 - Seleção de clones com os fenotipos Erya e 5-FUR (Thiams).

H' - Análise por PCR para verificar a substituição de gene e perda do plasmideo.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Construção de vetores

1.1 Construção do pUC18-FRT-MLS2

Esse plasmideo contém um gene MLSr funcional em Clostridia e flanqueado por dois sítios FRT e dois sítios StuI e é útil para a construção dos cassetes de substituição. Reação em cadeia de polimerase inversa (IPCR) foi realizada com DNA polimerase Pwo com pKD4 como um plasmideo modelo (Datsenko e Wanner, 2000) e oligonucleotídeos PKD4.1 e PKD4.2 como primers para amplificar a região do plasmideo com os sítios FRT, mas sem o marcador Kmr. Esse fragmento com extremidade cega foi depois ligado ao gene MLSr obtido após uma digestão com JiindIII do plasmideo pETSPO (Harris e colaboradores, 2002, J. Bacteriol) e tratamento com Klenow. 0 plasmideo correspondente (pKD4-Eryl) foi, então, usado como um template para amplificar o gene MLSr flanqueado por dois sítios FRT e dois sítios StuI em uma reação de PCR usando os oligonucleotídeos FRT-MLSR-F e FRT-MLSR-R como primers e DNA polimerase Pwo. Esse fragmento foi diretamente clonado no pUC18 digerido com Sma I para produção do plasmídeo pUC18-FRT-MLS2 (Figura 1).

Primers de PCR:

PKD4.1 (SEQ ID N°l) :

5' -ctggcgccctgagtgcttgcggcagcgtgagggg-3' PKD4.2 (SEQ ID N°2):

5' -agcccggggatctcatgctggagttcttcgccc-3' FRT-MLSR-F (SEQ ID N°3):

5' -tacaggccttgagcgattgtgtaggctggagc-3' FRT-MLSR-R (SEQ ID N°4):

5' -aacaggcctgggatgtaacgcactgagaagccc-3' 1.2 Construção de pCons 2.1

Esse plasmídeo contém uma origem de replicação pIM13 funcional em Clostridia (mecanismo de replicação de rolamento circular), um gene catP que confere resistência ao tianfenicol e um sítio BamHI único para a clonagem do cassete de substituição. Esse plasmídeo foi construído em um procedimento em duas etapas a partir do plasmídeo pETSPO (Harris e colaboradores, 2002, J. Bacteriol) para remover parte de um poli-ligante e, dentre outros, um sitio BamHI e um EcoRI. IPCR foi realizada com DNA polimerase Pwo com pETSPO como um plasmideo modelo e oligonucleotideos PCONSAccI e PCONSEcoRI como primers, e o produto de PCR foi fosforilado e ligado. Após transformação de E. coli, o plasmideo pConsO foi obtido. Esse plasmideo foi, então, digerido com BamHI para remover o cassete spoOA, o fragmento de DNA apropriado purificado e ligado para produção do plasmideo pCons2-l. O mapa do pCons2-l é fornecido na Figura 2.

Primers de PCR:

PCONSAccI (SEQ ID N°5):

5'- ccggggtaccgtcgacctgcagcc-3'

PCONSEcoRI (SEQ ID N°6):

5'- gaattccgcgagctcggtacccggc-3'

1.3 Construção do vetor pCIP 2-1

Nessa construção, a origem de replicação pIMl3 do pCons2-l foi substituída pela origem de replicação do plasmideo pSOLl, um plasmideo tendo um mecanismo de replicação Θ. Para essa finalidade, a origem de replicação do pSOLl foi amplificada por PCR com DNA polimerase Pwo usando DNA total de Clostridium acetobutylicum como um modelo e oligonucleotideos ori-3-D e ori-4-R como primers. Esse produto de PCR foi clonado no pCR-Blunt II-TOPO e o plasmídeo resultante digerido por EcoRI e o fragmento de 2,2 kb foi purificado. Similarmente, o plasmideo pCons2.1 foi digerido por EcoRI e o fragmento de 2,4 kb purificado e ligado no fragmento EcoRI de 2,2 kb contendo a origem de replicação do pSOLl para proporcionar o plasmideo pCIP2-l (Figura 3).

Primers de PCR:

0RI-3-D (SEQ ID N°7):

5' -ccatcgatgggggtcatgcatcaatactatcccc-3' 0RI-4-R (SEQ ID N°8):

5'-gcttccctgttttaatacctttcgg-3' 1.4 Construção do vetor pCons::upp

O gene upp, com seu próprio sitio de ligação ribossômica (rbs) foi clonado no pCons2.1 no sitio BcgI exatamente a jusante do gene CatP de forma a construir um óperon artificial com upp expresso sob o controle do promotor de CatP. Dessa forma, não foi introduzida nenhuma região homóloga gue permitiria integração cromososmica do gene upp na cepa Acacl5 Aupp em outros experimentos de deleção, os quais usam o gene upp como um marcador contra- selecionável para perda de plasmideo. 0 gene upp, com seu rbs, foi amplificado por PCR (Pfu) a partir de DNA genômico de C. acetobutylicum usando os oligonucleotideos REP-UPP F e REP-UPP R como primers. 0 produto de PCR de 664 bp foi digerido por PvuII e clonado no pCons2.1 digerido por BcgI e tratado com DNA polimerase T 4 para cegar as extremidades. Dessa forma, o vetor replicativo pCons::UPP (veja figura 4) foi obtido.

Primers de PCR:

REP-UPP F (SEQ ID N°9):

5' -aaaacagctgggaggaatgaaataatgagtaaagttacac-3' REP-UPP R (SEQ ID N°10):

5' -aaaacagctgttattttgtaccgaataatctatctccagc-3'

1.5 Construção do vetor pCLFl

O gene FLPl de S. cerevisiae que codifica a recombinase FLP foi clonado no vetor pCons2.1 sob o controle do promotor e RBS do gene de tiolase (thl) de C. acetobutylicum, permitindo alta expressão nesse organismo.

O gene FLPl foi amplificado por PCR (Pfu) usando os oligonucleotideos FLPl-D e FLPl-R como primers e o plasmideo pCP20 (Datsenko e Wanner, 2000) como um modelo.

Primers de PCR:

FLPl-D (SEQ ID N°ll):

5' -aaaaggatccaaaaggagggattaaaatgccacaatttggtatattatgt aaaacaccacct-3'

FLPl-R (SEQ ID N°12):

5' -aaatggcgccgcgtacttatatgcgtctatttatgtaggatgaaaggta-3' FLPl-D tem uma extensão 5' incluindo um sitio BamHI e a seqüência RBS de thl. FLPl-R introduziu um sitio SioI em 3' do produto de PCR. O produto de PCR foi digerido por BamRI e SfoI e diretamente clonado no vetor de expressão pSOS95 que tinha sido digerido com as mesmas enzimas, proporcionando o plasmideo pEX-FLPl (6281 bp). O fragmento SalI (1585 bp) do pEX-FLPl contendo o cassete de expressão FLPl foi clonado no sitio SalI do pC0NS2.1 para obter o plasmideo pCLFl (4878 bp) (Figura 5). Exemplo 2: Deleção do gene cacl502 que codifica a enzima de restrição cacS241 em Clostridium acetobutylicwn.

Veja figura 6 para uma representação esquemática do método.

Dois fragmentos de DNA que envolvem o gene de codificação de Cac824I (CAC1502) foram amplificados por PCR com DNA polimerase Pwo usando DNA total de C. acetobutylicum como modelo e dois pares específicos de oligonucleotídeo como primers (veja tabela 2). Usando pares de primers CAC IB-CAC 2 e CAC 3-CAC 4B, fragmentos de DNA de 1493 bp e 999 bp foram obtidos, respectivamente. Ambos os primers, CAC IB e CAC 4B, introduzem um sitio BamHIf enquanto que os primers CAC 2 e CAC 3 têm seqüências estendidas 5' complementares as quais introduzem um sítio StuI. Fragmentos de DNA CAC IB-CAC 2 e CAC 3-CAC 4B foram unidos em um experimento de fusão por PCR com os primers CAC IB e CAC 4B e o fragmento resultante foi clonado no vetor pCR4-TOPO-Blunt para produzir pT0P0:cacl5. No sitio StuI único do pT0P0:cacl5, o fragmento StuI de 1372 bp do pUC18-FRT-MLS2, abrigando o gene de resistência a antibiótico MLSr com seqüências FRT sobre ambos os lados, foi introduzido. 0 cassete de substituição cacl502 obtido após digestão com BamHI do plasmideo resultante foi clonado, no BamHI, no sitio pCons2-l, para produção do plasmideo pREPCAC15 e no pCIP2.1 para produzir pCIPCAC15.

Os plasmideos pREPCAC15 e pCIPCAC15 foram metilados in vivo e usados para transformar C. acetobutylicum através de eletroporação. Após seleção sobre Placas de Petri de clones resistentes à - eritromicina (40 yg/ml), uma colônia de cada transformante foi cultivada durante 24 horas em meio sintético liquido com eritromicina a 40 pg/ml e, então, subcultivado em meio 2YTG liquido sem antibiótico. Diluições apropriadas foram colocadas sobre agar Clostridium reforçado (RCA) com eritromicina a 40 pg/ml. Para selecionar integrantes tendo perdido os vetores pREPCAC15 ou pCIPCAC15, clones resistentes à eritromicina foram colocados em réplica sobre RCA com eritromicina a 40 pg/ml e RCA com tianfenicol a 50 μg/ml. Embora várias colônias com o fenotipo desejado fossem obtidas com os transformantes pREPCAC15, nenhuma de tais colônias foi obtida com os transformantes pCIPCAC15. Isso demonstra que o mecanismo de replicação θ do pCIPCAC15 é menos favorável ao promover "crossover" duplo em C. acetobutylicum do que um mecanismo de rolamento circular. 0 genotipo de clones resistentes à eritromicina e sensíveis ao tianfenicol foi verificado através de análise por PCR (com os primers CAC O e CAC 5 localizados fora do cassete de substituição CAC15 e os primers CAC D e CAC R localizados dentro do cacl502) . Cepas Acacl5::mlsR, as quais perderam pREPCAC15, foram isoladas.

Uma cepa Acacl5::mlsR foi transformada com o vetor pCLFl expressando o gene FLPl que codifica a recombinase Flp de S. cerevisiae. Após transformação e seleção de resistência ao tianfenicol (50 pg/ml) sobre placas de Petri, uma colônia foi cultivada sobre meio líquido sintético com tianfenicol a 50 pg/ml e diluições apropriadas foram colocadas sobre RCA com tianfenicol a 50 pg/ml. Clones resistentes ao tianfenicol foram colocados em réplica sobre RCA com eritromicina a 40 μg/ml e RCA com tianfenicol a 50 pg/ml. O genotipo de clones com sensibilidade à eritromicina e resistência ao tianfenicol foi verificado através de análise por PCR com os primers CAC 0 e CAC 5B.

Duas culturas sucessivas de 24 horas da cepa Acacl5 com sensibilidade à eritromicina e resistência ao tianfenicol foram realizadas de forma a liberar o pCLFl. A cepa Acacl5, a qual perdeu pCLFl, foi isolada de acordo com sua sensibilidade à eritromicina e tianfenicol. A cepa foi denominada C. acetobutylicum MGCAcaclS.

Tabela 2

<table>table see original document page 28</column></row><table> Exemplo 3: Deleção do gene upp que codifica a fosforibosil- transferase de uracila em Clostridium acetobutylicum Acacl5

Dois fragmentos de DNA a montante e a jusante do upp (CAC2879) foram amplificados por PCR com DNA polimerase Pwo usando DNA total de C. acetobutylicum como modelo e dois pares específicos de oligonucleotideos como primers (veja tabela 3). Com os pares de primer UPP I-UPP 2 e UPP 3-UPP 4, fragmentos de DNA de 1103 bp e 1105 bp foram obtidos, respectivamente. Ambos os primers UPP 1 e UPP 4 introduzem um sitio BamHI, enquanto que os primers UPP 2 e UPP 3 têm seqüências estendidas 5' as quais introduzem um sitio StuI. Fragmentos de DNA UPP I-UPP 2 e UPP 3-UPP 4 foram unidos em um experimento de fusão por PCR com os primers UPP 1 e UPP 4 e o fragmento resultante foi clonado no pCR4-T0P0-Blunt para produzir pT0P0:upp. No sitio StuI único do pT0P0:upp, o fragmento StuI de 1372 bp do pUC18-FRT-MLS2, abrigando o gene de resistência a antibiótico MLSr com seqüências FRT sobre ambos os lados, foi introduzido. 0 cassete de substituição upp obtido após digestão por BamHI do plasmideo resultante foi clonado no pCons2-l no sitio BamHI para produzir o plasmideo pREPUPP.

0 plasmideo pREPUPP foi usado para transformar a cepa MGCAcaclõ de C. acetobutylicum através de eletroporaçâo sem metilação prévia in vivo. Após seleção sobre placas de Petri de clones resistentes à eritromicina (40 μg/ml) , uma colônia foi cultivada durante 24 horas em meio sintético liquido com eritromicina a 40 ug/ml e, então, subcultivada em meio liquido 2YTG sem antibiótico. Diluições apropriadas foram colocadas sobre RCA com eritromicina a 40 ug/ml. Para selecionar integrantes tendo perdido o vetor pREPUPP, clones resistentes à eritromicina foram colocados em réplica sobre RCA com eritromicina a 40 ug/ml e RCA com tianfenicol a 50 ug/ml. O genotipo de clones resistentes à eritromicina e sensíveis a tianfenicol foi verificado através de análise por PCR (com os primers UPP 0 e UPP 5 localizados fora do cassete de substituição UPP e os primers UPP D e UPP R localizados dentro do U PP). A cepa Acacl5Aupp: :mlsR, que tinha perdido o pREPUPP, foi isolada.

A deleção prévia de cacl502 foi confirmada conforme anteriormente descrito no primeiro exemplo. A cepa Acacl5 Aupp::mlsR é resistente a 5-FU a 400 μΜ comparado com 50 μΜ para a cepa Acacl5.

A cepa AcaclSAupp:: mlsR foi transformada com o vetor pCLFl expressando o gene FLPl que codifica a recombinase Flp de S. cerevisiae. Após transformação e seleção de resistência ao tianfenicol (50 pg/ml) sobre placas de Petri, uma colônia foi cultivada em meio liquido sintético com tianfenicol a 50 pg/ml e diluições apropriadas foram colocadas sobre RCA com tianfenicol a 50 pg/ml. Clones resistentes ao tianfenicol foram colocados em réplica sobre RCA com eritromicina a 40 pg/ml e RCA com tianfenicol a 50 pg/ml. O genotipo de clones com sensibilidade à eritromicina e resistência ao tianfenicol foi verificado através de análise por PCR com os primers UPP 0 e UPP 5. Duas culturas sucessivas de 24 horas da cepa AcaclSAupp com sensibilidade à eritromicina e resistência ao tianfenicol foram realizadas de forma a liberar o pCLFl. A cepa Acacl5 Auppr que tinha perdido o pCLFl, foi isolada através de determinação de sua sensibilidade à eritromicina e tianfenicol.

Tabela 3

<table>table see original document page 31</column></row><table> <table>table see original document page 32</column></row><table>

Exemplo 4 Deleção do gene cac3535 com o uso de upp e 5- fluorouracila como uma possível seleção de perda de plasmideo

Dois fragmentos de DNA a montante e a jusante do gene cac3535 que codifica um segundo sistema de modificação- restrição de C. acetobutylicum foram amplificados por PCR com DNA polimerase Pwo usando DNA total de C. acetobutylicum como modelo e dois pares específicos de oligonucleotídeos (veja tabela 4). Com os pares de primer RM I-RM 2 e RM 3-RM 4, fragmentos de DNA de 1 kbp e O, 9 kbp foram obtidos, respectivamente. Ambos os primers RM 1 e RM 4 introduzem um sítio BamRI, enquanto que os primers RM 2 e RM 3 têm seqüências estendidas 5' complementares que introduzem um sítio StuI. Fragmentos de DNA RM I-RM 2 e RM 3-RM 4 foram unidos em um experimento de fusão por PCR usando os primers RM 1 e RM 4 e o fragmento resultante foi clonado no vetor pCR4-T0P0-Blunt para produzir o plasmideo pTOPO:cac3535. No sítio StuI único do pTOPO:cac3535, o fragmento StuI de 1372 bp do pUC18-FRT-MLS2, abrigando o gene de resistência a antibiótico MLSr com seqüências FRT sobre ambos os lados, foi introduzido. 0 cassete de substituição CAC3535 obtido após digestão com BamHI do plasmideo resultante foi clonado no pCons::upp no sitio BamHI para proporcionar o plasmideo pREPCAC3535::upp.

0 plasmideo pREPCAC3535::upp foi usado para transformar a cepa MGCAcacl5 Aupp de C. acetobutylicum através de eletroporação. Após seleção de clones resistentes à eritromicina (40 pg/ml) sobre placas de Petri, uma colônia foi cultivada durante 24 horas em meio sintético liquido com eritromicina a 40 pg/ml e 100 μl de cultura não diluida foram colocados sobre RCA com eritromicina a 40 yg/ml e 5-FU a 400 μΜ. Colônias resistentes à eritromicina e 5-FU foram colocadas em réplica sobre RCA com eritromicina a 40 pg/ml e -RCA com tianfenicol a 50 pg/ml para verificar se a resistência à 5- FU está associada à sensibilidade ao tianfenicol. 0 genotipo de clones resistentes à eritromicina e sensíveis ao tianfenicol foi verificado através de análise por PCR (com os primers RM 0 e RM 5 localizados fora do cassete de substituição cac3535 e os primers RM D e RM R localizados dentro do gene cac3535). Dessa forma, a cepa Acacl5Aupp Acac35::mlsR, que perdeu o pREPCAC3535::upp, foi isolada. Tabela 4

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REFERÊNCIAS

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Claims (29)

1. Processo para a substituição de uma seqüência de DNA alvo através de recombinação homóloga em Clostridia caracterizado pelo fato de compreender: - transformação da referida cepa com um vetor compreendendo: - uma origem de replicação que permite sua replicação em Clostridia, e - um cassete de substituição compreendendo um primeiro gene marcador envolvido por duas seqüências homólogas às regiões selecionadas em torno da seqüência de DNA alvo, permitindo a recombinação do cassete, e - um segundo gene marcador, seleção de cepas, tendo integrado em seu genoma o referido cassete, que expressam o primeiro gene marcador, - seleção de cepas, tendo eliminado o referido vetor, que não expressam o segundo gene marcador.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de o segundo gene marcador ser um gene de resistência a antibiótico.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de o segundo gene marcador ser um marcador contra-selecionável.

4. Processo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de o marcador contra-selecionável ser um gene que restaura a atividade de um gene não essencial ausente ou deletado.

5. Processo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de o marcador contra-selecionável ser o gene upp.

6. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de o vetor compreender um terceiro marcador que permite uma seleção negativa de cepas tendo eliminado o referido vetor.

7. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de o vetor ser eliminado através de digestão com endonucleases.

8. Processo, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de o vetor abrigar seqüências de DNA que são reconhecidas por endonucleases de restrição e que estão, ao mesmo tempo, ausentes do genoma da cepa de Clostridium usada.

9. Processo, de acordo com as reivindicações 7 ou 8, caracterizado pelo fato de a cepa de Clostridium usada abrigar em seu genoma pelo menos uma endonuclease, especifica para sítios de restrição presentes no vetor, opcionalmente expressa sob o controle de um promotor induzivel.

10. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de o primeiro gene marcador ser um gene de resistência a antibiótico.

11. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de o primeiro gene marcador ser envolvido por dois sítios alvo de recombinase.

12. Processo, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de o primeiro gene marcador ser eliminado através da ação de uma recombinase após o evento de recombinação homóloga ter ocorrido.

13. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 ou 12, caracterizado pelo fato de a referida recombinase ser expressa por um gene trazido por um segundo vetor introduzido na cepa.

14. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 13, caracterizado pelo fato de os referidos sítios alvo de recombinase serem seqüências FRT e a referida recombinase ser a recombinase FLP.

15. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de as referidas seqüências homólogas às regiões em torno da seqüência de DNA alvo compreenderem mutações em até 10% dos pares de base usados para o evento de recombinação.

16. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que as Clostridia a serem transformadas sofreram deleção para genes que codificam endonuclease de restrição.

17. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que as Clostridia a serem transformadas sofreram deleção para genes que codificam DNAse.

18. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de que as Clostridia a serem transformadas sofreram deleção para gene upp.

19. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo fato de as cepas de Clostridium serem escolhidas dentre Clostridium acetobutylicum, Clostridium bejeirinckii, Clostridium saccharoperbutylacetonicum, Clostridium butylicum, Clostridium butyricum, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Clostridium sporogenes, Clostridium thermocellum, Clostridium saccharolyticum (agora Thermoanaerobacter saccharolyticum) , Clostridium thermosulfurogenes (agora Thermoanaerobacter thermosulfurigenes) , Clostridium thermohydrosulfuricum ('agora Thermoanaerobacter ethanolicus).

20. Processo, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de a cepa de Clostridium ser Clostridium acetobutylicum.

21. Processo, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a cepa de Clostridium acetobutylicum a ser transformada é Δ cacl5.

22. Processo, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a cepa de Clostridium acetobutylicum a ser transformada é Δ upp.

23. Processo, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a cepa de Clostridium acetobutylicum a ser transformada é Δ Cacl5 Aupp.

24. Processo para substituição de dois ou mais genes alvo através de recombinação homóloga em uma mesma cepa de Clostridium caracterizado pelo fato do processo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 23, ser realizado sucessivamente duas ou mais vezes.

25. Cepa de Clostridium recombinante caracterizada pelo fato de ser passível de ser obtida através do processo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 24.

26. Cepa de Clostridium recombinante, de acordo com a reivindicação 25, caracterizada pelo fato de que o gene cacl5 foi deletado.

27. Cepa de Clostridium recombinante, de acordo com a reivindicação 25, caracterizada pelo fato de que o gene upp foi deletado.

28. Cepa de Clostridium recombinante, de acordo com a reivindicação 25, caracterizada pelo fato de que ambos os genes cacl5 e upp foram deletados.

29. Vetor caracterizado pelo fato de ser conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 15.