FR2982276A1 - Cassette d'expression pour modifier le genome des bacteries et pour modifier un vecteur dans une souche bacterienne - Google Patents

Abstract

L'invention concerne une cassette d'expression pour modifier le génome des bactéries, par exemple celui d'Escherichia coli, ou pour modifier un vecteur dans une souche bactérienne. La présente invention concerne également un procédé de modification du génome bactérien par recombinaison homologue, ainsi qu'un procédé de modification d'un vecteur par recombinaison homologue dans une souche bactérienne.

Description

L'invention concerne une cassette d'expression pour modifier le génome des bactéries, par exemple celui d'Escherichia coll, ou pour modifier un vecteur dans une souche bactérienne. La présente invention concerne également un procédé de modification du génome bactérien par recombinaison homologue, ainsi qu'un procédé de modification d'un vecteur par recombinaison homologue dans une souche bactérienne. Les bactéries sont actuellement de plus en plus utilisées en tant que cellules hôtes pour produire des molécules d'intérêt industriel. Les souches de bactéries peuvent par exemple être modifiées pour produire des acides aminés ou des protéines hétérologues d'intérêt, du biocarburant, des molécules à visée thérapeutique (médicaments, antibiotiques, vaccins anti-cancer notamment). Ainsi, les molécules d'intérêt produites par les bactéries peuvent être de natures très variées, et il est donc souhaitable de disposer d'outils de modification de l'ADN efficaces pour pouvoir optimiser la production de ces molécules.

La modification de l'ADN d'un organisme nécessite la sélection facile de l'organisme modifié. L'ADN exogène utilisé pour modifier le génome de l'organisme contient généralement un gène de résistance à un antibiotique qui permet la sélection du clône recombinant, au moyen d'un milieu de culture contenant ledit antibiotique. Ces cassettes de résistance doivent être enlevées du génome receveur après modification afin d'éviter que l'organisme ne conserve sa résistance audit antibiotique. Des solutions ont été proposées pour permettre le retrait de ces cassettes, mais la plupart de ces solutions laissent néanmoins des « cicatrices » au sein de l'ADN de l'organisme, c'est-à-dire un ou plusieurs nucléotides exogènes, issus de la construction exogène de départ et dont l'intégration au génome endogène n'était pas souhaitée. Dans le cas où plusieurs modifications de l'ADN doivent être réalisées, la présence de multiples cicatrices sur le génome peut entraîner des remaniements génomiques indésirables. Un certain nombre de procédés de modification de l'ADN de l'art antérieur (e.g. Philippe et al., 2003) décrit l'utilisation de vecteurs suicides, notamment de plasmides suicides. Les plasmides suicides présentent la particularité de ne pas être réplicatifs dans l'organisme hôte, de sorte que les séquences d'intérêt portées par ces plasmides ne s'expriment que si elles sont intégrées au génome de l'organisme hôte. Néanmoins, l'utilisation de tels plasmides suicides présente également l'inconvénient de laisser des cicatrices au sein de l'ADN de l'organisme.

Alternativement, si aucune cicatrice n'est laissée, des expérimentations lourdes (e.g. Southern Blot, séquençages de nombreux clones) sont nécessaires pour trouver le clone recombinant attendu. Il faut noter, en outre, que de tels plasmides suicides sont longs à construire car ils nécessitent des clonages par enzymes de restriction. Les multiples inconvénients mentionnés ci-dessus conduisent au souhait grandissant des sociétés de biotechnologies d'utiliser des systèmes alternatifs, qui n'utilisent pas de cassettes de résistance aux antibiotiques ou de plasmides suicide, c'est-à-dire qui ne laissent pas de cicatrices sur l'ADN et qui permettent d'obtenir la souche attendue en un temps très court. Plusieurs systèmes basés sur des techniques de sélection/contre sélection positive s'inscrivent dans ce contexte. L'un de ceux-ci utilise le gène sacB. L'insertion de ce gène dans le génome bactérien rend la bactérie sensible au saccharose. Le remplacement ultérieur de sacB par la séquence d'intérêt élimine la sensibilité au saccharose. Les bactéries qui poussent sur un milieu contenant du saccharose sont donc des bactéries ayant incorporées la séquence d'intérêt (Gay P et al., 1985), à la place du gène sacB. Cependant, ce système comporte plusieurs inconvénients. D'une part, il nécessite de préparer des milieux de culture minimum dont le temps de préparation est important et sur lesquels les bactéries poussent très lentement. En outre, cette technique génère un grand nombre de faux-positifs (mutants spontanés), nécessitant ensuite un lourd travail de sélection et de repiquages pour isoler le clone bactérien d'intérêt. D'autres systèmes utilisent le gène galK (Warming et al., 2005), le gène rpsL (Rivero-Muller A et al., 2007), le gène thyA (Wong QN et al., 2005) ou le gène to/C (DeVito JA, 2008) comme gènes de sélection/contre-sélection. Ces systèmes présentent également des inconvénients. Ils nécessitent la mise en oeuvre de milieux de culture contenant des molécules coûteuses (colicine dans le cadre du système toIC) ou de milieux de culture minimum, entraînant une croissance lente des bactéries et donc une expérimentation étalée sur plusieurs jours ou semaines. En outre, toutes les manipulations doivent se faire dans des souches mutées pour ces gènes, c'est-à- dire des souches galK-, thyA- ou toIC-. Ainsi, il faut d'abord déléter une souche bactérienne puis réintroduire le gène dans la bactérie modifiée, ce qui constitue une procédure longue et coûteuse.

La présente invention s'inscrit dans un contexte de sélection/contre sélection positive de clones recombinants, utilisant un promoteur inductible, plus précisément le promoteur de l'opéron arabinose, appelé promoteur pBAD. Le promoteur pBAD est issu de l'opéron arabinose d'Escherichia coll. La régulation de l'opéron via le promoteur pBAD est décrite dans l'article de Smith et al. (1978). Pour être fonctionnel, ce promoteur nécessite notamment la présence du produit du gène ara bi n ase C (araC). L'opéron arabinose peut être régulé négativement ou positivement par la protéine AraC. Dans un milieu de culture présentant de l'arabinose, le produit du gène araC est capable d'activer la transcription des gènes araB, araA et araD. En présence de glucose par contre, la transcription est réprimée par cette même protéine arabinase C.

L'utilisation du promoteur inductible de l'opéron arabinose est notamment décrite dans W09811231 et W02008040387. Egalement, l'article de Le Roux et al. (2007) décrit l'utilisation d'un vecteur suicide comprenant un gène de résistance au chloramphénicol et un gène cytotoxique (le gène ccdB) sous contrôle d'un promoteur pBAD. Ces vecteurs suicides sont utilisés pour invalider des gènes candidats chez la bactérie Vibrio spiendidus, présente dans les sédiments marins. D'une part, la méthode décrite dans cet article utilise la technologie du vecteur suicide, qui présente les inconvénients mentionnés plus haut de laisser des cicatrices dans le génome transformé. D'autre part, cette méthode n'est pas suffisamment précise pour produire des mutants ponctuels rapidement. Enfin, les inventeurs se sont rendus compte que cette construction qui comprend un gène codant pour l'arabinase C n'est pas suffisamment efficace pour constituer une technologie de choix rapide et facile à mettre en oeuvre pour modifier des entérobactéries. L'article de Roux et al. (2005) décrit une cassette d'ADN linéaire double brin introduite dans le génome de la bactérie E. coli en utilisant la technologie Àred.

Cette cassette consiste en un gène de résistance au chloramphénicol, un gène araC et le promoteur pBAD. Insérée en amont d'un gène cible dont on souhaite procéder à l'analyse fonctionnelle (e.g. un gène cytotoxique ou un gène essentiel), cette cassette permet de réprimer ou d'activer l'expression du gène endogène. Cette cassette fournit une alternative aux méthodes conventionnelles d'inactivation des gènes endogènes, en vue de l'étude de leur fonction dans la bactérie. L'article ne s'intéresse pas à la production des molécules d'intérêts, notamment à l'insertion de séquences exogènes en vue de leur production par la bactérie. En outre, la construction présente l'inconvénient de comprendre un gène codant pour l'arabinase C. Elle constitue un outil permettant l'étude des gènes mais elle ne constitue pas un outil de contre- sélection puis sélection de clones recombinants. Tel que cela ressort notamment des articles ci-dessus décrits, le promoteur pBAD a toujours été décrit en association et à proximité d'un gène codant pour l'arabinase C dont la présence est nécessaire au fonctionnement du promoteur. Les inventeurs se sont néanmoins rendus compte que la présence d'une séquence codant pour AraC à proximité du promoteur pBAD dans une cassette d'expression utilisée comme outil de sélection et contre-sélection positive de clones recombinants avait le désavantage de présenter une activité résiduelle, ce même en l'absence d'arabinose. Cela conduit à diminuer l'efficacité de tout procédé de production de souches recombinantes basée sur l'utilisation de pBAD.

La présente invention propose une cassette d'expression et un procédé de modification de l'ADN qui ne présentent pas les inconvénients ci-dessus mentionnés. Notamment, la cassette d'expression et le procédé de la présente invention permet d'obtenir une modification de l'ADN (i.e. génome de l'organisme receveur ou vecteur), sans laisser de cicatrices à l'endroit de la modification. Cela présente l'avantage d'éviter des insertions nucléotidiques indésirables. En outre, cela présente l'avantage de permettre une meilleure maîtrise de l'outil de production de molécules d'intérêt, en particulier le génome de la souche bactérienne. De part l'utilisation de la cassette d'expression objet de la présente 15 invention, le procédé de la présente invention présente l'avantage de pouvoir générer une souche recombinante, alternativement un vecteur d'intérêt, en un temps très court. En outre, le procédé de la présente invention ne nécessite pas l'utilisation de milieu minimum, ce qui présente l'avantage d'éviter de générer des faux-positifs et 20 d'obtenir les organismes ou vecteurs recombinants en un temps très court. Il faut noter également que le procédé de la présente invention met en oeuvre des réactifs, notamment milieux de culture, peu coûteux et/ou faciles à préparer. Egalement la cassette d'expression de la présente invention présente 25 une taille qui la rend facilement manipulable. Description de l'invention Cassette d'expression La présente invention concerne une cassette d'expression pour la 30 modification par recombinaison homologue du génome d'une souche bactérienne présentant un génotype araC+, par exemple Escherichia coli, ou pour la modification par recombinaison homologue d'un vecteur dans ladite souche, ladite cassette comprenant : - une séquence nucléotidique codant pour un marqueur, 35 - un promoteur pBAD, et - une séquence nucléotidique codant pour une protéine cytotoxique sous contrôle dudit promoteur pBAD, caractérisée en ce que ladite cassette ne comprend pas de séquence nucléotidique codant pour l'arabinase C.

Par « cassette d'expression », on entend une séquence nucléotidique comprenant des éléments qui permettent de faire produire un polypeptide par une cellule hôte et des éléments nécessaires à la régulation de cette expression. Selon la présente invention, la cassette d'expression est un outil de biologie moléculaire, qui permet la modification du génome bactérien ou qui permet la 10 modification d'un vecteur, par exemple un plasmide. Dans la présente invention, on utilise les techniques classiques de biologie moléculaire telles que décrites par Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2000). Selon la présente invention, la cassette comprend une séquence 15 nucléotidique codant pour un marqueur, un promoteur pBAD et une séquence nucléotidique codant pour une protéine cytotoxique. Les cassettes d'expression, selon la présente invention, peuvent en outre inclure toute autre séquence nécessaire à l'expression des polypeptides ou des polynucléotides comme par exemple des éléments de régulation ou des séquences signal permettant la sécrétion des 20 polypeptides produits par l'organisme hôte. On peut notamment utiliser toute séquence de régulation permettant d'augmenter le niveau d'expression de la séquence codante insérée dans la cassette d'expression. Selon l'invention, on peut notamment utiliser, en association avec la séquence de régulation promotrice, d'autres séquences de régulation, qui sont situées entre le promoteur et la séquence codante, 25 telles que des activateurs de transcription ("enhancer"). Une grande variété de séquences terminatrices sont utilisables dans les cassettes d'expression selon l'invention, ces séquences permettent la terminaison de la transcription. Toute séquence terminatrice fonctionnelle dans l'organisme hôte sélectionné peut être utilisée. 30 La cassette objet de la présente invention comporte donc un promoteur pBAD. Selon la présente invention, par « un promoteur pBAD », on entend un promoteur bactérien inductible comprenant les régions -10, -35 et +1, ainsi qu'au moins un site de fixation pour la protéine arabinase C. Le promoteur utilisé dans la présente invention est inductible et repressible, c'est-à-dire qu'il est activé en 35 présence d'arabinose et réprimé en présence de glucose.

Selon un aspect de l'invention, le promoteur présent dans la cassette objet de la présente invention présente une séquence dont le brin complémentaire s'hybride à SEQ ID NO:1 de manière sélective. Par «séquence qui s'hybride de manière sélective» ou « oligonucléotide qui s'hybride de manière sélective », on entend selon l'invention les séquences qui s'hybrident avec la séquence de référence à un niveau supérieur au bruit de fond de manière significative. Le niveau du signal généré par l'interaction entre la séquence capable de s'hybrider de manière sélective et les séquences de référence est généralement 10 fois, de préférence 100 fois plus intense que celui de l'interaction des autres séquences d'ADN générant le bruit de fond. Les conditions d'hybridation stringentes permettant une hybridation sélective sont connues de l'homme du métier. En général, la température d'hybridation et de lavage est inférieure d'au moins 5°C, par exemple 10°C, au Tm de la séquence de référence à un pH donné et pour une force ionique donnée. Typiquement, la température d'hybridation est d'au moins 30°C pour un polynucléotide de 15 à 50 nucléotides et d'au moins 60°C pour un polynucléotide de plus de 50 nucléotides. A titre d'exemple, l'hybridation est réalisée dans le tampon suivant : 6X SSC, 50 mM Tris-HCI (pH 7.5), 1 mM EDTA, 0.02% PVP, 0.02% Ficoll, 0.02% BSA, 500 pg/ml sperme de saumon denaturé DNA. Les lavages sont par exemple réalisés successivement à faible stringence dans un tampon 2X SSC, 0,1% SDS, à moyenne stringence dans un tampon 0,5X SSC, 01% SDS et à forte stringence dans un tampon 0,1X SSC, 0,1%SDS. L'hybridation peut bien entendu être effectuée selon d'autres méthodes usuelles connues de l'homme du métier. Par « stringence », on entend la rigueur des conditions opératoires 25 (notamment la température et la force ionique) dans lesquelles se déroule une hybridation moléculaire. Le paramètre déterminant dans la spécificité et la réversibilité de l'hybridation moléculaire est le Tm ou température de fusion (melting temperature). C'est la température à laquelle la moitié de l'ADN est sous forme monobrin et l'autre 30 moitié sous forme double brin. Le Tm dépend de nombreux facteurs tels que la longueur du fragment d'ADN considéré, sa richesse en cytosines et guanines et la concentration en sels, notamment en ion Na du milieu réactionnel. En pratique, l'expérimentateur peut créer ou supprimer l'hybridation moléculaire en choisissant une température du milieu réactionnel inférieure, égale ou supérieure au Tm. Les 35 conditions de forte stringence sont celles pour lesquelles la température d'hybridation et de lavage est inférieure d'au moins 5°C et jusqu'à moins 10°C au Tm de la séquence de référence à un pH donné et pour une force ionique donnée. Selon un autre aspect encore de la présente invention, la cassette d'expression comprend un promoteur dont la séquence présente au moins 80% 5 d'identité avec SEQ ID NO:1. Par « identité » ou « nucléotides identiques », on entend des nucléotides invariants ou inchangés entre deux séquences. Ces polynucléotides peuvent présenter une délétion, une addition ou une substitution d'au moins un nucléotide par rapport à la séquence de référence. 10 L'invention concerne aussi une cassette d'expression qui comprend un promoteur dont la séquence présente au moins 85%, 90% et 95% d'identité avec SEQ ID NO:1. Les méthodes de mesure et d'identification du degré d'identité et du degré de similarité entre les séquences d'acides nucléiques sont bien connues de 15 l'homme du métier. On peut employer par exemple Vector NTi Vector NTi 9.1.0, programme d'alignement AlignX (Clustal W algorithm) (Invitrogen INFORMAX, http://www.invitrogen.com). De préférence, on utilise les paramètres par défaut. Selon un autre aspect de l'invention, le promoteur présent dans la cassette objet de la présente invention présente une séquence SEQ ID NO:1. 20 La séquence selon SEQ ID NO :1 comporte 390 nucléotides. Ces 390 nucélotides sont situés du nucléotide 70049 au nucléotide 70438 sur le chromosome de la souche E. coli K12 (numéro d'accession OP00302). Cette séquence de 390 nucléotides comporte cinq sites de fixation de la protéine arabinase C : 70109-70126 (araC activateur), 70130-70147 (araC activateur et represseur), 70184-70201 (araC 25 represseur), 70204-70221 (araC represseur) et 70342-70359 (araC represseur). La cassette objet de la présente invention comporte également une séquence nucléotidique codant pour un marqueur. Par « séquence nucléotidique codant pour un marqueur », on entend une séquence nucléotidique codant pour une protéine marqueur sous contrôle des 30 éléments de régulation fonctionnel dans les souches bactériennes décrites dans la présente invention, notamment E. coll. Les gènes marqueurs sont connus de l'homme du métier. Selon un aspect de la présente invention, la séquence nucléotidique codant pour un marqueur est sélectionnée parmi les gènes de résistance à un 35 antibiotique, les marqueurs colorés, les marqueurs fluorescents et les marqueurs d'auxotrophie. Des exemples de gènes de résistance à un antibiotique sont cat (résistance au chloramphenicol), bla (résistance à l'ampicilline), aad (résistance à la spectinomycine, streptomycine), aphA (résistance à la kanamycine) et tet (résistance à la tétracycline). La cassette objet de la présente invention comporte également une 5 séquence nucléotidique codant pour une protéine cytotoxique sous contrôle dudit promoteur pBAD. En d'autres mots, la cassette comporte un gène cytotoxique sous contrôle dudit promoteur pBAD. Par « gène cytotoxique », on entend tout gène dont l'expression est toxique pour l'organisme hôte ou risque d'interférer avec le métabolisme de celui-ci. Par « protéine cytotoxique », on entend une protéine toxique 10 pour l'organisme qui l'exprime ou qui risque d'interférer avec le métabolisme de celui-ci. Selon la présente invention, ladite protéine est cytotoxique pour la souche bactérienne modifiée, c'est-à-dire qu'elle conduit à sa destruction. En particulier, cela signifie que la souche modifiée ne pousse pas dans des conditions de culture habituelle. 15 Selon un aspect de la présente invention, la séquence nucléotidique codant pour une protéine cytotoxique code pour une protéine choisie dans le groupe consistant en un membre de la famille de toxines de type Rel/ParE (e.g. ReIE_K12, Re1E307, HigB, PasB, StbE, YoeB, Txe, YafQ, ParERK2, ParEl , ParE3), un membre de la famille de toxines de type CcdB/MazF (e.g. CcdBF, CcdBoi57, MazF, YdcE, PemK, 20 ChpBK), un membre de la famille de toxines de type VapC (i.e. VapC, MvpT), un membre de la famille des toxines de type GinA, un membre de la famille de toxines de type Doc, un membre de la famille de toxines de type GinC, un membre de la famille de toxines de type Zeta, un membre de la famille de toxines de type YafO, un membre de la famille de toxines de type HipA, un membre de la famille de toxines de type 25 GinB, un membre de la famille de toxines de type GinD et un membre de la famille de toxines de type VapD. Selon un aspect encore de la présente invention, la séquence nucléotidique codant pour une protéine cytotoxique est une séquence nucléotidique codant pour ccdB. Le gène ccdB code pour une protéine cytotoxique, en d'autres mots un 30 poison, et son activité est naturellement contrée par une protéine antidote (ou antitoxine) appelée CcdA. Néanmoins, la construction de la présente invention ne vise pas l'utilisation d'un système poison - antidote. Ainsi, le gène cytotoxique présent dans la cassette objet de la présente invention n'est pas accompagné du gène codant pour l'antidote. Ainsi, selon l'aspect de l'invention selon lequel la séquence 35 nucléotidique codant pour une protéine cytotoxique est une séquence nucléotidique codant pour ccdB, la cassette d'expression ne comporte par de séquence codant pour ccdA. La cassette d'expression ne comporte pas non plus de séquences codant pour les anti-toxines choisies dans les familles d'anti-toxines de type HigA (HigA, HipB), de type MazE (VapB, MvpA, ChpBl, Peml), de type Phd (Phd, YefM, Axe, PasB, StbD, YafN, ReIB307), de type ReIB (ReIBK12, DinJ, Paal), de type PasA (PasA, YdcD, ParDEDL933), de type FizA, de type FizB, de type FizC, de type FizF, de type VapX, de type FizD, de type Epsilon, de type ParD (ParDRK2), de type FizE, de type FizH, de type FizG, de type FijJ, de type FizK, de type FizL, anti-toxines contrant les effets toxiques des toxines citées ci-dessus, si ces toxines sont utilisées dans la cassette d'expression.

La cassette d'expression selon la présente invention présente l'avantage d'être un outil transitoire qui n'est pas destiné à rester dans le génome bactérien. En effet, selon une première étape, la cassette d'expression s'intègre au génome bactérien, ce qui permet la sélection positive des colonies modifiées en utilisant le marqueur présent dans la construction. Selon une seconde étape, la cassette d'expression est retirée du génome bactérien au profit d'une séquence portant le gène d'intérêt ou la modification d'intérêt ; son absence permet la contre-sélection positive des colonies nouvellement transformées sur un milieu riche contenant de l'arabinose. Ainsi, de manière avantageuse, la souche attendue, c'est-à-dire qui comporte la séquence d'intérêt ou la modification d'intérêt, ne comprend pas de séquence nucléotidique codant pour un marqueur, par exemple un gène de résistance. La construction objet de la présente invention ne comprend pas de séquence nucléotidique codant pour l'arabinase C. Les inventeurs ont constaté en effet que cette absence limite l'activité résiduelle généralement constatée lorsqu'une copie du gène araC est présente dans la cassette. Ainsi, la cassette de la présente invention permet une parfaite maîtrise de l'activation et de la répression du promoteur pBAD : l'expression atteint un niveau élevé en conditions d'induction (en présence d'arabinose) et est totalement bloquée en condition de non-induction (en présence de glucose). Un exemple de séquence codant pour l'arabinase C est donné à SEQ ID NO:23.

La cassette objet de la présente invention est destinée à être utilisée dans une souche bactérienne qui présente un génotype araC+. Ainsi, la cassette peut être utilisée pour modifier toute souche bactérienne sous réserve que cette souche contienne dans son génome une copie du gène codant pour l'arabinase C. A titre indicatif de souches bactériennes présentant un génotype araC+, 35 on peut citer à titre non limitatif Escherichia coli, Kiebsiella, Shigella, Salmonella, Citrobacter, Enterobacter, Cronobacter, Pantoea, Erwinia, Pectobacterium, Yersinia, Serratia. Selon un aspect de la présente invention, la cassette d'expression présente une taille inférieure à 2500 paires de base, de préférence inférieure à 2000pb ou 1900pb. L'insertion de la cassette selon l'invention dans le génome bactérien ou dans un plasmide étant réalisée par recombinaison homologue, il est ainsi avantageux de disposer d'une cassette de petite taille qui est donc plus facilement manipulable. La présente invention est basée sur la « recombinaison homologue ». La recombinaison homologue est un processus qui permet d'une part d'invalider un gène endogène, par perte physique de la séquence du gène ou d'une partie de la séquence du gène ou par insertion d'une séquence nucléotidique, ce qui conduit dans les deux cas à l'absence de la protéine codée par ce gène. Alternativement, la recombinaison homologue permet d'introduire une séquence d'ADN d'intérêt, visant à permettre son expression. La recombinaison homologue permet un ciblage précis du processus d'échange, au sein du génome d'un organisme hôte ou dans le vecteur à modifier. Ce ciblage précis est rendu possible par sélection de séquences homologues entre le gène endogène de l'organisme hôte (à invalider ou à remplacer) ou du vecteur et la séquence nucléotidique exogène, permettant ainsi l'appariement des séquences puis l'échange de matériel génétique entre les deux séquences. Ainsi, l'échange se produit en un lieu déterminé, appelé locus, du génome hôte ou du vecteur, le locus étant choisi par le manipulateur. Pour réaliser l'intégration par recombinaison homologue, on peut notamment utiliser le système lambda red. Ce système consiste en trois protéines : l'exonucléase lambda, qui digère progressivement l'extrémité 5' libre de l'ADN double brin ; la protéine beta, qui se lie à l'ADN simple brin et qui permet la reconnaissance du brin homologue et l'échange entre les deux brins; et la protéine gamma, qui lie l'enzyme bactérienne RecBCD et inhibe son activité (l'enzyme RecBCD étant responsable de la degradation d'ADN linéaire entrant dans la cellule). Ces protéines induisent un état d'hyper-recombinaison dans certaines souches bactériennes, par exemple chez Escherichia coli, et cela conduit à augmenter la fréquence des évènements de recombinaison. On peut par exemple utiliser un vecteur qui exprime les gènes lambda red. On peut alternativement utiliser une souche bactérienne qui exprime intrinsèquement les gènes lambda red.

Le système lambda red permet la recombinaison homologue entre un ADN linéaire simple ou double brin et le chromosome ou un ADN circulaire type plasmide, grâce à de courtes séquences d'homologies (e.g. entre 40 et 50 pb). Ainsi, selon un aspect de la présente invention, ladite cassette d'expression se trouve sous forme d'un ADN linéaire double brin. Egalement selon un autre aspect de la présente invention, la séquence nucléotidique d'intérêt qui remplace la cassette d'expression selon l'invention dans le génome bactérien ou dans le vecteur à modifier, se trouve sous forme d'un ADN linéaire double brin. La présente invention concerne également un vecteur comprenant une 10 cassette d'expression selon la présente invention. La présente invention concerne donc également des vecteurs pour la transformation d'un organisme hôte comprenant au moins une cassette d'expression selon la présente invention. Ce vecteur peut notamment correspondre à un plasmide, un cosmide, un Bac, un bactériophage ou un virus dans lequel est inséré une cassette 15 d'expression selon l'invention. Les techniques de construction de ces vecteurs et d'insertion d'une cassette selon l'invention dans ces vecteurs sont bien connues de l'homme du métier. De manière générale, tout vecteur capable de se maintenir, de s'autorépliquer ou de se propager dans une cellule hôte peut être utilisé. L'homme du métier choisira les vecteurs appropriés en fonction de l'organisme hôte à transformer, 20 et en fonction de la technique de transformation mise en oeuvre. Les vecteurs de la présente invention sont notamment utilisés pour transformer un organisme hôte en vue de la réplication du vecteur dans l'organisme hôte. La présente invention concerne également un organisme hôte transformé 25 avec une cassette d'expression selon l'invention ou un vecteur selon l'invention. Par « organisme hôte », on entend en particulier selon l'invention tout organisme mono ou pluricellulaire, inférieur ou supérieur, en particulier choisi parmi les bactéries, les levures, les protistes, les cellules eukaryotes supérieures et les champignons. 30 La présente invention a également pour objet, un procédé de transformation d'un organisme hôte par intégration dans ledit organisme hôte d'au moins une cassette d'expression ou d'un vecteur selon l'invention. La cassette peut être intégrée dans le génome de l'organisme hôte ou se repliquer de manière stable dans l'organisme hôte. Les méthodes de transformation des organismes hôtes sont 35 bien connus de l'homme du métier et largement décrits dans la littérature.

Procédé de modification du génome bactérien La présente invention concerne également un procédé de modification du génome d'une souche bactérienne présentant un génotype araC+, par exemple Escherichia coll, comprenant les étapes suivantes : a) on dispose d'une cassette d'expression selon l'invention, b) on procède à l'intégration de ladite cassette au génome de ladite souche par recombinaison homologue, c) on sélectionne les clones modifiés de ladite souche ayant intégré la cassette au moyen dudit marqueur et d'un milieu de culture riche, contenant du 10 glucose et en l'absence d'arabinose, d) on procède à l'intégration par recombinaison homologue d'une séquence nucléotidique d'intérêt à la place de ladite cassette d'expression au sein des clones modifiés, et e) on sélectionne les clones nouvellement modifiés ayant intégré ladite 15 séquence nucléotidique d'intérêt au moyen d'un milieu de culture riche, contenant de l'arabinose et en l'absence de glucose. Selon ce procédé objet de la présente invention, la souche bactérienne dont on souhaite la modification présente un génotype araC+, c'est-à-dire qu'elle 20 comporte au moins une copie du gène codant pour l'arabinase C dans son génome. Avantageusement, la souche bactéreinne dont on souhaite la modification comporte une seule et unique copie du gène codant pour l'arabinase C dans son génome. Selon une première étape, on dispose d'une cassette d'expression selon l'invention, c'est-à-dire une cassette d'expression qui comprend une séquence 25 nucléotidique codant pour un marqueur, un promoteur pBAD, et une séquence nucléotidique codant pour une protéine cytotoxique sous contrôle dudit promoteur pBAD, ladite cassette ne comprenant pas de séquence nucléotidique codant pour l'arabinase C. Alternativement à cette première étape, on dispose d'une cassette 30 d'expression qui comprend une séquence nucléotidique codant pour un marqueur, un promoteur pBAD, et une séquence nucléotidique codant pour une protéine cytotoxique sous contrôle dudit promoteur pBAD. Selon cette alternative, la cassette d'expression peut contenir une séquence nucléotidique codant pour l'arabinase C (par exemple SEQ ID NO:23 ou une séquence présentant un pourcentage d'identité d'au moins 35 80% avec SEQ ID NO:23).

La deuxième étape du procédé consiste donc à procéder à l'intégration de la cassette d'expression selon l'invention au génome de ladite souche par recombinaison homologue. L'intégration étant réalisée par recombinaison homologue, la cassette d'expression utilisée comporte à ses extrémités des séquences, appelées séquences homologues, qui permettent l'appariement à des séquences du génome de la souche au locus d'intérêt, puis l'échange de matériel génétique entre les deux. Pour réaliser cette étape d'intégration par recombinaison homologue, on peut, selon un aspect de l'invention, utiliser un système qui permet l'expression des gènes lambda red (ou Àred). On peut par exemple utiliser un vecteur qui permet l'expression des gènes lambda red. Des exemples de vecteurs exprimant les gènes lambda red sont les plasmides pSIM5, pSIM6, pSIM7, pSIM8, pSIM9, pSIM17, pSIM18 et pSIM19. La plupart de ces plasmides ont des origines de réplication thermosensibles, c'est-à-dire qu'ils peuvent être éliminés de la bactérie lorsque celle-ci pousse à haute température (42°C). Ils peuvent donc être éliminés facilement de la bactérie après que la modification génétique ait été réalisée. On peut alternativement utiliser une souche bactérienne qui exprime intrinsèquement les gènes lambda red. Un certain nombre de souche répondant à ce critère existent. Ces souches présentent toutes un phage lambda (ou mini-lambda) intégré au chromosome et stable, les gènes lambda red étant portés par ces phages lambda (ou mini-lambda). Des exemples de ces souches bactériennes sont DY380, NM1100 et NM1200. Les phages sont les phages lambda TetR, mini-lambda Kan, mini-lambda Tet, mini-lambda Ap, mini-lambda Cm. Le système lambda red peut, par exemple, être placé sous contrôle d'un promoteur inductible, par exemple un promoteur thermo-sensible. Dans ce cas, un affinement de la température de culture permet de réguler l'expression des gènes lambda red. Par exemple, on peut utiliser une souche qui n'exprime pas les protéines lambda red dans une gamme de températures, et les exprime dans une autre gamme de températures, par exemple supérieures. A titre d'exemple d'un système lambda red placé sous contrôle d'un promoteur thermo-inductible, il est possible d'utiliser une souche qui lorsqu'elle est cultivée à une température comprise entre 28 et 32°C, par exemple à 30°C, n'exprime pas les protéines lambda red. Par contre, cette même souche cultivée à une température comprise entre 40 et 44°C, par exemple à 42°C pendant 10 à 20 minutes, par exemple environ 15 minutes (c'est-à-dire des conditions de culture « temps court, haute température »), exprime les protéines lambda red nécessaires à la recombinaison homologue en vue de l'intégration de la cassette d'expression au génome bactérien. La température de culture est ensuite de nouveau abaissée entre 28 et 32°C, par exemple 30°C, pour le reste de l'expérimentation (notamment détection des clones modifiés). Alternativement, selon un autre aspect de la présente invention, le système lambda red est placé sous contrôle d'un promoteur pLAC et dans ce cas, la culture de la souche selon cette étape du procédé, c'est-à- dire en vue de l'intégration de la cassette d'expression au génome bactérien, s'effectue en présence d'IPTG. Selon une troisième étape, on sélectionne les clones modifiés de ladite souche ayant intégré la cassette au moyen dudit marqueur et d'un milieu de culture riche, contenant du glucose et en l'absence d'arabinose. La troisième étape du 10 présent procédé consiste en une sélection positive. Le procédé de l'invention utilise un milieu de culture riche, ce qui présente les avantages précédemment mentionnés et notamment rapidité de culture et donc d'obtention des résultats et suppression des faux-positifs. Par « milieu de culture riche », on entend un milieu de culture contenant tous les éléments 15 nécessaires à la croissance bactérienne. La présence du marqueur dans le milieu de culture permet de vérifier l'intégration effective de la cassette d'expression au génome. Ainsi le milieu de culture est par exemple supplémenté en kanamycine, si la séquence nucléotidique codant pour un marqueur est aphA. Le milieu de culture est, en outre, supplémenté en glucose qui permet de réprimer l'activité du promoteur pBAD. On peut 20 selon la présente invention utiliser des concentrations en glucose qui varient entre 0,05% et 4%. Ainsi il n'y a pas d'expression de la protéine cytotoxique. Le milieu de culture ne contient pas d'arabinose, qui est un activateur du promoteur pBAD. Dans une quatrième étape de ce procédé, on procède à l'intégration par recombinaison homologue d'une séquence nucléotidique d'intérêt à la place de ladite 25 cassette d'expression au sein des clones modifiés. Par « séquence nucléotidique d'intérêt », on entend une séquence nucléotidique qui permet la mutagénèse du génome sauvage ou l'insertion de systèmes rapporteurs. La mutagénèse peut par exemple consister à remplacer un unique nucléotide par un autre (cela est dû à la précision du système selon l'invention) ou remplacer plusieurs nucléotides. Elle peut 30 également consister en la délétion de un ou plusieurs nucléotides. Enfin elle peut consister en l'addition d'un ou de plusieurs nucléotides. Elle peut par exemple consister en des fusions traductionnelles ou des fusions transcriptionnelles, en fonction du locus d'insertion. Par exemple, l'insertion de systèmes rapporteurs, comme le gène codant pour la Green Fluorescent Protein (GFP), en aval d'un 35 promoteur (fusions transcriptionnelles) peut permettre de visualiser si un gène est transcrit ou ne l'est pas, et ce dans différentes souches mutantes. Les fusions transcriptionnelles peuvent également permettre de suivre la transcription d'un gène tout au long de la croissance bactérienne. L'insertion de systèmes rapporteurs, comme le gène codant pour la GFP, à l'intérieur d'une séquence codante (fusions traductionnelles), peut permettre de suivre la traduction d'une protéine tout au long de la croissance bactérienne, dans différentes souches, et de visualiser également la stabilité d'une protéine dans différentes conditions de croissance. Les insertions (ou fusions) doivent être très précises, elles doivent être faites au nucléotide près. En effet, pour les fusions traductionnelles, le cadre de lecture du gène rapporteur doit être intégré au cadre ouvert de lecture (ORF) du gène modifié.

Selon un aspect de la présente invention, la séquence nucléotidique d'intérêt est choisie de manière à invalider un gène endogène de ladite souche, par exemple par délétion d'au moins un nucléotide dudit gène. Selon un autre aspect de la présente invention, la séquence nucléotidique d'intérêt est choisie de manière à introduire une séquence nucléotidique d'intérêt dans ladite souche, par exemple par remplacement ou ajout d'au moins un nucléotide dans un gène endogène de ladite souche, par exemple une étiquette ou un gène qui code pour la GFP. De la même façon que dans la seconde étape du présent procédé, l'intégration étant réalisée par recombinaison homologue, la cassette nucléotidique d'intérêt comporte à ses extrémités des séquences homologues. Ces séquences homologues peuvent être identiques à celles utilisées dans la seconde étape du procédé. Dans ce cas, le procédé de modification du génome d'une souche bactérienne selon l'invention permet l'obtention de clones qui ne conservent aucun nucléotide de la cassette d'expression selon l'invention ; en d'autres mots, les clones obtenus selon le présent procédé ne présentent aucune cicatrice. Pour réaliser cette étape d'intégration par recombinaison homologue, on peut, selon un aspect de l'invention, utiliser un système qui permet l'expression des gènes lambda red (ou Àred). Ainsi, selon un aspect de la présente invention, on utilise un système 30 permettant l'expression des gènes lambda red pour l'intégration par recombinaison homologue de l'étape b) et/ou de l'étape d). Egalement selon un autre aspect de la présente invention, la culture de la souche selon l'étape b) et/ou selon l'étape d) s'effectue à une température comprise entre 40 et 44°C, par exemple à 42°C. 35 Dans une cinquième étape, on sélectionne les clones nouvellement modifiés ayant intégré ladite séquence nucléotidique d'intérêt au moyen d'un milieu de culture riche, contenant de l'arabinose et en l'absence de glucose. On peut selon la présente invention utiliser des concentrations en arabinose qui varient entre 0,05% et 4%. L'utilisation d'arabinose qui active le promoteur pBAD permet de sélectionner les seuls clones qui ont effectivement remplacé la cassette d'expression selon l'invention par la séquence nucléotidique d'intérêt. Cette cinquième étape du présent procédé consiste donc en une contre-sélection positive. Ainsi la souche obtenue selon la présente invention présente la séquence d'intérêt, par exemple un gène d'intérêt, sans comporter de séquences codant pour un 10 marqueur. On obtient ainsi une souche dite « markerless », avec tous les avantages associés. Procédé de modification d'un vecteur La présente invention concerne également un procédé de modification 15 d'un vecteur par recombinaison in vivo dans une souche hôte bactérienne présentant un génotype araC+, comprenant les étapes suivantes : a) on dispose d'une cassette d'expression selon l'invention, b) on co-transforme ladite souche hôte avec ladite cassette d'expression et ledit vecteur, de manière à permettre l'intégration de la cassette d'expression audit 20 vecteur par recombinaison homologue, c) on récupère les bactéries transformées qui possèdent le vecteur modifié ayant intégré ladite cassette d'expression, au moyen dudit marqueur et d'un milieu de culture riche contenant du glucose et en l'absence d'arabinose, d) on récupère ledit vecteur modifié, 25 e) on co-transforme une autre colonie de ladite souche hôte avec la séquence nucléotidique d'intérêt et ledit vecteur modifié, f) on récupère les bactéries transformées qui possèdent le vecteur nouvellement modifié ayant intégré ladite séquence nucléotidique d'intérêt, au moyen d'un milieu de culture riche contenant de l'arabinose et en l'absence de glucose, et 30 g) on récupère ledit vecteur nouvellement modifié. Le procédé objet de la présente invention permet donc de modifier un vecteur, par exemple un plasmide, un cosmide, un BAC, un bactériophage, un virus, par recombinaison homologue. Le procédé présente en outre l'avantage d'être réalisé 35 in vivo, c'est-à-dire dans une souche bactérienne qui présente un génotype araC+, c'est-à-dire qu'elle comporte au moins une copie du gène codant pour l'arabinase C dans son génome. Ainsi, de manière avantageuse, il n'est pas nécessaire d'utiliser des enzymes de restriction et des ligases, qui sont généralement utilisées pour modifier des vecteurs in vitro, mais sont très coûteuses. De plus, la modification de vecteurs par recombinaison homologue et au moyen de la présente invention permet de réaliser des modifications très précises à différents endroits du vecteur (n'importe où), ce qui n'est pas possible avec les étapes de restriction/ligation in vitro, dépendantes de la place des sites de restriction sur le vecteur. Selon une première étape, on dispose d'une cassette d'expression selon l'invention, c'est-à-dire une cassette d'expression qui comprend une séquence nucléotidique codant pour un marqueur, un promoteur pBAD, et une séquence nucléotidique codant pour une protéine cytotoxique sous contrôle dudit promoteur pBAD, ladite cassette ne comprenant pas de séquence nucléotidique codant pour l'arabinase C. Alternativement à cette première étape, on dispose d'une cassette d'expression qui comprend une séquence nucléotidique codant pour un marqueur, un promoteur pBAD, et une séquence nucléotidique codant pour une protéine cytotoxique sous contrôle dudit promoteur pBAD. Selon cette alternative, la cassette d'expression peut contenir une séquence nucléotidique codant pour l'arabinase C (par exemple SEQ ID NO:23 ou une séquence présentant un pourcentage d'identité d'au moins 80% avec SEQ ID NO:23). La deuxième étape du procédé consiste donc à co-transformer ladite souche bactérienne hôte avec la cassette d'expression et le vecteur dont la modification est attendue. L'intégration étant réalisée par recombinaison homologue, la cassette d'expression utilisée comporte à ses extrémités des séquences, appelées séquences homologues, qui permettent l'appariement à des séquences du vecteur au locus d'intérêt, puis l'échange de matériel génétique entre les deux. Pour réaliser cette étape d'intégration par recombinaison homologue, on peut, selon un aspect de l'invention, utiliser un système qui permet l'expression des gènes lambda red (ou Àred). On peut, par exemple, utiliser une souche bactérienne qui exprime intrinsèquement les gènes lambda red. Un certain nombre de souche répondant à ce critère existent. Ces souches présentent toutes un phage lambda (ou mini-lambda) intégré au chromosome et stable, les gènes lambda red étant portés par ces phages lambda (ou mini-lambda). Des exemples de ces souches bactériennes sont DY380, NM 1100 et NM1200. Les phages sont les phages lambda TetR, mini- lambda Kan, mini-lambda Tet, mini-lambda Ap, mini-lambda Cm.

Le système lambda red peut, par exemple, être placé sous contrôle d'un promoteur inductible, par exemple un promoteur thermo-sensible. Dans ce cas, un affinement de la température de culture permet de réguler l'expression des gènes lambda red. Par exemple, on peut utiliser une souche qui n'exprime pas les protéines lambda red dans une gamme de températures, et les exprime dans une autre gamme de températures, par exemple supérieures. A titre d'exemple d'un système lambda red placé sous contrôle d'un promoteur thermo-inductible, il est possible d'utiliser une souche qui lorsqu'elle est cultivée à une température comprise entre 28 et 32°C, par exemple à 30°C, n'exprime pas les protéines lambda red. Par contre, cette même souche cultivée à une température comprise entre 40 et 44°C, par exemple à 42°C pendant 10 à 20 minutes, par exemple environ 15 minutes (c'est-à-dire des conditions de culture « temps court, haute température »), exprime les protéines lambda red nécessaires à la recombinaison homologue en vue de l'intégration de la cassette d'expression au génome bactérien. La température de culture est ensuite de nouveau abaissée entre 28 et 32°C, par exemple 30°C, pour le reste de l'expérimentation (notamment détection des clones modifiés). Alternativement, selon un autre aspect de la présente invention, le système lambda red est placé sous contrôle d'un promoteur pLAC et dans ce cas, la culture de la souche selon cette étape du procédé, c'est-à-dire en vue de l'intégration de la cassette d'expression au génome bactérien, s'effectue en présence d'IPTG. Dans une troisième étape, on récupère les bactéries transformées qui possèdent le vecteur modifié ayant intégré ladite cassette d'expression, au moyen dudit marqueur et d'un milieu de culture riche contenant du glucose et en l'absence d'arabinose. La troisième étape du présent procédé consiste en une sélection positive.

Le procédé de l'invention utilise un milieu de culture riche, ce qui présente les avantages précédemment mentionnés et notamment rapidité de culture et donc d'obtention des résultats et suppression des faux-positifs. La présence du marqueur dans le milieu de culture permet de vérifier l'intégration effective de la cassette d'expression au vecteur. Le milieu de culture est, en outre, supplémenté en glucose qui permet de réprimer l'activité du promoteur pBAD. Ainsi il n'y a pas d'expression de la protéine cytotoxique. Le milieu de culture ne contient pas d'arabinose, qui est un activateur du promoteur pBAD. Par « milieu de culture riche », on entend un milieu de culture contenant tous les éléments nécessaires à la croissance bactérienne. Ce milieu de culture est 35 supplémenté en glucose. On utilise des concentrations en glucose qui varient entre 0,05% et 4%.

Selon une quatrième étape, on récupère ledit vecteur modifié. Selon un aspect de la présente invention, on récupère le vecteur modifié par lyse bactérienne, par exemple au moyen de minipréparation ou miniprep. Par « minipréparation » ou « miniprep », on entend le kit de biologie moléculaire qui permet d'extraire de petites quantités d'ADN plasmidique provenant de bactéries, par exemple Escherichia coll. Selon une cinquième étape, on co-transforme une autre colonie de ladite souche hôte avec la séquence nucléotidique d'intérêt et ledit vecteur modifié. Par « séquence nucléotidique d'intérêt », on entend une séquence nucléotidique qui permet la mutagénèse du vecteur ou l'insertion de systèmes rapporteurs. La mutagénèse peut par exemple consister à remplacer un unique nucléotide par un autre (cela est dû à la précision du système selon l'invention) ou remplacer plusieurs nucléotides. Elle peut également consister en la délétion de un ou plusieurs nucléotides dans le vecteur. Enfin elle peut consister en l'addition d'un ou de plusieurs nucléotides dans le vecteur. Elle peut par exemple consister en des fusions traductionnelles ou des fusions transcriptionnelles, en fonction du locus d'insertion. Par exemple, l'insertion de systèmes rapporteurs, comme le gène codant pour la Green Fluorescent Protein (GFP), en aval d'un promoteur (fusions transcriptionnelles) peut permettre de visualiser si un gène est transcrit ou ne l'est pas, et ce dans différentes souches mutantes. Les fusions transcriptionnelles peuvent également permettre de suivre la transcription d'un gène tout au long de la croissance bactérienne. L'insertion de systèmes rapporteurs, comme le gène codant pour la GFP, à l'intérieur d'une séquence codante (fusions traductionnelles), peut permettre de suivre la traduction d'une protéine tout au long de la croissance bactérienne, dans différentes souches, et de visualiser également la stabilité d'une protéine dans différentes conditions de croissance. Les insertions (ou fusions) doivent être très précises, elles doivent être faites au nucléotide près. En effet, pour les fusions traductionnelles, le cadre de lecture du gène rapporteur doit être intégré au cadre ouvert de lecture (ORF) du gène modifié.

Selon un aspect de la présente invention, la séquence nucléotidique d'intérêt est choisie de manière à invalider un gène du vecteur, par exemple par délétion d'au moins un nucléotide dudit gène. Selon un autre aspect de la présente invention, la séquence nucléotidique d'intérêt est choisie de manière à remplacer ou ajouter au moins un 35 nucléotide dans un gène porté par le vecteur, par exemple une étiquette ou un gène qui code pour la GFP.

Selon une sixième étape, on récupère les bactéries transformées qui possèdent le vecteur nouvellement modifié ayant intégré ladite séquence nucléotidique d'intérêt, au moyen d'un milieu de culture riche contenant de l'arabinose et en l'absence de glucose. L'utilisation d'arabinose qui active le promoteur pBAD permet de sélectionner les seuls clones porteurs d'un vecteur qui a effectivement remplacé la cassette d'expression selon l'invention par la séquence nucléotidique d'intérêt. Cette sixième étape du présent procédé consiste donc en une contre-sélection positive. Le milieu de culture riche utilisé pour cette étape du procédé est 10 supplémenté en arabinose. On utilise des concentrations en arabinose qui varient entre 0,05 et 4%. Selon une septième étape, on récupère ledit vecteur nouvellement modifié. On peut également réaliser cette étape au moyen d'une miniprep. Les vecteurs, par exemple plasmides, ainsi obtenus peuvent être ensuite 15 utilisés dans des organismes eucaryotes ou procaryotes. Procédé de production La présente invention concerne également un procédé de production 20 d'une molécule d'intérêt par une souche bactérienne présentant un génotype araC+, par exemple Escherichia coll, comprenant les étapes suivantes : a) on dispose d'une cassette d'expression selon l'invention, b) on procède à l'intégration de ladite cassette au génome de ladite souche par recombinaison homologue, 25 c) on sélectionne les clones modifiés de ladite souche ayant intégré la cassette au moyen dudit marqueur et d'un milieu de culture riche, contenant du glucose et en l'absence d'arabinose, d) on procède à l'intégration par recombinaison homologue d'une séquence nucléotidique d'intérêt à la place de ladite cassette d'expression au sein des 30 clones modifiés, e) on sélectionne les clones nouvellement modifiés ayant intégré ladite séquence nucléotidique d'intérêt au moyen d'un milieu de culture riche, contenant de l'arabinose et en l'absence de glucose, et f) on produit la molécule d'intérêt au moyen des clones nouvellement 35 modifiés.

Par « molécule d'intérêt », on entend notamment alcool, protéine, peptide, médicament, antibiotique, solvant et acide aminé. Selon une première étape, on dispose d'une cassette d'expression selon l'invention, c'est-à-dire une cassette d'expression qui comprend une séquence nucléotidique codant pour un marqueur, un promoteur pBAD, et une séquence nucléotidique codant pour une protéine cytotoxique sous contrôle dudit promoteur pBAD, ladite cassette ne comprenant pas de séquence nucléotidique codant pour l'arabinase C. Alternativement à cette première étape, on dispose d'une cassette d'expression qui comprend une séquence nucléotidique codant pour un marqueur, un promoteur pBAD, et une séquence nucléotidique codant pour une protéine cytotoxique sous contrôle dudit promoteur pBAD. Selon cette alternative, la cassette d'expression peut contenir une séquence nucléotidique codant pour l'arabinase C (par exemple SEQ ID NO:23 ou une séquence présentant un pourcentage d'identité d'au moins 80% avec SEQ ID NO:23). Utilisations La présente invention concerne également l'utilisation d'une cassette d'expression selon l'invention ou d'un vecteur recombinant selon l'invention pour modifier une souche bactérienne présentant un génotype araC+, par exemple Escherichia coll. La souche modifiée peut ensuite être utiliser pour la production d'une molécule d'intérêt, par exemple un acide aminé, une protéine ou un solvant. Alternativement la présente invention concerne l'utilisation d'une cassette d'expression qui comprend une séquence nucléotidique codant pour un marqueur, un promoteur pBAD, et une séquence nucléotidique codant pour une protéine cytotoxique sous contrôle dudit promoteur pBAD, pour modifier une souche bactérienne présentant un génotype araC+, par exemple Escherichia coll. La présente invention concerne également l'utilisation d'une cassette d'expression selon l'invention ou d'un vecteur recombinant selon l'invention pour 30 modifier un vecteur, par exemple un plasmide, dans une souche bactérienne présentant un génotype araC+, par exemple Escherichia coll. Alternativement la présente invention concerne l'utilisation d'une cassette d'expression qui comprend une séquence nucléotidique codant pour un marqueur, un promoteur pBAD, et une séquence nucléotidique codant pour une protéine cytotoxique 35 sous contrôle dudit promoteur pBAD, pour modifier un vecteur dans une souche bactérienne présentant un génotype araC+, par exemple Escherichia coll.

Kit La présente invention concerne également un kit, ou une trousse, comprenant une cassette d'expression selon l'invention.

Alternativement la présente invention concerne un kit comprenant une cassette d'expression qui comprend une séquence nucléotidique codant pour un marqueur, un promoteur pBAD, et une séquence nucléotidique codant pour une protéine cytotoxique sous contrôle dudit promoteur pBAD. Selon un aspect de la présente invention, le kit comprend également une 10 notice détaillée indiquant le protocole de modification du génome de la souche ou le protocole de modification du vecteur dans la souche bactérienne. Selon un autre aspect de l'invention, le kit comprend au moins l'un des éléments suivants : du glucose, de l'arabinose, des amorces qui s'hybrident à chaque extrémité de la cassette et qui permettent son amplification par PCR, les souches ou 15 les plasmides permettant l'expression des gènes lambda red. Description des séquences SEQ ID NO:1 : Séquence nucléotidique du promoteur pBAD de la souche E. coli K12 (numéro d'accession OP00302, nucléotides 70049 au nucléotide 70438 sur ce 20 chromosome) SEQ ID NO:2-22 : séquences des amorces utilisées dans la partie expérimentale SEQ ID NO:23 : séquence nucléotidique de la protéine arabinase C de la souche E. cou K12 (numéro d'accession EG10054 EcoCyc, nucléotides 70387 à 71265) 25 Description des figures Figure 1 : exemples de procédés selon l'invention Figure 2 : cassette Kn-pBADccdB A. Les fragments d'ADN Kn, pBAD et ccdB, amplifiés par PCR, ont été assemblés par une PCR fusion, et insérées dans le gène cya. 30 B. La souche CR200 (cya::Kn-pBADccdB) pousse très bien sur milieu riche contenant du glucose, mais pas du tout sur milieu riche contenant de l'arabinose. C. Le phénotype cya de différentes souches a été testé sur milieu minimum M9 contenant soit du glucose soit du maltose. 1. Souche WT - 2. CR200 - 3. Souche WT avec fragment Cya4-5 - 4. Souche WT 35 avec fragment Cya1-3 - 5. Souche WT avec fragment Cya1-2 - 6. CR202 (cyaG60D) - 7. CR203 (cya4(241-771)) - 8. CR205 (cya::PLtet01-cherry).

Figure 3 : Construction de la cassette Kn-pBADccdB Figure 4 : différentes constructions cya A. Des fragments PCR de differente taille et séquence ont été générés et électroporés dans la souche CR204 (cya::Kn-pBADccdB). La cassette ccdB est représentée par 5 une rectangle noir dans le gène cya. B. Après électroporation, les bactéries sont étalées sur milieu riche contenant de l'arabinose. Un contrôle negatif (electroporation sans ADN) a été réalisé de façon concomitante. C. Chaque construction a été vérifiée par PCR avec des amorces Cya1 et Cya2: 1. 10 souche VVT ; 2. Souche WT reconstruite cya ; 3. cya::Puetorcherty ; 4. Delcya ; 5. cyaG6OD ; 6. cya::Kn-pBADccdB. Figure 5 : Ingénierie d'un plasmide avec la cassette Kn-pBADccdB Le plasmide pQE8OL présente une taille de 4751pb et présente un unique site de restriction BamHl. La cassette Kn-pBADccdB a été insérée par recombinaison 15 homologue dans le plasmide, en remplacement de la cassette sans promoteur Cm (eliminant le gène à partir de l'ATG jusqu'au codon Stop). Cela a conduit au plasmide pQE80::Kn-pBADccdB. La cassette ccdB a un unique site de restriction BamHl, son insertion conduisant donc à un plasmide avec deux sites de restriction BamHl. Un longue amorce ADN simple brin (100 nucléotides) dont la séquence correspond au 20 50 nucléotides en amont de l'ATG de la cassette Cm fusionnés au 50 nucléotides en aval du codon stop (DelCm) a été insérée par recombinaison homologue dans le plasmide pQE80::Kn-pBADccdB, éliminant la cassette Kn-pBADccdB ce qui a conduit au plasmide pQE8ODCm. Chaque plasmide (1, 2 and 3) a été vérifié par digestion en utilisant BamHl. 25 Matériel et méthodes 1. Conditions de culture, milieux et réactifs Les bactéries sont cultivées à 37°C ou 30°C, sur milieu de culture riche ou sur milieu de culture M9 minimum supplémenté avec 2 mM de MgSO4, 0.0005% de thiamine, 0.1 30 mM de CaCl2 (Maniatis et al., 1982). Les antibiotiques suivants sont ajoutés si requis : kanamycine (50 pg/ml), chloramphénicol (30 pg/ml), ampicilline (50 pg/ml), tétracycline (25 pg/ml). Le promoteur pBAD est réprimé en présence de glucose et induit en présence d'arabinose. Le phénotype cya est testé en cultivant les souches sur milieu minimum 35 M9 contenant du maltose ou du glucose. Les antibiotiques et autres produits ont été achetés auprès de Sigma Aldrich. Les enzymes de restriction ont été achetées auprès de Fermentas. Deux Taq polymerase différentes ont été utilisées pour la PCR : PHUSION HIGH-FIDELITY (Finnzymes) pour les PCR fusion, et AMPLITAQ POLYMERASE (Applied Biosystems, USA), pour les PCR simples. 2. Procédures génétiques, souches bactériennes et plasmides Les amorces utilisées sont listées au tableau 1 ci-dessous. Les intégrations sont réalisées par la méthode de transformation d'ADN linéaire (À red recombineering, Yu et al., 2000). Cette méthode est basée sur l'utilisation de fragments PCR ou oligonucléotides ayant à chaque extrémité de petites régions homologues (50pb) à des séquences d'ADN cibles. Le fragment PCR linéaire est ensuite introduit dans des cellules compétentes exprimant de façon transitoire les fonctions À red. Ont été utilisés pour les expériences de recombinaison : 1/ la souche NM1100 portant un mini-À red simplifié (N. Majdalani, NIH) ou 2/ le plasmide pSIM5 exprimant les gènes À red. Dans les deux systèmes, les gènes À red sont sous contrôle du promoteur pL thermo-sensible (gènes du phage réprimés à basse température et dé-réprimés à haute température). Après un passage à 42°C pendant 15 minutes pour exprimer les fonctions red, les cellules électrocompétentes sont préparées tel que décrit dans Sharan et al., 2009. Les quantités d'ADN electroporées étaient les suivantes : 100 ng d'ADN linéaire pour l'ingenierie sur chromosome, et 100 ng de plasmide et 700 ng d'ADN linéaire pour l'ingenierie sur plasmide. Tableau 1 - séquences des amorces utilisées dans la construction des plasmides et des souches S.èquerc.es des amorces de 5" vers 3') CGIGGAATGICA(3TACAGGATCCGCCG.AAAGGTGAGCTT en AA.TTACTGGTATAGGAACTICAAGATCn- -- 0 ID NO:2) P6Kn-pBA D CTGCOGGGATACTCGTTTAA- -,, 11E1 -`... DCTCA. .`- .:1:- (SEC ID NO3) p B..4:1:i1 00CCt TTA.A._ -3.A' TATC- E- .i ID NO :4! araB-atg CGITT-A.CTCCAT.-.A.AA.' ... ,=...AClo 'EC ID NO:5) p BA D -ccd B COCO IIIIII 1.:._-.....2..A TG GAG TGAAA CGATGC1-% GTTTAA GGT TTA CACC (S EC ID N 0 :6) cya-ccdB GGAATCGATA CTC TTGTAGA GCTC.CCA; .AGGCT.:=;GCA CC AAA..2TACTCTICTTAT.ATTC.CnCA.G.A.ACATCA..3 G (SEC ID -- _ , , TT .: -1 I I._-.;'..i...CAT.A. - (SEC ID NO 8:: - GTGA.A. ..;=.,AGT AGITTCC :SEC ID NO : C- 'a2 i .,3 CAGCGACGTACTAAATC :.SEQ ID N 0' :10".) ',.-': 2.-'T G G AAT C-..- H1AGT AC- ...- ,,J 3E0 IDNO1 .. o :._,,-.AATCGATA CICTTSTA ( 2. (SEC ID NO-1 i K N1 AT.A.(3.SAACTT A.A.GATC.- EC: ID N.0:13) n D B1 TT; TATT COCAGAA .ATCAG, .SE'`,.- ID NO:14) cya.360 1 CTTC. - .«" _.'," CATIT ' (SEL_ ID NO:15) cya'360D21 T3TAAAGGC à. ii'ATSTC I I I GGG,"'., '._7. .IJ ID NO. : 6: DeFcya GIGGAATGTC.A.GTACA(3G.ATCCGCCGAAAGGIC4..a..GCTTC r' AATTA CTG GTG.A.A GA GTA CITTG G Pri2, C CA G CCTT T3 G C AGCTCTACAAGAGTATCGATTC 'SEC ID NO:1 , 1 ..._. , a 1 ' , I . CGTGGAATGICAGTACAGGATCCGCCG.AAAGGIG, SCIT CCAATTACTOEIr TAAATAGGCGTATCACGA1:C SEC D NO:18) C , erm , , .2,GAATCGATA.CTC11:3TA',3AGCTG.C. ." SC,'Cil.3G.C..-. C ,., .A.A '' GTACTCTTOGGATTIGTOCTACTCA G G :5 EC ID Nu , ,_., . , : ul_ TGAG.AAT.CCAA.GC,,TA(DCTIGG.,_:',_, ._,. .111T A(DGAGCTA Kr:1 AGGA.A(3CTAAAATAGG,A ACTTC,AAGATC SEC ID NO:2n) . pr,. rl " 0)- 'A.GAGICATTACCCCA.GGCGTTTAe1/4..bC.C.C.ACCA,ATAACTG CCITAAAA.A..,`3'...ATTA.T.ATTC.C.C,C.ASAA.C.A.-r,--AC-._ 'SEC ID NO:21) ,_,.. . r., ccd B1 pQE8C':deiCml TGAGAATCCAA(DCTAGOTTGGCGAGAII I TCAGGAG :_-.: TA. AGGAA.GCTAAA11111 [ 1.AAGGCAGTIATTL'iGTGCCC 1 1 A AACGCCIGGG(3TAATGA.CTCT (S EC ID NO:22) 3. Construction de la cassette Kn-pBADccdB La cassette Kn-pBADccdB a été construite comme suit, tel que montré à la figure 3: - la cassette Kn de la souche BW25113 trkH::kn (Keïo collection, Baba et al., 2006) a été amplifiée en utilisant l'amorce forward Cya-Kn2 et l'amorce reverse P6Kn-pBAD ; - le promoteur pBAD a été amplifié à partir de la souche sauvage MG1655 en utilisant l'amorce forward pBAD1 et l'amorce reverse araB-atg ; - le gène ccdB a été amplifié à partir du plasmide pEST14 (Invitrogen) en utilisant l'amorce forward pBAD-ccdB et une amorce reverse cya-ccdB. De manière à réunir les trois fragments, une PCR a été conduite en utilisant une amorce forward Cya4 et une amorce reverse Cya5 et avec 50 ng de chacun des trois 5 fragments. Le produit PCR (cassette Kn-pBADccdB, 1873 pb) a été purifié et électroporé dans les cellules NM1100 qui sont induites à la chaleur et électrocompétentes. Après électroporation, les bactéries sont récupérées dans 1 ml de milieu riche-glucose, et incubées avec aération à 30°C. Après une période de récupération, les bactéries sont 10 diluées dans du milieu milieu riche-Kn-glucose, et incubées pendant la nuit à 30°C. Les cellules sont ensuite étalées sur un milieu riche-Kn-glucose et incubées toute la nuit à 30°C pour augmenter les chances de maintenir les mini- À red pour la prochaine étape. Quelques colonies KnR ont été purifiées et testées pour leur sensibilité à l'arabinose. Pour vérifier que la cassette est insérée au site correct du chromosome 15 (dans le gène cya), les colonies sélectionnées pour être KnRaras ont été étalées sur milieu minimum M9 contenant du maltose comme seule source de carbone. Un clone KnR aras Mar a été sélectionné comme une souche correcte NM1100 cya::KnpBADccdB (CR200). La construction Kn-pBADccdB a ensuite été vérifiée par PCR et séquencée. 20 La cassette Kn-pBADccdB peut être amplifiée à partir de la souche CR201 et ensuite insérée n'importe où dans le chromosome E.coli ou dans n'importe quel plasmide en utilisant les amorces KN1 ou CCDB1, avec les 50 nucléotides nécessaires pour la recombinaison homologue au locus désiré, attaché à chaque terminaison 5' de chaque amorce. 25 4. Test de la fonctionnalité de la cassette Kn-pBADccdB comme marqueur de contre-sélection Obtenir différentes constructions cya 30 La souche CR201 a été transformée avec le plasmide pSIM5 (Datta et al., 2006) pour plusieurs expérimentations de recombinaison, pour conduire à la souche CR204. Nous avons d'abord obtenu plusieurs fragments PCR dans le but de modifier le gène cya : de manière à renverser le phénotype cya de la souche CR204, différents fragments PCR du gène cya ont été amplifiés à partir de la souche sauvage MG1655 35 avec : - l'amorce forward Cya4 et l'amorce reverse Cya5 (fragment Cya4-5), - l'amorce forward Cya1 et l'amorce reverse Cya2 (fragment Cya 1-2), - l'amorce forward Cya1 et l'amorce reverse Cya3 (fragment Cya 1-3). Voir la figure 4A pour la position de chacune de ces amorces Cya. De plus, pour insérer une mutation ponctuelle dans le gène cya (souche CR202), nous 5 avons amplifié une première partie de ce gène à partir de la souche sauvage MG1655 avec une amorce forward Cya1 et une une amorce reverse CyaG6OD (en introduisant un codon codant pour l'acide aspartique à la place d'un codon glycine à la position 60) (PCR1). L'autre partie de cya était amplifiée en utilisant une amorce CyaG6OD (étant le complémentaire réverse de CyaG60D2) et une amorce réverse Cya3 (PCR2). Voir 10 la figure 4A pour la position de chaque amorce. Les deux produits PCR obtenus à partir de PCR1 et PCR2 ont été mélanges et soumis à un second cycle de PCR avec les amorces forward Cya1 et reverse Cya3, générant ainsi un fragment PCR avec le gène mutant cya. Pour supprimer une partie du gène cya (à partir du nucléotide 241 à 771, souche 15 CR203), nous avons utilisé une amorce ADN simple-brin longue, ladite séquence correspondant aux 50 nucléotides en aval de la position 241, fusionnée aux 50 nucléotides en amont de la position 771. Au final, pour insérer la cassette rapporteur (PLtet01-cherry) dans le gène cya (souche CR205), nous avons amplifié la cassette à partir du plasmide pZA-tet-Cherry, avec l'amorce forward Cya-pTet(pZA), et l'amorce 20 reverse Cya-Term(pZA). Un codon stop a été introduit entre la séquence cya et la séquence plasmidique dans l'amorce Cya-pTET(pZA). Chacun de ces fragments ADN a été purifié et électroporé dans les cellules CR204 induites à la chaleur et électrocompétentes. Après électroporation, les cellules ont été diluées dans du milieu riche-glucose pour récupération, et incubées avec aération à 25 30°C. Les bactéries ont ensuite été étalées sur milieu riche-arabinose, et incubées toute la nuit à 30°C. Les colonies AraR ont été purifiées et testées pour leur croissance sur milieu maltose et perte de KnR, et le gène cya a été séquence. 5. Manipulation génétique du plasmide pQE8OL 30 Voir Figure 5 La cassette Kn-pBADccdB a d'abord été amplifiée à partir de la souche CR201 avec l'amorce forward Cm(pQE80)-KN1 et l'amorce reverse Cm(pQE80)-ccdB1. Le fragment PCR a été co-électroporé avec le plasmide pQE8OL, dans des souches NM1100 induites à la chaleur et électrocompétentes. Après électroporation, les 35 bactéries ont été récupérées dans du milieu riche-glucose, et incubées avec aération à 30°C. Après la période de récupération, les bactéries ont été diluées dans du milieu riche-Kn-glucose, et incubées toute la nuit à 30°C. Les bactéries ont été étalées sur milieu riche-Kn-Ap-glucose et incubées toute la nuit à 30°C. Les colonies ApRKnR ont été purifiées et testées pour leur sensibilité à l'arabinose. L'ADN plasmidique a été extrait par mini-prep à partir d'un clone ApRKnRAras. Pour éviter tout mélange entre le 5 pQE8OL original et le nouveau pQE80 (Kn-pBADccdB), nous avons transformé à nouveau la souche NM1100 avec très peu de quantité d'ADN à partir de la mini-prep (environ 1 pg) sélectionné à nouveau un clone ApRKnRAras et extrait à nouveau l'ADN plasmidique à partir de ce clone. Nous avons ensuite obtenu un stock pur de pQE80(Kn-pBADccdB). Dans cette construction, la cassette Kn-pBADccdB remplace 10 la cassette de résistance Cm du plasmide pQE8OL (à partir de l'ATG jusqu'au codon STOP, figure 5). Pour supprimer la cassette Cm, nous avons utilisé une amorce ADN simple-brin longue (environ 100 nt) ladite séquence correspondant aux 50 nt en amont de l'ATG de la cassette Cm fusionnés aux 50 nt en aval du codon STOP (pQE80DelCm). 15 L'amorce a été co-électroporée avec le plasmide pQE80(Kn-pBADccdB) dans des souches NM1100 induites à la chaleur et électrocompétentes. Après électroporation, les cellules ont été diluées dans du milieu riche-glucose pour récupération, et incubées avec aération à 30°C. Les bactéries ont ensuite été étalées sur milieu richeAp-arabinose, et incubées toute la nuit à 30°C. Les colonies AraRApR ont été purifiées 20 et testées pour leur perte de résistance à la résistance Kn. L'ADN plasmidique a été extrait en utilisant des mini-prep à partir du clone ApRKnsAraR et les plasmides obtenus pQE80DelCm ont été séquences. 25 Résultats et discussion 1. Design, construction et test de la cassette Kn-pBADccdB Nous avons généré une cassette de répression/activation pBAD-ccdB par PCR fusion, en clonant le gène ccdB en aval du promoteur pBAD et une cassette de résistance Kn 30 en amont de pBAD résultant en une construction qui a été appelée Kn-pBADccdB (voir Matériel et Méthodes, Figure 2A). Le promoteur pBAD a été amplifié directement à partir du chromosome de la souche E. cou MG1655. Il convient de noter que le promoteur pBAD a été cloné sans le gène araC conformément à la présente invention. En effet, deux copies de ce gène conduisent à 35 une mauvaise répression du promoteur, ce même en présence de glucose. Une seule copie du gène araC permet d'obtenir l'activation attendue du promoteur pBAD.

Nous avons choisi d'insérer la cassette Kn-pBADccdB, objet de la présente invention, en utilisant la méthode À red dans le gène cya de la bactérie E.coli qui code pour l'adenylate cyclase. L'insertion élimine une portion de cya (à partir du nucléotide 241 jusqu'au nucléotide 771, Figure 2A). Une souche délétée pour cya a un phénotype facile à tester : pas de croissance sur milieu minimum contenant du maltose comme seule source de carbone (ou d'autres sucres PTS), et de petites colonies sur milieu solide comparées à une souche WT. Nous avons décidé de toujours aditionner du glucose dans le milieu de culture, afin de bien réprimer pBAD, dans la mesure où une petite quantité de protéine CcdB dans la cellule est délétaire et conduit à des mutations chromosomiques. Nous avons ensuite sélectionné l'insertion de la cassette dans le chromosome sur milieu riche-Kn-glucose (voir Matériel et Méthodes). Nous avons obtenu des dizaines de clones KnR, que nous avons étalés à nouveau sur milieu riche-Kn-glucose et milieu riche-arabinose. 100% des clones KnR ne croissent pas sur arabinose (sont sensibles à l'arabinose, aras). Les résultats pour un tel clone sont montrés à la figure 2B. L'expression de la toxine CcdB est donc bien réprimée sur glucose et très bien activée sur milieu arabinose conduisant à la mort cellulaire. De plus, aucune croissance n'a été observée sur milieu maltose pour les bactéries porteuses de la cassette Kn-pBADccdB comparée à la souche WT, ce qui indique que la cassette était correctement insérée dans le gène cya (Figure 2C). La cassette était donc parfaitement régulée et la souche NM1100 cya::Kn-pBADccdB avait les phénotypes attendus. L'étape suivante a été de tester si elle pouvait être utilisée comme marqueur de contre-sélection positive. 2. Validation expérimentale de la cassette Kn-pBADccdB comme contre-sélection positive en vue de l'ingénierie génétique dans le chromosome E.coli Pour tester l'abilité de la cassette Kn-pBADccdB à être utilisée comme cassette de contre-sélection, nous avons tenté d'obtenir plusieurs constructions dans le gène cya : 30 (i) une réversion vers le gène cya WT, (ii) une déletion d'une portion nucléotidique comprise entre 241 et 771 du gène cya, (iii) une mutation ponctuelle dans le gène cya, (iv) l'insertion d'une cassette rapporteur dans le gène cya (Figure 4). A cette fin, nous avons utilisé la souche CR104 (MG1655 cya::Kn-pBADccdB/pSIM5). 35 Différents fragments PCR (voir plus bas) ont été électroporés dans les bactéries pour obtenir des souches cya correctes : après électroporation et une nuit de récupération sur milieu riche contenant du glucose, les cellules ont été étalées sur milieu richearabinose pour contre-sélectionner contre la cassette ccdB (voir Matériel et Méthodes). (i) Pour l'expérience reverse, nous avons utilisé différentes tailles d'amplification PCR dans le gène cya (voir Matériel et Méthodes et Figure 4) de manière à estimer celle qui donnerait le meilleur taux de réussite. Tel que montré à la Figure 4B, ont donné une épaisse marque de colonies AraR : un petit fragment correspondant presque exactement à la région déletée cya par l'insertion de Kn-pBADccdB (Cya4-5), ou de plus grands fragments (Cya1-3, Cya1-2). 100% des clones araR étaient Kns, indiquant que la cassette Kn-pBADccdB a été correctement éliminée. De plus, 100% des clones araR Kns ont poussé sur milieu minimum contenant du maltose comme seule source de carbone : ils étaient sauvages pour le phénotype cya (Figure 2C, souches 3, 4 et 5). De manière à être sûrs d'avoir des révertants de la souche CR104 et non une contamination avec une autre souche E.coli sauvage, nous avons testé la résistance des clones au chloramphénicol (le pSIM5 portant une cassette Cm). Tous les clones araR Kns Mal+ ont été testés pour leur CmR (donnée non montrée). Finalement, plusieurs révertants ont été séquences pour confirmer à nouveau la séquence cya. Tous étaient sauvages pour le gène cya. (ii) Pour la délétion d'une partie du gène cya, nous avons électroporé la souche CR104 avec un oligonucléotide de 100 nt (DelCya). La séquence de l'amorce était composée de 50 nucléotides en aval du site d'insertion de la cassette Kn-pBADccdB, liée aux 50 nucléotides en amont de ce site. Très peu de colonies araR ont poussé sur milieu riche-arabinose après électroporation (Figure 4B) : 60% de ces clones étaient Kns. 100% des clones AraR Kns n'ont pas poussé sur milieu minimum contenant du maltose et avaient une séquence délétée pour cya correcte (Figure 2C, souche 7). (iii) Nous avons introduit une mutation ponctuelle dans le gène cya en électroporant la souche CR104 avec un fragment d'ADN portant un codon GAC, codant pour l'acide aspartique à la position 60, à la place d'un codon GGC codant une acide aminée glycine. Nous avons choisi cette mutation car Amin et Peterkofsky (1992) ont montré qu'une enzyme mutante CyaG6OD était moins active. Nous avons obtenu plusieurs colonies AraR (Figure 4B) : 50% de ces colonies AraR avaient une mutation exacte dans le gène cya après séquençage. Une de ces souches cya mutantes a été étalée sur milieu minimum maltose mais de façon non prévue, elle a bien poussé (Figure 2C, souche 6), montrant que la souche avec une Adenylate cyclase moins active ne présentait pas un phénotype cya. (iv) Le dernier test était l'insertion d'une construction rapporteur dans le gène cya.

Nous avons choisi une construction que nous avions déjà dans le laboratoire sur un plasmide pZA (Lutz et Bujard, 1997) : le gène rapporteur cherry cloné en aval du promoteur PLtetO-1. Sans le répresseur Tet, le promoteur PLtetO-1 est complètement actif et la forte expression du gène cherry donne des bactéries rouges. Les amorces forward et reverse pour amplifier la cassette PLtetO-1-cherry ont été dessinées de manière à porter des homologies au gène cya de 50 nucléotides juste avant et après le site d'insertion de la construction Kn-pBADccdB (Figure 4A). Après électroporation de la souche CR104, nous avons obtenu des colonies AraR (Figure 4B). Seulement 20% de ces colonies étaient rouges, avec une cassette rapporteur à la bonne place dans le gène cya. Ceci a été confirmé par le séquençage et aussi l'étalement de la colonie rouge sur milieu minimum maltose (Figure 2C, souche 8) : la souche n'a pas poussé. Au final, nous avons fait deux contrôles : a) Nous avons réalisé une électroporation de la souche CR104 sans ADN, de manière à avoir un contrôle négatif. Comme montré sur la Figure 4B (no DNA), seules deux colonies ont poussé sur milieu riche arabinose. La contre-sélection en utilisant notre cassette ccdB est donc puissante dans la mesure où nous n'avons pas obtenu de faux positifs. b) Nous avons électroporé le fragment Cya2 dans la souche CR201 ((cya::Kn- pBADccdB mais sans les gènes À red) : contrairement à la souche CR204, aucun clone araR n'a été récupéré (données non montrées) montrant que l'efficacité de la cassette Kn-pBADccdB est strictement dépendante du système de recombinaison À red.

II est donc possible, du fait de la cassette Kn-pBADccdB, de manipuler à loisir et de manière très efficace le chromosome d'E.coli. 3. Ingénierie d'un plasmide avec la cassette Kn-pBADccdB - Figure 5 Le plasmide pQE8OL (Qiagen) est très largement utilisé pour surproduire les 35 protéines. Ce plasmide a une cassette de résistance Cm qui est sans promoteur, et qui n'est pas utile dans certaines expériences. Cette cassette conduit à une légère résistance à Cm qui peut interférer avec certaines des constructions de nos souches. Nous avons décidé d'éliminer cette cassette Cm en utilisant du remodeling d'ADN par le biais de la cassette Kn-pBADccdB. Dans ce but, la cassette a été amplifiée avec deux amorces portant chacune 50pb d'homologie au pQE80, ce qui a permis son intégration par recombinaison dans ce plasmide, entre l'ATG et le codon STOP de la cassette Cm (voir la Figure 5A). Un clone KnRApR (NM1100/pQE80::Kn-pBADccdB) a été récupéré sur milieu riche-Kn-Ap-glucose et le plasmide a été purifié et vérifié par digestion. Dans une seconde étape de recombinaison, un oligonucléotide simple-brin 100-mer (les mêmes 50 nucléotides des homologies en amont et en aval comme dans la cassette) a été coélectroporé avec le nouveau plasmide pQE80::Kn-pBADccdB dans NM 1100, et les recombinants ont été récupérés sur milieu riche Ap-arabinose. Dix clones ApRaras ont été choisis et l'ADN a été extrait : les dix plasmides (pQE8OiCm) ont exactement la taille attendue et le profil de digestion correct (Figure 5). Quatre d'entre eux ont été séquences et les séquences étaient toutes correctes, avec le nucléotide juste avant l'ATG de la cassette Cm fusionnée à celui juste après le codon STOP. Le taux de succès de la contre-sélection positive médiée par KnpBADccdB était donc de 100% dans ce cas.

Claims (15)

1. REVENDICATIONS1. Cassette d'expression pour la modification par recombinaison homologue du génome d'une souche bactérienne présentant un génotype araC+, par 5 exemple Escherichia coli, ou pour la modification par recombinaison homologue d'un vecteur dans ladite souche, ladite cassette comprenant : - une séquence nucléotidique codant pour un marqueur, - un promoteur pBAD, et - une séquence nucléotidique codant pour une protéine cytotoxique sous 10 contrôle dudit promoteur pBAD, caractérisée en ce que ladite cassette ne comprend pas de séquence nucléotidique codant pour l'arabinase C.
2. 2. Cassette selon la revendication 1, selon laquelle ledit promoteur pBAD 15 présente une séquence dont le brin complémentaire s'hybride à SEQ ID NO:1 de manière sélective.
3. 3. Cassette selon la revendication 1 ou 2, selon laquelle la séquence dudit promoteur pBAD présente au moins 80% d'identité avec SEQ ID NO:1. 20
4. 4. Cassette selon l'une quelconque des revendications précédentes, selon laquelle la séquence nucléotidique codant pour une protéine cytotoxique code pour une protéine choisie dans le groupe consistant en un membre de la famille de toxines de type Rel/ParE (e.g. ReIE_K12, Re1E307, HigB, PasB, StbE, YoeB, Txe, 25 YafQ, ParERK2, ParE1, ParE3), un membre de la famille de toxines de type CcdB/MazF (e.g. CcdBF, CcdBoi57, MazF, YdcE, PemK, ChpBK), un membre de la famille de toxines de type VapC (i.e. VapC, MvpT), un membre de la famille des toxines de type GinA, un membre de la famille de toxines de type Doc, un membre de la famille de toxines de type GinC, un membre de la famille de toxines de type Zeta, 30 un membre de la famille de toxines de type YafO, un membre de la famille de toxines de type HipA, un membre de la famille de toxines de type GinB, un membre de la famille de toxines de type GinD et un membre de la famille de toxines de type VapD.
5. 5. Cassette selon l'une quelconque des revendications précédentes, 35 selon laquelle ladite cassette d'expression se trouve sous forme d'un ADN linéaire double brin.
6. 6. Cassette selon l'une quelconque des revendications précédentes, selon laquelle ladite séquence nucléotidique codant pour un marqueur est sélectionnée parmi les gènes de résistance à un antibiotique, les marqueurs colorés, 5 les marqueurs fluorescents et les marqueurs d'auxotrophie.
7. 7. Vecteur comprenant une cassette d'expression selon l'une quelconque des revendications 1 à 6. 10
8. 8. Organisme hôte transformé avec une cassette d'expression selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 ou un vecteur selon la revendication 7.
9. 9. Procédé de modification par recombinaison homologue du génome d'une souche bactérienne présentant un génotype araC+, par exemple Escherichia 15 coll, comprenant les étapes suivantes : a) on dispose d'une cassette d'expression selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, b) on procède à l'intégration de ladite cassette au génome de ladite souche par recombinaison homologue, 20 c) on sélectionne les clones modifiés de ladite souche ayant intégré la cassette au moyen dudit marqueur et d'un milieu de culture riche, contenant du glucose et en l'absence d'arabinose, d) on procède à l'intégration par recombinaison homologue d'une séquence nucléotidique d'intérêt à la place de ladite cassette d'expression au sein des 25 clones modifiés, et e) on sélectionne les clones nouvellement modifiés ayant intégré ladite séquence nucléotidique d'intérêt au moyen d'un milieu de culture riche, contenant de l'arabinose et en l'absence de glucose. 30
10. 10. Procédé selon la revendication 9, selon lequel on utilise un système permettant l'expression des gènes lambda red pour l'intégration par recombinaison homologue de l'étape b) et/ou de l'étape d).
11. 11. Procédé selon l'une des revendications 9-10, selon lequel la culture 35 de la souche selon l'étape b) et/ou selon l'étape d) s'effectue à une température comprise entre 40 et 44°C, par exemple à 42°C.
12. 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 9-11, selon lequel la séquence nucléotidique d'intérêt est choisie de manière à invalider un gène endogène de ladite souche, par exemple par délétion d'au moins un nucléotide dudit 5 gène.
13. 13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 9-11, selon lequel la séquence nucléotidique d'intérêt est choisie de manière à remplacer ou ajouter au moins un nucléotide dans un gène endogène de ladite souche, par exemple une 10 étiquette ou un gène qui code pour la GFP.
14. 14. Procédé de modification d'un vecteur par recombinaison homologue in vivo dans une souche hôte bactérienne présentant un génotype araC+, comprenant les étapes suivantes : 15 a) on dispose d'une cassette d'expression selon l'une quelconque des revendications 1-6, b) on co-transforme ladite souche hôte avec ladite cassette d'expression et ledit vecteur, de manière à permettre l'intégration de la cassette d'expression audit vecteur par recombinaison homologue, 20 c) on récupère les bactéries transformées qui possèdent le vecteur modifié ayant intégré ladite cassette d'expression, au moyen dudit marqueur et d'un milieu de culture riche contenant du glucose et en l'absence d'arabinose, d) on récupère ledit vecteur modifié, e) on co-transforme une autre colonie de ladite souche hôte avec la 25 séquence nucléotidique d'intérêt et ledit vecteur modifié, de manière à permettre l'intégration de la séquence nucléotidique d'intérêt audit vecteur modifié par recombinaison homologue, f) on récupère les bactéries transformées qui possèdent le vecteur nouvellement modifié ayant intégré ladite séquence nucléotidique d'intérêt, au moyen 30 d'un milieu de culture riche contenant de l'arabinose et en l'absence de glucose, et g) on récupère ledit vecteur nouvellement modifié.
15. 15. Procédé de production d'une molécule d'intérêt par une souche bactérienne présentant un génotype araC+, par exemple Escherichia coli, comprenant 35 les étapes suivantes :a) on dispose d'une cassette d'expression selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, b) on procède à l'intégration de ladite cassette au génome de ladite souche par recombinaison homologue, c) on sélectionne les clones modifiés de ladite souche ayant intégré la cassette au moyen dudit marqueur et d'un milieu de culture riche, contenant du glucose et en l'absence d'arabinose, d) on procède à l'intégration par recombinaison homologue d'une séquence nucléotidique d'intérêt à la place de ladite cassette d'expression au sein des 10 clones modifiés, e) on sélectionne les clones nouvellement modifiés ayant intégré ladite séquence nucléotidique d'intérêt au moyen d'un milieu de culture riche, contenant de l'arabinose et en l'absence de glucose, et f) on produit la molécule d'intérêt au moyen des clones nouvellement 15 modifiés.