FR2920158A1 - Production de plasmides et expression de proteines recombinantes dans des cellules cultivees sans antibiotiques - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne une cellule mutée telle qu'une bactérie ou une levure, dans laquelle le gène thyA codant la thymidylate synthase comporte un codon non sens, de préférence le codon ambre, ledit codon non sens remplaçant un codon codant un acide aminé et entraînant un arrêt de la traduction du gène thyA et l'auxotrophie de la cellule pour la thymidine. Avantageusement, le gène endA codant l'endonucléase 1 et/ou le gène recA codant la recombinase est inactivé dans ladite cellule mutée. L'invention concerne également un plasmide d'expression comprenant un transgène et une séquence de gène structural d'ARNt suppresseur comprenant un anticodon capable de s'apparier au codon non sens du gène thyA et qui est spécifique d'un acide aminé capable de restaurer la traduction du gène thyA muté et d'obtenir ainsi une protéine de type sauvage ou mutée possédant une activité thymidylate synthase. Un procédé de multiplication du plasmide d'expression est également revendiqué.
Description
La présente invention concerne une cellule mutée telle qu'une bactérie ou
une levure, dans laquelle le gène thyA codant la thymidylate synthase comporte un codon non sens, de préférence le codon ambre, ledit codon non sens remplaçant un codon codant un acide aminé et entraînant un arrêt de la traduction du gène thyA et l' auxotrophie de la cellule pour la thymidine. Avantageusement, le gène endA codant l'endonucléase 1 et/ou le gène recA codant la recombinase est inactivé dans ladite cellule mutée. L'invention concerne également un plasmide d'expression comprenant un transgène et une séquence de gène structural d'ARNt suppresseur comprenant un anticodon capable de s'apparier au codon non sens du gène thyA et qui est spécifique d'un acide aminé capable de restaurer la traduction du gène thyA muté et d'obtenir ainsi une protéine de type sauvage ou mutée possédant une activité thymidylate synthase. Un procédé de multiplication du plasmide d'expression est également revendiqué.
Le traitement de maladies ou la vaccination fait appel à l'injection de protéines thérapeutiques ou antigéniques. Celles-ci sont généralement purifiées à partir de cellules bactériennes ou autres telles que des levures qui contiennent des vecteurs d'expression. De manière alternative, les protéines d'intérêt peuvent également être exprimées in vivo, après injection du plasmide d'expression dans des cellules humaines ou d'animaux. Cette technique est désignée thérapie génique lorsque la protéine exprimée présente un aspect curatif et vaccination ADN lorsque la protéine d'intérêt est codée par une partie du matériel génétique d'un agent pathogène ou toxique, déclenchant ainsi une réaction immunitaire protectrice. Les plasmides d'expression portent de manière générale une origine de réplication, un gène de sélection tel qu'un gène de résistance à un antibiotique (kanamycine, ampicilline,...) favorisant le maintien du plasmide dans la cellule hôte, et un ou plusieurs transgènes avec des séquences nécessaires à leur expression dans les cellules animales (enhancer, promoteur, séquences de polyadénylation....), ou autres telles que les levures ou les bactéries.
Les plasmides d'expression sont généralement obtenus par multiplication dans des cellules bactériennes Escherichia coli (E. coli) en division. Afin d'assurer le maintien des plasmides à isoler ou exprimant les protéines recombinantes lors des cultures bactériennes, une pression de sélection telle que la résistance à un antibiotique, est exercée. Cependant, dans le cadre d'une utilisation clinique, il est déconseillé d'utiliser des plasmides ou des protéines recombinantes qui ont été préparés à partir de milieux de culture contenant des antibiotiques. L'injection d'antibiotiques pourrait conduire à une sensibilisation ou à des chocs anaphylactiques. De plus, in vivo, les plasmides injectés pourraient être transférés aux microbes de la flore endogène puis environnementale, qui pourraient alors acquérir ainsi une résistance aux antibiotiques.
Des plasmides dépourvus de gènes de résistance aux antibiotiques ont déjà été construits, notamment en utilisant un système de sélection de plasmides basé sur un mécanisme de titration de répresseur : le gène chromosomique essentiel dapD (impliqué dans la synthèse du peptidoglycane) d'E. coli est placé sous le contrôle transcriptionnel du promoteur/opérateur lac. En l'absence d'inducteur dans le milieu de culture, le répresseur de l'opéron lac se lie à l'opérateur et inhibe l'expression du gène essentiel. Seules poussent les souches qui contiennent un plasmide portant des séquences opératrices. La présence de ce plasmide permet de titrer le répresseur lié à l'opérateur situé en amont du gène dapD et de restituer la croissance bactérienne (Cranenburg et al, 2001 et 2004). Il apparaît toutefois que le rendement des plasmides préparés en utilisant cette stratégie n'est pas satisfaisant.
Une autre stratégie consiste à construire des mini-cercles ne contenant que la cassette d'expression du gène eucaryote. Les mini- cercles sont générés dans les bactéries à partir d'un plasmide qui porte des séquences procaryotes nécessaires à sa propagation et une cassette d'expression du gène eucaryote flanquée par des sites reconnus par une recombinase. La recombinaison génère deux molécules : les mini-cercles et un mini-plasmide portant les séquences bactériennes (Kreiss et al., 1998). Ce dernier pourra éventuellement être digéré en utilisant des endonucléases (Chen et al., 2003 et 2005). L'obtention des mini-cercles fait appel à plusieurs étapes : recombinaison de l'ADN plasmidique pour générer les mini-cercles, digestion éventuelle des mini-plasmides portant l'ADN bactérien et purification des mini-cercles. Bien que les techniques de purification et d'obtention des mini-cercles aient été considérablement améliorées, on ne peut exclure une contamination des préparations par les plasmides natifs (due à une recombinaison partielle) ou par des mini-plasmides portant les séquences procaryotes (due à une digestion enzymatique ou à une purification incomplète).
Il existe donc un besoin de trouver un nouveau système de pression de sélection pour la multiplication de plasmides d'expression dépourvus de gènes de résistance aux antibiotiques.
Ce besoin est résolu par la présente invention, qui permet de sélectionner les bactéries transformées par le plasmide d'expression en utilisant un milieu riche et d'obtenir un bon rendement en faisant appel à des techniques standard de purification. In vivo, ces plasmides ne présentent aucun désavantage en comparaison avec les vecteurs d'expression couramment utilisés.
La présente invention consiste en une nouvelle combinaison d'une souche mutante d'E. coli et de plasmides dépourvus de gènes de résistance aux antibiotiques. La production de ces plasmides est basée sur la suppression d'une mutation ponctuelle générant un codon stop (mutation non sens) introduite dans un gène essentiel d'E. coli, par un ARNt suppresseur codé par le plasmide d'intérêt (cf. Figure 1).
Les domaines d'application de la présente invention sont les vecteurs utilisés pour la transfection de cellules animales, la production de vecteurs pour la vaccination ADN ou la thérapie génique chez l'homme ou l'animal, et l'utilisation de vecteurs pour la production de protéines recombinantes.
Ainsi selon un premier aspect, la présente invention a pour objet une cellule mutée dans laquelle le gène thyA codant la thymidylate synthase (ThyA) comporte un codon non sens, ledit codon non sens remplaçant un codon codant un acide aminé et entraînant un arrêt de la traduction du gène thyA et l'auxotrophie de ladite cellule pour la thymidine.
Par cellule mutée on entend désigner toute cellule exprimant la protéine ThyA dans laquelle une mutation est introduite dans le gène thyA (gène thyA muté). Avantageusement, la cellule mutée est choisie parmi les bactéries et les levures.
Les bactéries ou les levures pouvant être utilisées dans le cadre de la présente invention peuvent être de tous types étant entendu que celles-ci doivent contenir le gène thyA codant la thymidylate synthase (thyA). Il s'agit par exemple des levures du genre Pichia ou Saccharomyces ou des bactéries Escherichia coli (E. coli), Salmonella, Shigella ou Listeria. De manière préférée, la cellule mutée selon l'invention est une bactérie Escherichia coli (E. coli). Avantageusement, la souche E. coli est la souche MG1655 (obtenue auprès de The Coli Genetic Stock Center , USA) dont le génome a été entièrement séquencé (Blattner et al., 1997).
Les quatre bases nucléotidiques des molécules d'ADN portent l'information génétique. Cette information, sous la forme de codons de trois bases contiguës, est transcrite en ARNm puis traduite par l'ARNt et les ribosomes pour former des protéines. Le code génétique est la relation entre un codon et un acide aminé particulier. Parmi les 64 codons possibles qui forment le code génétique, il existe trois codons stop ou codons non-sens ou encore codons de terminaison, qui sont connus pour stopper la production de protéines au niveau des ribosomes. Les trois codons stop sont le codon ambre UAG, le codon ocre UAA et le codon opale UGA. Les mutations qui changent un codon en un codon stop sont appelées des mutations non sens et induisent l'arrêt de la synthèse protéique.
La mutation non sens de type ambre est préférée car les codons stop UAG sont minoritaires (7.6%) par rapport aux codons stop UAA (63%) et UGA (29.4%). Ceci minimise le risque d'affecter la synthèse des autres protéines bactériennes par une reconnaissance du codon stop par un ARN-t suppresseur de mutation, entraînant l'insertion d'un acide aminé.
Les ARN de transfert (ARNt) traduisent l'ARNm en une protéine sur le ribosome.
Chaque ARNt contient une région anticodon qui hybride avec l'ARNm, et un acide aminé qui peut être attaché à la protéine en cours de synthèse. Les ARNt ont une taille comprise entre environ 72 à 90 nucléotides et se replient en une structure en "feuille de trèfle". Les ARNt sont transcrits par l'ARN polymérase III et contiennent leurs propres promoteurs qui deviennent une partie de la séquence codant l'ARNt mature.
Les suppresseurs non sens sont des allèles de gènes ARNt qui sont modifiés au niveau de l'anticodon afin qu'ils puissent insérer un acide aminé en s'hybridant à un codon stop. Par exemple, une mutation ambre dans un gène aboutit à la création d'un codon UAG dans l'ARNm. Un gène suppresseur de la mutation ambre produit un ARNt avec un anticodon CUA qui introduit un acide aminé au niveau du site UAG, permettant de continuer la traduction malgré la présence du codon de terminaison ambre.
La mutation non sens létale est introduite dans le gène thyA qui code une thymidylate synthase (thyA) (EC 2.1.1.45). Cette enzyme est impliquée dans la synthèse de déoxythymidine 5'-monophosphate (dTMP), précurseur utilisé lors de la synthèse d'ADN. La mutation non sens peut aussi être introduite dans le gène thyA codant une protéine ayant les propriétés enzymatiques de la thymidylate synthase (EC 2.1.1.45).
Les mutants obtenus sont auxotrophes pour la thymidine et sont isolés en ajoutant ce supplément dans le milieu de culture. La thymidine pénètre dans les cellules via un transporteur de nucléosides et est ensuite transformée en dTMP par une voie alternative impliquant la thymidine kinase (cf. Figure 2). En l'absence d'apport exogène de thymidine, la mutation dans le gène thyA est létale ; seules poussent les souches qui contiennent un plasmide portant une origine de réplication, une cassette d'expression spécifique des cellules de mammifère, des bactéries, des levures ou autres et un ARNt suppresseur. Ce dernier contient un anticodon modifié afin de permettre un appariement avec le codon stop, restituant ainsi une traduction complète de la protéine ThyA de type sauvage ou mutée mais possédant néanmoins une activité enzymatique thymidylate synthase. Les souches portant le plasmide sont donc sélectionnées par une restauration de leur croissance. Cette sélection ne nécessite pas l'utilisation d'antibiotiques et peut être réalisée en utilisant un milieu riche tel que celui de Mueller Hinton contenant des quantités infimes voire nulles de thymidine (Fluka).
La mutation non sens peut être introduite à n'importe quel site du gène thyA, à des positions où la suppression par l'ARNt suppresseur sera effective. De nombreuses études ont en effet montré que la séquence nucléique localisée en aval de la mutation ambre influe sur l'efficacité de suppression (Kleina et al., 1990 ; Normanly et al., 1986). De préférence, la bactérie Escherichia cati (E. cati) mutée est caractérisée en ce que le codon non sens remplace un codon codant un acide aminé de la thymidylate synthase choisi dans le groupe constitué par l'histidine en position 147, le glutamate en position 14 ou 223, l'arginine en position 35 ou 127, la phénylalanine en position 30, l'aspartate en position 81 ou 105, la glutamine en position 33 et l'asparagine en position 121. De manière davantage préférée, le codon non sens remplace le codon codant l'histidine en position 147 de la thymidylate synthase.
Les mutations non sens UAG sont préférentiellement supprimées en utilisant des ARN-t suppresseurs de type Phe, Cyst, His, Gly, Ala, Lys, Pro ou Gln qui sont des suppresseurs efficaces de mutation ambre et/ou insérant l'acide aminé désiré (Bradley et al., 1981 ; Normanly et al., 1986 et 1990 ; Kleina et al., 1990). La modification de l'anticodon peut effectivement altérer la spécificité de l'acide aminé greffé sur l'ARNt ; ceci n'est pas souhaitable lorsque l'acide aminé est présent dans un site actif de l'enzyme.
La mutation non-sens introduite au niveau de l'histidine 147 est efficacement supprimée en utilisant un ARNt suppresseur histidine contenant un anticodon modifié de type CUA et en aval les nucléotides AA ; qui permettent d'augmenter l'efficacité de suppression (Kleina et al., 1990).
Selon un mode de réalisation particulier, la cellule mutée selon l'invention est caractérisée en ce que le codon non sens est le codon ambre UAG.
Selon un mode de réalisation préféré, la cellule mutée selon l'invention est la cellule E. coli MG1655 thyA#d2 déposée à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 PARIS Cedex 15, France, le 5 avril 2007 sous le numéro I-3739.
De préférence, la cellule mutée selon l'invention est caractérisée en ce que le gène endA codant l'endonucléase 1 comprend une mutation induisant une meilleure stabilité plasmidique dans ladite cellule mutée. Une telle cellule contient donc le gène thyA contenant une mutation non sens et le gène endA contenant une mutation induisant une meilleure stablitité plasmidique.
La qualité de l'ADN plasmidique isolé de souches endA+ ou de mutants endA a été étudiée (Schoenfeld et al., 1995). Il a été démontré que la qualité de l'ADN préparé à partir de mutants endA est globalement meilleure que celle de l'ADN produit dans les souches endA+ testées.
La mutation peut être introduite dans le gène endA codant une protéine ayant les propriétés enzymatiques de l'endonucléase 1 (EC 3.1.21.1).
Le gène endA peut être inactivé par mutation telle qu'une délétion, une mutation ponctuelle ou une insertion, engendrant une perte de fonction de la protéine ciblée. De préférence, la mutation est non polaire ; elle n'affecte pas la transcription et la traduction des gènes situés en aval du gène endA. Une délétion de la séquence codante est préférée afin d'éviter d'éventuels événements de réversion. De manière davantage préférée, la mutation génère une délétion de la séquence codant les acides aminés 7 à 234 de la protéine EndA qui est constituée de 235 acides aminés.
Selon un mode de réalisation davantage préféré, la cellule mutée selon l'invention est la cellule E. coli MG1655 thyA endA#1.2.C.3 déposée à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 PARIS Cedex 15, France, le 5 avril 2007 sous le numéro I-3738.
De préférence, la cellule mutée selon l'invention est caractérisée en ce que le gène recA codant une recombinase impliquée dans la recombinaison de séquences d'ADN est muté pour éviter des mécanismes de recombinaison entre le génome bactérien et les plasmides. Une telle cellule contient donc le gène thyA contenant une mutation non sens, le gène endA contenant une mutation induisant une meilleure stablitité plasmidique et/ou le gène recA contenant une mutation pour éviter les mécanismes de recombinaison entre le génome bactérien et les plasmides.
La mutation peut être introduite dans le gène recA codant une protéine ayant les propriétés enzymatiques de la recombinase.
Le gène recA peut être inactivé par mutation telle qu'une délétion, mutation ponctuelle, insertion engendrant une perte de fonction de la protéine ciblée. De préférence, la mutation est non polaire ; elle n'affecte pas la transcription et la traduction des gènes situés en aval du gène recA. Une délétion de la séquence codante est préférée afin d'éviter d'éventuels événements de réversion. De manière davantage préférée, la mutation génère une délétion de la séquence codant les acides aminés 5 à 343 de la protéine RecA qui est constituée de 353 acides aminés.
Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, la cellule mutée selon l'invention est la cellule E. coli MG1655 thyA endA recA#TM1a déposée à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 PARIS Cedex 15, France, le 5 avril 2007 à la CNCM sous le numéro I-3737.
Selon un mode de réalisation privilégié, la cellule mutée selon l'invention est transformée par un plasmide d'expression, et ce plasmide comprend : - une origine de réplication, - une séquence nucléotidique codant une protéine recombinante d'intérêt, - une cassette d'expression pour l'expression de ladite protéine recombinante d'intérêt dans une cellule hôte, et - une séquence de gène structural d'ARNt suppresseur, ledit ARNt suppresseur comprenant un anticodon capable de s'apparier à un codon non sens et étant spécifique d'un acide aminé capable de restaurer la traduction dudit gène thyA muté dans la cellule, ladite cellule étant capable de se multiplier dans un milieu exempt de thymidine.
La cellule hôte dans laquelle est exprimée la protéine recombinante d'intérêt peut être la cellule mutée elle-même ou bien une autre cellule telle qu'une cellule de mammifère (homme, animal,...) qui sera transformée par le plasmide d'expression selon l'invention. Avantageusement, la cassette d'expression est choisie parmi les cassettes d'expression eucaryotes pour l'expression de ladite protéine recombinante d'intérêt dans une cellule hôte de mammifère ou une levure et les cassettes d'expression procaryotes pour l'expression de ladite protéine dans des cellules hôtes procaryotes telles que des cellules bactériennes.
Les origines de réplication préférées sont celles bien connues de l'homme du métier qui conduisent à l'obtention de plusieurs centaines de copies de plasmides par cellules. Les origines de réplication davantage préférées sont de type ColEl ou pMB1 ou des dérivés. Outre l'origine de réplication qui permet l'initiation de la réplication, le plasmide d'expression contient une cassette d'expression eucaryote ou procaryote permettant l'expression de la protéine d'intérêt dans une cellule animale, une levure, une bactérie ou autres. Les cassettes d'expression procaryotes contiennent un promoteur fort de type T7, Tac (promoteur hybride composé de la région -35 du promoteur trp et de la région -10 du promoteur/opérateur lacUV5) ou lac. Elles peuvent également contenir des étiquettes de type His , glutathione S-transférase ou MBP = maltose binding protein destinées à purifier les protéines sous forme de protéines de fusion. Un site spécifique reconnu par des protéases de type thrombine, TEV ou enterokinase, pourra être introduit entre la protéine étiquette et la protéine d'intérêt afin d'obtenir après digestion de la protéine de fusion une protéine native. Les cassettes d'expression eucaryotes contiennent en général une région promotrice de la transcription fonctionnelle dans la cellule animale (ou promoteur), un enhancer (courte région d'ADN sur laquelle peut se fixer un activateur de la transcription) et une région située en 3', qui spécifie un signal de fin de transcription et un site de polyadénylation (Garmory et al., 2003). Parmi les différents promoteurs qui peuvent être utilisés, on peut citer : le promoteur / enhancer ubiquitaire immediate-early du cytomégalovirus CMV. L'introduction d'intron en aval du promoteur, tel que l'intron A, peut permettre d'élever les niveaux d'expression en augmentant apparemment le taux de polyadénylation et/ou le transport nucléaire associé à l'épissage de l'ARN. Dans le cas d'une application dans les domaines de la thérapie génique, les réponses immunitaires liées à une expression à un site aberrant du produit du transgène peuvent être réduites en utilisant des promoteurs spécifiques de certains tissus tels que le muscle ou la peau. Parmi les promoteurs spécifiques de muscle, on peut citer le promoteur desmine qui contrôle l'expression de la protéine desmine localisée spécifiquement dans les filaments du muscle. Le promoteur de la créatine kinase musculaire qui est impliquée dans le transfert du radical phosphoryl de la phosphocréatine vers l'ADP pour la convertir en ATP. Les promoteurs de gènes codant des protéines spécifiques des kératinocytes, cellules de la couche superficielle de la peau, peuvent être utilisés. Les séquences de polyadénylation préférées sont celles de l'hormone de croissance bovine, la (3-globine de lapin ou la séquence de polyadénylation SV40 éventuellement en combinaison avec un second enhancer SV40 localisé en aval du signal de polyadénylation. Le plasmide peut en outre comporter des séquences adjuvantes telles que celles reconnues par les miRNA (micro ARN) permettant d'améliorer la spécificité d'expression cellulaire.
Par protéine recombinante d'intérêt, on entend désigner toutes protéines, polypeptides ou peptides susceptibles d'être utilisés dans des domaines tels que celui de la santé humaine ou animale, de la cosmétologie, de la nutrition animale, de l'agro-industrie ou de l'industrie chimique. Avantageusement, la protéine recombinante d'intérêt est choisie dans le groupe constitué par les protéines de type eucaryote telles que celles présentant un intérêt thérapeutique ou celles modulant (stimulation/répression) la réponse immunitaire. Dans le cadre de la vaccination ADN, la protéine d'intérêt appartiendra au groupe constitué par des déterminants antigéniques identifiés chez des agents pathogènes d'hommes ou d'animaux et produisant éventuellement des toxines. Comme exemples de protéines recombinantes d'intérêt on peut citer, sans toutefois s'y limiter, l'érythropoïétine, la dystrophine, l'insuline, l'anti-TNFalpha, les cytokines, les facteurs de coagulation tels que le facteur IX humain, les antigènes protecteurs tels que ceux de Bacillus anthracis, Mycobacterium tuberculosis et l'antigène spécifique de la membrane prostatique (PSMA).
Avantageusement, la cellule mutée selon l'invention est caractérisée en ce que l'ARNt suppresseur est spécifique de l'histidine et permet de restaurer la traduction du gène thyA muté comportant un codon non sens remplaçant le codon codant l'histidine en position 147 de la thymidylate synthase.
De manière encore plus avantageuse la cellule mutée selon l'invention est caractérisée en ce que l'ARNt suppresseur comprend un anticodon CUA capable de s'associer au codon non sens ambre UAG.
De préférence, la cellule mutée selon l'invention est caractérisée en ce que la cassette d'expression eucaryote comprend un promoteur et des séquences de polyadénylation, ledit promoteur et lesdites séquences étant spécifiques des cellules hôtes de mammifère. De manière davantage préférée, le promoteur est le promoteur du cytomégalovirus (CMV) et les séquences de polyadénylation sont de type hormone de croissance bovine (HBV).
Egalement, le plasmide d'expression contient tout élément permettant l'expression de l'ARNt suppresseur. Avantageusement, la cellule mutée selon l'invention est caractérisée en ce que la séquence de gène structural d'ARNt suppresseur est exprimée à partir du promoteur fort lpp de type procaryote (Nakamura et al., 1979) et contient à son extrémité 3' la séquence de terminaison de transcription de l'opéron rrnC (Young, 1979), ladite séquence étant de préférence orientée de manière divergente par rapport à la séquence nucléotidique codant une protéine recombinante d'intérêt. Cette orientation divergente permet d'éliminer le risque d'expression de dARNt suppresseur à partir du promoteur eucaryote dans les cellules hôtes de mammifère ou de levure.
De manière encore préférée, la cellule mutée selon l'invention est caractérisée en ce que ledit plasmide est le plasmide pFAR1 (cf. Figure 7). De manière préférée entre toutes, la cellule mutée selon l'invention est caractérisée en ce que ledit plasmide est le plasmide pFAR4 de séquence SEQ ID N 21. Les plasmides dérivés de pFAR4 constituent également un mode de réalisation avantageux de l'invention.
Le plasmide d'expression selon la présente invention possède avantageusement un nombre réduit de motifs CpG, qui sont connus comme étant responsables de réponses inflammatoires et immunes, lesquelles doivent être évitées dans les applications de thérapie génique. Egalement, le plasmide selon l'invention possède avantageusement une taille réduite, un maximum de séquences procaryotes est éliminé et/ou des sites de clonage unique qui facilitent les manipulations moléculaires sont introduits.
Selon un deuxième aspect, la présente invention a pour objet un plasmide d'expression comprenant une origine de réplication, une séquence nucléotidique codant une protéine recombinante d'intérêt, une cassette d'expression pour l'expression de ladite protéine recombinante d'intérêt dans une cellule hôte et une séquence de gène structural d'ARNt suppresseur, caractérisé en ce que ledit ARNt suppresseur comprend un anticodon capable de s'apparier à un codon non sens et est spécifique d'un acide aminé capable de restaurer la traduction du gène thyA dans une cellule mutée selon la présente invention.
Avantageusement, la cassette d'expression est choisie parmi les cassettes d'expression eucaryotes pour l'expression de ladite protéine recombinante d'intérêt dans une cellule hôte de mammifère ou une levure et les cassettes d'expression procaryotes pour l'expression de ladite protéine dans des cellules hôtes procaryotes telles que des cellules bactériennes.
De préférence, lorsque la cellule mutée est E. coli, le codon non sens remplace un codon codant un acide aminé de la thymidylate synthase choisi dans le groupe constitué par l'histidine en position 147, le glutamate en position 14 ou 223, l'arginine en position 35 ou 127, la phénylalanine en position 30, l'aspartate en position 81 ou 105, la glutamine en position 33 et l'asparagine en position 121. De manière davantage préférée, le plasmide d'expression selon l'invention est caractérisé en ce que l'ARNt suppresseur est spécifique de l'histidine et permet de restaurer la traduction du gène thyA comportant un codon non sens remplaçant le codon codant l'histidine en position 147 de la thymidylate synthase.
De préférence, l'ARNt suppresseur comprend un anticodon CUA capable de s'associer au codon non sens ambre UAG.
De préférence, la cellule mutée selon l'invention est la cellule E. coli MG1655 thyA#d2 déposée à la CNCM le 5 avril 2007 sous le numéro I-3739.
Selon un mode de réalisation préféré, le plasmide d'expression selon l'invention est caractérisé en ce que le gène endA codant l'endonucléase 1 comprend une mutation induisant une meilleure stabilité plasmidique dans ladite cellule mutée. De manière davantage préférée, la cellule mutée selon l'invention est la cellule E. coli MG1655 thyA endA#1.2.C.3 déposée le 5 avril 2007 à la CNCM sous le numéro I-3738.
Selon un autre mode de réalisation préféré, le plasmide d'expression selon l'invention est caractérisé en ce que le gène recA codant une recombinaseimpliquée dans la recombinaison de séquences d'ADN est muté pour éviter des mécanismes de recombinaison entre le génome bactérien et les plasmides. De manière encore plus préférée, la cellule mutée selon l'invention est la cellule E. coli MG1655 thyA endA recA#TMla déposée le 5 avril 2007 à la CNCM sous le numéro I-3737.
Selon un mode de réalisation avantageux, le plasmide d'expression selon l'invention est caractérisé en ce que la cassette d'expression eucaryote comprend un promoteur et des séquences de polyadénylation, ledit promoteur et lesdites séquences étant spécifiques des cellules hôtes de mammifère. De préférence, le promoteur est le promoteur du cytomégalovirus (CMV) et les séquences de polyadénylation sont de type hormone de croissance bovine (BGH).
Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux lorsque la cellule mutée est E. coli, le plasmide d'expression selon l'invention est caractérisé en ce que la séquence de gène structural d'ARNt suppresseur est exprimée à partir du promoteur fort lpp de type procaryote et contient à son extrémité 3' la séquence de terminaison de transcription de l'opéron rrnC, ladite séquence étant de préférence orientée de manière divergente par rapport à la séquence nucléotidique codant une protéine recombinante d'intérêt.
De manière encore préférée, ledit plasmide d'expression est le plasmide pFAR1. De manière préférée entre toutes, ledit plasmide d'expression est le plasmide pFAR4 de séquence SEQ ID N 21 ou des dérivés du pFAR4.
Avantageusement, la protéine recombinante d'intérêt est choisie dans le groupe constitué par les protéines de type eucaryotes telles que celles présentant un intérêt thérapeutique ou celles modulant (stimulation/répression) la réponse immunitaire. Dans le cadre de la vaccination ADN, la protéine d'intérêt appartiendra au groupe constitué par des déterminants antigéniques identifiés chez des pathogènes d'hommes ou d'animaux, produisant éventuellement des toxines. De préférence, la protéine recombinante d'intérêt est choisie dans le groupe constitué par l' érythropoïétine, la dystrophine, l'insuline, l'anti-TNFalpha, les cytokines, les facteurs de coagulation tels que le facteur IX humain, les antigènes protecteurs tels que ceux de Bacillus anthracis, Mycobacterium tuberculosis et l'antigène spécifique de la membrane prostatique (PSMA).
Selon un troisième aspect, la présente invention a pour objet un procédé de multiplication d'un plasmide d'expression comprenant une origine de réplication, une séquence nucléotidique codant une protéine recombinante d'intérêt, une cassette d'expression pour l'expression de ladite protéine recombinante d'intérêt dans une cellule hôte et une séquence de gène structural d'ARNt suppresseur, ledit procédé comprenant : - la culture d'une cellule mutée dans laquelle le gène thyA comporte un codon non sens, ledit codon non sens remplaçant un codon codant un acide aminé et entraînant un arrêt de la traduction du gène thyA et l'auxotrophie de la cellule mutée pour la thymidine, - l'introduction du plasmide d'expression dans ladite cellule en culture, dans laquelle l'ARNt suppresseur du plasmide d'expression comprend un anticodon capable de s'apparier au codon non sens du gène thyA et est spécifique d'un acide aminé capable de restaurer la traduction dudit gène thyA dans la cellule mutée, et -l'extraction du plasmide d'expression à partir de la culture cellulaire, ladite culture étant effectuée dans un milieu exempt de thymidine afin de permettre la sélection des cellules transformées par ledit plasmide d'expression.
Avantageusement, la cassette d'expression est choisie parmi les cassettes d'expression eucaryotes pour l'expression de ladite protéine recombinante d'intérêt dans une cellule hôte de mammifère ou une levure et les cassettes d'expression procaryotes pour l'expression de ladite protéine dans des cellules hôtes procaryotes telles que des cellules bactériennes.
L'introduction du plasmide d'expression dans la cellule mutée peut être effectuée selon toute technique connue de l'homme du métier. Il peut s'agir notamment de transformation, d'électroporation, de conjugaison ou de toute autre technique appropriée.
Les plasmides d'expression obtenus après multiplication sont extraits selon toute technique connue de l'homme de l'art.
De préférence, lorsque la cellule mutée est E. coli, le codon non sens remplace un codon codant un acide aminé de la thymidylate synthase choisi dans le groupe constitué par l'histidine en position 147, le glutamate en position 14 ou 223, l'arginine en position 35 ou 127, la phénylalanine en position 30, l'aspartate en position 81 ou 105, la glutamine en position 33 et l'asparagine en position 121. De manière davantage préférée, le procédé de multiplication selon l'invention est caractérisé en ce que l'ARNt suppresseur est spécifique de l'histidine et permet de restaurer la traduction du gène thyA comportant un codon non sens remplaçant le codon codant l'histidine en position 147 de la thymidylate synthase.
De manière davantage préférée, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que l'ARNt suppresseur comprend un anticodon CUA capable de s'associer au codon non sens ambre UAG.
De préférence, la cellule mutée selon l'invention est la cellule E. coli MG1655 thyA#d2 déposée à la CNCM le 5 avril 2007 sous le numéro I-3739.
Selon un mode de réalisation préféré, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que le gène endA codant l'endonucléase 1 comprend une mutation induisant une meilleure stabilité plasmidique dans ladite cellule mutée. De manière davantage préférée, la cellule mutée selon l'invention est la cellule E. coli MG1655 thyA endA#1.2.C.3 déposée le 5 avril 2007 à la CNCM sous le numéro I-3738.
Selon un autre mode de réalisation préféré, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que le gène recA codant une recombinase impliquée dans la recombinaison de séquences d'ADN est muté pour éviter des mécanismes de recombinaison entre le génome bactérien et les plasmides. De manière encore plus préférée, la cellule mutée selon l'invention est la cellule E. coli MG1655 thyA endA recA#TMla déposée le 5 avril 2007 à la CNCM sous le numéro I-3737.
Selon un mode de réalisation avantageux, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que la cassette d'expression eucaryote comprend un promoteur et des séquences de polyadénylation, ledit promoteur et lesdites séquences étant spécifiques des cellules de mammifère. De préférence, le promoteur est le promoteur du cytomégalovirus (CMV) et les séquences de polyadénylation sont de type hormone de croissance bovine (BGH).
Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que, lorsque la cellule mutée est E. coli, la séquence de gène structural d'ARNt suppresseur est exprimée à partir du promoteur fort lpp de type procaryote et contient à son extrémité 3' la séquence de terminaison de transcription de l'opéron rrnC, ladite séquence étant de préférence orientée de manière divergente par rapport à la séquence nucléotidique codant une protéine recombinante d'intérêt.
De manière encore préférée, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que ledit plasmide est le plasmide pFAR1. De manière préférée entre toutes, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que ledit plasmide est le plasmide pFAR4 de séquence SEQ ID N 21 ou des plasmides dérivés du pFAR4.
Avantageusement, la protéine recombinante d'intérêt est choisie dans le groupe constitué par les protéines de type eucaryotes telles que celles présentant un intérêt thérapeutique ou celles modulant (stimulation/répression) la réponse immunitaire. Dans le cadre de la vaccination ADN, la protéine d'intérêt appartiendra au groupe constitué par des déterminants antigéniques identifiés chez des pathogènes d'hommes ou d'animaux. De préférence, la protéine recombinante d'intérêt est choisie dans le groupe constitué par l' érythropoïétine, la dystrophine, l'insuline, l'anti-TNFalpha, les cytokines, les facteurs de coagulation tels que le facteur IX humain, les antigènes protecteurs tels que ceux de Bacillus anthracis, Mycobacterium tuberculosis et l'antigène spécifique de la membrane prostatique (PSMA).
Selon un quatrième aspect, la présente invention a pour objet un procédé de production d'une protéine recombinante d'intérêt comprenant : - la multiplication d'un plasmide d'expression selon le procédé de multiplication selon la présente invention et décrit ci-dessus, - la transformation d'une cellule hôte par le plasmide d'expression obtenu à l'étape précédente, - la culture de ladite cellule hôte transformée dans un milieu de culture permettant l'expression de la protéine recombinante d'intérêt, et - la purification de la protéine recombinante d'intérêt à partir du milieu de culture ou de la cellule hôte transformée.
Selon un cinquième aspect, la présente invention a pour objet une composition pharmaceutique comprenant le plasmide d'expression selon l'invention dont la protéine d'intérêt est choisie dans le groupe constitué par les protéines de type eucaryotes telles que celles présentant soit un intérêt thérapeutique ou celles modulant (stimulation/répression) la réponse immunitaire. Dans le cadre de la vaccination ADN, la protéine d'intérêt appartiendra au groupe constitué par des déterminants antigéniques identifiés chez des pathogènes d'hommes ou d'animaux et produisant éventuellement des toxines. De préférence, la protéine recombinante d'intérêt est choisie dans le groupe constitué par l'érythropoïétine, la dystrophine, l'insuline, l'anti-TNFalpha, les cytokines, les facteurs de coagulation tels que le facteur IX humain, les antigènes protecteurs tels que ceux de Bacillus anthracis, Mycobacterium tuberculosis et l'antigène spécifique de la membrane prostatique (PSMA).
Le plasmide d'expression peut être associé à un vecteur chimique et/ou biochimique de transfection. Il peut s'agir notamment de cations (phosphate de calcium, DEAE-dextran,...), de liposomes. Les vecteurs synthétiques associés peuvent être des lipides ou polymères cationiques. Les compositions pharmaceutiques selon l'invention peuvent être formulées en vue d'administrations par voie topique, orale, parentérale, intranasale, intraveineuse,30 intramusculaire, sous-cutanée, intraoculaire, transdermique, etc. De préférence, le plasmide d'expression est utilisé sous une forme injectable ou en application. Il peut être mélangé à tout véhicule pharmaceutiquement acceptable pour une formulation injectable, notamment pour une injection directe au niveau du tissu à traiter. Il peut s'agir en particulier de solutions stériles, isotoniques. L'administration du plasmide peut aussi être favorisée au moyen d'une méthode physique telle que l'utilisation de champs électriques, d'un courant électrique, d'ultrasons, de pression hydrostatique selon la méthode hydrodynamique. Une injection directe dans la région atteinte du patient est intéressante car elle permet de concentrer l'effet thérapeutique au niveau des tissus affectés. A titre d'exemples de tissus dans lesquels on peut injecter le plasmide, on pourrait citer le muscle, le foie, l'oeil ou la peau et également les tumeurs. Les doses utilisées peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du gène, du mode d'administration, de la pathologie concernée ou encore de la durée du traitement recherchée.
Selon un autre aspect, la présente invention a pour objet l'utilisation du plasmide d'expression selon l'invention pour la transfection in vitro ou ex vivo dans une cellule hôte de la séquence nucléotidique codant une protéine recombinante d'intérêt.
Selon un autre aspect, la présente invention a pour objet un plasmide d'expression selon l'invention dont la protéine recombinante d'intérêt est choisie dans le groupe constitué par les protéines de type eucaryotes telles que celles présentant un intérêt thérapeutique ou celles modulant (stimulation/répression) la réponse immunitaire, pour son utilisation à titre de médicament ou à titre de vaccin. Dans le cadre de la vaccination ADN, la protéine d'intérêt appartiendra au groupe constitué par des déterminants antigéniques identifiés chez des pathogènes d'hommes ou d'animaux et produisant éventuellement des toxines. De préférence, la protéine recombinante d'intérêt est choisie dans le groupe constitué par l'érythropoïétine, la dystrophine, l'insuline, l'anti-TNFalpha, les cytokines, les facteurs de coagulation tels que le facteur IX humain, les antigènes protecteurs tels que ceux de Bacillus anthracis, Mycobacterium tuberculosis et l'antigène spécifique de la membrane prostatique (PSMA).
La présente invention concerne également l'utilisation du plasmide d'expression selon la présente invention pour le traitement et/ou la prévention de nombreuses pathologies, incluant les maladies génétiques, les maladies neurodégénératives (Alzheimer, Parkinson, sclérose latérale amyotrophique,...), les cancers, les pathologies liées aux infections virales (SIDA, hépatites,...). Enfin, la présente invention concerne une méthode de traitement d'une pathologie telle que celles précédemment citées comprenant l'administration du plasmide d'expression selon la présente invention.
Selon un dernier aspect, la présente invention a pour objet l'utilisation du plasmide d'expression selon la présente invention ou de la cellule mutée contenant le plasmide d'expression pour la production de protéines recombinantes d'intérêt.
Pour la mise en pratique de la présente invention, on utilise de nombreuses techniques classiques en biologie moléculaire, en microbiologie et en génie génétique. Ces techniques sont bien connues et sont expliquées, par exemple, dans Current Protocols in Molecular Biology, Volumes I, II et III, 1997 (F. M. Ausubel, éd.) ; Sambrook et coll., 1989, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2ème édition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. ; DNA Cloning : A Practical Approach, Volumes I et II, 1985 (D.N. Glover, éd.) ; Oligonucleotide Synthesis, 1984 (M.L. Gait, éd.) ; Nucleic Acid Hybridization, 1985 (Harnes et Higgins) ; Transcription and Translation, 1984 (Hames et Higgins, éd.) ; Animal Cell Culture, 1986 (R.I. Freshney, éd.) ; Immobilized Cells and Enzymes, 1986 (IRL Press) ; Perbal, 1984, A Pratical Guide to Molecular Cloning ; la série, Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.) ; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, 1987 (J.H. Miller et M.P. Calos, éds., Cold Spring Harbor Laboratory) ; et Methods in Enzymology Vol. 154 et Col. 155 (Wu et Grossmann, et Wu, éd. respectivement). La présente invention sera plus complètement décrite à l'aide des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.
LEGENDE DES FIGURES
Figure 1 : Schéma descriptif de la stratégie utilisée pour la sélection de plasmides dépourvus de gènes de résistance aux antibiotiques. L'introduction d'un codon stop de type ambre dans le gène essentiel conduit à l'arrêt prématuré de la synthèse de la protéine et à l'auxotrophie du mutant. Une modification de l'anticodon de l'ARN-t chargé avec l'acide aminé préféré permet l'appariement du codon et de l'anticodon, la synthèse complète de la protéine et la restauration d'une croissance normale du mutant.
Figure 2 : Le gène essentiel muté est le gène thyA qui code une thymidylate synthase, enzyme impliquée dans la synthèse de thymidine monophosphate, qui sont des précurseurs utilisés lors de la synthèse d'ADN. Une mutation dans le gène thyA génère une auxotrophie du mutant pour la thymidine. L'isolation du mutant est donc réalisée en suppléant le milieu de culture avec de la thymidine. La thymidine exogène pénètre dans les cellules via le transporteur des nucléosides puis est transformée en dTMP par la thymidine kinase. Figure 3 : Construction des mutants bactériens : L'insertion des gènes mutés dans le génome d'Escherichia coli est réalisée en deux étapes. Les dérivés du plasmide pST76-C sont dans un premier temps introduits par transformation en cultivant les transformants à 30 C en présence de chloramphénicol (Cm). Le premier événement de recombinaison conduisant à l'intégration du plasmide est sélectionné en cultivant les bactéries à 43 C en présence de chloramphénicol. Un second événement de recombinaison conduira à l'obtention d'un seul allèle, soit muté soit sauvage. Les souches mutantes seront criblées en effectuant des PCR sur colonies.
Figure 4 : Construction du mutant thyA. Figure 5 : Construction du mutant endA. Figure 6 : Construction du mutant recA. Figure 7 : Construction des plasmides pFAR1 et pFARl-LUC Figure 8: Carte du plasmide pFAR4: Le plasmide pFAR4 est un plasmide synthétique. La séquence MCS (Multiple cloning site) contient plus de 20 sites de restriction unique. Ce plasmide sera donc utilisé comme vecteur de base pour construire un certain nombre de dérivés contenant différents types de séquences de 21 sécrétion et d'expression eucaryote (promoteur ubiquitaire ou spécifique de tissus en combinaison avec différentes séquences de polyadénylation). Figure 9 : Quantification de l'activité luciférase dans le muscle tibial cranial de souris. A différents temps après injection des plasmides pVAX2-LUC et pFARl-LUC dans le muscle tibial cranial de souris, le substrat de l'enzyme, la luciférine a été administrée par voie intramusculaire. L'activité enzymatique a été enregistrée en utilisant une caméra PhotoImager de Bioespaces Mesures. La Figure A montre les activités obtenues, au cours du temps, sur échelle logarithmique. La Figure B montre l'activité luciférase obtenue, en représentation linéaire, 18 jours après l'injection des plasmides.
EXEMPLES
1. Construction des mutants bactériens Le mutant thyA a été généré à partir de la souche d'Escherichia coli MG1655 (obtenue auprès de "The Coli Genetic Stock Center", USA). Le génome de cette souche a été entièrement séquencé (Blattner et al., 1997). Le protocole suivi pour isoler les mutants d'E. coli est basé sur celui décrit par Pôsfai et al (1997 et 1999). Les gènes mutés sont clonés dans un vecteur, pST76-C, qui confère la résistance au chloramphénicol et dont la réplication est thermosensible. Elle est permissive à 30 C mais non effective entre 37 et 43 C. Les plasmides sont donc dans un premier temps introduits dans les bactéries par transformation en sélectionnant les bactéries à 30 C en présence de chloramphénicol. Afin de sélectionner les souches dans lesquelles le plasmide s'est intégré après un premier événement de recombinaison, les bactéries sont cultivées à 43 C en présence de chloramphénicol (cf. Figure 3). La résolution des cointégrats est un événement rare chez E. coli (Pôsfai et al., 1999). Pour contourner ce problème, le plasmide pST76-ASceP a été introduit dans les intégrants. Ce plasmide porte un gène codant une méganucléase, qui est une endonucléase qui provoque des cassures double brin au niveau du site I-Scel. Le génome de la souche sauvage MG1655 est dépourvu de ce site. Ce site est inséré dans le génome bactérien après intégration des dérivés du plasmide pST76C qui possède un site I-Scel.
En présence de méganucléase, seules poussent les souches qui ont perdu le site I-SceI, consécutif à la recombinaison intramoléculaire (cf. Figure 3). La réplication du plasmide pST76-ASceP est thermosensible. Il pourra donc aisément être curé des souches mutantes en cultivant les bactéries à 43 C. a. Construction du mutant thyA Pour isoler la souche mutante, une région de 2 kb comprenant le gène thyA a été amplifiée par PCR en utilisant la polymérase Ex-Taq (commercialisée par Takara), de l'ADN génomique préparé à partir de la souche MG1655 et les amorces ThyA- F et ThyA-R (SEQ ID N l et 2) (cf. Figure 4). Ces amorces ont été dessinées de manière à ce que la mutation se trouve au centre du fragment de 2kb. Après clonage du fragment PCR dans le vecteur pCR2.1 (commercialisé par INVITROGEN) et séquençage, la mutation non-sens de type ambre UAG (TAG) a été introduite au niveau de l'histidine 147. La mutagenèse dirigée a été réalisée en utilisant les amorces ThyA-His147-F et ThyA-His147-R (SEQ ID N 3 et 4) et le kit QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit commercialisé par Stratagène. Après séquençage de l'insert pour vérifier que le fragment de 2 kb ne contient que la mutation souhaitée, les plasmides pCR2.1 région thyA* et pST76-C (Posfai et al., 1997) ont été fusionnés après avoir été digérés, respectivement par EcoRV et Smal. Afin d'éliminer l'origine de réplication pUC ori, la séquence correspondant au vecteur pCR2.1 a été délétée en digérant le plasmide pCR2.1 région thyA* pST76-C par BamHI. Le fragment thyA muté est donc porté par le plasmide pST76-C région thyA* dont la réplication est thermosensible. Ce plasmide a été introduit par transformation dans la souche MG1655 puis le premier événement de recombinaison a été sélectionné en cultivant les bactéries à 43 C en présence de chloramphénicol. Le génome bactérien contient à présent deux copies du gène thyA : un allèle sauvage et un allèle muté. Le second événement de recombinaison a été sélectionné en introduisant dans les intégrants le plasmide pST76-SceP qui code la méganucléase. Les souches auxotrophes pour la thymidine et sensibles au chloramphénicol ont été sélectionnées pour une analyse complémentaire. Celle-ci consiste à amplifier la région contenant le gène thyA par PCR en utilisant les amorces ThyA-lgt-FI et ThyA-seql (SEQ ID N 5 et 6) puis à séquencer l'amplicon obtenu afin de vérifier que le gène thyA ne contient que la mutation ambre. Le mutant thyA a été curé du plasmide pST76-ASceP en cultivant les souches à 43 C. Cet événement a été confirmé en vérifiant la perte de la résistance à l'ampicilline conférée par le plasmide pST76A-SceP. b. Construction du double mutant thyA û endA Bien que les plasmides produits à partir du mutant thyA cultivé dans un milieu riche aient une pureté comparable à celle obtenue en utilisant d'autres souches, dans des milieux chimiquement définis la qualité des plasmides produits est moindre. Des études ont montré qu'une mutation dans le gène endA, qui code l'endonucléase 1, permet de contourner ce problème (Schoenfeld et al., 1995). Afin d'obtenir le double mutant thyA-endA, deux fragments PCR de 1 kb localisés en amont et en aval du gène endA ont été amplifiés en utilisant les amorces EndA-Fl/Rl (SEQ ID N 7 et 8) et EndA-F2/R2 (SEQ ID N 9 et 10), l'ADN génomique préparé à partir de la souche MG1655 et la polymérase Ex-Taq (commercialisée par Takara). Ces fragments ont été clonés dans le vecteur pCR2.1 puis séquencés (cf. Figure 5). Les régions situées en amont et en aval du gène endA ont été fusionnées après digestion des plasmides pCR2.1 yggI et pCR2.1 rsmE par respectivement Smal/Xbal et Smal/Spel. Le plasmide pCR2.1 delta endA a ensuite été digéré par Apal, traité à la Klenow, puis ligaturé au plasmide pST76-C digéré par Smal. Le plasmide pCR2.1 delta endA pST76-C produit a été digéré par BamHI puis ligaturé dans l'optique d'éliminer l'origine de réplication pUC ori. La région délétée du gène endA a été introduite dans le génome du mutant thyA en utilisant une stratégie similaire à celle décrite précédemment. Les souches mutantes endA ont été criblées en effectuant des PCR sur colonies en utilisant les amorces EndA-segl et EndA-seg5 (SEQ ID N 11 et 12). Le fragment PCR obtenu a été séquencé afin de vérifier que l'intégration a eu lieu au locus et n'a pas généré de mutation dans les gènes localisés en aval et en amont du gène endA. c. Construction du triple mutant thyA û endA û recA Afin d'éviter d'éventuels mécanismes de recombinaison entre le génome bactérien et les plasmides introduits dans le mutant thyA, le gène recA qui code une recombinase a également été délété. Pour construire le triple mutant thyA û endA û recA, une stratégie similaire à celle décrite précédemment a été utilisée. Des fragments PCR localisés en amont et en aval du gène recA ont été générés en utilisant les amorces RecA-Fl/Rl (SEQ ID N 13 et 14) et RecA-F2/R2 (SEQ ID N 15 et 16), la polymérase Ex-Taq (Takara) et de l'ADN génomique préparé à partir de la souche MG1655 (cf. Figure 6). Après séquençage des inserts, les fragments PCR ont été ligaturés après digestion des plasmides pCR2.1 ygaD et pCR2.1 recX par respectivement les enzymes SmaI/XbaI et SmaI/SpeI. Le plasmide pCR2.1 delta recA obtenu a été digére par XbaI, traité à la Klenow, et fusionné au plasmide pST76-C digéré par SmaI, pour conduire à la formation du plasmide pCR2.1 delta recA pST76-C. Ce dernier a été digéré par BamHI puis religaturé afin de ne conserver que l'origine de réplication thermosensible. La mutation a été introduite dans le génome bactérien en utilisant le même protocole que précédemment. La sélection du triple mutant a été réalisée en effectuant des PCR sur colonies en utilisant les amorces RecA-segl et RecA-R (SEQ ID N 17 et 18). L'amplicon a été séquencé afin de confirmer que l'intégration a été effectuée au locus et qu'elle n'a généré aucune autre mutation.
2. Construction du plasmide pFAR1 (Free of Antibiotic Resistance) Le plasmide pFAR1 a été construit en introduisant l'ARNt-suppresseur histidine dans le pVAX2 (cf. Figure 7). pVAX2 est un dérivé du plasmide pVAX1 (commercialisé par INVITROGEN) dans lequel le promoteur CMV du plasmide pCMV(3 (Clontech) a été introduit (Pascal Bigey et Daniel Scherman). L'ARNt suppresseur histidine est exprimé à partir du promoteur procaryote fort lpp (Nakamura et al., 1979). Dans le génome bactérien, ce promoteur est localisé en amont du gène lpp qui code une lipoprotéine. L'extrémité 3' de l'ARNt suppresseur contient la séquence de terminaison de transcription de l'opéron rrnC (Young, 1979). Cette cassette a été amplifiée à partir du plasmide pHis(AS) (obtenu auprès de "The Coli Genetic Stock Center", USA) en utilisant les amorces Nco-sup-F et Nco-sup-Rev (SEQ ID N 19 et 20) puis clonée dans le pVAX2 digéré par BspHI. Le plasmide portant l'ARNt- suppresseur orienté de manière divergente par rapport au gène eucaryote a été choisi afin d'éliminer le risque d'expression de l'ARNt suppresseur à partir du promoteur eucaryote CMV dans les cellules animales. Le gène conférant la résistance à la kanamycine a ensuite été délété en digérant le plasmide pVAX2-ARNtsup His par les enzymes HindIll (suivi d'un traitement à la klenow) et PvuII. Ce plasmide a été désigné pFAR1 (Free of Antibiotic Resistance). 3. Validation de la stratégie Afin de valider la stratégie mise en oeuvre, le plasmide pFAR1 a été introduit par transformation dans le mutant thyA. Les transformants peuvent être sélectionnés sur tout milieu dépourvu de thymidine. Il peut s'agir de milieu minimum de type M9 (Sambrook et al., 1989) ou riche tel que celui de Mueller Hinton (MH). Ce dernier contient de l'infusat de viande (2 g/1), l'hydrolysat de caséine 17,5 g/1, de l'amidon 1,5 g/1 et éventuellement de l'agar. Ce milieu présente l'avantage d'être commercialement disponible (Ex : auprès de la compagnie Fluka), d'être un milieu riche mais contenant des quantités très faibles, voire nulles de thymidine. Sur ce milieu, le mutant thyA ne se développe pas. En revanche, les souches contenant les plasmides pFAR ont une croissance normale. Les plasmides pVAX2 et pFAR1 ont été purifiés enparallèle à partir du mutant thyA cultivé dans le milieu MH. Des rendements similaires ont été obtenus. Ces résultats ont permis de valider la combinaison nouvellement inventée : mutation ambre dans le gène thyA / ARNt suppresseur histidine porté par le plasmide.
4. Test in vivo de l'activité luciférase Afin de déterminer si les plasmides pFAR peuvent être utilisés in vivo, le gène LUC qui code la protéine rapporteur luciférase a été cloné dans le plasmide pFAR1. Pour ce faire, le plasmide pVAX2-LUC a été digéré par les enzymes de restriction BamHI et Xhol puis la cassette d'expression eucaryote a été clonée dans le pFAR1 digéré par les mêmes enzymes. 3 gg de plasmides pVAX2-LUC et pFARl-LUC (dans 30 l de sérum physiologique) ont été injectés puis électrotransféres dans le muscle tibial cranial de la souris en effectuant 8 impulsions de 20 ms à 200 V/cm, à la fréquence de 2 Hz. Le substrat de la luciférase, la luciférine, a ensuite été injecté par voie intramusclaire à une concentration de 100 gg dans un volume de 40 l. L'activité luciférase a été enregistrée à différents temps après injection des plasmides en utilisant une caméra PhotoImager de Biospace Mesures (cf. Figure 9).
Ces résultats montrent que l'activité luciférase obtenue après injection du plasmide pFARl-LUC est similaire voire, dans certains cas et de manière surprenante, supérieure à celle obtenue après transfection des cellules par le plasmide pVAX2-LUC. Le vecteur d'expression nouvellement construit ne présente donc aucun désavantage pour les tests in vivo, conférant ainsi un avantage supplémentaire aux plasmides de type pFAR. 5. Optimisation des plasmides pFAR Ces résultats prometteurs ont conduit les Inventeurs à optimiser le plasmide pFAR1, dans l'optique de réduire sa taille, d'éliminer le maximum de séquences procaryotes et d'introduire des sites de clonage unique qui facilitent les manipulations moléculaires. En effet, les séquences procaryotes sont riches en motifs CpG qui peuvent induire des réponses inflammatoires et immunes, qui doivent être évitées pour les applications de thérapie génique. Le plasmide optimisé est appelé pFAR4 (cf. Figure 8). La production de ce plasmide à partir du mutant thyA cultivé dans le milieu de Mueller Hinton présente les mêmes propriétés (rendement, pureté) que le pVAX2. 6. Validation des dérivés du pFAR4 Deux types d'expériences sont réalisés afin de valider le plasmide pFAR4 pour des expériences in vivo : - la cassette d'expression CMV-LUC-BGH est introduite dans le plasmide pFAR4. Les plasmides pVAX2-LUC, pFARl-LUC et pFAR4-CMV LUC BGH sont injectés dans le muscle tibial cranial de la souris. Les activités luciférase sont déterminées à différents temps après injection et comparées. La comparaison de la réponse immunitaire induite après injection de ces trois plasmides est effectuée. - Le gène codant l'érythropoïétine murine exprimée à partir du promoteur ubiquitaire CMV (du cytomégamovirus) ou spécifique de muscle MCK (muscle creatine kinase) est cloné dans le pFAR4 afin de déterminer si ce plasmide peut être également utilisé dans un contexte de thérapie génique.
7. Construction de dérivés du pFAR4 Afin de construire une plate-forme de plasmides, les dérivés suivants du pFAR4 sont construits (cf. Figure 8) : - pFAR4.1 : dérivé du pFAR4 contenant le promoteur ubiquitaire CMV (du cytomégalovirus) - pFAR4.2 : dérivé du pFAR4 contenant le promoteur ubiquitaire CMV et la séquence de polyadénylation BGH - pFAR4.3: dérivé du pFAR4 contenant le promoteur ubiquitaire CMV et la séquence de polyadénylation SV40 - pFAR4.4 : dérivé du pFAR4 contenant le promoteur spécifique de muscle MCK Conclusion Une nouvelle combinaison souche mutante d'E. coli / plasmide sans gènes de résistance aux antibiotiques a été obtenue. La présente invention permet de sélectionner les bactéries transformées par le plasmide d'intérêt en utilisant un milieu riche et d'obtenir un bon rendement en faisant appel à des techniques standard de purification. Le milieu minimum de type M9 peut être utilisé. Un milieu riche que les Inventeurs ont identifié est celui de Mueller Hinton. Il est commercialisé, bon marché et ne nécessite pas une préparation laborieuse. In vivo, le plasmide pFAR1 ne présente aucun désavantage en comparaison avec les vecteurs d'expression couramment utilisés. Les inventeurs ont observé, dans certains cas et de manière surprenante, une expression plus forte avec le plasmide pFAR qu'avec un plasmide connu de l'homme de l'art. Le pFAR1 a été optimisé et a conduit à l'obtention du plasmide pFAR4. Après validation et clonage de gènes thérapeutiques ou codant des antigènes, les dérivés du pFAR4 auront de nombreuses applications dans le domaine de la thérapie génique, la vaccination à ADN et la production de protéines recombinantes.30 Liste des amorces utilisées Nom des amorces Séquences des amorces (5' û 3') Position SEQ ID N ThyA-F CATGCGGTATTGCGCAGGC 2961838 1 ThyA-R CGCTGTATCTGTTCCGTGTCT 2963794 2 ThyA û His 147-F CGCTGGCACCGTGCTAGGCATTCTTCCAGTTC 2962753 3 ThyA û His 147-R GAACTGGAAGAATGCCTAGCACGGTGCCAGCG 2962722 4 ThyA û lgt-FI GATTCGCGGAGGGTTATAGCG 2964228 5 ThyA seql GCAGCCAGATTTCATCTTCC 2961579 6 EndA-FI GTCGGTTTTGCCATGAGTGC 3087383 7 EndA-R1 tacccgggTAGACAAATAACGGTACATCAC 3088387 8 EndA-F2 ttcccgggAGAGCTAACCTACACTAGCG 3089069 9 EndA-R2 CCACTCTTCGTAGTTCTGCT 3090097 10 EndA ù segl TGCCACCTTTATCGCAATCG 3087211 11 EndA û seq5 CTCTTCGGCACGTTCCAGA 3090220 12 RecA-FI GTAATGGCAAACGGTCAGGC 2822782 13 RecA-R1 gatcccgggGTCGATAGCCATTTTTACTCC 2821780 14 RecA-F2 catcccgggGAAGGCGTAGCAGAAACTAAC 2820762 15 RecA-R2 GTCGCCGAAGCTGAAGTTG 2819731 16 RecA û segl TATGAAGATGCGTTGAATCG 2823190 17 RecA R GGTAACCCACAGACGCTCT 2819641 18 Nco-sup-F gtccatggCTGGCGCCGCTTCTTTGAGC 19 Nco sup-Rev ccccatggACGACGGCCAGTGCCAAGC 20 Séquences des amorces utilisées pour générer les mutants bactériens ou les plasmides pFAR. Le chiffre indiqué dans l'avant dernière colonne indique la position des amorces dans le génome de la souche MG1655 (numéro d'accession : U00096). Pour faciliter les étapes de clonage, des sites de restriction et des nucléotides supplémentaires ont été introduits aux extrémités des amorces (indiqués en minuscules).
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Claims (37)
1. Cellule mutée dans laquelle le gène thyA codant la thymidylate synthase (thyA) comporte un codon non sens, ledit codon non sens remplaçant un codon codant un acide aminé et entraînant un arrêt de la traduction du gène thyA et l'auxotrophie de ladite cellule pour la thymidine.
2. Cellule mutée selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi les bactéries et les levures.
3. Cellule mutée selon la revendication 2, caractérisée en ce que ladite cellule est une bactérie Escherichia cati (E. cati).
4. Cellule mutée selon la revendication 3, caractérisée en ce que le codon non sens remplace un codon codant un acide aminé de la thymidylate synthase choisi dans le groupe constitué par l'histidine en position 147, le glutamate en position 14 ou 223, l'arginine en position 35 ou 127, la phénylalanine en position 30, l'aspartate en position 81 ou 105, la glutamine en position 33 et l'asparagine en position 121.
5. Cellule mutée selon la revendication 4, caractérisée en ce que le codon non sens remplace le codon codant l'histidine en position 147 de la thymidylate synthase.
6. Cellule mutée selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que le codon non sens est le codon ambre UAG.
7. Cellule mutée selon la revendication 6, caractérisée en ce que ladite cellule est la cellule E. cati MG1655 thyA#d2 déposée à la CNCM le 5 avril 2007 sous le numéro I- 3739.
8. Cellule mutée selon l'une des revendications 1 à 7, dans laquelle le gène endA codant l'endonucléase 1 comprend une mutation induisant une meilleure stabilité plasmidique dans ladite cellule mutée.
9. Cellule mutée selon la revendication 8, caractérisée en ce que ladite cellule est la cellule E. coli MG1655 thyA endA#1.2.C.3 déposée le 5 avril 2007 à la CNCM sous le numéro I-3738.
10. Cellule mutée selon l'une des revendications 1 à 9, dans laquelle le gène recA codant une recombinase impliquée dans la recombinaison de séquences d'ADN est muté pour éviter des mécanismes de recombinaison entre le génome bactérien et les plasmides.
11. Cellule mutée selon la revendication 10, caractérisée en ce que ladite cellule est la cellule E. coli MG1655 thyA endA recA#TMla déposée le 5 avril 2007 à la CNCM sous le numéro I-3737.
12. Cellule mutée selon l'une des revendications 1 à 11 transformée par un plasmide d'expression, caractérisée en ce que ledit plasmide d'expression comprend : - une origine de réplication, - une séquence nucléotidique codant une protéine recombinante d'intérêt, - une cassette d'expression pour l'expression de ladite protéine recombinante d'intérêt dans une cellule hôte, et - une séquence de gène structural d'ARNt suppresseur, ledit ARNt suppresseur comprenant un anticodon capable de s'apparier à un codon non sens et étant spécifique d'un acide aminé capable de restaurer la traduction dudit gène thyA muté dans la cellule, ladite cellule étant capable de se multiplier dans un milieu exempt de thymidine.
13. Cellule mutée selon la revendication 12 transformée par un plasmide d'expression, caractérisée en ce que la cassette d'expression est choisie parmi les cassettes d'expression eucaryotes pour l'expression de ladite protéine recombinante d'intérêt dans une cellule hôte de mammifère ou une levure et les cassettes d'expression procaryotes pour l'expression de ladite protéine dans des cellules hôtes procaryotes telles que des cellules bactériennes.
14. Cellule mutée selon la revendication 12 ou 13, caractérisée en ce que ladite cellule est la cellule E. coli et en ce que l'ARNt suppresseur est spécifique de l'histidine et permet de restaurer la traduction du gène thyA muté comportant un codon non sens remplaçant le codon codant l'histidine en position 147 de la thymidylate synthase.
15. Cellule mutée selon l'une des revendications 12 à 14, caractérisée en ce que l'ARNt suppresseur comprend un anticodon CUA capable de s'apparier au codon non sens ambre UAG.
16. Cellule mutée selon l'une des revendications 13 à 15, caractérisée en ce que la cassette d'expression eucaryote comprend un promoteur et des séquences de polyadénylation, ledit promoteur et lesdites séquences étant spécifiques des cellules hôtes de mammifère.
17. Cellule mutée selon la revendication 16, caractérisée en ce que le promoteur est le promoteur du cytomégalovirus (CMV) et les séquences de polyadénylation sont de type hormone de croissance bovine (HBV).
18. Cellule mutée selon l'une des revendications 12 à 17, caractérisée en ce que ladite cellule est la cellule E. coli et en ce que la séquence de gène structural d'ARNt suppresseur est exprimée à partir du promoteur fort lpp de type procaryote et contient à son extrémité 3' la séquence de terminaison de transcription de l'opéron rrnC, ladite séquence étant de préférence orientée de manière divergente par rapport à la séquence nucléotidique codant une protéine recombinante d'intérêt.
19. Cellule mutée selon la revendication 18, caractérisée en ce que ledit plasmide est le plasmide pFAR4 de séquence SEQ ID N 21.
20. Plasmide d'expression comprenant une origine de réplication, une séquence nucléotidique codant une protéine recombinante d'intérêt, une cassette d'expression pour l'expression de ladite protéine recombinante d'intérêt dans une cellule hôte et une séquence de gène structural d'ARNt suppresseur, caractérisé en ce que ledit ARNt suppresseur comprend un anticodon capable de s'apparier à un codon non sens et est spécifique d'un acide aminé capable de restaurer la traduction du gène thyA dans une cellule mutée selon l'une des revendications 1 à 11.
21. Plasmide d'expression selon la revendication 20, caractérisé en ce que la cassette d'expression est choisie parmi les cassettes d'expression eucaryotes pour l'expression de ladite protéine recombinante d'intérêt dans une cellule hôte de mammifère ou une levure et les cassettes d'expression procaryotes pour l'expression de ladite protéine dans des cellules hôtes procaryotes telles que des cellules bactériennes.
22. Plasmide d'expression selon la revendication 20 ou 21, caractérisé en ce que la cellule mutée est une cellule E. coli et en ce que l'ARNt suppresseur est spécifique de l'histidine et permet de restaurer la traduction du gène thyA muté comportant un codon non sens remplaçant le codon codant l'histidine en position 147 de la thymidylate synthase.
23. Plasmide d'expression selon l'une des revendications 20 à 22, caractérisé en ce que l'ARNt suppresseur comprend un anticodon CUA capable de s'associer au codon non sens ambre UAG.
24. Plasmide d'expression selon l'une des revendications 21 à 23, caractérisé en ce que la cassette d'expression eucaryote comprend un promoteur et des séquences de polyadénylation, ledit promoteur et lesdites séquences étant spécifiques des cellules hôtes de mammifère.
25. Plasmide d'expression selon la revendication 24, caractérisé en ce que le promoteur est le promoteur du cytomégalovirus (CMV) et les séquences de polyadénylation sont de type hormone de croissance bovine (BGH).
26. Plasmide d'expression selon l'une des revendications 20 à 25, caractérisé en ce que la cellule mutée est une cellule E. coli et en ce que la séquence de gène structural d'ARNt suppresseur est exprimée à partir du promoteur fort lpp de type procaryote et contient en outre à son extrémité 3' la séquence de terminaison de transcription de l'opéron rrnC, ladite séquence étant de préférence orientée de manière divergente par rapport à la séquence nucléotidique codant une protéine recombinante d'intérêt.
27. Plasmide d'expression selon la revendication 26, caractérisé en ce que ledit plasmide d'expression est le plasmide pFAR4 de séquence SEQ ID N 21.
28. Plasmide d'expression selon l'une des revendications 20 à 27, caractérisé en ce que la protéine recombinante d'intérêt est choisie dans le groupe constitué par l'érythropoïétine, la dystrophine, l'insuline, l'anti-TNFalpha, les cytokines, les facteurs de coagulation tels que le facteur IX humain, les antigènes protecteurs tels que ceux de Bacillus anthracis, Mycobacterium tuberculosis et l'antigène spécifique de la membrane prostatique (PSMA).
29. Procédé de multiplication d'un plasmide d'expression comprenant une origine de réplication, une séquence nucléotidique codant une protéine recombinante d'intérêt, une cassette d'expression pour l'expression de ladite protéine recombinante d'intérêt dans une cellule hôte et une séquence de gène structural d'ARNt suppresseur, ledit procédé comprenant : - la culture d'une cellule mutée dans laquelle le gène thyA comporte un codon non sens, ledit codon non sens remplaçant un codon codant un acide aminé et entraînant un arrêt de la traduction du gène thyA et l'auxotrophie de la cellule mutée pour la thymidine, - l'introduction du plasmide d'expression dans ladite cellule en culture, dans laquelle l'ARNt suppresseur du plasmide d'expression comprend un anticodon capable de s'apparier au codon non sens du gène thyA et est spécifique d'un acide aminé capable de restaurer la traduction dudit gène thyA dans la cellule mutée, et - l'extraction du plasmide d'expression à partir de la culture cellulaire, ladite culture étant effectuée dans un milieu exempt de thymidine afin de permettre la sélection des cellules transformées par ledit plasmide d'expression.
30. Procédé selon la revendication 29 caractérisé en ce que la cassette d'expression est choisie parmi les cassettes d'expression eucaryotes pour l'expression de ladite protéine recombinante d'intérêt dans une cellule hôte de mammifère ou une levure et les cassettes d'expression procaryotes pour l'expression de ladite protéine dans des cellules hôtes procaryotes telles que des cellules bactériennes.
31. Procédé selon la revendication 30 caractérisé en ce que la cellule mutée est une cellule E. coli et en ce que l'ARNt suppresseur est spécifique de l'histidine et permet de restaurer la traduction du gène thyA muté comportant un codon non sens remplaçant le codon codant l'histidine en position 147 de la thymidylate synthase.
32. Procédé selon l'une des revendications 29 à 31, caractérisé en ce que l'ARNt suppresseur comprend un anticodon CUA capable de s'associer au codon non sens ambre UAG. 20
33. Procédé de production d'une protéine recombinante d'intérêt comprenant : - la multiplication d'un plasmide d'expression selon l'une des revendications 29 à 32, - la transformation d'une cellule hôte par le plasmide d'expression obtenu à l'étape précédente, 25 - la culture de ladite cellule hôte transformée dans un milieu de culture permettant l'expression de la protéine recombinante d'intérêt, et - la purification de la protéine recombinante d'intérêt à partir du milieu de culture ou de la cellule hôte transformée. 30
34. Composition pharmaceutique comprenant le plasmide d'expression selon la revendication 28.15
35. Utilisation du plasmide d'expression selon l'une des revendications 20 à 28 pour la transfection in vitro ou ex vivo dans une cellule hôte de la séquence nucléotidique codant une protéine recombinante d'intérêt.
36. Plasmide d'expression selon la revendication 28 pour son utilisation à titre de médicament ou de vaccin.
37. Utilisation d'une cellule mutée selon l'une des revendications 12 à 19 pour la production de protéines recombinantes d'intérêt.10
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