FR3050997A1 - Procede de mutagenese sans cicatrice - Google Patents
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Abstract
La présente invention a pour objet un procédé de modification sans cicatrice d'une séquence cible d'ADN chromosomique d'une souche bactérienne. L'invention vise également les vecteurs et plasmides utiles dans la mise en œuvre du procédé selon l'invention.
Description
PROCEDE DE MUTAGENESE SANS CICATRICE DOMAINE TECHNIQUE
La présente invention a pour objet un procédé de modification sans cicatrice d’une séquence cible d’ADN chromosomique d’une souche bactérienne. L’invention vise également les vecteurs et plasmides utiles dans la mise en œuvre du procédé selon l’invention.
ARRIERE-PLAN DE L'INVENTION
Les bactéries sont largement utilisées dans l’industrie en particulier pour la synthèse de molécules d’intérêt dans le domaine de la chimie industrielle ou pour leur capacité de fermentation dans le domaine de l’alimentation humaine ou animale. On utilise par exemple des bactéries recombinantes pour la production de substances à des fins thérapeutiques.
Le génie génétique qui rassemble l’ensemble des techniques issues des biotechnologies permet de modifier le génotype des bactéries, et donc leurs phénotypes, par l’insertion d’acide nucléique synthétique, par exemple provenant d’organismes étrangers. Cette manipulation permet aux bactéries receveuses d'acquérir de nouvelles propriétés provenant notamment d'une espèce différente.
Il est donc souhaitable de disposer de procédé de modifications génétiques pour permettre l’optimisation de ces bactéries en vue de leur utilisation spécifique.
Les procédés de modifications génétiques comprennent en général la transformation d’un plasmide ou vecteur comprenant une région homologue autour de la séquence cible à modifier et des acides nucléiques nécessaires à la réplication, la sélection et/ou au maintien dans l’organisme hôte.
Une fois la modification souhaitée effectuée dans l’organisme hôte, par exemple, le remplacement d’un gène par un gène muté, il est souhaitable que l’organisme hôte ne contiennent pas les traces ou « cicatrices » du procédé de modification utilisé et notamment les séquences d’acides nucléiques qui sont utiles uniquement à la mise en œuvre de la modification génétique. Ceci est particulièrement important lorsqu’il est envisagé d’effectuer une pluralité de modifications génétiques dans un même organisme.
Blomfield et al (1991) ont décrit un procédé d’échanges d’allèles chez les bactéries, utilisant un plasmide suicide avec une origine de réplication thermosensible, un marqueur de sélection (résistance à la kanamycine) et un marqueur de contre-sélection, produit de l’expression du gène de Bacillus subtilis en présence du gène SacB (Blomfield et al., 1991). Cependant, en dépit d’un système de contresélection, le procédé génère un nombre important de faux positifs et son succès s’avère fortement souche-dépendant.
La demande de brevet W093/18164 (Gruss and Maguin, 1993) décrit également un procédé d’inactivation d’un gène présent dans le chromosome d’une bactérie comprenant la transformation d’une bactérie avec un vecteur plasmidique comprenant une origine thermosensible et un marqueur de sélection. La culture à température non permissive permet de sélectionner les bactéries ayant intégré le plasmide. Cependant, ce procédé ne permet pas de contre-sélectionner les bactéries qui ont réalisé un double évènement de recombinaison homologue pour l’inactivation ou le remplacement d’un gène cible. Il génère donc également de nombreux faux positifs (en moyenne, un résultat positif pour un mutant sur 5000 clones testés).
La délétion de gènes grâce à un plasmide suicide contenant une origine de réplication (R6K) a été réalisée à plusieurs reprises chez différents microorganismes. Cette origine de réplication est fonctionnelle uniquement chez les bactéries dont le fond génétique est Xpir (Donnenberg and Kaper, 1991; Le Roux et al., 2007; Miller and Mekalanos, 1988; Philippe et al., 2004). En 2007, Le Roux et al. ont par exemple réalisé la délétion du gène vsm chez Vibrio splendidus (souche AraC-) avec un plasmide suicide contenant l’origine de réplication R6K et un système de sélection/contre sélection AraC-pBAD-CcdB. Le procédé est cependant dépendant de l’utilisation d’une souche Xpir. En outre, il ne permet pas de réaliser d’étapes d’amplification du plasmide après transformation dans une souche Xpir-, H n’est en effet pas possible de conserver sous forme de congélat la souche cible Xpir- transformée avec le plasmide suicide. Celui-ci est intégré nécessairement dans le chromosome et cette forme intégrée, dite mérodiploïde, est instable. Cette technique ne permet donc pas de congeler les souches transformées pour une sélection ultérieure.
La demande de brevet WO2013068692 (Ranquet and Geiselmann, 2013) décrit également une cassette d’expression pour modifier le génome bactérien de souches AraC+ ou un vecteur contenu dans une souche bactérienne AraC+. Cette cassette contient une séquence nucléotidique codant pour un marqueur, le promoteur pBAD et une séquence nucléotidique codant pour une protéine toxine sous contrôle dudit promoteur pBAD.
Ce système de modification chromosomique utilise une cassette qui ne contient pas d’origine de réplication et n’est pas sous la forme d’un plasmide vecteur bactérien. Il n’est donc pas possible d’amplifier le plasmide après transformation avant l’étape de sélection des bactéries recombinantes. L’insertion de la cassette se fait par la technique de recombinaison Xred qui nécessite que la souche soit préalablement transformée par un plasmide permettant l’espression des gènes exo, bet et gam. Cette technique de modification du chromosome est donc plus longue à mettre en œuvre que l’utilisation du plasmide selon la présente invention. De plus, cette technique n’est utilisable que chez E. coli.
Il existe par conséquent un réel besoin de perfectionner l’état de la technique afin de proposer un procédé de modification génétique - sans cicatrice - qui soit applicable à différentes espèces bactériennes, en particulier, gram négative, - qui ne génère pas ou très peu de faux positifs et/ou, - qui puisse être mis en œuvre aisément, en particulier dans le cas de modifications séquentielles de plusieurs gènes dans un même organisme.
RESUME DE L’INVENTION
La présente invention a pour objet un plasmide pour la modification d’une séquence cible d’ADN chromosomique d’une souche bactérienne par recombinaison homologue, comprenant les éléments suivants : ( 1 ) une origine de réplication thermosensible, ( 2 ) un acide nucléique codant pour un marqueur de sélection positive sur milieu riche, (3) un acide nucléique codant pour une protéine cytotoxique sous contrôle d’un promoteur inductible sur milieu riche.
Dans un mode de réalisation particulier, l’origine de réplication thermosensible est de type thêta.
De préférence il s’agit d’une origine thermosensible comprenant un acide nucléique de séquence SEQ ID NO:l, ou une séquence homologue présentant au moins 70% d’identité avec SEQ ID NO:l.
Dans un autre mode de réalisation qui peut être combiné avec le mode précédent, l’acide nucléique codant la protéine cytotoxique comprend un acide nucléique de séquence SEQ ID NO:2, ou une séquence homologue présentant au moins 70% d’identité avec SEQ ID NO:2.
Dans un autre mode de réalisation qui peut être combiné avec un ou plusieurs des modes précédents, ledit promoteur inductible est un promoteur inductible à l’arabinose sur milieu riche. A titre d’exemple, le promoteur inductible à l’arabinose sur milieu riche comprend la séquence SEQ ID NO:3, ou une séquence homologue présentant au moins 70% d’identité avec SEQ ID NO:3.
Dans un autre mode de réalisation qui peut être combiné avec un ou plusieurs des modes précédents, le marqueur de sélection sur milieu riche est choisi parmi les marqueurs de résistance à un antibiotique, les marqueurs colorés, les marqueurs fluorescents et les marqueurs d’auxotrophie, par exemple le marqueur de résistance à la kanamycine.
Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, le plasmide comprend : ( 1 ) une origine de réplication thermosensible de type thêta de séquence présentant entre 90% et 100% d’identité avec SEQ ID NO:l, ( 2 ) un acide nucléique codant pour un marqueur de sélection positive sur milieu riche, ( 3 ) un acide nucléique codant pour une protéine cytotoxique de séquence présentant entre 90% et 100% d’identité avec SEQ DD NO:2, sous contrôle d’un promoteur inductible sur milieu riche en présence d’arabinose, de séquence présentant entre 90% et 100% d’identité avec SEQ DD NO:3.
Le plasmide selon l’invention peut comprendre en outre (4) deux fragments d’acides nucléiques de séquences substantiellement homologues aux séquences d’ADN chromosomique flanquant les extrémités 5’ et 3’ respectivement d’une séquence cible à modifier, et le cas échéant (5) un acide nucléique comprenant une séquence de remplacement de la séquence cible à modifier. L’invention vise également un procédé de modification d’une séquence cible d’ADN chromosomique d’une souche bactérienne comprenant, a) la transformation d’une souche bactérienne avec un plasmide selon l’invention tel que défini plus haut, b) la culture de ladite souche transformée sur milieu sélectif à une température permissive, par exemple comprise entre 28°C et 32°C, c) le cas échéant, la conservation des souches transformées dans un milieu approprié pour la congélation, d) la culture des souches transformées sur milieu solide riche sélectif à une température non-permissive, par exemple comprise entre 40 et 44°C, pour la sélection des clones ayant intégré le plasmide dans leur génome, e) le repiquage des clones positifs obtenus à l’étape d) et leur culture sur milieu non sélectif et à température non-permissive, par exemple comprise entre 40 et 44°C, dans des conditions permettant l’induction de ladite protéine cytotoxique.
Dans un mode de réalisation particulier, ladite souche bactérienne est une souche Gram-négative, par exemple Escherichia coli.
Dans un autre mode de réalisation particulier du procédé selon l’invention, qui peut être combiné avec le précédent, ladite souche bactérienne présente un génotype RecA+.
La modification génomique peut être notamment une délétion de la séquence cible ou sa substitution par une séquence de remplacement ou l’ajout d’une séquence hétérologue. L’invention concerne également les souches bactériennes comprenant un plasmide selon l’invention. DESCRIPTION DETAILLEE DE MODES DE REALISATION Le plasmide selon l’invention
La présente invention a pour objet un plasmide pour la modification d’une séquence cible d’ADN chromosomique dans une souche bactérienne par recombinaison homologue, ledit plasmide comprenant les éléments suivants : ( 1 ) une origine de réplication thermosensible, ( 2 ) un acide nucléique codant pour un marqueur de sélection positive sur milieu riche, ( 3 ) un acide nucléique codant pour une protéine cytotoxique sous contrôle d’un promoteur inductible sur milieu riche.
Par plasmide, on entend une molécule d'ADN distincte de l'ADN chromosomique, capable de réplication autonome. Les plasmides sont généralement circulaires. Ils comportent une origine de réplication à partir de laquelle s’effectue la réplication de l’ADN plasmidique. La fonctionnalité de l’origine de réplication est induite par une protéine, qui peut être elle-même codée par un gène situé sur le plasmide. Au sens de l’invention, le terme plasmide englobe les plasmides artificiels utilisés comme vecteur pour l’ingénierie génétique.
Les plasmides peuvent être classés selon leur origine de réplication : les trois plus connues et utilisées sont les origines de type colEl, pl5A et pSClOl. De préférence, on utilisera dans le cadre de la présente invention un plasmide de type thêta. La réplication d’un plasmide de type thêta se fait à partir du brin direct, à un site déterminé (origine de réplication) et grâce au réplisome de la cellule hôte qui va permettre l’élongation du brin direct de façon continue et celle du brin indirecte de façon discontinue. Parmi les plasmides de type thêta figurent le pColEl, le pColE2-type, le pPSIO, le PI, le pSClOl, le pRK2, le pR6K et le pRl (del Solar et al., 1998).
Outre l’origine de réplication, un plasmide peut comprendre un ou plusieurs gènes, et notamment des marqueurs de sélection, comme un gène de résistance aux antibiotiques, des sites de clonages incluant des sites de reconnaissances aux enzymes de restriction.
Certains éléments spécifiques aux plasmides selon l’invention sont décrits ci-après. L ’origine de réplication thermosensible
Selon l’invention, le plasmide doit comporter une origine de réplication thermosensible.
Par « thermosensible » on entend un plasmide qui est réplicatif dans un organisme hôte lorsque celui-ci est cultivé à une plage de température dite permissive, et qui n’est plus capable de se répliquer dans un hôte lorsque celui-ci est cultivé au-delà d’un certain seuil de température (dite température non-permissive).
Les origines de réplication thermosensible sont connues de l’art antérieur. On peut citer à titre d’exemples l’origine de réplication du plasmide pSClOl mutée au niveau du nucléotide 974 (C en T) de rep 101, ce qui entraîne le changement d’une alanine en valine (Armstrong et al., 1984), du plasmide PvwlOl dont l’origine est de type cercle roulant, souvent utilisé chez les bactéries lactiques gram positive (Kok et al., 1984), les plasmides pE194 et pSH71 dont la température non permissive est de 51°C (Sozhamannan et al., 1990).
Dans un mode de réalisation, le plasmide selon l’invention comprend une origine de réplication thermosensible de type theta(Lilly and Camps, 2015).
Dans un mode de réalisation préféré, le plasmide selon l’invention comprendra l’origine de réplication thermosensible pSClOl, telle que décrite notamment dans l’article « Mutations to température sensitivity in R plasmid pSClOl » (Hashimoto-Gotoh and Sekiguchi, 1977).
Dans un mode de réalisation particulier, l’origine de réplication thermosensible comprend l’acide nucléique de séquence SEQ ID NO :1 ou une séquence homologue présentant au moins 70% d’identité, par exemple, au moins 80%, 90%, 95% ou 100% d’identité.
Dans un autre mode de réalisation préféré, le plasmide selon l’invention comprend une origine de réplication thermosensible identique à la séquence SEQ ID NO:l à l’exception d’un délétion, addition ou substitution d’un, deux ou trois nucléotides, étant entendu que ces mutations ne modifient pas la fonctionnalité de ladite origine de réplication thermosensible.
Le degré d’identité entre deux séquences est fonction du nombre de résidus identiques partagés entre deux séquences similaires après alignement optimale (% identité = nombre de résidus identiques / nombre total de résidus x 100). La comparaison (alignement optimal) et la détermination du pourcentage d’identité peut être réalisé à l’aide d’un algorithme mathématique, tel que décrit par Larkin MA, Blackshields G, Brown NP, Chenna R, McGettigan PA, McWilliam H, Valentin F, Wallace IM, Wilm A, Lopez R, Thompson JD, Gibson TJ, Higgins DG (2007) ("ClustalW and ClustalX version 2". Bioinformatics 23 (21): 2947-2948)(Larkin et al., 2007) qui a été implémenté dans le programme CLUSTALW.
Le marqueur de sélection positive
Le plasmide selon l’invention comprend en outre un acide nucléique codant pour un marqueur de sélection positive sur milieu riche. Les marqueurs de sélection positive sont bien connus dans le domaine du génie génétique.
Par « sélection positive », on entend que seules les bactéries qui expriment ledit marqueur peuvent être sélectionnées sur un milieu « sélectif », c'est-à-dire un milieu dont la composition permet de trier lesdites bactéries pour l’expression dudit marqueur.
Un milieu « riche » au sens de la présente invention s’entend par opposition à un milieu minimum ou milieu défini dont la composition est connue et limitée aux éléments chimiques strictement nécessaires à la croissance bactérienne. En particulier, la croissance sur milieu riche est moins dépendante d’éventuelles carences en un composé du fait de la redondance des sources métaboliques. A titre d’exemple de marqueurs de sélection positive sur milieu riche, on peut citer notamment les marqueurs de résistance à un antibiotique, les marqueurs colorés, ou les marqueurs fluorescents.
Des exemples d’acides nucléiques codant pour des marqueurs de résistance aux antibiotiques incluent le gène cat (pour la résistance sur un milieu en présence de chloramphénicol), le gène bla (pour la résistance sur un milieu en présence d’ampicilline), le gène aphA (pour la résistance sur un milieu en présence de kanamycine.
On pourra également utiliser les gènes de résistance à à la Tétracycline, à la Spectinomycine, ou à la Carbénicilline.
Dans un mode de réalisation préféré, le plasmide selon l’invention comprend un acide nucléique codant le gène de résistance à la kanamycine et par exemple, le gène aphA.
La séquence de chacun de ces gènes de résistance peut être optimisée le cas échéant pour que les protéines soient fonctionnelles dans des espèces bactériennes autres que E. coli.
Le marqueur de contre-sélection
Le plasmide selon l’invention présente en outre un acide nucléique codant pour une protéine cytotoxique sous contrôle d’un promoteur inductible sur milieu riche.
Seules les bactéries qui ne comprennent pas ledit acide nucléique peuvent survivre sur milieu riche dans des conditions d’induction. C’est pourquoi, au sens de l’invention on parlera de marqueur de « contre-sélection ». Ledit marqueur de contre-sélection permet en effet de contre-sélectionner les bactéries ayant perdu cet élément génétique. Les plasmides comprenant de tels marqueurs sont également appelés « plasmide suicide », puisqu’il est possible de supprimer sur milieu contre-sélectif les bactéries comprenant de tels plasmides.
Les acides nucléiques codant un marqueur de contre-sélection sont choisis dans le groupe des gènes codant pour des protéines cytotoxique pour l’organisme (bactérie) hôte. A titre d’exemple, on peut citer les acides nucléiques codant pour un membre de la famille de toxines de type Rel/ParE (e.g. RelE_K12, RelE307, HigB, PasB, StbE, YoeB, Txe, YafQ, ParERK2, ParEl, ParE3), un membre de la famille des toxines CcdB/MazF (e.g. CcdBF, CcdBoisv, MazF, YdcE, PemK, ChpBK), un membre de la famille de toxines de type VapC (i.e. VapC, MvpT), un membre de la famille des toxines de type GinA, un membre de la famille de toxines de type Doc, un membre de la famille de toxines de type GinC, un membre de la famille de toxines de type Zêta, un membre de la famille de toxines de type YafO, un membre de la famille de toxines de type HipA, un membre de la famille de toxines de type GinB, un membre de la famille de toxines de type GinD et un membre de la famille de toxines de type VapD.
Selon un aspect encore de la présente invention, l’acide nucléique codant pour une protéine cytotoxique est un acide nucléique comprenant la région codante du gène CcdB.
Le gène ccdB code pour une protéine cytotoxique (toxine), dont l’activité cytotoxique peut être contrée par une protéine antidote (ou antitoxine) appelée CcdA. Néanmoins, le plasmide de la présente invention n'est pas accompagné du gène codant pour l'antidote. Ainsi, dans un mode de réalisation utilisant le gène ccdB (ou plus précisément, sa région codante), le plasmide selon l’invention ne comporte pas de séquence codant pour ccdA.
Dans un autre mode de réalisation particulier, le plasmide selon l’invention ne comporte pas non plus d’autres acides nucléiques codant pour les anti-toxines choisies dans les familles d'anti-toxines de type HigA (HigA, HipB), de type MazE (VapB, MvpA, ChpBI, Peml), de type Phd (Phd, YefM, Axe, PasB, StbD, YafN, RelB307), de type RelB (RelBK 12, DinJ, Paal ), de type PasA (PasA, YdcD, ParDEDL933), de type FizA, de type FizB, de type FizC, de type FizF, de type VapX, de type FizD, de type Epsilon, de type ParD (ParDRK2), de type
FizE, de type FizH, de type FizG, de type FijJ, de type FizK, de type FizL, anti-toxines contrant les effets toxiques des toxines citées ci-dessus, si ces toxines sont choisies comme marqueur de contre-sélection dans le cadre de la présente invention.
Dans un mode de réalisation préféré du plasmide selon l’invention, l’acide nucléique codant la protéine cytotoxique comprend un acide nucléique de séquence SEQ ID NO:2, qui constitue la partie codante du gène ccdB, ou une séquence codant une protéine cytotoxique homologue et présentant au moins 70% d’identité avec SEQ ID NO:2, par exemple, au moins 80%, 90%, 95% ou 100% d’identité.
Dans un autre mode de réalisation préféré, le plasmide selon l’invention comprend un acide nucléique codant pour une protéine cytotoxique, ledit acide nucléique étant identique à la séquence SEQ ID NO :2 à l’exception de mutations, par exemple une délétion, addition ou substitution d’un, deux ou trois nucléotides, consécutifs ou non, étant entendu que ces mutations ne modifient pas la fonctionnalité de ladite protéine cytotoxique. Il peut s’agir par exemple de mutations ne modifiant pas la séquence d’acide aminé du fait de la dégénérescence du code génétique, ou de mutations conservatrices.
Afin de permettre le contrôle de l’expression du marqueur de contre-sélection au moment souhaité, l’acide nucléique codant ledit marqueur de contre-sélection (ou protéine cytotoxique) est placé sous le contrôle d’un promoteur inductible sur milieu riche. Ledit promoteur ne permet l’expression du gène qu’en présence de conditions inductibles.
Des exemples de promoteurs inductibles sur milieu riche comprennent notamment le promoteur pBAD, inductible sur milieu riche en présence d’arabinose et en l’absence de glucose. Le promoteur pBAD et sa séquence sont décrits en particulier dans la demande WO2013/068692.
Dans un mode de réalisation préféré du plasmide selon l’invention, le promoteur pBAD, inductible à l’arabinose sur milieu riche, comprend la séquence SEQ ID NO:3, ou une séquence homologue présentant au moins 70% d’identité avec SEQ ID NO:3, par exemple, au moins 80%, 90%, 95% ou 100% d’identité.
Dans un mode de réalisation préféré, le plasmide selon l’invention comprend un acide nucléique comprenant la région codante du gène ccdB, par exemple SEQ ID NO :2, ladite région codante étant sous le contrôle du promoteur pBAD, par exemple SEQ ID NO :3 ; ou un acide nucléique homologue présentant au moins 70% d’identité avec SEQ ID NO:3, par exemple, au moins 80%, 90%, 95% ou 100% d’identité.
Dans un autre mode de réalisation préféré, le plasmide selon l’invention comprend un acide nucléique de séquence SEQ ID NO :3 et un acide nucléique de séquence SEQ ID NO :2.
Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, le plasmide comprend : ( 1 ) une origine de réplication thermosensible de type thêta de séquence présentant entre 90% et 100% d’identité avec SEQ ID NO:l, ( 2 ) un acide nucléique codant pour un marqueur de sélection positive sur milieu riche, ( 3 ) un acide nucléique codant pour une protéine cytotoxique de séquence présentant entre 90% et 100% d’identité avec SEQ ID NO:2, sous contrôle d’un promoteur inductible sur milieu riche en présence d’arabinose, de séquence présentant entre 90% et 100% d’identité avec SEQ ID NO:3.
Les trois éléments essentiels du plasmide selon l’invention tels que décrits plus haut, à savoir, origine de réplication thermosensible, marqueur de sélection et marqueur de contre-sélection caractérisent ainsi le plasmide selon l’invention.
Un tel plasmide peut être ensuite modifié pour son utilisation comme vecteur dans un procédé particulier de modification d’une séquence cible par recombinaison homologue comme décrit ci-dessous. En particulier, l’homme du métier pourra insérer dans ledit plasmide selon l’invention (4) deux fragments d’acides nucléiques de séquences substantiellement homologues aux séquences d’ADN chromosomique flanquant les extrémités 5’ et 3’ respectivement d’une séquence cible à modifier, et le cas échéant (5) un acide nucléique comprenant une séquence de remplacement de la séquence cible à modifier.
Par substantiellement homologues, il faut comprendre une séquence présentant de préférence entre 90 et 100% d’identité avec les séquences correspondantes visées pour la recombinaison homologue chez la bactérie cible.
Lesdits fragments d’acides nucléiques de séquences substantiellement homologues aux séquences d’ADN chromosomique flanquant les extrémités 5’ et 3’ respectivement d’une séquence cible à modifier (4) sont en général d’une taille suffisante pour permettre la recombinaison homologue et éviter le mésappariement avec d’autres séquences de l’ADN chromosomique. Elles sont par exemple comprises entre 50pb et lOOOpb, de préférence entre 200pb et 700pb, par exemple entre 400pb et 500pb.
Dans un mode de réalisation particulier comprenant un acide nucléique codant pour une séquence de remplacement de la séquence cible à modifier, on choisira de préférence une séquence de remplacement d’une taille ne dépassant pas les lOOOOpb, de préférence ne dépassant pas 8000pb, par exemple comprise entre 20pb et 6000pb.
Ces différents éléments (1) à (5) du plasmide selon l’invention sont décrits par exemple dans la figure 1 à titre d’illustration.
Le plasmide peut comprendre en outre des motifs de reconnaissance d’enzyme de restriction pour l’insertion et le clonage en particulier des éléments (4) et (5), un second marqueur de sélection positive dans le cas d’une incompatibilité de marqueur entre la souche utilisée pour la production du plasmide et la souche finale.
Ces plasmides selon l’invention tels que décrits ci-dessus sont utiles pour la mise en œuvre de procédé de modifications sans cicatrice d’une séquence cible de l’ADN chromosomique d’une souche bactérienne tels que décrits ci-dessous.
Le procédé de modification d’une séquence cible d’ADN chromosomique selon l’invention L’invention vise également un procédé de modification d’une séquence cible d’ADN chromosomique d’une souche bactérienne comprenant, a) la transformation d’une souche bactérienne avec un plasmide selon l’invention tel que décrit aux paragraphes précédents, b) la culture de ladite souche transformée sur milieu sélectif à une température permissive, par exemple comprise entre 28°C et 32°C, c) le cas échéant, la conservation des souches transformées dans un milieu approprié pour la congélation, d) la culture des souches transformées sur milieu solide riche sélectif à une température non-permissive, par exemple comprise entre 40 et 44°C, pour la sélection des clones ayant intégré le plasmide dans leur génome, e) le repiquage des clones positifs obtenus à l’étape d) et leur culture sur milieu non sélectif et à température non-permissive, par exemple comprise entre 40 et 44°C, dans des conditions permettant l’induction de ladite protéine cytotoxique.
La modification de la séquence d’ADN chromosomique cible peut être notamment une délétion de la séquence cible ou sa substitution par une séquence de remplacement ou l’ajout d’une séquence hétérologue.
La séquence cible peut être un gène, ou une partie essentielle d’un gène. D peut s’agir par exemple de la région codante (ou phase ouverte de lecture) d’un gène. La délétion dudit gène (ou de sa partie essentielle) permet ainsi l’inactivation du gène cible par le procédé selon l’invention dans une souche bactérienne.
La substitution dudit gène (ou de sa partie essentielle) par une séquence de remplacement peut permettre le remplacement d’un gène cible par une version allélique.
En particulier, l’ADN chromosomique de la souche ainsi modifié ne comprend pas de délétion d’ADN autres que celles qui étaient précisément souhaitée, ni ne comprend d’insertion d’ADN exogène ou hétérologues autres que l’insertion d’une séquence de remplacement souhaitée. En ce sens, le procédé selon l’invention est un procédé de modification de l’ADN chromosomique « sans cicatrice ».
Par séquence « hétérologue » ou « exogène », il faut comprendre une séquence d’acide nucléique, par exemple un gène, qui n’est naturellement pas présente dans la souche bactérienne qui est l’objet du procédé. En particulier, la présence d’une séquence hétérologue dans une souche bactérienne résulte dans le cadre du procédé selon l’invention d’un procédé artificiel de recombinaison génétique (ou génie génétique).
La première étape du procédé consiste à transformer une souche bactérienne avec un plasmide selon l’invention tel que décrit aux paragraphes précédents.
Pour la mise en œuvre du procédé, on sélectionnera les différents éléments du plasmide selon l’invention en fonction de la souche bactérienne à modifier (ou souche cible).
Le procédé de l’invention est avantageusement applicable à un large spectre de bactéries, incluant les souches bactériennes gram-négatives et les souches bactériennes gram-positives.
Parmi les souches bactériennes gram-négatives, on choisira par exemple les espèces
Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, Pseudomonas fluorescens, Agrobacterium tumefaciuns, Agrobacterium rhizogenes, Salmonella enterica, Acinetobacter baumanii, Klebsiella pneumoniae, Providencia stuartii.
Bien entendu, l’homme du métier adaptera les différents éléments (1) à (5) du plasmide selon l’invention pour leur fonctionnalité dans la souche cible.
Dans un mode de réalisation particulier, ladite souche bactérienne est une souche Gram-négative, par exemple Escherichia coli.
Dans ce mode de réalisation encore plus préféré, l’étape a) du procédé consiste à transformer une souche bactérienne gram-négative, par exemple E. coli, avec un plasmide selon l’invention comprenant ( 1 ) une origine de réplication thermosensible de type thêta de séquence présentant entre 90% et 100% d’identité avec SEQ ID NO:l, ( 2 ) un acide nucléique codant pour un marqueur de sélection positive sur milieu riche, ( 3 ) un acide nucléique codant pour une protéine cytotoxique de séquence présentant entre 90% et 100% d’identité avec SEQ ID NO:2, sous contrôle d’un promoteur inductible sur milieu riche en présence d’arabinose, de séquence présentant entre 90% et 100% d’identité avec SEQ ID NO:3.
Par « transformation », on entend le procédé qui consiste à transfecter un plasmide dans une souche bactérienne et générer ainsi une bactérie comprenant ledit plasmide, non-intégrée dans le chromosome.
Les méthodes de transformations sont bien connues de l’homme du métier et incluent notamment la transformation par choc thermique ou par électroporation.
La deuxième étape du procédé consiste à cultiver les souches transformées sur milieu sélectif sur milieu riche. Le milieu sélectif sera évidemment adapté au marqueur de sélection positive (2) exprimé par le plasmide selon l’invention.
Par exemple, si le plasmide exprime un marqueur de résistance à un antibiotique, notamment, la kanamycine, le milieu sera un milieu comprenant une dose létale de kanamycine, permettant la sélection des souches transformées, résistantes à la kanamycine du fait de la présence du plasmide. L’utilisation d’un milieu riche permet en outre d’optimiser le rendement de l’étape de transformation, et d’obtenir une croissance rapide des souches transformées.
Lors de la deuxième étape du procédé, le milieu riche ne doit pas permettre l’induction du promoteur contrôlant l’expression de la protéine cytotoxique.
Par exemple, si le promoteur utilisé pour le plasmide selon l’invention est le promoteur inductible à l’arabinose, le milieu riche est de préférence supplémenté en glucose, par exemple dans des concentrations variant entre 0,05% et 4%. Ainsi, un tel milieu évite l’expression de la protéine cytotoxique à ce stade, par exemple la toxine CcdB. En outre, dans ce mode de réalisation, le milieu riche ne comprend pas d’arabinose, qui permet l’induction du promoteur pBAD.
On notera que selon une caractéristique essentielle du procédé selon l’invention, cette deuxième étape de culture doit être effectuée à température permissive, c'est-à-dire autorisant la réplication autonome du plasmide dans la souche cible.
Ainsi, sans être lié par une quelconque théorie, il est supposé que cette étape de culture à température permissive permet la croissance et la sélection des bactéries transformées et l’amplification du nombre de copie du plasmide pour un taux d’intégration plus élevé à l’étape ultérieur.
La température permissive sera choisie de façon à permettre une réplication optimale du plasmide. Par exemple, et notamment pour un plasmide comprenant une origine de réplication thermosensible de type pSClOl, on choisira une température permissive comprise entre 28°C et 32°C.
Selon un autre avantage du procédé selon l’invention, à l’issue de la deuxième étape, les souches transformées peuvent être conservées à froid, au congélateur, par exemple à une température inférieure ou égale à -70°C, et en général environ -80°C, pour une utilisation ultérieure et notamment pour la mise en oeuvre des étapes (d) à (e) du procédé selon l’invention tel que décrit ci-dessous.
La conservation permet par exemple de réaliser plusieurs transformations d’une même souche avec des plasmides différents, ou plusieurs transformations de souches différentes avec un même plasmide, de manière séquentielle, et de démarrer en parallèle les étapes ultérieures d’intégration sur milieu contre-sélectif.
Cette étape permet également de conserver la souche à modifier contenant le plasmide en multicopies non intégré au chromosome, ce qui augmente la probabilité d’insertion du plasmide. L’invention porte donc sur lesdites souches intermédiaires du procédé, comprenant le plasmide selon l’invention, le cas échéant dans un milieu de congélation approprié.
La quatrième étape du procédé selon l’invention consiste à cultiver les souches transformées sur milieu solide riche sélectif à une température non-permissive, par exemple comprise entre 40 et 44°C, pour « forcer » l’intégration du plasmide dans le génome.
En effet, le milieu sélectif sélectionne les bactéries capables d’exprimer le marqueur de sélection positive. En revanche, la culture à température non-permissive ne permet pas au plasmide de se maintenir sous sa forme autonome. Seules les bactéries ayant intégré le plasmide (et donc l’acide nucléique codant le marqueur de résistance) survivent dans ces conditions. L’intégration du plasmide est réalisée par recombinaison homologue. Afin de permettre un premier évènement de recombinaison homologue, le plasmide selon l’invention comprend (4) deux fragments d’acides nucléiques de séquences substantiellement homologues aux séquences d’ADN chromosomique flanquant les extrémités 5’ et 3’ respectivement d’une séquence cible à modifier.
Par séquence substantiellement homologue, on comprend que lesdites séquences sont suffisamment homologues pour permettre l’appariement aux séquences du génome de la souche au locus d’intérêt, puis l’échange de matériel génétique entre les deux (comme décrit dans la figure 2 à titre d’illustration).
Le procédé de l’invention doit bien évidemment être appliqué à une souche capable d’effectuer la recombinaison homologue, de préférence à un taux élevé, en particulier en comparaison aux évènements d’intégration non-homologue.
Des modifications génétiques des souches bactériennes pour permettre ou améliorer la recombinaison homologue sont connues de l’homme du métier et inclut notamment, la délétion des gènes impliqué dans la recombinaison non-homologue et/ou l’insertion de gènes favorisant la recombinaison homologue : A titre d’exemples, la surexpression des gènes appartenant au régulon SOS des bactéries (gènes recA, umuD et umuC) favorisent la recombinaison homologue (Walker, 1995). Néanmoins, une trop forte induction de ces protéines peut être délétère pour les bactéries.
Dans un autre mode de réalisation particulier du procédé selon l’invention, on choisira une souche bactérienne présentant un génotype RecA+, par exemple une souche bactérienne d’E. coli présentant un génotype RecA+.
Cette quatrième étape s’effectue également sur un milieu riche ne permettant pas l’expression de la protéine cytotoxique de sorte à optimiser le nombre de clones ayant intégré le plasmide (« clones positifs »).
La cinquième étape du procédé consiste à repiquer des clones positifs obtenus à la quatrième étape et à les cultiver sur milieu non sélectif et à température non-permissive, par exemple comprise entre 40 et 44°C, dans des conditions permettant cette fois-ci l’induction de ladite protéine cytotoxique, c’est-à-dire des conditions de contre-sélection. L’objectif de cette cinquième étape est d’exciser les éléments plasmidiques par une seconde recombinaison homologue. Comme expliqué dans la figure 2, ce deuxième évènement de recombinaison homologue peut se faire en amont ou en aval de la séquence cible à modifier, les clones finalement obtenus sont dans 50% des cas, des clones identiques à la souche de départ et dans 50% des cas, des clones présentant la modification attendue.
Dans un mode de réalisation du procédé utilisant le promoteur pBAD inductible à l’arabinose, cette cinquième étape du procédé est donc réalisée sur milieu riche contenant de l’arabinose et en absence de glucose pour permettre l’expression de la protéine cytotoxique sous contrôle du promoteur pBAD, par exemple le gène CcdB, et la contre-sélection des souches n’ayant pas effectué les deux évènements de recombinaison homologue.
La vérification de la modification souhaitée peut être faite par les techniques connues de l’homme du métier, incluant, l’amplification par PCR, le séquençage, et/ou l’hybridation à l’aide de sonde spécifique de la région modifiée.
Souches bactériennes et trousse pour la mise en œuvre du procédé selon l’invention et utilisations L’invention concerne également les souches bactériennes comprenant un plasmide selon l’invention, ou les souches bactériennes obtenues par le procédé selon l’invention.
Ces souches bactériennes ainsi modifiées sont utiles notamment pour la production d’une molécule d’intérêt, par exemple, une enzyme ou autre protéine thérapeutique. L’invention vise également un kit, ou une trousse comprenant un plasmide selon l’invention, pour la mise en œuvre d’un procédé de modification d’une séquence cible d’ADN chromosomique d’une souche bactérienne.
Le kit ou trousse peut comprend en outre au moins l’un des éléments suivants : - des solutions pour la transfection, - une souche bactérienne, - un milieu de culture riche, - un agent sélectif pour le marqueur de sélection, par exemple, un antibiotique, - un agent contre-sélectif pour le marqueur de contre-sélection, par exemple, l’arabinose.
La présente invention sera mieux comprise à la lumière des exemples non limitatifs suivants, qui sont donnés à titre purement illustratif et n'ont pas pour but de limiter la portée de cette invention qui est définie par les revendications.
FIGURES
La Figure 1 illustre les différents éléments génétiques et leurs agencements sur un plasmide selon l’invention.
La Figure 2 est une représentation schématique du fonctionnement d’un plasmide suicide. Exemple de la délétion du gène ftiuA. La première étape de recombinaison peut se faire au niveau de la partie amont du gène à déléter (A) ou de la partie aval (B). Il existe donc deux formes mérodiploïdes possibles. Chacune de ces formes va à nouveau se recombiner au niveau de la partie amont ou aval du gène à déléter (2eme étape). Taille des fragments : FhuAam : 500 pb ; FhuAav : 500 pb ; FhuA : 2000 pb.
La figure 3 est une représentation des deux formes et analyse par PCR de la zone modifiée et électrophorèse sur gel d’agarose. A : Représentation schématique du chromosome bactérien lorsque la délétion de flmA n’a pas lieu. B : Représentation schématique du chromosome bactérien lorsque la délétion de ftiuA a eu lieu. C : Analyse par PCR et électrophorèse des différents clones obtenus après la deuxième étape de recombinaison. Dans cet exemple, la délétion du gène ftiuA a eu lieu pour 4 clones sur 8.
La Figure 4 est une représentation schématique du fonctionnement d’un plasmide suicide. Exemple du remplacement du gène 1 par le gène 2. La première étape de recombinaison peut se faire au niveau de la partie amont du gène à remplacer (A) ou de la partie aval (B). Il existe donc deux formes mérodiploïdes possibles. Chacune de ces formes va à nouveau se recombiner au niveau de la partie amont ou aval du gène à déléter (2eme étape). Taille des fragments : Genel amont : 500 pb ; Genel aval : 500 pb ; Gène 1 : 1000 pb ; Gène 2 : 2000 pb.
La Figure 5 est une représentation des deux formes et analyse par PCR de la zone modifiée et électrophorèse. A : Représentation schématique du chromosome bactérien lorsque le remplacement n’a pas lieu. B : Représentation schématique du chromosome bactérien lorsque l’insertion du gène 2 à la place du gène 1 a eu lieu. C : Analyse par PCR et électrophorèse des différents clones obtenus après la deuxième étape de recombinaison. Dans cet exemple, l’insertion du gène 2 à la place du gène 1 a eu lieu pour 1 clone sur 4.
EXEMPLES
Exemple 1
Un plasmide selon l’invention contenant les éléments (1) à (4) suivants a été construit (illustrés à la Figure 1): (1) l’origine thermosensible de réplication issue du pSC 101 (Hashimoto and Sekiguchi, 1976; Hashimoto-Gotoh et al., 1981), (2) un acide nucléique codant pour le gène de résistance à la kanamycine, (3) un acide nucléique comprenant le promoteur pBAD, et un acide nucléique codant pour la toxine CcdB sous contrôle du promoteur pBAD, (4) les zones d’homologies (500pb) en amont et en aval de la séquence cible à déléter (dans le présent cas la séquence nucléotidique codant pour le gène fhua),
Ce plasmide a un système de réplication de type thêta (Lilly and Camps, 2015).
Il est adapté pour la délétion d’une séquence cible dans une souche bactérienne.
Exemple 2
Un autre plasmide selon l’invention a été construit contenant les éléments (1) à (4) tels que décrit en exemple 1 et comprenant en outre, entre les régions homologues, une séquence de remplacement (5) à insérer à la place de la région délétée. Cette séquence de remplacement (5) est la séquence nucléotidique codant pour le promoteur T7 suivie de la séquence nucléotidique codant pour une protéine de 2 kb.
Ce plasmide comprenant les éléments Ts-Kn-pBAD-CcdB a également un système de réplication de type thêta (Lilly and Camps, 2015).
Il est adapté pour le remplacement d’une séquence cible dans une souche bactérienne par une autre séquence hétérologue ou une séquence mutée.
Exemple 3 : Procédé de délétion sans cicatrice d’une séquence cible d’une souche bactérienne
Une souche d’E. coli AraC+ et RecA+ est transformée à 30°C (il faut respecter cette température en raison de la présence de l’origine thermosensible) avec le plasmide selon l’exemple 1 et cette souche est conservée sous forme d’un stock glycérol.
Mise en œuvre de l’étape de sélection des clones avant intégré le plasmide selon l’invention dans leur génome A partir du stock glycérol, la souche est striée sur une boite de milieu riche LB Kanamycine-Glucose (Kn-Glu) à 42°C. 18h plus tard, les clones qui ont poussé sur la boite ont réalisé une première recombinaison homologue qui permet l’intégration du plasmide suicide dans le génome. Si ces clones n’avaient pas réalisé cette recombinaison, ils ne pourraient pas pousser sur un milieu Kn à 42°C mais seulement sur un milieu Kn à 30 °C en raison de la présence de l’origine thermosensible. L’intégration du plasmide suicide dans le génome est vérifiée par PCR et 2 formes mérodiploïdes sont identifiées (recombinaison au niveau de la partie amont du gène à déléter ou au niveau de la partie aval) en proportion 50/50. Ceci montre bien que le procédé selon l’invention est efficace car 100 % des clones sont sous forme mérodiploïde, il n’y a pas de faux positifs à 42°C.
Etape d’Excision du plasmide suicide
Les clones isolés lors de la première étape sont repiqués sur des boites LB Ara à 42 °C. Le lendemain, les clones qui ont poussé sur la boîte Ara ont réalisé une seconde recombinaison homologue qui a permis l’excision du plasmide. Les boîtes étant placées à 42°C sans Kn, le plasmide suicide excisé n’est pas maintenu chez les clones ayant réalisé l’excision. La recombinaison homologue pouvant se faire en amont ou en aval du gène à déléter, les différents clones obtenus sont dans 50 % des clones identiques à la souche initiale et dans 50% des cas des clones présentant la délétion attendue (cf Figure 3). Le ratio 50/50 obtenu correspond au ratio attendu.
Exemple 4 :
Une souche d’E. coli AraC+ et RecA+ est transformée à 30°C (il faut respecter cette température en raison de la présence de l’origine thermosensible) avec le plasmide selon l’exemple 2 et cette souche est conservée sous forme d’un stock glycérol.
Mise en œuvre de l’étape de sélection des clones avant intégré le plasmide selon l’invention dans leur génome A partir du stock glycérol, la souche est striée sur une boite de milieu riche LB Kanamycine-Glucose (Kn-Glu) à 42°C. 18h plus tard, les clones qui ont poussé sur la boite ont réalisé une première recombinaison homologue qui permet l’intégration du plasmide suicide dans le génome. Si ces clones n’avaient pas réalisé cette recombinaison, ils ne pourraient pas pousser sur un milieu Kn à 42°C mais seulement sur un milieu Kn à 30 °C en raison de la présence de l’origine thermosensible. L’intégration du plasmide suicide dans le génome est vérifiée par PCR et 2 formes mérodiploïdes sont identifiées (recombinaison au niveau de la partie amont du gène à déléter ou au niveau de la partie aval) en proportion 50/50. Ceci montre bien que l’origine thermosensible est efficace car 100 % des clones sont sous forme mérodiploïde, il n’y a pas de faux positifs à 42°C.
Etape d’Excision du plasmide suicide
Les clones isolés lors de la première étape sont repiqués sur des boites LB Ara à 42 °C. Le lendemain, les clones qui ont poussé sur la boîte Ara ont réalisé une seconde recombinaison homologue qui a permis l’excision du plasmide. Les boîtes étant placées à 42°C sans Kn, le plasmide suicide excisé n’est pas maintenu chez les clones ayant réalisé l’excision. La recombinaison homologue pouvant se faire en amont ou en aval du gène à déléter, les différents clones obtenus sont dans 50 % des clones identiques à la souche initiale et dans 50% des cas des clones présentant le remplacement attendu (cf Figure 5).
Exemple 5 : Acides nucléiques SEQIDNOrl Ori Ts
GCGCTATTTCTTCCAGAATTGCCATGATTTTTTCCCCACGGGAGGCGTCACTGGCT
CCCGTGTTGTCGGCAGCTTTGATTCGATAAGCAGCATCGCCTGTTTCAGGCTGTCT
ATGTGTGACTGTTGAGCTGTAACAAGTTGTCTCAGGTGTTCAATTTCATGTTCTAG
TTGCTTTGTTTTACTGGTTTCACCTGTTCTATTAGGTGTTACATGCTGTTCATCTGT
TACATTGTCGATCTGTTCATGGTGAACAGCTTTGAATGCACCAAAAACTCGTAAA
AGCTCTGATGTATCTATCTTTTTTACACCGTTTTCATCTGTGCATATGGACAGTTTT
CCCTTTGATATGTAACGGTGAACAGTTGTTCTACTTTTGTTTGTTAGTCTTGATGCT
TCACTGATAGATACAAGAGCCATAAGAACCTCAGATCCTTCCGTATTTAGCCAGT
ATGTTCTCTAGTGTGGTTCGTTGTTTTTGCGTGAGCCATGAGAACGAACCATTGAG
ATCATACTTACTTTGCATGTCACTCAAAAATTTTGCCTCAAAACTGGTGAGCTGAA
TTTTTGCAGTTAAAGCATCGTGTAGTGTTTTTCTTAGTCCGTTATGTAGGTAGGAA
TCTGATGTAATGGTTGTTGGTATTTTGTCACCATTCATTTTTATCTGGTTGTTCTCA
AGTTCGGTTACGAGATCCATTTGTCTATCTAGTTCAACTTGGAAAATCAACGTATC
AGTCGGGCGGCCTCGCTTATCAACCACCAATTTCATATTGCTGTAAGTGTTTAAAT
CTTTACTTATTGGTTTCAAAACCCATTGGTTAAGCCTTTTAAACTCATGGTAGTTA
TTTTCAAGCATTAACATGAACTTAAATTCATCAAGGCTAATCTCTATATTTGCCTT
GTGAGTTTTCTTTTGTGTTAGTTCTTTTAATAACCACTCATAAATCCTCATAGAGT
ATTT GTTTT C AAA AGAC TT A AC AT GTTCC AGATT AT ATTTT AT GA ATTTTTTT A AC T
GGAAAAGATAAGGCAATATCTCTTCACTAAAAACTAATTCTAATTTTTCGCTTGA
GAACTT GGC AT AGTTTGT CC ACT GGA A A AT CT C AAAGCCTTT AACC AAAGGATT C
CTGATTTCCACAGTTCTCGTCATCAGCTCTCTGGTTGCTTTAGCTAATACACCATA
AGCATTTTCCCTACTGATGTTCATCATCTGAGCGTATTGGTTATAAGTGAACGATA
CCGTCCGTTCTTTCCTTGTAGGGTTTTCAATCGTGGGGTTGAGTAGTGCCACACAG
CATAAAATTAGCTTGGTTTCATGCTCCGTTAAGTCATAGCGACTAATCGCTAGTTC
ATTTGCTTTGAAAACAACTAATTCAGACATACATCTCAATTGGTCTAGGTGATTTT
AATCACTATACCAATTGAGATGGGCTAGTCAATGATAATTACTAGTCCTTTTCCTT
TGAGTTGTGGGTATCTGTAAATTCTGCTAGACCTTTGCTGGAAAACTTGTAAATTC
TGCTAGACCCTCTGTAAATTCCGCTAGACCTTTGTGTGTTTTTTTTGTTTATATTCA
AGT GGTT AT AATTT AT AGAAT AAAGAA AGAAT AAAAA AAGAT A AAAAG A AT AG A
TCCCAGCCCTGTGTATAACTCACTACTTTAGTCAGTTCCGCAGTATTACAAAAGG
ATGTCGCAAACGCTGTTTGCTCCTCTACAAAACAGACCTTAAAACCCTAAAGGCT
TAAGTAGCACCCTCGCAAGCTCGGGCAAATCGCTGAATATTCCTTTTGTCTCCGA
CCATCAGGCACCTGAGTCGCTGTCTTTTTCGTGACATTCAGTTCGCTGCGCTCACG
GCTCTGGCAGTGAATGGGGGTAAATGGCACTACAGGCGCCTTTTATGGATTCATG
CAAGGAAACTACCCATAATACAAGAAAAGCCCGTCACGGGCTTCTCAGGGCGTTT
TATGGCGGGTCTGCTATGTGGTGCTATCTGACTTTTTGCTGTTCAGCAGTTCCTGC
CCTCTGATTTTCCAGTCTGACCACTTCGGATTATCCCGTGACAGGTCATTCAGACT
GGCTAATGCACCCAGTAAGGCAGCGGTATCATCAACAGGCTTACCCGTCTTACTG
TC
SEQ ID NO :2 : CcdB
ATGCAGTTTAAGGTTTACACCTATAAAAGAGAGAGCCGTTATCGTCTGTTTGTGG
ATGTACAGAGTGATATTATTGACACGCCCGGGCGACGGATGGTGATCCCCCTGGC
CAGTGCACGTCTGCTGTCAGATAAAGTCTCCCGTGAACTTTACCCGGTGGTGCAT
ATCGGGGATGAAAGCTGGCGCATGATGACCACCGATATGGCCAGTGTGCCGGTCT
CCGTTATCGGGGAAGAAGTGGCTGATCTCAGCCACCGCGAAAATGACATCAAAA
ACGCCATTAACCTGATGTTCTGGGGAATATAA
SEQ ID NO :3 : pBAD
CCATAAGATTAGCGGATCCTACCTGACGCTTTTTATCGCAACTCTCTACTGTTTCT
CCATA
REFERENCES
Armstrong, K.A., Acosta, R., Ledner, E., Machida, Y., Pancotto, M., McCormick, M., Ohtsubo, H., and Ohtsubo, E. (1984). J. Mol. Biol. 175, 331-348.
Blomfield, I.C., Vaughn, V., Rest, R.F., and Eisenstein, B.I. (1991). Mol. Microbiol. 5, 1447-1457.
Donnenberg, M.S., and Kaper, J.B. (1991). Infect. Immun. 59, 4310-4317.
Gruss, A., and Maguin, E. (1993). Thermosensitive Plasmid.
Hashimoto, T., and Sekiguchi, M. (1976). J. Bacteriol. 127, 1561-1563.
Hashimoto-Gotoh, T., and Sekiguchi, M. (1977). J. Bacteriol. 131, 405-412.
Hashimoto-Gotoh, T., Franklin, F.C., Nordheim, A., and Timmis, K.N. (1981). Gene 16, 227-235.
Kok, J., van der Vossen, J.M., and Venema, G. (1984). Appl. Environ. Microbiol. 48, 726-731.
Larkin, M.A., Blackshields, G., Brown, N.P., Chenna, R., McGettigan, P.A., McWilliam, H., Valentin, F., Wallace, LM., Wilm, A., Lopez, R., et al. (2007). Clustal W and Clustal X version 2.0. Bioinforma. Oxf. Engl. 23, 2947-2948.
Le Roux, F., Binesse, J., Saulnier, D., and Mazel, D. (2007). Appl. Environ. Microbiol. 73, 777-784.
Lilly, J., and Camps, M. (2015). Microbiol. Spectr. 3, PLAS-0029-2014.
Miller, V.L., and Mekalanos, J.J. (1988). J. Bacteriol. 170, 2575-2583.
Philippe, N., Alcaraz, J.-P., Coursange, E., Geiselmann, J., and Schneider, D. (2004). Plasmid 51,246-255.
Ranquet, C., and Geiselmann, H. (2013). Expression Cassette for Modifying the Genome of Bacteria and for Modifying a Vector in a Bacterial Strain. del Solar, G., Giraldo, R., Ruiz-Echevarria, M.J., Espinosa, M., and Diaz-Orejas, R. (1998). Microbiol. Mol. Biol. Rev. MMBR 62, 434-464.
Sozhamannan, S., Dabert, P., Moretto, V., Ehrlich, S.D., and Gruss, A. (1990). J. Bacteriol. 172, 4543-4548.
Walker, G.C. (1995). Trends Biochem. Sci. 20, 416^120.
Claims (10)
- REVENDICATIONS1. Plasmide pour la modification d’une séquence cible d’ADN chromosomique d’une souche bactérienne par recombinaison homologue, comprenant les éléments suivants : ( 1 ) une origine de réplication thermosensible, ( 2 ) un acide nucléique codant pour un marqueur de sélection positive sur milieu riche, (3) un acide nucléique codant pour une protéine cytotoxique sous contrôle d’un promoteur inductible sur milieu riche.
- 2. Plasmide selon la revendication 1, caractérisé en ce que l’origine de réplication thermosensible est de type thêta et comprend un acide nucléique de séquence SEQ ID NO:l, ou une séquence homologue présentant au moins 70% d’identité avec SEQ ID NO:l.
- 3. Plasmide selon l’une quelconque des revendications 1 à 2, caractérisé en ce que l’acide nucléique codant la protéine cytotoxique comprend un acide nucléique de séquence SEQ ID NO:2, ou une séquence homologue présentant au moins 70% d’identité avec SEQ ID NO:2.
- 4. Plasmide selon la revendication 3, caractérisé en ce que le promoteur sur milieu riche est un promoteur inductible à l’arabinose et comprend la séquence SEQ ID NO:3, ou une séquence homologue présentant au moins 70% d’identité avec SEQ ID NO:3.
- 5. Plasmide selon l’une des revendications 1 à 4, comprenant : (1) une origine de réplication thermosensible de type thêta de séquence présentant entre 90% et 100% d’identité avec SEQ ID NO:l, (2) un acide nucléique codant pour un marqueur de sélection positive sur milieu riche, (3) un acide nucléique codant pour une protéine cytotoxique de séquence présentant entre 90% et 100% d’identité avec SEQ ID NO:2, sous contrôle d’un promoteur inductible sur milieu riche en présence d’arabinose, de séquence présentant entre 90% et 100% d’identité avec SEQ IDNO:3.
- 6. Plasmide selon l’une des revendications 1 à 5, comprenant en outre (4) deux fragments d’acides nucléiques de séquences substantiellement homologues aux séquences d’ADN chromosomique flanquant les extrémités 5’ et 3’ respectivement d’une séquence cible à modifier, et le cas échéant (5) un acide nucléique comprenant une séquence de remplacement de la séquence cible à modifier.
- 7. Procédé de modification d’une séquence cible d’ADN chromosomique d’une souche bactérienne comprenant, a) la transformation d’une souche bactérienne avec un plasmide selon l’une des revendications 1 à 6, b) la culture de ladite souche transformée sur milieu sélectif à une température permissive, c) le cas échéant, la conservation des souches transformées dans un milieu approprié pour la congélation, d) la culture des souches transformées sur milieu solide riche sélectif à une température non-permissive, pour la sélection des clones ayant intégré le plasmide dans leur génome, e) le repiquage des clones positifs obtenus à l’étape d) et leur culture sur milieu non sélectif et à température non-permissive, dans des conditions permettant l’induction de ladite protéine cytotoxique.
- 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que ladite souche bactérienne est une souche Gram-négative, par exemple Escherichia coli.
- 9. Procédé selon l’une quelconque des revendications 7 à 8, caractérisé en ce que la modification génomique est une délétion de la séquence cible ou sa substitution par une séquence de remplacement ou l’ajout d’une séquence hétérologue.
- 10. Souche bactérienne comprenant un plasmide selon l’une des revendications 1 à 6.
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR3099769A1 (fr) * | 2019-08-05 | 2021-02-12 | Bgene Genetics | Mutagénèse bactérienne par conjugaison en milieu liquide |
| WO2024149383A1 (fr) * | 2023-01-13 | 2024-07-18 | 上海吉量医药工程有限公司 | Miniplasmide sans antibiotique, son procédé de préparation et son utilisation |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2982276A1 (fr) * | 2011-11-08 | 2013-05-10 | Univ Grenoble 1 | Cassette d'expression pour modifier le genome des bacteries et pour modifier un vecteur dans une souche bacterienne |
| US8586058B2 (en) * | 2007-11-21 | 2013-11-19 | Universidad Publica De Navarra | Method for producing multiple modifications in the chromosome of gram-negative bacteria and salmonella strains which are deficient in c-di-GMP synthesis obtained by said method |
-
2016
- 2016-05-04 FR FR1654046A patent/FR3050997B1/fr active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8586058B2 (en) * | 2007-11-21 | 2013-11-19 | Universidad Publica De Navarra | Method for producing multiple modifications in the chromosome of gram-negative bacteria and salmonella strains which are deficient in c-di-GMP synthesis obtained by said method |
| FR2982276A1 (fr) * | 2011-11-08 | 2013-05-10 | Univ Grenoble 1 | Cassette d'expression pour modifier le genome des bacteries et pour modifier un vecteur dans une souche bacterienne |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| LINK A J ET AL: "METHODS FOR GENERATING PRECISE DELETIONS AND INSERTIONS IN THE GENOME OF WILD-TYPE ESCHERICHIA COLI: APPLICATION TO OPEN READING FRAME CHARACTERIZATION", JOURNAL OF BACTERIOLOGY, AMERICAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY, US, vol. 179, no. 20, 1 October 1997 (1997-10-01), pages 6228 - 6237, XP000890089, ISSN: 0021-9193 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR3099769A1 (fr) * | 2019-08-05 | 2021-02-12 | Bgene Genetics | Mutagénèse bactérienne par conjugaison en milieu liquide |
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