CN107835854B - 基于盐酸处理的革兰氏阳性细菌菌蜕的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基于盐酸处理来制备的革兰氏阳性细菌菌蜕及其制备方法，具体地，在根据本发明的方法来制备的革兰氏阳性菌的细菌菌蜕中，当以可抑制革兰氏阳性菌的生菌菌落的生成的盐酸的最小抑菌浓度(MIC)进行处理的方式来进行培养时，可有效地形成细菌菌蜕，并且所形成的上述细菌菌蜕处于完全保留细胞的外膜形态且在细胞质内未残留蛋白质或脱氧核糖核酸的形态，因此，当向体内给药时，对基于增殖的二次感染症等的副作用的危险少，从而根据本发明的方法制备的革兰氏阳性菌的细菌菌蜕可有效地作为用于预防或治疗革兰氏阳性菌感染症的疫苗或外来抗原载体。

Description

基于盐酸处理的革兰氏阳性细菌菌蜕的制备方法
技术领域
本申请主张于2016年04月15日向韩国专利局提交的韩国专利申请第10-2016-0046466号的优先权，上述说明书的所有内容为本申请的参考文献。
本发明设计基于盐酸处理来制备的革兰氏阳性细菌菌蜕及其制备方法。
背景技术
细菌菌蜕(bacteria ghost，bacterial ghost)可简单地定义成如下的结构体，即，由于去除了微生物的细胞内的结构物(细胞质包涵体)，从而虽然上述结构体处于内部空的状态，但细胞膜完整地维持外膜(envelope)的形态。细菌菌蜕缺少细胞内的脱氧核糖核酸(DNA)或遗传物质，从而事实上处于死菌状态，因此并不视为遗传重组生物体(GMO)。
但是，细菌菌蜕原样地维持生菌的外膜形态，因此维持存在于外膜的抗原决定簇(antigenic determinant)，从而可呈现功能上与生疫苗类似的效果。尤其，在治疗细菌感染症的方面，由于使用细菌菌蜕的疫苗(菌蜕疫苗)没有因非特异性的大量细胞质而产生的免疫诱导抑制，从而即使不添加外来的助剂(adjuvant)，也可简单地刺激固有免疫系统和适应性免疫系统。由于这种优点，利用细菌菌蜕的疫苗被视为既低廉，又可有效地克服现有化学药品疫苗等的局限的代替方案。
并且，细菌菌蜕没有作为生菌的增殖性或病原性的功能，因此可使处于非活化(inactivated)状态的细菌菌蜕附着于动物、人类或植物的特殊组织或细胞。而且，由于可导入于植物细胞或动物细胞的内部，因此可使用成可向靶细胞有效地传递重组抗原或核酸的转运系统(delivery system)。
已开发了用于生成这种细菌菌蜕的多种方法。生成细菌菌蜕的最普通的方法为如下的E蛋白质介导溶解法，即，以在革兰氏阴性菌中进行形质转换(transformation)的方式表达克隆有噬菌体(bacteriophage)φX174溶解基因E的质粒(plasmid)。完成形质转换的细菌对E基因进行抑制，并根据温度变化来表达E蛋白质，所合成的E蛋白质并未向细菌表面结构给予物理化学性损伤，并且通过在细菌细胞膜及细胞壁形成跨膜通道来最终释放细胞结构物(非专利文献0001)。这种方法具有如下的优点，即，当克隆质粒时，可将抗原基因转换成所需的多种蛋白质，并且可通过现有的形质转换法和培养法实现大量生产。
但是，为了实现包括上述E蛋白质介导溶解法且通过所克隆的质粒的形质转换的细菌菌蜕的制备方法，而伴随着需要多步骤的分子生物学技术、高价的费用及长时间的制备时间的问题。因此，需要可实现简单的制备技术、低价的生产费用及节约时间的细菌菌蜕的大量生产方法。
最近公开了如下的方法，即，将作为革兰氏阴性菌的大肠菌(E.coli BL21(DE3)pLysS)作为模型，并使用作为化学物质的十二烷基硫酸钠(SDS)、氢氧化钠(NaOH)或过氧化氢(H2O2)来制备细菌菌蜕(非专利文献0004)。除此之外，还公开了如下的方法，即，对大肠菌(E.coliDH5α)进行最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration；MIC)的硫酸铵(NH4)2SO4、氯化钙(CaCl2)或乙二胺四乙酸(EDTA)处理，从而以在细胞壁施加影响的方式进行诱导来制备细菌菌蜕(专利文献0004)。
大部分的细菌菌蜕及利用其的疫苗被报道为将大肠菌或沙门氏菌(salmonella)等革兰氏阴性菌作为模型。作为使用革兰氏阳性菌的细菌菌蜕的制备方法，公开了如下的方法，即，在作为革兰氏阴性菌的肠道沙门氏菌(Salmonella enterica Enteriditis)及作为革兰氏阳性菌的金黄色酿脓葡萄球菌(Staphylococcus aureus)中处理作为碱性的氢氧化钠来制备细菌菌蜕。当通过如上所述的方法来制备的沙门氏菌或葡萄球菌的细菌菌蜕免疫接种于实验动物时，可诱导免疫功能，从而还公开了作为疫苗的可能性(非专利文献0005及非专利文献0006)。
但是，存在于细胞膜的抗原表位的蛋白质可产生可根据种类而被盐基游离的情况，因此在通过处理作为碱性的氢氧化钠来制备的细菌菌蜕的情况下，存在会降低作为疫苗的效果的隐患。为了克服上述问题，正进行在酸性环境下也可制备细菌菌蜕的方法的研究，但还未公开针对利用酸(acid)的细菌菌蜕的研究及专利。
为此，本发明者们经过努力开发利用酸的革兰氏阳性菌的细菌菌蜕的制备方法的结果，确认到如下的内容，即，当确定可抑制作为革兰氏阳性菌的单核增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)的生菌菌落生成的盐酸的最小抑菌浓度(MIC)且通过处理最小抑菌浓度的盐酸来培养单核增生李斯特菌时，可有效地形成细菌菌蜕，因此可将本发明的利用李斯特菌的革兰氏阳性菌的细菌菌蜕有用地使用成预防或治疗革兰氏阳性菌感染症的疫苗或外来抗原载体，由此完成了本发明。
现有技术文献
专利文献
(专利文献1)KR10-0273847B1(2000年12月15日)
(专利文献2)KR10-0765357B1(2007年10月10日)
(专利文献3)US7968323B2(2011年06月28日)
(专利文献4)KR10-1449628B1(2014年10年02日)
非专利文献
(非专利文献1)Haidinger,W.,et al.Applied and environmentalmicrobiology 69.1(2003)。
(非专利文献2)Ebensen,Thomas,et al.The Journal of Immunology 172.11(2004):6858-6865。
(非专利文献3)Konopa,Grazyna,and Karol Taylor.Biochimica et BiophysicaActa(BBA)-General Subjects 399.2(1975):460-467。
(非专利文献4)Amara,Amro A.,Mounir M.Salem-Bekhit,and FarsK.Alanazi.The Scientific World Journal 2013(2013)。
(非专利文献5)Vinod,Nagarajan,et al.Vaccine 32.26(2014):3249-3255:3249-3255。
(非专利文献6)Vinod,Nagarajan,et al.Infection and immunity 83.7(2015):2957-2965。
发明内容
技术问题
为此，本发明者们通过制备基于盐酸处理的单核增生李斯特菌的细菌菌蜕来完成了本发明。
因此，本发明的目的在于，提供革兰氏阳性菌的细菌菌蜕的制备方法。
本发明的再一目的在于，提供通过上述制备方法制备的革兰氏阳性菌的细菌菌蜕。
本发明的还有一目的在于，提供通过上述制备方法制备的革兰氏阳性菌的细菌菌蜕的用途。
本发明的另一目的在于，提供包含上述革兰氏阳性菌的细菌菌蜕作为有效成分的用于预防及治疗革兰氏阳性菌感染症的疫苗组合物。
本发明的又一目的在于，提供包括向所需个体给药上述革兰氏阳性菌的细菌菌蜕的步骤的革兰氏阳性菌感染症的预防方法或治疗方法。
本发明的又一目的在于，提供包含上述革兰氏阳性菌的细菌菌蜕作为有效成分的用于预防及治疗革兰氏阳性菌感染症的疫苗组合物的用途。
解决问题的方案
为了达成上述目的，本发明提供革兰氏阳性菌的细菌菌蜕的制备方法，包括：步骤i)，在培养基中接种革兰氏阳性菌来进行培养；步骤ii)，从在上述步骤i)中培养的培养液取得革兰氏阳性菌；步骤iii)，对在上述步骤ii)中取得的革兰氏阳性菌进行盐酸处理来形成细菌菌蜕；以及步骤iv)取得在上述步骤iii)中形成的细菌菌蜕。
根据本发明的优选一实施例，上述步骤i)的革兰氏阳性菌可以为选自由李斯特菌(Listeria sp.)、葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)、炭疽杆菌(Bacillus anthracis)、白喉杆菌(Corynebacteriumdiphtheriae)及破伤风杆菌(Clostrium tetani)等组成的组中的一种以上。
根据本发明的优选一实施例，上述步骤iii)的处理可以为以最小抑菌浓度对盐酸进行的处理。
根据本发明的优选一实施例，上述盐酸的最小抑菌浓度能够为6.25mg/ml。
根据本发明的优选一实施例，上述步骤iii)的处理可以为对盐酸进行10分钟至60分钟的处理。
根据本发明的优选一实施例，上述步骤iii)的处理可以为在30℃至40℃的温度下对盐酸进行的处理。
本发明还提供通过上述制备方法来制备的革兰氏阳性菌的细菌菌蜕。
本发明还提供通过上述制备方法来制备的革兰氏阳性菌的细菌菌蜕的用途。
本发明还提供包含上述革兰氏阳性菌的细菌菌蜕作为有效成分的用于预防及治疗革兰氏阳性菌感染症的疫苗组合物。
本发明还提供包括向所需个体给药上述革兰氏阳性菌的细菌菌蜕的步骤的革兰氏阳性菌感染症的预防方法或治疗方法。
本发明还提供包含上述革兰氏阳性菌的细菌菌蜕作为有效成分的用于预防及治疗革兰氏阳性菌感染症的疫苗组合物的用途。
根据本发明的优选一实施例，上述革兰氏阳性菌可以为选自由李斯特菌、葡萄球菌、肺炎链球菌、炭疽杆菌、白喉杆菌以及破伤风杆菌等组成的组中的一种以上。
根据本发明的优选一实施例，上述疫苗组合物作为死疫苗或外来抗原载体，可包含细菌菌蜕。
发明的效果
因此，本发明提供通过盐酸的处理的革兰氏阳性菌的细菌菌蜕及其制备方法。
在本发明的革兰氏阳性菌的细菌菌蜕中，当通过处理可抑制革兰氏阳性菌的生菌菌落的生成的盐酸的最小抑菌浓度(MIC)来进行培养时，可有效地形成细菌菌蜕。并且，所形成的上述细菌菌蜕完整地保存细胞的外膜形态，并且处于不存在细胞质内的蛋白质或脱氧核糖核酸的形态，因此当向体内给药时，因增殖而产生的二次感染症等的副作用的危险较少。因此，本发明的革兰氏阳性菌的细菌菌蜕可有用地使用成预防或治疗革兰氏阳性菌感染症的疫苗或外来抗原载体。
附图说明
图1为示出在制备利用单核增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)的细菌菌蜕的过程中，从脑心浸液(BHI)液体培养基中确认盐酸的最小抑菌浓度(minimum inhibitionconcentration，MIC)的培养结果。
图2为示出为了确认对以多种浓度进行处理的盐酸或氢氧化钠的细菌生存能力(viability)，而在脑心浸液琼脂培养基中确认是否形成菌落的结果。
图3为示出在处理最小抑菌浓度的盐酸或氢氧化钠后确认随着时间的推移而形成的单核增生李斯特菌的细菌菌蜕的结果。
图4为示出在处理最小抑菌浓度的盐酸或氢氧化钠后确认随着时间的推移而残留于单核增生李斯特菌的细菌菌蜕内的总蛋白质量的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果。
图5为示出在处理最小抑菌浓度的盐酸或氢氧化钠后用于确认残留于单核增生李斯特菌的细菌菌蜕内的基因组脱氧核糖核酸(genome DNA)的琼脂糖电泳结果。
图6为示出在处理最小抑菌浓度的盐酸或氢氧化钠后用于确认残留于单核增生李斯特菌的细菌菌蜕内的基因组脱氧核糖核酸的实时聚合酶链式反应(PCR)分析结果。
图7为示出在处理最小抑菌浓度的盐酸或氢氧化钠后用于观察单核增生李斯特菌的细菌菌蜕的表面形态的扫描型电子显微镜(SEM)分析结果。
具体实施方式
以下，进一步详细地说明本发明。
如上所述，在通过化学处理的细菌菌蜕的制备方法中，在以往技术中公开了通过处理作为碱性的氢氧化钠来使革兰氏阳性菌制备成细菌菌蜕的方法，但未实现针对通过处理酸来制备革兰氏阳性菌的细菌菌蜕的方法的研究。
在本发明的通过盐酸处理来制备的革兰氏阳性菌的细菌菌蜕中，当对可抑制革兰氏阳性菌的生菌菌落生成的盐酸的最小抑菌浓度(MIC)进行处理来培养时，可有效地形成细菌菌蜕，所形成的上述细菌菌蜕完整地保存细胞的外膜形态，并且处于在细胞质内未残留蛋白质或脱氧核糖核酸的形态，因此当向体内给药时，因增殖而产生的二次感染症等的副作用的危险较少，因此，本发明的革兰氏阳性菌的细菌菌蜕有效地作为用于预防或治疗革兰氏阳性菌感染症的的疫苗或外来抗原载体使用。
因此，本发明提供如下的革兰氏阳性菌的细菌菌蜕的制备方法，即，包括：步骤i)，在培养基中接种革兰氏阳性菌来进行培养；步骤ii)，从在上述步骤i)中培养的培养液取得革兰氏阳性菌；步骤iii)，对在上述步骤ii)中取得的革兰氏阳性菌进行盐酸处理来形成细菌菌蜕；以及步骤iv)取得在上述步骤iii)中形成的细菌菌蜕。
优选地，本发明的步骤i)的“革兰氏阳性菌”是指选自由李斯特菌、葡萄球菌、肺炎链球菌、炭疽杆菌、白喉杆菌以及破伤风杆菌等组成的组中的一种以上，但并不限定于此，只要是在本领域中被作为死疫苗或外来抗原载体使用且被公知为病原性菌的革兰氏阳性菌，则可使用任何。
具体地，上述李斯特菌更优选为单核增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、去硝化李斯特菌(L.denitrificans)、格雷李斯特菌(L.grayi)或默里李斯特菌(L.murrayi)，更具体地，作为呈现对李氏杆菌病的病原性的菌存在单核增生李斯特菌，因此最优选为单核增生李斯特菌，但并不限定于此。
优选地，本发明的步骤i)的“培养”是指在30℃至40℃的温度下培养革兰氏阳性菌，具体地，更优选地在37℃的温度下进行培养。并且，优选地培养65小时至75小时的革兰氏阳性菌，具体地，更优选地培养72小时。在培养上述革兰氏阳性菌的过程中，虽然细菌生长步骤的指数生长期(exponential grow thphase)中的细胞的细胞壁对盐酸敏感，但对指数生长期以后的静止期(stationary phase)中的细胞的最小抑菌浓度盐酸具有外膜的损伤程度低且有弹性的细胞壁，从而有效地形成被溶解的隧道结构。
优选地，上述步骤iii)的“处理”是指最小抑菌浓度(MIC)处理盐酸，但并不限定于此。具体地，上述盐酸的最小抑菌浓度优选为6mg/ml至7mg/ml，更具体地，最优选为6.25mg/ml。在本发明的革兰氏阳性菌的细菌菌蜕的制备方法中，重要的是以最小抑菌浓度处理盐酸。若以小于最小抑菌浓度的浓度处理盐酸，则使革兰氏阳性菌的溶解率不足，从而会存在生存的细菌，因此无法将所制备的细菌菌蜕利用成死疫苗或外来抗原载体。并且，若以大于最小抑菌浓度的浓度处理盐酸，则增加革兰氏阳性菌的外膜结构的损伤程度，并且无法在细胞膜形成完美的隧道结构，因此无法制备完美形态的细菌菌蜕，从而可降低作为死疫苗或外来抗原载体的效果。
优选地，上述步骤iii)的“处理”是指对盐酸进行10分钟至60分钟的处理，具体地，更优选地进行15分钟至60分钟的处理，但并不限定于此。在本发明的革兰氏阳性菌的细菌菌蜕的制备方法中，在进行最小抑菌浓度的盐酸处理后，在约15分钟后，革兰氏阳性菌的溶解率可以为100％程度。但是，若考虑将细菌菌蜕作为疫苗使用的过程中的安全性，则上述盐酸的处理最优选地进行60分钟。
优选地，上述步骤iii)的“处理”是指在30℃至40℃的温度下处理盐酸，但并不限定于此，具体地，最优选地在37℃的温度下进行处理。当上述处理的温度小于30℃或大于40℃时，可使盐酸的最小抑菌浓度不同，从而可使本发明的细菌菌蜕的制备效率不同。
在本发明的具体的实施例中，本发明者们为了将单核增生李斯特菌制备成细菌菌蜕而确认盐酸的最小抑菌浓度的结果，当以6.25mg/ml的浓度添加盐酸时，有效地抑制李斯特菌的生长，从而以盐酸的最小抑菌浓度决定李斯特菌，并且确认到有效地抑制生菌的生长程度(图1的A部分及图2)。为了作为对照组进行比较而使用的氢氧化钠的最小抑菌浓度为6.25mg/ml，但被视为可制备细菌菌蜕的硫酸铵或氯化钙在500mg/ml的处理浓度下也不会对革兰氏阴性菌呈现抑制生长的效果(图1的B部分至D部分)。
并且，在制备李斯特菌的细菌菌蜕的过程中，确认处理最小抑菌浓度的盐酸的最佳条件的结果，确认到在约15分钟时，最小抑菌浓度的盐酸处理有效地实现细菌菌蜕的形成(图3)。
并且，本发明者们在确认是否能够有效地使用根据本发明的方法制备的李斯特菌的细菌菌蜕的结果，确认到上述细菌菌蜕有效地生成细胞壁的被溶解的隧道，因此缺少残留于细胞质内的蛋白质及基因组脱氧核糖核酸，并且仅存在维持细菌菌蜕的结构的细胞壁蛋白质(图4及图5)。相反地，在以相同的方法处理氢氧化钠来制备的细菌菌蜕的情况下，通过残留极微量的细胞质内的基因组脱氧核糖核酸的现象，确认到与通过盐酸处理的方法相比更有效(图6)。
而且，本发明者们在分析通过盐酸或氢氧化钠的处理来制备的李斯特菌细菌菌蜕的表面的结果，在盐酸处理组的细菌菌蜕形成被溶解的隧道结构，从而确认到略维持被溶解的外膜形态(图7)。
因此，在根据本发明的方法制备的革兰氏阳性菌的细菌菌蜕中，当通过处理可抑制革兰氏阳性菌的生菌菌落生成的盐酸的最小抑菌浓度(MIC)来进行培养时，可有效地形成细菌菌蜕，所形成的上述细菌菌蜕完整的保存细胞的外膜形态，并处于细胞质内不存在蛋白质或脱氧核糖核酸的形态，因此，当向体内给药时，对基于增殖的二次感染症等的副作用的危险少，从而根据本发明的方法制备的革兰氏阳性菌的细菌菌蜕可有效地作为用于预防或治疗革兰氏阳性菌感染症的疫苗或外来抗原载体。
并且，本发明提供根据本发明的革兰氏阳性菌的细菌菌蜕的制备方法制备的革兰氏阳性菌的细菌菌蜕。
并且，本发明提供根据本发明的革兰氏阳性菌的细菌菌蜕的制备方法制备的革兰氏阳性菌的细菌菌蜕的用途。
并且，本发明提供包含上述革兰氏阳性菌的细菌菌蜕作为有效成分的用于预防及治疗革兰氏阳性菌感染症的疫苗组合物。
并且，本发明提供包括向所需个体给药上述革兰氏阳性菌的细菌菌蜕的步骤的革兰氏阳性菌感染症的预防方法或治疗方法。
并且，本发明提供包含上述革兰氏阳性菌的细菌菌蜕作为有效成分的用于预防及治疗革兰氏阳性菌感染症的疫苗组合物的用途。
本发明的“革兰氏阳性菌”优选为为选自由李斯特菌、葡萄球菌、肺炎链球菌、炭疽杆菌、白喉杆菌以及破伤风杆菌等组成的组中的一种以上，但并不限定于此，只要是在本领域中被作为死疫苗或外来抗原载体使用且被公知为病原性菌的革兰氏阳性菌，则可使用任何。
具体地，上述李斯特菌更优选为单核增生李斯特菌、去硝化李斯特菌)、格雷李斯特菌或默里李斯特菌，更具体地，作为呈现对李氏杆菌病的病原性的菌存在单核增生李斯特菌，因此最优选为单核增生李斯特菌，但并不限定于此。
本发明的“疫苗组合物”优选地包含本发明的革兰氏阳性菌的细菌菌蜕作为死疫苗或外来抗原载体，但并不限定于此。
在本发明的革兰氏阳性菌的细菌菌蜕中，当通过处理可抑制革兰氏阳性菌的生菌菌落的生成的盐酸的最小抑菌浓度(MIC)来进行培养时，可有效地形成细菌菌蜕。并且，所形成的上述细菌菌蜕完整地保存细胞的外膜形态，并且处于不存在细胞质内的蛋白质或脱氧核糖核酸的形态，因此当向体内给药时，因增殖而产生的二次感染症等的副作用的危险较少，因此，本发明的革兰氏阳性菌的细菌菌蜕可有用地使用成预防或治疗革兰氏阳性菌感染症的疫苗或外来抗原载体。
以下，通过实施例对本发明进行更详细的说明。这些实施例仅用于例示本发明，本发明的范围并不被这些实施例所限制，这对本技术领域中的普通技术人员是理所当然地。
用于实施发明的实施方式
实施例1：利用单核增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)的细菌菌蜕的制备
<1-1>确认用于制备细菌菌蜕的最小抑菌浓度(minimuminhibitionconcentration，MIC)
在本发明中，在将单核增生李斯特菌制备成细菌菌蜕的过程中，确认了所需的盐酸的最小抑菌浓度。
具体地，在7℃、200rpm的条件下，在作为革兰氏阴性菌的脑心浸液(BHI，brainheart infusion)培养基中振荡培养过夜(overnight)，通过BiochromLibraS22分光光度计(spectrophotometer)在O.D.600nm下检测吸光度，由此确认菌的生长程度。然后，在新脑心浸液培养基下以下述[表1]的浓度分组稀释盐酸，以106CFU/ml的浓度接种所培养的上述单核增生李斯特菌，病在37℃的温度下培养18小时左右。在培养后，在O.D.600nm下检测吸光度来确认根据盐酸浓度的单核增生李斯特菌的生长程度。为了作为阳性对照组使用，以下述[表1]的浓度在脑心浸液培养基中添加在现有细菌菌蜕的制备方法中所公开的硫酸铵、氯化钙及氢氧化钠，作为无处理对照组而使用未对盐酸进行处理的脑心浸液培养基，并以与上述相同的方法确认单核增生李斯特菌的生长程度。
表1
用于确认为了将单核增生李斯特菌制备成细菌菌蜕而使用的最小抑菌浓度的培养基的浓度
Figure BDA0001338252850000131
Figure BDA0001338252850000141
其结果，如图1所示，当向脑心浸液液体培养基中以6.25mg/ml的浓度添加盐酸或氢氧化钠时，培养基的pH分别为pH3.16及pH10.75，并有效地抑制李斯特菌的生长，由此确认到对李斯特菌的盐酸及氢氧化钠的最小抑菌浓度为6.25mg/ml(图1的A部分及B部分)。与此相比，确认到在以往在通过抑制作为革兰氏阴性菌的大肠菌的生长来制备细菌菌蜕的方面被视为有效的化学剂的硫酸铵及氯化钙即使在500mg/ml的处理浓度下也不会对作为革兰氏阳性菌的李斯特菌呈现抑制生长的效果(图1的C部分及D部分)。
<1-2>确认对李斯特菌的细菌菌蜕的生菌生长功能
确认了对作为革兰氏阳性菌的李斯特菌的盐酸及氢氧化钠的最小抑菌浓度，并通过作为标准分析法的涂抹法(plating)来确认在处理最小抑菌浓度的盐酸或氢氧化钠的培养基中制备的细菌菌蜕的生菌生长程度。
具体地，在上述实施例<1-1>培养的李斯特菌中，以下述[表2]的浓度向脑心浸液琼脂培养基涂抹后，在37℃的温度下培养18小时来诱导菌落的形成，然后进行观察。
表2
用于确认细菌菌蜕的生菌生长功能的琼脂培养基接种菌的浓度
Figure BDA0001338252850000142
Figure BDA0001338252850000151
其结果，如图2所示，确认到在以1/1000的稀释倍数稀释盐酸的未处理对照组来进行涂抹的培养基中形成了无法检测的程度的许多菌落，并且在以1/10的稀释倍数稀释3.125mg/ml的浓度的盐酸处理组来进行涂抹的培养基中也形成了数十个菌落，但确认到在并未稀释作为最小抑菌浓度的6.25mg/ml的浓度的盐酸处理组来进行涂抹的培养基中完全没有形成生存菌落(图2的A部分)。并且，在氢氧化钠处理组中，确认到以1/1000的稀释倍数稀释未处理对照组来进行涂抹的培养基中形成了许多菌落，并且在将3.125mg/ml的浓度的氢氧化钠处理组作为原液进行涂抹的培养基中也形成有数千个以上的菌落，但在将作为最小抑菌浓度的6.25mg/ml的浓度的氢氧化钠处理组作为原液进行涂抹的培养基中完全没有行程有生存菌落(图2的B部分)。
<1-3>决定用于制备对李斯特菌的细菌菌蜕的最少小时
确认到对作为革兰氏阳性菌的李斯特菌可在盐酸及氢氧化钠的最小抑菌浓度下制备细菌菌蜕，由此确认了用于制备细菌菌蜕的最佳时间。
具体地，在脑心浸液液体培养基中接种后，离心分离72小时来取得所培养的李斯特菌(10000g，10分钟)，在以磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.0)来进行清洗后，调节成106CFU/ml的菌浓度来准备李斯特菌。然后，可通过混合12.5mg/ml的浓度的盐酸或氢氧化钠和所准备的2ml的李斯特菌来使盐酸的最终浓度成为6.25mg/ml，由此在37℃的温度下培养李斯特菌。在开始培养后，在15、30、45、60、90分钟取得李斯特菌来检测溶解率，并以与上述实施例<1-2>相同的方法进行涂抹法来确认李斯特菌的菌落形成单位(Colony Forming Unit，CFU)。在终止培养后，取得李斯特菌，并在以磷酸盐(PBS)溶液清洗2次后，在10000g的条件下离心分离15分钟来取得最终的单核增生李斯特菌地细菌菌蜕。相对于氢氧化钠处理，也在开始培养后，在5、10、15、30、45、60分钟后取得菌来确认李斯特菌的细菌菌蜕的制备。
其结果，如图3所示，在最小抑菌浓度的盐酸处理组中处理盐酸，并在15分钟以内有效地形成细菌菌蜕，由此确认到从处理15分钟后在涂抹所制备的细菌菌蜕的脑心浸液琼脂培养基中不形成菌落(图3的A部分)。并且，在最小抑菌浓度的氢氧化钠处理组中，处理氢氧化钠，并在约10分钟完成细菌菌蜕的制备，由此确认到在处理10分钟后在涂抹所制备的细菌菌蜕的脑心浸液琼脂培养基中不形成菌落(图3的B部分)。
实施例2：确认单核增生李斯特菌的细菌菌蜕的特征
<2-1>残留于细菌菌蜕内的蛋白质量的确认
为了确认以盐酸或氢氧化钠制备的李斯特菌的细菌菌蜕的特征，确认了残留于细菌菌蜕内的蛋白质的量。
具体地，以上述实施例<1-3>的方法添加盐酸或氢氧化钠，在15、30、45、60分钟后取得李斯特菌来添加变性缓冲液(Laemmli，1970，Nature227:680-685)，在加热3分钟至5分钟后，准备变性的试料。将所准备的试料搭载在12％的聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶，并在40mA的电流下发育4小时左右后，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。以包含考马斯亮蓝R-250的染色溶液(甲醇：醋酸：水＝5:1:5(v:v:v))染色完成发育后的凝胶来确认细菌菌蜕内的整个蛋白质量。作为未处理对照组，以与上述相同的方法来对大肠菌进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，由此确认整个蛋白质量。
其结果，如图4所示，在盐酸处理组中，确认到在细菌菌蜕中主要存在高分子蛋白质，与此相反地，确认到在氢氧化钠处理组中主要存在低分子蛋白质，与在作为未处理对照组的大肠菌中呈现的蛋白质带相比，确认到其为少量(图4)。由此，确认到在本发明中所制备的细菌菌蜕缺少存在于细胞质内的蛋白质，并且仅残留存在于维持细菌菌蜕的结构的细胞壁的蛋白质。
<2-2>确认残留于细菌菌蜕内的脱氧核糖核酸的量
确认到在本发明中所制备的单核增生李斯特菌的细菌菌蜕内具有蛋白质损失，由此确认残留于细菌菌蜕内的脱氧核糖核酸的量。
具体地，通过上述实施例<1-3>的方法来添加盐酸或氢氧化钠，并在60后取得李斯特菌，然后利用商业用提取试剂盒(iNtRON Biotechnology公司，韩国)并根据生产商提供的协议来提取基因组脱氧核糖核酸。然后，向包含0.5g/ml的溴化乙锭(ethidium bromide，EtBr)的1％的琼脂糖凝胶搭载所提取的上述提取液来进行电泳。
并且，进行实时聚合酶链式反应，并为了更定量地分析基因组脱氧核糖核酸的量，混合所提取的1μl的上述提取液(1:100稀释)、具有记载于下述[表3]的碱基序列的正向引物或反向引物的分别1μl、2×鲜绿II master mix(Agilent Technology公式，美国)及7μl的蒸馏水后，在Stratagene Mx3000P实时聚合酶链式反应分析器中进行如下述[表4]的条件，并进行用于增幅基因组脱氧核糖核酸的实时聚合酶链式反应，然后以荧光分析定量地确认所增幅的产物的量。
作为未处理对照组而使用未处理盐酸或氢氧化钠的单核增生李斯特菌，作为溶剂对照组而使用处理TE缓冲溶液的李斯特菌，作为阳性对照组而使用硫酸铵的李斯特菌，并以与上述相同的方法进行实时聚合酶链式反应分析。
表3
用于定量分析本发明的单核增生李斯特菌的细菌菌蜕的基因组脱氧核糖核酸的引物碱基序列
Figure BDA0001338252850000181
上述正向引物及反向引物被设计为可特异性增幅单核增生李斯特菌的的16S核糖体核糖核酸(rRNA)部分。
表4
用于定量分析本发明的单核增生李斯特菌的细菌菌蜕的基因组脱氧核糖核酸的实时聚合酶链式反应的分析条件
Figure BDA0001338252850000182
其结果，如图5及图6所述，确认到未呈现处理60分钟的盐酸或氢氧化钠的残留于细菌菌蜕内的脱氧核糖核酸(图5)。与此相比，当以实时聚合酶链式反应定量分析时，在处理氢氧化钠的情况下，增幅微量的脱氧核糖核酸，并确认到在细菌菌蜕内存在极微量的单核增生李斯特菌的脱氧核糖核酸，与此相反地，在处理盐酸的情况下，不仅完全没有呈现脱氧核糖核酸的增幅，还确认到呈现小于TE缓冲溶液的Ct值(图6)。由此，根据本发明，通过处理盐酸或氢氧化钠来制备的细菌菌蜕不包含基因组脱氧核糖核酸及细胞质内的蛋白质，并确认到仅维持细胞壁的结构，尤其，与处理氢氧化钠的情况相比，通过处理盐酸来制备的细菌菌蜕残留更低程度的基因组脱氧核糖核酸的量，因此确认到作为死疫苗或外来抗原载体，在使用细菌菌蜕的方面可具有安全性的效果。
<2-3>确认细菌菌蜕表面的形态性分析
为了确认在本发明中制备的细菌菌蜕是否可有效地使用成死疫苗或外来抗原载体等细菌菌蜕，以扫描型电子显微镜(Scanning Electron Mircroscopy，SEM)观察细菌菌蜕的表面来进行形态性分析。
具体地，以上述实施例<1-3>的方法添加盐酸或氢氧化钠，在60分钟后取得李斯特菌的细菌菌蜕，并悬浮于添加2.5％的戊二醛(glutaraldehyde)的磷酸盐溶液中，在4℃的温度下固定2小时左右后，在相同的溶液中进行清洗。然后，将细菌菌蜕移到1％的四氧化锇(osmium tetroxide，OsO4)溶液，并在4℃的温度下固定1.5小时后，以按组稀释的乙醇对细菌菌蜕进行脱水。以液化二氧化碳对所脱水的细菌菌蜕进行干燥，并利用极化子的高分辨率溅射(polaron high-resolution sputter)来涂覆金(gold)，由此准备试料，并以日立S-4800FESEM扫描型电子显微镜观察细菌菌蜕的表面。作为未处理对照组，对李斯特菌的生菌进行与上述相同的方法来以扫描式电子显微镜进行观察。
其结果，如图7所示，与未处理对照组相比，在盐酸处理组的细菌菌蜕中，在细胞壁形成有具有显著的大小的被溶解的隧道结构(以箭头表示)，确认到具有外膜形态被略溶解的结构(图7的A部分)。与此相比，在氢氧化钠处理组中，被溶解的隧道的大小略小，因此与盐酸处理组相比，外膜的形态维持完整的形态(图7的B部分)。

Claims (6)

1.一种李斯特菌的细菌菌蜕的制备方法，其特征在于，包括：
将李斯特菌用浓度为6mg/ml至7mg/ml的盐酸在30℃至40℃的温度下处理15至60分钟以形成细菌菌蜕；以及
收集所述李斯特菌的细菌菌蜕。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，上述盐酸处理中，所述盐酸的所述浓度为6.25mg/ml。
3.一种李斯特菌的细菌菌蜕，其特征在于，通过权利要求1所述的李斯特菌的细菌菌蜕的制备方法来制备。
4.一种用于预防及治疗革兰氏阳性菌感染症的疫苗组合物，其特征在于，包含权利要求3所述的李斯特菌的细菌菌蜕作为有效成分。
5.根据权利要求4所述的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物作为死疫苗或外来抗原载体，包含李斯特菌的细菌菌蜕。
6.根据权利要求1所述的方法所制备李斯特菌的细菌菌蜕在制备用于预防及治疗革兰氏阳性菌感染症的疫苗组合物中的用途。
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