PT1618128E - Vacina de tuberculose com eficácia melhorada - Google Patents

Description

ΕΡ 1 618 128/ΡΤ DESCRIÇÃO "Vacina de tuberculose com eficácia melhorada" 0 presente invento refere-se a novas vacinas recombinantes que proporcionam imunidade protectora especialmente contra tuberculose. A tuberculose (TB) causada por Micobacterium tuberculosis é ainda um problema global significativo. Estima-se que um terço da população mundial esteja infectado com M. tuberculosis (Kochi, 1991). Em muitos paises, a única medida para o controlo de TB tem sido a vacinação com o bacilo de M. bovis de Calmette-Guérin (BCG) . No entanto, a eficácia global da vacina de BCG contra TB é de cerca de 50% com variações extremas na gama de 0% a 80% entre diferentes ensaios de campo (Roche et al., 1995) . Assim, a BCG deve ser melhorada, e.g. por engenharia genética para proporcionar uma vacina para um melhor controlo de TB (Murray et al., 1996; Hess e Kaufmann, 1993). A emergência disseminada de estirpes de M. tuberculosis multi-resistentes a fármacos reforça adicionalmente a necessidade urgente de novas vacinas para TB (Grange, 1996) . A M. tuberculosis pertence ao grupo de bactérias intracelulares que replicam dentro de vacúolos fagossómicos de macrófagos em repouso, pelo que a protecção contra TB depende da imunidade mediada por células T (Kaufmann, 1993). No entanto, vários estudos em ratinhos e humanos demonstraram que as micobactérias estimulam células T CD4 e CD8 restritas ao complexo de histocompatibilidade principal (MHC) de classe II ou de classe I, respectivamente, especificas de antigénio (Kaufmann, 1993). O papel importante de células T CD8 restritas ao MHC de classe I foi demonstrado de forma convincente pela incapacidade de ratinhos deficientes em p2-microglobulina (β2ιη) controlarem infecção experimental de M. tuberculosis (Flynn et al., 1993). Dado que estes ratinhos mutantes não contêm MHC de classe I, não se podem desenvolver células T CD8 funcionais. Contrariamente à infecção por M. tuberculosis, os ratinhos deficientes em β2ιη são capazes de controlar 2 ΕΡ 1 618 128/ΡΤ determinadas doses infecciosas da estirpe de vacina BCG (Flynn et al., 1993; Ladel et al., 1995). Adicionalmente, a vacinação com BCG de ratinhos deficientes em β2ιη prolongou a sobrevivência após subsequente infecção com M. tuberculosis, enquanto C57BU6 imunizados com BCG resistiram a TB (Flynn et al., 1993). Esta dependência diferente de células T CD8 entre M. tuberculosis e BCG pode ser explicada da seguinte forma: os antigénios de M. tuberculosis ganham um melhor acesso ao citoplasma do que os antigénios de BCG levando a uma apresentação mais pronunciada de MHC de classe I (Hess e

Kaufmann, 1993). Consequentemente, gera-se uma resposta de células T CD8 mais eficaz por M. tuberculosis. Esta noção foi corroborada recentemente pela apresentação aumentada de MHC de classe I de um antigénio irrelevante, ovalbumina, por infecção simultânea de células apresentadoras de antigénio (APC) com M. tuberculosis, mas não com BCG (Mazzaccaro et al., 1996).

As proteínas excretadas de M. tuberculosis compreendem uma fonte valiosa de antigénios para a apresentação de MHC de classe I. Recentemente, uma vacina de ADN que codifica o antigénio excretado Ag85A desencadeou respostas de células T CD8 restritas ao MHC de classe I em ratinhos que podem contribuir para defesa contra TB (Huygen et ai., 1996). Em geral, estão a acumular-se evidências de que a imunização com antigénios de proteínas excretadas por M. tuberculosis induz alguma protecção contra TB em porquinhos-da-índia e ratinhos (Horwitz et al., 1995; Andersen, 1994). Assim, constitui um objectivo importante para o desenvolvimento de vacinas de TB melhoradas com base em BCG, aumentar a acessibilidade de antigénios específicos de BCG excretados para o citoplasma de APC infectadas. A subsequente entrega de péptidos derivados destas proteínas excretadas para a via de apresentação do MHC de classe I pode potenciar a resposta imunitária já existente específica de BCG para prevenir TB. A fuga fagolisossómica de L. monocytogenes representa um mecanismo único para facilitar a apresentação de antigénios do MHC de classe I de antigénios listeriais (Berche et al., 1987; Portnoy et al., 1988). A listeriolisina (Hly), uma citolisina activada por sulfidrilo formadora de poros, é essencial para a libertação de microrganismos L. monocytogenes de vacúolos fagolisossómicos para o citosol de células hospedeiras 3 ΕΡ 1 618 128/ΡΤ (Gaillard et al., 1987; Portnoy et al., 1988). Esta função de fuga foi recentemente transferida para Bacillus subtilis e para estirpes atenuadas de Salmonella ssp. (Bielecki et al., 1991; Gentschev et al., 1995; Hess e Kaufmann, 1997). A expressão de Hly por uma estripe mutante asporogénica de B. subtilis ou por Salmonella ssp. resulta em fuga bacteriana do f agolisossoma para o citosol de células J774 do tipo macrófago (Bielecki et al., 1991; Gentschev et al., 1995; Hess e Kaufmann, 1997). WO 99/101496 e Hess et al. (1998) revelam estirpes recombinantes de Mycobacterlum bovis que excretam proteínas de fusão de listeriolisina biologicamente activas. Demonstrou-se que estas estirpes de M. bovis são vacinas eficazes contra TB em vários modelos animais.

De acordo com o presente invento, expressou-se Hly em estirpes de BCG deficientes em urease. Estas estirpes de BCG deficientes em urease apresentam uma actividade Hly aumentada em fagossomas e por seu lado melhoram a formação de poros nas membranas endossómicas, levando a uma imunoprotecção mais elevada. Além disso, as estirpes de BCG-Hly deficientes em urease estão envolvidas em processos apoptóticos que podem contribuir para uma protecção imunitária melhorada. Assim, as estirpes de BCG deficientes em urease têm uma capacidade de vacina ainda mais melhorada. Adicionalmente, verificou-se surpreendentemente que as estirpes de BCG deficientes em urease apresentam um perfil de segurança aumentado comparativamente às estirpes de BCG parentais e são assim particularmente adequadas para a vacinação de doentes imunodeficientes.

Um primeiro aspecto do presente invento é uma célula de Mycobacterlum que é deficiente em urease e compreende uma molécula de ácido nucleico recombinante que codifica um polipéptido de fusão compreendendo (a) pelo menos um domínio de um polipéptido, em que o referido domínio de polipéptido é capaz de desencadear uma resposta imunitária num mamífero e (b) um domínio de fuga fagolisossómica. É preferível que a célula seja capaz de expressar a molécula de ácido nucleico do invento. Com maior preferência, a célula é capaz de excretar o polipéptido de fusão e/ou de proporcioná-lo de uma forma 4 ΕΡ 1 618 128/ΡΤ adequada para reconhecimento de antigénio restrito a MHC de classe I. A célula bacteriana do invento é uma célula de Mycobacterium. A deficiência em urease pode ser conseguida por inactivação parcial ou completa de uma ou várias moléculas de ácido nucleico celular que codificam uma subunidade de urease, em particular ureA que codifica a subunidade A de urease, ureB que codifica a subunidade B de urease e/ou ureC que codifica a subunidade C de urease. As sequências de ureA, ureB e ureC em micobactérias, em particular M. bovis e M. tuberculosis e as proteínas por elas codificadas são descritas em Reyrat et al. (1995) e Clemens et al. (1995) que são aqui incorporadas por referência.

De preferência, a estirpe de Mycobacterium deficiente em urease é obtida por deleções e/ou inserções de um ou vários nucleótidos nas sequências de ácido nucleico de codificação da subunidade de urease e/ou das suas sequências de controlo da expressão. As deleções e/ou inserções podem ser geradas por recombinação homóloga, inserção de transposões ou outros métodos adequados.

Numa concretização especialmente preferida, inactiva-se a sequência ureC, e.g. por construção de um vector suicida contendo um gene ureC com ruptura por um gene marcador de selecção, transforma-se a célula alvo com o vector e rastreia-se para selecção de células positivas a marcador de selecção com um fenótipo negativo a urease, tal como descrito por Reyrat et al. (1995). A célula do invento é de preferência uma célula de M. bovis, uma célula de M. tuberculosis, em particular uma célula de M. tuberculosis atenuada ou outras micobactérias, e.g. M. microti, M. smegmatis, M. canettii, M. marinum ou M. fortuitum ou micobactérias tal como descritas por Reyrat et al. (1995). A célula de Mycobacterium do invento compreende uma molécula de ácido nucleico recombinante, e.g. a molécula de ácido nucleico em SEQ ID No. 1. Esta molécula de ácido nucleico compreende uma sequência que codifica um péptido de 5 ΕΡ 1 618 128/ΡΤ sinal (nucleótidos 1-120), uma sequência de codificação para um domínio imunogénico (nucleótidos 121-153), uma sequência que codifica um ligante peptídico (nucleótidos 154-210) , uma sequência que codifica um domínio fagolisossómico (nucleótidos 211-1722), uma sequência que codifica um ligante peptídico adicional (nucleótidos 1723-1800) e uma sequência de codificação para um péptido aleatório (nucleótidos 1801-1870). A sequência de aminoácidos correspondente apresenta-se em SEQ ID No. 2. O ácido nucleico contém pelo menos um domínio imunogénico de um polipéptido. O domínio imunogénico pode ser derivado de um organismo do género Mycobacterium, de preferência de Mycobacterium tuberculosis ou de Mycobacterium bovis. Este domínio tem um comprimento de pelo menos 6, de preferência pelo menos 8 aminoácidos. O domínio imunogénico é de preferência uma parte de um polipéptido de Mycobacterium nativo. No entanto, encontra-se também no âmbito do presente invento um domínio imunogénico modificado, que é derivado de um domínio imunogénico nativo por substituição, deleção e/ou adição de um ou vários aminoácidos.

No entanto, o domínio imunogénico não está restrito a antigénios de Mycobacterium e pode ser seleccionado de auto-antigénios, antigénios de tumores e antigénios de patogénios, tais como antigénios de vírus, antigénios de parasitas, antigénios bacterianos em geral e seus fragmentos imunogénicos. São exemplos específicos de antigénios de tumores adequados os antigénios de tumores humanos, tal como produto de gene supressor tumoral p53 (Houbiers et al., 1993) e antigénios de diferenciação de melanócito, e.g. Melan-A/MART-1 e gplOO (van Elsas et al., 1996). São exemplos específicos de antigénios de vírus adequados os antigénios de vírus de tumores humanos, tais como antigénios de vírus de papiloma humano, e.g. antigénios E6 e E7 (Bosch et al., 1991), antigénios de vírus de influenza, e.g. nucleoproteína de vírus de influenza (Matsui et al., 1995; Fu et al., 1997) ou antigénios retrovíricos tais como antigénios de VIH, e.g. os antigénios de VIH-1 pl7, p24, RT e Env (Harrer et al., 1996;

Haas et al., 1996). São exemplos específicos de antigénios de parasitas adequados os antigénios de Plasmodium, tal como antigénio de estágio de fígado (LSA-1), proteína de 6 ΕΡ 1 618 128/ΡΤ circunsporozoíto (CS ou variantes alélicas cp26 ou cp29), proteína anónima relacionada com trombospondina (TRAP), proteína rica em treonina e asparagina de esporozoíto (STARP) de Plasmodium falciparum (Aidoo et al., 1995) e antigénios de Toxoplasma tal como p30 de Toxoplasma gondii (Khan et al., 1991; Bulow e Boothroyd, 1991). São exemplos específicos de antigénios bacterianos adequados os antigénios de Legionella, tal como a proteína excretada principal de Legionella pneumophila (Blander e Horwitz, 1991). 0 domínio imunogénico é capaz de desencadear uma resposta imunitária num mamífero. Esta resposta imunitária pode ser uma resposta imunitária mediada por células B. No entanto, de preferência, o domínio imunogénico é capaz de desencadear uma resposta imunitária mediada por células T, com maior preferência uma resposta de células T CD8 restritas a MHC de classe I. 0 domínio capaz de desencadear uma resposta imunitária é com maior preferência seleccionado de péptidos ou polipéptidos imunogénicos de M. bovis ou M. tuberculosis ou de seus fragmentos imunogénicos. São exemplos específicos de antigénios adequados Ag85B (p30) de M. tuberculosis (Harth et al., 1996), Ag85B (α-antigénio) de BCG de M. bovis (Matsuo et al., 1988), Ag85A de M. tuberculosis (Huygen et al., 1996) e ESAT-6 de M. tuberculosis (Sorensen et al., 1996, Harboe et al., 1996 e Andersen et al., 1995). Com maior preferência, o domínio imunogénico é derivado do antigénio Ag85B. Com a maior preferência, o domínio imunogénico compreende a sequência de aa.41 a aa.51 em SEQ ID No. 2. A molécula de ácido nucleico recombinante de acordo com o presente invento compreende adicionalmente um domínio de fuga fagolisossómica, i.e. um domínio de polipéptido que proporciona uma fuga do polipéptido de fusão do fagolisossoma para o citosol de células de mamífero. De preferência, o domínio de fuga fagolisossómica é um domínio de fuga fagolisossómica de Listeria, que se descreve em US 5 733 151. Com maior preferência, o domínio de fuga fagolisossómica é derivado do organismo L. monocytogenes. Com a maior preferência, o domínio fagolisossómico é codificado por uma molécula de ácido nucleico seleccionada de: (a) uma sequência 7 ΕΡ 1 618 128/ΡΤ de nucleótidos compreendendo os nucleótidos 211-1722, tal como apresentados em SEQ ID No. 1, (b) uma sequência de nucleótidos que codifica a mesma sequência de aminoácidos do que a sequência de (a) , e (c) uma sequência de nucleótidos que híbrida em condições rigorosas com a sequência de (a) ou (b).

Além da sequência de nucleótidos apresentada em SEQ ID No. 1, o presente invento também compreende sequências de ácido nucleico que hibridam com esta. No presente invento, a expressão "hibridação" é utilizada tal como definido em

Sambrook et al. (Molecular Cloning. A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), 1.101-1.104). De acordo com o presente invento, a expressão "hibridação" é utilizada caso ainda se observe um sinal de hibridação positivo após lavagem durante uma hora com 1 X SSC e SDS a 0,1% a 55°C, de preferência a 62°C e com maior preferência a 68°C, em particular durante 1 hora em 0,2 X SSC e SDS a 0,1% a 55°C, de preferência a 62°C e com maior preferência a 68°C. Uma sequência que híbrida com uma sequência de nucleótidos tal como SEQ ID No. 1 em tais condições de lavagem é uma sequência de nucleótidos que codifica um domínio de fuga fagolisossómica preferido pelo presente invento.

Uma sequência de nucleótidos que codifica um domínio de fuga fagolisossómica, tal como descrito anteriormente, pode ser directamente obtida de um organismo Listeria ou de qualquer fonte recombinante e.g. uma célula de E. coli recombinante contendo a molécula de ácido nucleico de Listeria correspondente ou uma sua variante, tal como descrito anteriormente.

De preferência, a molécula de ácido nucleico recombinante que codifica um polipéptido de fusão contém uma sequência de codificação de um péptido de sinal. Com maior preferência, a sequência de sinal é uma sequência de sinal activa em micobactérias, de preferência em M. bovis, e.g. uma sequência de sinal de M. bovis nativa. Um exemplo preferido de uma sequência de sinal adequada é a sequência de nucleótidos que codifica o péptido de sinal Ag85B, que é apresentada em SEQ ID No. 1 do nucleótido 1 a 120. 8 ΕΡ 1 618 128/ΡΤ

Adicionalmente, é preferível proporcionar-se um ligante peptidico entre o dominio imunogénico e o dominio de fuga fagolisossómica. De preferência, o referido ligante peptidico tem um comprimento desde 5 a 50 aminoácidos. Com maior preferência, uma sequência que codifica um ligante tal como apresentado em SEQ ID No. 1 dos nucleótidos 154 a 210 ou uma sequência a ela correspondente no que se refere à degenerescência do código genético. 0 ácido nucleico pode estar localizado num vector recombinante. De preferência, o vector recombinante é um vector procariótico, i.e. um vector contendo elementos para replicação ou/e integração genómica em células procarióticas. De preferência, o vector recombinante transporta a molécula de ácido nucleico do presente invento ligada operativamente a uma sequência de controlo da expressão. A sequência de controlo da expressão é de preferência uma sequência de controlo da expressão activa em micobactérias, em particular em M. bovis. O vector pode ser um vector extracromossómico ou um vector adequado para integração no cromossoma. Os peritos na especialidade conhecem exemplos de tais vectores, por exemplo, os apresentados em Sambrook et al. supra.

Num aspecto adicional do presente invento, proporciona-se uma célula de Mycobacterium, de preferência uma célula de M. bovis que compreende pelo menos uma molécula de ácido nucleico que codifica um péptido ou polipéptido de fuga fagolisossómica. Mesmo quando o péptido ou polipéptido de fuga fagolisossómica não está fundido com um antigénio, verifica-se um aumento surpreendente das propriedades imunogénicas. A célula de Mycobacterium recombinante que se proporciona de acordo com este aspecto adicional do presente invento pode conter pelo menos uma molécula de ácido nucleico recombinante adicional, e.g. heteróloga, que codifica um péptido ou polipéptido capaz de desencadear uma resposta imunitária num mamifero. O referido péptido ou polipéptido imunogénico adicional pode ser seleccionado de antigénios de Mycobacterium ou, num sentido mais abrangente, de auto-antigénios, antigénios de tumores, antigénios de patogénios e seus fragmentos imunogénicos. A molécula de ácido nucleico que codifica o péptido ou polipéptido adicional pode estar situada 9 ΕΡ 1 618 128/ΡΤ no mesmo vector do gene de fusão. No entanto, pode também estar situada por exemplo num plasmídeo diferente, independentemente do gene de fusão ou pode estar integrado cromossomicamente.

Surpreendentemente, verificou-se que uma célula de

Mycobacterium de acordo com o presente invento tem uma persistência intracelular em células infectadas, e.g. macrófagos, que é igual ou menor à persistência intracelular da uma célula de Mycobacterium nativa correspondente que não contém a molécula de ácido nucleico recombinante. 0 presente invento também se refere a uma composição farmacêutica compreendendo como um agente activo uma célula, tal como definida anteriormente, opcionalmente conjuntamente com diluentes, transportadores e adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis. De preferência, a composição é uma vacina viva adequada para administração a um mamífero, de preferência um humano. A via de vacina que é de facto seleccionada depende da escolha do vector de vacinação. A administração pode ser conseguida numa dose única ou repetida após intervalos de tempo. A dosagem adequada depende de vários parâmetros, tais como o próprio vector de vacina ou a via de administração. Pode ser seleccionada a administração a uma superfície mucosa (e.g. ocular, intranasal, oral, gástrica, intestinal, rectal, vaginal ou tracto urinário) ou através da via parentérica (e.g. subcutânea, intradérmica, intramuscular, intravenosa ou intraperitoneal) .

Adicionalmente, o presente invento refere-se a um método para preparar uma célula de Mycobacterium recombinante, tal como definido anteriormente. De acordo com o primeiro aspecto, este método compreende as etapas de (i) proporcionar uma célula bacteriana deficiente em urease, em particular uma célula de Mycobacterium, (ii) inserir uma molécula de ácido nucleico recombinante na referida célula bacteriana, em que a referida molécula de ácido nucleico codifica um polipéptido de fusão compreendendo (a) pelo menos um domínio de um polipéptido em que o referido domínio é capaz de desencadear uma resposta imunitária num mamífero e (b) um domínio de fuga fagolisossómica e (iii) cultivar a célula obtida de acordo com a etapa (ii) em condições adequadas. De preferência, obtém-se 10 ΕΡ 1 618 128/ΡΤ uma célula que é capaz de expressar a referida molécula de ácido nucleico. Com maior preferência, a célula é uma célula M. bovis.

De acordo com o aspecto adicional, este método compreende as etapas de (i) proporcionar uma célula bacteriana deficiente em urease, em particular uma célula de Mycobacterium, (ii) inserir uma molécula de ácido nucleico recombinante na referida célula bacteriana, em que a referida molécula de ácido nucleico codifica um péptido ou polipéptido de fuga fagolisossómica e (iii) cultivar a célula obtida de acordo com (ii) em condições adequadas.

Caso pretendido, o método do presente invento compreende inserção de pelo menos uma molécula de ácido nucleico recombinante adicional na célula bacteriana, em que a referida molécula de ácido nucleico recombinante codifica um péptido ou polipéptido capaz de desencadear uma resposta imunitária num mamifero.

Finalmente, o presente invento refere-se a um método para a preparação de uma vacina viva compreendendo formular a célula recombinante numa quantidade farmaceuticamente eficaz com diluentes, transportadores e/ou adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis.

Devido à elevada segurança das células bacterianas deficientes em urease, que foi demonstrada em dois modelos animais diferentes (exemplo 3) , a vacina viva do presente invento é particularmente adequada para administração a individuos imunodeficientes, e.g. indivíduos que sofrem de uma infecção por VIH ou indivíduos em tratamento com fármacos imunossupressores. Numa concretização especialmente preferida, a vacina viva do presente invento é utilizada como uma vacina de tuberculose para indivíduos imunodeficientes.

Numa concretização preferida adicional, a vacina viva é utilizada como uma vacina tumoral, e.g. como uma vacina contra cancro da bexiga superficial. Ainda numa outra concretização adicional do invento, a vacina viva é utilizada no campo da veterinária, e.g. como uma vacina contra listeriose, paratuberculose ou tuberculose bovina. 11 ΕΡ 1 618 128/ΡΤ Ο invento será ilustrado adicionalmente pelas seguintes figuras e listagens de sequências.

Figura 1: Apresenta a capacidade protectora de rBCG ureC

Hly no modelo de aerossol de tuberculose murina. Imunizaram-se i.v. ratinhos BALB/c com lxlO6 UFC de rBCG ureC Hly, BCG P ureC ou BCG "Pasteur" nativa. 120 dias após a vacinação provocaram-se os animais com H37Rv (200 organismos/pulmão) via aerossol. A carga bacteriana nos órgãos infectados (baço e pulmão) foi avaliada 30, 60 e 90 dias após provocação. Cada barra representa 10 animais.

Figura 2: Apresenta a quantidade de microrganismos no pulmão (figura 2a) ou no baço (figura 2b). Infectaram-se ratinhos Ragl-/- com a estirpe parental de BCG (wt) ou a estirpe rBCG ureC Hly (urea-Hly). A carga bacteriana do órgão infectado foi avaliada 30, 60 e 90 dias após infecção.

Figura 3: Apresenta a taxa de sobrevivência de ratinhos SCID infectados com BCG "Pasteur" e rBCG delta ureC Hly. SEQ ID No. 1: Apresenta a sequência de nucleótidos de uma molécula de ácido nucleico de acordo com o presente invento. SEQ ID No. 2: Apresenta a sequência de aminoácidos correspondente à molécula de ácido nucleico de SEQ ID No. 1.

Exemplo 1 Produção de estirpes de BCG Hly deficientes em urease e ensaios num modelo de ratinho 1. Inactivação de actividade de urease de BCG delta ureC.

De modo a melhorar a capacidade protectora de uma estirpe de BCG contendo a proteína Hly (rBCG-Hly), eliminou-se a actividade de urease. 12 ΕΡ 1 618 128/ΡΤ

Para obter um mutante deficiente em urease, Reyrat et al. construiram um vector suicida contendo um gene ureC com ruptura por um marcador de canamicina (o gene aph) .

Linearizaram-se dois microgramas desta construção com Sac I e electroporaram-se para M. bovis BCG. Rastrearam-se os produtos de transformação resistentes a canamicina para fenótipo negativo a urease (cf. Reyrat et al., 1995). 2. Construção do vector de expressão de vaivém de E. coli micobacteriano pMV306:Hly.

Para transferir a função de fuga fagossómica (mediada por Hly de L. monocytogenes EGD Sv l/2a) , para BCG Pasteur (1173 P3) delta ureC, utilizou-se um vector de vaivém E. coli-micobacteriano. 0 plasmideo de integração pMV306, um precursor do vector pMV361, permite expressão cromossómica estável de Hly.

Inseriu-se um fragmento de ADN PstI de 1,7 kb derivado de pILH-1 que codifica um ORF de hly-hlyA (hemolisina A especifica de pHlyl52 de E. coli) no local PstI do plasmideo pAT261. Este gene de fusão resultante codifica a expressão de proteínas excretadas dirigidas ao sobrenadante pelo péptido de sinal Ag85B especifico de BCG. A construção foi denominada pAT261:Hly e utilizou-se subsequentemente a sua cassete de expressão de ADN Xbal-Sall sob controlo de transcrição do promotor micobacteriano hsp60 para inserção no vector pMV306 parental, resultando na construção pMV306:Hly. Analisou-se a sequência de ADN dos locais de inserção específicos de hly em ambos os plasmídeos de expressão micobacteriana. A proteína de fusão Hly madura consiste supostamente de 30 aa no terminal N e 52 aa na parte do terminal C da fusão que pertencia parcialmente a HlyA de E. coli. 3. Capacidade protectora no modelo de ratinho O vector de expressão pMV306:Hly foi transformado para uma estirpe de BCG pasteur deficiente em urease (BCG P ureC). A estirpe resultante foi denominada rBCG ureC Hly. Apresenta-se na figura 1 a capacidade protectora desta estirpe micobacteriana deficiente em urease comparativamente a BCG Pasteur parental e BCG Pasteur ureC num modelo de tuberculose murina. Surpreendentemente, verificou-se que rBCG ureC Hly 13 ΕΡ 1 618 128/ΡΤ induziu protecção melhorada já em pontos temporais precoces (dia 30 após provocação) que durou todo o periodo de observação (até ao dia 90).

Efectuou-se uma experiência de protecção a longo prazo adicional com rBCG ureC Hly. Vacinaram-se i.v. ratinhos BALB/c com rBCG ureC Hly, rBCG-Hly ou BCG parental e provocaram-se com aerossol no dia 120 após injecção com M. tuberculosis H37Rv. RBCG-Hly e BCG parental induziram protecção comparável contra M. tuberculosis H37Rv no dia 90. Vincadamente em contraste, a rBCG ureC Hly induziu protecção melhorada logo em pontos temporais precoces, desde o dia 30 após provocação. Além disso, esta protecção melhorada durou o periodo completo de observação e revelou uma redução da carga de M. tuberculosis H37Rv no pulmão no dia 90 após provocação superior a 2 unidades logarítmicas de UFC comparativamente a ratinhos naive e superior a 1 unidade logarítmica de UFC comparativamente a ratinhos vacinados com BCG parental.

Obtiveram-se resultados semelhantes após provocação com o isolado clinico de M. tuberculosis Beijing. Imunizaram-se i.v. ratinhos BALB/c com rBCG ureC Hly, BCG-Hly ou BCG parental e provocaram-se com aerossol ao dia 120 após injecção com M. tuberculosis Beijing. A vacinação com BCG ureC Hly induziu uma protecção melhorada contra M. tuberculosis Beijing já em pontos temporais precoces (dia 30) e que durou todo o periodo de observação até ao dia 90 após provocação. Comparativamente a vacinação com BCG parental, a vacinação com rBCG ureC Hly levou a uma redução no pulmão de 1 unidade logarítmica de UFC de M. tuberculosis Beijing.

Exemplo 2 Protecção a longo prazo contra M. tuberculosis H37Rv em porquinhos-da-índia

Dado que os ratinhos são relativamente resistentes a infecção por M. tuberculosis, utilizaram-se porquinhos-da-índia como um modelo animal mais susceptível para ensaiar a capacidade de vacinação de rBCG ureC Hly. Imunizaram-se subcutaneamente porquinhos-da-índia com a estirpe de vacina micobacteriana respectiva, rBCG ureC Hly ou BCG parental, e monitorizou-se o ganho de peso, bem como as UFC após provocação com aerossol com M. tuberculosis H37Rv. Os porquinhos-da-índia imunizados com rBCG ureC Hly apresentaram 14 ΕΡ 1 618 128/ΡΤ um aumento de peso semelhante aos animais vacinados com a estirpe de BCG parental até ao dia 120, enquanto os animais não vacinados sofreram claramente de TB, tal como indicado pela falha em aumentar de peso corporal. O exame visual dos pulmões e baços antes da análise de UFC detectou tubérculos na superfície de ambos os órgãos, mas os dos porquinhos-da-índia imunizados com BCG eram muito maiores e mais numerosos do que os de animais vacinados com BCG ureC Hly.

Exemplo 3 Avaliação de segurança de BCG ureC Hly

Infectaram-se ratinhos Ragl-/- deficientes em células T e células B com 106 microrganismos da estirpe de BCG parental (wt) ou com a estirpe rBCG ureC Hly. A presença de microrganismos nos pulmões e baço foi monitorizada.

Verificaram-se UFC significativamente reduzidas de rBCG ureC Hly no pulmão (figura 2a). No baço, verificaram-se UFC ligeiramente reduzidas após infecção com rBCG ureC Hly comparativamente a infecção com BCG parental (figura 2b).

Adicionalmente, a segurança de BCG ureC Hly foi ensaiada em ratinhos SCID imunodeficientes.

Para este objectivo, inocularam-se intravenosamente ratinhos SCID com 107-108 microrganismos de rBCG ureC Hly ou a estirpe BCG parental. Enquanto os ratinhos SCID inoculados com a estirpe parental morreram até ao dia 25 após injecção, os ratinhos inoculados com rBCG ureC Hly sobreviveram até ao dia 150 após injecção (figura 3).

Estas experiências demonstraram que BCG ureC Hly tem uma segurança maior comparativamente à estirpe de BCG parental.

Referências

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LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL: (i) REQUERENTE: (A) NOME: Max-Planck-Gesellschaft zur Foerderung der

Wissenschaften e:V. (B) RUA: Hofgartenstrasse 2 (C) CIDADE: Muenchen (E) PAÍS: Alemanha (F) CÓDIGO POSTAL (ZIP) : 80539 (ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: Vacina da tuberculose (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 2 (iv) FORMATO LEGÍVEL EM COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: Disquete

(B) COMPUTADOR: compatível com PC IBM

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Version #1.30 (EPO) (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1881 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: ambos (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1..1878 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 1: ATG ACA GAC GTG AGC CGA AAG ATT CGA GCT TGG GGA CGC CGA TTG ATG 4 8

Met Thr Asp Vai Ser Arg Lys Ile Arg Ala Trp Gly Arg Arg Leu Met 15 10 15 ATC GGC ACG GCA GCG GCT GTA GTC CTT CCG GGC CTG GTG GGG CTT GCC 96

Ile Gly Thr Ala Ala Ala Vai Vai Leu Pro Gly Leu Vai Gly Leu Ala 20 25 30 GGC GGA GCG GCA ACC GCG GGC GCG TTC TCC CGG CCG GGG CTG CCG GTC 144

Gly Gly Ala Ala Thr Ala Gly Ala Phe Ser Arg Pro.Gly Leu Pro Vai 35 '40 45 GAG TAC CTG CAG TCT GCA AAG CAA TCC GCT GCA AAT AAA TTG CAC TCA 192

Glu Tyr Leu Gin.Ser A.la Lys Gin Ser Ala Ala Asn Lys Leu Hie Ser 50 55 60 GCA GGA CAA AGC ACG AAA GAT GCA TCT GCA TTC AAT AAA GAA AAT TCA 240

Ala Gly Gin Ser Thr Lys Asp Ala Ser Ala Phe Asn Lys Glu Asn Ser 65 70 75 80 ATT TCA TCC ATG GCA CCA CCA GCA TCT CCG CCT GCA AGT CCT AAG ACG Ile Ser Ser Met Ala Pro Pro Ala Ser Pro Pro Ala Ser Pro Lys Thr 85 90 95 288 336 23 336 23 GAA ATC GAT AAG TAT ATA CAA GGA Glu Ile Asp Lys Tyr Ile Gin Gly 105 110 TTA GTA TAC CAC GGA GAT GCA GTG Leu Vai Tyr His Gly Asp Ala Vai 125 TAC AAA GAT GGA AAT GAA TAT A*JT Tvr Lys Asp Gly Asn Giu Tyr Ile 140 ATC AAT CAA AAT AAT GCA GAC ATT Ile Asn Gin Asn Asn Ala Asp Ile 155 160 CTA ACC TAT CCA GGT GCT CTC GTA Leu Thr Tvr Pro Gly Ala Leu Vai 170 * 175 AAT CAA CCA GAT GTT CTC CCT GTA Asn Gin Pro Asp Vai Leu Pro Vai 165 . 190 ATT GAT TTG CCA GGT ATG ACT AAT Ile Asp Leu Pro Gly Met Thr Asn 205 AAT GCC ACT AAA TCA AAC GTT AAC Asn Ala Thr Lys Ser Asn Vai Asn 220 AGA TGG AAT GAA AAA TAT GCT CAA Arg Tro Asn Glu Lys Tyr Ala Gin 235 240 ATT GAT TAT GAT GAC GAA ATG GCT Ile Asp Tyr Asp Asp Glu Met Ala 250 255 AAA TTT GGT ACA GCA TTT AAA GCT Lys Phe GÍy Thr Ala Phe Lys Ala 265 270 TTC GGC GCA ATC AGT GAA GGG AAA Phe Gly Ala Ile Ser Glu Gly Lys 285 AAA CAA ATT TAC TAT AAC GTG AAT Lys Gin Ile Tyr Tyr Asn Vai Asn 300 AGA TTT TTC GGC AAA GCT GTT ACT Arg Phe Phe Gly Lys Ala Vai Thr 315 320 GTG AAT GCA GAA AAT CCT CCT GCA Vai Asn Ala Glu Asn Pro Pro Ala 330 335 CGT CAA GTT TAT TTG AAA TTA TCA Arg Gin Vai Tyr Leu Lys Leu Ser 345 350 AAA GCT GCT TTT GAT GCT GCC GTA Lys Ala Ala Phe Asp Ala Ala Vai 365 GTA GAA CTA ACA AAT ATC ATC AAA Vai Glu Leu Thr Asn Ile Ile Lys 360 ΕΡ 1 618 128/ΡΤ CCA ATC GAA AAG AAA CAC GCG GAT Pro Ile Glu Lys Lys His Ala Asp 100 TTG GAT TAC AAT AAA AAC AAT GTA Leu Asp Tyr Asn Lys Asn Αεη Vai 115 120 ACA AAT GTG CCG CCA AGA AAA GGT Thr Asn vai Pro Pro Arg L»ys Gly 130 135 GTT GTG GAG AAA AAG AAG AAA TCC Vai Vai Glu Lys Lys Lvs Lys Ser 145 150 CAA GTT GTG AAT GCA ATT TCG AGC Gin Vai Vai Asn Ala Ile Ser Ser 165 AAA GCG AAT TCG GAA TTA GTA GAA Lys Ala Asn Ser Glu Leu Vai Glu 1Θ0 AAA CGT GAT TCA TTA ACA CTC AGC Lys Arg Asp Ser Leu Thr Leu Ser 195 200 CAA GAC AAT AAA ATC GTT GTA AAA Gin Asd Asn Lys 'Ile Vai Vai Lys 210 215 .. AAC GCA GTA AAT ACA TTA GTG GAA Asn Ala Vsl Asn Thr Leu Vai Glu 225 230 GCT ΤΑΓ CCA AAT GTA AGT GCA AAA Ala Tyr Pro Asn Vai Ser Ala Lys 245 TAC AGT GAA TCA CAA TTA ATT GCG Tyr Ser Glu Ser Gin Leu Ile Ala 260 GTA AAT AAT AGC TTG AAT GTA AAC Vai Asn Asn Ser Leu Asn Vai Αεη 275 280 ATG CAA GAA GAA GTC ATT AGT ITT Met Gin Glu Glu Vai Ile Ser Phe 290 295 GTT AAT GAA CCT ACA AGA CCT TCC Vai Asn Glu Pro Thr Arg Pro Ser 305 310 AAA GAG CAG TTG CAA GCG CTT GGA Lys Glu Gin Leu Gin Ala Leu Gly 325 TAT ATC TCA AGT GTG GCG TAT GGC Tyr Ile Ser Ser Vai Ala Tyr Gly 340 ACT AAT TCC CAT AGT ACT AAA GTA Thr Asn Ser His Ser Thr Lys Vai 355 360 AGC GGA AAA TCT GTC TCA GGT GAT Ser Gly Lys Ser Vai Ser Gly Asp 370 375 384 432 480 528 576 624 672 720 768 816 864 912 960 1008 1056 1104 1152 1200 24 1200 24 TAC GGA GGT TCC GCA AAA GAT GAA Tyr Gly Gly Ser Ala Lys Asp Glu 395 ‘ 400 GGA GAC TTA CGC GAT ATT TTG AAA Glv Asp Leu Arg Asp Ile Leu Lys 410 415 ACA CCA GGA GTT CCC ATT GCT TAT Thr Pro Gly Vai Pro Ile Ala Tyr 425 430 GAA TTA GCT GTT ATT AAA AAC AAC Glu Leu Ala Vai Ile Lys Asn Asn 445 AAA GCT TAT ACA GAT GGA AAA ATT Lys Ala Tyr Thr Asp Gly Lys Ile 460 GTT GCT CAA TTC AAC ATT TCT TGG Vai Ala Gin Phe Asn Ile Ser Tm 475 400 GGT AAC GAA ATT GTT' CAA CAT AAA Gly Asn Glu Ile Vai Gin His Lys 490 495 AAG CTA GCT CAT TTC ACA TCG TCC Lys Leu Ala His Phe Thr Ser Ser 505 510 AAT ATT AAT GTT TAC GCT AAA GAA Asn Ile Asn Vai Tyr Ala Lys Glu 525 TGG AGA ACG GTA ATT GAT GAC CGG Trp Arg Thr Vai Ile Asp Asp Arg 540 AAT ATC TCC ATC TGG GGC ACC ACG Asn Ile Ser Ile Trp Gly Thr Thr 555 560 GTA GAT AAT CCA ATC GAA TAT GCA Vai Asp Asn Pro Ile Glu Tyr Ala 570 575 CTT AAT CCA TTA ATT AAT GAA ATC Leu Asn Pro Leu Ile Asn Glu Ile 585 590 CTT TCC TCT TTA ACA TCG AAG CTA Leu Ser Ser Leu Thr Ser Lys Leu 605 TCC GGA ATT CGA AGC TTA TCG ATG Ser Gly lie Arg Ser Leu Ser Met 620 ΕΡ 1 618 128/ΡΤ AAT TCT TCC TTC AAA GCC GTA ATT Asn Ser Ser Phe Lys Ala Vai Ile 385 390 GTT CAA ATC ATC GAC GGC AAC CTC Vai Glr. Ile Ile Asp Gly Asn Leu 405 AAA GGC GCT ACT TTT AAT CGA GAA Lys Gly Ala Thr Phe Asn Arg Glu 420 ACA ACA AAC TTC CTA AAA GAC AAT Thr Thr Asn Phe Leu Lys Asp Asn 435 440 TCA GAA TAT ATT GAA ACA ACT TCA Ser Glu Tyr Ile Glu Thr Thr Ser 450 455 AAC ATC GAT CAC TCT GGA GGA TAC Asn Ile Asp His Ser Gly Gly Tyr 465 470 GAT GAA GTA AAT TAT GAT CCT GAA Asp Glu Vai Asn Tyr Asp. Pro Glu 465 AAC TGG AGC GAA AAC AAT AAA AGC Asn Trp Ser Glu Asn Asn Lys Ser 500 ATC TAT TTG CCA GGT AAC GCG AGA Ile Tyr Leu Pro Gly Asn Ala Arg 515 520

TGC ACT GGT TTA GCT TGG GAA TGG

Cys Thr Gly Leu Ala Ttd Glu Trp 530 ' 535

AAC TTA CCA CTT GTG AAA AAT AGA

Asn Leu Pro Leu Vai Lys Asn Arg 545 550

CTT TAT CCG ΛΛΛ TAT AGT AAT AAA

Leu Tyr Pro Lys Tyr Ser Asn Lys 5 65 TTA GCC TAT GGA AGT CAG GGT GAT Leu Ala Tyr Gly ser Gin Gly Asp 560 AGC AAA ATC ATT TCA GCT GCA GTT Ser Lys Ile Ile Ser Ala Ala Vai 595 500 CCT GCA GAG TTC GTT AGG CGC GGA Pro Ala Glu Phe Vai Arg Arg Gly 610 615 TCG ACG TAG Ser Thr 625 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 626 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína 1248 129S 1344 1392 1440 14ΘΘ 1536 1584 1532 1680 1728 1776 1824 1872 1881 25 ΕΡ 1 618 128/ΡΤ (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 2:

Met 1 Thr Asp Vai Ser Arg 5 Lys Ile Arg Ala 10 Trp Gly Arg Arg Leu 15 Met Ile Gly Thr Ala 20 Ala Ala Val Val Leu 25 Pro Gly Leu Val Glv 30 Lgu Ala Gly Gly Ala 35 Ala Thr Ala Gly Ala 40 Phe Ser Arg Pro Gly 45 Leu Pro Val Glu Tyr 50 Leu Gin Ser Ala Lys 55 Gin Ser Ala Ala Asn 60 Lys Leu His Ser Ala 65 Gly Gin -Ser Thr Lys 70 Asp Ala Ser Ala Phe Asn 75 Lys Glu Asn Ser 80 r .. . 1 85 90 95 Pro Ile Glu Lys 100 Lys His Ala Asp Glu 105 Ile Asp Lys Tyr Ile 110 Gin Gly Leu Asp Tyr Asn 115 Lys Asn Asn Val 120 Leu Val Tyr His Gly Asp 125 Ala Val Thr Asn 130 Vai Pro Pro Arg Lys 135 Gly Tyr Lys Asp Gly Asn 140 Glu Tyr Ile Vai 145 Vai Glu Lys Lys Lys 150 Lys ser ile Asn Gin Asn 155 Asn Ala Asp Ile 160 Gin Vai Vai Asn Ala Ile Ser Ser Leu Thr Tyr Pro Gly Ala Leu Val 165 170 175

Lye Ala Asn Ser Glu Leu Vai Glu Asn Gin Pro Asp Vai Leu Pro Vai 180 185 190

Lys Arg Asp Ser Leu Thr Leu Ser IIe Asp Leu Pro Gly Met Thr Asn 195 200 205

Gin Asp Asn Lys Ile Vai Vai Lys Asn Ala Thr Lys Ser Asn Vai Asn 210 215 · 220

Asn Ala Vai Asn Thr Leu Vai Glu Arg Trp Asn Glu Lye Tyr Ala Gin 225 230 235 240

Ala Tyr Pro Asn vál Ser Ala Lys Ile Asp Tyr Asp Asp Glu Met Ala 245 250 255

Tyr Ser Glu Ser Gin Leu Ile Ala Lys Phe Gly Thr Ala Phe Lys Ala 260 265 270

Vai Asn Asn Ser Leu Asn Vai Asn Phe Gly Ala Ile Ser Glu Gly Lys 275 280 285

Met Gin Glu Glu Vai Ile Ser Phe Lys Gin Ile Tyr Tyr Asn Vai Asn 290 295 300

Vai Asn Glu Pro Thr Arg Pro Ser Arg Phe Phe Gly Lys Ala Vai Thr 305 310 .-:==¾- 315 320

Lys Glu Gin Leu Gin Ala Leu Gly Vai Asn Ala Glu Asn Pro Pro Ala 325 330 335 26 26 Arg Gin Vai Tyr Leu Lys Leu Ser 345 350 Lys Ala Ala Phe Asp Ala Ala Vai 365 Vai Glu Leu Thr Asn Ile Ile Lys 380 Tyr Gly Gly ser Ala Lys Asp Glu 395 400 Gly Asp Leu Arg Asp Ile Leu Lys 410 415 Thr Pro Gly Vai Pro Ile A.la Tyr 425 430 Glu Leu Ala Vai Ile Lys Asn Asn 445 Lys Ala Tyr Thr Asp Glv Lys Ile 460 Vai Ala Gin Phe Asn Ile Ser Trp 475 480 Gly Asn Glu Ile Vai Gin His Lys 490 495 Lys Leu Ala His Phe Thr Ser Ser 505 ' 510 Asn Ile Asn Vai Tyr Ala Lys Glu 525 Trp Arg Thr Vai Ile Asp Asp Arg 540 Asn Ile Ser Ile Trp Gly Thr Thr 555 560 Vai Asp Asn Pro Ile Glu Tyr Ala 570 575 Leu Asn Pro Leu Ile Asn Glu Ile 585 590 Leu Ser Ser Leu Thr Ser Lys Leu 605 Ser Gly Ile Arg Ser Leu Ser Met 620 ΕΡ 1 618 128/ΡΤ

Tyr Ile Ser Ser Vai Ala Tyr Gly 340

Thr Asn Ser His Ser Thr Lys Vai 355 360

Ser Gly Lys Ser Vai Ser Gly Asp 370 375

Asn Ser Ser Phe Lys Ala Vai Ile 365 390

Vai Gin Ile Ile Asp Gly Asn Leu 405

Lys Gly Ala Thr Phe Asn Arg Glu 420

Thr Thr Asn Phe Leu Lys Asp Asn 435 440

Ser Glu Tyr Ile Glu Thr Thr Ser 450 455

Asn Ile Asp His Ser Gly Gly Tyr 465 470

Asp Glu Vai Asn Tyr Asp Pro Glu 485

Asn Trp Ser Glu Asn Asn Lys Ser 500

Ile Tyr Leu Pro Gly Asn Ala Arg 515 520

Cys Thr Gly Leu Ala Trp Glu Trp 530 535

Asn Leu Pro Leu Vai Lys Asn Arg 545 550

Leu Tyr Pro Lys Tyr Ser Asn Lys 565

Leu Ala Tyr Gly Ser Gin Gly Asp 580

Ser Lys ile Ile Ser Ala Ala Vai 595 600

Pro Ala Glu Phe Vai Arg Arg Gly 610 615

Ser Thr 625

Lisboa, 2010-10-06

Claims (36)

1. ΕΡ 1 618 128/ΡΤ 1/5 REIVINDICAÇÕES 1. Célula de Mycobacterium que é deficiente em urease e que compreende uma molécula de ácido nucleico recombinante que codifica um polipéptido de fusão compreendendo (a) pelo menos um domínio de um polipéptido, em que o referido domínio de polipéptido é capaz de desencadear uma resposta imunitária num mamífero e (b) um domínio de fuga fagolisossómica.
2. 2. Célula da reivindicação 1, em que pelo menos uma sequência de ácido nucleico que codifica uma subunidade de urease celular está inactivada.
3. 3. Célula da reivindicação 2, em que pelo menos a sequência que codifica a subunidade C de urease celular está inactivada.
4. 4. Célula da reivindicação 1, em que o referido domínio de fuga fagolisossómica é um domínio de fuga fagolisossómica de Listeria.
5. 5. Célula da reivindicação 1, em que o referido domínio fagolisossómico é codificado por uma molécula de ácido nucleico seleccionada de: (a) uma sequência de nucleótidos compreendendo os nucleótidos 211-1722, tal como apresentados em SEQ ID No. 1, (b) uma sequência de nucleótidos que codifica a mesma sequência de aminoácidos que a sequência de (a), e (c) uma sequência de nucleótidos que híbrida em condições rigorosas com a sequência de (a) ou (b).
6. 6. Célula da reivindicação 1, em que o domínio capaz de desencadear uma resposta imunitária é um péptido ou um polipéptido capaz de desencadear respostas de células T CD8 restritas ao MHC de classe I.
7. 7. Célula da reivindicação 1, em que o domínio capaz de desencadear uma resposta imunitária é de um polipéptido de Mycobacterium. ΕΡ 1 618 128/ΡΤ 2/5
8. 8. Célula da reivindicação 7, em que o domínio capaz de desencadear uma resposta imunitária é seleccionado dos antigénios de Mycobacterium Ag85B (M. tuberculosis), Ag85B (M. bovis) , Ag85A (M. tuberculosis) e ESAT-6 (M. tuberculosis) ou um seu fragmento imunogénico.
9. 9. Célula da reivindicação 8, em que o domínio capaz de desencadear uma resposta imunitária é o antigénio Ag85B ou um seu fragmento imunogénico.
10. 10. Célula da reivindicação 1, em que o polipéptido de fusão é precedido por uma sequência de péptido de sinal.
11. 11. Célula da reivindicação 1, em que um ligante peptídico está localizado entre o domínio que desencadeia a resposta imunitária e o domínio fagolisossómico.
12. 12. Célula da reivindicação 1, em que a referida molécula de ácido nucleico está ligada operativamente a uma sequência de controlo da expressão.
13. 13. Célula da reivindicação 12, em que a referida sequência de controlo da expressão é activa na referida célula.
14. 14. Célula da reivindicação 1, em que a referida molécula de ácido nucleico está localizada num vector.
15. 15. Célula da reivindicação 1, que é uma célula de Mycobacterium bovis.
16. 16. Célula de Mycobacterium que é deficiente em urease e que compreende pelo menos uma molécula de ácido nucleico recombinante que codifica um péptido ou polipéptido de fuga fagolisossómica.
17. 17. Célula da reivindicação 16, que compreende pelo menos uma molécula de ácido nucleico recombinante adicional que codifica um péptido ou polipéptido capaz de desencadear uma resposta imunitária num mamífero. ΕΡ 1 618 128/ΡΤ 3/5
18. 18. Célula da reivindicação 16 que é uma célula de Mycobacterium bovis.
19. 19. Célula das reivindicações 1 ou 17, em que o domínio, ou péptido ou polipéptido capaz de desencadear uma resposta imunitária é seleccionado de auto-antigénios, antigénios de tumores, antigénios de vírus, antigénios de parasitas, antigénios bacterianos e seus fragmentos imunogénicos.
20. 20. Célula das reivindicações 1 ou 16, que é capaz de expressar a referida pelo menos uma molécula de ácido nucleico recombinante.
21. 21. Célula da reivindicação 20, que é capaz de excretar um polipéptido codificado pela referida pelo menos uma molécula de ácido nucleico.
22. 22. Célula das reivindicações 1 ou 21, que tem uma persistência intracelular em macrófagos infectados que é igual ou menor do que a persistência intracelular de uma célula de Mycobacterium nativa.
23. 23. Composição farmacêutica compreendendo como um agente activo uma célula das reivindicações 1 ou 16, opcionalmente em conjunto com diluentes, transportadores e adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis.
24. 24. Composição da reivindicação 23, que é uma vacina viva adequada para administração a uma superfície mucosa ou através da via parentérica.
25. 25. Método para a preparação de uma vacina viva compreendendo a formulação de uma célula das reivindicações 1 ou 16 numa quantidade farmaceuticamente eficaz com diluentes, transportadores e adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis.
26. 26. Método para preparar a célula de Mycobacterium da reivindicação 1 compreendendo as etapas de: (i) proporcionar uma célula bacteriana deficiente em urease; (ii) inserir uma molécula de ácido nucleico recombinante na referida célula bacteriana, em que a referida molécula de ácido nucleico codifica um polipéptido de fusão ΕΡ 1 618 128/ΡΤ 4/5 compreendendo (a) pelo menos um domínio de um polipéptido, em que o referido domínio é capaz de desencadear uma resposta imunitária num mamífero e (b) um domínio de fuga fagolisossómica e (iii) cultivar a célula obtida de acordo com (ii) em condições adequadas.
27. 27. Método da reivindicação 26, em que a referida célula é uma célula de M. bovis.
28. 28. Método para preparar a célula de Mycobacterium da reivindicação 16 compreendendo as etapas de: (i) proporcionar uma célula bacteriana deficiente em urease; (ii) inserir uma molécula de ácido nucleico recombinante na referida célula bacteriana, em que a referida molécula de ácido nucleico codifica um péptido ou polipéptido de fuga fagolisossómica e (iii) cultivar a célula obtida de acordo com (ii) em condições adequadas.
29. 29. Método da reivindicação 28 compreendendo a inserção de pelo menos uma molécula de ácido nucleico recombinante adicional na célula bacteriana, em que a referida molécula de ácido nucleico recombinante adicional codifica um péptido ou polipéptido capaz de desencadear uma resposta imunitária num mamífero.
30. 30. Método da reivindicação 26 ou 28, em que o domínio ou péptido ou polipéptido capaz de desencadear uma resposta imunitária é seleccionado de auto-antigénios, antigénios de tumores, antigénios de vírus, antigénios de parasitas, antigénios bacterianos e seus fragmentos imunogénicos.
31. 31. Utilização de uma célula bacteriana de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-22 para o fabrico de uma vacina viva.
32. 32. Utilização da reivindicação 31 para o fabrico de uma vacina para indivíduos imunodeficientes. ΕΡ 1 618 128/ΡΤ 5/5
33. 33. Utilização da reivindicação 32 para o fabrico de uma vacina para indivíduos que sofrem de uma infecção por VIH.
34. 34. Utilização da reivindicação 31 para o fabrico de uma vacina tumoral.
35. 35. Utilização da reivindicação 34 para o fabrico de uma vacina contra cancro da bexiga superficial.
36. 36. Utilização da reivindicação 31 para o fabrico de uma vacina no campo veterinário. Lisboa, 2010-10-06