ES2344698T3

ES2344698T3 - Vacuna contra la tuberculosis con eficacia mejorada.

Info

Publication number: ES2344698T3
Application number: ES04729090T
Authority: ES
Inventors: Leander Grode; Stefan H. E. Kaufmann; Barbel Raupach; Jurgen Hess
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 2003-04-23
Filing date: 2004-04-23
Publication date: 2010-09-03
Anticipated expiration: 2024-04-23
Also published as: RU2342400C2; DE602004028000D1; CA2523084C; ATE473238T1; ZA200508276B; WO2004094469A1; AU2004232485A1; KR20050114281A; JP4662925B2; US20120027794A1; US20070134267A1; BRPI0409789A; US7988980B2; BRPI0409789B1; SI1618128T1; RU2005136354A; CU23608A3; CA2523084A1; MXPA05011360A; UA91180C2

Abstract

Una célula Mycobacterium que es deficiente en ureasa y que comprende una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica un polipéptido de fusión que comprende (a) al menos un dominio de un polipéptido, en donde dicho dominio de polipéptido es capaz de suscitar una respuesta inmunitaria en un mamífero, y (b) un dominio de escape fagolisosómico.

Description

Vacuna contra la tuberculosis con eficacia mejorada.

La presente invención se refiere a nuevas vacunas recombinantes que proporcionan inmunidad protectora especialmente contra la tuberculosis.

La tuberculosis (TB) causada por Mycobacterium tuberculosis sigue siendo un problema global importante. Se estima que un tercio de la población mundial está infectada con M. tuberculosis (Kochi, 1991). En muchos países, la única medida para control de la TB ha sido la vacunación con el bacilo Calmette-Guérin (BCG) de M. bovis. La eficacia global de la vacuna BCG contra TB, sin embargo, es aproximadamente 50% con variaciones extremas que van desde 0% a 80% entre diferentes pruebas en campo (Roche et al., 1995). Así pues, BCG debería mejorarse, v.g. por ingeniería genética, para proporcionar una vacuna para mejor control de la TB (Murray et al., 1996; Hess y Kaufmann, 1993). La aparición extendida de cepas de M. tuberculosis con resistencia múltiple a los fármacos pone de manifiesto adicionalmente la necesidad urgente de nuevas vacunas TB (Grange, 1996).

M. tuberculosis pertenece al grupo de bacterias intracelulares que se replican en el interior de las vacuolas fagosómicas de los macrófagos en reposo, por lo que la protección contra TB depende de la inmunidad mediada por las células T (Kaufmann, 1993). Varios estudios en ratones y humanos, sin embargo, han demostrado que las Micobacterias estimulan las células T CD4 y CD8 restringidas por el complejo de histocompatibilidad mayor (MHC) clase II o clase I, respectivamente (Kaufmann, 1993).

El papel importante de las células T CD8 restringidas por el MHC clase I se demostró convincentemente por el fallo de ratones deficientes en microglobulina \beta2 (\beta2m) para controlar la infección experimental de M. tuberculosis (Flynn et al., 1993). Debido a que estos ratones mutantes carecen del MHC clase I, no pueden desarrollarse células T CD8 funcionales. En contraste con la infección de M. tuberculosis, los ratones deficientes en \beta2m son capaces de controlar ciertas dosis infecciosas de la cepa de la vacuna BCG (Flynn et al., 1993; Ladel et al., 1995). Adicionalmente, la vacunación con BCG de ratones deficientes en \beta2m prolongaba la supervivencia después de la infección subsiguiente de M. tuberculosis, mientras que los C57BL/6 inmunizados con BCG resistían la TB (Flynn et al., 1993). Esta dependencia diferencial de las células T CD8 entre M. tuberculosis y BCG puede explicarse como sigue: los antígenos de M. tuberculosis logran mejor acceso al citoplasma que los antígenos de BCG, conduciendo a una presentación más pronunciada del MHC clase I (Hess y Kaufmann, 1993). Por consiguiente, una respuesta de las células T CD8 más eficaz es generada por M. tuberculosis. Esta noción se vio respaldada recientemente por la presentación de MHC clase I incrementada de un antígeno irrelevante, ovoalbúmina, por infección simultánea con M. tuberculosis, en lugar de BCG, de células presentadoras de antígeno (APC) (Mazzaccaro et al., 1996).

Las proteínas secretadas de M. tuberculosis comprenden una fuente valiosa de antígenos para la presentación de MHC clase I. Recientemente, una vacuna de DNA que codificaba el antígeno secretado Ag85A provocaba respuestas de células T CD8 restringidas por el MHC clase I en los ratones, lo que puede contribuir a la defensa contra TB (Huygen et al., 1996). En general, se están acumulando pruebas de que la inmunización con antígenos proteínicos secretados de M. tuberculosis induce cierta protección contra TB en cobayos y ratones (Horwitz et al., 1995; Andersen, 1994). Una meta importante hacia el desarrollo de vacunas TB mejoradas basadas en BCG, por consiguiente, consiste en aumentar la accesibilidad de los antígenos específicos de BCG secretados al citoplasma de las APC infectadas. El suministro subsiguiente de péptidos derivados de estas proteínas secretadas en el camino de presentación del MHC clase I puede potenciar la respuesta inmunitaria específica de BCG ya existente para prevención de la TB.

El escape fagolisosómico de L. monocytogenes representa un mecanismo singular para facilitar la presentación antigénica al MHC clase I de antígenos de listeria (Berche et al., 1987; Portnoy et al., 1988). La listeriolisina (Hly), una citolisina formadora de poros activada por sulfhidrilo, es esencial para la liberación de los microorganismos L. monocytogenes por las vacuolas fagolisosómicas en el citosol de las células hospedadoras (Gaillard et al., 1987; Portnoy et al., 1988). Esta función de escape fue transferida recientemente a Bacillus subtilis y a cepas atenuadas de Salmonella ssp. (Bielecki et al., 1991; Gentschev et al., 1995; Hess y Kaufmann, 1997). La expresión de Hly por una cepa mutante asporogénica de B. subtilis o en Salmonella ssp. da como resultado el escape de bacterias del fagolisosoma al citosol de las células J774 semejantes a macrófagos (Bielecki et al., 1991; Gentschev et al., 1995; Hess y Kaufmann, 1997).

WO 99/101496 y Hess et al (1998) describen cepas recombinantes de Mycobacterium bovis que secretan proteínas de fusión de listeriolisina biológicamente activas. Se ha demostrado que estas cepas de M. bovis son vacunas eficaces contra TB en varios modelos animales.

De acuerdo con la presente invención, se expresó Hly en cepas BCG deficientes en ureasa. Estas cepas BCG deficientes en ureasa exhiben una actividad incrementada de Hly en fagosomas y aumentaban a su vez la formación de poros en las membranas endosómicas, conduciendo a inmunoprotectividad superior. Adicionalmente, las cepas BCG-Hly deficientes en ureasa están implicadas en procesos apoptóticos, lo que puede contribuir a una protección inmunológica mejorada. Así, las cepas BCG deficientes de ureasa tienen una capacidad como vacuna mejorada aún más. Además, se encontró sorprendentemente que las cepas BCG deficientes de ureasa exhiben un perfil de seguridad incrementado comparado con las cepas BCG parentales y por consiguiente son particularmente adecuadas para la vacunación de pacientes inmunodeficientes.

Un primer aspecto de la presente invención es una célula de Mycobacterium que es eficiente en ureasa y comprende una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica un polipéptido de fusión que comprende (a) al menos un dominio de un polipéptido, en donde dicho dominio de polipéptido es capaz de suscitar una respuesta inmunitaria en un mamífero, y (b) un dominio de escape fagolisosómico. Se prefiere que la célula sea capaz de expresar la molécula de ácido nucleico de la invención. Más preferiblemente, la célula es capaz de secretar el polipéptido de fusión y/o de proporcionar el mismo en una forma adecuada para el reconocimiento de antígenos restringidos por el MHC clase I.

La célula bacteriana de la invención es una célula de Mycobacterium. La deficiencia en ureasa puede conseguirse desactivando parcial o completamente una o varias moléculas celulares de ácido nucleico que codifican una subunidad ureasa, particularmente ureA codificante de la subunidad A de ureasa, ureB codificante de la subunidad B de ureasa y/o ureC codificante de la subunidad C de ureasa. Las secuencias de ureA, ureB y ureC en Micobacterias, particularmente en M. bovis y M. tuberculosis y las proteínas codificadas por las mismas han sido descritas por Reyrat et al., (1995) y Clemens et al., (1995).

Preferiblemente, la cepa Mycobacterium deficiente en ureasa se obtiene por deleciones y/o inserciones de uno o varios nucleótidos en secuencias de ácido nucleico codificantes de subunidades de ureasa y/o sus secuencias de control de la expresión. Las deleciones y/o inserciones pueden generarse por recombinación homóloga, inserción de transposones u otros métodos adecuados.

En una realización especialmente preferida, la secuencia ureC se desactiva, v.g. por construcción de un vector suicida que contiene un gen de ureC interrumpido por un gen marcador de selección, transformación de las células diana con el vector y cribado para selección de células positivas del marcador que tienen un fenotipo de ureasa negativo como se describe por Reyrat et al., (1995).

La célula de la invención es preferiblemente una célula de M. bovis, una célula de M. tuberculosis, particularmente una célula atenuada de M. tuberculosis u otras Micobacterias, v.g. M. microti, M. smegmatis, M. canettii, M. marinum o M. fortuitum o Micobacterias como las descritas por Reyrat et al., (1995).

La célula de Mycobacterium de la invención comprende una molécula de ácido nucleico recombinante, v.g. la molécula de ácido nucleico en SEQ ID No. 1. Esta molécula de ácido nucleico comprende una secuencia codificante del péptido señal (nucleótido 1-120), una secuencia codificante de un dominio inmunógeno (nucleótidos 121-153), una secuencia codificante de enlazador peptídico (nucleótidos 154-210), una secuencia codificante de un dominio fagolisosómico (nucleótidos 211-1722), una secuencia codificante de enlazador peptídico adicional (nucleótidos 1723-1800) y una secuencia codificante de un péptido aleatorio (nucleótidos 1801-1870). La secuencia de aminoácidos correspondiente se muestra en SEQ ID No. 2.

El ácido nucleico contiene al menos un dominio inmunógeno de un polipéptido. El dominio inmunógeno puede derivarse de un organismo del género Mycobacterium, preferiblemente de Mycobacterium tuberculosis o de Mycobacterium bovis. Este dominio tiene una longitud de al menos 6, preferiblemente de al menos 8 aminoácidos. El dominio inmunógeno es preferiblemente una porción de un polipéptido nativo de Mycobacterium. Sin embargo, dentro del alcance de la presente invención se encuentra también un dominio inmunógeno modificado, que se deriva de un dominio inmunógeno nativo por sustitución, deleción y/o adición de uno o varios aminoácidos.

Sin embargo, el dominio inmunógeno no está restringido a antígenos de Mycobacterium, y puede seleccionarse de autoantígenos, antígenos tumorales y antígenos patógenos tales como antígenos virales, antígenos parasitarios, antígenos bacterianos en general y fragmentos inmunógenos de los mismos. Ejemplos específicos de antígenos tumorales adecuados son antígenos tumorales humanos tales como el producto del gen supresor de tumores p53 (Houbiers et al., 1993) y antígenos de diferenciación de melanocitos, v.g. MelanA/MART-1 y gp100 (van Elsas et al., 1996). Ejemplos específicos para antígenos virales adecuados son los antígenos virales tumorales humanos tales como los antígenos del virus del papiloma humano, v.g. los antígenos E6 y E7 (Bosch et al., 1991), antígenos del virus de la gripe, v.g. la nucleoproteína del virus de la gripe (Matsui et al., 1995; Fu et al., 1997) o antígenos retrovirales tales como antígenos del HIV, v.g. los antígenos de HIV-1 p17, p24, RT y Env (Harrer et al., 1996; Haas et al., 1996). Ejemplos específicos de antígenos parasitarios adecuados son antígenos de Plasmodium tales como al antígeno de la etapa hepática (LSA-1), la proteína de los circumsporozoítos (CS o las variantes alélicas cp26 o cp29), la proteína anónima afín a la trombospondina (TRAP), la treonina de los esporozoítos y la proteína rica en asparagina (STARP) de Plasmodium falciparum (Aidoo et al., 1995) y antígenos de Toxoplasma tales como p30 de Toxoplasma gondii (Khan et al., 1991; Bulow y Boothroyd, 1991). Ejemplos específicos de antígenos bacterianos adecuados son antígenos de Legionella tales como la proteína Major secretory de Legionella pneumophila (Blander y Howitz, 1991).

El dominio inmunógeno es capaz de suscitar una respuesta inmune en un mamífero. Esta respuesta inmune puede ser una respuesta inmune mediada por las células B. Preferiblemente, sin embargo, el dominio inmunógeno es capaz de suscitar una respuesta inmune mediada por las células T, más preferiblemente una respuesta de las células T CD8 restringidas por el MHC clase I.

El dominio capaz de suscitar una respuesta inmune se selecciona más preferiblemente de péptidos o polipéptidos inmunógenos de M. bovis o M. tuberculosis, o de fragmentos inmunógenos de los mismos. Ejemplos específicos para antígenos adecuados son Ag85B (p30) de M. tuberculosis (Harth et al., 1996), Ag85B (antígeno \alpha) de M. bovis BCG (Matsuo et al., 1988), Ag85A de M. tuberculosis (Huygen et al., 1996) y ESAT-6 de M. tuberculosis (Sorensen et al., 1996, Harboe et al., 1996 y Andersen et al., 1995). Más preferiblemente, el dominio inmunógeno se deriva del antígeno Ag85B. Muy preferiblemente el dominio inmunógeno comprende la secuencia desde aa.41 a aa.51 en SEQ ID No. 2.

La molécula de ácido nucleico recombinante de acuerdo con la presente invención comprende adicionalmente un dominio de escape fagolisosómico, es decir un dominio polipeptídico que proporciona un escapa del polipéptido de fusión del fagolisosoma al citosol de las células de mamífero. Preferiblemente, el dominio del escape fagolisosómico es un dominio de escape fagolisosómico de Listeria, que se describe en US 5.773.151. Más preferiblemente, el dominio de escape fagolisosómico se deriva del organismo L. monocytogenes. Muy preferiblemente, el dominio fagolisosómico está codificado por una molécula de ácido nucleico seleccionada de: (a) una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 211-1722 como se muestra en SEQ ID No. 1, (b) una secuencia de nucleótidos que codifica la misma secuencia de aminoácidos que la secuencia de (a), y (c) una secuencia de nucleótidos que se hibrida en condiciones severas con la secuencia de (a) o (b).

Aparte de la secuencia nucleotídica representada en SEQ ID No. 1, la presente invención comprende también secuencias de ácido nucleico que se hibridan con ella. En la presente invención, el término "hibridación" se utiliza como se define en Sambrook et al., (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), 1.101-1.104). De acuerdo con la presente invención, el término "hibridación" se utiliza si puede observar todavía una señal de hibridación positiva después de lavado durante una hora con 1 X SSC y 0,1% SDS a 55ºC, preferiblemente a 62ºC y más preferiblemente a 68ºC, en particular durante una hora en 0,2 X SSC y 0,1% SDS a 55ºC, preferiblemente a 62ºC y más preferiblemente a 68ºC. Una secuencia que se hibrida con una secuencia de nucleótidos de acuerdo con SEQ ID No. 1 en tales condiciones de lavado es una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio de escape fagolisosómico preferida por la presente invención.

Una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio de escape fagolisosómico como se describe arriba puede obtenerse directamente de un organismo Listeria o de cualquier fuente recombinante, v.g. una célula recombinante de E. coli que contiene la molécula de ácido nucleico de Listeria correspondiente o una variante de la misma como se ha descrito arriba.

Preferiblemente, la molécula de ácido nucleico recombinante que codifica un polipéptido de fusión contiene una secuencia que codifica un péptido señal. Más preferiblemente, la secuencia señal es un secuencia señal activa en Micobacterias, preferiblemente en M. bovis, v.g. una secuencia señal de M. bovis nativa. Un ejemplo preferido de una secuencia señal adecuada es la secuencia de nucleótidos que codifica el péptido señal Ag85B que se representa en SEQ ID No. 1 desde el nucleótido 1 al 120.

Adicionalmente, se prefiere que esté provisto un enlazador peptídico entre el dominio inmunógeno y el dominio de escape fagolisosómico. Preferiblemente, dicho enlazador peptídico tiene una longitud de 5 a 50 aminoácidos. Más preferiblemente, una secuencia que codifica un enlazador como se muestra en SEQ ID No. 1 desde el nucleótidos 154 al 210 o una secuencia correspondiente a la misma en lo que respecta a la degeneración del código genético.

El ácido nucleico puede estar localizado en un vector recombinante. Preferiblemente, el vector recombinante es un vector procariota, es decir un vector que contiene elementos para replicación y/o integración genómica en células procariotas. Preferiblemente, el vector recombinante lleva la molécula de ácido nucleico de la presente invención enlazada operativamente con una secuencia de control de la expresión. La secuencia de control de la expresión es preferiblemente una secuencia de control de la expresión activa en Micobacterias, particularmente en M. bovis. El vector puede ser un vector extracromosómico o un vector adecuado para integración en el cromosoma. Ejemplos de tales vectores son conocidos por los expertos en la técnica y se dan, por ejemplo, en Sambrook et al. supra.

En un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona una célula de Mycobacterium, preferiblemente una célula de M. bovis, que comprende al menos una molécula de ácido nucleico que codifica un péptido o polipéptido de escape fagolisosómico. Aun cuando el péptido o polipéptido de escape fagolisosómico no esté fusionado con un antígeno, se encuentra una mejora sorprendente de las propiedades inmunógenas.

La célula Mycobacterium recombinante que se proporciona de acuerdo con este aspecto adicional de la presente invención puede contener al menos un recombinante adicional, v.g. una molécula de ácido nucleico heteróloga que codifica un péptido o polipéptido capaz de suscitar una respuesta inmunitaria en un mamífero. Dicho péptido o polipéptido inmunógeno adicional puede seleccionarse de antígenos de Mycobacterium o, en un sentido más amplio, de autoantígenos, antígenos tumorales, antígenos patógenos y fragmentos inmunógenos de los mismos. La molécula de ácido nucleico que codifica el péptido o polipéptido adicional puede estar situada en el mismo vector que el gen de fusión. No obstante, la misma puede situarse también, por ejemplo, en un plásmido diferente, con independencia del gen de fusión, o estar integrada cromosómicamente.

Sorprendentemente, se ha encontrado que una célula de Mycobacterium de acuerdo con la presente invención tiene una persistencia intracelular en células infectadas, v.g. macrófagos, que es igual o menor que la persistencia intracelular de una célula nativa de Mycobacterium correspondiente que no contiene la molécula de ácido nucleico recombinante.

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La presente invención se refiere también a una composición farmacéutica que comprende como agente activo una célula como se ha definido arriba, opcionalmente junto con diluyentes, vehículos y adyuvantes farmacéuticamente aceptables. Preferiblemente, la composición es una vacuna viva adecuada para administración a un mamífero, preferiblemente un humano. La ruta de vacunación seleccionada realmente depende de la elección del vector de vacunación. La administración puede realizarse en una sola dosis o repetirse a intervalos. La dosis apropiada depende de diversos parámetros tales el vector vacunal propiamente dicho o la ruta de administración. Podría seleccionarse la administración a una superficie mucosal (v.g. ocular, intranasal, oral, gástrica, intestinal, rectal, vaginal o del tracto urinario) o por la ruta parenteral (v.g. subcutánea, intradérmica, intramuscular, intravenosa o intraperitoneal).

Adicionalmente, la presente invención se refiere a un método para preparar una célula Mycobacterium recombinante como se ha definido arriba. De acuerdo con el primer aspecto, este método comprende los pasos de (i) proporcionar una célula bacteriana deficiente en ureasa, particularmente una célula de Mycobacterium, (ii) insertar una molécula de ácido nucleico recombinante en dicha célula bacteriana, codificando dicha molécula de ácido nucleico un polipéptido de fusión que comprende (a) al menos un dominio de un polipéptido en donde dicho dominio es capaz de suscitar una respuesta inmunitaria en un mamífero y (b) un dominio de escape fagolisosómico, y (iii) cultivar la célula obtenida de acuerdo con el paso (ii) en condiciones adecuadas. Preferiblemente, se obtiene una célula que es capaz de expresar dicha molécula de ácido nucleico. Más preferiblemente, la célula es una célula de M. bovis.

De acuerdo con el aspecto adicional, este método comprende el paso de (i) proporcionar una célula bacteriana deficiente en ureasa, particularmente una célula de Mycobacterium, (ii) insertar una molécula de ácido nucleico recombinante en dicha célula bacteriana, codificando dicha molécula de ácido nucleico un péptido o polipéptido de escape fagolisosómico, y (iii) cultivar la célula obtenida de acuerdo con (ii) en condiciones adecuadas.

Si se desea, el método de la presente invención comprende insertar al menos una molécula de ácido nucleico recombinante adicional en la célula bacteriana, codificando dicha molécula de ácido nucleico recombinante adicional un péptido o polipéptido capaz de suscitar una respuesta inmunitaria en un mamífero.

Por último, la presente invención se refiere a un método para la preparación de una vacuna viva que comprende formular la célula recombinante en una cantidad farmacéuticamente eficaz con diluyentes, vehículos y/o adyuvantes farmacéuticamente aceptables.

Debido a la alta seguridad de las células bacterianas deficientes en ureasa, que se demostró en dos modelos animales diferentes (Ejemplo 3), la vacuna viva de la presente invención es particularmente adecuada para administración a individuos inmunodeficientes, v.g. individuos que padecen una infección de HIV o individuos que están siendo tratados con fármacos inmunosupresores. En una realización especialmente preferida, la vacuna viva de la presente invención se utiliza como vacuna contra la tuberculosis para individuos inmunodeficientes.

En una realización preferida adicional, la vacuna viva se utiliza como vacuna tumoral, v.g. como una vacuna contra el cáncer superficial de vejiga. En una realización preferida adicional de la invención, la vacuna viva se utiliza en el campo veterinario, v.g. como vacuna contra la listeriosis, paratuberculosis o tuberculosis bovina.

La invención se ilustrará adicionalmente por las figuras y listados de secuencia siguientes.

Fig. 1: muestra la capacidad protectora de rBCG ureC Hly en el modelo de aerosol de tuberculosis murina. Se inmunizaron ratones BALB/c por vía i.v. con 1x10^{6} unidades formadoras de colonias de rBCG ureC Hly, BCG P ureC o BCG "Pasteur" nativo. 120 días después de la vacunación, se expusieron los animales con H37Rv (200 organismos/pulmón) al aerosol. La carga bacteriana en los órganos infectados (bazo y pulmón) se evaluó 30, 60 y 90 días después de la exposición. Cada barra representa 10 animales.

Fig. 2: muestra la cantidad de microorganismos en el pulmón (Fig. 2a) o en el bazo (Fig. 2b). Se infectaron ratones Rag1-/- con la cepa BCG parental (wt) o la cepa rBCG ureC Hly (urea-Hly). La carga bacteriana del órgano infectado se evaluó 30, 60 y 90 días después de la infección.

Fig. 3: muestra la tasa de supervivencia de ratones SCID infectados con BCG "Pasteur" y rBCG delta ureC Hly.

SEQ ID No. 1:: muestra la secuencia de nucleótidos de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención.

SEQ ID No. 2:: muestra la secuencia de aminoácidos correspondiente de la molécula de ácido nucleico de SEQ ID No. 1.

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Ejemplo 1 Producción de cepas BCG Hly deficientes en ureasa y tests en un modelo de ratón 1. Desactivación de la actividad de ureasa de BCG delta ureC

Con objeto de mejorar la capacidad protectora de una cepa BCG que contenía la proteína Hly (rBCG-Hly), se delecionó la actividad de ureasa.

Para obtener un mutante deficiente en ureasa, Reyrat et al construyeron un vector suicida que contenía un gen de ureC interrumpido por un marcador kanamicina (el gen aph). Se linealizaron dos microgramos de este constructo con Sac I y se sometieron a electroporación en BCG de M. bovis. Los transformantes resistentes a kanamicina se cribaron respecto al fenotipo de ureasa negativo (véase Reyrat et al., 1995).

2. Construcción del vector de expresión lanzadera Micobacteriano de M. coli pMV306:Hly

Para transferir la función de escape fagosómica (mediada por Hly de L. monocytogenes EGD Sv 1/2a), a BCG Pasteur (1173 P_{3}) delta ureC, se utilizó un vector lanzadera E. coli-micobacteriano. El plásmido de integración pMV306, un precursor del vector pMV361, permite la expresión cromosómica estable de Hly.

Un fragmento de DNA Pst I de 1,7 kb derivado de pILH-1 que codificaba un ORF hly-hlyA (hemolisina A específica de E. coli pHly152) se insertó en el sitio PstI del plásmido pAT261. Esta fusión de genes resultante codifica la expresión de proteínas secretadas dirigidas al sobrenadante por el péptido señal Ag85B específico de BCG. El constructo se denominó pAT261:Hly y su casete de expresión de DNA XbaI-SalI bajo control de transcripción del promotor micobacteriano hsp60 se utilizó subsiguientemente para inserción en el vector parental pMV306 dando como resultado el constructo pMV306:Hly. Se analizó la secuencia de DNA de los sitios de inserción específicos de hly en ambos plásmidos de expresión micobacterianos. La proteína de fusión Hly madura consiste supuestamente en 30 aa en el término N y 52 aa en la parte terminal C de la fusión que pertenecen parcialmente a HlyA de E. coli.

3. Capacidad protectora en el modelo de ratón

El vector de expresión pMV306:Hly se transformó en una cepa Pasteur de BCG deficiente en ureasa (BCG ureC). La cepa resultante se designó rBCG ureC Hly. La capacidad protectora de esta cepa micobacteriana deficiente en ureasa comparada con la BCG Pasteur parental y BCG Pasteur ureC en un modelo de tuberculosis murina se representan en la Figura 1. Sorprendentemente, se encontró que rBCG ureC Hly inducía protección mejorada ya en momentos precoces (día 30 p.c.) que duraba durante el periodo de observación completo (hasta el día 90).

Se realizó un experimento adicional de protección a largo plazo con rBCG ureC Hly. Se vacunaron por vía i.v. ratones BALB/c con rBCG ureC Hly, rBCG-Hly o BCG parental y se expusieron a un aerosol el día 120 p.i. con M. tuberculosis H37Rv. rBCG-Hly y BCG parental inducían protección comparable contra M. tuberculosis H37Rv llegado el día 90. En contraste acusado, la rBCG ureC Hly inducía protección mejorada ya en momentos precoces comenzando el día 30 p.c. Adicionalmente, esta protección mejorada duraba durante todo el periodo de observación y revelaba una reducción de la carga de M. tuberculosis H37Rv en el pulmón desde el día 90 p.c. de más de 2 log CFU comparada con los ratones naíf, y mayor que 1 log CFU comparada con los ratones vacunados con BCG parental.

Se obtuvieron resultados similares después de la exposición al aislado clínico de M. tuberculosis Beijing. Se inmunizaron por vía i.v. ratones BALB/c con rBCG ureC Hly, BCG-Hly o BCG parental y se expusieron por aerosol el día 120 p.i. con M. tuberculosis Beijing. La vacunación con BCG ureC Hly inducía una protección mejorada contra M. tuberculosis Beijing ya en momentos precoces (día 30) y duraba durante todo el periodo de observación hasta el día 90 p.c. Comparada con la vacunación con BCG parental, la vacunación con rBCG ureC Hly conducía a una reducción en el pulmón de 1 log CFU de M. tuberculosis Beijing.

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Ejemplo 2 Protección a largo plazo contra M. tuberculosis H37Rv en los cobayos

Dado que los ratones son relativamente resistentes a la infección por M. tuberculosis se utilizaron cobayos como un modelo animal más susceptible para testar la capacidad de vacunación de rBCG ureC Hly. Se inmunizaron por vía subcutánea cobayos con la cepa de la vacuna micobacteriana respectiva, rBCG ureC Hly o BCG parental, y se monitorizó el aumento de peso así como las CFU después de la exposición al aerosol con M. tuberculosis H37Rv. Los cobayos inmunizados con rBCG ureC Hly exhibían un aumento de peso similar al de los animales vacunados con la BCG parental hasta el día 120, mientras que los animales no vacunados padecían claramente TB como se indicaba por el fallo en el aumento de peso corporal.

El examen visual del pulmón y el bazo antes de los análisis CFU demostró que los tubérculos en la superficie de ambos órganos de los cobayos inmunizados con BCG eran mucho mayores y más numerosos que los de los animales vacunados con BCG ureC Hly.

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Ejemplo 3 Evaluación de la seguridad de BCG ureC Hly

Se infectaron ratones Rag1-/- deficientes en células T y B con 10^{6} microorganismos de la cepa BCG parental (wt) o la cepa rBCG ureC Hly. Se monitorizó la presencia de microorganismos en pulmón y bazo. Se observaron CFU's significativamente reducidas de rBCG ureC Hly en el pulmón (Fig. 2a). En el bazo, se observaron CFU's ligeramente reducidas después de infección con rBCG ureC Hly comparadas con la infección con BCG parental (Fig. 2b).

Adicionalmente, la seguridad de BCG ureC Hly se testó en ratones SCID inmunodeficientes. Para este propósito, se inocularon ratones SCID por vía intravenosa con 10^{7}-10^{8} microorganismos de rBCG ureC Hly o la cepa BCG parental. Mientras que los ratones SCID inoculados con la cepa parental morían hasta el día 25 p.i., los ratones inoculados con rBCG ureC Hly sobrevivieron hasta el día 150 p.i. (Fig. 3).

Estos experimentos demostraban que BCG ureC Hly tiene una mayor seguridad comparada con la cepa BCG parental.

Referencias

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(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i): SOLICITANTE:

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(A): NOMBRE: Max-Planck-Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften e:V.

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(B): CALLE: Hofgartenstrasse 2

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(C): CIUDAD: Münich

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(E): PAÍS: Alemania

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(F): CÓDIGO POSTAL (ZIP): 80539

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(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Vacuna contra la tuberculosis

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(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 2

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(iv): FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

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(A): TIPO DE MEDIO: Disco flexible

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(B): COMPUTADORA: IBM PC compatible

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(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS/DOS

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(D): SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Versión #1.30 (EPO)

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(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID No: 1:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 1881 pares de bases

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(B): TIPO: ácido nucleico

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(C): CLASE DE CADENA: ambas

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ix): CARACTERÍSTICAS:

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(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

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(B): LOCALIZACIÓN: 1..1878

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID No: 1:

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1

2

3

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(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID No: 2:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 626 aminoácidos

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(B): TIPO: aminoácido

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID No: 2:

4

5

Claims

1. Una célula Mycobacterium que es deficiente en ureasa y que comprende una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica un polipéptido de fusión que comprende (a) al menos un dominio de un polipéptido, en donde dicho dominio de polipéptido es capaz de suscitar una respuesta inmunitaria en un mamífero, y (b) un dominio de escape fagolisosómico.

2. La célula de la reivindicación 1, en donde al menos una subunidad de ureasa celular que codifica una secuencia de ácido nucleico está desactivada.

3. La célula de la reivindicación 2, en donde al menos la secuencia codificante de la subunidad C de ureasa celular está desactivada.

4. La célula de la reivindicación 1, en donde dicho dominio de escape fagolisosómico es un dominio de escape fagolisosómico de Listeria.

5. La célula de la reivindicación 1, en donde dicho dominio de escape fagolisosómico está codificado por una molécula de ácido nucleico seleccionada de:

(a): una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 211-1722 como se muestran en SEQ ID No: 1,

(b): una secuencia de nucleótidos que codifica la misma secuencia de aminoácidos que la secuencia de (a), y

(c): una secuencia de nucleótidos que se hibrida en condiciones severas con la secuencia de (a) o (b).

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6. La célula de la reivindicación 1, en donde el dominio capaz de suscitar una respuesta inmunitaria es un péptido o polipéptido capaz de suscitar respuestas de las células T CD8 restringidas por el MHC clase I.

7. La célula de la reivindicación 1, en donde el dominio capaz de suscitar una respuesta inmunitaria es un polipéptido de Mycobacterium.

8. La célula de la reivindicación 7, en donde el dominio capaz de suscitar una respuesta inmunitaria se selecciona de los antígenos de Mycobacterium Ag85B (M. tuberculosis), la Ag85B (M. bovis), Ag85A (M. tuberculosis) y ESAT-6 (M. tuberculosis) o un fragmento inmunógeno de los mismos.

9. La célula de la reivindicación 8, en donde el dominio capaz de suscitar una respuesta inmunitaria es el antígeno Ag85B o un fragmento inmunógeno del mismo.

10. La célula de la reivindicación 1, en donde el polipéptido de fusión está precedido por una secuencia de péptido señal.

11. La célula de la reivindicación 1, en donde está localizado un enlazador peptídico entre el dominio que suscita la respuesta inmunitaria y el dominio fagolisosómico.

12. La célula de la reivindicación 1, en donde dicha molécula de ácido nucleico está enlazada operativamente con una secuencia de control de la expresión.

13. La célula de la reivindicación 12, en donde dicha secuencia de control de la expresión es activa en dicha célula.

14. La célula de la reivindicación 1, en donde dicha molécula de ácido nucleico está localizada en un vector.

15. La célula de la reivindicación 1, que es una célula de Mycobacterium bovis.

16. Una célula de Mycobacterium que es deficiente en ureasa y que comprende al menos una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica un péptido o polipéptido de escape fagolisosómico.

17. La célula de la reivindicación 16, que comprende al menos una molécula de ácido nucleico recombinante adicional que codifica un péptido o polipéptido capaz de suscitar una respuesta inmunitaria en un mamífero.

18. La célula de la reivindicación 16, que es una célula de Mycobacterium bovis.

19. La célula de las reivindicaciones 1 ó 17, en donde el dominio de péptido o polipéptido capaz de suscitar una respuesta inmunitaria se selecciona de autoantígenos, antígenos tumorales, antígenos virales, antígenos parasitarios, antígenos bacterianos y fragmentos inmunógenos de los mismos.

20. La célula de las reivindicaciones 1 ó 16, que es capaz de expresar dicha al menos una molécula de ácido nucleico recombinante.

21. La célula de la reivindicación 20, que es capaz de secretar un polipéptido codificado por dicha al menos una molécula de ácido nucleico.

22. La célula de las reivindicaciones 1 ó 21, que tiene una persistencia intracelular en macrófagos infectados que es igual o menor que la persistencia intracelular de una célula nativa de Mycobacterium.

23. Una composición farmacéutica que comprende como agente activo una célula de las reivindicaciones 1 ó 16, opcionalmente junto con diluyentes, vehículos y adyuvantes farmacéuticamente aceptables.

24. La composición de la reivindicación 23, que es una vacuna viva adecuada para administración a una superficie mucosal o por la ruta parenteral.

25. Un método para la preparación de una vacuna viva que comprende formular una célula de las reivindicaciones 1 ó 16 en una cantidad farmacéuticamente eficaz con diluyentes, vehículos y adyuvantes farmacéuticamente aceptables.

26. Un método para preparar la célula de Mycobacterium de la reivindicación 1, que comprende los pasos:

(i): proporcionar una célula bacteriana deficiente en ureasa;

(ii): insertar una molécula de ácido nucleico recombinante en dicha célula bacteriana, codificando dicha molécula de ácido nucleico un polipéptido de fusión que comprende (a) al menos un dominio de un polipéptido, en donde dicho dominio es capaz de suscitar una respuesta inmunitaria en un mamífero, y (b) un dominio de escape fagolisosómico, y

(iii): cultivar la célula obtenida de acuerdo con (ii) en condiciones adecuadas.

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27. El método de la reivindicación 26, en donde dicha célula es una célula de M. bovis.

28. Un método para preparar la célula de Mycobacterium de la reivindicación 16, que comprende los pasos de:

(i): proporcionar una célula bacteriana deficiente en ureasa;

(ii): insertar una molécula de ácido nucleico recombinante en dicha célula bacteriana, codificando dicha molécula de ácido nucleico un péptido o polipéptido de escape fagolisosómico y

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29. El método de la reivindicación 28 que comprende insertar al menos una molécula de ácido nucleico recombinante adicional en la célula bacteriana, codificando dicha molécula de ácido nucleico recombinante adicional un péptido o polipéptido capaz de suscitar una respuesta inmunitaria en un mamífero.

30. El método de la reivindicación 26 ó 28, en donde el dominio de péptido o polipéptido capaz de suscitar una respuesta inmunitaria se selecciona de autoantígenos, antígenos tumorales, antígenos virales, antígenos parasitarios, antígenos bacterianos y fragmentos inmunógenos de los mismos.

31. El uso de una célula bacteriana de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-22 para la fabricación de una vacuna viva.

32. El uso de la reivindicación 31 para la fabricación de una vacuna para individuos inmunodeficientes.

33. El uso de la reivindicación 32 para la fabricación de una vacuna para individuos que sufren una infección de HIV.

34. El uso de la reivindicación 31 para la fabricación de una vacuna contra tumores.

35. El uso de la reivindicación 34 para la fabricación de una vacuna contra el cáncer superficial de vejiga.

36. El uso de la reivindicación 31 para la fabricación de una vacuna en el campo veterinario.