BRPI0409789B1 - célula bacteriana, seus processos de preparação e seu uso, composição, e processo para a preparação de uma vacina viva - Google Patents

Abstract

"vacina de tuberculose com eficácia aperfeiçoada". a presente invenção refere-se a novas vacinas recombinantes provendo imunidade protetora contra tuberculose. ainda, a presente invenção refere-se a novas moléculas de ácido nucléico recombinante, vetores contendo as ditas moléculas de ácido nucléico, células transformadas com as ditas moléculas de ácido nucléico e polipeptídeos codificados pelas ditas moléculas de ácido nucléico.

Description

(54) Título: CÉLULA BACTERIANA, SEUS PROCESSOS DE PREPARAÇÃO E SEU USO, COMPOSIÇÃO, E PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE UMA VACINA VIVA (51) lnt.CI.: C07K 14/35; C07K 14/195 (30) Prioridade Unionista: 23/04/2003 US 60/464,644 (73) Titular(es): MAX-PLANCK-GESELLSCHAFT ZUR FOERDERUNG DER WISSENSCHAFTEN E.V.

(72) Inventor(es): LEANDER GRODE; STEFAN Η. E. KAUFMANN; BÃRBEL RAUPACH; JÜRGEN HESS (85) Data do Início da Fase Nacional: 24/10/2005

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para CÉLULA BACTERIANA, SEUS PROCESSOS DE PREPARAÇÃO E SEU USO, COMPOSIÇÃO, E PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE UMA VACINA VIVA

A presente invenção refere-se a novas vacinas recombinantes proporcionando imunidade protetora especialmente contra tuberculose.

Tuberculose (TB) causada por Mycobacterium tuberculosis permanece um significante problema global. É estimado que um terço da população mundial está infectada com M. tuberculosis (Kochi, 1991). Em muitos países a única medida para controle de TB tem sido vacinação com bacilo M. bovis Calmette10 Guérin (BCG). A eficácia de vacina total de BCG contra TB, entretanto, é cerca de 50% com extremas variações variando de 0% a 80% entre diferentes experimentos de campo (Roche et al., 1995). Assim, BCG deve ser aperfeiçoada, por exemplo, por engenharia genética para prover uma vacina para melhor controle de TB (Murray et al., 1996; Hess and Kaufmann, 1993). A emergência amplamente dis15 seminada de cepas de M. tuberculosis resistentes a múltiplas drogas adicionalmente acentua o urgente requisito por novas vacinas TB (Grange, 1996).

M. tuberculosis pertence ao grupo de bactérias intracelulares que replicam dentro de vacúolos fagossomais de macrófagos restantes, assim proteção contra TB depende de imunidade mediada por célula T (Kaufmann, 1993). Vários estudos em camundongos e seres humanos, entretanto, mostraram que Micobactéria estimula células T CD4 ou CD8 restritas classe II ou classe I de complexo de histocompatibilidade principal (MHC), específico antígeno, respectivamente (Kaufmann, 1993).

O importante papel de células T CD8 restritas classe I MHC foi convincentemente demonstrado pela falha de camundongos deficientes em p2-microglobulina (p2m) para controlar infecção de M.tuberculosis experimental (Flynn et al., 1993). Porque estes camundongos mutantes carecem de MHC classe I, células T CD8 funcionais não se desenvolvem. Em contraste com infecção de M. tuberculosis, camundongos deficientes - p2m são capazes de controlarem certas doses de infecção da cepa de vacina BCG (Flynn et al., 1993; Ladel et al., 1995). Além disso, vacinação BCG de camundongos deficientes p2m prolongou sobrevivência após subsequente inPetição 870180072341, de 17/08/2018, pág. 5/16 ί · • · ♦ ····· > · · · · * * • » · · · fecção com M.tuberculosis enquanto C57BL/6 (Flynn et al., 1993). Esta dependência de célula T CD8 diferencial entre M.tuberculosis e BCG pode ser explicada como se segue: antígenos de M.tuberculosis ganham melhor acesso ao citoplasma que antígenos de BCG conduzindo a mais pronunciada apresentação de MHC classe I (Hess and Kaufmann, 1993). Consequentemente, uma resposta de célula T CD8 mais efetiva é gerada por M. tuberculosis. Esta noção foi recentemente suportada por aumentada apresentação de MHC classe I de um antígeno irrelevante, ovalbumina, por infecção de M. tuberculosis simultânea, antes que BCG, de células apresentando antígeno (APC)(Mazzacaro et al., 1996).

Proteínas secretadas de M. tuberculosis compreendem uma valiosa fonte de antígenos para apresentação de MHC classe I. Recentemente, uma vacina DNA codificando o antígeno secretado Ag85A elicitou respostas de célula T CD8 restrita MHC classe I em camundongos que podem contribuir para defesa contra TB (Huygen et al., 1996). Em geral, evidência está acumulando-se de que imunização com antígenos de proteína secretada de M. tuberculosis induz alguma proteção contra TB em porquinhos da índia e camundongos (Horwitz et al., 1995; Andersen, 1994). Uma importante meta na direção de desenvolvimento de aperfeiçoadas vacinas TB baseadas em BCG, por isso, é aumentar a acessibilidade de antígenos específicos BCG secretados para o citoplasma de APC infectadas. Subseqüente liberação de peptídeos derivados destas proteínas secretadas no caminho de apresentação de MHC classe I pode potencializar a resposta imune específica-BCG já existente para prevenção de TB.

A fuga fagolisossomal de L. monocitogenes representa um mecanismo único para facilitar antígeno MHC classe I de antígenos listeriais (Berche et al., 1987; Portnoy et al., 1988). Listeriolisina (Hly), uma citolisina ativada com sulfidrila formadora de poro, é essencial para a liberação de microorganismos L. monocitogenes a partir de vacúolos fagolisossomais no citosol de células hospedeiras (Gaillard et al., 1987; Portnoy et al., 1988). Esta função de fuga foi recentemente transferida para Bacillus subtilis e para cepas de Salmonella ssp. Atenuadas (Bielecki et al., 1991; Gentschev et al., imunizado-BCG resistiu TB

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1995; Hess and Kaufmann, 1997). Expressão de Hly por uma cepa mutante de b. subtilis asporogênica ou em Salmonella ssp. Resulta em escape bacterial do fagolisossoma no citosol de células semelhantes a macrófago J774 (Bielecki et al., 1991; Gentschev et al., 1995; Hess and Kaufmann, 1997).

WO 99/101496 and Hess et al. (1998) mostram cepas de Mycobacterium bovis recombinants que secretam proteínas de fusão Listeriolisina biologicamente ativas. Estas cepas M. bovis foram mostradas serem efetivas vacinas contra TB em vários modelos animais.

De acordo com a presente invenção Hly foi expresso em cepas BCG deficientes - urease. Estas cepas BCG deficientes - urease exibem uma aumentada atividade Hly em fagossomas e por sua vez aperfeiçoada formação de poro nas membranas endossomais conduzindo a superior capacidade de proteção imune. Ainda, cepas BCG-Hly deficientes - urease estão envolvidas em processos apoptóticos que podem contribuir para uma aperfeiçoada proteção imune. Assim, as cepas BCG deficientes - urease têm ainda uma mesmo aperfeiçoada capacidade de vacina. Ainda, foi surpreendentemente verificado que cepas BCG deficientes - urease exibem um aumentado perfil de segurança comparadas a cepas parentes BCG e são assim particularmente apropriadas para a vacinação de pacientes imunodeficientes.

Um primeiro aspecto da presente invenção é uma célula bacterial, particularmente uma célula micobacterium que é deficiente em urease e compreende uma molécula de ácido nucléico recombinante codificando um polipeptíodeo de fusão compreendendo (a) pelo menos um domínio de um polipeptídeo, onde o dito domínio polipeptídeo é capaz de elicitar uma resposta imuno em um mamífero, e (b) um domínio escape fagolisossomal. É preferido que a célula seja capaz de expressar a molécula de ácido nucléico da invenção. Mais preferivelmente, a célula é capaz de secretar o polipeptídeo de fusão e/ou de prover o mesmo em uma forma apropriada para reconhecimento de antígeno restrito - MHC classe I.

A célula bacterial da invenção é uma célula deficiente de urease, por exemplo, uma célula bacterial gram - negativa ou gram - positiva, prefeβ • * · · • · · · · • · ··· · • ♦ · · • · ·*· • · · • · · · • ·· · • · * • ·· · • · • · · · · • · · • · ·· • · · • ·· rivelmente uma célula micobacterium. A deficiência de urease pode ser obtida inativando parcial ou completamente uma ou várias moléculas de ácido nucléico que codificam a subunidade urease, particularmente ureA codificando subunidade urease A, ureB codificando subunidade urease B e/ou ureC codificando subunidade urease C. As seqüências de ureA, ureB e ureC em micobactéria, particularmente M. bovia e M. tuberculosis e as proteínas codificadas pelas mesmas são descritas por Reyrat et al. (1995) e Clemens et al. (1995), que são aqui incorporadas por referência.

Preferivelmente a cepa bacterial deficiente em urease é obtida por supressões e/ou inserções de um ou vários nucleotídeos em subunidade urease - codificando seqüências de ácidos nucléicos e/ou suas seqüências de controle de expressão. Supressões e/ou inserções podem ser geradas através de recombinação homóloga, inserção de transposon ou outros processos apropriados.

Em uma realização especialmente preferida a seqüência ureC é inativada, por exemplo, através de construção de um vetor suicida contendo um gene ureC interrompido por um gene marcador de seleção, transformando a célula alvo com o vetor e selecionando para células positivas - marcador de seleção tendo um fenótipo negativo de urease como descrito por Reyrat et al. (1995).

A célula da invenção é preferivelmente uma célula M.bovis, uma célula M.tuberculosis, particularmente uma célula M.tuberculosis atenuada ou outra Micobactéria, por exemplo, M. microti, M. smegmatis, M. canetti, M. marinum ou M. fortuitum ou Micobactéria como descrita por Reyrat et al. (1995).

A célula Mycobacteríum da invenção compreende uma molécula de ácido nucléico recombinante, por exemplo, a molécula de ácido nucléico em SEQ ID NO. 1. Esta molécula de ácido nucléico compreende uma seqüência codificando peptídeo sinal (nucleotídeo 1-120), uma seqüência codificando um domínio imunogênico (nucleotídeo 121-153), uma sequência codificando ligador peptídeo (nucleotídeo 154-210), uma sequência codificando um domínio fagolisossomal (nucleotídeo 211-1722), ainda seqüência codifi5 • · · cando ligador peptídeo (nucleotídeo 1723-1800) e uma seqüência codificando um peptídeo randômico (nucleotídeo 1801-1870). A correspondente seqüência de aminoácidos é mostrada em SEQ ID NO: 2.

O ácido nucléico contém pelo menos um domínio imunogênico de um polipeptídeo. O domínio imunogênico pode ser derivado de um organismo do gênero Mycobacterium, preferivelmente de Mycobacterium tuberculosis ou de Mycobacterium bovis. Este domínio tem um comprimento de pelo menos 6, preferivelmente de pelo menos 8 aminoácidos. O domínio imunogênico é preferivelmente uma porção de um polipeptídeo de Myco10 bacterium nativo. Entretanto, dentro do escopo da presente invenção é também um domínio imunogênico modificado, que é derivado de um domínio imunogênico nativo através de substituição, supressão e/ou adição de um ou vários aminoácidos.

O domínio imunogênico não é entretanto restrito a antígenos

Mycobacterium e pode ser selecionado de autoantígenos, antígenos de tumor e antígenos patógenos tais como antígenos de vírus, antígenos de parasitas, antígenos bacteriais em geral e seus fragmentos imunogênicos. Específicos exemplos para apropriados antígenos de tumor são antígenos de tumor humano como o produto gene supressor de tumor p53 (Houbiers et al., 1993) e antígenos de diferenciação de melanócitos, por exemplo, MelanA/MART-1 e gp100 (van Elsas et al., 1996). Específicos exemplos para apropriados antígenos de vírus são antígenos de vírus de tumor humano como antígenos de vírus de papiloma humano, por exemplo, antígenos E6 e E7 (Bosch et al., 1991), antígenos de vírus influenza, por exemplo, nucleo25 proteína de vírus influenza (Matsui et al., 1995); Fu et al., 1997) ou antígenos retrovirais como antígenos de HIV, por exemplo, os antígenos de HIV-1 p17, p24, RT e Env (Harrer et al., 1996; Haas et al., 1996). Específicos exemplos para apropriados antígenos de parasitas são antígenos de Plasmodium tais como antígeno de estágio no fígado (LSA-1), proteína circumsporozóite (CS ou variantes alélicas cp26, ou cp29), proteína amonimosa relacionada a trombospondina (TRAP), treonina de esporozóite e proteína rica em asparagina (STARP) de Plasmodium falciparum (Aidoo et al., 1995) e antígenos de

Toxoplasma como p30 de Toxoplasma gondii (Khan et al. 1991; Bulow and Boothroyd, 1991). Exemplos específicos para apropriados antígenos bacteriais são antígenos de Legionella tais como proteína secretária Principal de Legionella pneumophila (Blander and Horwitz, 1991).

O domínio imunogênico é capaz de elicitar uma resposta imune em um mamífero. Esta resposta imune pode ser uma resposta imune mediada por célula B. Preferivelmente, entretanto, o domínio imunogênico é capaz de elicitar uma resposta imune mediada por célula T, mais preferivelmente uma resposta de célula T CD8 restrita - MHC classe I.

O domínio capaz de elicitar uma resposta imune é mais preferivelmente selecionado de peptídeos imunogênicos ou polipeptídeos de M.bovis ou M. tuberculosis ou de seus fragmentos imunogênicos. Específicos exemplos para antígenos apropriados são Ag85B (p30) de M. tuberculosis (Harthe et al., 1996), Ag85B (antígeno - alfa) de M. bovis BCG (Matsuo et al., 1988), Ag85A de M. tuberculosis (Huygen et al., 1996) e ESAT-6 de M. tuberculosis (Sorensen t al., 1996, Harboe et al., 1996 e Andersen et al., 1995). Mais preferivelmente, o domínio imunogênico é derivado do antígeno Ag85B. Mais preferivelmente, o domínio imunogênico compreende a seqüência de aa.41 a aa.51 em SEQ ID NO: 2.

A molécula de ácido nucléico recombinante de acordo com a presente invenção ainda compreende um domínio de escape fagolisossomal, isto é, um domínio polipeptídeo que provê um escape do polipeptídeo de fusão do fagolisossoma no citosol de células de mamíferos. Preferivelmente, o domínio de escape fagolisossomal é um domínio de escape fagolisossomal Listeria, que é descrito em US 5.733.151, aqui incorporada por referência. Mais preferivelmente, o domínio escape fagolisossomal é derivado do organismo L. monocitogenes. Mais preferivelmente, o domínio fagolisossomal é codificado por uma molécula de ácido nucléico selecionada de: (a) uma seqüência de nucleotídeos compreendendo nucleotídeos 211-1722 como mostrada em SEQ ID NO: 1, (b) uma seqüência de nucleotídeos que codifica a mesma seqüência de aminoácidos como a seqüência de (a), e (c) uma seqüência de nucleotídeos hibridizando sob condições rigorosas com a seqüência de (a) ou (b).

À parte da seqüência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 1 a presente invenção também compreende seqüências de ácidos nucléicos hibridizando com a mesma. Na presente invenção o termo hibridização é usado como definido em Sambrook et al. (Molecular Cloning. A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), 1.101-1.104). De acordo com a presente invenção o termo hibridização é usado se um sinal de hibridização positivo ainda puder ser observado após lavagem por uma hora com 1 X SSC e 0,1% SDS a 55°C, preferivelmente a 62°C e mais prefe10 rivelmente a 68°C, particularmente por 1 hora em 0,2 X SSC e 0,1% SDS a 55°C, preferivelmente a 62°C e mais preferivelmente a 68°C. Uma seqüência hibridizando com uma seqüência de nucleotídeos como per SEQ ID NO:1 sob tais condições de lavagem é uma seqüência de nucleotídeos codificando domínio de escape fagolisossomal preferida pela presente invenção.

Uma seqüência de nucleotídeos codificando um domínio escape fagolisossomal como descrito acima pode ser diretamente obtida de um organismo Listeria ou de qualquer fonte recombinante, por exemplo, uma célula de E.coli recombinante contendo a correspondente molécula de ácido nucléico de Listeria ou uma sua variante como descrito acima.

Preferivelmente, a molécula de ácido nucléico recombinante codificando um polipeptídeo de fusão contém uma seqüência codificando peptídeo sinal. Mais preferivelmente, a seqüência sinal é uma seqüência sinal ativa em Micobactérias, preferivelmente em M.bovls, por exemplo, uma seqüência sinal de M.bovis nativa. Um exemplo preferido de uma seqüência sinal apropriada é a seqüência de nucleotídeos codificando o peptídeo sinal Ag85B que é mostrada em SEQ ID NO:1 a partir de nucleotídeo 1 a 120.

Ainda, é preferido que um ligante peptídeo seja provido entre o domínio imunogênico e o domínio de escape fagolisossomal. Preferivelmente, o dito ligante de peptídeo tem um comprimento de 5 a 50 aminoáci30 dos. Mais preferivelmente, uma seqüência codificando um ligante como mostrado em SEQ ID NO: 1 a partir de nucleotídeo 154 a 210 ou uma seqüência correspondendo à mesma com relação à degeneração do código

4» · · genético.

O ácido nucléico pode estar localizado sobre um vetor recombinante. Preferivelmente, o vetor recombinante é um vetor procariótico, isto é, um vetor contendo elementos para replicação e/ou integração genômica em células procarióticas. Preferivelmente, o vetor recombinante transporta a molécula de ácido nucléico da presente invenção ligada operativamente com uma seqüência de controle de expressão. A seqüência de controle de expressão é preferivelmente uma seqüência de controle de expressão ativa em Mycobacteria, particularmente M.bovis. O vetor pode ser um vetor extracromossomal ou um vetor apropriado para integração no cromossoma. Exemplos de tais vetores são conhecidos por aqueles versados na técnica e, por exemplo, dados em Sambrook et al., supra.

Ainda em um aspecto da presente invenção uma célula bacterial deficiente em urease, por exemplo, uma célula Mycobacteríum, preferivelmente uma célula M.bovis é provida que compreende pelo menos uma molécula de ácido nucléico codificando um peptídeo de escape fagolisossomal ou polipeptídeo. Mesmo se o peptídeo ou polipeptídeo de escape fagolisossomal não é fundido com um antígeno, um surpreendente aperfeiçoamento das propriedades imunogênicas é verificado.

A célula bacterial recombinante que é provida de acordo com ainda este aspecto da presente invenção pode conter pelo menos ainda uma molécula de ácido nucléico recombinante, por exemplo heteróloga, codificando um peptídeo ou polipeptídeo capaz de elicitar uma resposta em um mamífero. O ainda dito peptídeo ou polipeptídeo imunogênico pode ser selecionado de antígenos de Mycobacteríum ou, em um sentido mais amplo, de auto-antígenos, antígenos de tumor, antígenos de patógenos e seus fragmentos imunogênicos. A molécula de ácido nucléico codificando ainda o peptídeo ou polipeptídeo pode estar situada sobre o mesmo vetor como o gene de fusão. Entretanto, ela pode, por exemplo, também estar situada sobre um plasmídeo diferente, independentemente do gene de fusão, ou ser integrada cromossalmente.

Surpreendentemente, foi verificado que uma célula Mycobacte• · · rium de acordo com a presente invenção tem uma persistência intracelular em células infectadas, por exemplo, macrófagos, que é igual ou menos que a persistência intracelular de uma correspondente célula Mycobacterium nativa que não contem a molécula de ácido nucléico recombinante.

A presente invenção também refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo como um agente ativo uma célula como definida acima, opcionalmente junto com diluentes, veículos e adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis. Preferivelmente, a composição é uma vacina viva apropriada para administração a um mamífero, preferivelmente um humano. A rota de vacinação realmente escolhida depende da escolha do vetor de vacinação. Administração pode ser obtida em uma dose simples ou repetida em intervalos. A dosagem apropriada depende de vários parâmetros tais como o próprio vetor vacina ou a rota de administração. Administração a uma superfície de mucosa (por exemplo, ocular, intranasal, oral, gástrica, intestinal, retal, vaginal, ou trato urinário) ou via a rota parenteral (por exemplo, subcutânea, intradérmica, intramuscular, intravenosa ou intraperitoneal) pode ser escolhida.

Ainda, a presente invenção pertence a um processo para preparação de uma célula bacterial recombinante como definida acima. De acordo com o primeiro aspecto, este processo compreende as etapas de (i) provimento de uma célula bacterial deficiente de urease, particularmente uma célula Mycobacterium, (ii) inserção de uma molécula de ácido nucléico recombinante na dita célula bacterial, a dita molécula de ácido nucléico codificando um polipeptídeo de fusão compreendendo (a) pelo menos um domínio de um polipeptídeo onde o dito domínio é capaz de elicitar uma resposta imune em um mamífero e (b) um domínio escape fagolisossomal, e (iii) cultivo de célula obtida de acordo com a etapa (ii) sob condições apropriadas. Preferivelmente, uma célula é obtida a qual é capaz de expressar a dita molécula de ácido nucléico. Mais preferivelmente, a célula é uma célula de M.bovis.

Ainda de acordo com um aspecto, este processo compreende a etapa de (i) provimento de uma célula bacterial deficiente de urease, parti• · ία.

cularmente uma célula Mycobacterium, (ii) inserção de uma molécula de ácido nucléico recombinante na dita célula bacterial, a dita molécula de ácido nucléico recombinante codificando um peptídeo escape fagolisossomal ou polipeptídeo, e (iii) cultivo de célula obtida de acordo com (ii) sob condições apropriadas.

Se desejado, o processo da presente invenção compreende inserção de ainda pelo menos uma molécula de ácido nucléico recombinante na célula bacterial, a dita ainda molécula de ácido nucléico recombinante codificando um peptídeo ou polipeptídeo capaz de elicitar uma resposta imune em um mamífero.

Finalmente, a presente invenção refere-se a um processo para a preparação de uma vacina viva compreendendo formulação de uma célula recombinante em uma quantidade farmaceuticamente efetiva com diluentes, carreadores e/ou adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis.

Devido à alta segurança de células bacteriais deficiente de urease, o que foi demonstrado em dois diferentes modelos animais (Exemplo 3), a vacina viva da presente invenção é particularmente apropriada para administração a sujeitos imunodeficientes, por exemplo, sujeitos sofrendo de uma infecção de HIV ou sujeitos que são tratados com drogas imunossupressivas. Em uma realização especialmente preferida, a vacina viva da presente invenção é usada como uma vacina de tuberculose para sujeitos imunodeficientes.

Ainda em uma realização preferida, a vacina viva é usada como uma vacina de tumor, por exemplo, uma vacina contra câncer de bexiga superficial. Ainda em uma realização preferida da invenção, a vacina viva é usada no campo veterinário, por exemplo, como uma vacina contra listeriose, paratuberculose ou tuberculose bovina.

A invenção será ainda ilustrada pelas seguintes figuras e listagens de seqüências.

A figura 1 mostra a capacidade protetora de rBCG ureC Hly no modelo aerossol de tuberculose murina. Camundongos BALB/c foram imunizados i.v. com 1x10⁶ CFU rBCG ureC Hly, BCG ureC ou BCG nativa Pas-

1t.· teur. 120 dias após vacinação animais foram desafiados com H37Rv (200 organismo/pulmão) via aerossol. Carga bacterial em órgãos infectados (baço e pulmão) foi avaliada 30, 60 e 90 dias após desafio. Cada barra representa 10 animais.

A figura 2 mostra a quantidade de microorganismos no pulmão (figura 2a) ou no baço (figura 2b). camundongos Rag1-/- foram infectados com a cepa parente BCG (wt) ou a cepa rBCG ureC Hly (uréia-Hly). Carga bacterial do órgão infectado foi avaliada 30, 60 e 90 dias após infecção.

A Figura 3 mostra a taxa de sobrevivência de camundongos SCID infectados com BCG Pasteur e rBCG delta ureC Hly.

SEQ ID NO: 1 mostra a seqüência de nucleotídeos de uma molécula de ácido nucléico de acordo com a presente invenção.

SEQ ID NO: 2 mostra a correspondente seqüência de aminoácidos da molécula de ácido nucléico de SQ ID NO:1.

Exemplo 1 Produção de cepas BCG Hly deficientes de urease e testes em um modelo animal

1. Inativação da atividade urease de BCG delta ureC

De modo a aperfeiçoar a capacidade protetora de uma cepa BCG contendo a proteína Hly (rBCG-Hly), a atividade urease foi suprimida.

Para obter um mutante deficiente de urease, Reyrat et al. construíram um vetor suicida contendo um gene ureC interrompido por um marcador canamicina (o gene aph). Dois microgramas desta construção foram linarizados com Sac I e eletroporados em M. bovis BCG. Transformantes resistentes a canamicina foram selecionados para fenótipo negativo de urease (cf. Reyrat et al., 1995).

2. Construção do vetor de expressão de lançamento E.coli mycobacterial pMV306:Hly

Para transferir a função escape fagossomal (mediada por Hly de L. monocitogenes EGD Sv 1/2a), para BCG Pasteur (1173P₃) delta ureC, um vetor lançador mycobacterial-E.coli foi usado. O plasmídeo integrativo pMV306, um precursor de vetor pMV361, permite estável expressão cromossomal de Hly.

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Um fragmento de DNA Pstl 1,7 kb derivado-plLH-1 codificando

ORF hly-hlyA (hemolisina A específica-pHiyl 52 E.coli) foi inserido no sítio Pstl de plasmídeo pAT261. Esta resultante fusão de gene codifica a expressão de proteínas secretadas direcionadas para o sobrenadante através de peptídeo sinal Ag85B específico - BCG. A construção foi chamada pAT261:Hly e seu cassete de expressão de DNA Xbal-Sall sob controle transcricional do promotor micobacterial hsp60 foi subseqüentemente usado para inserção no vetor pMV306 parente resultando na construção pMV306:Hly. A seqüência de DNA dos sítios de inserção específicos-hly em ambos plasmídeos de expressão micobacterial foi analisada. A proteína de fusão Hly madura consiste putativamente em 30 aa no terminus N e 52 aa no terminal C parte da fusão que parcialmente pertence a HlyA de E.coli.

3. Capacidade protetora no modelo de camundongo

O vetor de expressão pMV306:Hly foi transformado em BCG cepa Pasteur deficiente de urease (BCG P ureC). A resultante cepa foi designada rBCG ureC Hly. A capacidade protetora desta cepa micobacterial deficiente de urease comparada a BCG Pasteur parente e BCG Pasteur ureC em um modelo de tuberculose murina é mostrada na figura 1. Surpreendentemente, foi verificado que rBCG ureC Hly induziu aperfeiçoada proteção já em pontos de tempo iniciais (dia 30 p.c.) que demoraram para o inteiro período de observação (até dia 90).

Ainda um experimento de proteção de longo termo com rBCG ureC Hly foi realizado. Camundongos BALB/c foram vacinados i.v. com rBCG ureC Hly, rBCG-Hly ou BCG parente e desafiados em aerossol no dia 120 p.i. com M. tuberculosis H37Rv. RBCG-Hly e BCG parente induziram comparável proteção contra M. tuberculosis H37Rv no dia 90. Em forte contraste, a rBCG ureC Hly induziu aperfeiçoada proteção já em pontos de tempos iniciais começando em dia 30 p.c. Além disso, esta proteção aperfeiçoada demorou para o inteiro período de observação e revelou uma redução de carga de M. tuberculosis H37Rv no pulmão no dia 90 p.c. de mais que 2 log CFU comparada a camundongos nativos, e de mais que 1 log CFU comparada a camundongos vacinados com BCG parenteral.

Resultados foram obtidos após desafio com o isolado clínico de M. tuberculosis Beijing. Camundongos BALB/c foram imunizados i.v. com rBCG ureC Hly, BCG-Hly ou BCG parente e desafiados em aerossol no dia 120 p.i. com M. tuberculosis Beijing. Vacinação com BCG ureC Hly induziu uma proteção aperfeiçoada contra M. tuberculosis Beijing já em pontos de tempo iniciais (dia 30) e demorando pelo inteiro período de observação até dia 90 p.c.. Comparada a vacinação com BCG parente, vacinação com rBCG ureC Hly conduziu a uma redução no pulmão de 1 log CFU de M. tuberculosis Beijing.

Exemplo 2 Proteção de longo termo contra M. tuberculosis H37Rv em porquinhos da índia

Uma vez que camundongos são relativamente resistentes a infecção com M. tuberculosis, porquinhos da índia como um modelo animal mais suscetível foram usados para testar capacidade de vacinação de rBCG ureC Hly. Porquinhos da índia foram imunizados subcutaneamente com a respectiva cepa de vacina mycobacterial, rBCG ureC Hly ou BCG parente, e ganho de peso assim como CFU foram monitorados após desafio de aerossol com M. tuberculosis H37Rv. Porquinhos da índia imunizados com rBCG ureC Hly mostraram ganho de peso similar àqueles animais vacinados com a cepa BCG parente até o dia 120, enquanto animais não-vacinados sofreram claramente de TB como indicado pela falha de ganho de peso de corpo.

Exame visual de pulmão e baço antes de análises CFU mostrou que tubérculos sobre a superfície de ambos os órgãos de porquinhos da índia imunizados com BCG foram muitos maiores e mais numerosos que aqueles de animais vacinados com BCG ureC Hly.

Exemplo 3 Avaliação de segurança de BCG ureC Hly

Camundongos Rag1-/- deficientes em células T e B foram infectados com 10⁶ microorganismos da cepa parente BCG (wt) ou a cepa rBCG ureC Hly. A presença de microorganismos em pulmão e baço foi monitorada. CFU significantemente reduzida de rBCG ureC Hly foram observadas no pulmão (figura 2a). No baço, CFU levemente reduzidas foram observadas após injeção com rBCG ureC Hly comparada a infecção com BCG * · ·

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14Υ • 9 · · · • · · · · • · ♦ ·

parente (figura 2b).

Ainda, a segurança de BCG ureC Hly foi testada em camundongos SCID imunodeficientes.

Para este propósito, camundongos SCID foram inoculados intravenosamente com 10⁷-10⁸ microorganismos de rBCG ureC Hly ou a cepa BCG parente. Enquanto camundongos SCID inoculados com a cepa parente morreram até dia 25 p.i., camundongos inoculados com rBCG ureC Hly sobreviveram até dia 150 p.i. (figura 3).

Estes experimentos demonstraram que BCG ureC Hly temuma segurança maior comparada à cepa BCG parente.

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Claims (10)

REIVINDICAÇÕES

1. Célula bacteriana, caracterizada pelo fato de que é deficiente de urease e que compreende uma molécula e ácido nucléico recombinante codificando um polipeptídeo de fusão compreendendo

2. Célula, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que pelo menos uma subunidade de urease celular codificando a

20 sequência de ácidos nucléicos é inativada.

3. Célula, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que pelo menos a sequência codificando a subunidade de urease C celular é inativada.

4. Célula, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo 25 fato de que o domínio capaz de elicitar uma resposta imune é um peptídeo ou polipeptídeo capaz de elicitar respostas de células T CD8 restrita a MHC de classe I.

5 polipeptídeo, onde o dito domínio é capaz de elicitar uma resposta imune em um mamífero, e (b) um domínio de escape fagolisossomal, e (iii) cultivo da célula obtida em (ii) sob condições apropriadas.

26. Processo, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que a referida célula é uma célula de M. bovis.

10

27. Processo para preparação de uma célula bacteriana recombinante, como definida na reivindicação 17, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que compreendendo as etapas:

(i) provimento de uma célula bacteriana deficiente em urease;

(ii) inserção de uma molécula de ácido nucléico recombinante na 15 referida célula bacteriana, a referida molécula de ácido nucléico codificando um peptídeo ou polipeptídeo de escape fagolisossomal, e (iii) cultivo da célula obtida em (ii) sob condições apropriadas.

28. Processo, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que compreende inserção de pelo menos uma molécula de áci20 do nucléico recombinante na célula bacteriana, a referida molécula de ácido nucléico recombinante codificando um peptídeo ou polipeptídeo capaz de elicitar uma resposta imune em um mamífero.

29. Processo, de acordo com a reivindicação 25 ou 27, caracterizado pelo fato de que o domínio ou peptídeo ou polipeptídeo capaz de elici25 tar uma resposta imune é selecionado dentre auto-antígenos, antígenos de tumor, antígenos de vírus, antígenos de parasitas, antígenos bacterianos e seus fragmentos imunogênicos.

30. Uso de uma célula bacteriana, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fato de que é para a fabri30 cação de uma vacina viva.

31. Uso, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de uma vacina para indivíduos imunodeficiPetição 870180072341, de 17/08/2018, pág. 9/16 entes.

32. Uso, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de uma vacina para indivíduos sofrendo de uma infecção por HIV.

5

33. Uso, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de uma vacina de tumor.

34. Uso, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de uma vacina contra câncer superficial de bexiga.

5 fato de que o domínio ou peptídeo ou polipeptídeo capaz de elicitar uma resposta imune é selecionado dentre autoantígenos, antígenos de tumor, antígenos de vírus, antígenos de parasitas, antígenos bacterianos e seus fragmentos imunogênicos.

19. Célula, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo

10 fato de que é capaz de expressar a referida pelo menos uma molécula de ácido nucléico recombinante.

20. Célula, de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de que é capaz de secretar um polipeptídeo codificado pela referida pelo menos uma molécula de ácido nucléico.

15

21. Célula, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que tem uma persistência intracelular em macrófagos infectados que é igual ou menos que a persistência intracelular de uma célula de Mycobacteríum nativa.

22. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que

20 compreende como um agente ativo uma célula, como definida na reivindicação 1, opcionalmente junto com diluentes, veículos e adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis.

23. Composição, de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelo fato de que é uma vacina viva apropriada para administração em

25 uma superfície de mucosa ou via rota parenteral.

24. Processo para a preparação de uma vacina viva, caracterizado pelo fato de que compreende formulação de uma célula, como definida na reivindicação 1, em uma quantidade farmaceuticamente efetiva com diluentes, veículos e adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis.

30

25. Processo para preparação de uma célula bacteriana recombinante, como definida na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas:

Petição 870180072341, de 17/08/2018, pág. 8/16 (i) provimento de uma célula bacteriana deficiente de urease;

(ii) inserção de uma molécula de ácido nucléico recombinante na referida célula bacteriana, a referida molécula de ácido nucléico codificando um polipeptídeo de fusão compreendendo (a) pelo menos um domínio de um

5. Célula, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o domínio capaz de elicitar uma resposta imune é de um polipep30 tídeo de Mycobacteríum.

5 (a) pelo menos um domínio de um polipeptídeo, onde o dito domínio polipeptídeo é capaz de elicitar uma resposta imune em um mamífero, e (b) um domínio de escape fagolisossomal, em que o referido domínio de escape fagolisossomal é um do10 mínio de escape fagolisossomal de Listeria-, em que o referido domínio fagolisossomal é codificado por uma molécula de ácido nucléico selecionada dentre:

(a) uma sequência de nucleotídeos compreendendo nucleotídeo

211-1722 como mostrado em SEQ ID N°1,

15 (b) uma sequência de nucleotídeos degenerada da SEQ ID N° 1 que codifique a sequência de aminoácidos descrita na SEQ ID N°2; e em que a referida célula é uma célula de Mycobacteríum.

6. Célula de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que o domínio capaz de elicitar uma resposta imune é selecionado

Petição 870180072341, de 17/08/2018, pág. 6/16 dentre antígenos de Mycobacterium Ag85B (M. tuberculosis), Ag85B (M.bovis), Ag85A (M. tuberculosis) e ESAT-6 (M. tuberculosis) ou um seu fragmento imunogênico.

7. Célula, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo 5 fato de que o domínio capaz de elicitar uma resposta imune é o antígeno

Ag85B ou um fragmento imunogênico do mesmo.

8. Célula, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo de fusão é precedido por uma sequência de peptídeo sinal.

10

9. Célula, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o peptídeo ligante está localizado entre o domínio elicitando a resposta imune e o domínio fagolisossomal.

10. Célula de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a referida molécula de ácido nucléico está ligada operativamente

15 com uma sequência de controle de expressão.

11. Célula, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que a referida sequência de controle de expressão está ativa na referida célula.

12. Célula, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo 20 fato de que a referida molécula de ácido nucléico está localizada em um vetor.

13. Célula, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que é uma célula de Mycobacterium bovis.

14. Célula, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo 25 fato de que é deficiente em urease e que compreende pelo menos uma molécula de ácido nucléico recombinante codificando um peptídeo ou polipeptídeo escape fagolisossomal.

15. Célula, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos uma molécula adicional de ácido nu30 cléico recombinante codificando um peptídeo ou polipeptídeo capaz de elicitar uma resposta imune em um mamífero.

16. Célula, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo

Petição 870180072341, de 17/08/2018, pág. 7/16 fato de que é uma célula de Mycobacteríum.

17. Célula, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que é uma célula de Mycobacteríum bovis.

18. Célula, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo

10 35. Uso, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de uma vacina no campo veterinário.

Petição 870180072341, de 17/08/2018, pág. 10/16