BR112013015878B1 - método para determinação da eficácia de uma vacina e kit de reagentes - Google Patents

Abstract

MÉTODO PARA DETERMINAÇÃO DA EFICÁCIA DE UMA VACINA, KIT DE REAGENTES E USO DO KIT DE REAGENTES A invenção refere-se a métodos e reagentes para a determinação da eficácia de uma vacina, particularmente de uma vacina contra a tuberculose.

Description

DESCRIÇÃO

[001] A invenção refere-se a métodos e reagentes para a determinação da eficácia de uma vacina, particularmente de uma vacina contra a tuberculose.

[002] A cada ano, cerca de 2 milhões de pessoas morrem por tuberculose (TB) (1). A única vacina disponível contra a TB é o Mycobacterium bovis bacilo de Calmette-Guérin (BCG), que foi utilizada em humanos pela primeira vez em 1921 (2). Até hoje, 4 milhões de doses de BCG foram administradas, tornando esta a vacina humana mais amplamente utilizada em todo o mundo (3). Entretanto, ainda estamos longe de ter alcançado a erradicação da tuberculose. A vacinação com a vacina BCG previne a meningite tuberculosa e a TB miliar em crianças (4). No entanto, a proteção contra outras formas de TB, principalmente a TB pulmonar em adolescentes e adultos é inconclusiva, conforme enfatizado por uma meta-análise, que revelou eficácias de proteção que vão 0 a 80% em adultos (5). Portanto, novas vacinas contra a tuberculose são urgentemente necessárias. Atualmente, as novas estratégias de vacinação contra a tuberculose em ensaios clínicos incluem a BCG recombinante para substituir a BCG canônica, assim como as vacinas de subunidades e vacinas baseadas em vetores virais não replicantes para doses de intensificação da primeira dose (dose booster)da BCG (6) (7).

[003] A identificação de mecanismos imunológicos subjacentes à proteção pode facilitar a concepção racional de novas estratégias de vacinação para a prevenção da tuberculose. Além disso, essa estratégia poderia revelar biomarcadores indicativos de imunidade protetora que poderiam revelar desfechos da evolução clínica em ensaios clínicos que avaliam a eficácia da vacina na tuberculose, e, assim, reduzir a sua duração, bem como facilitar os testes de um maior número de vacinas candidatas em ensaios paralelos. Estudos observacionais com foco em recém-infectados, contato de indivíduos saudáveis com pacientes com TB e crianças vacinadas com BCG foram iniciados para definir esses biomarcadores (8). Apesar da extensa investigação sobre a resposta imunológica à tuberculose, os elementos fundamentais da memória de proteção necessitam ainda serem esclarecidos. Após a vacinação com a BCG, as células T CD4 de memória antígeno-específicas são difíceis de detectar devido à escassez de antígenos imunodominantes. Atualmente, os biomarcadores mais utilizados são aqueles baseados nas elevadas frequências de células T CD4 produtoras de IFNy. Evidências crescentes colocam em questão o valor do IFNy como um correlato de proteção na TB (9,10). Indubitavelmente o IFNy desempenha um papel fundamental na defesa contra o MTB (11), mas a determinação do IFNy por si só não pode ser considerada como um marcador fiável da imunidade protetora.

[004] Uma cepa de BCG recombinante expressando um domínio de escape fagolisossomal é descrita no documento WO99/101496, cujo conteúdo é incorporado ao presente pela referência. O domínio de escape fagolisossomal permite que a cepa escape do fagossomo de células hospedeiras infectadas pela perfuração da membrana do fagossomo. A fim de proporcionar um pH fagossomal ácido para uma atividade de escape fagolisossomal ótima, uma cepa recombinante deficiente em urease foi desenvolvida. Esta cepa é descrita no documento W02004/094469, cujo conteúdo é incorporado ao presente.

[005] Uma cepa recombinante ΔureC Hly+ rBCG (rBCG) expressando a listeriolisina perfurante de membrana (Hly) de Listeria monocytogenese desprovida de urease C induz uma proteção superior contra o desafio aerogênico com MTB, em comparação com a BCG parental (pBCG) em um modelo pré-clínico (12). Esta construção de vacina demonstrou com sucesso a segurança e imunogenicidade em um ensaio clínico de fase I (US 61/384.375), cujo conteúdo é incorporado ao presente pela referência.

[006] No presente estudo, foi demonstrado que a rBCG e a pBCG induzem de maneira acentuada respostas imunes do tipo Th1, enquanto que apenas a rBCG provoca uma resposta Th17 profunda adicional. Também foi observado o recrutamento precoce de linfócitos T antígeno-específicos para o pulmão após a infecção do MTB nos camundongos vacinados rBCG. Estas células T produzem abundantes citocinas Th1 após a reestimulação. A eficácia protetora superior da rBCG foi aparentemente dependente de IL17. A elevada produção de IL17 após a rBCG, mas não na vacinação com pBCG, também foi detectada em voluntários saudáveis durante os ensaios clínicos de fase I. Nossos achados identificam um via imunológica geral como um marcador para estratégias de vacinação aprimoradas contra a TB, que também podem ser exploradas por vacinas de subunidade candidatas.

[007] Um objeto da presente invenção é um método para a determinação da eficácia de uma vacina, compreendendo a determinação da resposta imune Th17 em um sujeito vacinado, em que uma resposta imune Th17 detectável é indicativa de imunidade protetora no referido sujeito.

[008] Um aspecto adicional da presente invenção é um kit de reagente para a determinação da eficácia de uma vacina que compreende pelo menos um reagente para a detecção de uma resposta imune Th17.

[009] Em um exemplo de realização preferido, a vacina é uma vacina viva, especialmente uma célula de Mycobacterium. Em um exemplo de realização ainda mais preferido a vacina é um Mycobacterium recombinante que compreende uma molécula de ácido nucleico recombinante que codifica um polipeptídeo de fusão compreendendo (a) um domínio capaz de suscitar uma resposta imune; e (b) um domínio de escape fagolisossomal. O domínio capaz de desencadear a resposta imune é preferencialmente um peptídeo ou polipeptídeo imunogênico a partir de um agente patogênico ou fragmento imunogênico deste. Em um exemplo de realização adicional, a vacina é uma vacina de subunidade, ou seja, uma vacina compreendendo um antígeno purificado a partir de um agente patogênico ou seu fragmento imunogênico, particularmente, um antígeno recombinante ou um fragmento imunogênico deste. Em outro exemplo de realização, a vacina é uma vacina baseada em uma célula patógena inteira inativada ou fração celular.

[010] A célula de Mycobacterium é preferencialmente uma célula de M. bovís, uma célula de M. tuberculosis,e particularmente uma célula de M. tuberculosisatenuado ou outras Micobactérias, por exemplo, M. microti, M. smegmatls, M. canettii, M. marinum ou M. fortuitum. Mais preferencialmente, a célula é uma célula recombinante de M. bovis(BCG), em particular uma célula de M. bovis recombinante da cepa Danishsubtipo Prague(43). Em um exemplo de realização especialmente preferido, a vacina é uma célula de Mycobacterium deficiente em urease recombinante. Em um exemplo de realização especialmente preferido, a sequência ureC da célula do Mycobacterium é inativada (ΔUrec),por exemplo, pela construção de um vetor suicida contendo um gene ureC interrompido por um gene marcador de seleção, transformando a célula-alvo com o vetor e selecionado as células positivas para o marcador de seleção que possuem o fenótipo de urease negativa. Mais preferencialmente, a célula é BCG da cepa recombinante Danishsubtipo Praguee caracterizada como rBCG Δllrec :: Hly+:: Hyg+.

[011] O domínio capaz de suscitar uma resposta imune é preferencialmente selecionado a partir de peptídeos ou polipeptídeos imunogênicos do M. bovis ou de M. tuberculosisou a partir de fragmentos imunogênicos que possuem um comprimento de pelo menos 6, preferencialmente de pelo menos 8 aminoácidos, e mais preferencialmente de pelo menos 9 aminoácidos, por exemplo, até 20 aminoácidos. Exemplos específicos de antígenos adequados são Ag85B (p30) do M. tuberculosis,Ag85B (a-antígeno) do M. bovis BCG, Ag85A do M. tuberculosise ESAT-6 do M. tuberculosise os fragmentos dos mesmos.

[012] A vacina é preferencialmente uma vacina contra as infecções micobacterianas, especialmente as infecções pulmonares micobacterianas, mais especificamente a tuberculose.

[013] De acordo com o método da invenção, é determinada a resposta imune Th17 em um sujeito vacinado. O sujeito é preferencialmente um mamífero, por exemplo, um humano. A determinação é realizada de preferência em uma amostra biológica obtida a partir do referido sujeito, em que a referida amostra compreende células imunes, em particular células T e/ou células NK, mais particularmente células T antígeno-específicas, tais como células T CD4. A amostra pode ser um fluido corporal ou amostra de tecido, por exemplo, sangue, soro ou amostra de plasma, ou uma amostra a partir do pulmão ou baço. Os métodos para a coleta de amostras são bem conhecidos no estado da técnica.

[014] O método da presente invenção requer uma determinação da resposta imune Th17. Para esta finalidade, é preferível reestimular as células imunes presentes na amostra do sujeito que será analisada com um imunógeno e, em seguida, a determinação da expressão de citocinas é realizada a partir das referidas células. As células a serem analisadas são preferencialmente células T antígeno-específicas, com maior preferência para células T CD4. O imunógeno para a reestimulação corresponde ao imunógeno presente na vacina (cuja eficácia está sendo determinada). O imunógeno pode estar presente tanto em uma forma idêntica à forma presente na vacina quanto em uma forma diferente. Por exemplo, quando a vacina compreende um polipeptídeo imunogênico, o imunógeno na etapa de reestimulação pode compreender um fragmento imunogênico da vacina, ou vice-versa. Preferivelmente, o imunógeno utilizado para a etapa de reestimulação é um polipeptídeo ou peptídeo purificado. A fim de testar a eficácia de vacinas contra a tuberculose, especificamente uma vacina contra a tuberculose viva conforme descrito acima, o imunógeno pode ser, vantajosamente, um antígeno micobacteriano, por exemplo, selecionado a partir de PPD “Derivado de Proteína Purificada”, que é um extrato glicerol de micobactérias ou Ag85A e Ag85B, bem como outros antígenos micobacterianos e fragmentos imunogênicos destes (conforme descrito acima).

[015] A determinação da resposta Th17 de acordo com a invenção pode compreender células associadas com a resposta Th17, por exemplo, células produtoras de IL-17, por meio de marcadores de superfície e de citocinas presentes na e/ou secretadas pelas referidas células. Exemplos de marcadores de superfície são CD4, CD8, IL-23R, CCR4 e/ou CCR6. Exemplos de citocinas presentes e/ou secretadas por estas células são: IL-17, IL-21, IL-22, IL-23, IFNy e combinações dos mesmos. Preferencialmente, a citocina é IL-17. Tais células podem ser determinadas por métodos citológicos, por exemplo, separação de células usando técnicas com reagentes de detecção imunológicos, tais como anticorpos específicos para marcadores da superfície celular e/ou citocinas, que podem carregar uma marcação, por exemplo, um grupo de fluorescência.

[016] Mais preferencialmente, as células associadas com uma resposta imune Th17 são, por exemplo, células T CD4 produtoras e opcionalmente secretoras de IL-17.

[017] Em um exemplo de realização adicional, a determinação da resposta imune Th17 compreende a determinação de uma citocina secretada a partir de células associadas com a resposta imune Th17, por exemplo, a IL-17. A citocina pode ser determinada por métodos imunológicos utilizando anticorpos apropriados, por exemplo, anticorpos direcionados contra a IL-17.

[018] No método da invenção, a resposta imune Th17 é determinada no momento apropriado após a vacinação. Por exemplo, a resposta imune pode ser determinada 20 a 50 dias, particularmente, 25 a 35 dias após a vacinação.

[019] A invenção também se refere a um kit de reagentes para a determinação da eficácia de uma vacina, especialmente para o uso em um método tal como descrito acima. O kit de reagentes compreende um imunógeno adequado para a reestimulação de células imunes presentes em uma amostra de um sujeito que foi vacinado. Além disso, o kit de reagentes compreende, pelo menos, um reagente adequado para a detecção de um marcador da resposta imune Th17, tal como descrito acima. Os reagentes, por exemplo, podem ser selecionados a partir de reagentes de detecção citológica e/ou imunológica, por exemplo, anticorpos contra marcadores celulares característicos para células imunes associadas à resposta Th17 e/ou a um reagente imunológico específico para as citocinas associadas a uma resposta imune Th17, particularmente a IL-17 e/ou IL-22. As regiões de detecção podem carregar grupos detectáveis, por exemplo, grupos de marcação por fluorescência.

[020] Além disso, a invenção é descrita em mais detalhes pelas Figuras e Exemplos a seguir.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[021] Figura 1: carga de MTB em camundongos tipo selvagem (WT). A imunização s.c. protege contra a infecção com MTB 90 dias p.i. (A). Carga bacteriana é comparável entre grupos de animais vacinados e não vacinados no dia 7 p.i. (B). Determinação da UFC no pulmão e baço após a infecção por aerossol com 400 UFC de MTB. O lobo pulmonar cardíaco (aprox. 71/10 do órgão inteiro) ou metade de um baço foi homogeneizado, o material remanescente foi utilizado para em ensaios de reestimulação in vitro. A significância estatística foi determinada pelo teste de Mann-Whitney, com valores de p bilaterais. *, P < 0,05; **, P < 0,01. Os dados são representativos de três experimentos com resultados semelhantes.

[022] Figura 2: Indução superior de citocinas após a vacinação com rBCG em relação a pBCG. Respostas no pulmão (A) e baço (B) 83 dias após a vacinação s.c. com rBCG ou pBCG. Um total de 2,5 x 105 células (pulmão) ou 2 x 106 células (baço) foram reestimuladas com PPD durante 20 horas e os sobrenadantes analisados por ensaios multiplex. As concentrações de citocinas são representadas como média ± EPM de quatro experimentos independentes com três repetições cada. Produção de citocinas de fundo (background)a partir de controles médios foi subtraída. A Análise de Variância (ANOVA) e o teste de comparações múltiplas de Bonferroni foram aplicados para a análise estatística. *, P < 0,05; **, P < 0,01.

[023] Figura 3: A vacinação com rBCG acelera o recrutamento de células T antígeno-específicas para o pulmão após a infecção por aerossol com MTB. Secreção de citocinas por células do pulmão 7 dias após a infecção por aerossol com 200-400 CFU de MTB. Um total de 2 x 105 células foram estimuladas com PPD durante 20 horas e os sobrenadantes analisados por ensaio multiplex (A). As concentrações de citocinas são representadas como média ± EPM de dois experimentos independentes com três repetições cada. Produção de citocinas de fundo (background)a partir de controles médios foi subtraída. As células reestimuladas com PPD durante 6 horas na presença de Brefeldina A foram analisadas por citometria de fluxo multicolor (B). As frequências de respostas das células T CD4 são representadas como médias ± EPM de três experimentos independentes com três repetições cada. A Análise de Variância (ANOVA) e o teste de comparações múltiplas de Bonferroni foram aplicados para a análise estatística. *, P < 0,05; **, P < 0,01, ***, P < 0,001.

[024] Figura 4: Vacinação com rBCG aumenta as respostas PPD- específicas no baço após infecção por aerossol com MTB. Secreção de citocinas por esplenócitos 7 dias após a infecção por aerossol com 200-400 CFU de MTB. Um total de 2 x 106 células foram estimuladas com PPD durante 20 horas e os sobrenadantes analisados por ensaios multiplex (A). As concentrações de citocinas são representadas como média ± EPM de quatro experimentos independentes com três repetições cada. Produção de citocinas de fundo (background)a partir de controles médios foi subtraída. As células reestimuladas com PPD durante 6 horas na presença de Brefeldina A foram analisadas por citometria de fluxo multicolor(B). As frequências de respostas das células T CD4 são representadas como média ± EPM de três experimentos independentes com três repetições cada. A Análise de Variância (ANOVA) e o teste de comparações múltiplas de Bonferroni foram aplicados para a análise estatística. *, P < 0,05; **, P < 0,01, ***, P < 0,001.

[025] Figura 5: Vacinação com pBCG ou rBCG não conduz a alterações significativas na população de células Treg. Células Treg no baço após a imunização s.c. com rBCG ou pBCG. As barras pretas representam CD25+FoxP3+ e as barras brancas representam células CD25Foxp3+. Frequências de células T CD4 e Treg CD8 83 dias após a imunização (A e B), bem como 7 dias (C e D) ou 90 dias (E e F) após a infecção por aerossol com 200-400 CFU de MTB. Três camundongos por grupo, representados como média ± EPM. Os dados são representativos de três experimentos independentes com resultados similares.

[026] Figura 6: Frequências da produção de citocina por células T CD8 no pulmão após a vacinação e a subsequente infecção por aerossol com MTB. Secreção de citocinas 7 dias após a infecção por aerossol com 200-400 CFU de MTB. As células reestimuladas com PPD durante 6 horas na presença de Brefeldina A foram analisadas por citometria de fluxo multicolor.As frequências de respostas das células T CD8 são representadas como médias ± EPM de dois experimentos independentes com três repetições cada. A Análise de Variância (ANOVA) e o teste de comparações múltiplas de Bonferroni foram aplicados para a análise estatística.

[027] Figura 7: Frequências da produção de citocina por células T CD8 no baço após a vacinação e a subsequente infecção por aerossol com MTB. Secreção de citocinas 7 dias após a infecção por aerossol com 200-400 CFU de MTB. As células reestimuladas com PPD durante 6 horas na presença de Brefeldina A foram analisadas por citometria de fluxo multicolor. As frequências de respostas das células T CD8 são representadas como médias ± EPM de quatro experimentos independentes com três repetições cada. A Análise de Variância (ANOVA) e o teste de comparações múltiplas de Bonferroni foram aplicados para a análise estatística. *, P < 0,05; **, P < 0,01, ***, P < 0,001.

[028] Figura 8: Respostas imunes no pulmão durante a infecção persistente por MTB em camundongos vacinados com rBCG. Secreção de citocinas por células do pulmão 90 dias após a infecção por aerossol com 200- 400 CFU de MTB. As células foram reestimuladas com PPD durante 20 horas e os sobrenadantes analisados por ensaios multiplex (A). As concentrações de citocinas são representadas como média ± EPM de dois experimentos independentes com três repetições cada. Produção de citocinas de fundo (background)a partir de controles médios foi subtraída. As células reestimuladas com PPD durante 6 horas na presença de Brefeldina A foram analisadas por citometria de fluxo multicolor (B). As frequências de respostas das células T CD4 são representadas como médias ± EPM de dois experimentos independentes com três repetições cada. A Análise de Variância (ANOVA) e o teste de comparações múltiplas de Bonferroni foram aplicados para a análise estatística. *, P < 0,05; **, P < 0,01.

[029] Figura 9: Frequências da produção de citocina por células T CD8 após a vacinação e a subsequente infecção por aerossol com MTB. Secreção de citocinas por células isoladas a partir do pulmão 90 dias após a infecção por aerossol com 200-400 CFU de MTB. As células reestimuladas com PPD durante 6 horas na presença de Brefeldina A foram analisadas por citometria de fluxo multicolor. As frequências de respostas das células T CD8 são representadas como médias ± EPM de dois experimentos independentes com três repetições cada. A Análise de Variância (ANOVA) e o teste de comparações múltiplas de Bonferroni foram aplicados para a análise estatística. *, P < 0,05.

[030] Figura 10: Vacinação induz a produção de IL22, mas não a produção de IL21. Secreção de IL21 (A) e IL22 (B) por células do baço (2 x 106 células) ou pulmões (2 x 105 células) de camundongos 83 dias após a vacinação e subsequente infecção por aerossol com 200-400 UFC de MTB. Concentrações de IL21 mensuradas a partir de três amostras por grupo, representadas como média ± EPM. Para IL22 amostras a parir de um grupo foram reunidas. Os dados são representativos de dois (dia 83 após a vacinação) e cinco (dia 7 p.i.) experimentos similares. As células foram reestimuladas com PPD durante 20 horas e os sobrenadantes analisados por ELISA.

[031] Figura 11: A rBCG provoca aumento do recrutamento de células yδT e células NK, sem alterar significativamente as populações de APC. Células recrutadas para a cavidade peritoneal após a administração de 106 UFC de rBCG ou pBCG i.p. Análise das populações de células no fluido de lavagem peritoneal por citometria de fluxo. APC recrutadas para o peritônio 5 horas (painel superior) e 6 dias (painel inferior), após a administração i.p. de rBCG ou pBCG (A). ICS de populações de células T 5 horas após a injeção (B). As células foram estimuladas com anticorpos αCD3/αCD28 durante 18 horas na presença de Brefeldina A. ICS de populações de células T 6 dias após a administração (C). As células foram reestimuladas com PPD por 18 horas na presença de Brefeldina A. Dados apresentados como resumo de três experimentos independentes, com cinco camundongos por grupo. A linha horizontal indica a mediana. A Análise de Variância (ANOVA) e o teste de comparações múltiplas de Bonferroni foram aplicados para a análise estatística. *, P < 0,05; **, P < 0,01. Citocinas e quimiocinas detectadas no fluido de lavagem peritoneal analisado por ensaio multiplex (D) representado como concentrações médias ± EPM.

[032] Figura 12: a rBCG induz IL17 em células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) humanas de voluntários saudáveis em um estudo clínico de fase I. Produção de IL17 por PBMCs humanas isoladas a partir de voluntários humanos saudáveis de um estudo clínico fase I. Um total de 5 x 105 células isoladas 29 dias após a vacinação com rBCG ou pBCG foram reestimuladas com PPD durante 20 horas e os sobrenadantes analisados por ensaio multiplex. A significância estatística foi determinada pelo teste de Mann- Whitney, com valores de p unilateral e correção de Welch. *, P <0,05, n = 3 para pBCG e n = 7 para rBCG.

EXEMPLO MATERIAIS E MÉTODOS CAMUNDONGOS

[033] Camundongos BALB/c fêmeas foram criados no Bundesinstitut fur Risikobewertung (BFR) em Berlim. Os camundongos eram de 6-8 semanas de idade no início dos experimentos e foram mantidos livres de agentes patogênicos específicos (SPF). Os experimentos com animais foram realizados com a aprovação das autoridades locais (Landesamt fur Gesundheit und Soziales - LAGeSo, Berlin, Alemanha).

BACTÉRIAS

[034] O MTB H37Rv e as cepas rBCG e pBCG foram usados conforme descrito anteriormente (12). As bactérias foram cultivadas em caldo Middlebrook 7H9 suplementado com glicerol, 0,05% de Tween 80 e ADC. Culturas na fase semi-logarítmica foram coletadas e armazenadas a -80 °C até a utilização. Todos os estoques foram titulados antes do uso. Suspensões de células bacterianas individuais foram obtidas pela transferência repetida através de uma seringa com uma agulha 27G.

VACINAÇÃO E INFECÇÃO COM MTB

[035] A pBCG ou rBCG (106 UFC) foi administrada por via subcutânea (s.c.) na proximidade da base da cauda. A infecção aerogênica dos camundongos com o MTB foi realizada usando um sistema de exposição por inalação Glas-Col. As cargas bacterianas foram avaliadas pela ruptura mecânica de órgãos removidos assepticamente em PBS 0,5% v/v; Tween 80 e o plaqueamento de diluições seriadas em placas de ágar Middlebrook 7H11 suplementado com OADC. Após 3 semanas, as colônias de MTB foram contadas. A significância estatística dos resultados foi determinada pelo teste de Mann-Whitney, com valores de p bilaterais para dados não paramétricos utilizando o softwareGraphPad Prism 5.0.

ISOLAMENTO CELULAR, ESTÍMULOS E CITOMETRIA DE FLUXO

[036] As células foram purificadas conforme descrito anteriormente (42). Grupos experimentais forma compostos por cinco camundongos. Dois baços e pulmões foram reunidos em um uma amostra que foi processada individualmente (pool),resultando em três amostras para cada grupo de cinco camundongos por estimulações subsequentes. As células foram estimuladas com 50 pg/mL de PPD (SSI, Copenhague, Dinamarca) durante 20 horas para análise de citocinas pelo ensaio multiplex ou durante 6 horas na presença de 25 pg/ml de Brefeldina A para coloração de citocina intracelular (ICS). Os seguintes anticorpos foram utilizados: CD4 (RM4-5), IFNy (XMG-1.2), IL-2 (JES6-5H4), Ly6G/C (RB6-8C5), CD11 b (M1/70), yδ-TCR (GL- 3), conjunto de coloração FoxP3 e CD49b (cloneDX5) todos da eBioscience. CD8a (YTS169), TNF-α (XT22), CD16/CD32 (2.4G2), F4/80 (CI:A3-1) e CD11c (N418), foram purificados a partir de sobrenadantes de hibridoma e marcados com fluorescência em nosso laboratório. IL-17 (TC11-18h10) foi obtido a partir da BD Biosciences. As células foram analisadas usando um citômetro de fluxo FACSCanto II ou LSRII e o software FACSDiva (BD Biosciences). As citocinas foram mensuradas utilizando o os imunoensaios baseados em esferas Bio-Plex Th1/Th2, IL17 e IL6 da Bio-Rad de acordo com as instruções do fabricante. A IL21 e IL22 foram mensuradas por ELISA utilizando o kit da R&D systems. A IL17 humana foi detectada com um teste Milliplex 42-plex da Millipore.

LAVAGEM PERITONEAL

[037] A pBCG ou rBCG foram preparadas a partir de culturas em fase semi-logarítmica. As bactérias foram lavadas três vezes com PBS e a concentração determinada pela medição da densidade óptica a 580 nm. A administração de 106 UFC foi realizada por via intraperitoneal. As células recrutadas foram obtidas a partir da cavidade peritoneal, 5 horas ou 6 dias mais tarde utilizando injeções de 5 ml de PBS e a análise foi feita por citometria de fluxo. As citocinas e quimiocinas no lavado foram determinadas usando o kit Bio-Plex Mouse Cytokine 23-plex da Bio-Rad.

RESULTADOS RESPOSTAS TH1/TH17 APÓS A VACINAÇÃO COM RBCG E PBCG

[038] Na tentativa de elucidar os mecanismos imunitários relevantes para a eficácia da vacina para a TB, as respostas imunitárias para rBCG e pBCG em camundongos foram comparadas. Uma eficácia protetora superior da rBCG foi originalmente determinada após a imunização i.v (12). Na presente invenção, mostramos que a administração subcutânea de rBCG induz níveis comparáveis de proteção e mantém um eficácia superior em relação a pBCG (Figura 1A). Em seguida, nós analisamos as respostas de memória a longo prazo nos pulmões e baços de camundongos 83 dias após a vacinação s.c. com rBCG ou pBCG. As células foram reestimuladas com PPD e os sobrenadantes analisados por meio de ensaios multiplex para citocinas. A imunização com rBCG induziu um produção de citocinas por células isoladas a partir do pulmão significativamente maior em comparação com a imunização com pBCG (Figura 2A). Estas incluíram IFNy, IL2, IL6, e GM-CSF. Em contrapartida, as citocinas tipo 2: IL4, IL5 e IL10 não aumentaram acima dos níveis de fundo (dados não mostrados). Curiosamente, concentrações aproximadamente 3 vezes mais elevadas de IL17 foram produzidas por células de pulmão de camundongos vacinados com rBCG. Note que apenas poucas células puderam ser isoladas dos pulmões de camundongos infectados. Consequentemente, as concentrações globais de citocinas foram menores do que no baço, onde uma densidade de células 10 vezes maior por poço pôde ser utilizada para a estimulação (Figura 2B). Nos baços, ambas as vacinas induziram igualmente fortes respostas Th1, tal como refletido pelas concentrações comparáveis de IL-2, IL6, IFNy e GM-CSF. No entanto, as células do baço de camundongos vacinados com rBCG produziram significativamente mais IL17 mediante a reestimulação com PPD, em comparação com os animais vacinados com pBCG. Assim, a imunização com rBCG, mas não com pBCG, induz respostas Th1 e Th17 de maneira forte e concomitante nos pulmões e baço que foram mantidas por períodos de tempo prolongados.

RECRUTAMENTO ACELERADO DE CÉLULAS T MTB-ESPECÍFICAS APÓS INFECÇÃO COM MTB VIRULENTO EM CAMUNDONGOS VACINADOS COM RBCG

[039] As células Th17 foram ligadas a melhora da vigilância imunológica (13). Nós comparamos as respostas de células T antígeno- específicas em animais vacinados após infecção por aerossol com MTB virulento, nos pulmões e baços, sete dias após a infecção. Uma notável produção de IFNy, IL17, IL-2 e GM-CSF pelas células do pulmão de camundongos vacinados com rBCG foi detectada 20 horas após a reestimulação com PPD (Figura 3A) ou peptídeos Ag85A (dados não mostrados). Em contraste, estas citocinas foram mal secretada por células de camundongos vacinados com pBCG. Nos animais não vacinados infectados com MTB, a produção de citocina estava abaixo do limite de detecção, de acordo com relatórios anteriores de que as células T MTB-específicas não aparecem antes de 3 semanas após a infecção pelo MTB (13). As citocinas tipo 2: IL4, IL5 e IL10, não foram detectados e o TNFa, IL-6 e IL12p70 estavam apenas um pouco acima dos níveis de fundo neste ponto de tempo precoce após o desafio com MTB (dados não mostrados).

[040] Nós determinados a produção de citocinas por células T de pulmão por citometria de fluxo 7 dias após a infecção por MTB (Figura 3B). As células foram estimuladas com PPD, durante 6 horas, seguido pela coloração intracelular de citocinas, IL2, IL17, IFNy e TNFa. Em indivíduos controle não vacinados uma pequena proporção de células T CD4 produziu IL2, TNF ou IFNy. Nos camundongos vacinados, as células T CD4 secretaram IL2, IFNy, TNFa e também IL17. As frequências de células produtoras de citocinas individuais foram mais elevadas, embora não significantemente, no grupo rBCG. Nos animais vacinados foram detectadas células T multifuncionais envolvidas na imunidade protetora (14). Diversas células T produtoras de citocinas eram predominantemente duplas produtoras IL2+TNFa+ e aumentaram significativamente após a vacinação com rBCG. As células produtoras triplas foram quase exclusivamente IL2+IFNy+TNFa+ e estavam ligeiramente aumentadas nos animais vacinados com rBCG em comparação com os camundongos vacinados com pBCG. Além disso, as células quádruplas-positivas IL2+TNFa+IFNy+IL17+ apareceram exclusivamente no grupo de camundongos rBCG embora em frequências muito baixas.

[041] Em princípio, as células T do baço produziram padrões de citocinas semelhantes às células T pulmonares (Figura 4). A produção de IL2 e GM-CSF foi significativamente mais elevada nos animais vacinados com rBCG em comparação com o grupo pBCG e abaixo do nível de detecção em animais controles não vacinados, e mesmo nos controles não vacinados, uma pequena percentagem de células T CD4 produzia IFNy. Em resumo, a vacinação tanto com pBCG quanto com rBCG induz células T CD4 a secretarem IFNy e TNF com frequências mais elevadas como produtoras individuais e multi-produtoras em camundongos vacinados com rBCG, em comparação com o grupo pBCG.

[042] Aos 7 dias p.i. as células T CD4 foram as principais produtoras de citocina; as produtoras de citocinas CD8 foram detectadas com frequências mais baixas no pulmão (Figura 6) e no baço (Figura 7), embora com padrões similares. É importante notar que frequências significativamente mais altas de células T CD8 produtoras unicamente de TNFa foram detectadas no grupo rBCG.

[043] A produção diferencial de citocinas e as frequências de células produtoras não foram resultado de diferentes cargas bacterianas neste ponto de tempo precoce após a infecção, conforme confirmado pela número de Unidades Formadoras de Colônias (UFC) comparáveis nos pulmões e baços (Figura 1B). Os números totais de células Treg aumentaram após a infecção para um grau comparável nos dois grupos vacinados (Figura 5).

VACINAÇÃO COM RBCG CONFERE RESPOSTAS IMUNES POTENTES DURANTE A INFECÇÃO PERSISTENTE

[044] Nós analisamos as respostas imune MTB-específicas 90 dias p.i. quando as cargas bacterianas pulmonares estavam aproximadamente 10 vezes mais baixas nos animais imunizados com rBCG em comparação com o grupo pBCG e 100 vezes mais baixas em comparação com o grupo controle não vacinado. As células a partir dos pulmões de camundongos vacinados e controles não tratados foram reestimuladas com PPD durante 20 horas e as concentrações de citocinas foram mensuradas por ensaios multiplex (Figura 8A). As citocinas detectadas após a reestimulação eram predominantemente do tipo 1. No entanto, nós não conseguimos detectar diferenças no IFNy ou IL17 entre os grupos vacinados durante a infecção persistente. Em contraste, a quantidade de IL-2, IL-6, GM-CSF e TNFα estava mais elevada nos camundongos vacinados com rBCG. Em todos os grupos, a IL4 e IL5 estavam abaixo do limite de detecção e em alguns casos a IL12p70 e IL10 foi mesurada (dados não mostrados). Além disso, a análise de células do pulmão por citometria de fluxo multicolor revelou células T CD4 predominantemente produtoras de citocinas durante a infecção persistente (Figura 8B). As células T CD4 secretoras de IFNy foram detectadas em todos os grupos com frequências semelhantes. Após a vacinação, as células T CD4 produtoras de IL-2, IFNy, TNFα ou IL17 em diferentes combinações podiam ser detectadas. Curiosamente, as frequências de resposta de células T CD4 não diferiram significativamente entre a vacinação rBCG e pBCG apesar das concentrações mais elevadas de IL-2 e TNFα nos sobrenadantes. Assumimos que ambas as vacinas aumentam as frequências de células T CD4 antígeno-específicas no pulmão durante a infecção persistente por MTB em células T induzidas por rBCG que se tomam produtoras mais potentes de citocinas. As células T CD8 secretando quase que exclusivamente IFNy tiveram frequências comparáveis em todos os grupos, enquanto que as células T CD8 que produziam unicamente TNFα de forma mais significativa foram detectadas no grupo rBCG. As células T CD8 multifuncionais apareceram fracamente acima dos valores de fundo (Figura 9).

VACINAÇÃO CAUSA A PRODUÇÃO DEIL22, MAS NÃO DEIL21

[045] As células Th17 podem produzir citocinas efetoras adicionais, tais como IL21 (15) e IL22 (16). As células produtoras de IL22 foram identificadas em pacientes com TB, mas parecem ser distintas das células produtoras de IL17 (17). Não detectamos IL21 após a estimulação com PPD em células de pulmão ou baço em camundongos vacinados e, posteriormente, infectados com MTB (Figura 10a). A IL22 foi produzida em concentrações elevadas por esplenócitos estimulados com PPD por 20 horas (Figura 10B) nos camundongos imunizados com rBCG, mas não houve aumento precoce após a infecção com MTB. A produção de IL22 por células do pulmão só foi observada no grupo vacinado com rBCG diminuiu após a infecção pelo MTB em aerossol.

A RBCG INTRAPERITONEAL PROVOCA AUMENTO DO RECRUTAMENTO DE CÉLULAS TΔT E CÉLULAS NK, SEM ALTERAR SIGNIFICATIVAMENTE AS POPULAÇÕES DE APC.

[046] Queríamos definir os mecanismos subjacentes a indução de células Th17 preferencial após a imunização com rBCG. Para este fim, rBCG e pBCG foram administradas i.p., e as células migrantes foram isoladas a partir da cavidade peritoneal 5 horas e 6 dias após a administração e analisadas por citometria de fluxo (Figura 11 A). Os neutrófilos (definidos como Gr1Hl, CD11bHI, MHCII; CD11c) entraram rapidamente na cavidade peritoneal e permaneceram elevados até o dia 6 p.i. nos grupos pBCG e rBCG na mesma extensão. As frequências de macrófagos peritoneais residentes (definidos como CD11bHI, F4/80HI, GrT, MHCIIHI, CD11c’) e células dendríticas (CD11c+, CD11bL0, GrT) mantiveram-se em baixas porcentagens. Em resumo, não foram detectadas diferenças significativas entre os grupos rBCG e pBCG.

[047] As células peritoneais coletadas 5 horas após a vacinação foram submetidos à estimulação policlonal (Figura 11B) com anticorpos αCD3/αCD28. As frequências de células T CD4 e células NK foram comparáveis entre todos os grupos como produtoras de IFNy e IL17. Seis dias após a administração, essas células aumentaram numericamente e atingiram maiores frequências do grupo rBCG (Figura 11C). O PPD foi utilizado para a reestimulação das células no tempo de 6 dias. As células T CD4 não produzem quantidades apreciáveis de IFNy ou IL17, enquanto que uma proporção substancial de células NK produziu IFNy após a administração de rBCG. Células T yõ foram identificadas como sendo a maior fonte de IL17 inicial na tuberculose (18). Proporções de células T yõ aumentadas, embora não significante, produtoras de IFNy foram identificadas cinco horas após a injeção da rBCG. Esta população de células aumentou ainda mais e frequências de células T yõ produtoras de IL17 notavelmente maiores foram detectadas no grupo rBCG 6 dias após a injeção. As células T CD8 não foram detectadas no peritônio em qualquer um dos grupos. Nós analisamos as citocinas e quimiocinas presentes na cavidade peritoneal por ensaio multiplex do fluido de lavagem peritoneal (Figura 11 D). MCP-1, MIP1α, G-CSF e KC aumentaram rapidamente após a injeção; níveis de Eotaxina permaneceram inalterados e IL12p40 foi detectada em concentrações mais elevadas após 6 dias. As concentrações de IL12p70, IFNy, IL1 A, IL2, IL3, IL4, IL-5, IL-10, IL17, GM-CSF e TNFa estavam abaixo do limite de detecção enquanto que as concentrações de IL1β, IL6, IL9, IL13, MIP1β e RANTES puderam ser mesuradas, mas a produção foi comparável entre os grupos rBCG e pBCG. Assim, a rBCG e pBCG induziram o recrutamento de APCs, bem como a produção de citocinas e quimiocinas no local de administração de uma forma semelhante. Curiosamente, as proporções de células T yõ secretoras de IL17 e células NK produtoras de IFNy foram mais abundantes após a administração de rBCG.

A VACINAÇÃO COM RBCG GERA CÉLULAS PRODUTORAS DE IL17 EM HUMANOS

[048] Por último, analisamos células mononucleares do sangue periférico (PBMC) de voluntários humanos saudáveis em um ensaio clínico de fase I para interrogar se a produção de IL17 foi maior nos participantes do estudo vacinados com rBCG. O sangue de voluntários foi coletado 29 dias após a imunização com rBCG ou pBCG e as PBMCs foram isoladas e congeladas. As PBMCs foram descongeladas e descansadas durante a noite, seguido pela reestimulação 20 horas com PPD. A produção de citocinas foi analisada pelo ensaio Multiplex.A produção de IL17 foi detectada exclusivamente nas PBMCs a partir dos participantes do estudo imunizados com rBCG (Figura 12). È importante observar que havia um número limitado de amostras disponíveis.

DISCUSSÃO

[049] A identificação de marcadores imunológicos de proteção é crucial para o desenho racional de novas vacinas para a TB. Estes marcadores também podem estabelecer a base para a definição de marcadores substitutos para predizer desfechos da evolução clínica da tuberculose em ensaios de eficácia da vacina e, desse modo, fornecer orientações para melhoria das atuais vacinas candidatas. A importância de citocinas chave que ativam macrófagos com capacidades antimicobacteriana incluindo IFNy (21) e TNFα (22), e a necessidade da IL-2 para a expansão de células de memória (23) estão bem estabelecidas e, portanto, são utilizadas para monitorar estudos de vacinas contra a tuberculose.

[050] Na tentativa de identificar biomarcadores da eficácia de vacina, nós comparamos as respostas imune de memória de longo prazo suscitada pela rBCG, que provou conferir proteção superior sobre sua linhagem parental, a pBCG. As respostas diferiam em termos tanto quantitativos como qualitativos. Detectamos abundância aumentada de citocinas tipo 1, bem como de IL17 após à vacinação com a rBCG no pulmão (Figura 2A). A análise de respostas imunes induzidas pela vacina no pulmão obviamente não é possível no âmbito dos ensaios clínicos. Portanto, nós também analisamos as respostas de memória a longo prazo sistêmicas (Figura 2B). Interessantemente, concentrações comparáveis de citocinas tipo 1 foram detectadas em ambos os grupos, pBCG e rBCG. Em contraste, a produção de IL17 pelos esplenócitos estava significativamente elevada no grupo vacinado com rBCG. Assim, podemos concluir que a IL17, ao invés do IFNy ou IL-2, pode ser considerada um marcador de proteção superior induzida pela rBCG.

[051] As células Th17 contribuem para a defesa antimicrobiana, atraindo e ativando neutrófilos (24), que estão entre as primeiras células a serem recrutadas em resposta à IL17. Foi demonstrado que a IL17 é dispensável durante a infecção primária pelo MTB (25,26), mas ganha importância nas respostas de memória (13). Além disso, divulgações recentes sobre a expressão de CCR6 em células Th17 humanas (27,28) apontam para um ciclo de feedbackpositivo, pois o CCR6 é o receptor para CCL20 produzido pelos neutrófilos (29) e o complexo CCL20-CCR6 tem sido implicado na imunopatogênese da TB (30). Assim, as células Th17 poderiam facilitar o recrutamento acelerado de células T antígeno-específicas de memória para os locais de residência bacteriana. Ao analisar as respostas imunes induzidas pela vacina 7 dias após a infecção pelo aerossol com MTB, verificamos que a vacinação com rBCG realmente leva ao recrutamento acelerado de células efetoras para os sítios de replicação bacteriana. Nós observamos aumento das frequências de células T CD4 antígeno-específicas e elevada produção de IL2, IL17, IFNy e GM-CSF pelas células do pulmão (Figura 3) e células do baço (Figura 4).

[052] As células T CD4 multifuncionais coprodutoras de IL2, IFNy e TNFα foram implicados pela primeira vez em estratégias de vacinação bem sucedidas contra a Leishmania major (14) e mais tarde também contra o MTB (31). Recentemente, estas células T CD4 polifuncionais também foram detectadas em ensaios clínicos de vacina para tuberculose (32,33). Nós detectamos células T CD4 polifuncionais após a vacinação com rBCG e pBCG e subsequente infecção (Figura 3 e 4), enquanto a composição de citocinas (IL2, IL17, TNF e IFNy) em células triplas e duplas produtoras variaram consideravelmente entre os experimentos, bem como os animais individuais. Se as células multifuncionais eram um verdadeiro correlato de proteção, então, suas frequências gerais, que foram maiores no grupo rBCG, ao invés de sua composição, parecem mais relevantes.

[053] Por que a rBCG induz uma resposta Th17? A imunização com rBCG e pBCG causou o recrutamento de APC, bem como de produtores de quimiocinas e citocinas em uma extensão semelhante. Curiosamente, as proporções de células T yõ secretoras de IL17 e células NK produtoras de IFNy foram mais abundantes mais elevadas após a administração de rBCG. Isto é consistente com divulgações que mostram que a IL17 pode ser produzida rapidamente por células T yõ (34,18), bem como as células NK (35). As células NK, que foram igualmente aumentadas após a vacinação com rBCG, são uma importante fonte de IFNy precoce. Nós já demonstramos que diferentes componentes moleculares liberados a partir da rBCG residem no citoplasma de macrófagos infectados (12). A Nod-2 é um importante PRR citosólico e sua atuação tem sido associada ao desenvolvimento de respostas de células T de memória Th17 (19).

[054] A apoptose induzida durante a infecção bacteriana induz células Th17 (36). Obtivemos evidências de que a rBCG induz o aumento da apoptose em comparação com a pBCG (12), o que pode contribuir ainda mais para o aumento do desenvolvimento de células Th17. A ativação de inflamassomos também poderia contribuir para respostas de memória Th17 via produção de IL1 β (37). Foi descoberto que a NLRP3, por exemplo, detecta a presença de listeriolisina através de mudanças nos níveis de ATP (38). Assim, a indução de células Th17 após a vacinação com rBCG pode exigir uma complexa interação de estímulos intracelulares e apoptose aumentada.

[055] As células Th17 são consideradas fundamentais para doenças inflamatórias e autoimunes, tais como artrite induzida por colágeno (39), a EAE (40, 39) e a hipersensibilidade das vias respiratórias alérgicas (41,39) ao invés de serem benéficas para a vacinação bem sucedida. Este papel patogênico está geralmente associado com o desenvolvimento de uma profunda resposta inflamatória mediada pela IL21. Nós nunca detectamos a IL21 após a vacinação e subsequente infecção por MTB em valores acima dos níveis de fundo em todos os experimentos (Figura 10a). Além disso, nunca foram observados sinais de autoimunidade ou inflamação excessiva no local da injeção após a vacinação com a rBCG, e nem no pulmão até 200 dias após a infecção pelo MTB.

[056] Em uma primeira tentativa de comparar os dados da TB experimental em camundongos com dados humanos, foram analisados perfis de citocinas de PBMCs congeladas a partir de um ensaios clínicos de fase I com rBCG e pBCG. Em um pequeno número de amostras, nós detectamos a produção de IL17 após a vacinação com rBCG, mas não após a vacinação com pBCG. As células Th17 foram detectadas no sangue periférico de humanos infectados com MTB (17). Recentemente, as células T CD4 produtoras de IL17 foram descritas em adolescentes vacinados com uma vacina candidata contra a tuberculose constituída por vírus vaccinia Ankara modificado expressando Ag85A (33). Respostas com picos entre os dias 7 e 28 após a vacinação, seguido de declínio. Isto está de acordo com os nossos dados mostrando elevada produção de IL17 no dia 29 após a vacinação no grupo rBCG (Figura 12). Assim, é tentador propor a IL17 como um correlato de proteção em ensaios de vacinas contra a TB.

[057] Em resumo, demonstramos que a vacinação com rBCG induz à geração preferencial de células Th17, provavelmente dependente do reconhecimento intracelular de componentes bacterianos por Nod-2. Estas células Th17, por sua vez, aceleram o recrutamento de células T antígeno- específicas para o pulmão. Finalmente, esta cascata de eventos resulta na contenção precoce do MTB e, portanto, uma proteção superior pela rBCG, em comparação com a pBCG. Nós detectamos a produção de IL17 exclusivamente por PBMCs de voluntários vacinados com rBCG em um estudo clínicos de fase I concluído com êxito. Uma vez que a IL17 parece fundamental para o recrutamento acelerado de células T antígeno-específicas para os locais de replicação do MTB, futuras vacinas contra a TB devem ser adaptadas para induzirem concomitantemente respostas equilibradas Th1 e Th17. LISTA DE REFERÊNCIA 1. Tuberculosis Fact Sheet N°104 ; Março. WHO. 2010; 2. Calmette A. 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Claims (11)

1. MÉTODO PARA DETERMINAÇÃO DA EFICÁCIA DE UMA VACINA VIVA DE MICOBACTÉRIA RECOMBINANTE, caracterizado por compreender a determinação da resposta imune de células T auxiliares tipo 17 (Th17) em um sujeito vacinado, em que uma resposta imune Th17 detectável é indicativa de imunidade protetora no referido sujeito.

2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela vacina ser uma Mycobacterium recombinante que compreende uma molécula de ácido nucleico recombinante que codifica um polipeptídeo de fusão que compreende (a) um domínio capaz de suscitar uma resposta imune e (b) um domínio de escape fagolisossomal.

3. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pela Mycobacterium ser deficiente em urease.

4. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pela Mycobacterium ser rBCGΔUreC :: Hly+:: Hyg+.

5. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela vacina ser uma vacina de subunidade.

6. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pela vacina ser uma vacina contra infecções micobacterianas, particularmente infecções micobacterianas pulmonares, mais particularmente tuberculose.

7. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pela determinação da resposta imune Th17 compreender submeter uma amostra que compreende células imunes do referido sujeito vacinado a uma reestimulação com um imunógeno correspondente ao imunógeno na referida vacina e determinar a presença e/ou quantidade de células associadas à resposta imune Th17 na referida amostra.

8. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pela determinação da resposta imune Th17 compreender a determinação de IL17, por exemplo, por métodos imunológicos.

9. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo sujeito ser um mamífero, por exemplo, um humano.

10. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pela resposta imune Th17 ser determinada 20 a 50 dias após a vacinação.

11. KIT DE REAGENTES para determinação da eficácia de uma vacina viva de micobactéria recombinante de acordo com o método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado por compreender (a) um reagente para a reestimulação de células imunes de um sujeito previamente vacinado e (b) um reagente para a detecção de uma resposta imune Th17.

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