JP6055780B2

JP6055780B2 - 抗マイコバクテリアのワクチン接種の有効性の判定

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Publication number: JP6055780B2
Application number: JP2013545368A
Authority: JP
Inventors: クリスティアーネディーゼル; ステファンエイチ．イー．カウフマン; シルケバンデルマン; リンダーグローデ
Original assignee: マックス−プランク−ゲゼルシャフトツールフェルデルンクデルヴィッセンシャフテンエー．ファウ．; ワクチンプロジェクトマネジメントゲーエムベーハー
Priority date: 2010-12-21
Filing date: 2011-12-21
Publication date: 2016-12-27
Anticipated expiration: 2031-12-21
Also published as: CU20130084A7; CN103492877A; CA2822715C; AU2011347266A1; DK2656070T3; PT2656070E; HRP20160558T1; MX2013007244A; SG191331A1; AU2011347266B2; EA201300738A1; ES2569035T3; CY1117412T1; SI2656070T1; CA2822715A1; EP2656070B1; KR101882040B1; RS54770B1; EA029833B9; UA113282C2

Description

本発明は、ワクチン、特に結核ワクチンの有効性を判定するための方法および試薬に関する。

毎年、最大で２００万人までが、結核（ＴＢ）により死亡する（１）。ＴＢに対して利用可能なただ一つのワクチンは、ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｂｏｖｉｓＢａｃｉｌｌｕｓＣａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ（ＢＣＧ）であり、１９２１年に初めてヒトで用いられた（２）。これまでに、４０億回のＢＣＧが投与されて、それを、世界中で最も広く用いられるヒトワクチンにしてきた（３）。しかしながら、我々はまだ、決してＴＢの根絶を達成したわけではない。ＢＣＧワクチン接種は、乳幼児での結核性髄膜炎および粟粒結核症を防止する（４）。しかしながら、ＴＢの他の形態、とりわけ青年期および成人での肺のＴＢに対する防御は、成人での０〜８０％の範囲の防御の有効性を明らかにしたメタ分析で強調されるとおり決定的ではない（５）。したがって、ＴＢに対する新しいワクチンが緊急に必要とされる。現在、臨床試験中のＴＢに対する新しいワクチン接種の戦略は、標準的なＢＣＧを置き換えるための組み換えＢＣＧ、ならびにＢＣＧの初回投与をブーストするための、サブユニットワクチン、および非複製性のウイルスベクターに基づくワクチンを含む（６）（７）。

防御に潜在する免疫学的メカニズムの同定は、ＴＢ予防のための新規のワクチン接種の戦略の合理的なデザインを促進することができる。さらに、この戦略は、臨床のＴＢワクチン有効性試験における臨床転帰の代替エンドポイントを明らかにすることが可能な防御免疫を示すバイオマーカーを明らかにすることができ、そして、したがって、それらの持続時間を減少させ、そして、並行試験での、より多くの数のワクチン候補の試験を促進する。新しく感染されたＴＢ患者の健常接触者、およびＢＣＧワクチン接種された乳幼児に着目した観察研究が、そのようなバイオマーカーを決定するために開始された（８）。ＴＢに対する免疫応答に関する広範囲の研究にもかかわらず、防御メモリーの基本要素は、まだ解明されていない。ＢＣＧワクチン接種後、抗原特異的なメモリーＣＤ４Ｔ細胞は、免疫優性抗原の不足のせいで、検出するのが困難である。現在、最も広く用いられるバイオマーカーは、ＣＤ４Ｔ細胞の亢進されたＩＦＮγ産生頻度に基づく。ＴＢにおける防御の関連要因としてのＩＦＮγの価値に疑問を投げかける証拠が増加している（９、１０）。疑いの余地なく、ＩＦＮγは、ＭＴＢに対する防御において、確かに重要な役割を果たすが（１１）、ＩＦＮγのみの判定は、もはや、防御免疫の信頼できるマーカーとして考えることができない。

ファゴリソソームエスケープドメインを発現する組み換えＢＣＧ株は、ＷＯ９９／１０１４９６に記載され、その内容は参照により本明細書中に援用される。ファゴリソソームエスケープドメインは、ファゴソームの膜を穿孔することによって、感染した宿主細胞のファゴソームからこの株が逃れることを可能にする。最適なファゴリソソームエスケープ活性のための酸性のファゴソームのｐＨを提供するために、ウレアーゼ欠損組み換え株が開発された。この株は、ＷＯ２００４／０９４４６９に開示され、その内容は本明細書中に援用される。

Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの膜穿孔性リステリオリシン（Ｈｌｙ）を発現し、ウレアーゼＣを欠いている、組み換えΔｕｒｅＣＨｌｙ^＋ｒＢＣＧ（ｒＢＣＧ）株は、前臨床モデルにおいて、ＭＴＢでの吸入チャレンジ（ａｅｒｏｇｅｎｉｃｃｈａｌｌｅｎｇｅ）に対して、親ＢＣＧ（ｐＢＣＧ）と比較して優れた防御を誘導する（１２）。このワクチン構築物は、第Ｉ相臨床試験において安全性と免疫原性の証明に成功しており（ＵＳ６１／３８４，３７５）、その内容は参照により本明細書中に援用される。

本研究では、ｒＢＣＧおよびｐＢＣＧが、顕著なＴｈ１免疫応答を誘導し、一方で、ｒＢＣＧのみが誘導するのは、加えて、重大なＴｈ１７応答であることが示される。ｒＢＣＧワクチン接種されたマウスのＭＴＢ感染時に、抗原特異的Ｔリンパ球の肺への早期の動員も観察された。これらのＴ細胞は、再刺激後に、大量のＴｈ１サイトカインを産生した。ｒＢＣＧの優れた防御の有効性は、見かけ上、ＩＬ１７に依存した。ｐＢＣＧではなくｒＢＣＧワクチン接種後の亢進されたＩＬ１７産生は、第Ｉ相臨床試験中に、健常ボランティアでも検出された。本発明者らの知見は、サブユニットワクチン候補によって探索されることもできる、ＴＢに対する改良されたワクチン接種の戦略のためのマーカーとしての、一般的な免疫学的経路を同定する。

本発明の要旨は、ワクチンの有効性を判定するための方法であって、
ワクチン接種された対象でのＴｈ１７免疫応答を判定するステップを含み、
ここで、Ｔｈ１７免疫応答の存在は、前記対象での防御免疫に関する指標であることを特徴とする、方法である。

本発明のさらなる態様は、少なくとも１つの、Ｔｈ１７免疫応答を検出するための試薬を含む、ワクチンの有効性を判定するための試薬キットである。

好ましい実施態様では、ワクチンは、生ワクチン、特に、マイコバクテリウム細胞である。さらにより好ましい実施態様では、ワクチンは、（ａ）免疫応答を誘導することが可能なドメイン、および、（ｂ）ファゴリソソームエスケープドメインを含む融合ポリペプチドをコードする組み換え核酸分子を含む、組み換えマイコバクテリウムである。免疫応答を誘導することが可能なドメインは、好ましくは、病原体またはその免疫原性フラグメント由来の免疫原性ペプチドまたはポリペプチドである。さらなる実施態様では、ワクチンは、サブユニットワクチン、すなわち病原体由来の精製された抗原またはその免疫原性フラグメント、特に組み換え抗原またはその免疫原性フラグメントを含むワクチンである。さらに、さらなる実施態様では、ワクチンは、不活化された病原体細胞全体または細胞画分に基づくワクチンである。

ＷＴマウスでのＭＴＢ負荷。皮下（ｓ．ｃ．）免疫付与は、ＭＴＢでの持続的感染（ｐ．ｉ．）９０日の感染から防御する（Ａ）。持続的感染（ｐ．ｉ．）７日では、細菌負荷は、ワクチン接種されたグループとワクチン接種されていないグループとの間で、同等である（Ｂ）。４００ＣＦＵのＭＴＢでのエアロゾル感染後の肺および脾臓におけるＣＦＵ測定。心肺葉（臓器全体の約７１／１０^ｔｈ）または脾臓の半分がホモジナイズされた；残りの材料は、インビトロの再刺激分析に用いられた。両側Ｐ値でのマンホイットニー検定により判定された統計的有意性。^★Ｐ<０．０５；^★★Ｐ<０．０１。データは、同様の結果を有する３つの実験を代表する。ｐＢＣＧワクチン接種後よりも優れた、ｒＢＣＧワクチン接種後のサイトカイン誘導。ｒＢＣＧまたはｐＢＣＧでの皮下（ｓ．ｃ．）ワクチン接種後８３日の、肺（Ａ）および脾臓（Ｂ）での応答。合計２．５×１０^５（肺）または２×１０^６細胞（脾臓）が、ＰＰＤで２０時間再刺激されて、上清が多重分析により分析された。サイトカイン濃度は、それぞれ３回再現した４つの独立の実験の平均±標準誤差として示される。培地コントロールからのバックグラウンドのサイトカイン産生が差し引かれた。ＡＮＯＶＡおよびボンフェローニ多重比較検定が、統計的分析のために用いられた。^★Ｐ<０．０５；^★★Ｐ<０．０１。ｒＢＣＧでのワクチン接種は、ＭＴＢでのエアロゾル感染時に、抗原特異的Ｔ細胞の、肺への動員を促進する。２００〜４００ＣＦＵのＭＴＢでのエアロゾル感染後７日の、肺細胞によるサイトカイン分泌。合計２×１０^５細胞が、ＰＰＤで２０時間刺激されて、上清が多重分析により分析された（Ａ）。サイトカイン濃度は、それぞれ３回再現した２つの独立の実験の平均±標準誤差として示される。培地コントロールからのバックグラウンドのサイトカイン産生が差し引かれた。ブレフェルジンＡの存在下で、ＰＰＤで６時間再刺激された細胞が、多色フローサイトメトリーによって分析された（Ｂ）。応答性ＣＤ４Ｔ細胞の頻度は、それぞれ３回再現した３つの独立の実験の平均±標準誤差として示される。ＡＮＯＶＡおよびボンフェローニ多重比較検定が、統計的分析に用いられた。^★Ｐ<０．０５；^★★Ｐ<０．０１；^★★★Ｐ<０．００１。ｒＢＣＧでのワクチン接種は、ＭＴＢでのエアロゾル感染時に、脾臓でのＰＰＤ特異的な応答を増加させる。２００〜４００ＣＦＵのＭＴＢでのエアロゾル感染後７日の、脾臓細胞によるサイトカイン分泌。合計２×１０^６細胞が、ＰＰＤで２０時間再刺激されて、上清が多重分析により分析された（Ａ）。サイトカイン濃度は、それぞれ３回再現した４つの独立の実験の平均±標準誤差として示される。培地コントロールからのバックグラウンドのサイトカイン産生が差し引かれた。ブレフェルジンＡの存在下で、ＰＰＤで６時間再刺激された細胞が、多色フローサイトメトリーによって分析された（Ｂ）。応答性ＣＤ４Ｔ細胞の頻度は、それぞれ３回再現した３つの独立の実験の平均±標準誤差として示される。ＡＮＯＶＡおよびボンフェローニ多重比較検定が、統計的分析に用いられた。^★Ｐ<０．０５；^★★Ｐ<０．０１；^★★★Ｐ<０．００１。ｐＢＣＧまたはｒＢＣＧでのワクチン接種は、Ｔｒｅｇ細胞の集団に有意な変化をもたらさない。ｒＢＣＧまたはｐＢＣＧでの皮下（ｓ．ｃ．）免疫付与後の脾臓におけるＴｒｅｇ細胞。黒い棒は、ＣＤ２５^＋ＦｏｘＰ３^＋を表し、白い棒は、ＣＤ２５⁻ＦｏｘＰ３^＋細胞を表す。免疫付与後８３日（ＡとＢ）および７日（ＣとＤ）、または、２００〜４００ＣＦＵのＭＴＢでのエアロゾル感染後９０日（ＥとＦ）の、ＣＤ４Ｔ細胞およびＣＤ８Ｔｒｅｇ細胞の頻度。平均±標準誤差として示された、グループあたり３マウス。データは、同様の結果を有する３つの独立の実験を代表する。ワクチン接種および後に続くＭＴＢでのエアロゾル感染後に、肺でサイトカインを産生するＣＤ８Ｔ細胞の頻度。２００〜４００ＣＦＵのＭＴＢでのエアロゾル感染後７日の、サイトカイン分泌。ブレフェルジンＡの存在下で、ＰＰＤで６時間再刺激された細胞が、多色フローサイトメトリーによって分析された。応答性ＣＤ８Ｔ細胞の頻度は、それぞれ３回再現した２つの独立の実験の平均±標準誤差として示される。ＡＮＯＶＡおよびボンフェローニ多重比較検定が、統計的分析に用いられた。ワクチン接種および後に続くＭＴＢでのエアロゾル感染後に、脾臓でサイトカインを産生するＣＤ８Ｔ細胞の頻度。２００〜４００ＣＦＵのＭＴＢでのエアロゾル感染後７日の、サイトカイン分泌。ブレフェルジンＡの存在下で、ＰＰＤで６時間再刺激された細胞が、多色フローサイトメトリーによって分析された。応答性ＣＤ８Ｔ細胞の頻度は、それぞれ３回再現した４つの独立の実験の平均±標準誤差として示される。ＡＮＯＶＡおよびボンフェローニ多重比較検定が、統計的分析に用いられた。^★Ｐ<０．０５；^★★Ｐ<０．０１；^★★★Ｐ<０．００１。ｒＢＣＧワクチン接種されたマウスでの、持続的なＭＴＢ感染の間の、肺における免疫応答。２００〜４００ＣＦＵのＭＴＢでのエアロゾル感染後９０日の、肺細胞によるサイトカイン分泌。細胞はＰＰＤで２０時間再刺激されて、上清が多重分析により分析された（Ａ）。サイトカイン濃度は、それぞれ３回再現した２つの独立の実験の平均±標準誤差として示される。培地コントロールからのバックグラウンドのサイトカイン産生が差し引かれた。ブレフェルジンＡの存在下で、ＰＰＤで６時間再刺激された細胞が、多色フローサイトメトリーによって分析された（Ｂ）。応答性ＣＤ４Ｔ細胞の頻度は、それぞれ３回再現した２つの独立の実験の平均±標準誤差として示される。ＡＮＯＶＡおよびボンフェローニ多重比較検定が、統計的分析に用いられた。^★Ｐ<０．０５；^★★Ｐ<０．０１。ワクチン接種および後に続くＭＴＢでのエアロゾル感染後に、サイトカインを産生するＣＤ８Ｔ細胞の頻度。２００〜４００ＣＦＵのＭＴＢでのエアロゾル感染後９０日の、肺から単離された細胞による、サイトカイン分泌。ブレフェルジンＡの存在下で、ＰＰＤで６時間再刺激された細胞が、多色フローサイトメトリーによって分析された。応答性ＣＤ８Ｔ細胞の頻度は、それぞれ３回再現した２つの独立の実験の平均±標準誤差として示される。ＡＮＯＶＡおよびボンフェローニ多重比較検定が、統計的分析に用いられた。^★Ｐ<０．０５。ワクチン接種は、ＩＬ２２産生を誘導するが、ＩＬ２１産生は誘導しない。ワクチン接種および後に続く２００〜４００ＣＦＵのＭＴＢでのエアロゾル感染後８３日のマウスの脾臓（２×１０^６細胞）または肺（２×１０^５細胞）由来の細胞による、ＩＬ２１（Ａ）およびＩＬ２２（Ｂ）分泌。平均±標準誤差が示された、グループあたり３サンプルから測定されたＩＬ２１濃度。１グループ由来のＩＬ２２サンプルに関しては、プールされた。データは、２つ（ワクチン接種後８３日）および５つ（持続的感染（ｐ．ｉ．）７日）の同様な実験を代表する。細胞はＰＰＤで２０時間再刺激されて、上清がＥＬＩＳＡにより分析された。ｒＢＣＧは、有意にＡＰＣの集団を変化させることなく、γδＴ細胞およびＮＫ細胞の増加された動員を生じさせる。１０^６ＣＦＵのｒＢＣＧまたはｐＢＣＧの腹腔内（ｉ．ｐ．）投与時に、腹膜腔へ動員された細胞。フローサイトメトリーによる、腹腔洗浄液中の細胞集団の分析。ｒＢＣＧまたはｐＢＣＧの腹腔内（ｉ．ｐ．）投与後５時間（上パネル）および６日（下パネル）に、腹膜へ動員されたＡＰＣ（Ａ）。注射後５時間の、Ｔ細胞集団のＩＣＳ（Ｂ）。細胞は、ブレフェルジンＡの存在下で、αＣＤ３／αＣＤ２８抗体で１８時間刺激された。投与後６日の、Ｔ細胞集団のＩＣＳ（Ｃ）。細胞は、ブレフェルジンＡの存在下で、ＰＰＤで１８時間再刺激された。グループあたり５マウスでの、３つの独立の実験の概要として示されたデータ。横線は、中央値を示す。ＡＮＯＶＡおよびボンフェローニ多重比較検定が、統計的分析に用いられた。^★Ｐ<０．０５；^★★Ｐ<０．０１。平均濃度±標準誤差として示された、多重分析により分析された、腹腔洗浄液中に検出されたサイトカインおよびケモカイン（Ｄ）。ｒＢＣＧは、第Ｉ相臨床試験の健常ボランティア由来のヒトＰＢＭＣにおいて、ＩＬ１７を誘導する。第Ｉ相臨床試験のヒト健常ボランティアから単離されたヒトＰＢＭＣによるＩＬ１７産生。ｒＢＣＧまたはｐＢＣＧでのワクチン接種後２９日に単離された、合計５×１０^５細胞は、ＰＰＤで２０時間再刺激されて、上清が多重分析により分析された。片側Ｐ値およびウェルチの補正を伴うマンホイットニー検定により判定された統計的有意性。^★Ｐ<０．０５；ｐＢＣＧに関してｎ＝３、および、ｒＢＣＧに関してｎ＝７。

マイコバクテリウム細胞は、好ましくはＭ．ｂｏｖｉｓ細胞、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ細胞、特に、弱毒化Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ細胞または他のマイコバクテリア、例えばＭ．ｍｉｃｒｏｔｉ、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ、Ｍ．ｃａｎｅｔｔｉｉ、Ｍ．ｍａｒｉｎｕｍまたはＭ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍである。さらに好ましくは、細胞は、組み換えＭ．ｂｏｖｉｓ（ＢＣＧ）細胞、特に、Ｄａｎｉｓｈ株の亜種Ｐｒａｇｕｅ（４３）由来の組み換えＭ．ｂｏｖｉｓ細胞である。特に好ましい実施態様では、ワクチンは、組み換えウレアーゼ欠損マイコバクテリウム細胞である。特に好ましい実施態様では、例えば、選択マーカー遺伝子によって破壊されたｕｒｅＣ遺伝子を含む自殺ベクター（ｓｕｉｃｉｄｅｖｅｃｔｏｒ）を構築して、そのベクターで標的細胞を形質転換し、そして、ウレアーゼ陰性の表現型を有する選択マーカー陽性の細胞をスクリーニングすることによって、マイコバクテリウム細胞のｕｒｅＣ配列が不活化される（ΔＵｒｅｃ）。最も好ましくは、細胞は、ｒＢＣＧ ΔＵｒｅｃ：：Ｈｌｙ^＋：：Ｈｙｇ^＋として特徴付けられる、組み換えＢＣＧの、Ｄａｎｉｓｈ株の亜型Ｐｒａｇｕｅである。

免疫応答を誘導することが可能なドメインは、好ましくは、Ｍ．ｂｏｖｉｓまたはＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来の免疫原性ペプチドまたはポリペプチド、または、少なくとも６、好ましくは少なくとも８アミノ酸、さらに好ましくは少なくとも９アミノ酸、そして例えば、最大で２０アミノ酸までの長さを有する、それらの免疫原性フラグメントから選択される。適切な抗原に関する具体例は、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来のＡｇ８５Ｂ（ｐ３０）、Ｍ．ｂｏｖｉｓＢＣＧ由来のＡｇ８５Ｂ（α−抗原）、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来のＡｇ８５Ａ、および、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来のＥＳＡＴ−６、およびそれらのフラグメントである。

ワクチンは、好ましくはマイコバクテリア感染、特に肺のマイコバクテリア感染、さらに特に結核に対するワクチンである。

本発明の方法によれば、ワクチン接種された対象でのＴｈ１７免疫応答が判定される。対象は、好ましくは哺乳類、例えばヒトである。判定は、好ましくは、前記対象由来の生物学的サンプル中で行われ、ここで前記サンプルは、免疫細胞、特にＴ細胞および／またはＮＫ細胞、さらに特に、ＣＤ４Ｔ細胞のような抗原特異的Ｔ細胞を含む。サンプルは、体液または組織サンプル、例えば血液、血清または血漿サンプル、または、肺または脾臓由来のサンプルであってよい。サンプルを採取する方法は、当技術分野でよく知られている。

本発明の方法は、Ｔｈ１７免疫応答の判定を必要とする。この目的のために、分析される対象におけるサンプル中に存在する免疫細胞を、免疫原で再刺激して、前記細胞からのサイトカイン発現を判定することが好ましい。分析されるべき細胞は、好ましくは抗原特異的Ｔ細胞、さらに好ましくはＣＤ４Ｔ細胞である。再刺激のための免疫原は、（その有効性が判定されるべき）ワクチン中に存在する免疫原に対応する。免疫原は、ワクチン中に存在する形態と同一の形態または異なる形態のいずれかで存在してよい。例えば、ワクチンが免疫原性ポリペプチドを含む場合は、再刺激のステップでの免疫原は、その免疫原性フラグメントを含んでよく、また逆の場合も同様である。好ましくは、再刺激のステップに用いられる免疫原は、精製されたポリペプチドまたはペプチドである。結核ワクチン、特に、上述の結核生ワクチンの有効性を試験するために、免疫原は、有利に、例えば、マイコバクテリアのグリセロール抽出物またはＡｇ８５ＡおよびＡｇ８５ＢであるＰＰＤ「精製されたタンパク質誘導体」から選択されるマイコバクテリアの抗原、ならびに、他のマイコバクテリアの抗原およびそれらの免疫原性フラグメント（上述のような）であってよい。

本発明による、Ｔｈ１７応答の判定は、表面マーカー、および、前記細胞中に存在し、および／または、前記細胞により分泌されるサイトカインを用いて、Ｔｈ１７応答と関連する細胞、例えばＩＬ−１７を産生する細胞を判定するステップを含んでよい。表面マーカーの例は、ＣＤ４、ＣＤ８、ＩＬ−２３Ｒ、ＣＣＲ４および／またはＣＣＲ６である。そのような細胞中に存在し、および／またはそのような細胞により分泌されるサイトカインの例は、ＩＬ−１７、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＦＮ−γおよびそれらの組み合わせである。好ましくは、サイトカインは、ＩＬ−１７である。そのような細胞は、細胞学的方法によって、例えば、蛍光基などの標識を有し得る、細胞表面マーカーおよび／またはサイトカインに特異的な抗体のような免疫学的検出試薬を用いた細胞ソーティング技術によって、判定されてよい。

さらに好ましくは、Ｔｈ１７免疫応答と関連する細胞は、例えば、ＩＬ−１７を産生し、場合により分泌するＣＤ４Ｔ細胞である。

さらなる実施態様では、Ｔｈ１７免疫応答の判定は、Ｔｈ１７免疫応答と関係がある細胞から分泌されるサイトカイン、例えばＩＬ−１７を判定するステップを含む。サイトカインは、適切な抗体、例えばＩＬ−１７に対する抗体を用いた免疫学的方法により、判定されてよい。

本発明の方法では、Ｔｈ１７免疫応答は、ワクチン接種後の適切な時に判定される。例えば、免疫応答は、ワクチン接種後２０−５０日、特に２５−３５日に判定されてよい。

本発明は、また、ワクチンの有効性を判定するための、特に上述の方法での使用のための、試薬キットに関する。試薬キットは、ワクチン接種された対象由来のサンプル中に存在する免疫細胞を再刺激するのに適切な免疫原を含む。さらに、試薬キットは、上述のＴｈ１７免疫応答マーカーを検出するのに適切な、少なくとも１つの試薬を含む。試薬は、例えば、細胞学的および／または免疫学的検出試薬、例えば、Ｔｈ１７免疫応答と関係がある細胞に特徴的な細胞マーカーに対する抗体、および／または、Ｔｈ１７免疫応答と関連するサイトカイン、特にＩＬ−１７および／またはＩＬ−２２に特異的な免疫学的試薬から選択されてよい。検出領域は、検出可能な基、例えば蛍光標識基を有してよい。

さらに、本発明は、以下の図および実施例により、より詳細に説明される。

［材料および方法］
［マウス］
雌ＢＡＬＢ／ｃマウスは、ベルリンのＢｕｎｄｅｓｉｎｓｔｉｔｕｔｆｕｒＲｉｓｉｋｏｂｅｗｅｒｔｕｎｇ（ＢｆＲ）で繁殖された。マウスは、実験の開始時に６〜８週齢であり、特定病原体不在（ＳＰＦ）の状態に維持された。動物実験は、ＬａｎｄｅｓａｍｔｆｕｒＧｅｓｕｎｄｈｅｉｔｕｎｄＳｏｚｉａｌｅｓ（ＬＡＧｅＳｏ、ベルリン、ドイツ）の承認を得て行われた。

［細菌］
用いられたＭＴＢＨ３７ＲｖおよびｐＢＣＧ株とｒＢＣＧ株は、以前に記載された（１２）。細菌は、グリセロール、０．０５％Ｔｗｅｅｎ８０とＡＤＣが補充されたＭｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ７Ｈ９ブロス中で培養された。中間対数（Ｍｉｄ−ｌｏｇａｒｉｔｈｍｉｃ）の培養物が回収されて、使用するまで−８０℃で保存された。全ての保存は、使用の前に滴定された。単細胞の細菌懸濁液が、２７Ｇニードルを有するシリンジを通した繰り返しの移行により得られた。

［ワクチン接種およびＭＴＢ感染］
ｐＢＣＧまたはｒＢＣＧ（１０^６ＣＦＵ）は、尾の基部にごく接近して皮下投与（ｓ．ｃ．）された。ＭＴＢでのマウスの吸入感染が、Ｇｌａｓ−Ｃｏｌ吸入チャレンジシステムを用いて行われた。細菌負荷は、ＰＢＳ０．５％ｖ／ｖＴｗｅｅｎ８０中での、無菌的に除去された臓器の機械的破砕およびＯＡＤＣが補充されたＭｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ７Ｈ１１寒天プレート上に段階希釈でプレーティングすることにより、評価された。３週間後、ＭＴＢコロニーが数えられた。結果の統計的有意性は、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ５．０を用いて、ノンパラメトリックデータに関する両側Ｐ値でのマンホイットニー検定により判定された。

［細胞単離、刺激およびフローサイトメトリー］
細胞は、以前に記載されるとおりに（４２）、精製された。実験グループは、５マウスからなる。２つの脾臓または肺がプールされて、１つのサンプルが個々に処理されて、後に続く刺激のために、５マウスのグループあたり３つのサンプルをもたらした。細胞は、多重分析によるサイトカイン分析のために５０μｇ／ｍｌのＰＰＤ（ＳＳＩ、コペンハーゲン、デンマーク）で２０時間、または、細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）のために２５μｇ／ｍｌのブレフェルジンＡの存在下で６時間、刺激された。以下の抗体が用いられた：ＣＤ４（ＲＭ４−５）、ＩＦＮγ（ＸＭＧ−１．２）、ＩＬ２（ＪＥＳ６−５Ｈ４）、Ｌｙ６Ｇ／Ｃ（ＲＢ６−８Ｃ５）、ＣＤ１１ｂ（Ｍ１／７０）、γδ−ＴＣＲ（ＧＬ−３）、ＦｏｘＰ３染色セットおよびＣＤ４９ｂ（ｃｌｏｎｅＤＸ５）、全てｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ。ＣＤ８α（ＹＴＳ１６９）、ＴＮＦ−α（ＸＴ２２）、ＣＤ１６／ＣＤ３２（２．４Ｇ２）、Ｆ４／８０（ＣＩ：Ａ３−１）およびＣＤ１１ｃ（Ｎ４１８）は、ハイブリドーマ上清から精製されて、自家で（ｉｎｈｏｕｓｅ）蛍光標識された。ＩＬ−１７（ＴＣ１１−１８Ｈ１０）はＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから取得された。細胞は、ＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩまたはＬＳＲＩＩフローサイトメーターおよびＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェア（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析された。サイトカインは、メーカーの使用説明書にしたがって、Ｂｉｏ−Ｒａｄからの、Ｂｉｏ−ＰｌｅｘＭｏｕｓｅＴｈ１／Ｔｈ２、ＩＬ１７およびＩＬ６ビーズに基づくイムノアッセイを用いて測定された。ＩＬ２１およびＩＬ２２は、Ｒ&ＤｓｙｓｔｅｍｓからのＥＬＩＳＡによって測定された。ヒトＩＬ１７は、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅからのＭｉｌｌｉｐｌｅｘ４２−ｐｌｅｘアッセイで検出された。

［腹腔洗浄］
ｐＢＣＧまたはｒＢＣＧは、中間対数の培養物から新しく調製された。細菌はＰＢＳで３回洗浄されて、濃度が、５８０ｎｍでの光学濃度を測定することにより判定された。１０^６ＣＦＵの投与が、腹腔内に行われた。動員された細胞は、５時間または６日後に、５ｍｌのＰＢＳの注射により腹膜腔から得られて、フローサイトメトリーにより分析された。洗浄液中のサイトカインおよびケモカインは、Ｂｉｏ−ＲａｄからのＢｉｏ−ＰｌｅｘＭｏｕｓｅＣｙｔｏｋｉｎｅ２３−ｐｌｅｘキットを用いて判定された。

［結果］
［ｒＢＣＧおよびｐＢＣＧワクチン接種後のＴｈ１／Ｔｈ１７応答］
ＴＢワクチンの有効性に関連のある免疫のメカニズムを解明する試みにおいて、本発明者らは、マウスにおけるｒＢＣＧおよびｐＢＣＧに対する免疫応答を比較した。ｒＢＣＧの優れた防御の有効性は、当初は、経静脈（ｉ．ｖ．）免疫付与後に判定された（１２）。ここで、本発明者らは、ｒＢＣＧの皮下（ｓ．ｃ．）投与が、匹敵するレベルの防御を誘導し、ｐＢＣＧよりも優れた有効性を保持したことを示す（図１Ａ）。次に、本発明者らは、ｒＢＣＧまたはｐＢＣＧでの皮下（ｓ．ｃ．）ワクチン接種後８３日の、マウスの肺および脾臓における長期のメモリー応答を分析した。細胞は、ＰＰＤで再刺激されて、上清が、サイトカインに関する多重分析により分析された。ｒＢＣＧでの免疫付与は、ｐＢＣＧと比較して、有意により高い、肺から単離された細胞によるサイトカイン産生を誘導した（図２Ａ）。これらは、ＩＦＮγ、ＩＬ２、ＩＬ６、およびＧＭ−ＣＳＦを含んだ。対照的に、タイプ２サイトカインＩＬ４、ＩＬ５およびＩＬ１０は、バックグラウンドのレベルを超えては増加しなかった（データ示さず）。興味深いことに、およそ３倍高いＩＬ１７濃度が、ｒＢＣＧワクチン接種されたマウス由来の肺細胞により産生された。感染されていないマウスの肺からは、ほんの少しの細胞しか単離され得なかったことに留意されたい。その結果として、全体のサイトカイン濃度は、ウェルあたり１０倍高い細胞密度を刺激のために用いることができた脾臓よりも低かった（図２Ｂ）。脾臓では、ＩＬ２、ＩＬ６、ＩＦＮγおよびＧＭ−ＣＳＦの同程度の濃度により示されるように、両方のワクチンが同様に強いＴｈ１応答を誘導した。しかしながら、ｒＢＣＧワクチン接種されたマウス由来の脾臓細胞は、ＰＰＤでの再刺激の際に、ｐＢＣＧワクチン接種された動物と比較して、有意に、より多いＩＬ１７を産生した。このように、ｐＢＣＧではなくｒＢＣＧでの免疫付与は、肺および脾臓での同時かつ強いＴｈ１およびＴｈ１７応答を誘導し、それは長期間持続した。

［ｒＢＣＧワクチン接種されたマウスにおける、毒性ＭＴＢでの感染時の、ＭＴＢ特異的なＴ細胞の促進された動員］
Ｔｈ１７細胞は、改良された免疫監視に関係している（１３）。本発明者らは、ワクチン接種された動物における、毒性ＭＴＢでのエアロゾル感染時の、感染後７日の肺および脾臓での、抗原特異的なＴ細胞の応答を比較した。ｒＢＣＧワクチン接種されたマウス由来の肺細胞による、際立ったＩＦＮγ、ＩＬ１７、ＩＬ２およびＧＭ−ＣＳＦ産生が、ＰＰＤ（図３Ａ）またはＡｇ８５Ａペプチド（データ示さず）での再刺激後２０時間に検出された。対照的に、これらのサイトカインは、ｐＢＣＧワクチン接種されたマウス由来の細胞からは、ほとんど分泌されなかった。ＭＴＢで感染された、ワクチン接種されていない動物では、サイトカイン産生は検出限界よりも下であり、ＭＴＢ特異的なＴ細胞は、ＭＴＢ感染後３週間前は現れないという以前の報告（１３）と一致した。タイプ２サイトカインＩＬ４、ＩＬ５およびＩＬ１０は検出されず、ＴＮＦα、ＩＬ１２ｐ７０およびＩＬ６は、ＭＴＢチャレンジ後の、この早い時点において、かろうじてバックグラウンドレベルよりも上なだけであった（データ示さず）。

本発明者らは、ＭＴＢ感染後７日に、フローサイトメトリーによって、肺のＴ細胞によるサイトカイン産生を判定した（図３Ｂ）。細胞はＰＰＤで６時間刺激されて、ＩＬ２、ＩＬ１７、ＩＦＮγおよびＴＮＦαに関する細胞内サイトカイン染色が続いた。ワクチン接種されていないコントロールでは、少ない割合のＣＤ４Ｔ細胞が、ＩＬ２、ＴＮＦαまたはＩＦＮγを産生した。ワクチン接種されたマウスでは、ＣＤ４Ｔ細胞は、ＩＬ２、ＩＦＮγ、ＴＮＦαおよびＩＬ１７をも、分泌した。単一のサイトカインを産生する細胞の頻度は、有意ではないが、ｒＢＣＧグループにおいて最も高かった。ワクチン接種された動物において、本発明者らは、防御免疫に関与する多機能Ｔ細胞（１４）を検出した。多重のサイトカインを産生するＴ細胞は、主に、ＩＬ２^＋ＴＮＦα^＋の二重プロデューサーであり、ｒＢＣＧワクチン接種時に有意に増加した。三重プロデューサー細胞は、ほぼ例外なくＩＬ２^＋ＩＦＮγ^＋ＴＮＦα^＋であり、ｐＢＣＧワクチン接種されたマウスと比較して、ｒＢＣＧにおいてわずかに増加した。また、ＩＬ２^＋ＴＮＦα^＋ＩＦＮγ^＋ＩＬ１７^＋四重陽性細胞は、非常に低い頻度であるが、ｒＢＣＧグループにおいてのみ現れた。

原理上、脾臓のＴ細胞は、肺のＴ細胞と同様のサイトカインパターンを産生した（図４）。ＩＬ２とＧＭ−ＣＳＦの産生は、ｐＢＣＧグループと比較して、ｒＢＣＧワクチン接種された動物において、有意により高く、ワクチン接種されていないコントロールで少ない割合のＣＤ４Ｔ細胞がＩＦＮγを産生したとしても、ワクチン接種されていないコントロールでは、検出レベルより低かった。要するに、ｐＢＣＧまたはｒＢＣＧのいずれかでのワクチン接種は、ｐＢＣＧグループと比較して、ｒＢＣＧワクチン接種されたマウスにおいて、より高い頻度の単一または多重プロデューサーでＩＦＮγおよびＴＮＦαを分泌するＣＤ４Ｔ細胞を誘導した。

持続的感染（ｐ．ｉ．）７日目に、ＣＤ４Ｔ細胞は、主要なサイトカインプロデューサーであった。；ＣＤ８サイトカインプロデューサーは、同様のパターンであるが、肺（図６）および脾臓（図７）において、より低い頻度で検出された。有意により高い頻度の、ＴＮＦαを単一に産生するＣＤ８Ｔ細胞が、ｒＢＣＧグループに検出されたことは、留意することである。

差示的なサイトカイン産生およびプロデューサー細胞の頻度は、肺および脾臓での同等のコロニー形成単位（ＣＦＵ）数により確認されるように（図１Ｂ）、感染後の、この早い時点での異なる細菌負荷のせいではなかった。Ｔｒｅｇ細胞の合計数は、２つのワクチン接種されたグループにおいて同程度に、感染時に増加した（図５）。

［ｒＢＣＧでのワクチン接種は、持続的な感染の間、強力な免疫応答を与える］
本発明者らは、肺の細菌負荷がｐＢＣＧグループと比較してｒＢＣＧで免疫付与された動物においておよそ１０倍低く、そしてワクチン接種されていないコントロールグループと比較して１００倍低い場合の、持続的感染（ｐ．ｉ．）９０日のＭＴＢ特異的な免疫応答を分析した。ワクチン接種されたマウスおよび未処理のコントロールの肺由来の細胞は、ＰＰＤで２０時間、再刺激されて、サイトカイン濃度が多重分析により測定された（図８Ａ）。再刺激時に検出されたサイトカインは、主にタイプ１であった。しかしながら、本発明者らは、持続的な感染の間、ワクチン接種されたグループ間で、ＩＦＮγまたはＩＬ１７に違いは検出することができなかった。対照的に、ＩＬ２、ＩＬ６、ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＮＦαの量は、ｒＢＣＧワクチン接種されたマウスにおいて、より高かった。全てのグループにおいて、ＩＬ４およびＩＬ５は、検出限界よりも低く、いくらかのＩＬ１２ｐ７０およびＩＬ１０が測定された（データ示さず）。さらに、多色フローサイトメトリーによる肺細胞の分析は、持続的な感染の間にサイトカインを産生するＣＤ４Ｔ細胞を、主に、明らかにした（図８Ｂ）。ＩＦＮγのみを分泌するＣＤ４Ｔ細胞は、全てのグループにおいて同様の頻度で検出された。その上、ワクチン接種時にＩＬ２、ＩＦＮγ、ＴＮＦαまたはＩＬ１７を異なる組み合わせで産生するＣＤ４Ｔ細胞が検出され得た。興味深いことに、応答性ＣＤ４Ｔ細胞の頻度は、上清中のＩＬ２およびＴＮＦαの、より高い濃度にもかかわらず、ｒＢＣＧおよびｐＢＣＧワクチン接種の間で有意に異ならなかった。本発明者らは、両方のワクチンが、持続的なＭＴＢ感染の間に、ｒＢＣＧ誘導されたＴ細胞がより強力なサイトカインプロデューサーになるのに伴って肺における抗原特異的ＣＤ４Ｔ細胞の頻度を増加させたことを推測する。ＣＤ８Ｔ細胞は、ほぼ例外なく、全てのグループにおいて同等の頻度でＩＦＮγを分泌し、一方で、有意に、より高い単一のＴＮＦαを産生するＣＤ８Ｔ細胞がｒＢＣＧグループにおいて検出された。多機能ＣＤ８Ｔ細胞は、かろうじてバックグラウンドよりも上に現れた（図９）。

［ワクチン接種はＩＬ２２産生を生じさせるが、ＩＬ２１産生を生じさせない］
Ｔｈ１７細胞は、ＩＬ２１（１５）およびＩＬ２２（１６）のような、さらなるエフェクターサイトカインを産生することができる。ＩＬ２２を産生する細胞は、ＴＢ患者で同定されているが、これらはＩＬ１７を産生する細胞（１７）とは異なるようである。本発明者らは、ワクチン接種されてその後にＭＴＢ感染されたマウス由来の脾臓または肺細胞のＰＰＤでの刺激後に、ＩＬ２１を検出しなかった（図１０Ａ）。ＩＬ２２は、ｒＢＣＧで免疫付与されたマウスにおいて、ＰＰＤで２０時間刺激された脾細胞により、亢進された濃度で産生されたが（図１０Ｂ）、ＭＴＢでの感染後早期には、さらに増加しなかった。肺細胞によるＩＬ２２産生は、ｒＢＣＧワクチン接種されたグループでのみ観測され、エアロゾルＭＴＢ感染後に減少した。

［腹腔内ｒＢＣＧは、有意にＡＰＣの集団を変化させることなく、γδＴ細胞およびＮＫ細胞の増加した動員を生じさせる］
本発明者らは、ｒＢＣＧでの免疫付与後の、潜在する選択的なＴｈ１７細胞の誘導のメカニズムを明らかにしたかった。この目的を達成するために、ｒＢＣＧおよびｐＢＣＧが、腹腔内（ｉ．ｐ．）投与されて、投与後５時間または６日に移民細胞（ｉｍｍｉｇｒａｎｔｃｅｌｌ）が腹膜腔から単離されて、そしてフローサイトメトリーにより分析された（図１１Ａ）。好中球（Ｇｒ１^ＨＩ、ＣＤ１１ｂ^ＨＩ、ＭＨＣＩＩ⁻、ＣＤ１１ｃ⁻として定義される）は、急速に腹膜腔に入り、そして、ｐＢＣＧおよびｒＢＣＧグループにおいて同程度に、持続的感染（ｐ．ｉ．）６日の時点で亢進されたままであった。常在性の腹膜のマクロファージ（ＣＤ１１ｂ^ＨＩ、Ｆ４／８０^ＨＩ、Ｇｒ１⁻、ＭＨＣＩＩ^ＨＩ、ＣＤ１１ｃ⁻として定義される）および樹状細胞（ＣＤ１１ｃ^＋、ＣＤ１１ｂ^ＬＯ、Ｇｒ１⁻）の頻度は、低い割合で変化されないままであった。要するに、ｒＢＣＧおよびｐＢＣＧグループの間で、有意差は検出されなかった。

ワクチン接種後５時間に回収された腹膜細胞は、αＣＤ３／αＣＤ２８抗体でのポリクローナル刺激（図１１Ｂ）にさらされた。ＣＤ４Ｔ細胞およびＮＫ細胞の頻度は、ＩＦＮγおよびＩＬ１７産生と同じように、全てのグループ間で同等であった。投与後６日に、これらの細胞は数値的に増加して、ｒＢＣＧグループにおいて最高頻度に到達した（図１１Ｃ）。ＰＰＤが、６日の時点での細胞の再刺激のために用いられた。ＣＤ４Ｔ細胞は、はっきり認識できるほどの量のＩＦＮγまたはＩＬ１７を産生せず、一方で、相当な割合のＮＫ細胞が、ｒＢＣＧ投与後にＩＦＮγを産生した。γδＴ細胞は、ＴＢでの早期のＩＬ１７の主要な原因として同定された（１８）。有意ではないが、増加した割合の、ＩＦＮγを産生するγδＴ細胞が、ｒＢＣＧでの注射後５時間に確認された。この細胞集団は、さらに増加して、そして、著しくより高い頻度の、ＩＬ１７を産生するγδＴ細胞が、注射後６日にｒＢＣＧグループで検出された。ＣＤ８Ｔ細胞は、いずれのグループにおいても、腹膜で検出されなかった。本発明者らは、腹膜腔中に存在するサイトカインおよびケモカインを、腹腔洗浄液の多重分析により分析した（図１１Ｄ）。ＭＣＰ−１、ＭＩＰ１α、Ｇ−ＣＳＦおよびＫＣは、注射の際に急激に増加した；エオタキシンのレベルは変化しないままであり、ＩＬ１２ｐ４０は６日後に、より高い濃度で検出された。ＩＬ１２ｐ７０、ＩＦＮγ、ＩＬ１ａ、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ１０、ＩＬ１７、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＴＮＦαの濃度は、検出限界よりも低く、一方で、ＩＬ１β、ＩＬ６、ＩＬ９、ＩＬ１３、ＭＩＰ１βおよびＲＡＮＴＥＳは測定され得たが、産生はｒＢＣＧとｐＢＣＧとの間で同等であった。このように、ｒＢＣＧおよびｐＢＣＧは、ＡＰＣの動員、および、投与部位でのケモカインおよびサイトカインの同程度の産生を誘導した。興味深いことに、ＩＬ１７を分泌するγδＴ細胞およびＩＦＮγを産生するＮＫ細胞の割合は、ｒＢＣＧ投与後に最も大量であった。

［ｒＢＣＧでのワクチン接種は、ヒトにおいて、ＩＬ１７を産生する細胞を産生する］
最後に、本発明者らは、ｒＢＣＧワクチン接種された研究被験者においてＩＬ１７産生が増加されるかどうかを調べるために、第Ｉ相臨床試験のヒト健常ボランティア由来のＰＢＭＣを分析した。ボランティア由来の血液が、ｒＢＣＧまたはｐＢＣＧでの免疫付与後２９日に採取されて、ＰＢＭＣが単離されて凍結された。ＰＢＭＣは、解凍されて一晩休まされて、２０時間のＰＰＤでの再刺激がその後に続いた。サイトカイン産生は、多重分析により分析された。ＩＬ１７産生は、ｒＢＣＧで免疫付与された研究被験者由来のＰＢＭＣにおいてのみ検出された（図１２）。制限された数のサンプルが利用可能であったことに留意されたい。

［考察］
防御の免疫マーカーの同定は、新規のＴＢワクチンの合理的デザインに極めて重要である。これらのマーカーは、また、ＴＢワクチン有効性試験での臨床転帰のエンドポイントを予測するための代替マーカーの定義のための基礎を確立することができ、そしてこのように、現在のワクチン候補者の改良のためのガイドラインを提供する。マクロファージの抗マイコバクテリア能力を活性化する、ＩＦＮγ（２１）およびＴＮＦα（２２）を含む、主要なサイトカインの重要性、および、メモリー細胞の増殖におけるＩＬ２の必要性（２３）が良く実証されて、そしてこのように、一般に、ＴＢワクチン試験をモニターするために用いられる。

ワクチンの有効性のバイオマーカーを同定するための試みにおいて、本発明者らは、その親株であるｐＢＣＧよりも優れた防御を与えることが証明されたｒＢＣＧによって誘導される長期のメモリー免疫応答を比較した。応答は、量的および質的の両方で異なった。本発明者らは、肺において、ｒＢＣＧでのワクチン接種に続いて、タイプ１サイトカインおよびＩＬ１７の増加した存在量を検出した（図２Ａ）。肺での、ワクチン誘導された免疫応答の分析は、臨床試験に照らして、明らかに実行不可能である。したがって、本発明者らは、全身性の長期のメモリー応答（図２Ｂ）も分析した。興味深いことに、同等の濃度のタイプ１指向性のサイトカインが、ｐＢＣＧおよびｒＢＣＧグループで検出された。対照的に、脾細胞によるＩＬ１７産生は、ｒＢＣＧワクチン接種時に有意に亢進した。このように、本発明者らは、ＩＦＮγまたはＩＬ２よりむしろ、ＩＬ１７が、ｒＢＣＧにより誘導される、優れた防御のマーカーとして適格であると結論付ける。

Ｔｈ１７細胞は、ＩＬ１７に応答して動員される最初の細胞のうちの一つである好中球を引き付けて、活性化することにより、抗菌の防御に寄与する（２４）。ＩＬ１７は、初期のＭＴＢ感染の間は不必要であるが（２５、２６）、メモリー応答において重要性を得る（１３）ことが示されている。加えて、ＣＣＲ６は、好中球により産生されるＣＣＬ２０に対する受容体であり（２９）、そして、ＣＣＬ２０−ＣＣＲ６は、ＴＢの免疫病原性に関与している（３０）ので、ヒトＴｈ１７細胞上のＣＣＲ６の発現に関する最近の報告（２７、２８）は、ポジティブフィードバックループを指摘する。このように、Ｔｈ１７細胞は、細菌が存在する部位への、抗原特異的なメモリーＴ細胞の促進された動員を促すことができた。ＭＴＢでのエアロゾル感染後７日の、ワクチン誘導された免疫応答を分析することにより、本発明者らは、ｒＢＣＧでのワクチン接種は、実際に、細菌の複製の部位への、エフェクター細胞の促進された動員をもたらすことを示す。本発明者らは、抗原特異的なＣＤ４Ｔ細胞の増加した頻度および肺（図３）および脾臓細胞（図４）によるＩＬ２、ＩＬ１７、ＩＦＮγおよびＧＭ−ＣＳＦの亢進された産生を確認した。

ＩＬ２、ＩＦＮγおよびＴＮＦαを共に産生する多機能ＣＤ４Ｔ細胞は、当初、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａｍａｊｏｒに対して（１４）、そして後に、ＭＴＢに対しても（３１）、成功したワクチン接種戦略に関与した。最近になって、これらの多機能ＣＤ４Ｔ細胞は、臨床のＴＢワクチン試験においても検出された（３２、３３）。本発明者らは、ｒＢＣＧとｐＢＣＧのワクチン接種と後に続く感染時に、多機能ＣＤ４Ｔ細胞を検出した（図３ａｎｄ４）；しかしながら、二重および三重のプロデューサーにおけるサイトカインの構成（ＩＬ２、ＩＬ１７、ＩＦＮγおよびＴＮＦα）は、実験および個々の動物間で、かなり変化した。もし、多機能細胞が、真の、防御の関連要因であるならば、ｒＢＣＧグループにおいて、より高いそれらの全体の頻度は、それらの構成よりむしろ、最も関連があるように思われる。

ｒＢＣＧはなぜＴｈ１７応答を誘導したのだろうか？ｒＢＣＧおよびｐＢＣＧでの免疫付与は、ＡＰＣおよびケモカインとサイトカインのプロデューサーの動員を、同程度に生じさせた。興味深いことに、ＩＬ１７を分泌するγδＴ細胞とＩＦＮγを産生するＮＫ細胞の割合は、ｒＢＣＧワクチン接種後に極めて高かった。これは、ＩＬ１７はγδＴ細胞（３４、１８）およびＮＫＴ細胞（３５）によって、急速に産生されることができることを示している報告と一致する。ＮＫ細胞は、これもｒＢＣＧでのワクチン接種時に増加したものであり、早期のＩＦＮγの重要な原因である。本発明者らは、ｒＢＣＧから遊離された異なる分子構成要素が、感染されたマクロファージの細胞基質中に存在することをすでに示している（１２）。Ｎｏｄ−２は重要な細胞質ＰＲＲであり、そしてそれの関与は、Ｔｈ１７メモリーＴ細胞応答の発生に関連している（１９）。

細菌の感染中に誘導されるアポトーシスは、Ｔｈ１７細胞を誘導する（３６）。本発明者らは、ｒＢＣＧが、ｐＢＣＧに比較して増加したアポトーシスを誘導し（１２）、さらに、Ｔｈ１７細胞の増加した発生に寄与することができたという証拠を得た。インフラマソームの活性化もまた、ＩＬ１βの産生を経由したＴｈ１７メモリー応答に寄与することができた（３７）。例えば、ＮＬＲＰ３は、ＡＴＰレベルでの変化を通じて、リステリオリシンの存在を感知することが見出されている（３８）。このように、ｒＢＣＧワクチン接種時のＴｈ１７細胞の誘導は、細胞内刺激と増加したアポトーシスの複雑な相互作用を必要とするのかもしれない。

Ｔｈ１７細胞は、成功したワクチン接種に対して有用であるよりむしろ、コラーゲン誘導の関節炎（３９）、ＥＡＥ（４０、３９）およびアレルギー性気道過敏症（４１、３９）のような炎症性および自己免疫性疾患に役立つと考えられる。この病原の役割は、通常、深刻なＩＬ２１仲介の炎症性応答の発生に関連する。本発明者らは、いずれの実験においても、決して、ワクチン接種および後に続くＭＴＢ感染後に、バックグラウンドレベルより上のＩＬ２１を検出しなかった（図１０Ａ）。加えて、本発明者らは、ｒＢＣＧでのワクチン接種時にも、またはＭＴＢ感染後最大で２００日までの肺においても、決して、注射の部位において自己免疫または過剰な炎症の兆候を観察しなかった。

マウスでの実験的ＴＢ由来のデータとヒトデータを比較する最初の試みでは、本発明者らは、ｒＢＣＧおよびｐＢＣＧでの第Ｉ相臨床試験由来の冷凍ＰＢＭＣのサイトカインプロファイルを分析した。制限された数のサンプルにおいて、本発明者らは、ｒＢＣＧワクチン接種後にＩＬ１７産生を検出したが、ｐＢＣＧワクチン接種後では検出しなかった。Ｔｈ１７細胞は、ＭＴＢ感染されたヒトの末梢血中に検出された（１７）。最近になって、ＩＬ１７を産生するＣＤ４Ｔ細胞は、Ａｇ８５Ａを発現する改良されたワクシニアウイルスＡｎｋａｒａからなるＴＢワクチン候補でワクチン接種された青年において、報告されている（３３）。応答はワクチン接種後７〜２８日にピークになり、そしてその後減少した。これは、ｒＢＣＧグループにおいて、ワクチン接種後２９日に亢進されたＩＬ１７産生を示す、本発明者らのデータと一致する（図１２）。このように、ＴＢワクチン試験における、防御の関連要因として、ＩＬ１７を提案したい。

要するに、本発明者らは、ｒＢＣＧでのワクチン接種は、Ｔｈ１７細胞の選択的な産生をもたらし、おそらく、Ｎｏｄ−２による細菌の構成要素の細胞内認識に依存することを示す。これらのＴｈ１７細胞は、次々に、抗原特異的Ｔ細胞の、肺への動員を促進する。最終的に、この現象のカスケードは、ＭＴＢの早期の抑制をもたらし、したがって、ｐＢＣＧと比較して、ｒＢＣＧによる優れた防御をもたらす。本発明者らは、成功を果たした第Ｉ相臨床試験での、ｒＢＣＧワクチン接種されたボランティア由来のＰＢＭＣによってのみ、ＩＬ１７産生を検出する。ＩＬ１７は、抗原特異的Ｔ細胞の、ＭＴＢ複製部位への、促進された動員に役立つようなので、さらなるＴＢワクチンは、バランスのとれたＴｈ１およびＴｈ１７応答を同時に誘導する目的に合わせられるべきである。
［参考文献］

Claims

組み換えマイコバクテリア生ワクチン（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌｌｉｖｅｖａｃｃｉｎｅ）の有効性を判定するための方法であって、ここで、前記ワクチンはＤａｎｉｓｈ株の亜種Ｐｒａｇｕｅ由来の組み換えマイコバクテリウムボビス細胞であり、
ワクチン接種された対象から得られた生物学的サンプル中でのＴヘルパー１７型（Ｔｈ１７）免疫応答を判定するステップを含み、
ここで、前記ワクチン接種された対象はヒトであり、検出可能なＴｈ１７免疫応答は、前記対象での防御免疫に関する指標であることを特徴とする、
方法。
請求項１に記載の方法であって、
ここで前記ワクチンは、
（ａ）免疫応答を誘導することが可能なドメイン、および、
（ｂ）ファゴリソソームエスケープドメイン
を含む融合ポリペプチドをコードする組み換え核酸分子を含む、組み換えマイコバクテリウムであることを特徴とする、
方法。
請求項２に記載の方法であって、
前記マイコバクテリウムがウレアーゼ欠損であることを特徴とする、
方法。
請求項３に記載の方法であって、
前記マイコバクテリウムは、ｒＢＣＧΔＵｒｅＣ：：Ｈｌｙ^＋：：Ｈｙｇ^＋であることを特徴とする、
方法。
請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法であって、
前記ワクチンは、マイコバクテリア感染に対するワクチンであることを特徴とする、
方法。
請求項５に記載の方法であって、
前記ワクチンは、結核菌（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）感染に対するワクチンであることを特徴とする、
方法。
請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法であって、
ここで、前記Ｔｈ１７免疫応答を判定するステップは、
前記のワクチン接種された対象由来の免疫細胞を含むサンプルを、前記ワクチンにおける免疫原に対応する免疫原での再刺激にさらすステップ、および、
前記サンプルにおけるＴｈ１７免疫応答に関連する細胞の存在および／または量を判定するステップ
を含むことを特徴とする、
方法。
請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法であって、
前記Ｔｈ１７免疫応答を判定するステップは、ＩＬ１７を判定するステップを含むことを特徴とする、
方法。
請求項８に記載の方法であって、
ＩＬ１７が免疫学的方法によって判定されることを特徴とする、
方法。
請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法であって、
前記Ｔｈ１７免疫応答は、ワクチン接種後２０〜５０日に判定されることを特徴とする、
方法。
組み換えマイコバクテリア生ワクチンの有効性を判定するための、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法における試薬キットの使用であって、ここで、前記ワクチンはＤａｎｉｓｈ株の亜種Ｐｒａｇｕｅ由来の組み換えマイコバクテリウムボビス細胞であり、
（ａ）以前にワクチン接種された対象由来の免疫細胞を再刺激するための試薬、ここで、前記ワクチン接種された対象はヒトである、および、
（ｂ）Ｔｈ１７免疫応答を検出するための試薬
を含む、
試薬キットの使用。