ES2569035T3 - Determinación de la eficacia de una vacunación anti-micobacteriana recombinante viva - Google Patents

Abstract

Un método para determinar la eficacia de una vacuna viva micobacteriana recombinante, que comprende determinar la respuesta inmunitaria T auxiliar de tipo 17 (Th17) en un sujeto vacunado, en el que una respuesta inmunitaria Th17 detectable es indicativa de inmunidad protectora en dicho sujeto.

Description

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

DESCRIPCION

Determinacion de la eficacia de una vacunacion anti-micobacteriana recombinante viva

La invencion se refiere a metodos y reactivos para determinar la eficacia de una vacuna, particularmente de una vacuna contra la tuberculosis.

Cada ano, hasta 2 millones de personas mueren de tuberculosis (TB) (1). La unica vacuna disponible contra TB es el bacilo Calmette-Guerin (BCG) de Mycobacterium bovis, que se uso en seres humanos por primera vez en 1921 (2). Hasta la fecha, se han administrado 4 billones de dosis de BCG, convirtiendola en la vacuna humana mas ampliamente usada en todo el mundo (3). Pese a ello, aun estamos muy lejos de haber conseguido la erradicacion de TB. La vacunacion con BCG previene la meningitis por tuberculosis y Tb miliar en bebes (4). Sin embargo, la proteccion contra otras formas de TB, especialmente TB pulmonar en adolescentes y adultos, no es concluyente como se enfatiza por un meta-analisis, que revelo que las eficacias de proteccion que variaban del 0-80 % en adultos (5). Por lo tanto, se necesitan urgentemente nuevas vacunas contra TB. Actualmente, las nuevas estrategias de vacunacion contra TB en ensayos clmicos incluyen BCG recombinante para remplazar BCG canonico asf como vacunas de subunidad y vacunas basadas en vector vmco no replicante para sensibilizar a BCG de refuerzo (6) (7).

La identificacion de mecanismos inmunologicos subyacentes a la proteccion puede facilitar un diseno racional de novedosas estrategias de vacunacion para la prevencion de TB. Ademas, esta estrategia podna revelar biomarcadores indicativos para inmunidad protectora que podnan revelar criterios de valoracion sustitutos de resultado clmico en ensayos de eficacia de vacuna contra TB clmica, y por tanto podna reducir su duracion asf como facilitar el ensayo de cantidades mayores de candidatos de vacuna en ensayos paralelos. Se han iniciado estudios de observacion centrados en contactos sanos recien infectados de pacientes con TB y en bebes vacunados con BCG para definir dichos marcadores (8). A pesar de la amplia investigacion sobre la respuesta inmunitaria a TB, los elementos fundamentales de la memoria protectora aun tienen que dilucidarse. Despues de vacunacion con BCG, son difmiles de detectar las celulas T CD4 de memoria especfficas de antfgeno debido a la escasez de antfgenos inmunodominantes. Actualmente, los biomarcadores mas ampliamente usados se basan en frecuencias elevadas de celulas T CD4 que producen IFNy. Las evidencias crecientes cuestionan el valor de IFNy como correlato de proteccion en TB (9,10). Indudablemente, IFNy desempena un papel crucial en la defensa contra MTB (11), pero la determinacion de IFNy solo ya no puede considerarse como un marcador fiable de inmunidad protectora.

Se describe una cepa de BCG recombinante que expresa un dominio de escape fagolisosomico en el documento WO99/10496. El dominio de escape fagolisosomico posibilita que la cepa escape del fagosoma de celulas hospedadoras infectadas perforando la membrana del fagosoma. Para proporcionar un pH fagosomico acido para una actividad optima de escape fagolisosomico, se desarrollo una cepa recombinante deficiente en ureasa. Esta cepa se describe en el documento WO2004/094469.

Una cepa recombinante AureC Hly+ rBCG (rBCG) que expresa listeriolisina perforante de membrana (Hly) de Listeria monocytogenes y desprovista de ureasa C induce proteccion superior contra exposicion aerogenica con MTB en comparacion con BCG precursor (pBCG) en un modelo preclmico (12). Esta construccion de vacuna ha demostrado de forma satisfactoria seguridad e inmunogenicidad en un ensayo clmico en fase I (documento US 61/384.375).

Jay. K. Kolls (Semin. Immunopathpol. (2010), 32; 1-2) (44) describe que celulas T auxiliares tipo 17 (Th17) han demostrado tener papeles cnticos en autoinmunidad e inflamacion tisular. Ademas, estas celulas pueden inducirse despues de vacunacion y han demostrado ser cnticas para la eficacia de la vacuna contra patogenos tanto extracelulares como intracelulares.

Cassan et al. (Clin. Vaccine Immunol. (2010), 17(7); 1066-1073) (45) se refiere a celulas Th17 y T reguladoras inducidas por vacuna en adultos sanos inmunizados con BCG de Mycobacterium bovis vacunados con una nueva vacuna contra la tuberculosis, MVA85A.

Lin et al. (Semin. Immunopathol. (2010), 32(1); 79-90) (46) describe el papel de IL17 en respuestas celulares protectoras inducidas por vacuna contra varios patogenos y enfermedades infecciosas, como el patogeno intracelular Mycobacterium tuberculosis.

Desel et al. (Journal of Infectious Diseases (2011), 204 (10); 1573-1584) (47) describe un BCG recombinante AureC gly+ que induce proteccion superior sobre BCG precursor estimulando una combinacion equilibrada de respuestas de citoquina tipo 1 y tipo 17.

En el presente estudio, se demuestra que rBCG y pBCG inducen marcadas respuestas inmunitarias Th1, mientras que solamente rBCG provoca una profunda respuesta Th17 adicionalmente. Tambien se observo un reclutamiento prematuro de linfocitos T especificos de antigeno al pulmon tras infeccion por MTB de ratones vacunados con rBCG. Estas celulas T produclan abundantes citoquinas Th1 despues de re-estimulacion. La eficacia protectora superior de rBCG aparentemente era dependiente de IL17. La elevada produccion de IL17 despues de vacunacion con rBCG, pero no con pBCG, tambien se detecto en voluntarios sanos durante un ensayo clinico en fase I. Nuestros hallazgos identifican una ruta inmunologica

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

general como marcador para estrategias mejoradas de vacunacion contra TB que tambien puede explorarse por candidates de vacuna de subunidad.

Un objeto de estudio de la presente invencion es un metodo para determinar la eficacia de una vacuna, que comprende determinar la respuesta inmunitaria Th17 en un sujeto vacunado, donde la presencia de una respuesta inmunitaria Th17 es indicativa de inmunidad protectora en dicho sujeto.

Un aspecto adicional de la presente invencion es un kit de reactivos para determinar la eficacia de una vacuna, que comprende al menos un reactivo para detectar una respuesta inmunitaria Th17.

En una realizacion preferida, la vacuna es una vacuna viva, particularmente una celula de Mycobacterium. En una realizacion incluso mas preferida, la vacuna es una Mycobacterium recombinante que comprende una molecula de acido nucleico recombinante que codifica un polipeptido de fusion que comprende (a) un dominio capaz de provocar una respuesta inmunitaria y (b) un dominio de escape fagolisosomico. El dominio capaz de provocar una respuesta inmunitaria es preferiblemente un peptido o polipeptido inmunogenico de un patogeno o un fragmento inmunogenico del mismo. En una realizacion adicional, la vacuna es una vacuna de subunidad, es decir, una vacuna que comprende un antigeno purificado de un patogeno o un fragmento inmunogenico del mismo, particularmente un antigeno recombinante o un fragmento inmunogenico del mismo. En una realizacion adicional mas, la vacuna es una vacuna basada en una celula patogenica completa o fraccion celular inactivada.

La celula de Mycobacterium es preferiblemente una celula de M. bovis, una celula de M. tuberculosis, particularmente una celula de M. tuberculosis atenuada u otra micobacteria, por ejemplo, M. microti, M. smegmatis, M. canettii, M. marinum o M. fortuitum. Mas preferiblemente, la celula es una celula de M. bovis (BCG) recombinante, particularmente una celula de M. bovis recombinante de la cepa Danesa subtipo Praga (43). En una realizacion especialmente preferida, la vacuna es una celula de Mycobacterium deficiente en ureasa recombinante. En una realizacion especialmente preferida, la secuencia ureC de la celula de Mycobacterium esta inactivada (AUreC), por ejemplo, mediante la construccion de un vector de suicidio que contiene un gen ureC alterado por un gen marcador de seleccion, transformacion de la celula diana con el vector y deteccion de celulas positivas al marcador de seleccion que tienen un fenotipo negativo a ureasa. Mas preferiblemente, la celula es BCG recombinante de la cepa Danesa subtipo Praga caracterizada como rBCG AUrec :: Hly+:: Hyg+.

El dominio capaz de provocar una respuesta inmunitaria se selecciona preferiblemente de peptidos o polipeptidos inmunogenicos de M. bovis o M. tuberculosis o de fragmentos inmunogenicos de los mismos que tienen una longitud de al menos 6, preferiblemente al menos 8 aminoacidos, mas preferiblemente al menos 9 aminoacidos y, por ejemplo, hasta 20 aminoacidos. Ejemplos espedficos para antigenos adecuados son Ag85B (p30) de M. tuberculosis, Ag85B (a-antigeno) de BCG de M. bovis, Ag85A de M. tuberculosis y ESAT-6 de M. tuberculosis y fragmentos de los mismos.

La vacuna es preferiblemente una vacuna contra infecciones micobacterianas, particularmente infecciones micobacterianas pulmonares, mas particularmente tuberculosis.

De acuerdo con el metodo de la invencion, se determina la respuesta inmunitaria Th17 en un sujeto vacunado. El sujeto es preferiblemente un mairnfero, por ejemplo, un ser humano. La determinacion se realiza preferiblemente en una muestra biologica obtenida de dicho sujeto, donde dicha muestra comprende celulas inmunitarias, particularmente celulas T y/o celulas NK, mas particularmente celulas T espedficas de antfgeno tales como celulas T CD4. La muestra puede ser un fluido corporal o muestra tisular, por ejemplo, una muestra de sangre, suero o plasma o una muestra de pulmon o bazo. Los metodos para recoger muestras son bien conocidos en la tecnica.

El metodo de la presente invencion requiere una determinacion de la respuesta inmunitaria Th17. Para este fin, se prefiere re-estimular las celulas inmunitarias presentes en la muestra en el sujeto a analizar con un inmunogeno y determinar la expresion de citoquinas a partir de dichas celulas. Las celulas a analizar son preferiblemente celulas T espedficas de antfgeno, mas preferiblemente celulas T CD4. El inmunogeno para la re-estimulacion corresponde al inmunogeno presente en la vacuna (cuya eficacia tiene que determinarse). El inmunogeno puede estar presente en una forma identica a la forma presente en la vacuna o en una forma diferente. Por ejemplo, cuando la vacuna comprende un polipeptido inmunogenico, el inmunogeno en la etapa de re-estimulacion puede comprender un fragmento inmunogenico del mismo o viceversa. Preferiblemente, el inmunogeno usado para la etapa de re- estimulacion es un polipeptido o peptido purificado. Para ensayar la eficacia de vacunas contra la tuberculosis, particularmente una vacuna viva contra la tuberculosis como se ha descrito anteriormente, el inmunogeno puede ser ventajosamente un antfgeno micobacteriano, por ejemplo, seleccionado del "Derivado de Proterna Purificada" PPD, que es un extracto con glicerol de micobacterias o Ag85A y Ag85B, asf como otros antfgenos micobacterianos y fragmentos inmunogenicos de los mismos (tal como se ha descrito anteriormente).

La determinacion de la respuesta Th17 de acuerdo con la invencion puede comprender la determinacion de celulas asociadas con la respuesta Th17, por ejemplo, celulas productoras de IL-17, mediante marcadores de superficie y citoquinas presentes en y/o secretadas por dichas celulas. Ejemplos de marcadores de superficie son CD4, CD8, IL- 23R, CCR4 y/o CCr6. Ejemplos de citoquinas presentes en y/o secretadas por dichas celulas son IL-17, IL-21, IL-22,

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

IL-23, IFN-y y combinaciones de las mismas. Preferiblemente, la citoquina es IL-17. Dichas celulas pueden determinarse por metodos citologicos, por ejemplo, por tecnicas de clasificacion celular usando reactivos de deteccion inmunologica tales como anticuerpos espedficos para marcadores de superficie celular y/o citoquinas, que pueden portar un grupo de marcaje, por ejemplo, un grupo de fluorescencia.

Mas preferiblemente, las celulas asociadas con una respuesta inmunitaria Th17 son, por ejemplo, celulas T CD4 que producen y opcionalmente secretan IL-17.

En una realizacion adicional, la determinacion de la respuesta inmunitaria Th17 comprende determinar una citoquina secretada a partir de celulas asociadas con la respuesta inmunitaria Th17, por ejemplo, IL-17. La citoquina puede determinarse por metodos inmunologicos usando anticuerpos apropiados, por ejemplo, anticuerpos dirigidos contra IL-17.

En el metodo de la invencion, la respuesta inmunitaria Th17 se determina en un momento adecuado despues de la vacunacion. Por ejemplo, la respuesta inmunitaria puede determinarse 20-50 dfas, particularmente 25-35 dfas despues de la vacunacion.

La invencion tambien se refiere a un kit de reactivos para determinar la eficacia de una vacuna, particularmente para su uso en un metodo como se ha descrito anteriormente. El kit de reactivos comprende un inmunogeno adecuado para re-estimular celulas inmunitarias presentes en una muestra de un sujeto que se ha vacunado. Adicionalmente, el kit de reactivos comprende al menos un reactivo adecuado para detectar un marcador de respuesta inmunitaria Th17, como se ha descrito anteriormente. Los reactivos pueden seleccionarse, por ejemplo, de reactivos citologicos y/o inmunologicos de deteccion, por ejemplo, anticuerpos contra marcadores celulares caractensticos de celulas asociadas a respuesta inmunitaria Thl7 y/o un reactivo inmunologico espedfico para citoquinas asociadas con una respuesta inmunitaria Th17, particularmente IL-17 y/o IL-22. Las regiones de deteccion pueden portar grupos detectables, por ejemplo, grupos de marcaje por fluorescencia.

Ademas, la invencion se describe en mas detalle por las siguientes Figuras y Ejemplos.

Leyendas de las figuras

Figura 1: Carga de MTB en ratones WT. La inmunizacion s.c. protege contra infeccion con MTB 90 dfas p.i. (A). La carga bacteriana es comparable entre grupos vacunados y no vacunados el dfa 7 p.i. (B). Determinacion de CFU en pulmon y bazo despues de infeccion por aerosol con 400 CFU de MTB. Se homogeneizo el lobulo pulmonar cardiaco (aprox. 71/10° del organo completo) o la mitad de un bazo; el material restante se uso para ensayos de re-estimulacion in vitro. Se determino la significacion estadfstica por ensayo de Mann-Whitney con valores P bilaterales. *, P < 0,05; **, P < 0,01. Los datos son representativos de tres experimentos con resultados similares.

Figura 2: Induccion superior de citoquinas despues de vacunacion con rBCG sobre pBCG. Respuestas en pulmon (A) y bazo (B) 83 dfas despues de vacunacion s.c. con rBCG o pBCG. Se re-estimulo un total de 2,5 x 105 (pulmon) o 2 x 106 (bazo) celulas con PPD durante 20 horas y se analizaron los sobrenadantes por ensayos combinados. Las concentraciones de citoquinas se representan como medias ± ETM de cuatro experimentos independientes con tres replicas cada uno. Se resto la produccion de fondo de citoquinas de los controles de medio. Se aplico ANOVA y ensayo de comparacion multiple de Bonferroni para el analisis estadfstico. *, P < 0,05; **, P < 0,01.

Figura 3: La vacunacion con rBCG acelera el reclutamiento de celulas T especificas de antigeno al pulmon tras infeccion por aerosol con MTB. Secrecion de citoquinas por celulas pulmonares 7 dfas despues de infeccion por aerosol con 200-400 CFU de MTB. Se estimulo un total de 2 x 105 celulas con PPD durante 20 horas y se analizaron los sobrenadantes por ensayo combinado (A). Las concentraciones de citoquinas se representan como la media ± ETM de dos experimentos independientes con tres replicas cada uno. Se resto la produccion de fondo de citoquinas de los controles de medio. Se analizaron celulas re-estimuladas con PPD durante 6 horas en presencia de Brefeldina A por citometna de flujo multicolor (B). Se representan las frecuencias de celulas T CD4 respondedoras como medias ± ETM de tres experimentos independientes con tres replicas cada uno. Se aplico ANOVA y ensayo de comparacion multiple de Bonferroni para el analisis estadfstico. *, P < 0,05; **, P < 0,01; ***, P < 0,001.

Figura 4: La vacunacion con rBCG aumenta las respuestas especificas de PPD en bazo tras infeccion por aerosol con MTB. Secrecion de citoquinas por celulas de bazo 7 dfas despues de infeccion por aerosol con 200400 CFU de MTB. Se re-estimulo un total de 2 x 106 celulas con PPD durante 20 horas y se analizaron los sobrenadantes por ensayos combinados (A). Las concentraciones de citoquinas se representan como medias ± ETM de cuatro experimentos independientes con tres replicas cada uno. Se resto la produccion de fondo de citoquinas de los controles de medio. Se analizaron celulas re-estimuladas con pPd durante 6 horas en presencia de Brefeldina A por citometna de flujo multicolor (B). Se representan las frecuencias de celulas T CD4 respondedoras como medias ± ETM de tres experimentos independientes con tres replicas cada uno. Se aplico

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ANOVA y ensayo de comparacion multiple de Bonferroni para el analisis estadfstico. *, P < 0,05; **, P < 0,01; ***, P < 0,001.

Figura 5: La vacunacion con pBCG o rBCG no conduce a cambios significativos en poblaciones de celulas Treg. Celulas Treg en el bazo despues de inmunizacion s.c. con rBCG o pBCG. Las barras negras representan celulas CD25+FoxP3+ y las barras blancas celulas CD25-FoxP3+. Frecuencias de celulas T CD4 y celulas Treg CD8 83 dfas despues de inmunizacion (A y B) asf como 7 dfas (C y D) o 90 dfas (E y F) despues de infeccion por aerosol con 200-400 CFU de MTB. Tres ratones por grupo, representado como media ± eTm. Los datos son representativos de tres experimentos independientes con resultados similares.

Figura 6: Frecuencias de celulas T CD8 productoras de citoquinas en el pulmon despues de vacunacion y posterior infeccion por aerosol con MTB. Secrecion de citoquinas 7 dfas despues de infeccion por aerosol con 200-400 CFU de MTB. Se analizaron celulas re-estimuladas con PPD durante 6 horas en presencia de Brefeldina A por citometna de flujo multicolor. Las frecuencias de celulas T CD8 respondedoras se representan como medias ± ETM de dos experimentos independientes con tres replicas cada uno. Se aplico ANOVA y ensayo de comparacion multiple de Bonferroni para el analisis estadfstico.

Figura 7: Frecuencias de celulas T CD8 productoras de citoquinas en bazo despues de vacunacion y posterior infeccion por aerosol con MTB. Secrecion de citoquinas 7 dfas despues de infeccion por aerosol con 200-400 CFU de MTB. Se analizaron celulas re-estimuladas con PPD durante 6 horas en presencia de Brefeldina A por citometna de flujo multicolor. Las frecuencias de celulas T CD8 respondedoras se representan como medias ± ETM de cuatro experimentos independientes con tres replicas cada uno. Se aplico ANOVA y ensayo de comparacion multiple de Bonferroni para el analisis estadfstico. *, P < 0,05; **, P < 0,01; ***, P < 0,001.

Figura 8: Respuestas inmunitarias en pulmon durante infeccion persistente por MTB en ratones vacunados con rBCG. Secrecion de citoquinas por celulas pulmonares 90 dfas despues de infeccion por aerosol con 200-400 CFU de MTB. Las celulas se re-estimularon con PPD durante 20 horas y se analizaron los sobrenadantes con ensayos combinados (A). Las concentraciones de citoquinas se representan como medias ± ETM de dos experimentos independientes con tres replicas cada uno. Se resto la produccion de fondo de citoquinas de los controles de medio. Se analizaron celulas re-estimuladas con pPd durante 6 horas en presencia de Brefeldina A por citometna de flujo multicolor (B). Las frecuencias de celulas T CD4 respondedoras se representan como medias ± ETM de dos experimentos independientes con tres replicas cada uno. Se aplico ANOVA y ensayo de comparacion multiple de Bonferroni para el analisis estadfstico. *, P < 0,05; **, P < 0,01.

Figura 9: Frecuencias de celulas T CD8 productoras de citoquinas despues de vacunacion y posterior infeccion por aerosol con MTB. Secrecion de citoquinas por celulas aisladas del pulmon 90 dfas despues de infeccion por aerosol con 200-400 CFU de MTB. Se analizaron celulas re-estimuladas con PPD durante 6 horas en presencia de Brefeldina A por citometna de flujo multicolor. Las frecuencias de celulas T CD8 respondedoras se representan como medias ± ETM de dos experimentos independientes con tres replicas cada uno. Se aplico ANOVA y ensayo de comparacion multiple de Bonferroni para el analisis estadfstico. *, P < 0,05.

Figura 10: La vacunacion induce produccion de IL22 pero no de IL21. Secrecion de IL21 (A) e IL22 (B) por celulas de bazos (2 x 106 celulas) o pulmones (2 x 105 celulas) de ratones 83 dfas despues de vacunacion y posterior infeccion por aerosol con 200-400 CFU de MTB. Concentraciones de IL21 medidas a partir de tres muestras por grupo, media ± ETM representada. Para IL22 se combinaron muestras de un grupo. Los datos son representativos de dos (dfas 83 post-vacunacion) y cinco (dfa 7 p.i.) experimentos similares. Las celulas se re- estimularon con PPD durante 20 horas y se analizaron los sobrenadantes por ELISA.

Figura 11: rBCG causa reclutamiento aumentado de celulas T y5 y celulas NK sin alterar significativamente las poblaciones de APC. Celulas reclutadas en la cavidad peritoneal tras administracion de 10° CFU de rBCG o pBCG i.p. Analisis de poblaciones celulares en fluido de lavado peritoneal por citometna de flujo. APC reclutadas en el peritoneo 5 horas (panel superior) y 6 dfas (inferior) despues de administracion i,p. de rBCG o pBCG (A). ICS de poblaciones de celulas T 5 horas despues de inyeccion (B). Las celulas se estimularon con anticuerpos aCD3/aCD28 durante 18 horas en presencia de Brefeldina A. ICS de poblaciones de celulas T 6 dfas despues de administracion (C). Las celulas se re-estimularon con PPD durante 18 horas en presencia de Brefeldina A. Los datos se presentan como el resumen de tres experimentos independientes con cinco ratones por grupo. La lmea horizontal indica la media. Se aplico ANOVA y ensayo de comparacion multiple de Bonferroni para el analisis estadfstico. *, P < 0,05; **, P < 0,01. Las citoquinas y quimioquinas detectadas en fluido de lavado peritoneal se analizaron por ensayo combinado (D) representadas como concentraciones medias ± ETM.

Figura 12: rBCG induce IL17 en PBMC humanas de voluntarios sanos de un ensayo clmico en fase I.

Produccion de IL17 por PBMC humanas aisladas de voluntarios humanos sanos de un estudio clmico en fase I. Se re-estimulo un total de 5 x 105 celulas aisladas 29 dfas post-vacunacion con rBCG o pBCG, con PPD durante 20 horas y se analizaron los sobrenadantes por ensayo combinado. La significacion estadfstica se determino por ensayo de Mann-Whitney con valor P unilateral y correccion de Welch. *, P < 0,05; n=3 para pBCG y n=7 para rBCG.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Ejemplo

Materiales y metodos Ratones

Se criaron ratones BALB/c hembra en el Bundesinstitut fur Risikobewertung (BfR) en Berlin. Los ratones eran de 6-8 semanas de edad al inicio de los experimented y se mantuvieron en condiciones libres de patogenos espedficos (SPF). Los experimentos en animales se realizaron con la aprobacion del Landesamt fur Gesundheit und Soziales (LAGeSo, Berlin, Alemania).

Bacterias

El MTB H37Rv y las cepas pBCG y rBCG usadas se describieron previamente (12). Las bacterias se cultivaron en caldo Middlebrook 7H9 suplementado con glicerol, Tween 80 al 0,05 % y ADC. Se recogieron cultivos semi- logantmicos y se almacenaron a -80 °C hasta su uso. Todas las reservas se titularon antes de su uso. Se obtuvieron suspensiones bacterianas de celulas individuales por transferencia repetida a traves de una jeringa con una aguja 27G.

Vacunacion e infeccion por MTB

Se administraron pBCG o rBCG (106 CFU) por via subcutanea (s.c.) en cercana proximidad a la base de la cola. Se realizo infeccion aerogenica de ratones con MTB usando un sistema de exposicion por inhalacion Glas-Col. Las cargas bacterianas se evaluaron por alteracion mecanica de organos retirados de forma aseptica en PBS con Tween 80 al 0,05 % v/v y siembra de diluciones en serie en placas de agar Middlebrook 7H11 1 suplementadas con OADC. Despues de 3 semanas, se contaron las colonias MTB. La significacion estadfstica de los resultados se determino por ensayo de Mann-Whitney con valores P bilaterales para datos no parametricos usando GraphPad Prism 5.0.

Aislamiento de celulas, estimulaciones y citometria de flujo

Las celulas se purificaron como se ha descrito previamente (42). Los grupos experimentales comprendfan cinco ratones. Se combinaron dos bazos o pulmones y se proceso una muestra individualmente, produciendo tres muestras por grupo de cinco ratones para posteriores estimulaciones. Las celulas se estimularon con 50 pg/ml de PPD (SSI, Copenhague, Dinamarca) durante 20 horas para analisis de citoquinas por ensayo combinado o durante 6 horas en presencia de 25 pg/ml de Brefeldina A para tincion de citoquinas intracelulares (ICS). Se usaron los siguientes anticuerpos: CD4 (RM4-5), IFNy (XMG-1.2), IL2 (JES6-5H4), Ly6G/C (RB6-8C5), CD11b (M1/70), yS-TCR (GL-3), conjunto de tincion FoxP3 y CD49b (clon Dx5) todos de eBioscience. CD8a (YTS169), TNF-a (XT22), CD16/CD32 (2.4G2), F4/80 (CI:A3-1) y CD11 c (N418) se purificaron de sobrenadantes de hibridoma y se marcaron de forma fluorescente en el propio laboratorio. IL-17 (TC11-18H10) se obtuvo de BD Biosciences. Las celulas se analizaron usando un citometro de flujo FACSCanto II o LSRII y el software FACSDiva (BD Biosciences). Las citoquinas se midieron usando los inmunoensayos basados en perlas Bio-Plex de Th1/Th2 de raton, IL17 e IL6 de Bio-Rad de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se midieron IL21 e IL22 por ELISA de R&D systems. Se detecto IL17 humana con un ensayo Milliplex de 42 combinaciones de Millipore.

Lavado peritoneal

Se prepararon de forma reciente pBCG o rBCG de cultivos semi-logantmicos. Las bacterias se lavaron tres veces con PBS y se determino la concentracion midiendo la densidad optica a 580 nm. La administracion de 106 CFU se realizo por via intraperitoneal. Se obtuvieron celulas reclutadas de la cavidad peritoneal 5 horas o 6 dfas despues por inyeccion de 5 ml de PBS y se analizaron por citometna de flujo. Las citoquinas y quimioquinas en el fluido de lavado se determinaron usando el kit Bio-Plex de citoquinas de raton de 23 combinaciones de Bio-Rad.

Resultados

Respuestas Th1/Th17 despues de vacunacion con rBCG y pBCG

En un intento por dilucidar los mecanismos inmunitarios relevantes para la eficacia de vacuna contra TB, se compararon las respuestas inmunitarias contra rBCG y pBCG en ratones. Se habfa determinado originalmente una eficacia superior de proteccion de rBCG despues de inmunizacion i.v. (12). Aqu se demuestra que la administracion s.c. de rBCG induda niveles comparables de proteccion y retema su eficacia superior sobre pBCG (Figura 1A). A continuacion, se analizaron respuestas de memoria a largo plazo en pulmones y bazos de ratones 83 dfas despues de vacunacion s.c. con rBCG o pBCG. Las celulas se re-estimularon con PPD y se analizaron los sobrenadantes por ensayos combinados para citoquinas. La inmunizacion con rBCG indujo produccion significativamente mayor de citoquinas por celulas aisladas del pulmon en comparacion con pBCG (Figura 2A). Estas inclrnan IFNy, IL2, IL6, y GM-CSF. En contraste, las citoquinas de tipo 2 IL4, IL5, e IL10 no estaban aumentadas por encima de los niveles de

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

fondo (datos no mostrados). Curiosamente, se produjeron concentraciones aproximadamente 3 veces mayores de IL17 por celulas pulmonares de ratones vacunados con rBCG. Observese que pudieron aislarse solamente unas pocas celulas de los pulmones de ratones no infectados. Por consiguiente, las concentraciones globales de citoquinas fueron inferiores que en bazo donde podfan usarse densidades celulares 10 veces mayores por pocillo para la estimulacion (Figura 2b). En los bazos, ambas vacunas provocaron respuestas Th1 igual de fuertes como se refleja por las concentraciones comparables de IL2, IL6, IFNy y GM-CSF. Ademas, las celulas del bazo de ratones vacunados con rBCG produjeron significativamente mas IL17 tras re-estimulacion con PPD en comparacion con animales vacunados con pBCG. Por tanto, la inmunizacion con rBCG, pero no con pBCG, induda respuestas Th1 y Th17 concomitantes y fuertes en pulmones y bazos, que estaban sostenidas durante periodos prolongados de tiempo.

Reclutamiento acelerado de celulas T espedficas de MTB tras infeccion con MTB virulento en ratones vacunados con rBCG

Las celulas TH17 se han vinculado a la vigilancia inmunitaria mejorada (13). Se compararon respuestas de celulas T especificas de antigeno en animales vacunados tras infeccion por aerosol con MTB virulento, en pulmones y bazos 7 dfas post-infeccion. Se detecto produccion marcada de IFNy, IL17, IL2 y GM-CSF por celulas pulmonares de ratones vacunados con rBCG 20 horas despues de la re-estimulacion con PPD (Figura 3A) o peptidos Ag85A (datos no mostrados). En contraste, estas citoquinas se secretaban escasamente por celulas de ratones vacunados con pBCG. En animales no vacunados infectados con MTB, la produccion de citoquinas estuvo por debajo del lfmite de deteccion, de acuerdo con los informes previos de que las celulas T espedficas de MTB no aparecen antes de 3 semanas despues de infeccion con MTB (13). Las citoquinas de tipo 2 IL4, IL5 e IL10 no se detectaron y TNFa, IL12p70 e IL6 estuvieron solamente en niveles escasamente por encima de los de fondo en este punto temporal prematuro posterior a exposicion a MTB (datos no mostrados).

Se determino la produccion de citoquinas por celulas T pulmonares por citometna de flujo 7 dfas despues de infeccion con MTB (Figura 3B). Las celulas se estimularon con PPD durante 6 horas seguido por tincion de citoquinas intracelulares para IL2, IL17, IFNy y TNFa. En controles no vacunados, una pequena proporcion de celulas T CD4 produjo IL2, TNFa o IFNy. En ratones vacunados, las celulas T CD4 secretaban IL2, IFNy, TNFa y tambien IL17. Las frecuencias de celulas productoras de una citoquina fueron las mas altas, aunque no significativas, en el grupo de rBCG. En animales vacunados se detectaron celulas T multifuncionales implicadas en inmunidad protectora (14). Las celulas T productoras de multiples citoquinas fueron predominantemente productoras dobles IL2+TNFa+ y aumentaron significativamente tras vacunacion con rBCG. Las celulas productoras triples fueron casi exclusivamente IL2+IFNY+TNFa+ y estaban ligeramente aumentadas en ratones vacunados con rBCG en comparacion con ratones vacunados con pBCG. Ademas, las celulas positivas cuadruples IL2+TNFa+IFNY+IL17+ aparedan exclusivamente en el grupo de rBCG aunque a frecuencias muy bajas.

En principio, las celulas T esplenicas produjeron patrones de citoquinas similares a los de celulas T pulmonares (Figura 4). La produccion de IL2 y GM-CSF fue significativamente mayor en los animales vacunados con rBCG en comparacion con el grupo de pBCG y por debajo del nivel de deteccion en controles no vacunados, aunque en controles no vacunados, un pequeno porcentaje de celulas T CD4 produjo IFNy. En resumen, la vacunacion con pBCG o rBCG induda celulas T CD4 que secretaban IFNy y TNFa con frecuencias mayores de productores individuales y multiples en ratones vacunados con rBCG en comparacion con el grupo de pBCG.

A los 7 dfas p.i., las celulas T CD4 eran las principales productoras de citoquinas; se detectaron productores de citoquinas cD8 con frecuencias inferiores en el pulmon (Figura 6) y el bazo (Figura 7) aunque con patrones similares. Es de observar que se detectaron frecuencias significativamente mayores de celulas T CD8 productoras individuales de TNFa en el grupo de rBCG.

La produccion diferencial de citoquinas y las frecuencias de celulas productoras no se debfan a diferentes cargas bacterianas en este punto temporal prematuro despues de infeccion, como se confirmo por las cantidades comprables de unidades formadoras de colonias (CFU) en pulmones y bazos (Figura 1B). Las cantidades totales de celulas Treg aumentaron tras infeccion hasta un grado comprable en los dos grupos vacunados (Figura 5).

La vacunacion con rBCG confiere potentes respuestas inmunitarias durante infeccion persistente

Se analizaron las respuestas inmunitarias espedficas de MTB 90 dfas p.i. cuando las cargas bacterianas pulmonares eran aproximadamente 10 veces inferiores en animales inmunizados con rBCG en comparacion con el grupo de pBCG y 100 veces inferiores en comparacion con el grupo de control no vacunado. Las celulas de pulmones de ratones vacunados y controles no tratados se re-estimularon con PPD durante 20 horas y se midieron las concentraciones de citoquinas por ensayos combinados (Figura 8A). Las citoquinas detectadas tras re- estimulacion eran predominantemente de tipo 1. Sin embargo, no pudieron detectarse diferencias en IFNy o IL17 entre los grupos vacunados durante infeccion persistente. En contraste, las cantidades de IL2, IL6, GM-CSF y TNFa fueron mayores en ratones vacunados con rBCG. En todos los grupos, IL4 e IL5 estuvieron por debajo del Kmite de deteccion y se midio algo de IL12p70 e IL10 (datos no mostrados). Adicionalmente, el analisis de celulas pulmonares por citometna de flujo multicolor revelo predominantemente celulas T CD4 productoras de citoquinas durante

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

infeccion persistente (Figura 8B). Se detectaron celulas T CD4 que secretaban solamente IFNy en todos los grupos con frecuencias similares. Tras vacunacion, tambien pudieron detectarse celulas T CD4 productoras de IL2, IFNy, TNFa e IL17 en diferentes combinaciones. Curiosamente, las frecuencias de celulas T CD4 respondedoras no difenan significativamente entre vacunacion con rBCG y pBCG a pesar de las mayores concentraciones de IL2 y TNFa en los sobrenadantes. Se asume que ambas vacunas aumentaban las frecuencias de celulas T CD4 espetficas de antigeno en el pulmon durante infeccion con MTB persistente llegando a ser las celulas T inducidas por rBCG productores mas potentes de citoquinas. Las celulas T CD8 secretaban casi exclusivamente IFNy con frecuencias comparables en todos los grupos mientras que se detectaron significativamente mas celulas T CD8 productoras de solamente TNFa en el grupo de rBCG. Aparetan celulas T CD8 multifuncionales escasamente por encima del fondo (Figura 9).

La vacunacion causa produccion de IL22 pero no de IL21

Las celulas Th17 pueden producir citoquinas efectoras adicionales tales como IL21 (15) e IL22 (16). Se han identificado celulas productoras de IL22 en pacientes con TB, pero estas parecen distintas de las celulas productoras de IL17 (17). No se detecto IL21 despues de estimulacion con PPD de celulas de bazo o pulmonares de ratones vacunados y posteriormente infectados con MTB (Figura 10A). Se produjo IL22 a concentraciones elevadas por esplenocitos estimulados con PPD durante 20 horas (Figura 10B) en ratones inmunizados con rBCG pero no aumentaron adicionalmente poco despues de infeccion con MTB. La produccion de IL22 por celulas pulmonares se observo solamente en el grupo vacunado con rBCG y disminuyo despues de infeccion con MTB en aerosol.

rBCG intraperitoneal causa reclutamiento aumentado de celulas T y5 y celulas NK sin alterar significativamente las poblaciones de APC

Se deseaba definir los mecanismos subyacentes a la induccion de celulas Th17 preferentes despues de inmunizacion con rBCG. Para este fin, se administraron i.p. rBCG y pBCG, se aislaron las celulas inmigrantes de la cavidad peritoneal 5 horas y 6 dfas despues de la administracion y se analizaron por citometna de flujo (Figura 11A). Los neutrofilos (definidos como Gr1HI, CD11bHI, MHCII-, CD11c-) entraron rapidamente en la cavidad peritoneal y permanecieron elevados en el dfa 6 p.i. en los grupos de pBCG y rBCG al mismo grado. Las frecuencias de macrofagos peritoneales residentes (definidos como CD11bHI, F4/80, Gr1-, MHCIIhi, CD11c-) y celulas dendnticas (CD11c+, CDl1bLO, Gr1-) permanecieron inalteradas a bajos porcentajes. En resumen, no fueron detectables diferencias significativas entre los grupos de rBCG y pBCG. Las celulas peritoneales recogidas 5 horas despues de vacunacion se sometieron a estimulacion policlonal (Figura 11B) con anticuerpos aCD3/aCD28. Las frecuencias de celulas T CD4 y celulas NK fueron comparables entre todos los grupos como la produccion de IFNy e IL17. Seis dfas despues de la administracion, estas celulas aumentaron numericamente y alcanzaron las mayores frecuencias en el grupo de rBCG (Figura 11C). Se uso PPD para la re-estimulacion de celulas en el punto temporal de 6 dfas. Las celulas T CD4 no produjeron cantidades apreciables de IFNy o IL17, aunque una proporcion sustancial de celulas NK produjo IFNy despues de administracion de rBCG. Las celulas T y§ se han identificado como una fuente principal de IL17 prematura en TB (18). Se identificaron proporciones aumentadas, aunque no significativas, de celulas T y§ que producen IFNy 5 horas post-inyeccion con rBCG. Esta poblacion celular aumentaba adicionalmente y se detectaron frecuencias marcadamente mayores de celulas T y§ que producen IL17 en grupo el de rBCG 6 dfas despues de la inyeccion. No se detectaron celulas T CD8 en el peritoneo en ninguno de los grupos. Se analizaron las citoquinas y quimioquinas presentes en la cavidad peritoneal por ensayo combinado de fluido de lavado peritoneal (Figura 11D). Aumentaron rapidamente MCP-1, MIP1a, G-CSF y KC tras inyeccion; los niveles de Eotaxina permanecieron inalterados y se detecto IL12p40 en concentraciones mayores despues de 6 dfas. Las concentraciones de IL12p70, IFNy, IL1a, IL2, IL3, IL4, IL5, IL10, IL17, GM-CSF, y TNFa estuvieron por debajo del lfmite de deteccion mientras que IL1p, IL6, IL9, IL13, MIP1p y RANTES pudieron medirse, pero la produccion fue comparable entre rBCG y pBCG. Por tanto, rBCG y pBCG indutan reclutamiento de APC asf como produccion de quimioquinas y citoquinas en el sitio de administracion a un grado similar. Curiosamente, las proporciones de celulas T y§ que secretan IL17 y celulas NK que producen IFNy fueron las mas abundantes despues de administracion de rBCG.

La vacunacion con rBCG genera celulas productoras de IL17 en seres humanos

Por ultimo, se analizaron las PBMC de voluntarios humanos sanos de un ensayo clmico en fase I para cuestionar si la produccion de IL17 estaba aumentada en participates del estudio vacunados con rBCG. Se obtuvo sangre de los voluntarios 29 dfas despues de inmunizacion con rBCG o pBCG y se aislaron las PBMC y se congelaron. Las PBMC se descongelaron y dejaron en reposo durante la noche, seguido por re-estimulacion de 20 horas con PPD. Se analizo la produccion de citoquinas por ensayos combinados. La produccion de IL17 se detecto exclusivamente en PBMC de participates del estudio inmunizados con rBCG (Figura 12). Observese que estaba disponible una cantidad limitada de muestras.

Analisis

La identificacion de marcadores inmologicos de proteccion es crucial para el diseno racional de vacunas novedosas contra TB. Estos marcadores tambien podnan establecer la base para la definicion de marcadores sustitutos para

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

predecir criterios de valoracion de resultado clmico en ensayos de eficacia de vacuna contra TB y por tanto proporcionar directrices para la mejora de candidates actuales de vacuna. La importancia de las citoquinas clave que activan las capacidades antimicobacterianas de los macrofagos incluyendo IFNy (21) y TNFa (22), y la necesidad de IL2 en la expansion de celulas de memoria (23) esta bien establecida y por tanto se usa habitualmente para controlar los ensayos de vacuna contra TB.

En un intento por identificar biomarcadores de eficacia de vacuna, se compararon las respuestas inmunitarias de memoria a largo plazo provocadas por rBCG que demostraron conferir proteccion superior sobre su cepa precursora, pBCG. Las respuestas difenan en terminos tanto cuantitativos como cualitativos. Se detecto abundancia aumentada de citoquinas de tipo 1 asf como IL17 despues de vacunacion con rBCG en el pulmon (Figura 2A). El analisis de respuestas inmunitarias inducidas por vacuna en pulmon obviamente no es factible en el contexto de ensayos clmicos. Por lo tanto, tambien se analizaron las respuestas de memoria sistemica a largo plazo (Figura 2B). Curiosamente, se detectaron concentraciones comparables de citoquinas que dirigen el tipo 1 en los grupos de pBCG y rBCG. En contraste, la produccion de IL17 por esplenocitos estuvo significativamente elevada tras vacunacion con rBCG. Por tanto, se concluyo que IL17, en lugar de IFNy o IL2 reune los requisitos de un marcador de proteccion superior inducida por rBCG.

Las celulas Th17 contribuyen a la defensa antimicrobiana atrayendo y activando neutrofilos (24) que estan entre las primeras celulas a reclutarse en respuesta a IL17. Se ha demostrado que IL17 es dispensable durante infeccion primaria por MTB (25,26), pero gana importancia en las respuestas de memoria (13). Ademas, los recientes informes sobre la expresion de CCR6 en celulas Th17 humanas (27, 28) apuntan hacia un bucle de retroalimentacion positiva, porque CCR6 es el receptor para CCL20 producido por neutrofilos (29) y CCL20-CCR6 se ha implicado en la inmunopatogenesis de TB (30). Por tanto, las celulas Th17 podnan facilitar el reclutamiento acelerado de celulas T de memoria espedficas de antfgeno a los sitios de residencia bacteriana. Analizando las respuestas inmunitarias inducidas por vacuna 7 dfas despues de infeccion por aerosol con MTB, se demuestra que la vacunacion con rBCG de hecho conduce a reclutamiento acelerado de celulas efectoras a los sitios de replicacion bacteriana. Se observaron frecuencias aumentadas de celulas T CD4 espedficas de antfgeno y produccion elevada de IL2, IL17, IFNy y GM-CSF por celulas de pulmon (Figura 3) y bazo (Figura 4).

Las celulas T CD4 multifuncionales que co-producen IL2, IFNy y TNFa se implicaron por primera vez en estrategias de vacunacion satisfactoria contra Leishmania major (14) y posteriormente tambien contra MTB (31). Recientemente, estas celulas T CD4 polifuncionales tambien se detectaron en ensayos clmicos de vacuna contra TB (32, 33). Se detectaron celulas T CD4 polifuncionales tras vacunacion con rBCG y pBCG y posterior infeccion (Figuras 3 y 4); sin embargo, la composicion de citoquinas (IL2, IL17, IFNy y TNFa) en productores dobles y triples vario considerablemente entre experimentos asf como entre animales individuales. Si las celulas multifuncionales fueran un correlato verdadero de proteccion, entonces sus frecuencias globales, que eran mayores en el grupo de rBCG, en lugar de su composicion, parecen mas relevantes.

^Por que rBCG induda una respuesta Th17? La inmunizacion con rBCG y pBCG causaba reclutamiento de APC asf como de productores de quimioquinas y citoquinas a un grado similar. Curiosamente, las proporciones de celulas T Y8 que secretan IL17 y celulas NK que producen IFNy eran altamente abundantes despues de vacunacion con rBCG. Esto es coherente con los informes que demuestran que IL17 puede producirse rapidamente por celulas T y§ (34, 18) asf como celulas T NK (35). Las celulas NK, que tambien estaban aumentadas tras vacunacion con rBCG, son una fuente importante de IFNy prematuro. Ya se ha demostrado que diferentes componentes moleculares liberados de rBCG residen en el citosol de macrofagos infectados (12). Nod-2 es un PRR citosolico importante y su participacion se ha vinculado al desarrollo de respuestas de celulas T de memoria Th17 (19).

La apoptosis inducida durante infeccion bacteriana induce celulas Th17 (36). Se han obtenido evidencias de que rBCG induce apoptosis aumentada en comparacion con pBCG (12), que podna contribuir adicionalmente al desarrollo aumentado de celulas Th17. La activacion de inflamasomas podna tambien contribuir a las respuestas de memoria Th17 mediante la produccion de IL1p (37). Se ha descubierto que NLRP3, por ejemplo, detecta la presencia de listeriolisina a traves de cambios en los niveles de ATP (38). Por tanto, la induccion de celulas Th17 tras vacunacion con rBCG podna requerir una interaccion compleja de estfmulos intracelulares y apoptosis aumentada.

Las celulas Th17 se consideran instrumentales en enfermedades inflamatorias y autoinmunitarias tales como artritis inducida por colageno (39), EAE (40, 39) e hipersensibilidad alergica de las vfas respiratorias (41, 39) en lugar de ser beneficiosas para una vacunacion satisfactoria. Este papel patogenico habitualmente esta asociado con el desarrollo de una respuesta inflamatoria mediada por IL21 profunda. Nunca se detecto IL21 despues de vacunacion y posterior infeccion con MTB por encima de los niveles de fondo en ningun experimento (Figura 10A). Ademas, nunca se observaron signos de autoinmunidad o inflacion excesiva en el sitio de inyeccion tras vacunacion con rBCG ni en el pulmon hasta 200 dfas post-infeccion con MTB.

En un primer intento por comparar los datos de TB experimental en ratones con datos humanos, se analizaron los perfiles de citoquinas de PBMc congeladas de un ensayo clmico en fase I con rBCG y pBCG. En una cantidad limitada de muestras se detecto produccion de IL17 despues de vacunacion con rBCG, pero no con pBCG. Se han

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

detectado celulas Th17 en sangre periferica de seres humanos infectados con MTB (17). Recientemente, se ha informado de celulas T CD4 productoras de IL17 en adolescentes vacunados con un candidato de vacuna contra TB compuesto de virus vaccinia modificado Ankara que expresa Ag85A (33). Las respuestas alcanzaron el maximo entre los dfas 7 y 28 post-vacunacion y disminuyeron despues de ello. Esto esta en lmea con nuestros datos que muestran produccion elevada de IL17 en el dfa 29 post-vacunacion en el grupo de rBCG (Figura 12). Por tanto, es tentador proponer IL17 como correlato de proteccion en ensayos de vacuna contra TB.

En resumen, se ha demostrado que la vacunacion con rBCG conduce a generacion preferente de celulas Th17, probablemente dependiente del reconocimiento intracelular de componentes bacterianos por Nod-2. Estas celulas Th17 a su vez aceleran el reclutamiento de celulas T espedficas de antigeno al pulmon. Finalmente, esta cascada de eventos provoca contencion prematura de MTB y, por tanto, proteccion superior por rBCG en comparacion con pBCG. Se detecto produccion de IL17 exclusivamente por PBMC de voluntarios vacunados con rBCG en un ensayo clmico en fase I completado de forma satisfactoria. Como IL17 parece instrumental para el reclutamiento acelerado de celulas T espedficas de antfgeno a los sitios de replicacion de MTB, las futuras vacunas contra TB debenan estar adaptadas a inducir de forma concomitante respuestas Th1 y Th17 equilibradas.

Lista de referencias

1. Hoja informativa de tuberculosis n.° 104 marzo. OMS. 2010.

2. Calmette A. Sur la vaccination preventive des enfants nouveau-nes contre tuberculose par le BCG. Ann Inst Pasteur. 1929;41201-232.

3. Reece ST, Kaufmann S. H. Rational design of vaccines against tuberculosis directed by basic immunology. Int J Med Microbiol. 2008;298(1-2):143-150.

4. Trunz BB, Fine P., Dye C. Effect of BCG vaccination on childhood tuberculous meningitis and miliary tuberculosis worldwide: a meta-analysis and assessment of cost-effectiveness. Lancet. 2006;367(9517):1173- 1180.

5. Colditz GA, Brewer T. F., BerkeyC. S., Wilson M. E., Burdick E., Fineberg H. V.et el. Efficacy of BCG vaccine in the prevention of tuberculosis. Meta-analysis of the published literature. JAMA. 1994;271 (9):698-702.

6. Skeiky YA, Sadoff J. C. Advances in tuberculosis vaccine strategies. Nat Rev Microbiol. 2006;4(6):469-476.

7. Kaufmann SH, Baumann S., Nasser Eddine A. Exploiting immunology and molecular genetics for rational vaccine design against tuberculosis. Int J TubercLung Dis. 2006; 10(10):1068-1079.

8. Fletcher HA. Correlates of immune protection from tuberculosis. Curr Mol Med. 2007;7(3):319-325.

9. Goldsack L, Kirman J. R. Half-truths and selective memory: Interferon gamma, CD4(+) T cells and protective memory against tuberculosis. Tuberculosis (Edinb). 2007;87(6):465-473.

10. Tchilian EZ, DeselC., Forbes E. K., Bandermann S., Sander C. R., Hill A. V.et el. Immunogenicity and protective efficacy of prime-boost regimens with recombinant (delta)ureC hly+ Mycobacterium bovis BCG and modified vaccinia virus ankara expressing M. tuberculosis antigen 85A against murine tuberculosis. Infect Immun. 2009;77(2):622-631.

11. Pearl JE, Saunders B., Ehlers S., Orme I. M., Cooper A. M. Inflammation and lymphocyte activation during mycobacterial infection in the interferon-gamma-deficient mouse. Cell Immunol. 2001;211(1):43-50.

12. Grode L, Seiler P., Baumann S., Hess J., Brinkmann V., Nasser Eddine A.et el. Increased vaccine efficacy against tuberculosis of recombinant Mycobacterium bovis bacille Calmette-Guerin mutants that secrete listeriolysin. J Clin Invest. 2005;115(9):2472-2479.

13. Khader SA, Bell G. K., Pearl J. E., Fountain J. J., Rangel-Moreno J., Cilley G. E.et al. IL-23 and IL-17 in the establishment of protective pulmonary CD4+ T cell responses after vaccination and during Mycobacterium tuberculosis challenge. Nat Immunol. 2007;8(4):369-377.

14. Darrah PA, Patel D. T., De Luca P. M., Lindsay R. W., Davey D. F., Flynn B. J.et el. Multifunctional TH1 cells define a correlate of vaccine-mediated protection against Leishmania major. Nat Med. 2007;13(7):843-850.

15. Korn T, Bettelli E., Gao W., Awasthi A., Jager A., Strom T. B.et al. IL-21 initiates an alternative pathway to induce proinflammatory T(H)17 cells. Nature. 2007;448(7152):484-487.

16. Liang SC, Tan X. Y., Luxenberg D. P., Karim R., Dunussi-Joannopouios K., Collins M.et al. Interleukin (IL)-22

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

and IL-17 are coexpressed by Th17 cells and cooperatively enhance expression of antimicrobial peptides. J Exp Med. 2006;203(10):2271-2279.

17. Scriba TJ, Kalsdorf B., Abrahams D. A., Isaacs F., Hofmeister J., Black G.et al. Distinct, Specific IL-17- and IL-22-Producing CD4+ T Cell Subsets Contribute to the Human Anti-Mycobacterial Immune Response. J Immunol. 2008;180(3):1962-1970.

18. Lockhart E, Green A. M., Flynn J. L. IL-17 production is dominated by gammadelta T cells rather than CD4T cells during Mycobacterium tuberculosis infection. J Immunol. 2006;177(7):4662-4669.

19. van Beelen AJ, Zelinkova Z., Taanman-Kueter E. W., Muller F. J., Hommes D. W., Zaat S. A.et al. Stimulation of the intracellular bacterial sensor NOD2 programs dendritic cells to promote interleukin-17 production in human memory T cells. Immunity. 2007;27(4):660-669.

20. Ferwerda G, Girardin S. E., Kullberg B. J., Le Bourhis L, de Jong D. J., Langenberg D. M.et al. NOD2 and tolllike receptors are nonredundant recognition systems of Mycobacterium tuberculosis. PLoS Pathog. 2005;1 (3):279-285.

21. Flynn JL, Chan J., Triebold K. J., Dalton D. K., Stewart T. A., Bloom B. R. An essential role for interferon gamma in resistance to Mycobacterium tuberculosis infection. J Exp Med. 1993;178(6):2249-2254.

22. Flynn JL, Goldstein M. M., Chan J., Triebold K. J., PfefferK., Lowenstein C. J.et al. Tumor necrosis factor- alpha is required in the protective immune response against Mycobacterium tuberculosis in mice. Immunity. 1995;2(6):561-572.

23. Williams MA, Tyznik A. J., Bevan M. J. Interleukin-2 signals during priming are required for secondary expansion of CD8+ memory T cells. Nature. 2006;441(7095):890-893.

24. Happel Kl, Dubin P. J., Zheng M., Ghilardi N., Lockhart C., Quinton L. J.et al. Divergent roles of IL- 23 and IL- 12 in hostdefense against Klebsiella pneumoniae. J Exp Med. 2005;202(6):761-769.

25. Khader SA, Pearl J. E., Sakamoto K., Gilmartin L., Bell G. K., Jelley-Gibbs D. M.et al. IL-23 compensates for the absence of IL-12p70 and is essential for the IL-17 response during tuberculosis but is dispensable for protection and antigen-specific IFN- gamma responses if IL-12p70 is available. J Immunol. 2005;175(2):788-795.

26. Steinman L. A brief history of T(H)17, the first major revision in the T(H)1/T(H)2 hypothesis of T cell-mediated tissue damage. Nat Med. 2007;13(2):139-145.

27. Singh SP, Zhang H. H., Foley J. F., Hedrick M. N., Farber J. M. Human T cells that are able to produce IL-17 express the chemokine receptor CCR6. J Immunol. 2008;180(1):214-221.

28. Liu H, Rohowsky-Kochan C. Regulation of IL-17 in human CCR6+ effector memory T cells. J Immunol. 2008; 180(12):7948-7957.

29. Scapini P, Laudanna C., Pinardi C., Allavena P., Mantovani A., Sozzani S.et al. Neutrophils produce biologically active macrophage inflammatory protein-3alpha (MIP-3alpha)/CCL20 and MIP-3beta/CCL19. Eur J Immunol. 2001;31(7):1981-1988.

30. Lee JS, Lee J. Y., Son J. W., Oh J. H., Shin D. M., Yuk J. M.et al. Expression and regulation of the CC- chemokine ligand 20 during human tuberculosis. Scand J Immunol. 2008;67(1):77-85.

31. Forbes EK, Sander C., Ronan E. O., McShane H., Hill A. V., Beverley P. C.et al. Multifunctional, high-level cytokine-producing Th1 cells in the lung, but not spleen, correlate with protection against Mycobacterium tuberculosis aerosol challenge in mice. J Immunol. 2008;181(7):4955-4964.

32. Abel B, Tameris M., Mansoor N., Gelderbloem S., Hughes J., Abrahams D.et al. The novel tuberculosis vaccine, AERAS-402, induces robust and polyfunctional CD4+ and CD8+ T cells in adults. Am J Respir Grit Care Med. 2010;181(12):1407-1417.

33. Scriba TJ, Tameris M., Mansoor N., Smit E., van der Merwe L., Isaacs F.et al. Modified vaccinia Ankara- expressing Ag85A, a novel tuberculosis vaccine, is safe in adolescents and children, and induces polyfunctional CD4+ T cells. Eur J Immunol. 2010;40(1):279-290.

34. Roark CL, Simonian P. L., Fontenot A. P., Born W. K., O'Brien R. L.gammadeltaT cells: an important source of IL-17. Curr Opin Immunol. 2008;20(3):353-357.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

35. Rachitskaya AV, Hansen A. M., Horai R., Li Z., Villasmil R., Luger D.et al. Cutting edge: NKT cells constitutively express IL-23 receptor and RORgammatand rapidly produce IL-17 upon receptor ligation in an IL-6- independent fashion. J Immunol. 2008;180(8):5167-5171.

36. Torchinsky MB, Garaude J., Martin A. P., Blander J. M. Innate immune recognition of infected apoptotic cells directs T(H)17 cell differentiation. Nature. 2009;458(7234):78-82.

37. Meng G, Zhang F., Fuss L. Kitani A., Strober W. A mutation in the Nlrp3 gene causing inflammasome hyperactivation potentiates Th17 cell-dominant immune responses. Immunity. 2009;30(6):860-874.

38. Mariathasan S, Weiss D. S., Newton K., McBride J., O'Rourke K., Roose-Girma M. et al. Cryopyrin activates the inflammasome in response to toxins and ATP. Nature. 2006;440(7081):228-232.

39. Nakae S, Nambu A., Sudo K., Iwakura Y Suppression of immune induction of collagen-induced arthritis in IL- 17-deficient mice. J Immunol. 2003;171 (11):6173-6177.

40. Langrish CL, Chen Y., Blumenschein W. M., Mattson J., Basham B., Sedgwick J. D.et al. IL-23 drives a pathogenic T cell population that induces autoimmune inflammation. J Exp Med. 2005;201 (2):233-240.

41. Hellings PW, Kasran A., Liu Z., Vandekerckhove P., Wuyts A., Overbergh L.et al. Interleukin-17 orchestrates the granulocyte influx into airways after allergen inhalation in a mouse model of allergic asthma. Am J Respir Cell Mol Biol. 2003;28(1):42-50.

42. Kursar M, Koch M., Mittrucker H. W., Nouailles G., Bonhagen K., Kamradt T.et al. Cutting Edge: Regulatory T cells prevent efficient clearance of Mycobacterium tuberculosis. J Immunol. 2007; 178(5):2661-2665.

43. Brosch R, Gordon SV, Gamier T, Eiglmeier K, Frigui W, Valenti P, Dos Santos S, Duthoy S, Lacroix C, Garcia-Pelayo C, Inwald JK, Golby P, Garcia JN, Hewinson RG, Behr MA, Quail MA, Churcher C, Barrell BG, Parkhill J, Cole ST, Proc Natl Acad Sci USA. 27 de marzo de 2007; 104 (13): 5596-601. Epub 19 de marzo de 2007.

44. Jay K. Kols Th17 cells in mucosal immunity and tissue inflammation. Semin Immunopathol. 2010; 32:1-2

45. de Cassan S.C., Pathan A.A., Sander C.R., Minassian A., Rowland R., Hill A.V.S., McShaneH, Fletcher H.A. Investigating the Induction of Vaccine-Induced Th17 and Regulatory T Cells in Healthy, Mycobacterium bovis BCG-Immunized Adults vaccinated with a New Tubervulosis Vaccine, MVA 85A. Clin. Vaccine Immunol. 2010; 17(7):1066-1073.

46. Lin Y., Slight S.R., Khader S.A. Th17 cytokines and Vaccine Induced Immunity. Semin. Immunopathol. 2010; 32(1):79-90.

47. Desel C., Dorhoi A., Bandermann S., Grode L., ElseleB., Kaufmann S.H.E. Recombinant BCG Aure C hly + Induces Superior Protection over Parental BCG by stimulating a Balanced Combination of Type 1 and Type 17 Cytokine Responses. Journal of Infectious Diseases. 2011; 204(10):1573-1584.

48. Documento WO 99/10496 (MAX PLANCKGESELLSCHAFT ZUR FORDERUNG DER WISSENSCHAFTEN) [DE]

49. Documento WO 2004/094469 (MAX PLANCKGESELLSCHAFT ZUR FORDERUNG DER WISSENSCHAFTEN) [DE]

50. Documento US 61/384.375 (MAX PLANCKGESELLSCHAFT ZUR FORDERUNG DER WISSENSCHAFTEN) [DE]

Claims (11)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   REIVINDICACIONES

   1. Un metodo para determinar la eficacia de una vacuna viva micobacteriana recombinante, que comprende determinar la respuesta inmunitaria T auxiliar de tipo 17 (Th17) en un sujeto vacunado, en el que una respuesta inmunitaria Th17 detectable es indicativa de inmunidad protectora en dicho sujeto.
2. 2. El metodo de la reivindicacion 1, en el que la vacuna es una Mycobacterium recombinante que comprende una molecula de acido nucleico recombinante que codifica un polipeptido de fusion que comprende (a) un dominio capaz de provocar una respuesta inmunitaria y (b) un dominio de escape fagolisosomico.
3. 3. El metodo de la reivindicacion 2, en el que la Mycobacterium es deficiente en ureasa.
4. 4. El metodo de la reivindicacion 3, en el que la Mycobacterium es rBCGAUreC :: Holy* :: Hyg+.
5. 5. El metodo de la reivindicacion 1, en el que la vacuna es una vacuna de subunidad.
6. 6. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que la vacuna es una vacuna contra infecciones micobacterianas, particularmente infecciones micobacterianas pulmonares, mas particularmente tuberculosis.
7. 7. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que la determinacion de la respuesta inmunitaria Th17 comprende someter a una muestra que comprende celulas inmunitarias de dicho sujeto vacunado a una re- estimulacion con un inmunogeno correspondiente al inmunogeno en dicha vacuna y determinar la presencia y/o la cantidad de celulas asociadas a respuesta inmunitaria Th17 en dicha muestra.
8. 8. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que la determinacion de la respuesta inmunitaria Th17 comprende determinar IL17, por ejemplo, por metodos inmunologicos.
9. 9. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que el sujeto es un mairnfero, por ejemplo, un ser humano.
10. 10. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que la respuesta inmunitaria Th17 se determina 20-50 dfas despues de la vacunacion.
11. 11. Uso de un kit de reactivos en el metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10 para determinar la eficacia de una vacuna viva micobacteriana recombinante, que comprende (a) un reactivo para la re-estimulacion de celulas inmunitarias de un sujeto previamente vacunado, y (b) un reactivo para la determinacion de una respuesta inmunitaria Th17.