PT2656070E - Determinação da eficácia de uma vacinação antimicobacteriana viva recombinante - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "DETERMINAÇÃO DA EFICÁCIA DE UMA VACINAÇÃOANTIMICOBACTERIANA VIVA RECOMBINANTE" A invenção refere-se a métodos e reagentes paradeterminação da eficácia de uma vacina, particularmente deuma vacina contra a tuberculose.

Todos os anos, até 2 milhões de pessoas morrem detuberculose (TB) (1). A única vacina disponível contra a TBé a Bacilo Calmette-Guérin Mycobacterium bovis (BCG), aqual foi usada em humanos pela primeira vez em 1921 (2) .

Até à data, 4 biliões de doses de BCG foram administradas,tornando-a a vacina humana mais largamente usada em todo omundo (3) . Porém, estamos ainda longe de ter alcançado aerradicação da TB. A vacinação com BCG previne meningitetuberculosa e TB miliar em crianças (4) . Contudo, proteçãocontra outras formas de TB, notavelmente TB pulmonar emadolescentes e adultos, é inconclusiva, como enfatizado poruma meta-análise, que revelou eficácias protetoras variandode 0-80% em adultos (5) . Portanto, novas vacinas contra aTB são urgentemente necessárias. Atualmente, novasestratégias de vacinação contra a TB em ensaios clínicosincluem BCG recombinante para substituir a BCG canónica bemcomo vacinas de subunidades e vacinas baseadas em vetoresvirais não replicantes para reforçar a BCG principal(6) (7) . A identificação de mecanismos imunológicos subjacentes àproteção pode facilitar o desenho racional de novasestratégias de vacinação para a prevenção da TB. Alémdisso, esta estratégia poderia revelar biomarcadoresindicativos quanto à imunidade protetora que poderiamrevelar pontos finais alternativos de desfechos clínicos em ensaios clínicos de eficácia de vacinas contra a TB, edeste modo reduzir a sua duração bem como facilitar o testede maiores números de candidatos a vacina em ensaiosparalelos. Estudos observacionais focados em recentementeinfetados, contactos saudáveis de pacientes com TB e emcrianças vacinadas com BCG foram iniciados para definirtais biomarcadores (8). Apesar da extensa pesquisa naresposta imune à TB, os elementos fundamentais de memóriaprotetora ainda têm de ser elucidados. Após vacinação comBCG, as células T CD4 de memória específicas de antigéniosão difíceis de detetar devido à escassez de antigéniosimunodominantes. Atualmente, os biomarcadores maislargamente usados são baseados em frequências elevadas decélulas T CD4 produzindo IFNy. Evidência crescentequestiona o valor do IFNy como uma correlação com proteçãona TB (9,10). Indubitavelmente, o IFNy tem um papel crucialna defesa contra MTB (11), mas a determinação do IFNyisolado já não pode ser considerada como um marcadorconfiável de imunidade protetora.

Uma estirpe de BCG recombinante expressando um domínio deescape fagolisossomal é descrita na WO99/10496. O domíniode escape fagolisossomal permite à estirpe escapar dofagossoma de células hospedeiras infetadas por perfuraçãoda membrana do fagossoma. De modo a proporcionar um pHfagossomal ácido para atividade de escape fagolisossomalótima, uma estirpe recombinante deficiente em urease foidesenvolvida. Esta estirpe é divulgada na W02004/094469.

Uma estirpe ΔureC Hly+ rBCG (rBCG) recombinante expressandolisteriolisina perfuradora de membrana (Hly) de Listeriamonocytogenes e desprovida de urease C induz proteçãosuperior contra desafio aerogénico com MTB em comparaçãocom a BCG parental (pBCG) num modelo pré-clínico (12). Esteconstructo de vacina provou com sucesso segurança e imunogenicidade num ensaio clínico de fase I (US61/384,375).

Jay. K. Rolls (Semin. Immunopathpol. (2010), 32; 1-2) (44)divulga que se mostrou que as células T auxiliares do tipo17 (Thl7) têm papéis críticos na autoimunidade e inflamaçãode tecido. Adicionalmente, estas células podem serinduzidas após vacinação e mostrou-se que são críticas paraa eficácia de vacinas contra patogénios tantoextracelulares como intracelulares.

Cassan et al. (Clin. Vaccine Immunol. (2010), 17(7); 1066-1073) (45) referem-se à indução de células Thl7 e Treguladoras induzidas por vacinas em adultos saudáveis,imunizados com BCG Mycobacterium bovis vacinados com umanova vacina contra a tuberculose, MVA85A.

Lin et al. (Semin. Immunopathol. (2010), 32(1); 79-90) (46)divulgam o papel de IL17 em respostas celulares protetorasinduzidas por vacinas contra diversos patogénios e doençasinfecciosas, como o patogénio intracelular Mycobacteriumtuberculosis.

Desel et al. (Journal of Infectious Diseases (2011), 204(10); 1573-1584) (47) descrevem uma AureC gly+ BCGrecombinante induzindo proteção superior em relação à BCGparental por estimulação de uma combinação equilibrada derespostas de citocinas do tipo 1 e do tipo 17.

No presente estudo, é mostrado que a rBCG e a pBCG induzemrespostas imunes marcadas de Thl, enquanto apenas a rBCGinduz adicionalmente uma resposta profunda de Thl7. Tambémfoi observado recrutamento mais precoce de linfócitos Tespecíficos de antigénio para o pulmão após infeção com MTB de camundongos vacinados com rBCG. Estas células Tproduziram citocinas Thl abundantes após re-estimulação. Aeficácia protetora superior da rBCG era aparentementedependente de IL17. Elevada produção de IL17 após vacinaçãocom rBCG, mas não com pBCG, foi também detetada emvoluntários saudáveis durante um ensaio clinico de fase I.Os nossos achados identificam um via imunológica geral comoum marcador para estratégias de vacinação melhoradas contraa TB que também podem ser exploradas por candidatos avacina de subunidade.

Um assunto da presente invenção é um método paradeterminação da eficácia de uma vacina, compreendendo adeterminação da resposta imune de Thl7 num sujeitovacinado, em que a presença de resposta imune de Thl7 éindicativa quanto à imunidade protetora no sujeitoreferido.

Um aspeto adicional da presente invenção é um estojo dereagente para determinação da eficácia de um vacinacompreendendo pelo menos um reagente para deteção de umaresposta imune de Thl7.

Numa forma de realização preferencial, a vacina é umavacina viva, particularmente uma célula de Mycobacterium.Numa forma de realização ainda mais preferencial, a vacinaé uma Mycobacterium recombinante que compreende umamolécula de ácido nucleico recombinante codificando umpolipéptido de fusão compreendendo (a) um dominio capaz deindução de uma resposta imune e (b) um dominio de escapefagolisossomal. 0 domínio capaz de indução de uma respostaimune é preferencialmente um péptido ou polipéptidoimunogénico de um patogénio ou um seu fragmentoimunogénico. Numa forma de realização adicional, a vacina éuma vacina de subunidade, i.e. uma vacina compreendendo um antigénio purificado de um patogénio ou um seu fragmentoimunogénico, particularmente um antigénio recombinante ouum seu fragmento imunogénico. Ainda numa forma derealização adicional a vacina é uma vacina baseada numacélula patogénica inteira inativada ou fração de célula. A célula de Mycobacterium é preferencialmente uma célula deM. bovis, uma célula de M. tuberculosis, particularmenteuma célula de M. tuberculosis atenuada ou outrasMycobacteria, p.ex., M. microti, M. smegmatis, M. canettii,M. marinum ou M. fortuitum. Mais preferencialmente, acélula é uma célula de M. bovis recombinante (BCG),particularmente uma célula de M. bovis recombinante daestirpe Danish do subtipo Prague (43) . Numa forma derealização especialmente preferencial, a vacina é umacélula de Mycobacterium recombinante deficiente em urease.Numa forma de realização especialmente preferencial, asequência de ureC da célula de Mycobacterium é inativada(AUrec), p.ex., por construção de um vetor de suicidiocontendo um gene ureC desregulado por um gene marcador deseleção, transformação da célula alvo com o vetor erastreio quanto às células positivas quanto ao marcador deseleção, tendo um fenótipo negativo quanto à urease. 0 maispreferencialmente, a célula é BCG recombinante estirpeDanish do subtipo Prague caracterizada como rBCG AUrec : :Hly+ : : Hyg+. 0 domínio capaz de indução de uma resposta imune épreferencialmente selecionado a partir de péptidos oupolipéptidos imunogénicos de M. bovis ou M. tuberculosis oua partir de seus fragmentos imunogénicos tendo umcomprimento de pelo menos 6, preferencialmente pelo menos 8aminoácidos, mais preferencialmente pelo menos 9aminoácidos e, p.ex., até 20 aminoácidos. Exemplos específicos de antigénios adequados são Ag85B (p30) de M.tuberculosis, Ag85B (α-antigénio) de BCG M. bovis, Ag85A deM. tuberculosis e ESAT-6 de M. tuberculosis e seusfragmentos. A vacina é preferencialmente uma vacina contra infeçõesmicobacterianas, particularmente infeções micobacterianaspulmonares, mais particularmente tuberculose.

De acordo com o método da invenção, a resposta imune deThl7 num sujeito vacinado é determinada. 0 sujeito épreferencialmente um mamífero, p.ex., um humano. Adeterminação é preferencialmente levada a cabo numa amostrabiológica derivada do sujeito referido, em que a amostrareferida compreende células imunes, particularmente célulaT e/ou células NK, mais particularmente células Tespecíficas de antigénio, tais como células T CD4. Aamostra pode ser um fluido corporal ou amostra de tecido,p.ex., uma amostra de sangue, soro ou plasma ou uma amostrado pulmão ou baço. Os métodos para coleção de amostras sãobem conhecidos na técnica. 0 método da presente invenção requer uma determinação daresposta imune de Thl7. Para este propósito é preferencialre-estimular as células imunes presentes na amostra nosujeito a ser analisado com um imunogénio e determinar aexpressão de citocinas das células referidas. As células aserem analisadas são preferencialmente células Tespecíficas de antigénio, mais preferencialmente células TCD4. 0 imunogénio para a re-estimulação corresponde aoimunogénio presente na vacina (a eficácia da qual é paraser determinada). 0 imunogénio pode estar presente ou numaforma idêntica à forma presente na vacina ou numa formadiferente. Por exemplo, quando a vacina compreende umpolipéptido imunogénico, o imunogénio no passo da re- estimulação pode compreender um seu fragmento ou viceversa. Preferencialmente, o imunogénio usado para o passode re-estimulação é um polipéptido ou péptido purificado.De modo a testar a eficácia de vacinas contra atuberculose, particularmente uma vacina viva contra atuberculose como descrito acima, o imunogénio pode servantajosamente um antigénio micobacteriano, p.ex.,selecionado a partir de PPD "Derivado de ProteínaPurificada", o qual é um extrato de glicerol demicobactérias, ou Ag85A e Ag85B, bem como outros antigéniosmicobacterianos e seus fragmentos imunogénicos (tal comodescrito acima). A determinação da resposta de Thl7 de acordo com a invençãopode compreender determinação das células associadas com aresposta de Thl7, p.ex., células produtoras de IL17, pormeio de marcadores de superfície e citocinas presentes nase/ou secretadas pelas células referidas. Exemplos demarcadores de superfície são CD4, CD8, IL23R, CCR4 e/ouCCR6. Exemplos de citocinas presentes em e/ou secretadaspor tais células são IL17, IL21, IL22, IL23, IFNy e suas combinações. Preferencialmente, a citocina é IL17. Taiscélulas podem ser determinadas por métodos citológicos,p.ex., por técnicas de separação de células usandoreagentes de deteção imunológica tais como anticorposespecíficos para marcadores de superfície de células e/oucitocinas, que podem transportar uma marcação, p.ex., umgrupo de fluorescência.

Mais preferencialmente, células associadas a uma respostaimune de Thl7 são, p.ex., células T CD4 produzindo eopcionalmente secretando IL17.

Numa forma de realização adicional, a determinação daresposta imune de Thl7 compreende determinação de uma citocina secretada por células associadas à resposta imunede Thl7, p.ex., IL17. A citocina pode ser determinada pormétodos imunológicos usando anticorpos apropriados, p.ex.,anticorpos dirigidos contra a IL17.

No método da invenção, a resposta imune de Thl7 édeterminada num tempo adequado após a vacinação. Porexemplo, a resposta imune pode ser determinada 20-50 dias,particularmente 25-35 dias após a vacinação. A invenção também se refere a um estojo de reagente paradeterminação da eficácia de uma vacina, particularmentepara uso num método como descrito acima. O estojo dereagente compreende um imunogénio adequado para re-estimulação das células imunes presentes numa amostra de umsujeito que foi vacinado. Adicionalmente, o estojo dereagente compreende pelo menos um reagente adequado paradeteção de um marcador da resposta imune de Thl7, comodescrito acima. Os reagentes podem, p.ex., ser selecionadosa partir de reagentes de deteção citológica e/ouimunológica, p.ex., anticorpos contra marcadores de célulascaracterísticos de células associadas à resposta imune deThl7 e/ou um reagente imunológico especifico para citocinasassociadas a uma resposta imune de Thl7, particularmenteIL17 e/ou IL22. As regiões de deteção podem transportargrupos detetáveis, p.ex., grupos de marcação porfluorescência.

Adicionalmente, a invenção é descrita em mais detalhe pelasseguintes Figuras e Exemplos.

Legendas das Figuras

Figura 1: Carga de MTB em camundongos WT. A imunizaçãos.c. protege contra a infeção com MTB 90 dias p.i. (A).A carga bacteriana é comparável entre os gruposvacinado e não vacinado no dia 7 p.i. (B). Determinaçãode CFU no pulmão e baço após infeção por aerossol com400 CFU MTB. Foi homogenizado o lobo cardiaco do pulmão(aprox. 71/10° de todo o orgão) ou metade do baço; omaterial remanescente foi usado para ensaios de re-estimulação in vitro. Significância estatísticadeterminada pelo teste de Mann-Whitney com valores Pbicaudais. *, P < 0,05; **, P < 0,01. Os dados sãorepresentativos de três experiências com resultadossimilares.

Figura 2: Indução de citocinas superior após vacinaçãocom rBCG em relação a pBCG. Respostas no pulmão (A) ebaço (B) 83 dias após vacinação s.c. com rBCG ou pBCG.Um total de 2,5xl05 (pulmão) ou 2xl06 células (baço)foi re-estimulado com PPD durante 20 horas e ossobrenadantes analisados por ensaios em multiplex. Asconcentrações de citocinas estão ilustradas como médias±SEM de quatro experiências independentes com trêsreplicados cada. A produção de citocinas de fundo decontrolos do meio foi subtraída. Foram aplicados ANOVAe Teste de Comparação Múltipla de Bonferroni paraanálise estatística. *, P < 0,05; **, P < 0,01.

Figura 3: Ά vacinação com rBCG acelera o recrutamentode células T especificas de antigénio para o pulmãoapós infeção por aerossol com MTB. Secreção decitocinas pelas células do pulmão 7 dias após infeçãopor aerossol com 200-400 CFU MTB. Um total de 2xl05 células foi estimulado com PPD durante 20 horas e ossobrenadantes analisados por ensaio em multiplex (A) .As concentrações de citocinas estão ilustradas comomédias ±SEM de duas experiências independentes com trêsreplicados cada. A produção de citocinas de fundo decontrolos do meio foi subtraída. As células re-estimuladas com PPD durante 6 horas na presença deBrefeldina A foram analisadas por citometria de fluxomulticolorida (B) . As frequências de células T CD4respondedoras estão ilustradas como médias ±SEM de trêsexperiências independentes com três replicados cada.Foram aplicados ANOVA e Teste de Comparação Múltipla deBonferroni para análise estatística. *, P < 0,05; **, P< 0,01; ***, P < 0,001.

Figura 4: A vacinação com rBCG aumenta as respostasespecificas a PPD no baço após infeção por aerossol comMTB. Secreção de citocinas pelas células do baço 7 diasapós infeção por aerossol com 200-400 CFU MTB. Um totalde 2xl06 células foi re-estimulado com PPD durante 20horas e os sobrenadantes analisados por ensaios emmultiplex (A). As concentrações de citocinas estãoilustradas como médias ±SEM de quatro experiênciasindependentes com três replicados cada. A produção decitocinas de fundo de controlos do meio foi subtraída.As células re-estimuladas com PPD durante 6 horas napresença de Brefeldina A foram analisadas porcitometria de fluxo multicolorida (B) . As frequênciasde células T CD4 respondedoras estão ilustradas comomédia ±SEM de três experiências independentes com trêsreplicados cada. Foram aplicados ANOVA e Teste deComparação Múltipla de Bonferroni para análiseestatística. *, P < 0,05; **, P < 0,01; ***, p < 0,001.

Figura 5: A vacinação com pBCG ou rBCG não leva amudanças significativas em populações de células Treg. Células Treg no baço após imunização s.c. com rBCG oupBCG. As barras pretas representam CD25+FoxP3+ e asbarras brancas células CD25~FoxP3+. As frequências decélulas T CD4 e células Treg CD8 83 dias apósimunização (A e B) bem como 7 dias (C e D) ou 90 dias(E e F) após infeção por aerossol com 200-400 CFU MTB.Três camundongos por grupo, ilustrados como média ±SEM.Os dados são representativos de três experiênciasindependentes com resultados similares.

Figura 6: Frequências de células T CD8 produtoras decitocinas no pulmão após vacinação e subsequenteinfeção por aerossol com MTB. Secreção de citocinas 7dias após infeção por aerossol com 200-400 CFU MTB. Ascélulas re-estimuladas com PPD durante 6 horas napresença de Brefeldina A foram analisadas porcitometria de fluxo multicolorida. As frequências dascélulas T CD8 respondedoras estão ilustradas como média±SEM de duas experiências independentes com trêsreplicados cada. Foram aplicados ANOVA e Teste deComparação Múltipla de Bonferroni para análiseestatística.

Figura 7: Frequências de células T CD8 produtoras decitocinas no baço após vacinação e subsequente infeçãopor aerossol com MTB. Secreção de citocinas 7 dias apósinfeção por aerossol com 200-400 CFU MTB. As célulasre-estimuladas com PPD durante 6 horas na presença deBrefeldina A foram analisadas por citometria de fluxomulticolorida. As frequências das células T CD8respondedoras estão ilustradas como média ±SEM dequatro experiências independentes com três replicados cada. Foram aplicados ANOVA e Teste de ComparaçãoMúltipla de Bonferroni para análise estatística. *, P <0,05; **, P < 0,01; ***, P < 0,001.

Figura 8: Respostas imunes no pulmão durante infeção persistente com MTB em camundongos vacinados com rBCG.

Secreção de citocinas por células do pulmão 90 diasapós infeção por aerossol com 200-400 CFU MTB. Ascélulas foram re-estimuladas com PPD durante 20 horas eos sobrenadantes analisados por ensaios em multiplex(A) . As concentrações de citocinas estão ilustradascomo médias ±SEM de duas experiências independentes comtrês replicados cada. A produção de citocinas de fundode controlos do meio foi subtraída. As células re-estimuladas com PPD durante 6 horas na presença deBrefeldina A foram analisadas por citometria de fluxomulticolorida (B) . As frequências das células T CD4respondedoras estão representadas como média ±SEM deduas experiências independentes com três replicadoscada. Foram aplicados ANOVA e Teste de ComparaçãoMúltipla de Bonferroni para análise estatística. *, P <0,05; **, P < 0,01.

Figura 9: Frequências de células T CD8 produtoras de citocinas após vacinação e subsequente infeção poraerossol com MTB. Secreção de citocinas por célulasisoladas do pulmão 90 dias após infeção por aerossolcom 200-400 CFU MTB. As células re-estimuladas com PPDdurante 6 horas na presença de Brefeldina A foramanalisadas por citometria de fluxo multicolorida. Asfrequências das células T CD8 respondedoras estãoilustradas como média ±SEM de duas experiênciasindependentes com três replicados cada. Foram aplicados ANOVA e Teste de Comparação Múltipla de Bonferroni paraanálise estatística. *, P < 0,05.

Figura 10: A vacinação induz a produção de IL22 mas nãode IL21. Secreção de IL21(A) e IL22 (B) por células debaços (2xl06 células) ou pulmões (2xl05 células) decamundongos 83 dias após vacinação e subsequenteinfeção por aerossol com 200-400 CFU MTB. Concentraçõesde IL21 medidas a partir de três amostras por grupo,ilustradas por média ±SEM. Para IL22 foram agrupadasamostras de um grupo. Os dados são representativos deduas (dia 83 pós-vacinação) e cinco (dia 7 p.i.)experiências similares. As células foram re-estimuladascom PPD durante 20 horas e os sobrenadantes analisadospor ELISA.

Figura 11: rBCG causa recrutamento de células T γδ ecélulas NK sem alterar significativamente as populaçõesde APC. Células recrutadas para a cavidade peritonealapós administração de 106 CFU de rBCG ou pBCG i.p.Análise de populações de células no fluido de lavagemperitoneal por citometria de fluxo. APC recrutadas parao peritoneu 5 horas (painel superior) e 6 dias (painelinferior) após administração i.p. de rBCG ou pBCG (A) .ICS de populações de células T 5 horas após injeção(B) . As células foram estimuladas com anticorpos paraaCD3/aCD28 durante 18 horas na presença de BrefeldinaA. ICS de populações de células T 6 dias apósadministração (C). As células foram re-estimuladas comPPD durante 18 horas na presença de Brefeldina A. Dadosapresentados como resumo de três experiênciasindependentes com cinco camundongos por grupo. A linhahorizonta indica a mediana. Foram aplicados ANOVA eTeste de Comparação Múltipla de Bonferroni para análise estatística. *, P < 0,05; **, P < 0,01. Citocinas equimiocinas detetadas no fluido de lavagem peritonealanalisadas por ensaio em multiplex (D) ilustrado comoconcentrações médias ±SEM.

Figura 12: rBCG induz IL17 em PBMCs humanas devoluntários saudáveis de um ensaio clinico de fase I.

Produção de IL17 por PBMCs humanas isoladas devoluntários humanos saudáveis de um estudo clínico defase I. Um total de 5xl06 células isoladas 29 dias pós-vacinação com rBCG ou pBCG foi re-estimulado com PPDdurante 20 horas e os sobrenadantes analisados porensaio em multiplex. Significância estatística determinada por teste de Mann-Whitney com valor Punicaudal e correção de Welch. *, P < 0,05; n=3 para pBCG e n=7 para rBCG.

Exemplo

Materiais e MétodosCamundongos

Camundongos BALB/c fémeas foram criados no Bundes-institutfur Risikobewertung (BfR) em Berlim. Os camundongos tinham6-8 semanas de idade no início das experiências e forammantidos sob condições específicas isentas de patogénios(SPF) . As experiências em animais foram conduzidas com aaprovação da Landesamt fur Gesundheit und Soziales (LAGeSo,Berlim, Alemanha).

Bactérias

As MTB H37Rv e as estirpes de pBCG e rBCG usadas foramdescritas previamente (12). As bactérias foram cultivadasem caldo de Middlebrook 7H9 suplementado com glicerol,Tween 80 a 0,05% e ADC. As culturas semi-logaritmicas foramrecolhidas e armazenadas a -80 °C até ao uso. Todos osstocks foram titulados antes do uso. Foram obtidassuspensões bacterianas unicelulares por transferênciarepetida através de uma seringa com uma agulha 27G.

Vacinação e infeção com MTB

Foram administradas pBCG ou rBCG (106 CFU) subcutaneamente(s.c.) em estreita proximidade à base da cauda. Foirealizada infeção aerogénica com MTB dos camundongos usandoum sistema de exposição por inalação da Glas-Col. As cargasbacterianas foram avaliadas por disrupção mecânica deórgãos removidos assepticamente em PBS a 0,5% v/v Tween 80e plaqueamento de diluições em série em placas de agarMiddlebrook 7H11 1 suplementadas com OADC. Após 3 semanas,as colónias de MTB foram contadas. A significância estatística dos resultados foi determinada pelo teste deMann-Whitney com valores p bicaudais para dados nãoparamétricos usando GraphPad Prism 5.0.

Isolamento de células, estimulações e citometria de fluxo

As células foram purificadas como previamente descrito(42). Os grupos experimentais compreenderam cincocamundongos. Dois baços ou pulmões foram agrupados e umaamostra processada individualmente, resultando em trêsamostras por grupo de cinco camundongos para estimulaçõessubsequentes. As células foram estimuladas com PPD a 50 yg/mL (SSI, Copenhaga, Dinamarca) durante 20 horas paraanálise de citocinas por ensaio em multiplex ou durante 6horas na presença de Brefeldina A a 25 yg/mL para coloraçãointracelular de citocinas (ICS). Foram usados os seguintesanticorpos: CD4 (RM4-5), IFNy (XMG-1.2), IL2 (JES6-5H4),Ly6G/C (RB6-8C5), CDllb (Ml/70), γδ-TCR (GL-3), conjunto decoloração FoxP3 e CD49b (clone DX5), todos da eBioscience.CD8a (YTS169), TNFa (XT22), CD16/CD32 (2.4G2), F4/80(CI:A3-1) e CDllc (N418) foram purificados a partir desobrenadantes de hibridoma e marcados por fluorescência nolaboratório. IL17 (TC11-18H10) foi obtida da BDBiosciences. As células foram analisadas usando umFACSCanto II ou citómetro de fluxo LSRII e softwareFACSDiva (BD Biosciences). As citocinas foram medidasusando os imunoensaios à base de esférulas de Thl/Th2, IL17e IL6 Bio-Plex Mouse da BioRad de acordo com as instruçõesdo fabricante. IL21 e IL22 foram medidas por ELISA da R&amp;Dsystems. IL17 humana foi detetada com um ensaio Milliplex42-plex da Millipore.

Lavagem peritoneal pBCG e rBCG foram recém-preparadas a partir de culturassemi-logaritmicas. As bactérias foram lavadas três vezescom PBS e a concentração determinada por medição dadensidade ótica a 580 nm. Foi realizada administração de106 CFU intraperitonealmente. As células recrutadas foramobtidas a partir da cavidade peritoneal 5 horas ou 6 diasmais tarde por injeção de 5 mL de PBS e analisadas porcitometria de fluxo. Citocinas e quimiocinas no fluido delavagem foram determinadas usando o estojo Bio-Plex MouseCytokine 23-plex da Bio-Rad.

Resultados

Respostas de Thl/Thl7 após vacinação com rBCG e pBCG

Numa tentativa de elucidar os mecanismos imunes relevantespara a eficácia de vacinas da TB, comparámos respostasimunes a rBCG e pBCG em camundongos. Eficácia protetorasuperior da rBCG tinha sido originalmente determinada apósimunização i.v. (12) . Aqui mostramos que a administraçãos.c. de rBCG induziu niveis comparáveis de proteção ereteve a sua eficácia superior em relação à pBCG (FiguraIA). Depois, analisámos respostas de memória de longo prazoem pulmões e baços de camundongos 83 dias após vacinaçãos.c. com rBCG e pBCG. As células foram re-estimuladas comPPD e os sobrenadantes analisados por ensaios em multiplexpara citocinas. A imunização com rBCG induziu produção decitocinas significativamente mais elevada por célulasisoladas do pulmão em comparação com a pBCG (Figura 2A) .Estas incluiam IFNy, IL2, IL6 e GM-CSF. Em contraste, ascitocinas do tipo 2 IL4, IL5 e IL10 não estavam aumentadasacima dos niveis de fundo (dados não mostrados).

Intrigantemente, concentrações de IL17 aproximadamente 3vezes mais elevadas foram produzidas por células do pulmãode camundongos vacinados com rBCG. Note-se que apenasalgumas células puderam ser isoladas de pulmões decamundongos não infetados. Consequentemente, as concentrações globais de citocinas foram mais baixas que nobaço, onde densidades celulares 10 vezes mais elevadas porpoço puderam ser usadas para estimulação (Figura 2B) . Nosbaços, ambas as vacinas induziram respostas de Thligualmente fortes como refletido por concentraçõescomparáveis de IL2, IL6, IFNy e GM-CSF. Porém, as célulasdo baço de camundongos vacinados com rBCG produziramsignificativamente mais IL17 após re-estimulação com PPD em comparação com animais vacinados com pBCG. Deste modo, aimunização com rBCG, mas não pBCG, induziu respostasconcomitantes e fortes de Thl e Thl7 nos pulmões e baços,as quais foram sustentadas por periodos prolongados detempo.

Recrutamento acelerado de células T especificas para MTBapós infeção com MTB virulenta em camundongos vacinados comrBCG

As células Thl7 foram ligadas a vigilância imune melhorada(13) . Comparámos respostas de células T especificas deantigénio em animais vacinados após infeção por aerossolcom MTB virulenta, em pulmões e baços 7 dias pós-infeção.Produção marcada de IFNy, IL17, IL2 e GM-CSF por células dopulmão de camundongos vacinados com rBCG foi detetada 20horas após re-estimulação com PPD (Figura 3A) ou péptidosAg85A (dados não mostrados). Em contraste, estas citocinasforam escassamente secretadas por células de camundongosvacinados com pBCG. Em animais não vacinados infetados comMTB, a produção de citocinas foi abaixo do limite dedeteção, em concordância com relatórios anteriores de quecélulas T especificas para MTB não aparecem antes de 3semanas após a infeção com MTB (13). As citocinas do tipo 2IL4, IL5 e IL10 não foram detetadas e TNFa, ILl2p70 e IL16estavam apenas escassamente acima dos niveis de fundo nesteponto temporal inicial pós-desafio com MTB (dados nãomostrados).

Determinámos a produção de citocinas por células T dopulmão por citometria de fluxo 7 dias após a infeção comMTB (Figura 3B). As células foram estimuladas com PPDdurante 6 horas seguido por coloração de citocinasintracelulares para IL2, IL17, IFNy e TNFa. Em controlos não vacinados, uma pequena proporção de células T CD4produziu IL2, TNFa ou IFNy. Em camundongos vacinados, ascélulas T CD4 secretaram IL2, IFNy, TNFa e também IL17. Asfrequências de células produtoras de citocina única foramas mais elevadas, embora não significativas, no grupo rBCG.Em animais vacinados detetámos células T multifuncionaisimplicadas na imunidade protetora (14). As células Tprodutoras de citocinas múltiplas eram predominantementeprodutoras duplas de IL2+TNFa+ e significativamenteaumentadas após vacinação com rBCG. As células produtorastriplas foram quase exclusivamente IL2+IFNY+TNFa+ eligeiramente aumentadas com rBCG em comparação comcamundongos vacinados com pBCG. Igualmente, as célulasquadruplamente positivas IL2+TNFa+IFNY+IL17+ apareceramexclusivamente no grupo com rBCG embora em frequênciasmuito baixas.

Em principio, as células T esplénicas produziram padrões decitocinas similares a células T pulmonares (Figura 4). Aprodução de IL2 e GM-CSF foi significativamente maiselevada nos animais vacinados com rBCG em comparação com ogrupo com pBCG e abaixo do nivel de deteção nos controlosnão vacinados, apesar de, nos controlos não vacinados, umapercentagem pequena de células T CD4 ter produzido IFNy. Emsuma, a vacinação com ou pBCG ou rBCG induziu as células TCD4 a secretarem IFNy e TNFa com frequências mais elevadasde produtores únicos e múltiplos em camundongos vacinadoscom rBCG em comparação com o grupo com pBCG.

Aos 7 dias p.i. as células T CD4 eram os principaisprodutores de citocinas; CD8 produtoras de citocinas foramdetetadas com frequências mais baixas no pulmão (Figura 6)e baço (Figura 7) embora com padrões similares. É de notarque frequências significativamente mais elevadas de células T CD8 produtoras únicas de TNFa foram detetadas no grupocom rBCG.

Produção de citocinas e frequências de células produtorasdiferenciais não eram devidas a cargas bacterianasdiferentes neste ponto temporal inicial após infeção, comoconfirmado por números comparáveis de unidades formadorasde colónias (CFU) nos pulmões e baços (Figura 1B) . Osnúmeros totais de células Treg aumentaram após infeção paraum grau comparável nos dois grupos vacinados (Figura 5). A vacinação com rBCG confere respostas imunes potentesdurante infeção persistente

Analisámos respostas imunes especificas para MTB 90 diasp.i. quando as cargas bacterianas no pulmão eram aproximadamente 10 vezes mais baixas em animais imunizadoscom rBCG em comparação com o grupo com pBCG e 100 vezesmais baixas em comparação com o grupo de controlo com nãovacinados. As células do pulmão de camundongos vacinados econtrolos não tratados foram re-estimuladas com PPD durante20 horas e as concentrações de citocinas medidas porensaios em multiplex (Figura 8A) . As citocinas detetadasapós re-estimulação eram predominantemente do tipo 1.Contudo, não conseguimos detetar diferenças no IFNy ou IL17entre os grupos vacinados durante infeção persistente. Emcontraste, as quantidades de IL2, IL6, GM-CSF e TNFa erammais elevadas em camundongos vacinados com rBCG. Em todosos grupos, IL4 e IL5 estavam abaixo do limite de deteção ealgumas IL12p70 e IL10 foram medidas (dados não mostrados).Adicionalmente, a análise de células do pulmão porcitometria de fluxo multicolorida revelou predominantementecélulas T CD4 produtoras de citocinas durante infeçãopersistente (Figura 8B) . Células T CD4 secretando apenas IFNy foram detetadas em todos os grupos com frequênciassimilares. Após vacinação, as células T CD4 produzindo IL2,IFNy, TNFa ou IL17 em diferentes combinações também podiamser detetadas. Intrigantemente, as frequências de células TCD4 respondedoras não diferiram significativamente entre avacinação com rBCG e pBCG apesar de concentrações maioresde IL2 e TNFa nos sobrenadantes. Assumimos que ambas asvacinas aumentaram as frequências de células T CD4especificas de antigénio no pulmão durante a infeçãopersistente com MTB, com as células T induzidas pela rBCGtornando-se produtoras de citocinas mais potentes. Ascélulas T CD8 secretaram quase exclusivamente IFNy comfrequências comparáveis em todos os grupos ao passo quecélulas T CD8 produtoras únicas de TNFa significativamentemais elevadas foram detetadas no grupo com rBCG. Células TCD8 multifuncionais apareceram escassamente acima do fundo(Figura 9). A vacinação causa produção de IL22 mas não de IL21

As células Thl7 podem produzir citocinas efetorasadicionais tais como IL21 (15) e IL22 (16) . Foramidentificadas células produtoras de IL22 em pacientes comTB, mas estas parecem distintas das células produtoras deIL17 (17) . Não detetámos IL21 após estimulação com PPD decélulas de baço ou pulmão de camundongos vacinados esubsequentemente infetados com MTB (Figura 10A) . Foiproduzida IL22 em elevadas concentrações por esplenócitosestimulados com PPD durante 20 horas (Figura 10B) emcamundongos imunizados com rBCG mas não aumentouadicionalmente imediatamente após a infeção com MTB. Aprodução de IL22 por células do pulmão foi apenas observadano grupo vacinado com rBCG e descresceu após infeção comMTB por aerossol.

rBCG intraperitoneal causa recrutamento aumentado decélulas T γδ e células NK sem alterar significativamente aspopulações de APC

Queríamos definir os mecanismos subjacentes à induçãopreferencial de células Thl7 após imunização com rBCG. Paraeste fim, rBCG e pBCG foram administradas i.p., célulasimigrantes isoladas a partir da cavidade peritoneal 5 horasou 6 dias após a administração e analisadas por citometriade fluxo (Figura 11A) . Neutrófilos (definidos como GrlHI,CDllbHI, MHCII-, CDllc-) rapidamente entraram na cavidadeperitoneal e permaneciam elevados ao dia 6 p.i. nos gruposcom pBCG e rBCG em igual medida. As frequências demacrófagos peritoneais residentes (definidos como CDllbHI,F4/80HI, Grl-, MHCIIHI, CDllc-) e células dendríticas(CDllc+, CDllbL0, Grl-) permaneceram inalteradas empercentagens baixas. Em suma, não foram detetadasdiferenças significativas entre os grupos com rBCG e pBCG.As células peritoneais recolhidas 5 horas após a vacinaçãoforam sujeitas a estimulação policlonal (Figura 11B) comanticorpos para aCD3/aCD28. As frequências de células T CD4e células NK foram comparáveis entre todos os grupos como oforam as produções de IFNy e IL17. Seis dias após aadministração, estas células aumentaram numericamente eatingiram as frequências mais elevadas no grupo com rBCG(Figura 11C). Foi usado PPD para re-estimulação das célulasno ponto temporal dia 6. As células T CD4 não produziramquantidades apreciáveis de IFNy ou IL17, enquanto umaproporção substancial de células NK produziu IFNy apósadministração de rBCG. Células T γδ foram identificadascomo uma grande fonte de IL17 inicial na TB (18) .Proporções aumentadas, embora não significativas, decélulas T γδ produzindo IFNy foram identificadas 5 horaspós-injeção com rBCG. Esta população de células aumentou adicionalmente e frequências marcadamente mais elevadas decélulas T γδ produzindo IL17 foram detetadas no grupo comrBCG 6 dias após a injeção. Não foram detetadas células TCD8 no peritoneu em nenhum dos grupos. Analisámos citocinase quimiocinas presentes na cavidade peritoneal por ensaioem multiplex do fluido de lavagem peritonal (Figura 11D) .MCP-1, MIPIoí, G-CSF e KC foram rapidamente aumentadas apósinjeção; os niveis de Eotaxina permaneceram inalterados eIL12p40 foi detetada em concentrações mais elevadas após 6dias. As concentrações de IL12p70, IFNy, ILla, IL2, IL3,IL4, IL5, IL10, IL17, GM-CSF, e TNFa estavam abaixo dolimite de deteção ao passo que IL3, IL6, IL9, IL13, ΜΙΡΙβ eRANTES puderam ser medidas mas a produção foi comparávelentre rBCG e pBCG. Deste modo, rBCG e pBCG induziramrecrutamento de APC bem como produção de quimiocinas ecitocinas no local da administração em igual medida.Intrigantemente, proporções de células T γδ secretando IL17e células NK produzindo IFNy foram as mais abundantes apósadministração de rBCG. A vacinação com rBCG gera células produtoras de IL17 emhumanos

Por último, analisámos PBMCs de voluntários humanossaudáveis de um ensaio clinico de fase I para interrogar sea produção de IL17 estava aumentada em participantes deestudo vacinados com rBCG. Foi colhido sangue dosvoluntários 29 dias após imunização com rBCG ou pBCG e asPBMCS isoladas e secas. As PMBCs foram descongeladas edeixadas em repouso durante a noite, seguido por re-estimulação de 20 horas com PPD. A produção de citocinasfoi analisada por ensaios em multiplex. A produção de IL17foi exclusivamente detetada nas PBMCs de participantes de estudo imunizados com rBCG (Figura 12) . Note-se que umnúmero limitado de amostras estava disponível.

Discussão A identificação de marcadores imunes de proteção é crucialpara o desenho racional de novas vacinas conta a TB. Estesmarcadores poderiam também estabelecer a base para adefinição de marcadores alternativos para prever pontosfinais de desfechos clinicos em ensaios de eficácia devacinas contra a TB e deste modo proporcionar orientaçõespara a melhoria de candidatos a vacinas atuais. Aimportância de citocinas chave que ativam as capacidadesantimicobacterianas dos macrófagos incluindo IFNy (21) eTNFa (22), e a necessidade da IL2 na expansão de células dememória (23) estão bem estabelecidas e deste modo sãocomummente usadas para monitorizar ensaios de vacinascontra a TB.

Numa tentativa de identificar biomarcadores de eficácia devacinas, comparámos repostas imunes de memória de longoprazo induzidas pela rBCG que se provou que conferemproteção superior em relação à sua estirpe parental, pBCG.As respostas diferiram em termos tanto quantitativos comoqualitativos. Detetámos abundância aumentada de citocinasdo tipo 1 bem como IL7 após vacinação com rBCG no pulmão(Figura 2A) . A análise de respostas imunes induzidas porvacinas no pulmão não é obviamente praticável no contextode ensaios clinicos. Portanto, também analisámos respostasde memória de longo prazo sistémicas (Figura 2B) .Intrigantemente, concentrações comparáveis de citocinasdirigidas do tipo 1 foram detetadas nos grupos com pBCG erBCG. Em contraste, a produção de IL17 pelos esplenócitosestava significativamente elevada após vacinação com rBCG.

Deste modo, concluímos que a IL17, ao invés do IFNy ou IL2se qualifica como um marcador de proteção superior induzidapor rBCG.

As células Thl7 contribuem para a defesa antimicrobiana poratração e ativação de neutrófilos (24) que estão entre asprimeiras células a serem recrutadas em resposta a IL17.Foi mostrado que a IL17 é dispensável durante a infeçãoprimária com MTB (25,26), mas ganha importância nasrespostas de memória (13). Além disso, relatórios recentessobre a expressão de CCR6 em células Thl7 humanas (27,28)apontam para uma retroalimentação positiva, porque CCR6 é orecetor de CCL20 produzido por neutrófilos (29) e CCL20-CCR6 foi implicado na imunopatogénese da TB (30) . Destemodo, as células Thl7 poderiam facilitar o recrutamentoacelerado de células T de memória específicas de antigéniopara locais de residência bacteriana. Por análise derespostas imunes induzidas por vacinas 7 dias após infeçãopor aerossol com MTB, mostramos que a vacinação com rBCGleva de facto a recrutamento acelerado de células efetoraspara os locais de replicação bacteriana. Observámosfrequências aumentadas de células T CD4 específicas deantigénio e produção elevada de IL2, IL17, IFNy e GM-CSFpelas células do pulmão (Figura 3) e baço (Figura 4).

As células T CD4 multifuncionais co-produzindo IL2, IFNy eTNFa foram primeiramente implicadas em estratégias devacinação bem-sucedidas contra Leishmania major (14) e maistarde também contra MTB (31). Recentemente, estas células TCD4 polifuncionais também foram detetadas em ensaiosclínicos de vacinas contra a TB (32,33). Detetámos célulasT CD4 polifuncionais após vacinação com rBCG e pBCG einfeção subsequente (Figuras 3 e 4); contudo a composiçãode citocinas (IL2, IL17, IFNy e TNFa) em produtores duplose triplos variou consideravelmente entre experiências bem como animais individuais. Se as células multifuncionaisfossem uma verdadeira correlação de proteção, então as suasfrequências globais, que foram mais elevadas no grupo comrBCG, ao invés da sua composição, parecem o mais relevante.

Porque é que a rBCG induziu uma resposta de Thl7? A imunização com rBCG e pBCG causou recrutamento de APC bemcomo produtores de quimiocinas e citocinas em igual medida.Intrigantemente, as proporções de células T γδ secretandoIL17 e células NK produzindo IFNy foram extremamente

abundantes após vacinação com rBCG. Isto é consistente comrelatórios mostrando que a IL17 pode ser rapidamenteproduzida por células T γδ (34, 18) bem como células NK (35). As células NK, que também estavam aumentadas apósvacinação com rBCG, são uma fonte importante de IFNy inicial. Já mostrámos que diferentes componentes moleculares libertados a partir da rBCG residem no citosolde macrófagos infetados (12) . 0 Nod-2 é um PRR citosólico importante e o seu envolvimento foi ligado aodesenvolvimento de respostas de células T de memória Thl7(19) . A apoptose induzida durante a infeção bacteriana induzcélulas Thl7 (36) . Obtivemos evidência que a rBCG induzapoptose aumentada em comparação com a pBCG (12), o quepoderia contribuir adicionalmente para desenvolvimentoaumentado de células Thl7. A ativação de inflamossomaspoderia também contribuir para as repostas de memória deThl7 através da produção de ΙΙΑβ (37) . Descobriu-se que,por exemplo, NLRP3 sente a presença de listeriolisinaatravés de mudanças nos niveis de ATP (38) . Deste modo, aindução de células Thl7 após vacinação com rBCG poderiarequerer uma interação complexa de estímulos intracelularese apoptose aumentada.

As células Thl7 são consideradas instrumentais em doençasinflamatórias e auto-imunes tais como artrite induzida pelocolagénio (39), EAE (40, 39) e hipersensibilidade alérgicadas vias aéreas (41, 39) ao invés de serem benéficas para avacinação bem-sucedida. Este papel patogénico é usualmenteassociado ao desenvolvimento de uma resposta inflamatóriaprofunda mediada por IL21. Nunca detetámos IL21 apósvacinação e subsequente infeção com MTB acima dos níveis defundo em nenhuma experiência (Figura 10A) . Além disso,nunca observámos sinais de auto-imunidade ou inflamaçãoexcessiva no local da injeção após vacinação com rBCG nemno pulmão até 200 dias pós-infeção com MTB.

Numa primeira tentativa de comparar dados de TBexperimental em camundongos com dados humanos, analisámosperfis de citocinas de PBMCs congeladas de um ensaioclínico de fase I com rBCG e pBCG. Num número limitado deamostras detetámos produção de IL17 após vacinação comrBCG, mas não pBCG. Células Thl7 foram detetadas no sangueperiférico de humanos infetados com MTB (17). Recentemente,células T CD4 produtoras de IL17 foram relatadas emadolescentes vacinados com um candidato a vacina contra aTB composto por vírus Vaccinia Ankara modificadoexpressando Ag85A (33) . As respostas atingiram um picoentre 7 e 18 dias pós-vacinação e descresceramsubsequentemente. Isto está de acordo com os nossos dadosmostrando produção elevada de IL17 ao dia 29 pós-vacinaçãono grupo com rBCG (Figura 12) . Deste modo, é tentadorpropor IL17 como uma correlação de proteção em ensaios devacinas contra a TB.

Em resumo, mostramos que a vacinação com rBCG leva a umageração preferencial de células Thl7, provavelmentedependente do reconhecimento intracelular de componentesbacterianos por Nod-2. Estas células Thl7 por sua vez aceleram o recrutamento de células T específicas deantigénio para o pulmão. Em última análise, a cascata deeventos resulta numa contenção mais precoce do MTB econsequentemente numa proteção superior por rBCG emcomparação com pBCG. Detetámos produção de IL17exclusivamente por PBMCs de voluntários vacinados com rBCGnum ensaio clínico de fase I completado com sucesso. Umavez que a IL17 parece fundamental para o recrutamentoacelerado de células T específicas de antigénio para oslocais de replicação de MTB, futuras vacinas contra a TBdevem ser costumizadas para induzir concomitantementerespostas equilibradas de Thl e Thl7.

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Lisboa, 8 de junho de 2016

Claims (3)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Um método para determinação da eficácia de uma vacinaviva micobacteriana recombinante, compreendendodeterminação da resposta imune de T auxiliar do tipo17 (Thl7) num sujeito vacinado, em que uma respostaimune detetável de Thl7 é indicativa quanto àimunidade protetora no sujeito referido. 2. 0 método da reivindicação 1, em que a vacina é uma Mycobacterium recombinante que compreende uma moléculade ácido nucleico recombinante codificando umpolipéptido de fusão compreendendo (a) um dominiocapaz de indução de uma resposta imune e (b) umdominio de escape fagolisossomal. 3. 0 método da reivindicação 2, em que a Mycobacterium édeficiente em urease. 4. 0 método da reivindicação 3, em que a Mycobacterium érBCGAureC :: Holy* :: Hyg+. 5. 0 método da reivindicação 1, em que a vacina é uma vacina de subunidade. 6. 0 método de qualquer uma das reivindicações 1-5, em que a vacina é uma vacina contra infeções micobacterianas, particularmente infeções micobacterianas pulmonares, mais particularmentetuberculose. 7. 0 método de qualquer uma das reivindicações 1-6, em que a determinação da resposta imune de Thl7 compreende sujeição de uma amostra compreendendo células imunes do sujeito vacinado referido a uma re-estimulação com um imunogénio correspondente aoimunogénio na vacina referida e determinação dapresença e/ou quantidade de células associadas àresposta imune de Thl7 na amostra referida. 8. 0 método de qualquer uma das reivindicações 1-6, emque a determinação da resposta imune de Thl7compreende determinação de IL17, p.ex., por métodosimunológicos. 9. 0 método de qualquer uma das reivindicações 1-8, emque o sujeito é um mamifero, p.ex., um humano.
2. 10. O método de qualquer uma das reivindicações 1-9,em que a resposta imune de Thl7 é determinada 20-50dias após vacinação.
3. 11. Uso de um estojo de reagente no método dequalquer uma das reivindicações 1-10 para determinaçãoda eficácia de uma vacina micobacteriana vivarecombinante, compreendendo (a) um reagente para re-estimulação das células imunes de um sujeitopreviamente vacinado, e (b) um reagente para deteçãode uma resposta imune de Thl7.